JP7122772B2 - Ｈ５ｎ６組換えインフルエンザウイルス、その製造用組成物、及びそれを含むワクチン組成物 - Google Patents

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Description

KCTC KCTC14261BP KCTC KCTC14391BP
特許法第３０条第２項適用 令和２年２月６日に Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ Ｖｉｒｕｓｅｓ ２０２０－Ｎｏｖｅｌ Ｃｏｎｃｅｐｔｓ ｉｎ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（ディアグナル通り，５４７，０８０２９，バルセロナ，スペイン国）にて発表
本出願は、２０２０年１２月１４日に出願された大韓民国特許出願第１０－２０２０－０１７４８９９号に基づく優先権の利益を主張し、前記明細書全体は、本出願の参考文献である。
本発明は、Ｈ５Ｎ６組換えインフルエンザウイルス、その製造用組成物、及びそれを含むワクチン組成物に関する。
インフルエンザウイルスは、オルソミクソウイルスに属し、陰性の単一鎖ＲＮＡ切片８個をゲノムとして有するウイルスであって、前記８個のＲＮＡ切片からヘマグルチニン（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ；ＨＡ）、ノイラミニダーゼ（ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ、ＮＡ）、ヌクレオカプシドタンパク質（ｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ；ＮＰ）、マトリックスタンパク質１及び２（ｍａｔｒｉｘ、Ｍ１、Ｍ２）、重合酵素単位体Ａ、Ｂ１及びＢ２（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｓｕｂｕｎｉｔ Ａ、Ｂ１ ＆ Ｂ２；それぞれＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２）、及び非構造タンパク質１及び２（ｎｏｎｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ１ ＆ ２；それぞれＮＳ１、ＮＳ２）が作られる。
現在、大韓民国内では、低病原性鳥インフルエンザである０１３１０を１０日齢の発育卵で２０回継代した０１３１０ ＣＥ２０を不活化して死菌ワクチンに用いており、高病原性鳥インフルエンザワクチンは接種しないが、非常時の緊急ワクチンの製造のための抗原を備蓄している。しかし、中国など高病原性鳥インフルエンザの常在国では、高病原性鳥インフルエンザの予防のために、上記の逆遺伝学技術を通じてＰＲ８の６個の内部遺伝子と流行する高病原性ウイルスのＨＡ遺伝子を弱毒化した後、ＮＡ遺伝子とともに組み換えてウイルスを作出して発育卵で増殖させ、不活化した後に死菌ワクチンに用いている。
逆遺伝学技術を用いた組換えＡ型インフルエンザワクチンは、ニワトリ胚の増殖性が卓越であり、特性がよく知られているＰＲ８ウイルスやＡ／ＷＳＮ／３３（Ｈ１Ｎ１）ウイルスの低温適応弱毒株であるＡ／Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ／６／６０（Ｈ２Ｎ２）ウイルスなどの８個のゲノムをベクターの一方向にウイルスゲノム転写が起き、他の方向へは、ｍＲＮＡが作られる双方向性逆遺伝学ベクターにクローニングして、８個のプラスミドを形質転換形質注入（韓国登録特許第０８６２７５８号公報）させて作った組換えウイルスの形態で用いられている。通常、ＨＡとＮＡ遺伝子は、最近流行するウイルスからＲＴ－ＰＣＲ法で増幅して逆遺伝学ベクターにクローニングし、ＰＲ８の残りの遺伝子６個とともに形質注入してワクチン株を作出し、ウイルスを不活化して死菌ワクチンを製造している。
ＰＲ８の内部遺伝子を用いて製作した組換え高病原性鳥インフルエンザウイルスのうち特定のｓｕｂｔｙｐｅの場合、発育卵での増殖性が良くない場合もあり、ＰＲ８が人体インフルエンザＡウイルスであるため、鳥類とヒト間の交差感染の危険性が存在する。特に、ＰＢ２遺伝子の場合、ＰＲ８は、哺乳類の病原性と関連するアミノ酸変異（Ｅ６２７Ｋ、Ａ１９９Ｓ、Ａ６７４Ｔ、Ｔ２７１Ａ、ａｎｄ Ａ５８８Ｔ）を有している一方、低病原性Ｈ９Ｎ２鳥インフルエンザウイルスであるＡ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｋｏｒｅａ／０１３１０／２００１（Ｈ９Ｎ２）（０１３１０）のＰＢ２遺伝子の場合、ＰＲ８に組み換えてマウスに接種したとき、哺乳類での病原性が消えること（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．、２０１４）を確認し、この組換え発現ベクター（韓国登録特許１０－１４２３６９５号公報）を用いると、発育卵の高増殖性、哺乳類無病原性組換えウイルスが製作可能である。
Ｈ５Ｎ１低病原性鳥インフルエンザウイルスであるＡ／ｗｉｌｄ ｄｕｃｋ／Ｋｏｒｅａ/ＳＮＵ５０－５／２００９（Ｈ５Ｎ１）（ＳＮＵ５０－５）は、発育卵での増殖性が低かったが、２０回の発育卵の継代を通じて発育卵の増殖性が改善された。この過程で、ＨＡタンパク質に４個の変異（ＨＡ１；Ｈ１０３Ｙ、Ｋ１６１Ｅ及びＬ３１７Ｐ、ＨＡ２；Ｒ５１Ｋ）とＮＡタンパク質の１個の変異（Ｓ３６９Ｎ）を獲得し、この変異がＳＮＵ５０－５の増殖性を高めることが確認された（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．、２０１３）。Ｈ５Ｎ１ウイルスＨＡタンパク質のＨ１０３Ｙ突然変異は、耐酸性及び耐熱性を高めて哺乳類の上部呼吸器の低いｐＨで感染能力を維持させて飛沫による水平伝播の可能性を高めるため、哺乳類の病原性において重要なものと知られている（Ｌｉｎｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．、２０１４；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．、２０１３）。高病原性クレード２．３．４．４ｂ Ｈ５Ｎ６インフルエンザＡウイルスに上の四種類の変異を適用したとき、Ｈ１０３Ｙ変異を適用した場合に発育卵での増殖性及び耐熱性が増加することを確認した（Ａｎ、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．、２０１９）。
高病原性クレード２．３．４．４ｃ Ｈ５Ｎ６インフルエンザＡウイルスは、大韓民国内でも大きな経済的被害をもたらし、農林検疫検査本部では、非常時の予防用ワクチン株として選定し、大韓民国内の動物ワクチン会社でワクチン製造用ウイルスの原料を生産して冷凍保管している。しかし、既存の逆遺伝学技術を用いて作出されたクレード２．３．４．４ｃ Ｈ５Ｎ６ワクチン株は、発育卵での高い増殖力価を有するが、実際の不活化ワクチンで接種したときの抗体力価が増殖力価に比べて低いため、ワクチンの免疫原性が低い問題点があり、既存の逆遺伝学システムを用いた組換えウイルスは、６個の内部遺伝子が全てＨ１Ｎ１ウイルス由来であって、細胞性免疫に重要なＴ ｃｅｌｌ ｅｐｉｔｏｐｅ配列が高病原性鳥インフルエンザウイルスの遺伝子との一致率が低いという問題点がある。
Ｈ５Ｎ６組換えインフルエンザウイルスを提供する。
Ｈ５Ｎ６組換えインフルエンザウイルス製造用組成物又はこれを用いた製造方法を提供する。
Ｈ５Ｎ６組換えインフルエンザウイルス製造用組成物で形質転換された細胞を提供する。
Ｈ５Ｎ６組換えインフルエンザウイルスを含むワクチン組成物を提供する。
一様態は、インフルエンザウイルスＨ５Ｎ６ストレインのヘマグルチニン（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ：ＨＡ）タンパク質;
Ｈ５Ｎ６ストレインのノイラミニダーゼ（ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ：ＮＡ）；
低病原性インフルエンザウイルスの重合酵素Ｂ２（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｓｕｂｕｎｉｔ Ｂ２：ＰＢ２）；及び
