WO2021232130A1 - Construção de ácido nucleico, virus influenza recombinante, método para preparar um virus influenza recombinante, composição, e, uso - Google Patents

Construção de ácido nucleico, virus influenza recombinante, método para preparar um virus influenza recombinante, composição, e, uso Download PDF

Info

Publication number
WO2021232130A1
WO2021232130A1 PCT/BR2021/050216 BR2021050216W WO2021232130A1 WO 2021232130 A1 WO2021232130 A1 WO 2021232130A1 BR 2021050216 W BR2021050216 W BR 2021050216W WO 2021232130 A1 WO2021232130 A1 WO 2021232130A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
influenza virus
virus
neuraminidase
recombinant
recombinant influenza
Prior art date
Application number
PCT/BR2021/050216
Other languages
English (en)
French (fr)
Other versions
WO2021232130A8 (pt
Inventor
Alexandre de Magalhães Vieira MACHADO
Sarah Giarola da Silva MESSIAS
Ana Paula de Faria GONÇALVES
Lídia Paula FAUSTINO
Igor A. PEREIRA
Ianca Évelyn Silva DE PAULA
Márcio Sobreira Silva ARAÚJO
Luciana Pádua TAVARES
Pedro Augusto ALVES
Marcelo Pascoal XAVIER
Kimberly Freitas CARDOSO
Ketyllen Reis Andrade DE CARVALHO
Original Assignee
Fundação Oswaldo Cruz
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Fundação Oswaldo Cruz filed Critical Fundação Oswaldo Cruz
Priority to AU2021275160A priority Critical patent/AU2021275160A1/en
Priority to JP2022552424A priority patent/JP2023525623A/ja
Priority to CA3170269A priority patent/CA3170269A1/en
Priority to US17/908,299 priority patent/US20230332174A1/en
Priority to EP21808722.9A priority patent/EP4155410A4/en
Publication of WO2021232130A1 publication Critical patent/WO2021232130A1/pt
Publication of WO2021232130A8 publication Critical patent/WO2021232130A8/pt

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/09—Lactobacillales, e.g. aerococcus, enterococcus, lactobacillus, lactococcus, streptococcus
    • A61K39/092—Streptococcus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/145—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/5418—IL-7
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01018—Exo-alpha-sialidase (3.2.1.18), i.e. trans-sialidase
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5254—Virus avirulent or attenuated
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A61K2039/575—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2 humoral response
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/58—Medicinal preparations containing antigens or antibodies raising an immune response against a target which is not the antigen used for immunisation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16021—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16051—Methods of production or purification of viral material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16071—Demonstrated in vivo effect
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16132—Use of virus as therapeutic agent, other than vaccine, e.g. as cytolytic agent
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2760/16143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16151—Methods of production or purification of viral material