インフルエンザウイルスＨ１Ｎ１ストレインの重合酵素Ｂ１（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｓｕｂｕｎｉｔ Ｂ１：ＰＢ１）、重合酵素Ａ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｓｕｂｕｎｉｔ Ａ：ＰＡ）、ヌクレオカプシドタンパク質（ｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ；ＮＰ）、マトリックスタンパク質（ｍａｔｒｉｘ：Ｍ）及び非構造的タンパク質（ｎｏｎｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ：ＮＳ）からなる群より選択された一つ以上のタンパク質を含むＨ５Ｎ６組換えインフルエンザウイルスを提供することができる。
本発明者らは、野外で分離された高病原性クレード２．３．４．４ｃ Ｈ５Ｎ６鳥インフルエンザウイルスの配列を収集し、最も頻度が高い配列でＨＡ、ＮＡタンパク質を人工合成した後、ＨＡタンパク質の１０３番ヒスチジン（Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ、Ｈ）コドンをチロシン（Ｔｙｒｏｓｉｎｅ、Ｙ）コドンに突然変異させた後、ＰＲ８ウイルスのＰＢ２遺伝子を０１３１０のＰＢ２遺伝子に交換してクレード２．３．４．４ｃ Ｈ５Ｎ６組換えウイルスを作出した。前記組換えウイルスの発育卵での増殖性を確認するために、１０日齢の発育卵に数当たり１００ ＥＩＤ５０／０．１ｍｌを接種し、ＨＡタンパク質の１０３番アミノ酸をヒスチジンからチロシンに変異させた場合、低ｐＨ環境でＨＡタンパク質が活性を失って発育卵及び哺乳類由来細胞株での増殖性を失い、ＰＲ８ ＰＢ２遺伝子を０１３１０のＰＢ２遺伝子に置換する場合にも、発育卵の高増殖性を維持しながら哺乳類由来細胞株及びマウスでの増殖性がないことから哺乳類無病原性を確認した。また、前記組換えウイルスを５５℃で９０分間熱処理する場合にも、血球凝集力価が全然減少しないことから耐熱性を有することを確認し、超遠心分離を通じて得たウイルスタンパク質量がより高くて抗原量に優れ、Ｂｉｎａｒｙ ｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ（ＢＥＩ）を用いて不活化してオイルエマルジョンワクチンで３週齢のニワトリ及び２週齢のカモに接種したとき、形成された抗体力価が増加することを確認した。また、Ｈ１０３Ｙ変異を適用することで、哺乳類での増殖性に影響を与えるＨＡタンパク質のｆｕｓｉｏｎ ｐＨをさらに高めて哺乳類への伝播危険性をより一層除去した。相対的に保存的な配列を有しているためｈｅｔｅｒｏ－ｓｕｂｔｙｐｉｃ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎにおいて重要であることが知られているＮＰ、Ｍ遺伝子を鳥インフルエンザウイルス由来の遺伝子に変更したワクチンが、力価が低いにもかかわらず、内部の遺伝子が一致する場合、排出されるウイルス量を一層減らすことを確認することで、ｖｉｒａｌ ｃｌｅａｒａｎｃｅに重要な細胞性免疫を一層刺激したことを確認した。本願発明の組換えインフルエンザウイルスの発育卵高増殖性及び哺乳類無病原性だけでなく耐熱性を確認し、超遠心で分離したウイルスの抗原量がより高く不活化してニワトリにオイルエマルジョンワクチンとして接種した結果、向上した抗体形成能を確認することで、高免疫原性を確認して、本発明を完成した。
インフルエンザウイルスは、オルソミクソウイルス科（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）のウイルスであって、インフルエンザ又は流行風邪を誘発することができる。前記インフルエンザウイルスは、クレード（ｃｌａｄｅ）２．３．４．４ｃ Ｈ５Ｎ６ウイルスであってもよい。前記インフルエンザウイルスＨ５Ｎ６ストレインは、インフルエンザＡウイルスのサブタイプＨ５Ｎ６と呼ばれる。
ヘマグルチニン（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ：ＨＡ）タンパク質は、赤血球凝集タンパク質又は血球凝集素とも呼ばれる。前記ヘマグルチニンタンパク質は、配列番号１又は２のアミノ酸配列を含むポリペプチドであってもよい。前記ヘマグルチニンタンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列でＮ末端から１０３番目のアミノ酸が突然変異したものであってもよい。前記ヘマグルチニンタンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列でＮ末端から１０３番目のアミノ酸であるヒスチジン（Ｈ）がチロシン（Ｙ）に突然変異したものであってもよい。
ノイラミニダーゼ（ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ：ＮＡ）は、ノイラミン酸（ｎｅｕｒａｍｉｎｉｃ ａｃｉｄ）を加水分解してシアリン酸を分離する酵素を言う。前記ノイラミニダーゼは、ウイルスが宿主の細胞に侵入するか抜け出るときに必要である。前記ノイラミニダーゼは、インフルエンザウイルスＨ５Ｎ６ストレイン由来のノイラミニダーゼであってもよい。前記ノイラミニダーゼは、配列番号３のアミノ酸配列を含むポリペプチドであってもよい。
前記低病原性インフルエンザウイルスは、大韓民国内の低病原性鳥インフルエンザウイルスであるＡ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｋｏｒｅａ／０１３１０／２００１（Ｈ９Ｎ２）（以下、「０１３１０」という）（韓国登録特許第０７９０８０１号公報）であってもよい。前記０１３１０菌株は、韓国登録特許第０７９０８０１号公報の実施例１でのように分離された大韓民国内の分離株であって低病原性である。しかし、前記０１３１０菌株は、低病原性ではあるが、病原性ウイルスであるので、寄託機関に寄託が不可能であり、現在、農林水産検疫検査本部の鳥類疾病科に保管中である。重合酵素Ｂ２は、インフルエンザウイルスのＲＮＡ－依存性ＲＮＡ重合酵素のサブユニットのうち一つである。前記重合酵素Ｂ２（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｓｕｂｕｎｉｔ Ｂ２：ＰＢ２）タンパク質は、配列番号４のアミノ酸配列を含むポリペプチドであってもよい。
前記インフルエンザウイルスＨ１Ｎ１ストレインは、Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／３４（以下、「ＰＲ８」という）であってもよい。
重合酵素Ｂ１（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｓｕｂｕｎｉｔ Ｂ１：ＰＢ１）は、インフルエンザウイルスのＲＮＡ－依存性ＲＮＡ重合酵素のサブユニットのうち一つである。前記重合酵素Ｂ１は、ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ＮＣ＿００２０２１の核酸配列でコーディングされるポリペプチド又はＵｎｉｐｒｏｔ Ｐ０３４３１のアミノ酸配列を含むポリペプチドであってもよい。
重合酵素Ａ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｓｕｂｕｎｉｔ Ａ：ＰＡ）は、インフルエンザウイルスのＲＮＡ－依存性ＲＮＡ重合酵素のサブユニットのうち一つである。前記重合酵素Ａは、ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ＮＣ＿００２０２２の核酸配列でコーディングされるポリペプチド又はＵｎｉｐｒｏｔ Ｐ０３４３３のアミノ酸配列を含むポリペプチドであってもよい。
ヌクレオカプシドタンパク質（ｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ；ＮＰ）は、陰性（ｎｅｇａｔｉｖｅ）鎖ウイルスＲＮＡｆｍｆをカプセル化する構造タンパク質である。前記ヌクレオカプシドは、ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ＮＣ＿００２０１９の核酸配列でコーディングされるポリペプチド又はＵｎｉｐｒｏｔ Ｐ０３４６６のアミノ酸配列を含むポリペプチドであってもよい。
マトリックスタンパク質（ｍａｔｒｉｘ：Ｍ）は、ウイルスコアとウイルス外皮を連結させる構造タンパク質である。前記マトリックスタンパク質は、ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ＮＣ＿００２０１６の核酸配列でコーディングされるポリペプチド又はＵｎｉｐｒｏｔ Ｐ０６８２１又はＰ０３４８５のアミノ酸配列を含むポリペプチドであってもよい。