Definitions

  • the present invention is positioned in the field of vaccinology, describing a variant of recombinant influenza virus defective for multiplication, applicable to the development of prophylactic and therapeutic vaccines against infectious diseases, particularly those caused by the influenza virus, by coronavirus or, still in the field of biomedical research, as a tool to promote the production of immunomodulatory polypeptides in the airways.
  • Influenza pandemics are defined by a dramatic global increase in morbidity and mortality due to the emergence of an antigenically novel influenza virus (usually of a new subtype).
  • Several factors combine to modulate the severity and extent of the pandemic, including the low degree of immunity in the population, the virulence of the pandemic influenza virus, and the efficiency with which the virus can be transmitted between humans. The latter is generally influenced not only by the characteristics of the virus, but also by population density and ease of travel in and out within a region.
  • the virus responsible for the pandemic is, in general, a newly emerged antigenic variant to which the majority of the population has had no previous contact and therefore has little or no immunity.
  • the ability to efficiently multiply and be transmitted in humans are prerequisites for the rapid spread of the virus in the population.
  • the pandemic can produce waves of disease, with peaks of incidence separated by several weeks to months.
  • the relatively rapid onset and spread of pandemic influenza poses several problems for the response to a global health problem of this magnitude and imposes crushing burdens on emergency responders and health care technicians. Rapid identification and response to the emerging pandemic are clearly necessary elements to minimize its impact.
  • Several programs are underway around the world to monitor the emerging influenza virus, including avian influenza virus, which causes sporadic but largely lethal infections in humans. This surveillance data is used in conjunction with pre-defined pandemic alert levels to identify threat probability and provide guidance for an effective response.
  • Vaccination is the most important public health measure to prevent disease caused by both annual epidemics and influenza pandemics.
  • the short response times needed to produce a “pandemic vaccine” do not allow for lengthy research and development processes to provide an effective response.
  • the reverse genetics technique allows the rapid expression and recombinant manipulation of RNA viruses in cell culture, for particular application in the production of vaccines.
  • the method involves transfecting host cells with one or more expression constructs that encode the viral genome and subsequent rescue of the virus from the host cells.
  • W02007 124327 describe a reverse genetics method in which influenza virus genomic RNA is expressed in canine cells using the canine RNA polymerase I (pol I) promoter.
  • pol I canine RNA polymerase I
  • Other sources have reported the expression of influenza genomic RNA in human cells using the human pol I promoter.
  • the document WO2010133964 described a reverse genetics method to produce recombinant influenza virus in host cells using an exogenous pol I promoter, from an organism of distinct taxonomic class (for example, using the human pol I promoter in canine host cells).
  • the present invention represents an advantage over the current methodology for producing vaccines against infections caused by the various subtypes of influenza virus.
  • the recombinant viruses of the present invention are capable of generating long-lasting heterosubtypic responses, protecting against antigenically distinct influenza viruses even two and a half months after intranasal treatment.
  • the technology in question also has the advantage of protecting immunized individuals against secondary bacterial infections, responsible for a large percentage of complicated conditions and deaths in patients infected with the influenza virus. Therefore, vaccines comprising these recombinant viruses, both as immunogens and as an adjuvant, will allow overcoming the problems related to the frequent antigenic incompatibility between the viruses included in the formulation. vaccinate and those circulating in the population, as well as to mitigate problems related to secondary bacterial infections.
  • the present invention can be used in the field of biomedical research as a tool to provide the topical expression of immunomodulatory polypeptides in the airways.
  • the invention makes it possible to assess the role of said immunomodulatory proteins in the establishment, progression and resolution of inflammatory or infectious processes in the respiratory tract, such as those caused by influenza viruses and coronaviruses.
  • Kang et al demonstrate that the intranasal administration of IL-7-Fc is able to promote a favorable immune environment to fight respiratory infections, through the proliferation and activation of leukocytes in the lungs.
  • the strategy used by these authors is not capable of generating a memory response, as there is no specific antigenic stimulus and, therefore, there is no activation of cells and transcription factors necessary for cell differentiation to occur.
  • APC's antigen-presenting cells
  • T and B lymphocytes capable of activating cells of adaptive immunity, such as T and B lymphocytes, responsible for long-term memory immunity
  • APC's antigen-presenting cells
  • T and B lymphocytes capable of activating cells of adaptive immunity, such as T and B lymphocytes, responsible for long-term memory immunity
  • the viral antigenic stimulus is essential for the formation of lymphoid tissues associated with the bronchi and/or nasal region, BALT and NALT respectively, important for the maintenance of memory cells for long periods (Onodera T, et al. Memory B cells in the lung participate in protective humoral immune responses to pulmonary influenza viral reinfection. PNAS 2012; 109(7):2485—2490).
  • mice it is considered that the definition of immunological memory is that measured after 50 days after inoculation (Hye Mee Joo et al. Broad dispersion and lung localization of virus-specific memory B cells induced by influenza pneumonia; Primary and long-term B-cell responses in the upper airway and lung after influenza A viral infection. PNAS 2008, 105 (9) 3485-3490).
  • the duration of immunity in humans with that evaluated in the animal model (mouse), mainly considering the differences in life span and cell population/phenotype between them, which interfere in the kinetics and duration of the immune response (Boyden, AW, Frickman, AM, Legge, KL et al.
  • the favorable duration of the heterosubtypic vaccine response in humans for the development of an influenza vaccine should be at least 2-4 months, in order to ensure greater protection during the season of increased virus circulation, which occurs right after the vaccination campaigns.
  • the carrying of the immunomodulatory protein 11-7 by an influenza virus enables the production of said protein directly in the infected cells, in a transient and localized manner, resulting in the generation of a heterosubtypic memory immune response.
  • the protection obtained in the present invention is maintained even when the challenge with the virus is carried out two and a half months after intranasal inoculation, demonstrating that there is induction of immunological memory.
  • FluIL-7 virus was shown to be safe and incapable of causing disease in inoculated mice, there is no need for revaccination and heterosubtypic protection was observed at later times (30 and 60 days after immunization) than the studies mentioned above. [0017] Finally, it is of great relevance the fact that immunization with influenza virus encoding IL-7 was able to provide protection against secondary bacterial infection caused by Streptococcus pneumoniae. Secondary bacterial infections, especially those caused by S. pneumoniae, are responsible for the most serious complications of influenza, resulting in a worse prognosis, especially in children and the elderly. Another striking aspect of the present invention is the performance of immunomodulatory proteins in inflammatory or infectious processes caused by coronaviruses.
  • the invention is, at its essence, a replication-defective recombinant influenza virus that expresses an immunomodulatory protein.
  • said immunomodulatory protein may be a chemokine or a cytokine.
  • said protein is a cytokine of the interleukin class, particularly interleukin 7 (IL-7).
  • the recombinant influenza virus is obtained from a nucleic acid construct comprising a neuraminidase (NA) gene truncated by the removal of its medial portion and in which the sequence encoding the immunomodulatory protein.
  • NA neuraminidase
  • the nucleic acid construct further comprises a heterologous promoter region and a terminator region.
  • said promoter region is the promoter region of human RNA Polymerase I (Pol I).
  • nucleic acids dealt with in the invention is that described by SEQ ID NO: 1 corresponding to plasmid pPRNA 166x178.
  • the nucleic acid construct of the invention comprises the terminator sequence of the hepatitis delta virus ribozyme; followed by (i) a truncated human Pol I promoter; (ii) coding sequence of the first 166 nucleotides of the neuraminidase, in which all ATG breaks were mutated; (iii) sequence encoding the last 178 nucleotides of neuraminidase (iv) neuraminidase 3'promoter; (v) repetition of the last 42 nucleotides of the neuraminidase ORF; and (vi) truncated human RNA Pol I promoter; wherein a sequence encoding an immunomodulatory protein is inserted between the first 166 and the last 178 nucleotides of the neuraminidase.
  • Another embodiment of the invention provides for a recombinant influenza virus comprising a truncated neuraminidase gene, in which the nucleotide sequence corresponding to the gene of an immunomodulatory protein has been inserted.
  • nucleotides corresponding to the 3' and 5' portions of the neuraminidase gene flank the gene encoding an immunomodulatory protein of SEQ ID NOs: 6 or 7.
  • a further embodiment comprises a method for preparing a recombinant influenza virus which, in turn, comprises the steps of (i) preparing the nucleic acid construct comprising the truncated neuraminidase gene and the immunomodulatory protein gene; (ii) exposing host cells, concomitantly, to the construction of step (i) and to one or more plasmids encoding the NP, PA, PB1, PB2, M1, NS and HA segments of the influenza virus; (iii) recovering recombinant influenza virus from the supernatant.
  • said plasmids from step (ii) above encode cDNA encoding at least seven viral RNA segments from influenza virus A/PR8/34 (PR8).
  • said plasmids from step (ii) above encode the minimum number of viral RNA segments necessary for the synthesis of viral particles.
  • the said minimum number being viral RNA segments at least 1, at least 2, at least 3, at least 4, at least 5, at least 6 or at least 7.
  • the method of preparing the recombinant influenza virus comprises the additional steps of infecting a substrate with the recombinant influenza virus recovered in step (iii) above and purifying the virus from the substrate.
  • Another embodiment of the invention relates to an immunogenic composition
  • an immunogenic composition comprising the recombinant influenza virus and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • Said immunogenic composition is, in an alternative modality, capable of inducing long-term heterosubtypic immune response. Furthermore, such composition is preferably administered by the intranasal route. [0034] Finally, the invention also includes the use of influenza virus to prepare an immunogenic composition to prevent or treat infections caused by influenza virus, coronavirus and secondary bacterial infections, to be used as an adjuvant in vaccines, or as a tool to provide the topical expression of immunomodulatory polypeptides in the airways.
  • FIGURE 1 Schematic representation of the construction of plasmid pPRNA 166x178 and pPRNA166-IL-7-178
  • Plasmid pPRNA 166x178 is derived from plasmid pPR-NA, which contains the cDNA of the complete segment of NA in negative orientation under the control of the truncated human polymerase I promoter and the hepatitis delta virus ribozyme.
  • To obtain pPRNA166xl78 an additional 3' promoter and an Xhol/Nhel cloning site were first introduced in this plasmid.
  • the last 42 nucleotides of the NA ORF (open square) were then duplicated, to preserve the integrity of the 5' end of the neuraminidase over its last 70 nucleotides, resulting in plasmid pPR- NA38.
  • the NA targeting occurred by replacing the ORF present in the plasmid by the first 169 nucleotides and the last 178 nucleotides of the NA segment, flanking the multiple cloning site and removing nucleotides 170-1232.
  • the first 166 nucleotides of the NA were then replaced by a sequence containing all of the ATG breaks (nucleotides 20-22; 62-64; 115-117; 163-165) mutated to the CTA break.
  • pPRNA166-IL-7-178 was obtained by cloning the heterologous sequence of murine interleukin 7 (IL-7), constructed as a synthetic gene using the corresponding cDNA sequence, in the cloning site recognized by Xhol/Nhel restriction enzymes.
  • IL-7 murine interleukin 7
  • FIGURE 2 Reverse genetics of influenza virus. Recombinant viruses were obtained by reverse genetics according to the methodology described by Kawaoka et al. (Fujii Y, Goto H, Watanabe T, Yoshida T, Kawaoka Y. Proc Natl Acad Sei US A. 2003 Feb 18;100(4):2002- 7), with modifications.
  • co-cultures of HEK 293T and MDCK cells were co-transfected with the plasmid encoding a segment of recombinant NA containing or not IL-7 (pPRNA166-IL -7-178 and pPRNA166xl78, respectively) and seven other plasmids encoding the other segments of the PR8 influenza virus (NP, PA, PB1, PB2, M1, NS and HA).
  • FIGURE 3 Characterization of recombinant influenza viruses carrying the interleukin 7 gene in cell culture.
  • Recombinant influenza viruses defective for multiplication carrying the murine IL-7 sequence (Flu-IL7), constructed by reverse genetics, were evaluated for their ability to produce IL-7 in cell culture.
  • Flu-IL7 murine IL-7 sequence
  • results are represented in bar graphs, where the means and standard error of the mean cytokine production at each time are plotted. The times evaluated in hours are represented on the x-axis and the cytokine production in pg/ml on the y-axis.
  • FIGURE 4 Kinetics of IL-7 cytokine production in the lungs and bronchoalveolar lavage (BALF) of infected mice.
  • C57BL/6 mice were anesthetized and inoculated with different doses of recombinant virus Flu-IL7 (10 2 -10 4 pfu/animal via intranasal route) or Flu-CT (10 4 pfu/animal via intranasal route) in 25 m ⁇ of PBS. Animals from the mock group were inoculated with only 25 m ⁇ of PBS.
  • the animals were euthanized at previously determined times (12, 24, 48 and 72 hours after infection) for the collection of bronchoalveolar lavage and lungs and quantification of the cytokine IL-7 by the ELISA technique.
  • the results of IL-7 levels (A) in the lungs and (B) in the bronchoalveolar lavage are shown.
  • FIGURE 5 Recombinant influenza viruses carrying murine cytokine genes as a tool to assess their role in immunopathogenesis.
  • A Mortality assessment. Intranasal inoculum was performed with PBS (Mock), 10 4 PFU (lethal dose) of PR8 or 10 4 PFU of PR8 and Flu-CT or Flu-IL7.
  • FIGURE 6 Flu-IL7 recombinant influenza virus and protection against secondary bacterial infections.
  • mice Male C57BL/6 mice, aged 8 to 12 weeks, were anesthetized subcutaneously with a mixture of Ketamine (100mg/kg) and Xylazine (10mg/kg) and divided into groups (8 animals) that were immunized intranasally (40m L/animal) with 10 2 PFU/animal PR8 (sublethal dose), PBS lx (Mock) or co-inoculated with 10 2 PFU/animal PR8 and 10 4 PFU/animal Flu-IL-7 or Flu-Ct.
  • FIGURE 7 Flu-IL7 recombinant influenza virus as a tool for the development of a vaccine capable of conferring heterosubtypic protection.
  • FIGURE 8 Flu-IL7 recombinant influenza virus as a tool for the development of a vaccine capable of inducing long-term memory cells.
  • mice under the same immunization schedule were challenged after 4 weeks with a sublethal dose of 10 2 PFU of the H3N2 subtype virus, the mice were followed for a period of 15 days for analysis of weight loss and survival, then they were euthanized and had their lungs collected for different analyses.
  • an ex vivo analysis of the phenotypic profile of effector and memory cells in the lungs was performed by flow cytometry, using different panels of biomarkers. Were evaluated different cell subpopulations and memory phenotypes, using different combinations of biomarkers conjugated to fluorochromes.
  • T lymphocytes CD3+CD4+ or CD3+CD8+
  • T effectors CD44+
  • T effector memory CD44+CD62L-CD127+
  • T C M T central memory
  • T central memory long-lasting CD44+CD62L+CD127+
  • TRM T resident memory
  • B lymphocytes CD19+
  • memory and B cell activation CD62L, CD80, CD27.
  • the “Biomarker Signatures” graphs represent the percentage of individuals with cell frequency above or below the global median of the groups.
  • the regions highlighted by colors represent the populations that presented a frequency above the global median of the groups in more than 50% of the individuals evaluated (ascending order).
  • Statistically significant differences (p ⁇ 0.05) between groups are represented by an asterisk (*).
  • the Venn diagram represents the main differences observed within each group and between groups in the “Biomarker Signatures” analysis.
  • Statistically significant differences (p ⁇ 0.05) between the FluIL-7and FluCt group are represented by an asterisk (*).
  • the increase (p ⁇ 0.05) in the frequency of subpopulations in the PR/8 group compared to both the FluIL-7 and FluCt vaccine groups, are represented by ochtothorpe (#).
  • nucleic acid, polynucleotide, polynucleotide sequence refers to single-stranded or double-stranded deoxyribonucleotide or ribonucleotide polymers or chimeras or analogues thereof. Unless otherwise indicated, a particular nucleic acid sequence of this invention encompasses both degenerate sequences and complementary sequences in addition to the explicitly indicated sequence.
  • genes are widely used to refer to any polynucleotide that encodes an instruction relating to a biological function. Generally speaking, genes comprise coding sequences and may also contain non-coding regions, which regulate the expression of the coding portion.
  • the term “gene” applies to a specific genomic sequence, a messenger RNA (mRNA) encoded by a genomic sequence, and a complementary DNA (cDNA) to an mRNA.
  • mRNA messenger RNA
  • cDNA complementary DNA
  • the non-coding regions of genes can include one or more segments that, for example, form recognition sequences for other proteins.
  • Such non-coding segments include "promoters” and “amplifiers,” for regulatory proteins such as transcription factors to bind, resulting in transcription from adjacent or neighboring sequences.
  • Promoter or “promoter sequence” refers to a DNA sequence whose function is to regulate the expression of a gene, initiating the transcription of a nucleic acid sequence to which it is functionally switched on.
  • the regulation of gene expression can be determined temporally, spatially and/or physiologically.
  • construction denotes a polynucleotide sequence containing at least one gene operably linked to at least one promoter. "By operably linked” it is meant that a promoter is positioned relative to a coding sequence in such a way that the promoter directs or regulates the expression of the nucleic acid. Said construction can be later introduced into an expression vector. Both the construct itself and the expression vector can subsequently be introduced into a host cell to promote the expression of one or more genes.
  • An "expression vector” is a vector, such as a plasmid, that is capable of promoting expression, for example, transcription, of a coding polynucleotide sequence incorporated therein.
  • Expression vectors can be autonomously replicating or not replicating autonomously.
  • the polynucleotide sequence to be expressed is "operably linked" to a promoter and/or enhancer that regulates its transcription.
  • the nucleic acid can be incorporated into the genome of the cell (for example, chromosomal DNA , plasmid, plastid, or mitochondrial), converted to an autonomous or transiently expressed replicon (eg, transfected mRNA).
  • the term includes such methods as “infection,””transfection,””transformation” and “transduction.”
  • a variety of methods can be used to introduce polynucleotides into eukaryotic cells, including electroporation, lipid-mediated transfection (lipofection), microinjection, virus-mediated transfer, etc.
  • encode refers to the property of a nucleic acid, for example, deoxyribonucleic acid (DNA), to transcribe a complementary nucleic acid, including a nucleic acid that can be translated into a polypeptide .
  • a DNA can encode a ribonucleic acid (RNA) that is transcribed from that DNA.
  • RNA ribonucleic acid
  • DNA can encode a polypeptide translated from an RNA transcribed from DNA.
  • truncated denotes the interruption of a polynucleotide or polypeptide chain, preventing the expected physiological functioning of said truncated sequence.
  • a truncated neuraminidase gene as described herein is a polynucleotide sequence encoding a neuraminidase that has been disrupted by removal of a medial fragment of the native sequence.
  • host cell means a cell into which a nucleic acid has been introduced, such as a vector, and also includes the progen of that cell which also contains this nucleic acid.
  • Host cells can be prokaryotic cells, such as bacterial cells, or eukaryotic cells, such as, for example, yeast, insect, amphibian, avian or mammalian cells.
  • the term "recombinant” indicates that the material (eg, a nucleic acid or protein) has been artificially or synthetically (not naturally) modified by human intervention. Specifically, when referring to a virus, for example an influenza virus, the virus is recombinant when it is produced by expression of a recombinant nucleic acid.
  • immunogenic composition denotes a preparation that contains a substance capable of inducing a humoral and/or cellular memory immune response against one or more diseases. so
  • the response-inducing substance commonly referred to as the “antigen”
  • the causative agent of the disease from which you want to protect.
  • immunogenicity The ability of an antigen to induce an immune response is called "immunogenicity".
  • immunogenic composition against infections caused by different types of influenza viruses can be produced from structural proteins of the viral (viral) subtype(s) against which protection is desired.
  • these vaccines can be produced with intact viruses, however, inactivated or with attenuated infectious capacity.
  • the immune response generated by an antigen may be specific for a disease-causing agent or may be capable of conferring protection against more than one agent. Particularly in the case of immunogenic compositions against the influenza virus, each antigen can generate a response against a single viral strain. When a single antigen is capable of generating an immune response against several strains of other influenza virus subtypes, the immune response is then termed “heterosubtypic”.
  • heterosubtypic Long-term heterosubtypic response is defined as a response that activates immunological memory, protecting against antigenically distinct influenza viruses 2 months or more after treatment.
  • the immune response to an antigen may become more effective when the immunogenic composition contains one or more adjuvants.
  • adjuvants are substances of synthetic, organic or inorganic origin, or biological that increase the effectiveness of an immune response when administered together with an antigen.
  • immunomodulatory proteins can be part of an immunogenic composition capable of inducing the heterosubtypic immune response of the present invention.
  • immunomodulatory protein denotes a polypeptide with regulatory biological activity on the functioning of immune system cells.
  • an immunomodulatory protein can be employed to restore the natural balance or to enhance the activity of a patient's immune system.
  • the immunomodulatory protein increases the activity of the immune system, contributing to the response generated against the antigen.
  • immunomodulatory proteins include chemokines and cytokines such as, for example, MIP-1 (Macrophage Inflammatory Protein), MCP-1 (Monocyte Chemoattractant Protein), G-CSF (Granulocyte-colony stimulating factor), GM-CSF (Granulocyte- Macrophage Colony-Stimulating Factor ), TNF-a (Tumor Necro sis Factor ), interferons and interleukins.
  • Immunogenic compositions may be formulated for any manner of administration including, for example, oral, intranasal or parenteral.
  • parenteral as used herein includes subcutaneous, intradermal, intravascular (e.g., intravenous), intramuscular, spinal, intracranial, intrathecal and intraperitoneal injection, as well as any similar injection or infusion technique.
  • intranasal administration may be preferred.
  • the present invention represents an advance over the state of the art by providing a recombinant influenza virus, defective for multiplication, capable of generating a long-lasting heterosubtypic immune response.
  • IL-7 concurrently with exposure to the influenza virus in vivo in an individual confers long-term protection against other subtypes of the aforementioned virus and against secondary bacterial infections, and can also be used in the treatment of infections.
  • coronaviruses such as coronaviruses associated with severe acute respiratory syndromes (SARS-CoV and SARS-CoV-2).
  • IL-7 The concomitant expression of IL-7 was achieved by introducing a gene encoding such a cytokine between segments encoding the 3' and 5' portions of the viral neuraminidase. Due to the truncation of the neuraminidase gene by removing its medial portion, the recombinant influenza virus became defective for multiplication and, therefore, incapable of multiplying in vivo.
  • experiments described herein are representative of a concept encompassing (i) a nucleic acid construct comprising a truncated neuraminidase gene into which the sequence encoding an immunomodulatory protein has been inserted; (ii) a recombinant influenza virus comprising the construction of nucleic acids (i); a method of making recombinant influenza virus; (iii) an immunogenic composition; and (iv) the use of the recombinant influenza virus, as an immunogen or adjuvant, to prepare a vaccine to prevent infections caused by influenza viruses and secondary bacterial infections, or as a tool to promote the topical expression of immunomodulatory polypeptides in the airways. Additionally, the invention also encompasses the use of the recombinant influenza virus in the preparation of a therapeutic vaccine in infections caused by coronaviruses.
  • the virus is an influenza virus of type A or B, having viral RNA (vRNA) segments derived from one or more than one precursor virus.
  • vRNA viral RNA
  • the recombinant influenza virus is a multiplication defective virus.
  • the recombinant influenza virus is defective for multiplication in that it has a truncated neuraminidase, which is non-functional. Also, the neuraminidase of the recombinant influenza virus is not functional due to the removal of its medial portion (nucleotides 170-1232).
  • the heterologous protein produced by the virus is an immunomodulatory protein.
  • said immunomodulatory protein can be a chemokine.
  • the immunomodulatory protein can be a cytokine.
  • the immunomodulatory protein is an interleukin (IL) such as, for example, IL-15, IL-17, IL-4, IFN-G and particularly IL-7.
  • IL interleukin
  • the nucleotide sequence encoding IL-7 preferably gives rise to an IL-7 of the same biological origin as the individual who is to be protected or treated from an influenza virus or coronavirus infection.
  • the nucleotide sequence encoding IL-7 used in the construction of the invention encodes a human IL-7.
  • porcine IL-7 is used for the protection of pigs.
  • the application of the described construction is exemplified below using the murine homolog of IL-7, since, in an experimental phase of technology development, its effectiveness was evaluated in a murine model of influenza virus infection.
  • Nucleotide sequences encoding human IL-7 or homologs for example, from mouse (murine), swine, equine, rat or rhesus monkey are known to the person skilled in the art. In some species (eg humans and mice), there are reports that the transcript product of the IL-7 gene is subject to alternative post-transcriptional processing (splicing), resulting in more than one variant.
  • splicing alternative post-transcriptional processing
  • Polypeptides derived from the nucleotide sequences encoding IL-7 are also available in public databases and are known to the person skilled in the art.
  • the transcriptional variant 1 of the human IL-7 gene when translated, produces a protein of 177 amino acids, amino acids 1-25 of the N-terminal portion composing a signal peptide that is cleaved during post-processing. protein translation.
  • the mature IL-7 polypeptide corresponds to a sequence of 152 amino acids (SEQ ID NO: 5).
  • nucleotide sequence encoding an immunomodulatory protein can be a sequence encoding any polypeptide capable of, in this case, interacting with and activating the IL-7R.
  • the present invention encompasses nucleic acid molecules containing portions encoding an IL-7, wherein said portions are nucleic acid sequences of at least 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65% , 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% identical to the nucleic acid sequences described by SEQ ID NO: 2, 3 or 4 Nucleic acid molecules that are at least 95% identical to that represented by SEQ ID NO: 2 are particularly preferred.
  • the invention makes use of nucleic acid sequences encoding an IL-7 that are at least 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75 %, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% identical to the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 5, 6 or 7.
  • the nucleotide sequence encoding an immunomodulatory protein is introduced into an expression vector comprising the sequence corresponding to the truncated viral neuraminidase gene.
  • the sequence encoding the immunomodulatory protein preferably an IL-7
  • the sequence encoding the immunomodulatory protein, preferably an IL-7 is introduced immediately after the 166th nucleotide, 3' -5' sense, of the sequence encoding the neuraminidase.
  • the vector encoding the truncated neuraminidase is pPRNA166xl78 (SEQ ID NO: 1).
  • This vector contains the ORF of the reported neuraminidase in negative orientation.
  • the expression of neuramidase is impossible due to the removal of its medial portion (nucleotides 170-1232) and replacement of all ATG cracks from the first 166 nucleotides to the CTA crack (nucleotides 20-22; 62-64; 115-117; 163- 165).
  • nucleotide sequence encoding an immunomodulatory protein preferably an IL-7
  • an immunomodulatory protein preferably an IL-7
  • the vector pPRNA 166x178 in which a nucleotide sequence encoding an IL-7 was introduced immediately after the 166th nucleotide, 3' -5' sense, of the sequence encoding the neuraminidase of the WSN virus, termed pPRNA166-IL-7-178, corresponds to SEQ ID NO: 9.
  • the methods of the invention comprise introducing a plurality of vectors, each of which incorporates a portion of an influenza virus into a population of host cells capable of supporting viral replication.
  • Host cells can be cultured under conditions permissible for viral growth, and influenza virus recovered.
  • a method of producing recombinant viruses comprising a segmented RNA genome comprises the steps of: a) introducing into one or more expression vectors containing the viral cDNA corresponding to each gene in the viral genome; b) introducing said expression vectors into a host cell or population of host cells; c) incubating said host cells; and d) isolating a population of recombinant influenza virus.
  • RNA transcript can be packaged into a defective recombinant influenza virus for multiplication.
  • the host cell is selected from the group consisting of Vero cells, Per.C6 cells, BHK cells, PCK cells, MDCK cells, MDBK cells, 293 cells (e.g., HEK 293T cells, and COS cells.
  • Vero cells Per.C6 cells
  • BHK cells BHK cells
  • PCK cells PCK cells
  • MDCK cells MDBK cells
  • 293 cells e.g., HEK 293T cells, and COS cells
  • a population of host cells obtained by co-cultivating a mixture of at least two of these cell lines, e.g., a combination of HEK 293T and MDCK cells is employed.
  • expression vectors are transfected into cells by electroporation. In certain embodiments, expression vectors are introduced into cells by transfection into cells in the presence of a liposomal transfection reagent or by precipitation of calcium phosphate. In certain embodiments, the expression vectors are plasmids.
  • the expression vectors comprise an expression vector for the expression of all genomic RNA segments necessary for the synthesis of multiplication-deficient viral particles, expression vectors that separately encode each genomic RNA segment necessary for the synthesis of multiplication-deficient viral particles, or the corresponding messenger RNAs.
  • expression of each genomic RNA segment or encoded RNA is under the control of a promoter sequence derived from a human Pol I promoter.
  • recombinant influenza viruses can be recovered from the culture of host cells that incorporate the influenza genome plasmids.
  • the recovery of recombinant viruses involves exposing host cells to cell lysis conditions.
  • cell lysis conditions comprise the addition of digestive enzymes and/or a functional exogenous neuraminidase.
  • the digestive enzyme can be trypsin and the functional neuraminidase can be derived from Vibrio cholerae.
  • the methods may further comprise a step of infecting a substrate with the recovered recombinant influenza virus and purifying the virus from the substrate.
  • one or more expression vectors encoding influenza virus viral RNA segments necessary for the synthesis of multiplication-deficient viral particles are transfected into suitable host cells concurrently with the nucleic acid construct of the present invention.
  • said expression vectors comprise cDNA encoding the minimum number of viral RNA segments necessary for the synthesis of viral particles.
  • expression vectors comprising cDNA encoding at least seven influenza virus viral RNA segments (i.e., NP, PA, PB1, PB2, M1, NS and HA) are transfected into host cells suitable concurrently with the construction of nucleic acids of the present invention.
  • influenza virus viral RNA segments i.e., NP, PA, PB1, PB2, M1, NS and HA
  • said expression vectors encode cDNA encoding at least seven viral RNA segments of the influenza virus A/PR8/34 (PR8), as described by de Wit et al (de Wit, E . et al. Efficient generation and growth of influenza virus A/PR/8/34 from eight cDNA fragments.
  • Virus research v. 103, n. 1-2, p. 155-161, 2004).
  • the invention also provides for the use of a virus obtained by the methods of any of the modalities described above to prepare a immunogenic composition to prevent infections caused by influenza viruses and secondary bacterial infections or to treat infections caused by coronaviruses, either as an immunogen or as an adjuvant in combination with another immunogen or drug with antiviral activity.
  • a virus obtained by the methods of any of the modalities described above to prepare a immunogenic composition to prevent infections caused by influenza viruses and secondary bacterial infections or to treat infections caused by coronaviruses, either as an immunogen or as an adjuvant in combination with another immunogen or drug with antiviral activity.
  • the immunogenic compositions required herein may also include excipients and/or vehicles.
  • the vehicle or excipient is the pharmaceutically acceptable one, which, by way of example, but not limited to, may be: sterile water, aqueous saline solution, buffered aqueous saline solutions, aqueous dextrose solutions, aqueous glycerol solutions, ethanol, allantoic fluid from uninfected chicken eggs (ie, normal allantoic fluid “NAF”), or combinations thereof.
  • NAF normal allantoic fluid
  • the formulation for administering influenza virus or its subunits also contains one or more adjuvants to enhance the immune response to influenza antigens.
  • adjuvants known to the person skilled in the art includes: saponin, mineral gels such as aluminum hydroxide, cell surface active substances such as lysolecithin, pluronic polyols, polyanions, peptides, oil or hydrocarbon emulsions, Bacillus Calmette-Guerin (BCG ) and Corynebacterium parvum.
  • the immunogenic compositions will generally be in aqueous form. However, some compositions may be in dry form and in the form of injectable solids or dry preparations or polymerized into an adhesive. Immunogenic compositions can include preservatives such as thiomersal or 2-phenoxyethanol.
  • immunogenic compositions can include one or more buffers.
  • Typical buffers include: phosphate buffer, Tris, borate buffer, succinate buffer, histidine buffer (particularly with an aluminum hydroxide adjuvant), or citrate buffer.
  • the pH of an immunogenic composition will generally be between 5.0 and 8.1, and more typically between 6.0 and 8.0 e. 6.5 and 7.5, or between 7.0 and 7.8.
  • a method of the invention may therefore include a step of adjusting the pH of the bulk immunogenic composition prior to packaging.
  • the immunogenic composition can be a therapeutic composition or, alternatively, a prophylactic vaccine systemically administered or used as an immunotherapeutic, for example, by subcutaneous or intramuscular injection using a needle and syringe or a needleless injection device.
  • the vaccine formulation is administered intranasally, by drops, large particle aerosol (greater than about 10 microns) or spray into the upper respiratory tract.
  • influenza viruses of the invention are administered in an amount sufficient to stimulate an immune response specific to one or more influenza virus subtypes.
  • administration of influenza virus evokes a protective heterosubtypic immune response.
  • the recombinant influenza viruses of the invention can be administered in an amount sufficient to stimulate a therapeutic immune response against infection by Coronavims.
  • Plasmid pPRNA 166x178 encodes a truncated segment of the neuraminidase in which all ATG breaks of the first 166 nucleotides of the 3" region (nucleotides 20-22; 62-64; 115-117; 163-165) have been mutated to the crack CTA. This segment is followed by a multiple cloning site and the last 178 nucleotides of the 5" region of the neuraminidase segment.
  • the coding sequence of the murine cytokine IL-7 was constructed as a synthetic gene by the company GENSCRIPT (Hong Kong) based on the cDNA sequence, having been optimized for expression in murine cells (SEQ ID NO: 8), without alteration in the amino acids encoded by the sequence (SEQ ID NO: 6).
  • the optimized sequence was cloned into plasmid pPR 166x178 at the multiple cloning site, giving rise to vector pPRNA 166-IL-7-178 (SEQ ID NO: 9). This type of construction allows the production of the cytokine IL-7 in its native form within the infected cell, given that the mutations in the neuraminidase segment described above prevent the production of any peptide from this protein.
  • Plasmid pPRNA166xl78 was constructed from plasmid pPR-NA.
  • pPR-NA is a transfer plasmid containing the cDNA encoding the wild-type segment of the WSN virus neuraminidase. Its construction has been described previously ( Machado, A., N. Naffakh, S. van der Werf, and N. Escrou. 2003. Virology 313:235-249).
  • This plasmid contains the neuraminidase segment cloned in negative orientation in transfer plasmid pPR7 between the truncated human polymerase I (pol I) promoter sequence and the hepatitis delta virus ribozyme sequence. This type of construction allows the synthesis of a synthetic viral RNA molecule in the transfected cells.
  • pPR-NA was successively modified to result in plasmid pPRNA 166x178: (i) First, the neuraminidase 3' promoter region was amplified and inserted after the neuraminidase ORF present in the plasmid, together with a multiple cloning site Xhol / Nhe I; (ii) Next, to preserve the integrity of the 5" end of the neuraminidase over its last 70 nucleotides, the last 42 nucleotides of the neuraminidase ORF were amplified and inserted into the 5" end of the neuraminidase already cloned into the plasmid, resulting in the plasmid pPR-NA38 (Vieira Machado A, et al.
  • Recombinant influenza viruses were obtained by reverse genetics according to the technique shown in figure 2 and previously described by Kawaoka and collaborators (Fujii Y et al, Selective incorporation of influenza viral RNA segments into virions. Proc Natl Acad Sei US A 2003 Feb 18;100(4): 2002-7).
  • DMEM fetal calf serum
  • SIGMA TPCK trypsin
  • Vibrio cholerae neuraminidase which makes up for the lack of viral neuraminidase, allowing the release of neoformed viral particles.
  • Recombinant viruses obtained carrying the IL-7 gene (Flu-IL7) and the respective control virus without IL-7 (Flu-CT) were amplified and purified twice by limiting dilution (highest dilution in which we observed a cytopathic effect) in MDCK cells, before being subjected to a final amplification in this same cell line. All viral stocks thus obtained had their infectious titer determined by lysis plate titration under agarose in MDCK cells. O Recombinant virus genotype was evaluated by PCR and sequencing and did not show any deletion or mutation in the viral genome.
  • IL-7 The production of IL-7 in cells infected by the Flu-IL7 virus was evaluated by the ELISA technique.
  • MDCK cell monolayers were infected with Flu-IL7 or Flu-CT virus at the multiplicity of infection (M.O.I) of 1/1000.
  • Cell culture supernatants were collected at different times after infection. As shown in Figure 3A, it was possible to detect IL-7 production in infected cells from 48 hours after infection; the peak of production of this cytokine was detected 72 hours after infection, being in the order of 800 pg/ml.
  • Macrophages play an important role as antigen-presenting cells in the respiratory tract, in addition to producing important inflammatory mediators in antiviral defense.
  • murine monocytes present in the bone marrow were differentiated into macrophages and infected with M.O.I 0.1 or 0.01 of recombinant virus, in the presence of neuraminidase.
  • IL-7 production in macrophages was detected 24 hours after Flu-IL7 virus infection using 0.1 M.O.I.
  • EXAMPLE 2 EVALUATION OF IL-7 PRODUCTION IN MICE INFECTED WITH FLU-IL7 VIRUS
  • Male C57BL/6/C mice between 8 and 10 weeks of age were anesthetized and inoculated intranasally with 10 2 , 10 3 or 10 4 Flu-IL7 PFU or 10 4 Flu-CT PFU diluted in 25 ⁇ l PBS.
  • the Mock group was inoculated only with PBS.
  • the animals were euthanized to collect the lungs and bronchoalveolar lavage (BALF).
  • BALF bronchoalveolar lavage
  • the group of animals co-infected with the Flu-IL7 + PR8 viruses showed less total weight loss than the group that received only PR8 (Figure 5B) and less weight loss at specific times with regarding the PR8 group and the group co-infected with Flu-CT + PR8, in addition to having regained initial weight earlier than the animals in the control group (Flu-CT+PR8; Figure 5C).
  • our results suggest a protective role for the cytokine IL-7 and demonstrate the viability of the virus we have constructed as a tool to be used in the study of the immunopathogenesis of influenza virus infection.
  • EXAMPLE 4 PROTECTION AGAINST SECONDARY BACTERIAL INFECTIONS AFTER IMMUNIZATION WITH THE FLU-IL7 VIRUS
  • mice Ten days after infection the mice were challenged with a dose of 10 2 CFU/animal of bacteria (gram-positive) Streptococcus pneumoniae serotype ATCC6303. Forty-eight hours after the challenge, the animals were euthanized and their lungs were collected in a sterile environment to determine the bacterial load by titration on a blood-agar plate. The experiment was carried out in triplicate.
  • EXAMPLE 5 FLU-IL7 VIRUS AS A TOOL FOR INDUCTION OF EXPANDED SPECTRUM IMMUNE RESPONSE (HETEROSUBTYPIC RESPONSE)
  • mice Male C57BL/6 mice, 8 to 12 weeks old, were anesthetized and immunized with 10 4 PFU of the recombinant virus (Flu-CT or Flu-IL7) or with a sub-lethal dose of 10 2 PFU of the wild-type virus subtype H3N2. About seventy-five days after immunization, when the memory immune response had already been established, the animals were challenged with 5x10 2 PFU of an influenza virus of the H3N2 subtype.
  • FluIL-7 Immunization with the FluIL-7 virus confers a more robust heterosubtypic protection in immunized animals, although animals in the control group (FluCt) had a milder disease when compared to the Mock group. IL-7 seems to act by enhancing the establishment of an immunological memory, which results in longer-lasting immunity and greater survival of challenged animals.
  • EXAMPLE 6 FLU-IL7 RECOMBINANT INFLUENZA VIRUS AS A TOOL FOR THE DEVELOPMENT OF A VACCINE CAPABLE OF INDUCING LONG-TERM MEMORY CELLS.
  • mice Male C57BL/6 mice, 8 to 12 weeks old, were anesthetized subcutaneously with a mixture of Ketamine (100mg/kg) and Xylazine (10mg/kg) and divided into groups (6 animals) that were immunized via intranasal (40pL/animal) with 10 4 PFU of FluIL-7 or FluCt or 10 2 PFU of PR/8 (sublethal dose) or PBS 1x (Mock).
  • the immunophenotypic profile of lung cells was evaluated 21 days after immunization with the recombinant viruses FluIL-7 or FluCt or with the wild type virus PR/8.
  • the previously perfused lungs were subjected to treatment with collagenase type IV (0.5mg/mL) (37°C for 40min) to allow tissue dissociation.
  • the organs were then macerated in a cell filter sieve (70pm) with 5mL of RPMI (10% FCS) and the suspension centrifuged at 800xg for 7min at 8°C. The supernatant was discarded and red cell lysis was performed with 9mL H20 type I (20s) under vortexing and isotonicity corrected with 1mL of 10x PBS.
  • the cells were subjected to a 40% isotonic Percoll® (Sigma) gradient in RPMI medium.
  • T lymphocytes CD3+CD4+ or CD3+CD8+
  • T effector CD44+
  • T effector memory CD44+CD62L-CD127+
  • TCM T central memory
  • CD44+CD62L+CD127+ T MCD
  • T resident memory CD69+CD103
  • B lymphocytes CD19+
  • memory and activation of B cells CD62L, CD80, CD27.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

A presente invenção trata de uma construção de ácido nucleico, um vírus influenza recombinante defectivo para multiplicação que promove a expressão de uma proteína imunomoduladora em um hospedeiro, aplicável ao desenvolvimento de vacinas contra doenças infecciosas, particularmente, aquelas causadas pelo vírus influenza e Coronavírus.

Description

CONSTRUÇÃO DE ÁCIDO NUCLEICO, VIRUS INFLUENZA RECOMBINANTE, MÉTODO PARA PREPARAR UM VIRUS INFLUENZA RECOMBINANTE, COMPOSIÇÃO, E, USO
Campo da invenção
[001] A presente invenção posiciona-se no campo da vacinologia, descrevendo variante de vírus influenza recombinante defectivo para multiplicação, aplicável ao desenvolvimento de vacinas profiláticas e terapêuticas contra doenças infecciosas, particularmente aquelas causadas pelo vírus influenza, por coronavírus ou, ainda no campo da pesquisa biomédica, como ferramenta para propiciar a produção de polipeptídeos imunomoduladores nas vias aéreas.
Antecedentes da invenção
[002] Pandemias de gripe são definidas por um aumento global dramático em morbidez e mortalidade devido ao surgimento de vírus influenza antigenicamente inédito (geralmente de um novo subtipo). Diversos fatores combinam-se para modular a gravidade e a extensão de pandemia, incluindo o grau baixo da imunidade na população, a virulência do vírus influenza pandémico e a eficiência com que o vírus pode ser transmitido entre os seres humanos. O último é geralmente influenciado não apenas pelas características do vírus, mas também pela densidade da população e facilidade de viajar para dentro e para fora dentro de uma região. O vírus responsável pela pandemia é, em geral, uma variante antigênica recentemente emergida com a qual a maioria da população não teve contato anterior e, portanto, tem pouca ou nenhuma imunidade. A capacidade de se multiplicar e ser transmitido eficientemente em seres humanos são pré-requisitos para a disseminação rápida do vírus na população.
[003] A influenza pandémica espalha- se muito rapidamente e pode ter impacto devastador. A pandemia mais severa no século 20, a pandemia de 1918, matou mais de 500.000 cidadãos americanos e entre 20 a 40 milhões de pessoas por todo mundo. A pandemia pode produzir ondas de doença, com picos de incidência separados por várias semanas a meses. O início e a disseminação relativamente rápidos da influenza pandémica acarretam diversos problemas para a resposta a um agravo de saúde global desta magnitude e impõem cargas esmagadoras sobre atendentes de emergência e técnicos de cuidado à saúde. A identificação e resposta rápidas para a pandemia emergente são claramente elementos necessários para minimizar seu impacto. Diversos programas estão em andamento pelo mundo inteiro para monitorar o vírus da influenza emergente, incluindo vírus da influenza aviária, que causa infecções esporádicas, porém, majoritariamente letais em seres humanos. Estes dados de vigilância são usados em conjunção com níveis de alerta de pandemia predefinidos de modo a identificar a probabilidade da ameaça e fornecer orientação para uma resposta eficaz.
[004] A vacinação é a medida de saúde pública mais importante para prevenir doença causada tanto pelas epidemias anuais quanto pelas pandemias de influenza. O curto intervalo entre a identificação de um vírus pandémico e a sua dispersão ao redor do mundo, a exemplo do que ocorreu durante a pandemia de gripe suína em 2009, representa um desafio significante para produção de vacinas específicas para o vírus pandémico e em quantidade suficiente para proteger um segmento amplo da população. Os tempos de resposta curtos necessários para produzir uma “vacina pandémica” não permitem processos prolongados de pesquisa e desenvolvimento para fornecer uma resposta eficaz.
[005] Como solução, a técnica de genética reversa permite a rápida expressão e manipulação recombinante de vírus de RNA em cultura de células, para particular aplicação na produção de vacinas. O método envolve transfectar células hospedeiras com uma ou mais construções de expressão que codificam o genoma virai e subsequente recuperação do vírus a partir das células hospedeiras. [006] Por exemplo, os documentos W02007002008 e
W02007 124327 descrevem um método de genética reversa no qual o RNA genômico de vírus influenza é expresso em células caninas usando o promotor da RNA polimerase I (pol I) canina. Outras fontes relataram a expressão do RNA genômico de influenza em células humanas usando o promotor humano da pol I.
[007] Mais recentemente, o documento WO2010133964 descreveu um método de genética reversa para produzir vírus influenza recombinante em células hospedeiras utilizando um promotor de pol I exógeno, de um organismo de classe taxonômica distinta (por exemplo, utilizando o promotor de pol I humana em células hospedeiras caninas).
[008] No entanto, apesar de técnicas de genética reversa garantirem agilidade à produção de estirpes vacinais do vírus influenza, as estirpes sazonais mudam anualmente conforme previsão de predominância para o período. Então, é altamente desejável que a próxima geração de vacinas contra influenza confira proteção cruzada contra diferentes estirpes e subtipos do vírus influenza gerando, portanto, uma resposta heterosubtípica.
[009] Neste sentido, a presente invenção representa uma vantagem sobre a atual metodologia de produção de vacinas contra infecções causadas pelos diversos subtipos de vírus influenza. Os vírus recombinantes da presente invenção são capazes de gerar respostas heterosubtípicas de longa duração, protegendo contra vírus influenza antigenicamente distintos mesmo dois meses e meio após o tratamento intranasal. A tecnologia em questão possui ainda a vantagem de proteger indivíduos imunizados contra infecções bacterianas secundárias, responsáveis por grande porcentagem dos quadros complicados e óbitos em pacientes infectados com vírus influenza. Portanto, vacinas compreendendo esses vírus recombinantes, tanto como imunógenos quanto como adjuvante, permitirão contornar os problemas relacionados à frequente incompatibilidade antigênica entre os vírus incluídos na formulação vacinai e aqueles circulantes na população, assim como mitigar problemas relacionados a infecções bacterianas secundárias.
[0010] Adicionalmente, a presente invenção pode ser empregada no campo da pesquisa biomédica como ferramenta para propiciar a expressão tópica de polipeptídios imunomoduladores nas vias aéreas. Assim, a invenção permite avaliar o papel das referidas proteínas imunomoduladoras no estabelecimento, progressão e resolução de processos inflamatórios ou infecciosos no trato respiratório, a exemplo daqueles provocados pelos vírus influenza e por coronavírus.
[0011] Kang e colaboradores demonstraram que a administração de proteínas imunomoduladoras pela via intranasal, mais especificamente interleucina-7 (IL-7), é capaz de induzir resposta profilática contra infecção subsequente por vírus influenza em camundongos. Proteção completa é obtida quando o desafio com o vírus influenza ocorre até 14 dias após tratamento nasal dos camundongos com IL-7 fusionada a Fc (Kang et al. "Intranasal introduction of Fc-fused interleukin-7 provides long-lasting prophylaxis against lethal influenza viras infection." Journal of virology 90.5 (2016): 2273-2284).
[0012] Entretanto, o desenvolvimento de uma vacina contra vírus influenza requer obter uma resposta imunológica heterosubtípica de longa duração, de forma a manter um indivíduo protegido contra exposições subsequentes ao agente infeccioso. Kang e colaboradores demonstram que a administração de IL-7-Fc via intranasal é capaz de promover um ambiente imunológico favorável ao combate a infecções respiratórias, através da proliferação e ativação dos leucócitos nos pulmões. Apesar disso, a estratégia utilizada por esses autores não é capaz de gerar resposta de memória, pois não há estímulo antigênico específico e, portanto, não há ativação das células e fatores de transcrição necessários para que ocorra a diferenciação celular. A formação de uma resposta de memória é dependente da apresentação do antígeno por células apresentadoras de antígeno (APC’s) (e.g. células dendríticas e macrófagos) capazes de ativar as células da imunidade adaptativa, tais como linfócitos T e B, responsáveis pela imunidade de memória de longa duração (Devarajan P, et al. New Insights into the Generation of CD4 Memory May Shape Future Vaccine Strategies for Influenza. Front Immunol. 2016;7:136). De fato, a expressiva redução da proteção após 21 e 35 dias demonstra que o estímulo inespecífico local obtido por Kang e colaboradores é transitório, ao contrário do que ocorre na presença do antígeno virai (Jones PD, Ada GL. Influenza virus-specific antibody- secreting cells in the murine lung during primary influenza viras infection. J Virol. 1986;60(2):614— 619). Como já demonstrado, o estímulo antigênico virai é fundamental para a formação dos tecidos linfoides associados aos brônquios e/ou à região nasal, BALT e NALT respectivamente, importantes para a manutenção das células de memória por longos períodos (Onodera T, et al. Memory B cells in the lung participate in protective humoral immune responses to pulmonary influenza viras reinfection. PNAS 2012; 109(7):2485— 2490).
[0013] Em camundongos, considera-se que a definição de memória imunológica é aquela mensurada após 50 dias após a inoculação (Hye Mee Joo et al. Broad dispersion and lung localization of virus-specific memory B cells induced by influenza pneumonia; Primary and long-term B-cell responses in the upper airway and lung after influenza A viras infection. PNAS 2008, 105 (9) 3485-3490). No entanto, não é possível comparar diretamente a duração da imunidade em humanos com aquela avaliada no modelo animal (camundongo), considerando principalmente as diferenças no tempo de vida e população/fenótipo celular entre ambos, os quais interferem na cinética e duração da resposta imune (Boyden, A.W., Frickman, A.M., Legge, K.L. et al. Primary and long-term B-cell responses in the upper airway and lung after influenza A viras infection. Immunol Res 59, 73-80 (2014)). [0014] Não há relatos na literatura sobre qual seria a duração propícia da resposta heterosubtípica em humanos, porém diversos estudos demonstram que a pré-existência de linfócitos T (CD4+ e/ou CD8+) em indivíduos com ausência de anticorpos de resposta cruzada está relacionada com a redução dos sintomas da doença, da difusão virai e consequentemente, do agravamento da doença. Estas células reconhecem principalmente antígenos internos altamente conservados entre diferentes subtipos de influenza, tais como NB, PB1, Ml e M2 e, embora não sejam capazes de neutralizar a partícula virai, limitam sua replicação nas vias aéreas, reduzindo a morbidade associada à doença e o risco de morte (Wilkinson, T., Li, C., Chui, C. et al. Preexisting influenza-specific CD4+ T cells correlate with disease protection against influenza challenge in humans. Nat Med 18, 274-280 (2012); Sridhar, et al. Cellular immune correlates of protection against symptomatic pandemic influenza. Nat Med 19, 1305-1312 (2013).; Hayward AC, et al. Natural T Cell-mediated Protection against Seasonal and Pandemic Influenza. Results of the Flu Watch Cohort Study. Am J Respir Crit Care Med. 2015 ; 191 (12): 1422—1431). Um estudo recente (2019) utilizou furões, modelo padrão-ouro para infecção por influenza humana, para análise da resposta cruzada induzida por uma infecção prévia. Os autores demonstraram que os animais infectados com uma baixa dose de influenza A H1N1 (100 PFU) foram parcialmente protegidos frente ao desafio com um isolado heterosubtípico H3N2 após 28 dias, com redução dos sintomas e da difusão virai, sugerindo uma proteção mediada por linfócitos T de memória, uma vez que não foram detectados anticorpos neutralizantes anti-H3N2 (Gooch KE, et al. Heterosubtypic cross-protection correlates with cross-reactive interferon- gamma-secreting lymphocytes in the ferret model of influenza. Sei Rep. 2019;9(1):2617). Em outro estudo que propõe o desenvolvimento de uma vacina universal contra o vírus influenza, os autores utilizaram um vírus recombinante codificando diferentes proteínas do vírus e o gene da citocina IL-15 como adjuvante e relataram significativa proteção cruzada contra outros subtipos de influenza 21 dias após a terceira dose da vacinação subcutânea (Valkenburg et al. Protection by universal influenza vaccine is mediated by memory CD4 T cells. Vaccine, 2018, 4198-4206).
[0015] De qualquer maneira, a duração propícia da resposta vacinai heterosubtípica em humanos para desenvolvimento de uma vacina contra influenza deveria ser no mínimo de 2-4 meses, de forma a garantir maior proteção durante a temporada de maior circulação do vírus, que ocorre logo após as campanhas de vacinação.
[0016] O carreamento da proteína imunomoduladora 11-7 por um vírus influenza, como alcançado pela presente invenção, possibilita a produção da referida proteína diretamente nas células infectadas, de forma transiente e localizada, resultando na geração de resposta imune heterosubtípica de memória. Assim, é possível obter proteção contra vírus influenza antigenicamente distintos daquele utilizado na vacinação. Ao contrário dos resultados de Kang et al. , a proteção obtida na presente invenção se mantém mesmo quando o desafio com o vírus é realizado dois meses e meio após a inoculação intranasal, demonstrando que há indução de memória imunológica. O vírus recombinante FluIL-7 se mostrou seguro e incapaz de causar doença nos camundongos inoculados, não há necessidade de revacinação e a proteção heterosubtípica foi observada em tempos mais tardios (30 e 60 dias após a imunização) que os estudos acima mencionados. [0017] Finalmente, é de grande relevância o fato de que a imunização com vírus influenza codificando a IL-7 foi capaz de conferir proteção contra infecção bacteriana secundária causada por Streptococcus pneumoniae. Infecções bacterianas secundárias, sobretudo aquelas causadas por S. pneumoniae , são responsáveis pelas complicações mais graves dos quadros de influenza, resultando em pior prognóstico, sobretudo em crianças e idosos. Um outro aspecto marcante da presente invenção consiste na atuação das proteínas imunomoduladoras em processos inflamatórios ou infecciosos provocados por coronavírus.
[0018] A invenção passará a ser apresentada com maiores detalhes abaixo.
Breve descrição da invenção
[0019] A invenção é, em sua essência, um vírus influenza recombinante defectivo para multiplicação que expressa uma proteína imunomoduladora.
[0020] Em uma modalidade da invenção, a referida proteína imunomoduladora pode ser uma quimiocina ou uma citocina. Preferencialmente, a dita proteína é uma citocina da classe das interleucinas, particularmente, a interleucina 7 (IL-7).
[0021] Em uma forma particular da invenção, o vírus influenza recombinante é obtido a partir de uma construção de ácido nucleico que compreende um gene da neuraminidase (NA) truncado pela remoção de sua porção medial e na qual foi inserida a sequência que codifica a proteína imunomoduladora.
[0022] Em outra modalidade, a construção de ácido nucleico compreende adicionalmente uma região promotora e uma região terminadora heterólogas. Ainda, em uma modalidade da invenção, a referida região promotora é a região promotora da RNA Polimerase I (Pol I) humana.
[0023] Em outra modalidade, a construção de ácidos nucleicos de que trata a invenção é aquela descrita pela SEQ ID NO: 1 correspondente ao plasmídeo pPRNA 166x178.
[0024] Ainda, em uma de suas modalidades, a construção de ácido nucleico de que trata a invenção compreende a sequência terminadora da ribozima do vírus da hepatite delta; seguida de (i) um promotor truncado da Pol I humana; (ii) sequência codificadora dos primeiros 166 nucleotídeos da neuraminidase, em que todas as trincas ATG foram mutadas; (iii) sequência codificadora dos últimos 178 nucleotídeos da neuraminidase (iv) promotor 3’ da neuraminidase; (v) repetição dos últimos 42 nucleotídeos da ORF da neuraminidase; e (vi) promotor truncado da RNA Pol I humana; em que uma sequência codificando uma proteína imunomoduladora está inserida entre os primeiros 166 e os últimos 178 nucleotídeos da neuraminidase.
[0025] Outra modalidade da invenção prevê um vírus influenza recombinante que compreende um gene da neuraminidase truncado, no qual foi inserida a sequência nucleotídica correspondente ao gene de uma proteína imunomoduladora.
[0026] Em uma modalidade, nucleotídeos correspondentes às porções
3’ e 5’ do gene da neuraminidase flanqueiam o gene que codifica uma proteína imunomoduladora de SEQ ID NO: 5.
[0027] Em outras modalidades, nucleotídeos correspondentes às porções 3’ e 5’ do gene da neuraminidase flanqueiam o gene que codifica uma proteína imunomoduladora de SEQ ID NOs: 6 ou 7.
[0028] Uma modalidade adicional compreende um método para preparar um vírus influenza recombinante que, por sua vez, compreende as etapas de (i) preparar a construção de ácido nucleico compreendendo o gene de neuraminidase truncado e o gene da proteína imunomoduladora; (ii) expor células hospedeiras, concomitantemente, à construção da etapa (i) e a um ou mais plasmídeos codificando os segmentos NP, PA, PB1, PB2, Ml, NS e HA do vírus influenza; (iii) recuperar vírus influenza recombinante a partir do sobrenadante.
[0029] Em uma forma particular da invenção, os referidos plasmídeos da etapa (ii) acima codificam cDNA que codificam pelo menos sete segmentos de RNA virai do vírus influenza A/PR8/34 (PR8).
[0030] Em outra modalidade, os referidos plasmídeos da etapa (ii) acima codificam o número mínimo de segmentos de RNA virai necessário para a síntese de partículas virais. Sendo o referido número mínimo de segmentos de RNA virai pelo menos 1, pelo menos 2, pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6 ou pelo menos 7.
[0031] Ainda, em outra modalidade, o método de preparar o vírus influenza recombinante compreende as etapas adicionais de infectar um substrato com o vírus influenza recombinante recuperado na etapa (iii) acima e purificar o vírus do substrato.
[0032] Outra modalidade da invenção se refere a uma composição imunogênica compreendendo o vírus influenza recombinante e um veículo farmaceuticamente aceitável.
[0033] A referida composição imunogênica é, em uma modalidade alternativa, capaz de induzir resposta imune heterosubtípica de longa duração. Ainda, tal composição é preferivelmente administrada pela via intranasal. [0034] Por fim, a invenção também inclui o uso do vírus influenza para preparar uma composição imunogênica para prevenir ou tratar infecções causadas por vírus influenza, por coronavírus e infecções bacterianas secundárias, para ser utilizado como adjuvante em vacinas, ou como ferramenta para propiciar a expressão tópica de polipeptídios imunomoduladores nas vias aéreas.
Breve descrição das figuras
[0035] FIGURA 1: Representação esquemática da construção do plasmídeo pPRNA 166x178 e pPRNA166-IL-7-178 (A) O plasmídeo pPRNA 166x178 é derivado do plasmídeo pPR-NA, o qual contém o cDNA do segmento completo da NA em orientação negativa sob o controle do promotor truncado da polimerase I humana e da ribozima do vírus da hepatite delta. Para obtenção de pPRNA166xl78, primeiramente foram introduzidos um promotor 3’ adicional e um sítio de clonagem Xhol/Nhel nesse plasmídeo. Os últimos 42 nucleotídeos da ORF da NA (quadrado branco) foram então duplicados, para conservar a integridade da extremidade 5’ da neuraminidase ao longo dos seus últimos 70 nucleotídeos, resultando no plasmídeo pPR- NA38. A tnmcagem da NA se deu pela substituição da ORF presente no plasmídeo pelos primeiros 169 nucleotídeos e os últimos 178 nucleotídeos do segmento da NA, flanqueando o sítio múltiplo de clonagem e removendo os nucleotídeos 170-1232. Os primeiros 166 nucleotídeos da NA foram então substituídos por uma sequência contendo todas as trincas ATG (nucleotídeos 20-22; 62-64; 115-117; 163-165) mutadas para a trinca CTA. (B) pPRNA166- IL-7-178 foi obtido a partir da clonagem da sequência heteróloga da interleucina 7 murina (IL-7), construída sob a forma de um gene sintético utilizando a sequência do cDNA correspondente, no sítio de clonagem reconhecido pelas enzimas de restrição Xhol/Nhel.