非構造的タンパク質（ｎｏｎｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ：ＮＳ）は、ウイルス複製に必要な同種二量体（ｈｏｍｏｄｉｍｅｒｉｃ）ＲＮＡ－結合タンパク質である。前記非構造的タンパク質は、ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ＮＣ＿００２０２０の核酸配列でコーディングされるポリペプチド又はＵｎｉｐｒｏｔ Ｐ０３４９６のアミノ酸配列を含むポリペプチドであってもよい。
前記Ｈ５Ｎ６組換えインフルエンザウイルスは、インフルエンザウイルスＨ１Ｎ１ストレインの重合酵素Ｂ１、重合酵素Ａ、ヌクレオカプシド、マトリックスタンパク質及び非構造的タンパク質からなる群より選択された一つ以上のタンパク質を含むことができる。前記Ｈ５Ｎ６組換えインフルエンザウイルスは、インフルエンザウイルスＨ１Ｎ１ストレインの重合酵素Ｂ１、重合酵素Ａ、ヌクレオカプシド、マトリックスタンパク質及び非構造的タンパク質を全て含むことができる。
前記Ｈ５Ｎ６組換えインフルエンザウイルスは、寄託番号ＫＣＴＣ１４２６１ＢＰ（２０２０．０８．０４）で寄託されたものであってもよい。
前記Ｈ５Ｎ６組換えインフルエンザウイルスは、Ｈ５Ｎ６ストレイン由来タンパク質、低病原性インフルエンザウイルス由来タンパク質及びＨ１Ｎ１ストレイン由来タンパク質のうち２以上を含んだ組換えウイルスであってもよい。
前記Ｈ５Ｎ６組換えインフルエンザウイルスは、哺乳類無病原性、発育卵高増殖性又は耐熱性ウイルスであってもよい。前記Ｈ５Ｎ６組換えインフルエンザウイルスは、哺乳類無病原性、発育卵高増殖性、耐熱性、弱毒化クレード２．３．４．４ｃ Ｈ５Ｎ６組換えインフルエンザＡウイルスであってもよい。前記Ｈ５Ｎ６組換えインフルエンザウイルスは、哺乳類に病原性がなく安全であり、発育卵での抗原生産量に優れてワクチンの生産性及び抗体形成を高めることができるので、非常に有用である。また、高い耐熱性を備えているので、ワクチン原料／製品保管及び流通期間延長に有用である。
一様態は、インフルエンザウイルスＨ５Ｎ６ストレインのヘマグルチニン（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ：ＨＡ）タンパク質であって、配列番号１のアミノ酸配列でＮ末端から１０３番目のアミノ酸が突然変異したヘマグルチニンタンパク質；
インフルエンザウイルスＨ５Ｎ６ストレインのノイラミニダーゼ（ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ：ＮＡ）；
低病原性インフルエンザウイルスの重合酵素Ｂ２（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｓｕｂｕｎｉｔ Ｂ２：ＰＢ２）、マトリックスタンパク質（ｍａｔｒｉｘ：Ｍ）；
インフルエンザウイルスＨ１Ｎ１ストレインの重合酵素Ｂ１（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｓｕｂｕｎｉｔ Ｂ１：ＰＢ１）、重合酵素Ａ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｓｕｂｕｎｉｔ Ａ：ＰＡ）；
インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１ストレインのヌクレオカプシドタンパク質（ｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ；ＮＰ）；及び
インフルエンザウイルスＨ９Ｎ２の非構造的タンパク質（ｎｏｎｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ：ＮＳ）からなる群より選択された一つ以上のタンパク質を含む、Ｈ５Ｎ６組換えインフルエンザウイルスを提供することができる。
内部遺伝子を低病原性鳥インフルエンザウイルスであるＳＮＵ５０－５のＮＰ遺伝子（配列番号５）、００２８のＮＳ遺伝子（配列番号６）、０１３１０のＭ遺伝子（配列番号７）を置換した組換えクレード２．３．４．４ｃ Ｈ５Ｎ６ウイルスを製作し、内部遺伝子のみ他の野外株ウイルスＡ／Ｍａｎｄａｒｉｎ ｄｕｃｋ／Ｋｏｒｅａ／Ｋ１６－１８７－３／２０１６（Ｈ５Ｎ６）を攻撃接種した後、排出されるウイルスの量がより少ないことを確認することで、内部の遺伝子を置換した組換えワクチンの免疫原性が一層向上したことを確認した。
インフルエンザウイルスは、オルソミクソウイルス科（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）のウイルスであって、インフルエンザ又は流行風邪を誘発することができる。前記インフルエンザウイルスは、クレード（ｃｌａｄｅ）２．３．４．４ｃ Ｈ５Ｎ６ウイルスであってもよい。前記インフルエンザウイルスＨ５Ｎ６ストレインは、インフルエンザＡウイルスのサブタイプＨ５Ｎ６と呼ばれる。
ヘマグルチニン（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ：ＨＡ）タンパク質は、赤血球凝集タンパク質又は血球凝集素とも呼ばれる。前記ヘマグルチニンタンパク質は、配列番号１又は２のアミノ酸配列を含むポリペプチドであってもよい。前記ヘマグルチニンタンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列でＮ末端から１０３番目のアミノ酸が突然変異したものであってもよい。前記ヘマグルチニンタンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列でＮ末端から１０３番目のアミノ酸であるヒスチジン（Ｈ）がチロシン（Ｙ）に突然変異したものであってもよい。
ノイラミニダーゼ（ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ：ＮＡ）は、ノイラミン酸（ｎｅｕｒａｍｉｎｉｃ ａｃｉｄ）を加水分解してシアリン酸を分離する酵素を言う。前記ノイラミニダーゼは、ウイルスが宿主の細胞に侵入するか抜け出るときに必要である。前記ノイラミニダーゼは、インフルエンザウイルスＨ５Ｎ６ストレイン由来のノイラミニダーゼであってもよい。前記ノイラミニダーゼは、配列番号３のアミノ酸配列を含むポリペプチドであってもよい。
前記低病原性インフルエンザウイルスは、大韓民国内の低病原性鳥インフルエンザウイルスであるＡ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｋｏｒｅａ／０１３１０／２００１（Ｈ９Ｎ２）（以下、「０１３１０」という）（韓国登録特許第０７９０８０１号公報）であってもよい。前記０１３１０菌株は、韓国登録特許第０７９０８０１号公報の実施例１でのように分離された大韓民国内の分離株であって低病原性である。しかし、前記０１３１０菌株は、低病原性ではあるが、病原性ウイルスであるので、寄託機関に寄託が不可能であり、現在、農林水産検疫検査本部の鳥類疾病科に保管中である。重合酵素Ｂ２は、インフルエンザウイルスのＲＮＡ－依存性ＲＮＡ重合酵素のサブユニットのうち一つである。前記重合酵素Ｂ２（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｓｕｂｕｎｉｔ Ｂ２：ＰＢ２）タンパク質は、配列番号４のアミノ酸配列を含むポリペプチドであってもよい。マトリックスタンパク質（ｍａｔｒｉｘ：Ｍ）は、ウイルスコアとウイルス外皮を連結させる構造タンパク質である。前記マトリックスタンパク質（ｍａｔｒｉｘ：Ｍ）は、配列番号７のアミノ酸配列を含むポリペプチドであってもよい。
前記インフルエンザウイルスＨ１Ｎ１ストレインは、Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／３４（以下、「ＰＲ８」という）であってもよい。
重合酵素Ｂ１（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｓｕｂｕｎｉｔ Ｂ１：ＰＢ１）は、インフルエンザウイルスのＲＮＡ－依存性ＲＮＡ重合酵素のサブユニットのうち一つである。前記重合酵素Ｂ１は、ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ＮＣ＿００２０２１の核酸配列でコーディングされるポリペプチド又はＵｎｉｐｒｏｔ Ｐ０３４３１のアミノ酸配列を含むポリペプチドであってもよい。
重合酵素Ａ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｓｕｂｕｎｉｔ Ａ：ＰＡ）は、インフルエンザウイルスのＲＮＡ－依存性ＲＮＡ重合酵素のサブユニットのうち一つである。前記重合酵素Ａは、ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ＮＣ＿００２０２２の核酸配列でコーディングされるポリペプチド又はＵｎｉｐｒｏｔ Ｐ０３４３３のアミノ酸配列を含むポリペプチドであってもよい。