[0036] FIGURA 2: Genética reversa do vírus influenza. Os vírus recombinantes foram obtidos por genética reversa segundo a metodologia descrita por Kawaoka e colaboradores (Fujii Y, Goto H, Watanabe T, Yoshida T, Kawaoka Y. Proc Natl Acad Sei U S A. 2003 Feb 18;100(4):2002-7), com modificações. Assim, co-culturas de células HEK 293T e MDCK (cultivadas em meio de cultura DMEM com antibióticos e suplementada com 10% SFB) foram co-transfectadas com o plasmídeo codificando um segmento da NA recombinante contendo ou não IL-7 (pPRNA166-IL-7-178 e pPRNA166xl78, respectivamente) e outros sete plasmídeos codificando os demais segmentos do vírus influenza PR8 (NP, PA, PB1, PB2, Ml, NS e HA). Foi utilizado 250 ng de cada plasmídeo em 12 mΐ de Fugene HD (Promega), permitindo a reconstituição de 8 complexos ribonucleoprotéicos funcionais in vivo e, desta forma, a transcrição e a replicação dos segmentos virais. Vinte e quatro horas após a transição, o meio de cultura foi substituído por meio de cultura DMEM com antibióticos e suplementado com tripsina TPCK (SIGMA) e neuraminidase de Vibrio cholerae (SIGMA). Os sobrenadantes foram coletados 72 horas após a transfecção. Após uma etapa de amplificação em células MDCK, os vírus transfectantes foram clonados e posteriormente amplificados em células MDCK. Os vírus influenza recombinantes carreando o segmento NA 166x178 serão doravante denominados Flu-CT (vírus controle), enquanto os vírus carreando o segmento NA166-IL7-178 serão doravante chamados de Flu-IL7.
[0037] FIGURA 3: Caracterização dos vírus influenza recombinantes carreando o gene da interleucina 7 em cultura celular. Os vírus influenza recombinantes defectivos para a multiplicação carreando a sequência da IL-7 murina (Flu-IL7), construídos por genética reversa, foram avaliados quanto à capacidade de produzir IL-7 em cultura celular. (A) Monocamadas de células MDCK foram infectadas com vírus Flu-IL7 ou Flu-CT (m.o.i = 0,001), ou PBS (Mock) na presença de tripsina TPCK e neuraminidase do Vibrio cholerae. O sobrenadante da cinética foi coletado 8h, 24h, 48h, 72h para mensuração de IL-7 por reação enzimática através do ELISA. Os resultados estão representados em gráfico de barras, onde estão plotadas as médias e o erro padrão da média de produção da citocina em cada tempo. No eixo x estão representados os tempos avaliados em horas e no eixo y a produção de citocina em pg/mL. (B). Macrófagos murinos derivados de monócitos de medula óssea foram infectados com PBS (Mock) ou com o vírus Flu-IL7 ou Flu-CT (m.o.i = 0,1 e 0,01). Em tempos previamente determinados, os sobrenadantes das culturas de células MDCK e dos macrófagos foram coletados, clarificados por centrifugação à baixa velocidade e congelados a - 80°C. A produção da IL-7 foi avaliada pela técnica de ELISA em ambos os casos.
[0038] FIGURA 4: Cinética da produção da citocina IL-7 nos pulmões e no lavado bronco-alveolar (BALF) dos camundongos infectados. Camundongos C57BL/6 foram anestesiados e inoculados com diferentes doses de vírus recombinante Flu-IL7 (102-104 pfu/animal pela via intranasal) ou Flu-CT (104 pfu/animal pela via intranasal) em 25 mΐ de PBS. Animais do grupo mock foram inoculados somente com 25 mΐ de PBS. Os animais foram eutanasiados em tempos previamente determinados (12, 24, 48 e 72 horas após a infecção) para a coleta do lavado broncoalveolar e pulmões e quantificação da citocina IL-7 pela técnica de ELISA. Os resultados dos níveis da IL-7 (A) nos pulmões e (B) no lavado bronco-alveolar estão representados.
[0039] FIGURA 5: Vírus influenza recombinantes carreando genes de citocinas murinas como ferramenta para avaliação do seu papel na imunopatogênese. Camundongos C57BL/6, machos, de 8 a 12 semanas, foram anestesiados por via subcutânea com uma mistura de Ketamina (100mg/kg) e Xilazina (10mg/kg) e divididos em grupos que foram inoculados via intranasal com diferentes construções virais diluídas em PBS no volume de 20pL (inoculo) e acompanhados por 17 dias. (A) Avaliação de mortalidade. O inoculo intranasal foi realizado com PBS (Mock), 104 PFU (dose letal) de PR8 ou 104 PFU de PR8 e Flu-CT ou Flu-IL7. As diferenças estatisticamente significativas (p <0,05) no teste log-rank (Mantel-Cox) e Gehan-Breslow-Wilcoxon estão representadas por asterisco (*). Diferenças apenas no teste Gehan-Breslow-Wilcoxon estão representadas por octothorpe (#). (B) Perda de peso total. Os animais foram inoculados via intranasal com PBS (Mock), 102 PFU (dose subletal) de PR8 e/ou 104 PFU Flu-CT ou Flu- IL7. Os resultados estão representados em gráficos Box plot, em que estão plotadas as medianas, Io e 3o quartis e valores mínimo e máximo para cada grupo. (C) Perda de peso por tempo. Os animais foram inoculados via intranasal com PBS (Mock), 102 PFU (dose subletal) de PR8 e/ou 104 PFU Flu-CT ou Flu-IL7. Os resultados estão representados em gráficos de símbolos e linhas, em que estão plotadas as médias e erro padrão da média para cada grupo/tempo. As diferenças estatisticamente significativas (p <0,05) em cada tempo entre o FluCt e o FluIL-7 estão representadas por asterisco (*) [0040] FIGURA 6: Vírus influenza recombinante Flu-IL7 e proteção contra infecções bacterianas secundárias. Camundongos C57BL/6, machos, de 8 a 12 semanas, foram anestesiados por via subcutânea com uma mistura de Ketamina (lOOmg/kg) e Xilazina (10mg/kg) e divididos em grupos (8 animais) que foram imunizados via intranasal (40m L/animal) com 102 PFU/animal de PR8 (dose subletal), PBS lx (Mock) ou coinoculados com 102 PFU/animal de PR8 e 104 PFU/animal de Flu-IL-7 ou de Flu-Ct. Dez dias após a infecção os camundongos foram desafiados com uma dose de 102 CFU/animal de bactérias (gram-positivas) Streptococcus pneumoniae sorotipo ATCC6303. Quarenta e oito horas após o desafio os animais foram eutanasiados e tiveram seus pulmões coletados em ambiente estéril para determinação da carga bacteriana por titulação em placa ágar-sangue. O experimento foi realizado em triplicata. Os dados estão plotados em diagrama de caixa, nos quais estão representadas as medianas e valores mínimo e máximo para cada grupo no eixo x e no eixo y os valores da titulação bacteriana (UFC/pulmão). Diferenças estatisticamente significativas estão representadas por barras e asteriscos, conforme o grau de significância: (*) p=0,01 - 0,05, (**) p= 0,001 - 0,01 e (***) p< 0.001.
[0041] FIGURA 7: Vírus influenza recombinante Flu-IL7 como ferramenta para o desenvolvimento de vacina capaz de conferir proteção heterosubtípica. Camundongos C57BL/6, machos, de 8 a 12 semanas, foram anestesiados por via subcutânea com uma mistura de Ketamina (100mg/kg) e Xilazina (10mg/kg) e divididos em grupos que foram inoculados via intranasal com: (i) PBS; (ii) 104 PFU do vírus Flu-CT; (iii) 104 PFU do vírus Flu-IL7 ou (iv) com uma dose sub-letal (102 PFU) de um vírus influenza de subtipo H3N2. Dois meses e meio após a primo-inoculação, os animais foram desafiados com 5xl02 PFU do vírus de subtipo H3N2 ou inoculados com PBS (Mock). Os animais foram acompanhados por 16 dias para avaliação do peso. (A) Perda de peso total. Os resultados estão representados em gráficos Box plot, em que estão plotadas as medianas, Io e 3o quartis e valores mínimo e máximo para cada grupo. (B) Perda de peso por tempo. Os resultados estão representados em gráficos de símbolos e linhas, em que estão plotadas as médias e erro padrão da média para cada grapo/tempo. As diferenças estatisticamente significativas (p <0,05) entre o grupo imunizado com FluCt e o grupo imunizado com FluIL-7 estão representadas por asterisco (*), as diferenças (p <0,05) em relação ao Mock estão representadas por octothorpe (#). (C) Curva de sobrevivência. Alternativamente, os animais foram inoculados, conforme descrito acima, e desafiados após um mês com uma dose letal de 103 PFU do vírus de subtipo H3N2 ou inoculados com PBS (Mock). Os resultados estão representados em gráficos Staircase, em que estão plotadas curvas de sobrevivência para cada grupo. No eixo x estão representados os tempos avaliados em dias e no eixo y a porcentagem (%) de sobrevivência. As diferenças estatisticamente significativas (p <0,05) no teste log-rank (Mantel-Cox) e Gehan-Breslow-Wilcoxon estão representadas por asterisco (*).
[0042] FIGURA 8. Vírus influenza recombinante Flu-IL7 como ferramenta para o desenvolvimento de vacina capaz de induzir células de memória de longa duração. Camundongos C57BL/6, machos, de 8 a 12 semanas, foram anestesiados por via subcutânea com uma mistura de Ketamina (100mg/kg) e Xilazina (10mg/kg) e divididos em grupos (6 animais) que foram imunizados via intranasal (40pL/animal) com 104 PFU de FluIL-7 ou FluCt ou 102 PFU de PR/8 (dose subletal) ou PBS lx (Mock). Após três semanas (21 dpi) os camundongos foram eutanasiados e tiveram seus pulmões coletados para diferentes análises. Outros grupos de animais sob o mesmo esquema de imunização, foram desafiados após 4 semanas com uma dose subletal de 102 PFU do vírus de subtipo H3N2, os camundongos foram acompanhados por um período de 15 dias para análise de perda de peso e sobrevivência, depois foram eutanasiados e tiveram seus pulmões coletados para diferentes análises. Em ambos os experimentos, foi realizada uma análise ex vivo do perfil fenotípico de células efetoras e de memória nos pulmões por citometria de fluxo, utilizando diferentes painéis de biomarcadores. Foram avaliadas diferentes subpopulações celulares e fenótipos de memória, utilizando diferentes combinações de biomarcadores conjugados a fluorocromos. : linfócitos T (CD3+CD4+ ou CD3+CD8+), T efetores (CD44+), T memória efetora (CD44+CD62L-CD127+) (TEF), T memória central (CD44+CD62L+) (TCM) e T memória central de longa duração (CD44+CD62L+CD127+) (TCMLD), T residentes de memória (CD69+CD103) (TRM), linfócitos B (CD19+), memória e ativação de células B (CD62L, CD80, CD27). Os gráficos de “Assinaturas de biomarcadores” representam a porcentagem de indivíduos com frequência celular acima ou abaixo da mediana global dos grupos. As regiões destacadas por cores representam as populações que apresentaram frequência acima da mediana global dos grupos em mais de 50% de indivíduos avaliados (ordem crescente). As diferenças estatisticamente significativas (p <0,05) entre os grupos estão representadas por asterisco (*). O diagrama de Venn representa as principais diferenças observadas em cada grupo e entre os grupos na análise de “Assinaturas de biomarcadores”. As diferenças estatisticamente significativas (p <0,05) entre o grupo FluIL-7e FluCt estão representadas por asterisco (*). O aumento (p <0,05) da frequência de subpopulações no grupo PR/8 em relação à ambos os grupos vacinais FluIL-7e FluCt, estão representadas por ochtothorpe (#).
Descrição detalhada da invenção
[0043] A não ser que sejam definidos de maneira diferente, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados têm o mesmo significado entendido por um técnico no assunto ao qual a invenção pertence. As técnicas convencionais de biologia molecular e imunologia são bem conhecidas de um técnico no assunto. O relatório descritivo também provê definições de termos para auxiliar na interpretação daquilo que é aqui descrito e das reivindicações. A não ser que seja indicado de forma diferente, todos os números expressando quantidades, porcentagens e proporções, e outros valores numéricos usados no relatório descritivo e nas reivindicações, devem ser entendidos como sendo modificados, em todos os casos, pelo termo “cerca de”. Assim, a não ser que seja indicado o contrário, os parâmetros numéricos mostrados no relatório descritivo e nas reivindicações são aproximações que podem variar, dependendo das propriedades a serem obtidas.
DEFINIÇÕES
[0044] Os termos “ácido nucleico, polinucleotídeo, sequência de polinucleotídeo” e “sequência de ácido nucleico” referem-se a polímeros de desoxirribonucleotídeo ou ribonucleotídeo de filamento único ou de filamento duplo ou quimeras ou análogos destes. A menos que de outro modo indicado, uma sequência particular de ácido nucleico desta invenção abrange sequências degeneradas e sequências complementares, além da sequência explicitamente indicada.
[0045] O termo “gene” é amplamente usado para se referir a qualquer polinucleotídeo que codifica uma instrução relativa a uma função biológica. De modo geral, genes compreendem sequências codificadoras e podem, ainda, conter regiões não codificadoras, que regulam a expressão da porção codificadora. O termo “gene” aplica-se a uma sequência genômica específica, a um RNA mensageiro (mRNA) codificado por uma sequência genômica e a um DNA complementar (cDNA) a um mRNA.
[0046] As regiões não codificadoras de genes podem incluir um ou mais segmentos que, por exemplo, formam sequências de reconhecimento para outras proteínas. Tais segmentos não codificadores incluem “promotores” e “amplificadores,” para que as proteínas reguladoras tais como fatores de transcrição se liguem, resultando na transcrição de sequências adjacentes ou vizinhas.
[0047] “Promotor” ou “sequência promotora” refere-se a uma sequência de DNA cuja função é regular a expressão de um gene, iniciando a transcrição de uma sequência de ácido nucleico ao qual está funcionalmente ligado. A regulação de expressão do gene pode ser determinada de forma temporal, espacial e/ou fisiológica.
[0048] O termo “construção” denota uma sequência polinucleotídica contendo pelo menos um gene funcionalmente ligado a pelo menos um promotor. “Por funcionalmente ligado” entende-se que um promotor está posicionado em relação a uma sequência codificadora de tal forma que o promotor dirija ou regule a expressão do ácido nucleico. A referida construção pode ser posteriormente introduzida em um vetor de expressão. Tanto a construção em si quanto o vetor de expressão podem ser subsequentemente introduzidos em uma célula hospedeira para promover a expressão de um ou mais genes.
[0049] Um “vetor de expressão” é um vetor, tal como um plasmídeo, que é capaz de promover a expressão, por exemplo, transcrição, de uma sequência de polinucleotídeos codificante incorporada nele. Os vetores de expressão podem ser de replicação autónoma ou que não replicam de modo autónomo. Tipicamente, a sequência do polinucleotídeo a ser expresso é “funcionalmente ligado” a um promotor e/ou amplificador que regula sua transcrição.
[0050] O termo “introduzido”, quando referente a um gene heterólogo ou polinucleotídeo isolado, refere-se à incorporação de um polinucleotídeo em uma célula eucariótica ou procariótica onde o ácido nucleico pode ser incorporado no genoma da célula (por exemplo, DNA cromossômico, plasmídico, plastídeo ou mitocondrial), convertido em um replicon autónomo ou transitoriamente expresso (por exemplo, mRNA transfectado). O termo inclui tais métodos como “infecção,” “transfecção,” “transformação” e “transdução.” No contexto da invenção, uma variedade de métodos pode ser utilizada para introduzir polinucleotídeos em células eucarióticas, incluindo eletroporação, transfecção mediada por lipídeo (lipofecção), microinjeção, transferência mediada por vírus, etc. [0051] O termo “codificar,” como aqui usado, refere-se à propriedade de um ácido nucleico, por exemplo, ácido desoxirribonucleico (DNA), para transcrever um ácido nucleico complementar, incluindo um ácido nucleico que pode ser traduzido em um polipeptídeo. Por exemplo, um DNA pode codificar um ácido ribonucleico (RNA) que é transcrito a partir daquele DNA. Similarmente, o DNA pode codificar um polipeptídeo traduzido a partir de um RNA transcrito do DNA.
[0052] O termo “truncado”, conforme usado ao longo do presente relatório, denota a interrupção de uma cadeia polinucleotídica ou polipeptídica, impedindo o funcionamento fisiológico esperado da referida sequência truncada. Por exemplo, um gene de neuraminidase truncado, conforme aqui descrito, corresponde a sequência polinucleotídica que codifica uma neuraminidase que foi interrompida pela remoção de um fragmento medial da sequência nativa.
[0053] O termo “célula hospedeira” significa uma célula no qual um ácido nucleico foi introduzido, tal como um vetor, e inclui também a progene desta célula que também possua este ácido nucleico. As células hospedeiras podem ser células procarióticas, como células bacterianas, ou eucarióticas, como, por exemplo, células de levedura, de inseto, de anfíbios, de aves ou de mamíferos.
[0054] O termo “recombinante” indica que o material (por exemplo, um ácido nucleico ou proteína) foi artificial ou sinteticamente (não naturalmente) modificado pela intervenção humana. Especificamente, quando da referência a um vírus, por exemplo, um vírus da influenza, o vírus é recombinante quando o mesmo é produzido pela expressão de um ácido nucleico recombinante.
[0055] O termo “composição imunogênica” denota uma preparação que contém uma substância capaz de induzir uma resposta imunológica, humoral e/ou celular, de memória contra uma ou mais doenças. De modo geral, a substância indutora de resposta, comumente denominada de “antígeno”, costuma ser parte ou o todo do agente causador da doença da qual se deseja proteger.
[0056] A capacidade de um antígeno induzir uma resposta imunológica é dita “imunogenicidade”. Por exemplo, composição imunogênica contra infecções causadas pelos diversos tipos de vírus influenza podem ser produzidas a partir de proteínas estruturais do(s) subtipo(s) virai (virais) contra os quais se deseja proteção. Altemativamente, as referidas vacinas podem ser produzidas com vírus íntegros, porém, inativados ou com capacidade infecciosa atenuada.
[0057] A resposta imunológica gerada por um antígeno pode ser específica para um agente causador de doença ou pode ser capaz conferir proteção contra mais de um agente. Particularmente no caso de composições imunogênicas contra o vírus influenza, cada antígeno pode gerar uma resposta contra uma única estirpe virai. Quando um único antígeno é capaz de gerar resposta imunológica contra diversas estirpes de outros subtipos de vírus influenza, a resposta imunológica é então denominada “heterosubtípica”. [0058] A resposta heterosubtípica de longa duração é definida como uma resposta que ativa memória imunológica, protegendo contra vírus influenza antigenicamente distintos 2 meses ou mais após o tratamento.
[0059] A resposta imunológica a um antígeno pode se tomar mais eficaz quando a composição imunogênica contém um ou mais adjuvantes. No presente contexto, adjuvantes são substâncias de origem sintética, orgânica ou inorgânica, ou biológica que aumentam a eficácia de uma resposta imunológica quando administradas juntamente com um antígeno.
[0060] Ainda, proteínas imunomoduladoras podem fazer parte de uma composição imunogênica capaz de induzir resposta imune heterosubtípica da presente invenção. Neste contexto, o termo “proteína imunomoduladora” denota um polipeptídeo com atividade biológica regulatória sobre o funcionamento de células do sistema imunológico.
[0061] Portanto, uma proteína imunomoduladora pode ser empregada para restaurar o equilíbrio natural ou para intensificar a atividade do sistema imunológico de um paciente. Conforme desejável na presente invenção, a proteína imunomoduladora aumenta a atividade do sistema imunológico, contribuindo para a resposta gerada contra o antígeno. A grosso modo, proteínas imunomoduladoras incluem quimiocinas e citocinas como, por exemplo, MIP-1 ( Macrophage Inflammatory Protein ), MCP-1 ( Monocyte Chemoattractant Protein ), G-CSF ( Granulocyte-colony stimulating factor ), GM-CSF ( Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor ), TNF-a (Tumor Necro sis Factor ), interferons e interleucinas.
[0062] Composições imunogênicas podem ser formuladas para qualquer maneira de administração incluindo, por exemplo, oral, intranasal ou parenteral. O termo parenteral, conforme usado aqui, inclui injeção subcutânea, intradérmica, intravascular (por exemplo, intravenosa), intramuscular, espinhal, intracraniana, intratecal e intraperitoneal, bem como qualquer técnica de injeção ou infusão similar. Em certas modalidades, a administração por via intranasal pode ser preferida.