ヌクレオカプシドタンパク質（ｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ；ＮＰ）は、陰性（ｎｅｇａｔｉｖｅ）鎖ウイルスＲＮＡｆｍｆをカプセル化する構造タンパク質である。前記ヌクレオカプシドタンパク質（ｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ；ＮＰ）は、配列番号５のアミノ酸配列を含むポリペプチドであってもよい。
非構造的タンパク質（ｎｏｎｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ：ＮＳ）は、ウイルス複製に必要な同種二量体（ｈｏｍｏｄｉｍｅｒｉｃ）ＲＮＡ－結合タンパク質である。前記非構造的タンパク質（ｎｏｎｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ：ＮＳ）は、配列番号６のアミノ酸配列を含むポリペプチドであってもよい。
前記Ｈ５Ｎ６組換えインフルエンザウイルスは、寄託番号ＫＣＴＣ１４３９１ＢＰ（２０２０．１１．２７）で寄託されたものであってもよい。
前記Ｈ５Ｎ６組換えインフルエンザウイルスは、インフルエンザウイルスＨ５Ｎ６ストレイン由来タンパク質、低病原性インフルエンザウイルス由来タンパク質、インフルエンザウイルスＨ１Ｎ１ストレイン由来タンパク質、インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１ストレイン由来タンパク質及びインフルエンザウイルスＨ９Ｎ２ストレイン由来タンパク質のうち２以上を含んだ組換えウイルスであってもよい。
他の様態は、インフルエンザウイルスＨ５Ｎ６ストレインのヘマグルチニンタンパク質をコーディングするポリヌクレオチド；
Ｈ５Ｎ６ストレインのノイラミニダーゼをコーディングするポリヌクレオチド；
低病原性インフルエンザウイルスの重合酵素Ｂ２をコーディングするポリヌクレオチド；及び
インフルエンザウイルスＨ１Ｎ１ストレインの重合酵素Ｂ１、重合酵素Ａ、ヌクレオカプシド、マトリックスタンパク質及び非構造的タンパク質からなる群より選択された一つ以上のタンパク質をコーディングするポリヌクレオチドを含むＨ５Ｎ６組換えインフルエンザウイルス製造用組成物を提供する。
他の様態は、インフルエンザウイルスＨ５Ｎ６ストレインのヘマグルチニン（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ：ＨＡ）タンパク質であって、配列番号１のアミノ酸配列でＮ末端から１０３番目のアミノ酸が突然変異したヘマグルチニンタンパク質；
インフルエンザウイルスＨ５Ｎ６ストレインのノイラミニダーゼ（ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ：ＮＡ）；
低病原性インフルエンザウイルスの重合酵素Ｂ２（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｓｕｂｕｎｉｔ Ｂ２：ＰＢ２）、マトリックスタンパク質（ｍａｔｒｉｘ：Ｍ）；
インフルエンザウイルスＨ１Ｎ１ストレインの重合酵素Ｂ１（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｓｕｂｕｎｉｔ Ｂ１：ＰＢ１）、重合酵素Ａ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｓｕｂｕｎｉｔ Ａ：ＰＡ）；
インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１ストレインのヌクレオカプシドタンパク質（ｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ；ＮＰ）；及び
インフルエンザウイルスＨ９Ｎ２の非構造的タンパク質（ｎｏｎｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ：ＮＳ）からなる群より選択された一つ以上のタンパク質をコーディングするポリヌクレオチドを含むＨ５Ｎ６組換えインフルエンザウイルス製造用組成物を提供する。
インフルエンザウイルスＨ５Ｎ６ストレイン、ヘマグルチニンタンパク質、ノイラミニダーゼ、低病原性インフルエンザウイルス、重合酵素Ｂ２、インフルエンザウイルスＨ１Ｎ１ストレイン、重合酵素Ｂ１、重合酵素Ａ、ヌクレオカプシド、マトリックスタンパク質及び非構造的タンパク質は、上述した通りである。
前記ポリヌクレオチドは、前記ヘマグルチニンタンパク質、ノイラミニダーゼ、重合酵素Ｂ２、重合酵素Ｂ１、重合酵素Ａ、ヌクレオカプシド、マトリックスタンパク質及び非構造的タンパク質のうちいずれか一つをコーディングする核酸配列を含むポリヌクレオチドであってもよい。前記ポリヌクレオチドは、コドン使用頻度（ｃｏｄｏｎ ｕｓａｇｅ）によって変更され得る。
前記ポリヌクレオチドは、ベクターに含まれたものであってもよい。前記ベクターは、発現ベクターであってもよい。前記ベクターは、動物細胞での発現のために必要な調節領域（例えば、プロモーター、エンハンサー及びサイレンサー）を含むことができる。前記ポリヌクレオチドは、調節領域と作動可能に連結されたものであってもよい。前記ベクターは、複製原点、ポリＡ配列、多重クローニング部位、選別マーカーなどをさらに含むことができる。
前記ベクターは、プラスミドベクター、コスミドベクター、バクテリオファージベクター又はウイルスベクターであってもよい。前記ウイルスベクターは、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター又はアデノ随伴ウイルスベクターであってもよい。
他の様態は、一様態によるＨ５Ｎ６組換えインフルエンザウイルス製造用組成物と細胞をインキュベーションして細胞にＨ５Ｎ６組換えインフルエンザウイルスを形質転換させるステップを含むＨ５Ｎ６組換えインフルエンザウイルス製造方法を提供する。
前記細胞は、組換えウイルスを生産できる細胞であってもよい。例えば、前記細胞は、２９３Ｔ、ＭＤＣＫ、Ｖｅｒｏ、ＤＦ１、ＰＫ１５、Ａ５４９及びＳＴ１細胞である。前記細胞は、鳥類の動物細胞であってもよい。前記細胞は、ヒヨコの発育卵又はニワトリ胚の腎臓細胞であってもよい。
前記Ｈ５Ｎ６組換えインフルエンザウイルス製造用組成物と細胞をインキュベーションするステップは、Ｈ５Ｎ６組換えインフルエンザウイルスを発育卵の尿膜液に加え、尿膜液を培養するステップであってもよい。
前記形質転換は、細胞にＨ５Ｎ６組換えインフルエンザウイルス製造用組成物の核酸が導入されることであってもよい。形質転換は、当業界で知られている方法によって行われ得る。例えば、形質転換は、形質導入、形質感染、微細注入法、リポフェクション又は電気穿孔法で行われ得る。
前記方法は、形質転換された細胞からＨ５Ｎ６組換えインフルエンザウイルスを分離するステップをさらに含むことができる。
他の様態は、一様態によるＨ５Ｎ６組換えインフルエンザウイルス製造用組成物で形質転換された細胞を提供する。
Ｈ５Ｎ６組換えインフルエンザウイルス製造用組成物及び形質転換は、上述した通りである。
前記細胞は、組換えウイルスを生産できる細胞であってもよい。例えば、前記細胞は、２９３Ｔ、ＭＤＣＫ、Ｖｅｒｏ、ＤＦ１、ＰＫ１５、Ａ５４９及びＳＴ１細胞である。前記細胞は、鳥類の動物細胞であってもよい。前記細胞は、ヒヨコの発育卵又はニワトリ胚の腎臓細胞であってもよい。
他の様態は、一様態によるＨ５Ｎ６組換えインフルエンザウイルスを含むワクチン組成物を提供する。
前記Ｈ５Ｎ６組換えインフルエンザウイルスは、上述した通りである。
前記ワクチン組成物は、インフルエンザ又は鳥インフルエンザを予防するためのものであってもよい。前記ワクチン組成物は、鳥類（例えば、ニワトリ、カモ）又は哺乳類（例えば、ヒト、ブタ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジ、マウス、ラクダ）に投与するためのものであってもよい。前記予防は、前記ワクチン組成物の投与によってインフルエンザウイルスにより誘発される疾患（例えば、インフルエンザ、鳥インフルエンザ）の発生を抑制するかその発病を遅延させる全ての行為を意味する。
前記ワクチン組成物は、Ｈ５Ｎ６組換えインフルエンザウイルスを有効な量で含むことができる。用語「有効な量」は、予防または治療を必要とする個体に投与される場合、予防又は治療の効果を現わすに十分な量を意味する。前記有効な量は、当業者が選択される細胞又は個体によって適切に選択できる。疾患の重症度、患者の年齢、体重、健康、性別、患者の薬物に対する敏感度、投与時間、投与経路及び排出比率、治療期間、使われた組成物と配合又は同時使用される薬物を含んだ要素及びその他医学分野でよく知られている要素によって決定され得る。前記ワクチン組成物は、約１×１０７～１×１０１１、１×１０８～５×１０１０、５×１０８～２×１０１０個のウイルス粒子を含んだ量で投与され得る。
前記ワクチン組成物は、死菌ワクチン又は生菌ワクチン組成物であってもよい。
前記ワクチン組成物は、薬学的に許容可能な担体を含むことができる。前記担体は、賦形剤、希釈剤又は補助剤を含む意味で用いられる。前記担体は、例えば、ラクトース、デキストリン、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、澱粉、アカシアゴム、アルジネート、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、水、生理食塩水、ＰＢＳのような緩衝液、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、マグネシウムステアレート及びミネラルオイルからなる群より選択されたものであってもよい。前記組成物は、充填剤、抗凝集剤、潤滑剤、湿潤剤、風味剤、乳化剤、保存剤又はこれらの組み合わせを含むことができる。
前記ワクチン組成物は、非経口経路（例えば、血管内、静脈内、動脈内、筋肉内又は皮下など）、経口、鼻腔、直腸、経皮又はエアロゾルを通じた吸入経路で投与され得る。前記ワクチン組成物の投与量は、例えば、約１×１０７～１×１０１１、１×１０８～５×１０１０、５×１０８～２×１０１０個のウイルス粒子であってもよい。前記投与は、１日１回、１日２回～２４回、週１回～６回、月１回～３回又は年１回～１２回で投与され得る。
前記ワクチン組成物は、経口投与剤形（例えば、粉末、錠剤、カプセル、シロップ、丸薬又は顆粒）又は非経口剤形（例えば、注射剤）に剤形化され得る。また、前記組成物は、全身剤形又は局所剤形に製造され得る。
前記ワクチン組成物は、個別治療剤で投与するか他の治療剤と併用して投与され得、従来の治療剤とは順次又は同時に投与され得る。そして、単一又は多重投与され得る。
他の様態は、一様態によるワクチン組成物を個体に投与するステップを含むインフルエンザ又は鳥インフルエンザの予防方法を提供する。
前記個体は、鳥類（例えば、ニワトリ、カモ）又は哺乳類（例えば、ヒト、ブタ、イヌ、マウス）であってもよい。
前記ワクチン組成物の投与量は、患者の状態及び体重、疾病の程度、薬物形態、投与経路及び期間によって異なるが、当業者により適切に選択され得る。前記ワクチン組成物は、約１×１０７～１×１０１１、１×１０８～５×１０１０、５×１０８～２×１０１０個のウイルス粒子を含んだ量で投与され得る。前記投与は、１日１回、１日２回～２４回、週１回～６回、月１回～３回又は年１回～１２回で投与され得る。
本発明は、既存クレード２．３．４．４ｃ Ｈ５Ｎ６組換えインフルエンザＡウイルスの哺乳類増殖性（病原性獲得可能性）、低い体液性免疫刺激能力及び低い耐熱性問題を解決しようと、Ｈ１０３Ｙ突然変異をクレード２．３．４．４ｃ ＨＡ遺伝子に導入し、哺乳類病原性をＰＲ８のＰＢ２遺伝子を０１３１０のＰＢ２遺伝子に置換することで、哺乳類無病原性、高免疫原性、耐熱性、弱毒化クレード２．３．４．４ｃ Ｈ５Ｎ６組換えインフルエンザＡウイルスを提供し、本発明で提供する組換えウイルスは、生産性が高く、効能が卓越であり且つ安全なワクチン株として有用に活用され得る。また、内部遺伝子を低病原性鳥インフルエンザウイルスであるＳＮＵ５０－５のＮＰ遺伝子（配列番号５）、００２８のＮＳ遺伝子（配列番号６）、０１３１０のＭ遺伝子（配列番号７）を置換した組換えクレード２．３．４．４ｃ Ｈ５Ｎ６ウイルスを製作して、内部遺伝子のみ他の野外株ウイルスＡ／Ｍａｎｄａｒｉｎ ｄｕｃｋ／Ｋｏｒｅａ／Ｋ１６－１８７－３／２０１６（Ｈ５Ｎ６）を攻撃接種した後、排出されるウイルスの量がより少ないことを確認することで、内部遺伝子を置換した組換えワクチンの免疫原性が一層増加する効果がある。
図１は、哺乳類無病原性、高免疫原性、耐熱性、弱毒化クレード２．３．４．４ｃ Ｈ５Ｎ６組換えインフルエンザＡウイルスのゲノム組み合わせを図式化した図である。 図２は、ｒＨ５Ｎ６－３１０ＰＢ２とｒＨ５Ｎ６－Ｈ１０３Ｙ－３１０ＰＢ２ウイルス価の哺乳類細胞であるＭＤＣＫ ｃｅｌｌ又はＡ５４９ ｃｅｌｌでの増殖性を確認した結果である。 図３は、ｒＨ５Ｎ６－３１０ＰＢ２及びｒＨ５Ｎ６－Ｈ１０３Ｙ－３１０ＰＢ２ウイルスの耐熱性を確認した結果である。 図４は、ｒＨ５Ｎ６－３１０ＰＢ２及びｒＨ５Ｎ６－Ｈ１０３Ｙ－３１０ＰＢ２ウイルスの耐酸性を確認した結果である。 図５は、ｒＨ５Ｎ６－Ｈ１０３Ｙ－３１０ＰＢ２及びｒＨ５Ｎ６－３１０ＰＢ２の発育卵でのタンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥを通じて抗原量を確認した結果である。
以下、本発明を実施例によって詳細に説明する。ただし、下記実施例は本発明を例示するものに過ぎず、本発明が下記実施例によって限定されるものではない。
実施例１．高病原性Ｈ５Ｎ６鳥インフルエンザウイルスのＨＡ、ＮＡゲノム及び０１３１０のＰＢ２ゲノム分節を有する組換えウイルスの製作及び特性分析
１－１．インフルエンザウイルスＨＡタンパク質が変異されたＨＡゲノムプラスミドの製作
大韓民国内で分離された高病原性鳥インフルエンザウイルスＨ５Ｎ６のＨＡとＮＡタンパク質の配列を集めて最も一致度が高いＨＡ、ＮＡゲノム配列を選定し、ｃｌｅａｖａｇｅ ｓｉｔｅをＡＳＧＲに変更して病原性を除去したＨＡ遺伝子とＮＡ遺伝子をそれぞれ合成し、ホフマンベクター（韓国登録特許第０８６２７５８号公報）にクローニングした。合成したＨ５Ｎ６のＨＡタンパク質の場合、１０３番アミノ酸をヒスチジンからチロシンに置換するためにＨＡゲノム遺伝子で該当するアミノ酸のコドンをなすヌクレオチドをＣＡＣからＴＡＣに置換し、それを中心として両方向に同一な配列を有する約３０ｂｐの相補的なプライマーセットを製作した。プライマーとＭｕｔａ－Ｄｉｒｅｃｔ Ｓｉｔｅ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ｉＮｔＲｏｎ Ｃｏ．Ｓｏｕｔｈ Ｋｏｒｅａ）を用いてＨＡタンパク質の１０３番アミノ酸部分のゲノムがＣＡＣからＴＡＣに置換された合成したＨ５Ｎ６ウイルスのＨＡゲノムのクローニングベクタープラスミドを製作した。
１－２．組換えウイルスの製作
組換えインフルエンザウイルスの製作のために、ホフマン博士の逆遺伝学ベクターシステム（韓国登録特許第０８６２７５８号公報）を用いた。
具体的には、合成した高病原性Ｈ５Ｎ６鳥インフルエンザウイルスのＨＡとＮＡゲノム切片がクローニングされたホフマンベクター（韓国登録特許第０８６２７５８号公報）、０１３１０ ＰＢ２ゲノム切片がクローニングされたホフマンベクター（韓国登録特許第０８６２７５８号公報）及びＰＲ８のＰＢ１、ＰＡ、ＮＰ、Ｍ、ＮＳゲノム切片がクローニングされたホフマンベクター（韓国登録特許第０８６２７５８号公報）、０１３１０ Ｍゲノム切片がクローニングされたホフマンベクター、ＳＮＵ５０－５ ＮＰゲノム切片がクローニングされたホフマンベクター、００２８ ＮＳ切片がクローニングされたホフマンベクタープラスミドを準備した。
２９３Ｔ細胞（生命資源センター、ＫＣＴＣ）を６－ウェル細胞培養容器に５％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを含有したＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）培地に２×１０６個／２ｍｌ浮遊して各ウェルに添加した後、２４時間付着させた。培地を除去した後、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏ．ＵＳＡ）０．８ｍｌを添加した。
前記準備されたプラスミド８個を全て一つの１．５ｍｌ ｔｕｂｅにそれぞれ３００ｎｇずつの量で入れ、最終的に２５μｌになるようにＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地を添加し、また他の１．５ｍｌ ｔｕｂｅにｐｌｕｓ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏ．ＵＳＡ）６μｌとＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地６９μｌを添加して混合した後、プラスミドが入っている１．５ｍｌ ｔｕｂｅに添加して混合した後、室温で１５分間反応させた。