MODALIDADES
[0063] A presente invenção representa um avanço sobre o estado da arte ao fornecer um vírus influenza recombinante, defectivo para multiplicação, capaz de gerar resposta imunológica heterosubtípica de longa duração.
[0064] Sem qualquer intenção de limitar a amplitude inferencial dos fenômenos aqui representados experimentalmente, os inventores demonstraram que a expressão de IL-7 concomitantemente à exposição ao vírus influenza in vivo em um indivíduo confere proteção de longa duração contra outros subtipos do referido vírus e contra infecções bacterianas secundárias, podendo ser utilizada também no tratamento de infecções causadas por coronavíras, como, por exemplo, os coronavíras associados a síndromes respiratórias agudas graves (SARS-CoV e SARS-CoV-2).
[0065] A expressão concomitante de IL-7 foi alcançada pela introdução de um gene codificando tal citocina entre segmentos que codificam as porções 3’ e 5’ da neuraminidase virai. Devido à truncagem do gene da neuraminidase pela remoção de sua porção medial, o vírus influenza recombinante tomou-se defectivo para multiplicação sendo, portanto, incapaz de se multiplicar in vivo.
[0066] Outras estratégias podem ser exploradas para o desenvolvimento de víms influenza recombinantes defectivos para a multiplicação. Isto inclui a mutação de sequências do NS responsáveis pelo processamento do RNA mensageiro em NS1 e NS2 (Wolschek, M. et al. Establishment of a chimeric, replication-deficient influenza A virus vector by modulation of splicing efficiency. J Virol 85, 2469-2473, 2011), deleção da sequência codificadora da proteína da hemaglutinina (HA) (Watanabe, T., Watanabe, S., Noda, T., Fujii, Y. & Kawaoka, Y. Exploitation of nucleic acid packaging signals to generate a novel influenza virus-based vector stably expressing two foreign genes. J Virol77, 10575-10583, 2003) ou da proteína PB2 (Uraki, R. et al. A Bivalent Vaccine Based on a PB2-Knockout Influenza Vims Protects Mice From Secondary Pneumococcal Pneumonia. J Infect Dis 212, 1939-1948, 2015). Nestes casos, faz-se necessário o uso de linhagens celulares, constitutivamente transfectadas para produzirem a HA ou PB2 virais ou de células que não produzem interferon (em se tratando do vírus influenza com segmento NS modificado).
[0067] Um técnico no assunto compreenderá que os experimentos aqui descritos são representativos de um conceito que engloba (i) uma constmção de ácido nucleico compreendendo um gene da neuraminidase truncado no qual foi inserida a sequência que codifica uma proteína imunomoduladora; (ii) um vírus influenza recombinante compreendendo a construção de ácidos nucleicos (i); um método para preparar o vírus influenza recombinante; (iii) uma composição imunogênica; e (iv) o uso do vírus influenza recombinante, como imunógeno ou adjuvante, para preparar uma vacina para prevenir infecções causadas por vírus influenza e infecções bacterianas secundárias ou como ferramenta para propiciar a expressão tópica de polipeptídios imunomoduladores nas vias aéreas. Adicionalmente, a invenção também engloba o uso do vírus influenza recombinante no preparo de uma vacina terapêutica em infecções causadas por coronavírus.
[0068] Em certas formas de realização, o vírus é um vírus da influenza do tipo A ou B, tendo segmentos de RNA virai (vRNA) derivados de um ou mais do que um vírus percursor. Em certas formas de realização, o vírus influenza recombinante é um vírus defectivo para multiplicação.
[0069] Em certas formas de realização, o vírus influenza recombinante é defectivo para multiplicação por possuir uma neuraminidase truncada, que não é funcional. Ainda, a neuraminidase do vírus influenza recombinante não é funcional devido à remoção de sua porção medial (nucleotídeos 170-1232).
[0070] Em algumas formas de realização, a proteína heteróloga produzida pelo vírus é uma proteína imunomoduladora. Nestas modalidades, a referida proteína imunomoduladora pode ser uma quimiocina. Em formas alternativas, a proteína imunomoduladora pode ser uma citocina. Preferencialmente, a proteína imunomoduladora é uma interleucina (IL) como, por exemplo, IL-15, IL-17, IL-4, IFN-G e, particularmente, IL-7.
[0071] Para os fins desta invenção, a sequência nucleotídica que codifica a IL-7 origina, preferencialmente, uma IL-7 de mesma origem biológica que o indivíduo que se deseja proteger ou tratar de uma infecção por vírus influenza ou por coronavírus. Por exemplo, para proteger um indivíduo humano, a sequência nucleotídica que codifica a IL-7 utilizada na construção da invenção codifica uma IL-7 humana. Da mesma forma, para a proteção de porcos, utiliza-se IL-7 suína. Ilustrativamente, a aplicação da construção descrita é exemplificada adiante utilizando o homólogo murino da IL-7, pois, em fase experimental de desenvolvimento da tecnologia, sua eficácia foi avaliada em modelo murino de infecção por vírus influenza. Neste sentido, será evidente para o técnico no assunto a utilização da sequência nucleotídica que codifica a IL-7 adequada à construção desejada.
[0072] Sequências nucleotídicas que codificam IL-7 humana ou homólogos, por exemplo, de camundongo (murina), suínos, equinos, rato ou macaco rhesus são conhecidas do técnico no assunto. Em algumas espécies (ex. humanos e camundongos), há relatos de que o produto transcrito do gene da IL-7 está sujeito a processamentos pós-transcricionais ( splicing ) alternativos, resultando em mais de uma variante. A despeito das variações, as sequências correspondentes podem ser encontradas em repositórios públicos, como, por exemplo, no GenBank, sob os números de acesso NM_000880.4 {Homo sapiens ; variante de transcrição 1; SEQ ID NO: 2), NM_214135.2 ( Sus scrofa domesticus SEQ ID NO 3), NM_008371.5 {Mus musculus variante de transcrição 1; SEQ ID NO: 4), NM_013110 ( Ratus novergicus), NM_001032846 {Macaca mulatta ) e XM_519820 {Pan troglodytes; variante de transcrição 1).
[0073] Os polipeptídeos derivados das sequências nucleotídicas que codificam IL-7 também estão disponíveis em bancos de dados públicos e são conhecidos do técnico no assunto. Por exemplo, a variante de transcrição 1 do gene da IL-7 humana, quando traduzida, produz uma proteína de 177 aminoácidos, sendo que os aminoácidos 1-25 da porção N-terminal compõem um peptídeo sinal que é clivado durante o processamento pós-traducional da proteína. Assim, o polipeptídeo maduro da IL-7 corresponde a uma sequência de 152 aminoácidos (SEQ ID NO: 5).
[0074] O técnico no assunto compreenderá que o componente do efeito técnico da presente invenção atribuído à IL-7 está centrado na capacidade da IL-7 se ligar ao receptor de IL-7 (IL-7R) e transduzir um sinal através do referido receptor. Portanto, será evidente para o técnico no assunto que a sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína imunomoduladora, particularmente uma IL-7, pode ser uma sequência que codifique qualquer polipeptídeo capaz de, neste caso, interagir com e ativar o IL-7R.
[0075] A presente invenção engloba moléculas de ácidos nucleicos contendo porções que codificam uma IL-7, em que as ditas porções são sequências de ácidos nucleicos com pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idênticas às sequências de ácidos nucleicos descritas pelas SEQ ID NO: 2, 3 ou 4. As moléculas de ácidos nucleicos que são pelo menos 95% idênticas àquela representada pela SEQ ID NO: 2 são particularmente preferidas.
[0076] Em outra forma de realização, a invenção faz uso de sequências de ácido nucleico que codificam uma IL-7 que são pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idênticas às sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 5, 6 ou 7.
[0077] Em certa modalidade da invenção, a sequência nucleotídica que codifica uma proteína imunomoduladora, preferencialmente uma IL-7, é introduzida em um vetor de expressão compreendendo a sequência correspondente ao gene de neuraminidase virai truncado. De modo geral, a sequência que codifica a proteína imunomoduladora, preferencialmente uma IL-7, é introduzida entre sequências nucleotídicas correspondentes às regiões 3’ e 5’ do gene da neuraminidase. Particularmente, a sequência que codifica a proteína imunomoduladora, preferencialmente uma IL-7, é introduzida imediatamente após o 166° nucleotídeo, sentido 3’ -5’, da sequência que codifica a neuraminidase.
[0078] Particularmente, o vetor que codifica a neuraminidase truncada é o pPRNA166xl78 (SEQ ID NO: 1). O referido vetor contém a ORF da referida neuraminidase em orientação negativa. A expressão da neuramidase está impossibilitada devido à remoção de sua porção medial (nucleotídeos 170-1232) e substituição de todas as trincas ATG dos primeiros 166 nucleotídeos para a trinca CTA (nucleotídeos 20-22; 62-64; 115-117; 163- 165). Um técnico no assunto reconhecerá que a sequência nucleotídica que codifica uma proteína imunomoduladora, preferencialmente uma IL-7, pode ser introduzida no plasmídeo pPRNA 166x178 através de técnicas de DNA recombinante, com apoio das enzimas de restrição Xhol/Nhel.
[0079] Assim, em uma modalidade particular da invenção, o vetor pPRNA 166x178, no qual uma sequência nucleotídica que codifica uma IL-7 foi introduzida imediatamente após o 166° nucleotídeo, sentido 3’ -5’, da sequência que codifica a neuraminidase do vírus WSN, denominado pPRNA166-IL-7-178, corresponde à SEQ ID NO: 9.
[0080] Em certas formas de realização, os métodos da invenção compreendem introduzir uma pluralidade de vetores, cada um dos quais incorpora uma porção de um vírus influenza em uma população de células hospedeiras capazes de suportar a replicação virai. As células hospedeiras podem ser cultivadas sob condições permissíveis para o crescimento virai, e o vírus influenza pode ser recuperado.
[0081] Em certas formas de realização, um método de produzir vírus recombinantes compreendendo um genoma de RNA segmentado é fornecido, método este que compreende as etapas de: a) introduzir em um ou mais vetores de expressão contendo o cDNA virai correspondente a cada gene no genoma virai; b) introduzir os referidos vetores de expressão em uma célula hospedeira ou uma população de células hospedeiras; c) incubar referidas células hospedeiras; e d) isolar uma população de vírus influenza recombinante.
[0082] A introdução do ácido nucleico em uma célula ou população de células hospedeiras resulta na transcrição do RNA genômico do vírus influenza, e, na presença de proteínas adequadas da influenza, o transcrito de RNA pode ser empacotado em um vírus da influenza recombinante defectivo para multiplicação.
[0083] Em algumas formas de realização, a célula hospedeira é selecionada do grupo que consiste de células Vero, células Per.Có, células BHK, células PCK, células MDCK, células MDBK, células 293 (por exemplo, células HEK 293T, e células COS. Em algumas formas de realização, emprega-se uma população de células hospedeiras obtida através do co-cultivo de uma mistura de pelo menos duas destas linhagens celulares, por exemplo, uma combinação de células HEK 293T e MDCK.
[0084] Em certas formas de realização, os vetores de expressão são transfectados nas células por eletroporação. Em certas formas de realização, os vetores de expressão são introduzidos nas células pela transfecção em células na presença de um reagente de transfecção lipossômica ou por meio da precipitação de fosfato de cálcio. Em certas formas de realização, os vetores de expressão são plasmídeos.
[0085] Em certas formas de realização, os vetores de expressão compreendem um vetor de expressão para a expressão de todos os segmentos de RNA genômico necessários para a síntese de partículas virais deficientes para multiplicação, vetores de expressão que codificam separadamente cada segmento de RNA genômico necessários para a síntese de partículas virais deficientes para multiplicação, ou os RNAs mensageiros correspondentes. Em certas formas de realização, a expressão de cada segmento de RNA genômico ou RNA codificado está sob o controle de uma sequência promotora derivada de um promotor de Pol I humana.
[0086] Em algumas formas de realização dos métodos descritos acima, os vírus influenza recombinantes podem ser recuperados da cultura das células hospedeiras que incorporam os plasmídeos do genoma da influenza. Em algumas formas de realização, a recuperação dos vírus recombinantes envolve a exposição das células hospedeiras a condições de lise celular. Em modalidades adicionais, as condições de lise celular compreendem a adição de enzimas digestivas e/ou uma neuraminidase exógena funcional. Ainda, a enzima digestiva pode ser tripsina e a neuraminidase funcional pode ser derivada de Vibrio cholerae.
[0087] Os métodos podem compreender adicionalmente uma etapa de infectar um substrato com o vírus influenza recombinante recuperado e purificar o vírus do substrato.
[0088] Em uma forma de realização, um ou mais vetores de expressão que codificam segmentos de RNA virai do vírus influenza necessários para a síntese de partículas virais deficientes para multiplicação são transfectados em células hospedeiras adequadas concomitantemente à construção de ácidos nucleicos da presente invenção.
[0089] Em uma forma particular da invenção, os referidos vetores de expressão compreendem cDNA que codifica o número mínimo de segmentos de RNA virai necessário para a síntese de partículas virais.
[0090] Em uma forma de realização, vetores de expressão que compreendem cDNA que codifica pelo menos sete segmentos de RNA virai do vírus influenza (isto é, NP, PA, PB1, PB2, Ml, NS e HA) são transfectados em células hospedeiras adequadas concomitantemente à construção de ácidos nucleicos da presente invenção.
[0091] Em uma forma particular da invenção, os referidos vetores de expressão codificam cDNA que codifica pelo menos sete segmentos de RNA virai do vírus influenza A/PR8/34 (PR8), conforme descrito por de Wit et al (de Wit, E. et al. Efficient generation and growth of influenza virus A/PR/8/34 from eight cDNA fragments. Virus research, v. 103, n. 1-2, p. 155- 161, 2004).
[0092] A invenção também prevê o uso de um vírus obtido pelos métodos de qualquer uma das modalidades descritas acima para preparar uma composição imunogênica para prevenir infecções causadas por vírus influenza e infecções bacterianas secundárias ou tratar infecções causadas por coronavírus, tanto como imunógeno quanto como adjuvante em combinação com outro imunógeno ou fármaco com atividade anti virai. Além do referido vírus influenza recombinante, as composições imunogênicas ora requeridas também podem incluir excipientes e/ou veículos.
[0093] Tipicamente, o veículo ou excipiente é aquele farmaceuticamente aceitável, que, de modo exemplificativo, porém, não limitado, pode ser: água estéril, solução salina aquosa, soluções salinas aquosas tamponadas, soluções aquosas de dextrose, soluções aquosas de glicerol, etanol, fluído alantóico de ovos de galinhas não infectadas (isto é, fluido alantóico normal “NAF”) ou combinações destes. A preparação de tais soluções que garantem a esterilidade, pH, isotonicidade e estabilidade é efetuada de acordo com protocolos estabelecidos na técnica.
[0094] Opcionalmente, a formulação para a administração do vírus da influenza ou subunidades deste, também contém um ou mais adjuvantes para realçar a resposta imune aos antígenos da influenza. O arsenal de adjuvantes conhecidos do técnico versado na arte inclui: saponina, géis minerais tais como hidróxido de alumínio, substâncias ativas na superfície celular tais como lisolecitina, polióis plurônicos, poliânions, peptídeos, emulsões oleosas ou de hidrocarboneto, bacilo Calmette-Guerin (BCG) e Corynebacterium parvum.
[0095] Em certas modalidades, as composições imunogênicas estarão geralmente em forma aquosa. No entanto, algumas composições podem estar na forma seca e na forma de sólidos injetáveis ou preparações secas ou polimerizadas em um adesivo. As composições imunogênicas podem incluir conservantes tais como tiomersal ou 2-fenoxietanol.
[0096] Em certas modalidades, as composições imunogênicas podem incluir um ou mais tampões. Tampões típicos incluem: tampão fosfato, Tris, tampão borato, tampão succinato, tampão histidina (particularmente com um adjuvante de hidróxido de alumio), ou tampão citrato. O pH de uma composição imunogênica estará, geralmente, entre 5,0 e 8,1, e mais tipicamente entre 6,0 e 8,0 e. 6,5 e 7,5, ou entre 7,0 e 7,8. Um método da invenção pode, portanto, incluir uma etapa de ajuste do pH da composição imunogênica a granel antes da embalagem.
[0097] A composição imunogênica pode ser uma composição terapêutica ou, altemativamente, uma vacina profilática sistemicamente administrada ou utilizada como imunoterápico, por exemplo, pela injeção subcutânea ou intramuscular usando uma agulha e seringa ou um dispositivo de injeção sem agulha. Altemativamente, a formulação de vacina é administrada intranasalmente, por gotas, aerossol de partícula grande (mais do que cerca de 10 micrometros) ou pulverização no trato respiratório superior. Embora qualquer uma das vias acima de liberação resulte em uma resposta imune sistémica, a administração intranasal confere o benefício adicional de evocar imunidade de mucosa no local de entrada do víms da influenza.
[0098] No geral, os víms influenza recombinantes da invenção são administrados em uma quantidade suficiente para estimular uma resposta imune específica para um ou mais subtipos do víms da influenza. Preferencialmente, a administração do víms da influenza evoca uma resposta imune heterosubtípica protetora.
[0099] Ainda, os víms influenza recombinantes da invenção podem ser administrados em uma quantidade suficiente para estimular uma resposta imune terapêutica contra infeção por Coronavíms.
[00100] Dosagens e métodos para evocar uma resposta imune protetora contra uma ou mais estirpes de vírus influenza são conhecidos por aqueles de habilidade na técnica.
[00101] A presente invenção é descrita pelos exemplos não limitantes abaixo, que são meramente ilustrativas. Várias modificações e variações das concretizações são evidentes ao técnico no assunto, sem se afastar do espírito e do escopo da invenção.
EXEMPLOS
EXEMPLO 1: CONSTRUÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DOS VÍRUS INFLUENZA RECOMBINANTES
[00102] O plasmídeo pPRNA 166x178 codifica um segmento truncado da neuraminidase em que todos as trincas ATG dos primeiros 166 nucleotídeos da região 3" (nucleotídeos 20-22; 62-64; 115-117; 163-165) foram mutadas para a trinca CTA. Esse segmento é seguido por um sítio múltiplo de clonagem e pelos últimos 178 nucleotídeos da região 5 "do segmento da neuraminidase. A sequência codificadora da citocina murina IL-7 foi construída sob a forma de um gene sintético pela empresa GENSCRIPT (Hong Kong) baseado na sequência de cDNA, tendo sido otimizada para a expressão em células murinas (SEQ ID NO: 8), sem alteração nos aminoácidos codificados pela sequência (SEQ ID NO: 6). A sequência otimizada foi clonada no plasmídeo pPR 166x178 no sítio múltiplo de clonagem, dando origem ao vetor pPRNA 166-IL-7- 178 (SEQ ID NO: 9). Esse tipo de construção permite a produção da citocina IL-7 na sua forma nativa dentro da célula infectada, haja vista que as mutações no segmento da neuraminidase acima descritas fazem com que não ocorra a produção de qualquer peptídeo oriundo dessa proteína.
[00103] O plasmídeo pPRNA166xl78 foi construído a partir do plasmídeo pPR-NA. pPR-NA é um plasmídeo de transferência contendo o cDNA que codifica o segmento selvagem da neuraminidase do vírus WSN. Sua construção foi descrita previamente (Machado, A., N. Naffakh, S. van der Werf, and N. Escriou. 2003. Virology 313:235-249). Este plasmídeo contém o segmento da neuraminidase clonado em orientação negativa no plasmídeo de transferência pPR7 entre a sequência truncada do promotor da polimerase I humana (pol I) e a sequência da ribozima do vírus da hepatite delta. Este tipo de construção permite a síntese de uma molécula de RNA virai sintética nas células transfectadas.