１５分反応した後、ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ４μｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏ）とＯｐｔｉ－ＭＥＭ ９６μｌを混合して１００μｌを取り、前記プラスミドがあるｔｕｂｅに添加した後、１５分間追加反応させた。得られた反応生成物を前記２９３Ｔ細胞が入っている各ウェルに２００μｌを添加した。６－ウェル培養容器を５％ ＣＯ２、３７℃で２０時間培養した後、ウェル当たりトリプシン１０μｇ（２．５μｇ／４μｌ）とｏｐｔｉ－ＭＥＭ培地１ｍｌを添加した後、２４時間後に上層液を回収し、１０～１１日齢のＳＰＦ発育卵（Ｓｕｎｒｉｓｅ Ｃｏ．、ＮＹ）に尿膜腔経路で前記回収された原液２００μｌを接種した。前記接種された発育卵を３７℃で３日間培養した後に尿膜液を回収して血球凝集の有無を確認した結果、全て血球凝集において陽性を示した。この組換えウイルスの血球凝集力価を測定し、１００倍希釈して同一の方法によって発生卵で増殖させたウイルス（Ｅ２）を－７０℃で保管して実験に用いた。
Figure 0007122772000001
１－３．ウイルス力価の測定
上記の組換えウイルス（Ｅ２）のニワトリ胚での増殖力価（５０％ ｅｍｂｒｙｏ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｄｏｓｅ、ＥＩＤ５０／ｍｌ）を測定するために、それぞれの組換えウイルスをリン酸緩衝溶液で１０－１～１０－９まで１０進希釈し、各希釈倍数別に１０～１１日齢のＳＰＦ発育卵５個に尿膜腔経路で１００μｌずつ接種した。その後、３日間培養した後、尿膜液を回収してニワトリの赤血球で血球凝集有無を確認し、Ｓｐｅａｒｍａｎ－Ｋａｒｂｅｒ ｍｅｔｈｏｄ計算式によってウイルス力価（ＥＩＤ５０／ｍｌ）を測定した。
１－４．１０日齢発育卵での増殖性の比較
上の１－３から得られたウイルス力価（ＥＩＤ５０／ｍｌ（ｌｏｇ１０））を基に１００ ＥＩＤ５０のウイルスを各５個の１０日齢発育卵に尿膜腔経路で１００μｌずつ接種した後、その後、３日間培養した後に尿膜液を回収し、上と同一にＥＩＤ５０／ｍｌを測定して発育卵での増殖性を比較した結果を下の表１に示した。ウイルス力価（ＥＩＤ５０／ｍｌ（ｌｏｇ１０））をよく見ると、発育卵での増殖力価は、ｒＨ５Ｎ６、ｒＨ５Ｎ６－Ｈ１０３Ｙ、ｒＨ５Ｎ６－３１０ＰＢ２、ｒＨ５Ｎ６－Ｈ１０３Ｙ－３１０ＰＢ２の四つのウイルス全ての場合で１０９．０ ＥＩＤ５０／ｍｌ以上の高い増殖性を示すことを確認した。ＮＰ、Ｍ、ＮＳ遺伝子を変更したｒＨ５Ｎ６－ＩＧとｒＨ５Ｎ６－Ｈ１０３Ｙ－ＩＧウイルスも約１０９．０ ＥＩＤ５０／ｍｌの増殖性を示した。
Figure 0007122772000002
１－５．組換えウイルスの哺乳類細胞での増殖性の確認
各組換えウイルスが哺乳類細胞で増殖するかを比較するために、Ｍａｄｉｎ－Ｄａｒｂｙ Ｃａｎｉｎｅ Ｋｉｄｎｅｙ（ＭＤＣＫ）細胞株とＡ５４９細胞株での成長曲線を確認した。ＭＤＣＫ細胞株の場合、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏ．、ＣＡ、ＵＳＡ）培地に１０％ Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ）を入れて維持し、Ａ５４９細胞株の場合、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏ．、ＣＡ、ＵＳＡ）培地に１０％ ＦＢＳを入れて維持した。二つの種類の細胞株をそれぞれ１２ ｗｅｌｌ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｐｌａｔｅにｍｏｎｏ－ｌａｙｅｒを形成させた後、各組換えウイルスを５×１０５／０．５ｍｌ接種した後、０、２４、４８、７２時間ごとに上層液を１００μｌずつ収得した。収得した上層液は、１０－１～１０－９まで１０進希釈して９６ ｗｅｌｌ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｐｌａｔｅにｍｏｎｏ－ｌａｙｅｒが形成されたＭＤＣＫ ｃｅｌｌに接種し、Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｏｓｅ（ＴＣＩＤ５０／０．１ｍｌ）を測定して図２にその結果を示した。ＭＤＣＫ細胞とＡ５４９細胞いずれにおいてもｒＨ５Ｎ６はｒＰＲ８レベルに増殖したことに比べて、ｒＨ５Ｎ６－Ｈ１０３Ｙは、ＭＤＣＫ細胞では同様に増殖したが、Ａ５４９細胞では増殖性が落ち、ｒＨ５Ｎ６－３１０ＰＢ２とｒＨ５Ｎ６－Ｈ１０３Ｙ－３１０ＰＢ２は、二つの細胞いずれにおいても増殖しないことを確認した。
１－６．耐熱性の比較
Ｈ１０３Ｙが実際に耐熱性を高めて発育卵及び哺乳類細胞株とマウスでの増殖性が増加するかを確認するために、ｒＨ５Ｎ６－３１０ＰＢ２とｒＨ５Ｎ６－Ｈ１０３Ｙ－３１０ＰＢ２ウイルスをそれぞれ５５℃で０、１５、３０、４５、６０、９０分間処理した後、ＨＡ ｔｅｓｔを通じてＨＡ力価を比較した結果を図２に示した。ｒＨ５Ｎ６－３１０ＰＢ２とは異なり、ｒＨ５Ｎ６－Ｈ１０３Ｙ－３１０ＰＢ２の場合、９０分までもＨＡタンパク質が安定して耐熱性を高めることを確認した（図３）。
１－７．耐酸性の比較
Ｈ１０３Ｙが耐酸性に及ぶ影響を確認するために、ｒＨ５Ｎ６とｒＨ５Ｎ６－Ｈ１０３ＹウイルスをそれぞれｐＨ５．０からｐＨ６．０までの多様な環境で１時間の間反応させた後、哺乳類細胞株と卵に接種した結果、ｒＨ５Ｎ６－Ｈ１０３Ｙは、低いｐＨで活性を失い、ＭＤＣＫ細胞ではｐＨ５．２以下で増殖性を失い、発育卵ではｐＨ５．０で増殖性を失って酸性環境でより容易に不活化することを確認した。ヒトから分離されるインフルエンザウイルスは、より低いｐＨでＨＡタンパク質のｆｕｓｉｏｎが起き、鳥インフルエンザは、相対的に高いｐＨで活性を示すことが知られており、ｒＨ５Ｎ６－Ｈ１０３Ｙ－３１０ＰＢ２ウイルスは、低いｐＨでの活性が除去されることで人体への伝播危険性がより低いことが分かった（図４）。
１－８．抗原量の比較
Ｈ１０３Ｙを適用したときに抗原量が増加するかを確認するために、同量のｒＨ５Ｎ６－３１０ＰＢ２とｒＨ５Ｎ６－Ｈ１０３Ｙ－３１０ＰＢ２ウイルスを尿膜液の超遠心分離を通じて分離し、Ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｃ Ａｃｉｄ（ＢＣＡ）ａｓｓａｙを通じて総ウイルスタンパク質量を測定し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥを通じて各ウイルス構成タンパク質別の量を比較した。ｒＨ５Ｎ６－Ｈ１０３Ｙ－３１０ＰＢ２は、ｒＨ５Ｎ６－３１０ＰＢ２と発育卵での増殖力価であるＥＩＤ５０／ｍｌは多少低いが、ＨＡ力価とウイルス総タンパク質量及びＳＤＳ－ＰＡＧＥでのタンパク質別の量において一層優れ、増殖力価に比べて抗原量がより優れることを確認した（図５）。
Figure 0007122772000003
１－９．体液性免疫刺激能の比較
ｒＨ５Ｎ６－Ｈ１０３Ｙ－３１０ＰＢ２は、ｒＨ５Ｎ６－３１０ＰＢ２に比べて類似した増殖力価であるときに抗原量がより優れていたが、実際に不活化してオイルエマルジョンワクチンとしてニワトリとカモに接種したとき、抗体形成がさらに増加するかを確認した。３週齢のニワトリに接種したとき、接種３週目に、ｒＨ５Ｎ６－Ｈ１０３Ｙ－３１０ＰＢ２接種ニニワトリ群は、平均１７２．３であって、ｒＨ５Ｎ６－３１０ＰＢ２接種ニワトリ群に比べて約２倍程度の抗体力価を示し、カモでは、程度は低いが向上した抗体力価を確認して、ｒＨ５Ｎ６－Ｈ１０３Ｙ－３１０ＰＢ２が不活化オイルエマルジョンワクチンとしてより良い体液性免疫刺激能力を示した。
Figure 0007122772000004
１－１０．細胞性免疫刺激能の比較
ｒＨ５Ｎ６－ＩＧは、ｒＨ５Ｎ６－３１０ＰＢ２に比べて類似した増殖力価で発育卵に接種したとき、収得される抗原量がより少なかったが、実際に不活化してオイルエマルジョンワクチンとしてニワトリに接種したとき、抗体形成がより低かった。３週齢のニワトリに接種したとき、接種３週目に、ｒＨ５Ｎ６－３１０ＰＢ２接種ニワトリ群は、平均１１８．５であり、ｒＨ５Ｎ６－ＩＧ接種ニワトリ群の場合、６４であって、約２倍程度の低い抗体力価を示したが、野外株Ｈ５Ｎ６ウイルスを攻撃接種した後に１、３、５、７日目に咽喉頭腔と総排泄腔へのウイルス排出はより速く終了して、内部遺伝子を鳥インフルエンザウイルス由来のゲノム切片に置換した場合、抗体形成能は低いが、ｖｉｒａｌ ｃｌｅａｒａｎｃｅが一層効果的に行われることが確認できた。
Figure 0007122772000005
Figure 0007122772000006
配列番号１: (H5N6 HA)
MEKIVLLLAVVSLVKSDQICIGYHANNSTEQVDTIMEKNVTVTHAQDILEKTHNGRLCDLNGVKPLILKDCSVAGWLLGNPMCDEFIRVPEWSYIVERANPANDLCYPGNLNDYEELKHLLSRINHFEKTLIIPKSSWPNHETSGVSAACPYQGVPSFFRNVVWLTKKNDAYPTIKMSYNNTNGEDLLILWGIHHSNNAAEQTNLYKNPTTYVSVGTSTLNQRLVPKIATRSQVNGQQGRMDFFWTILKPNDAIHFESNGNFIAPEYAYKIVKKGDSTIMKSEMEYGHCNTKCQTPIGAINSSMPFHNIHPLTIGECPKYVKSNKLVLATGLRNSPLASGRGLFGAIAGFIEGGWQGMVDGWYGYHHSNEQGSGYAADRESTQKAIDGVTNKVNSIIDKMNTQFEAVGREFNNLERRIENLNKKMEDGFLDVWTYNAELLVLMENERTLDFHDSNVKNLYDKVRLQLRDNAKELGNGCFEFYHKCDNECMESVRNGTYDYPQYSEEARLKREEISGVKLESIGTYQILSIYSTVASSLALAIIVAGLSLWMCSNGSLQCRICI*
配列番号２: (H5N6 HA-H103Y)
MEKIVLLLAVVSLVKSDQICIGYHANNSTEQVDTIMEKNVTVTHAQDILEKTHNGRLCDLNGVKPLILKDCSVAGWLLGNPMCDEFIRVPEWSYIVERANPANDLCYPGNLNDYEELKYLLSRINHFEKTLIIPKSSWPNHETSGVSAACPYQGVPSFFRNVVWLTKKNDAYPTIKMSYNNTNGEDLLILWGIHHSNNAAEQTNLYKNPTTYVSVGTSTLNQRLVPKIATRSQVNGQQGRMDFFWTILKPNDAIHFESNGNFIAPEYAYKIVKKGDSTIMKSEMEYGHCNTKCQTPIGAINSSMPFHNIHPLTIGECPKYVKSNKLVLATGLRNSPLASGRGLFGAIAGFIEGGWQGMVDGWYGYHHSNEQGSGYAADRESTQKAIDGVTNKVNSIIDKMNTQFEAVGREFNNLERRIENLNKKMEDGFLDVWTYNAELLVLMENERTLDFHDSNVKNLYDKVRLQLRDNAKELGNGCFEFYHKCDNECMESVRNGTYDYPQYSEEARLKREEISGVKLESIGTYQILSIYSTVASSLALAIIVAGLSLWMCSNGSLQCRICI*
配列番号３: (H5N6 NA)
MNPNQKITCISATGVTLSVVSLLIGITNLGLNIGLHYKVSDSTTMNIPNMNETNPTTTNITNIIMNKNEERTFLKLTKPLCEVNSWHILSKDNAIRIGEDAHILVTREPYLSCDPQGCRMFALSQGTTLRGQHANGTIHDRSPFRALISWEMGQAPSPYNTRVECIGWSSTSCHDGISRMSICISGPNNNASAVVWYRGRPVTEIPSWAGNILRTQESECVCHKGICPVVMTDGPANSKAATKIIYFKEGKIQKTEELQGNAQHIEECSCYGAAGMIKCVCRDNWKGANRPIITIDPEMMTHTSKYLCSKILTDTSRPNDPTNGNCDAPITGGSPDPGVKGFAFLDGENSWLGRTISKDSRSGYEMLKVPNAEIDTQSGPISYQLIVNNQNWSGYSGAFIDYWANKECFNPCFYVELIRGRPKESGVLWTSNSMVALCGSRERLGSWSWHDGAEIIYFK*
配列番号４: (A/chicken/Korea/01310/2001(H9N2)-PB2)
MERIKELRDLMSQSRTREILTKTTVDHMAIIKKYTSGRQEKNPALRMKWMMAMKYPITADKRIMEIIPERNEQGQTLWSKTNDAGSDKVMVSPLAVTWWNRNGPTTSTIHYPKVYKTYFEKVERLKHGTFGPIHFRNQVKIRRRVDINPGHADLSAREAQDVIMEVVFPNEVGARILTSESQLTITKEKKEELQDCKIAPLMVAYMLERELVRKTRFLPVAGGTSSVYIEVLHLTQGTCWEQMYTPGGEVRNDDVDQSLIIAARNIVRRATVSADPLASLLEMCHGTQIGGIRMVDILRQNPTEEQAVDICKAAIGLRISSSFSFGGFTFKRTSGSSVKKEEEVLTGNLQTLKIRVHEGYEEFTMVGRRATALLRKATRRLIQLIVSGRDEQSIAEAIIVAMVFSQEDCMIKAVRGDLNFVNRANQRLNPMHQLLRHFQKDAKVLFQNWGIEPIDNVMGMIGILPDMTPSTEMSLRGVRVSKMGVDEYSSTERVVVSIDRFLRVRDQRGNILLSPEEVSETQGTEKLTITYSSSMMWEINGPESVLVNTYQWIIRNWETVKIQWSQDPTMLYNKVEFEPFQSLVPKAARGQYSGFVRTLFQQMRDVLGTFDTVQIIKLLPFAAAPPEQSRMQFSSLTVNVRGSGMRILVRGNSPVFNYNKATKRLTVLGKDAGALTEDPDEGTAGVESAVLRGFLILGKEDKRYGPALSINELSNLAKGEKANVLIGQGDVVLVMKRKRDSSILTDSQTATKRIRMAIN*
配列番号５: (A/wild duck/Korea/SNU50-5/2009(H5N1)-NP)
MASQGTKRSYEQMETGGERQNATEIRASVGRMVGGIGRFYIQMCTELKLSDYEGRLIQNSITIERMVLSAFDERRNKYLEEHPSAGKDPKKTGGPIYRRRDGKWMRELILYDKEEIRRIWRQANNGEDATAGLTHLMIWHSNLNDATYQRTRALVRTGMDPRMCSLMQGSTLPRRSGAAGAAVKGVGTMVMELIRMIKRGINDRNFWRGENGRRTRIAYERMCNILKGKFQTAAQRAMMDQVRESRNPGNAEIEDLIFLARSALILRGSVAHKSCLPACVYGLAVASGYDFEREGYSLVGIDPFRLLQNSQVFSLIRPNENPAHKSQLVWMACHSAAFEDLRVSSFIRGTRVVPRGQLSTRGVQIASNENMETMDSSTLELRSRYWAIRTRSGGNTNQQRASAGQISVQPTFSVQRNLPFERATIMAAFTGNTEGRTSDMRTEIIRMMESARPEDVSFQGRGVFELSDEKATNPIVPSFDMSNEGSYFFGDNAEEYDN*
配列番号６: (A/chicken/Korea/KBNP-0028/00(H9N2)-NS)
MDSNTVSSFQVDCFLWHVRKRFADQELGDAPFLDRLRRDQKSLRGRGSTLGLDIETATRGGKQIVERILFKESDEALKMTVASVPATRYLTDMTLEEMSRDWFMLMPKQKVAGSLCIKIDQAIMDKTITLKANFSVTFGRLETLILLRAFSEEGAIVGEISPLPSLPGHTDEDVKNAIGVLIGGLEWNNNTVRVSETLQRFAWRSSDENGRPPLPPKQKQKMARTIGSEV*RNKVADRRGAT*IKDYGEQL*TNNIYASLTTIA*
配列番号７: (A/chicken/Korea/01310/2001(H9N2)-M)
MSLLTEVETYVLSIVPSGPLKAEIAQRLEDVFAGKNTDLEALMEWLKTRPILSPLTKGILGFVFTLTVPSERGLQRRRFVQNALNGNGDPNNMDRAVKLYRKLKREITFHGAKEVALSYSTGALASCMGLIYNRMGTVTTEVAFGLVCATCEQIADSQHRSHRQMVATTNPLIRHENRMVLASTTAKAMEQMAGSSEQAAEAMEVASQARQMVQAMRTIGTHPSSSAGLKDDLLENLQAYQKRMGVQIQRFK*TSRYCRKYHWDLALDIVDS*SSFLQMHLSSP*IRFEKRAFYGRSA*VYEGRVSTGTAECCGC*

Claims (10)

  1. インフルエンザウイルスＨ５Ｎ６ストレインのヘマグルチニン（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ：ＨＡ）タンパク質であって、配列番号１のアミノ酸配列でＮ末端から１０３番目のアミノ酸であるヒスチジン（Ｈ）がチロシン（Ｙ）に突然変異したヘマグルチニンタンパク質；