[00104] pPR-NA foi modificado sucessivamente até resultar no plasmídeo pPRNA 166x178: (i) Primeiramente, a região promotora 3' da neuraminidase foi amplificada e inserida após a ORF da neuraminidase presente no plasmídeo, juntamente com um sítio múltiplo de clonagem Xhol / Nhe I; (ii) A seguir, para conservar a integridade da extremidade 5" da neuraminidase ao longo dos seus últimos 70 nucleotídeos, os últimos 42 nucleotídeos da ORF da neuraminidase foram amplificados e inseridos na extremidade 5 "da neuraminidase já clonada no plasmídeo, resultando no plasmídeo pPR-NA38 (Vieira Machado A, et al. Recombinant influenza A viruses harboring optimized dicistronic NA segment with an extended native 5' terminal sequence: induction of heterospecific B and T cell responses in mice. Virology. 2006 Feb 5;345(l):73-87) (iii) A neuraminidase do plasmídeo pPR-NA38 foi então substituída por uma neuraminidase truncada (devido à remoção dos nucleotídeos 170-1232). Para tanto, os primeiros 169 nucleotídeos da região 3' e dos últimos 178 nucleotídeos da região 5" do segmento da neuraminidase foram amplificados a partir da sequência de neuraminidase presente no plasmídeo pPR-NA. Esses dois produtos de amplificação foram sucessivamente clonados, substituindo a ORF da neuraminidase previamente clonada e flanqueando o sítio múltiplo de clonagem previamente introduzido; (iv) para impedir a expressão dos peptídeos codificados pelos 169 nucleotídeos da região 3' da neuraminidase, um gene sintético com todos as trincas ATG dos primeiros 166 nucleotídeos da região 3' da neuraminidase mutadas (nucleotídeos 20-22; 62-64; 115-117; 163-165), construído pela empresa GENSCRIPT (Hong Kong), foi clonado no sítio múltiplo de clonagem do plasmídeo acima descrito, substituindo a região 3’ da neuraminidase previamente clonada no plasmídeo, resultando finalmente no plasmídeo pPRNA 166x178. [00105] Os plasmídeos codificando os demais segmentos do vírus A/PR8/34 (PR8) foram gentilmente fornecidos pelo Dr. Ron Fouchier do Instituto Erasmus de Rotterdam (Holanda) mediante acordo de transferência de material.
[00106] Os vírus influenza recombinantes foram obtidos por genética reversa de acordo com a técnica mostrada na figura 2 e descrita previamente por Kawaoka e colaboradores (Fujii Y et al, Selective incorporation of influenza viras RNA segments into virions. Proc Natl Acad Sei U S A. 2003 Feb 18; 100(4): 2002-7). Resumidamente, co-culturas de monocamadas subconfluentes de células HEK 293T e células MDCK cultivadas em meio de Dulbecco modificado (DMEM) em presença de 10% de soro fetal bovino e antibióticos foram co-transfectadas com: 1) o plasmídeo codificando um segmento recombinante da neuraminidase, com ou sem IL-7 (pPRNA166-IL- 7-178 e pPRNA166xl78, respectivamente) e 2) os plasmídeos codificando os demais (sete) segmentos do vírus influenza, PR8. Desta forma, oito complexos ribonucleoproteicos foram reconstituídos in vitro, permitindo a transcrição e a replicação de todos os segmentos virais e a síntese de novas partículas virais. Vinte horas após a transfecção, o meio de cultura foi substituído por DMEM suplementado com 1 pg/ml de tripsina TPCK (SIGMA) e 300 pU/ml de neuraminidase do Vibrio cholerae (a qual supre a falta da neuraminidase virai, permitindo a liberação das partículas virais neoformadas). Após 72 horas de incubação a 37°C, os sobrenadantes das células transfectadas foram coletados. Os vírus recombinantes obtidos carreando o gene da IL-7 (Flu-IL7) e o respectivo vírus controle, sem IL-7 (Flu-CT) foram amplificados e purificados duas vezes por diluição limite (maior diluição na qual observamos efeito citopático) em células MDCK, antes de serem submetidos a uma amplificação final nesta mesma linhagem celular. Todos os estoques virais assim obtidos tiveram o seu título infeccioso determinado por titulação por placa de lise sob agarose em células MDCK. O genótipo dos vírus recombinantes foi avaliado por PCR e sequenciamento e não evidenciaram qualquer deleção ou mutação no genoma virai.
[00107] A produção da IL-7 nas células infectadas pelo vírus Flu-IL7 foi avaliada pela técnica de ELISA. Para esse fim, monocamadas de células MDCK foram infectadas com o vírus Flu-IL7 ou Flu-CT na multiplicidade de infecção (M.O.I) de 1/1000. Os sobrenadantes das culturas celulares foram coletados em diferentes tempos após a infecção. Conforme mostrado na figura 3A, foi possível detectar a produção da IL-7 nas células infectadas a partir de 48 horas após a infecção; o pico de produção dessa citocina foi detectado 72 horas após a infecção, sendo da ordem de 800 pg/ml.
[00108] Os macrófagos exercem importante papel como células apresentadoras de antígeno no trato respiratório, além de produzirem mediadores inflamatórios importantes na defesa antiviral. A fim de avaliarmos a capacidade do vírus Flu-IL7 em infectar macrófagos, monócitos murinos presentes na medula óssea foram diferenciados em macrófagos e infectados com a M.O.I 0,1 ou 0,01 de vírus recombinante, na presença de neuraminidase. Conforme mostrado na figura 3B, a produção da IL-7 nos macrófagos foi detectada 24 horas após a infecção com o vírus Flu-IL7 utilizando a M.O.I 0,1. Esses resultados evidenciam a capacidade do vírus Flu-IL7 de infectar os macrófagos, nos quais são capazes de expressar a citocina IL-7.
EXEMPLO 2: AVALIAÇÃO DA PRODUÇÃO DA IL-7 EM CAMUNDONGOS INFECTADOS COM O VÍRUS FLU-IL7 [00109] Camundongos C57BL/6/C machos entre 8 e 10 semanas de idade foram anestesiados e inoculadas pela via intranasal com 102, 103 ou 104 PFU do vírus Flu-IL7 ou 104 PFU Flu-CT diluídos em 25 pl de PBS. O grupo Mock foi inoculado somente com PBS. Nos tempos de 12, 24, 48 ou 72 horas após a inoculação, os animais foram eutanasiados para coleta dos pulmões e do lavado bronco-alveolar (BALF). A produção da IL-7 foi avaliada pela técnica de ELISA. Conforme mostrado na figura 4A, foi possível detectar níveis significativamente aumentados de IL-7 nos pulmões dos animais inoculados com Flu-IL7 na dose de 104 PFU, nos tempos 24 e 48 horas após a infecção, enquanto no BALF, o pico de expressão dessa citocina ocorreu mais tardiamente: 48 e 72 horas após a infecção (Figura 4B). Não foram detectados níveis significativos da IL-7 no soro dos animais infectados em qualquer tempo após a infecção (dados não mostrados). O conjunto desses dados demonstra a capacidade do vírus influenza infectar camundongos e expressar a sequência da IL-7, a qual é produzida de forma local e transitória. EXEMPLO 3: VÍRUS INFLUENZA RECOMBINANTES COMO FERRAMENTAS PARA O ESTUDO DA IMUNOPATOGÊNESE DA INFECÇÃO PELO VÍRUS INFLUENZA
[00110] Os diversos estudos que avaliam a imunopatogênese da infecção pelo vírus influenza apresentam o inconveniente de utilizarem camundongos knockouts ou se valerem da inoculação sistémica de citocinas, o que muito provavelmente não reflete o que ocorre durante uma infecção transitória e localizada ao nível do trato respiratório, a qual é a característica da infecção pelo vírus influenza. Desta forma, a presente invenção permite a utilização de uma estratégia inédita, a qual consiste na construção de vírus influenza recombinantes defectivos para a replicação carreando os genes de citocinas murinas, a fim de avaliar o papel dessas moléculas imunomoduladoras quando elas são produzidas de forma transitória e localizadas, durante a infecção pelo vírus influenza.
[00111] A fim de se demonstrar o potencial do vírus Flu-IL7 no estudo da imunopatogênese da infecção pelo vírus influenza, foi utilizada a seguinte abordagem:
[00112] Camundongos C57BL/6, machos, de 8 a 12 semanas, foram anestesiados por via subcutânea com uma mistura de Ketamina (100mg/kg) e Xilazina (10mg/kg) e divididos em grupos que foram inoculados via intranasal com diferentes vírus. Alguns grupos foram inoculados com o vírus selvagem (PR8) na dose de 102 PFU (dose subletal a qual, não obstante, é capaz de resultar em pneumonia nos animais inoculados) para avaliação da perda de peso, enquanto outros animais foram infectados com 104 PFU de PR8 para avaliação da mortalidade. O coinóculo com o vírus recombinante foi realizado na dose de 104 PFU de Flu-CT ou Flu-IL7, diluídos em PBS no volume de 20pL (inoculo). A perda de peso e a mortalidade foram acompanhadas durante três semanas. Na Figura 5A, podemos observar que com uma dose elevada (104 PFU) do vírus replicativo (PR/8) todos os animais adoecem, com elevada perda de peso (cerca de 25%) e mortalidade nos grupos inoculados com PR/8. Porém, os animais coinoculados com FluIL-7 apresentaram uma sobre vida significativamente maior do que nos demais grupos inoculados com o vírus PR/8. Além disso, ainda que elevada, a mortalidade foi estatisticamente menor na coinfecção com FluIL-7, do que naquela com o FluCt. Conforme mostrado na figura 5B, o grupo de animais co-infectado com os vírus Flu-IL7 + PR8 apresentou uma menor perda de peso total do que o grupo que recebeu apenas PR8 (Figura 5B) e uma menor perda de peso em tempos específicos com relação ao grupo PR8 e o grupo co- infectado com Flu-CT + PR8, além de terem recuperado o peso inicial mais precocemente do que os animais do grupo controle (Flu-CT+PR8; Figura 5C). No seu conjunto, nossos resultados sugerem um papel protetor da citocina IL- 7 e demonstram a viabilidade do vírus que construímos como uma ferramenta a ser utilizada no estudo da imunopatogênese da infecção pelo vírus influenza. EXEMPLO 4: PROTEÇÃO CONTRA INFECÇÕES BACTERIANAS SECUNDÁRIAS APÓS IMUNIZAÇÃO COM O VÍRUS FLU-IL7 [00113] Camundongos C57BL/6, machos, de 8 a 12 semanas, foram anestesiados por via subcutânea com uma mistura de Ketamina (100mg/kg) e Xilazina (10mg/kg) e divididos em grupos (8 animais) que foram imunizados via intranasal (40pL/animal) com 102 PFU/animal de PR8 (dose subletal) ou coinoculados com 102 PFU de PR8 e 104 PFU de Flu-IL7 ou Flu-CT por animal ou PBS lx (mock). Dez dias após a infecção os camundongos foram desafiados com uma dose de 102CFU/animal de bactérias (gram-positivas) Streptococcus pneumoniae sorotipo ATCC6303. Quarenta e oito horas após o desafio os animais foram eutanasiados e tiveram seus pulmões coletados em ambiente estéril para determinação da carga bacteriana por titulação em placa ágar-sangue. O experimento foi realizado em triplicata.
[00114] Para determinação da carga bacteriana nos pulmões, estes foram macerados em peneira de filtro para célula (70pm) com l,5mL de salina (0,5x). Os tubos foram centrifugados a 2000xg por lOmin a 4°C, o sobrenadante descartado e o precipitado bacteriano ressuspendido em 200pL de PBS lx. A suspensão de bactérias foi diluída (razão 1:10) em meio THY (Caldo Todd Hewitt, 5% de extrato de levedura) e 10pL de cada diluição foram aplicados (6 replicatas) em placas de Petri contendo ágar-sangue (BHI- ágar com 5% de sangue de cameio desfibrinado e 8pg/mL de gentamicina). As placas foram mantidas à 37°C sob restrição de oxigénio por 16-18 horas. A carga bacteriana foi determinada pela contagem de colónias que apresentavam a-hemólise (hemólise parcial) na menor diluição em que foi possível separá- las visualmente, média das replicatas, multiplicação pelo fator de correção de diluição e pelo fator de conversão para volume total do órgão macerado (x20). [00115] O desafio com Streptococcus pneumoniae foi realizado 10 dias após a infecção dos animais e a carga bacteriana pulmonar avaliada 48h após o desafio. Este ensaio evidenciou o papel protetor da citocina IL-7 na infecção pelo vírus influenza. Além de minimizar o agravo causado pelo vírus selvagem, o Flu-IL7 também reduziu a susceptibilidade à uma infecção bacteriana secundária pelo pneumococo. Os animais infectados com PR8 ou coinfectados com Flu-CT (grupo Flu-CT+PR8) apresentaram uma carga bacteriana elevada após o desafio, com cerca de 105 a 107 UFC/pulmão. Por outro lado, nos animais coinoculados com Flu-IL7 (grupo Flu-IL7+PR8) a carga bacteriana mediana foi de 102 UFC/pulmão (Figura 6).
EXEMPLO 5: VÍRUS FLU-IL7 COMO FERRAMENTA PARA A INDUÇÃO DE RESPOSTA IMUNE DE ESPECTRO AMPLIADO (RESPOSTA HETEROSUBTÍPICA)
[00116] Camundongos C57BL/6, machos, de 8 a 12 semanas foram anestesiados e imunizados com 104 PFU dos vírus recombinantes (Flu-CT ou Flu-IL7) ou com uma dose sub-letal de 102 PFU do vírus selvagem subtipo H3N2. Cerca de setenta e cinco dias após a imunização, quando já há o estabelecimento da resposta imune de memória, os animais foram desafiados com 5xl02 PFU de um vírus influenza de subtipo H3N2.
[00117] Conforme esperado, os animais previamente inoculados com vírus influenza H3N2 e desafiados com esse mesmo vírus (grupo H3N2- H3N2) não apresentaram perda de peso significativa, evidenciando a presença da proteção homosubtípica (contra a mesma estirpe virai da primeira imunização), prevista após a vacinação. Os animais instilados com PBS e desafiados com o vírus H3N2 (Mock-H3N2) foram aqueles que apresentaram maior perda de peso (média de 28,0% de perda de peso total), o que é esperado por não possuírem imunidade prévia. O grupo de animais imunizados com o vírus Flu-CT apresentou uma média de 20,5% de perda de peso total após o desafio com o vírus H3N2 (grupo Flu-CT-H3N2). Já no grupo vacinado com o vírus Flu-IL7 e desafiado com o vírus H3N2 (Flu-IL7- H3N2), a perda de peso foi menor (média de 6,3% de perda de peso) (Figura 7 A e 7B).
[00118] Os animais imunizados com Flu-CT e desafiados com o vírus influenza de subtipo H3N2 (grupo Flu-CT-H3N2) apresentaram maior perda de peso, em quase todos os tempos avaliados, quando comparado aos animais imunizados com Flu-IL7 e desafiados com o vírus influenza de subtipo H3N2 (grupo Flu-IL7-H3N2) (Figura 7B). Portanto, a imunização com um vírus influenza recombinante carreando a hemaglutinina do vírus PR8 (subtipo H1N1) foi capaz de conferir proteção frente ao desafio com um vírus influenza de subtipo H3N2, demonstrando que Flu-IL7 é capaz de conferir proteção heterosubtípica. Ademais, o fato de essa proteção ter sido detectada mais de 50 dias após a vacinação, demonstra que há indução de resposta imune de memória.
[00119] Neste contexto, uma vez demonstrada a capacidade do vírus FluIL-7 em conferir proteção frente ao desafio com uma dose subletal do vírus H3N2, avaliamos a também capacidade daquele vírus recombinante em proteger os animais frente a um desafio com uma dose letal. Para esse fim, os animais foram imunizados conforme descrito acima e desafiados 30 dias após a vacinação com a dose letal (103 PFU) do vírus H3N2. O grupo de animais inoculados somente com PBS (Mock) apresentou uma mortalidade de 80% após o desafio, enquanto o grupo imunizado com o vírus FluCt apresentou uma mortalidade de 50% (Figura 7C). Todavia, tanto os animais imunizados com o vírus FluIL-7 quanto com o vírus PR/8 sobreviveram ao desafio. Esses resultados nos permitem chegar às seguintes conclusões. A imunização com o vírus FluIL-7 confere uma proteção heterosubtípica mais robusta nos animais imunizados, embora os animais do grupo controle (FluCt) tenham apresentado uma doença mais branda quando comparado ao grupo Mock. A IL-7 parece atuar potencializando o estabelecimento de uma memória imunológica, o que resulta em uma imunidade mais duradoura e maior sobrevivência dos animais desafiados.
EXEMPLO 6: VÍRUS INFLUENZA RECOMBINANTE FLU-IL7 COMO FERRAMENTA PARA O DESENVOLVIMENTO DE VACINA CAPAZ DE INDUZIR CÉLULAS DE MEMÓRIA DE LONGA DURAÇÃO.
[00120] Camundongos C57BL/6, machos, de 8 a 12 semanas, foram anestesiados por via subcutânea com uma mistura de Ketamina (100mg/kg) e Xilazina (10mg/kg) e divididos em grupos (6 animais) que foram imunizados via intranasal (40pL/animal) com 104 PFU de FluIL-7 ou FluCt ou 102 PFU de PR/8 (dose subletal) ou PBS lx (Mock). O perfil imunofenotípico das células dos pulmões foi avaliado 21 dias após a imunização com os vírus recombinantes FluIL-7 ou FluCt ou com o vírus selvagem PR/8. Paralelamente, animais previamente imunizados com os vírus recombinantes (FluCt ou FluIL-7) ou o vírus selvagem PR/8 e desafiados após 30 dias com uma dose subletal (102 PFU) do isolado heterosubtípico H3N2, conforme acima mencionado, foram eutanasiados duas semanas pós-desafio e tiveram seus pulmões coletados para caracterização do perfil imunofenotípico de leucócitos no tecido. Este ensaio permite avaliar a resposta de memória nos pulmões induzida pela vacinação e específica contra influenza, logo após o segundo contato com o antígeno (vírus H3N2). Desta forma, é possível identificar a expansão de populações de memória residentes, bem como aquelas que migraram do baço e/ou linfonodos para os pulmões em resposta ao desafio.
[00121] Para isso, os pulmões previamente perfundidos foram submetidos ao tratamento com colagenase tipo IV (0,5mg/mL) (37°C por 40min) para permitir a dissociação do tecido. Os órgãos foram, então, macerados em peneira de filtro para célula (70pm) com 5mL de RPMI (10% SFB) e a suspensão centrifugada a 800xg por 7min a 8°C. O sobrenadante foi descartado e a lise de hemácias foi realizada com 9mL H20 tipo I (20s) sob agitação em vórtex e a isotonicidade corrigida com lmL de PBS lOx. Para retirar debris celulares provenientes da maceração, as células foram submetidas a um gradiente de Percoll® (Sigma) isotônico a 40% em meio RPMI. Esta solução foi adicionada (lOmL) às células (tubos 15mL), os tubos foram centrifugados 800xg por 20min a 8°C e o sobrenadante aspirado e descartado. Os leucócitos foram lavados com 3mL/tubo de PBS-Wash, e centrifugados à 800xg por 7min a 8°C e res suspendidos no volume remanescente após a lavagem.
[00122] Para marcação de viabilidade celular, foram adicionados 200m L/tubo do corante Live/Dead (Live/dead Fixable Aqua Dead Cell Stain exc 405nm) diluído 1:1.000 em PBS lx e os tubos incubados por 15min, protegidos da luz, à temperatura ambiente. As células foram lavadas (2mL/poço) com PBS-Wash, centrifugadas a 550xg por 7min a 8°C e o sobrenadante descartado. O volume total de células (-2.106 células) foi distribuído (50pL/poço) em placa de 96 poços (fundo U) para cada um dos três ou quatro painéis (-5.105 células por painel). Foram adicionados 10pL/poço do mix de anticorpos preparados na concentração previamente padronizada por titulação e as células foram incubadas por 30min à temperatura ambiente e protegidas da luz. Após o período de incubação, as amostras foram submetidas à fixação com 150pL/poço da solução de lise comercial (FACS™ Lysing Solution -BD) diluída 1:10 em água tipo I por 20min, à temperatura ambiente. As placas foram centrifugadas a 400xg por lOmin a 18°C e as células marcadas submetidas a duas lavagens (180pL/poço) com PBS-Wash. As células foram ressuspendidas em 100pL de PBS lx e transferidas tubos FACS antes da leitura no citômetro LRSFortessa (100.000 eventos). Os dados obtidos no citômetro de fluxo foram analisados no software FlowJO (BD).
[00123] Foram avaliadas diferentes subpopulações celulares e fenótipos de memória, utilizando diferentes combinações de biomarcadores conjugados a fluorocromos: linfócitos T (CD3+CD4+ ou CD3+CD8+), T efetores (CD44+), T memória efetora (CD44+CD62L-CD127+) (TEF), T memória central (CD44+CD62L+) (TCM) e T memória central de longa duração (CD44+CD62L+CD127+) (TCMLD), T residentes de memória (CD69+CD103) (TRM), linfócitos B (CD19+), memória e ativação de células B (CD62L, CD80, CD27).
[00124] A infecção com o vírus influenza de subtipo H3N2 resultou em diferentes perfis de resposta imune nos grupos experimentais. Nos animais imunizados com o vírus FluIL-7, foi possível observar um aumento significativo de linfócitos T CD4+ e CD8+ de memória central (CD44+CD62L+) e de memória central de longa duração (CD44+CD62L+CD127+) em relação aos animais imunizados com o vírus controle FluCt ou com o vírus PR/8. Além disso, o percentual de células T CD8+ efetoras (CD44+) também foi maior nos animais imunizados com o vírus FluIL-7, quando comparado aqueles imunizados com o vírus FluCt (Figura 8). Estes resultados demonstram que a vacinação com FluIL-7 induz o aumento de células de memória de longa duração (CD127+), o que sugere que essa citocina atua no estabelecimento de uma imunidade vacinai duradoura e persistente.