    Ｈ５Ｎ６ストレインのノイラミニダーゼ（ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ：ＮＡ）；
    低病原性インフルエンザウイルスの重合酵素Ｂ２（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｓｕｂｕｎｉｔ Ｂ２：ＰＢ２）；及び
    インフルエンザウイルスＨ１Ｎ１ストレインの重合酵素Ｂ１（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｓｕｂｕｎｉｔ Ｂ１：ＰＢ１）、重合酵素Ａ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｓｕｂｕｎｉｔ Ａ：ＰＡ）、ヌクレオカプシドタンパク質（ｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ；ＮＰ）、マトリックスタンパク質（ｍａｔｒｉｘ：Ｍ）及び非構造的タンパク質（ｎｏｎｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ：ＮＳ）からなる群より選択された一つ以上のタンパク質を含み、
    前記低病原性インフルエンザウイルスは、低病原性インフルエンザウイルス０１３１０ストレインであり、
    前記インフルエンザウイルスＨ１Ｎ１ストレインは、Ａ／ＰｕｅｒｔｏＲｉｃｏ／８／３４（ＰＲ８）であることを特徴とする、寄託番号ＫＣＴＣ１４２６１ＢＰで寄託されたＨ５Ｎ６組換えインフルエンザウイルス。
  2. インフルエンザウイルスＨ５Ｎ６ストレインのヘマグルチニン（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ：ＨＡ）タンパク質であって、配列番号１のアミノ酸配列でＮ末端から１０３番目のアミノ酸であるヒスチジン（Ｈ）がチロシン（Ｙ）に突然変異したヘマグルチニンタンパク質；
    インフルエンザウイルスＨ５Ｎ６ストレインのノイラミニダーゼ（ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ：ＮＡ）；
    低病原性インフルエンザウイルスの重合酵素Ｂ２（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｓｕｂｕｎｉｔＢ２：ＰＢ２）、マトリックスタンパク質（ｍａｔｒｉｘ：Ｍ）；
    インフルエンザウイルスＨ１Ｎ１ストレインの重合酵素Ｂ１（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｓｕｂｕｎｉｔ Ｂ１：ＰＢ１）、重合酵素Ａ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｓｕｂｕｎｉｔ Ａ：ＰＡ）；
    インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１ストレインのヌクレオカプシドタンパク質（ｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ；ＮＰ）；及び
    インフルエンザウイルスＨ９Ｎ２の非構造的タンパク質（ｎｏｎｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ：ＮＳ）からなる群より選択された一つ以上のタンパク質を含み、
    前記低病原性インフルエンザウイルスは、低病原性インフルエンザウイルス０１３１０ストレインであり、
    前記インフルエンザウイルスＨ１Ｎ１ストレインは、Ａ／ＰｕｅｒｔｏＲｉｃｏ／８／３４（ＰＲ８）であることを特徴とする、寄託番号ＫＣＴＣ１４３９１ＢＰで寄託されたＨ５Ｎ６組換えインフルエンザウイルス。
  3. 前記インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１ストレインは、Ａ／ｗｉｌｄ ｄｕｃｋ／Ｋｏｒｅａ／ＳＮＵ５０－５／２００９であることを特徴とする、請求項２に記載のＨ５Ｎ６組換えインフルエンザウイルス。
  4. 前記インフルエンザウイルスＨ９Ｎ２ストレインは、Ａ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｋｏｒｅａ／ＫＢＮＰ－００２８／００であることを特徴とする、請求項２に記載のＨ５Ｎ６組換えインフルエンザウイルス。
  5. インフルエンザウイルスＨ５Ｎ６ストレインのヘマグルチニンタンパク質をコーディングするポリヌクレオチドであって、前記ヘマグルチニンタンパク質の配列番号１のアミノ酸配列でＮ末端から１０３番目のアミノ酸であるヒスチジン（Ｈ）がチロシン（Ｙ）に突然変異したポリヌクレオチド；
    Ｈ５Ｎ６ストレインのノイラミニダーゼをコーディングするポリヌクレオチド；
    低病原性インフルエンザウイルスの重合酵素Ｂ２をコーディングするポリヌクレオチド；及び
    インフルエンザウイルスＨ１Ｎ１ストレインの重合酵素Ｂ１、重合酵素Ａ、ヌクレオカプシド、マトリックスタンパク質及び非構造的タンパク質からなる群より選択された一つ以上のタンパク質をコーディングするポリヌクレオチドを含み、
    前記低病原性インフルエンザウイルスは、低病原性インフルエンザウイルス０１３１０ストレインであり、
    前記インフルエンザウイルスＨ１Ｎ１ストレインは、Ａ／ＰｕｅｒｔｏＲｉｃｏ／８／３４（ＰＲ８）であることを特徴とする、寄託番号ＫＣＴＣ１４２６１ＢＰで寄託されたＨ５Ｎ６組換えインフルエンザウイルスの製造用組成物。
  6. インフルエンザウイルスＨ５Ｎ６ストレインのヘマグルチニン（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉ
    ｎｉｎ：Ｈ）タンパク質であって、配列番号１のアミノ酸配列でＮ末端から１０３番目のアミノ酸であるヒスチジン（Ｈ）がチロシン（Ｙ）に突然変異したヘマグルチニンタンパク質；
    インフルエンザウイルスＨ５Ｎ６ストレインのノイラミニダーゼ（ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ：ＮＡ）；
    低病原性インフルエンザウイルスの重合酵素Ｂ２（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｓｕｂｕｎｉｔ Ｂ２：ＰＢ２）、マトリックスタンパク質（ｍａｔｒｉｘ：Ｍ）；
    インフルエンザウイルスＨ１Ｎ１ストレインの重合酵素Ｂ１（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｓｕｂｕｎｉｔ Ｂ１：ＰＢ１）、重合酵素Ａ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｓｕｂｕｎｉｔ Ａ：ＰＡ）；
    インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１ストレインのヌクレオカプシドタンパク質（ｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ；ＮＰ）；及び
    インフルエンザウイルスＨ９Ｎ２の非構造的タンパク質（ｎｏｎｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ：ＮＳ）からなる群より選択された一つ以上のタンパク質をコーディングするポリヌクレオチドを含み、
    前記低病原性インフルエンザウイルスは、低病原性インフルエンザウイルス０１３１０ストレインであり、
    前記インフルエンザウイルスＨ１Ｎ１ストレインは、Ａ／ＰｕｅｒｔｏＲｉｃｏ／８／３４（ＰＲ８）であることを特徴とする、寄託番号ＫＣＴＣ１４３９１ＢＰで寄託されたＨ５Ｎ６組換えインフルエンザウイルスの製造用組成物。
  7. 前記ポリヌクレオチドは、ベクターに含まれたものであることを特徴とする、請求項５又は請求項６に記載の組成物。
  8. 請求項５又は請求項６に記載のＨ５Ｎ６組換えインフルエンザウイルスの製造用組成物で形質転換された細胞。
  9. 前記細胞は、Ａ５４９、２９３Ｔ、ＭＤＣＫ、Ｖｅｒｏ、ＤＦ１、ＰＫ１５及びＳＴ１細胞からなる群より選択されたものであることを特徴とする、請求項８に記載の細胞。
  10. 請求項１又は請求項２に記載のＨ５Ｎ６組換えインフルエンザウイルスを含むワクチン組成物。
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