Claims

REIVINDICAÇÕES
1. Construção de ácido nucleico, caracterizada por compreender um gene da neuraminidase truncado e um gene que codifica uma proteína imunomoduladora.
2. Construção, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a proteína imunomoduladora é uma interleucina-7.
3. Construção, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de compreender adicionalmente uma região promotora e uma região terminadora heterólogas.
4. Construção de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de compreender
(i) promotor truncado da polimerase I humana;
(ii) duplicação do promotor 3’ da neuraminidase;
(iii) duplicação dos últimos 42 nucleotídeos da ORF da neuraminidase; em que
(a) as trincas ATG dos primeiros 166 nucleotídeos da região 3’ do gene da neuraminidase foram substituídas por CTA; e
(b) uma sequência codificando uma proteína imunomoduladora inserida entre os primeiros 166 e os últimos 178 nucleotídeos do gene da neuraminidase truncado.
5. Vírus influenza recombinante defectivo para multiplicação, caracterizado por expressar uma proteína imunomoduladora.
6. Vírus influenza recombinante defectivo para multiplicação de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a proteína imunomoduladora é uma interleucina-7.
7. Método para preparar vírus influenza recombinante defectivo para multiplicação como definido na reivindicação 5, caracterizado pelo fato de compreender as etapas de: (i) preparar construção de ácido nucleico compreendendo gene de neuraminidase truncada e gene de proteína imunomoduladora;
(ii) expor células hospedeiras, concomitantemente, à construção da etapa (i) e plasmídeos codificando os segmentos NP, PA, PB 1 , PB2, Ml, NS e HA do vírus influenza;
(iii) recuperar vírus influenza recombinante a partir do sobrenadante.
8. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de compreender adicionalmente uma etapa de infectar um substrato com o vírus influenza recombinante defectivo para multiplicação recuperado na etapa (iii) e purificar o vírus do substrato.
9. Composição imunogênica, caracterizada pelo fato de que compreende um vírus influenza recombinante defectivo para multiplicação como definido na reivindicação 5 e um veículo farmaceuticamente aceitável.
10. Composição, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que induz resposta imune heterosubtípica de longa duração.
11. Composição, de acordo com a reivindicação 9 ou 10, caracterizada pelo fato de ser administrada pela via intranasal.
12. Uso de um vírus influenza recombinante defectivo para multiplicação como definido na reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que é para preparar uma composição imunogênica para prevenir ou tratar infecções causadas por vírus influenza ou por SARS-CoV-2, infecções bacterianas secundárias ou para ser utilizado como adjuvante.
13. Uso, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a composição imunogênica é capaz de induzir resposta imune heterosubtípica de longa duração e proteção ou tratamento contra infecções por vírus influenza, por SARS-CoV-2 e infecções bacterianas secundárias.
PCT/BR2021/050216 2020-05-21 2021-05-20 Construção de ácido nucleico, virus influenza recombinante, método para preparar um virus influenza recombinante, composição, e, uso WO2021232130A1 (pt)

Priority Applications (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AU2021275160A AU2021275160A1 (en) 2020-05-21 2021-05-20 Nucleic acid construct, recombinant influenza virus, method for preparing a recombinant influenza virus, composition and use
JP2022552424A JP2023525623A (ja) 2020-05-21 2021-05-20 核酸構築物、組み換えインフルエンザウイルス、組み換えインフルエンザウイルスを調製するための方法、組成物、および使用
CA3170269A CA3170269A1 (en) 2020-05-21 2021-05-20 Nucleic acid construct, recombinant influenza virus, method for preparing a recombinant influenza virus, composition, and use
US17/908,299 US20230332174A1 (en) 2020-05-21 2021-05-20 Nucleic acid construct, recombinant influenza virus, method for preparing a recombinant influenza virus, composition and use
EP21808722.9A EP4155410A4 (en) 2020-05-21 2021-05-20 NUCLEIC ACID CONSTRUCT, RECOMBINANT INFLUENZA VIRUS, METHOD FOR PRODUCING A RECOMBINANT INFLUENZA VIRUS, COMPOSITION AND USE

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
BRBR102020010208-7 2020-05-21
BR102020010208-7A BR102020010208A2 (pt) 2020-05-21 2020-05-21 Construção de ácido nucleico, virus influenza recombinante, método para preparar um virus influenza recombinante, composição, e, uso.

Publications (2)

Publication Number Publication Date
WO2021232130A1 true WO2021232130A1 (pt) 2021-11-25
WO2021232130A8 WO2021232130A8 (pt) 2022-11-10

Family

ID=78708789

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/BR2021/050216 WO2021232130A1 (pt) 2020-05-21 2021-05-20 Construção de ácido nucleico, virus influenza recombinante, método para preparar um virus influenza recombinante, composição, e, uso

Country Status (7)

Country Link
US (1) US20230332174A1 (pt)
EP (1) EP4155410A4 (pt)
JP (1) JP2023525623A (pt)
AU (1) AU2021275160A1 (pt)
BR (1) BR102020010208A2 (pt)
CA (1) CA3170269A1 (pt)
WO (1) WO2021232130A1 (pt)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007002008A2 (en) 2005-06-21 2007-01-04 Medimmune Vaccines, Inc. Methods and compositions for expressing negative-sense viral rna in canine cells
WO2007124327A2 (en) 2006-04-19 2007-11-01 Medimmune Llc. Methods and compositions for expressing negative-sense viral rna in canine cells
WO2010133964A1 (en) 2009-05-21 2010-11-25 Novartis Ag Reverse genetics using non-endogenous pol i promoters
US20180353573A1 (en) * 2015-12-04 2018-12-13 Genexine, Inc. Pharmaceutical composition comprising immunoglobulin fc-fused interleukin-7 fusion protein for preventing or treating infection from influenza virus

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007002008A2 (en) 2005-06-21 2007-01-04 Medimmune Vaccines, Inc. Methods and compositions for expressing negative-sense viral rna in canine cells
WO2007124327A2 (en) 2006-04-19 2007-11-01 Medimmune Llc. Methods and compositions for expressing negative-sense viral rna in canine cells
WO2010133964A1 (en) 2009-05-21 2010-11-25 Novartis Ag Reverse genetics using non-endogenous pol i promoters
US20180353573A1 (en) * 2015-12-04 2018-12-13 Genexine, Inc. Pharmaceutical composition comprising immunoglobulin fc-fused interleukin-7 fusion protein for preventing or treating infection from influenza virus

Non-Patent Citations (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"GenBank", Database accession no. NM 001032846
BARBOSA RAFAEL POLIDORO ALVES, SALGADO ANA PAULA CARNEIRO, GARCIA CRISTIANA COUTO, FILHO BRUNO GALVÃO, GONÇALVES ANA PAULA DE FARI: "Protective immunity and safety of a genetically modified influenza virus vaccine", PLOS ONE, vol. 9, no. 6, 13 June 2014 (2014-06-13), pages 1 - 14, XP055873327, DOI: 10.1371/journal.pone.0098685 *
BOYDEN, A.W.FRICKMAN, A.M.LEGGE, K.L. ET AL.: "Primary and long-term B-cell responses in the upper airway and lung after influenza A virus infection", IMMUNOL RES, vol. 59, 2014, pages 73 - 80
DE WIT, E ET AL.: "Efficient generation and growth of influenza virus A/PR/8/34 from eight cDNA fragments", VIRUS RESEARCH, vol. 103, no. 1-2, 2004, pages 155 - 161, XP002368127, DOI: 10.1016/j.virusres.2004.02.028
DEVARAJAN P ET AL.: "New Insights into the Generation of CD4 Memory May Shape Future Vaccine Strategies for Influenza.", FRONT IMMUNOL, vol. 7, 2016, pages 136
FUJII YGOTO HWATANABE TYOSHIDA TKAWAOKA Y: "Selective incorporation of influenza virus RNA segments into virus", PROC NATL ACAD SCI USA., vol. 100, no. 4, 18 February 2003 (2003-02-18), pages 2002 - 7, XP002428351, DOI: 10.1073/pnas.0437772100
GOOCH KE ET AL.: "Heterosubtypic cross-protection correlates with cross-reactive interferon-gamma-secreting lymphocytes in the ferret model of influenza", SCI REP, vol. 9, no. 1, 2019, pages 2617
HASSANE MAYA; JOUAN YOUENN; CREUSAT FLORENT; SOULARD DAPHNÉE; BOISSEAU CHLOÉ; GONZALEZ LOÏC; PATIN EMMANUEL C; HEUZÉ-VOURC’H NATHA: "Interleukin-7 bacterial Hassane, (2019) protects against respiratory infection by promoting IL -17-A-producing innate T- cell response", MUCOSAL IMMUNOLOGY, vol. 13, no. 1, 18 October 2019 (2019-10-18), pages 128 - 139, XP036965547, ISSN: 1933-0219, DOI: 10.1038/s41385-019-0212-y *
HAYWARD AC ET AL.: "Natural T Cell-mediated Protection against Seasonal and Pandemic Influenza. Results of the Flu Watch Cohort Study", AM J RESPIR CRIT CARE MED, vol. 191, no. 12, 2015, pages 1422 - 1431
HYE MEE JOO ET AL.: "Broad dispersion and lung localization of virus-specific memory B cells induced by influenza pneumonia; Primary and long-term B-cell responses in the upper airway and lung after influenza A virus infection", PNAS, vol. 105, no. 9, 2008, pages 3485 - 3490
JONES PDADA GL: "Influenza virus-specific antibody-secreting cells in the murine lung during primary influenza virus infection", J VIROL, vol. 60, no. 2, 1986, pages 614 - 619
KANG ET AL.: "Intranasal introduction of Fc-fused interleukin-7 provides long-lasting prophylaxis against lethal influenza virus infection", JOURNAL OF VIROLOGY, vol. 5, 2016, pages 2273 - 2284, XP055389018, DOI: 10.1128/JVI.02768-15
KYOKO SHINYA , YUTAKA FUJII , HIROSHI ITO , TOSHIHIRO ITO , YOSHIHIRO KAWAOKA: "Characterization of a neuraminidase- deficient influenza A virus as a potential gene delivery vector and a live vaccine", JOURNAL OF VIROLOGY, vol. 78, no. 6, 1 March 2004 (2004-03-01), pages 3083 - 3038, XP002459964, ISSN: 0022-538X, DOI: 10.1128/JVI.78.6.3083-3088.2004 *
MACHADO, A.N. NAFFAKHS. VAN DER WERFN. ESCRIOU, VIROLOGY, vol. 313, 2003, pages 235 - 249
ONODERA T ET AL.: "Memory B cells in the lung participate in protective humoral immune responses to pulmonary influenza virus reinfection", PNAS, vol. 109, no. 7, 2012, pages 2485 - 2490
PILAR BLANCO-LOBO; NOGALES AITOR; RODRÍGUEZ LAURA; MARTÍNEZ-SOBRIDO LUIS: "Novel approaches for the development of live attenuated influenza vaccines", VIRUSES, vol. 11, no. 2, 190, 22 February 2019 (2019-02-22), pages 1 - 35, XP055696765, ISSN: 1999-4915, DOI: 10.3390/v11020190 *
SARAH GIAROLA DA SILVA MESSIAS; IANCA ÉVELIN SILVA DE PAULA; ANA PAULA DE FARIA GONÇALVES; LÍDIA PAULA FAUSTINO; MARCELO ANTÔNIO P: "VC017: Recombinant influenza viruses carrying the gene of IL -X murine as a tool for evaluation of the role of this cytokine during infection and immunization against influenza virus", XLIII CONGRESS OF THE BRAZILIAN SOCIETY OF IMMUNOLOGY. XI EXTRA SECTION OF CLINICAL IMMUNOLOGY; OCTOBER 01 - 04, 2018; OURO PRETO, BRAZIL, 2018, pages 299, XP009532347 *
SARAH GIAROLA DA SILVA, ANA PAULA DE FARIA GONÇALVES, IANCA ÉVELIN SILVA DE PAULA, LÍDIA PAULA FAUSTINO, MARCO ANTÔNIO SILVA CAMPO: "Poster 171 – RECOMBINANT INFLUENZA VIRUSES CARRYING THE MURINE INTERLEUKIN-7 (IL-7) OR INTERLEUKIN-15 (IL-15) GENES, AS TOOLS FOR EVALUATION OF THE THEIR ROLE DURING INFLUENZA VIRUS INFECTION", XXVIII BRAZILIAN CONGRESS OF VIROLOGY & XII MERCOSUR MEETING OF VIROLOGY; SEPTEMBER 6-10, 2017, 2017, Brazil, pages 171, XP009532346 *
SRIDHAR ET AL.: "Cellular immune correlates of protection against symptomatic pandemic influenza", NAT MED, vol. 19, 2013, pages 1305 - 1312, XP037135478, DOI: 10.1038/nm.3350
THOMAS GERLACH , HUSNI ELBAHESH , GIULIETTA SALETTI , GUUS F RIMMELZWAAN: "Recombinant influenza A viruses as vaccine vectors", EXPERT REVIEW OF VACCINES, vol. 18, no. 4, 2019, pages 379 - 392, XP009532328, DOI: 10.1080/14760584.2019.1582338 *
URAKI, R ET AL.: "A Bivalent Vaccine Based on a PB2-Knockout Influenza Virus Protects Mice From Secondary Pneumococcal Pneumonia", J INFECT DIS, vol. 212, 2015, pages 1939 - 1948
VALKENBURG ET AL.: "Protection by universal influenza vaccine is mediated by memory CD4 T cells", VACCINE, 2018, pages 4198 - 4206
VIEIRA MACHADO A ET AL.: "Recombinant influenza A viruses harboring optimized dicistronic NA segment with an extended native 5' terminal sequence: induction of heterospecific B and T cell responses in mice", VIROLOGY, vol. 345, no. 1, 5 February 2006 (2006-02-05), pages 73 - 87, XP024896800, DOI: 10.1016/j.virol.2005.09.050
VIEIRA MACHADO A; NAFFAKH N; GERBAUD S; VAN DER WERF S; ESCRIOU N: "Recombinant influenza A viruses harboring optimized dicistronic NA segment with an extended native 5' terminal sequence: induction of heterospecific B and T cell responses in mice", VIROLOGY, vol. 345, 5 February 2006 (2006-02-05), pages 73 - 87, XP024896800, ISSN: 0042-6822, DOI: 10.1016/j.virol.2005.09.050 *
WATANABE, T.WATANABE, S.NODA, T.FUJII, Y.KAWAOKA, Y.: "Exploitation of nucleic acid packaging signals to generate a novel influenza virus-based vector stably expressing two foreign genes", J VIROL, vol. 77, 2003, pages 10575 - 10583, XP002325831, DOI: 10.1128/JVI.77.19.10575-10583.2003
WILKINSON, T.LI, C.CHUI, C. ET AL.: "Preexisting influenza-specific CD4+ T cells correlate with disease protection against influenza challenge in humans", NAT MED, vol. 18, 2012, pages 274 - 280, XP037135434, DOI: 10.1038/nm.2612
WOLSCHEK, M ET AL.: "Establishment of a chimeric, replication-deficient influenza A virus vector by modulation of splicing efficiency", J VIROL, vol. 85, 2011, pages 2469 - 2473, XP055046389, DOI: 10.1128/JVI.01650-10

Also Published As

Publication number Publication date
EP4155410A1 (en) 2023-03-29
BR102020010208A2 (pt) 2022-04-12
US20230332174A1 (en) 2023-10-19
CA3170269A1 (en) 2021-11-25
AU2021275160A1 (en) 2022-09-29
EP4155410A4 (en) 2024-07-03
EP4155410A9 (en) 2023-07-19
JP2023525623A (ja) 2023-06-19
WO2021232130A8 (pt) 2022-11-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US6528064B2 (en) Recombinant trytophan mutants of influenza
EP1086207B1 (en) Novel methods and interferon deficient substrates for the propagation of viruses
JP3545418B2 (ja) インフルエンザの新規組換え温度感受性変異体
JP6875274B2 (ja) ピチンデウイルスのリバースジェネティクス系及び使用方法
CN105518129B (zh) 减毒流感疫苗和其用途
WO2013043067A2 (en) Dna vaccine, method of inducing the immune response, method of immunisation, antibodies specifically recognising the h5 haemagglutinin of an influenza virus and use of the dna vaccine
JP2017529084A5 (pt)
Masic et al. An eight-segment swine influenza virus harboring H1 and H3 hemagglutinins is attenuated and protective against H1N1 and H3N2 subtypes in pigs
Xie et al. Influenza vaccine with consensus internal antigens as immunogens provides cross-group protection against influenza A viruses
WO2021232130A1 (pt) Construção de ácido nucleico, virus influenza recombinante, método para preparar um virus influenza recombinante, composição, e, uso
KR102076794B1 (ko) 재조합 돼지 인플루엔자 바이러스 및 이의 용도
US20160038583A1 (en) Influenza hemagglutinin variants and uses therefor
US10323231B2 (en) Attenuated influenza vaccines and uses thereof
Yang et al. Synthesized swine influenza NS1 antigen provides a protective immunity in a mice model
US10272149B2 (en) Modified bat influenza viruses and their uses
KR101582490B1 (ko) 인플루엔자 바이러스의 다중 아형에 대한 교차 면역반응을 형성하는 신규한 재조합 바이러스 백신
KR20200085396A (ko) H5N6형 재조합 인플루엔자 A 바이러스 및 이를 포함하는 clade 2.3.4.4D에 속하는 H5 혈청형 인플루엔자 A 바이러스에 대한 백신 조성물
JP7280832B2 (ja) インフルエンザｂウイルス変異体およびその使用
US11576963B2 (en) Multivalent live-attenuated influenza vaccine for prevention and control of equine influenza virus (EIV) in horses
Liu et al. Evaluation of a virus derived from MDCK cells infected persistently with influenza A virus as a potential live‐attenuated vaccine candidate in the mouse model
Nidom et al. Construction of Indonesian-strain avian flu virus seed vaccine using low pathogenic hemagglutinin gene and neuraminidase PR8 gene through reverse genetics
US10973903B2 (en) NS1 truncated virus for the development of canine influenza vaccines
Tully Towards the development of a universal influenza vaccine: investigating viral-vectored vaccine-induced heterosubtypic immune responses to influenza A

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 21808722

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

REG Reference to national code

Ref country code: BR

Ref legal event code: B01A

Ref document number: 112022014887

Country of ref document: BR

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2022552424

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

Ref document number: 3170269

Country of ref document: CA

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2021275160

Country of ref document: AU

Date of ref document: 20210520

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2021808722

Country of ref document: EP

Effective date: 20221221