JP6781045B2 - アッセイ及び薬剤 - Google Patents
アッセイ及び薬剤 Download PDFInfo
- Publication number
- JP6781045B2 JP6781045B2 JP2016546969A JP2016546969A JP6781045B2 JP 6781045 B2 JP6781045 B2 JP 6781045B2 JP 2016546969 A JP2016546969 A JP 2016546969A JP 2016546969 A JP2016546969 A JP 2016546969A JP 6781045 B2 JP6781045 B2 JP 6781045B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- rna
- virus
- segment
- influenza
- segments
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
- A61K35/76—Viruses; Subviral particles; Bacteriophages
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
- C12N7/04—Inactivation or attenuation; Producing viral sub-units
- C12N7/045—Pseudoviral particles; Non infectious pseudovirions, e.g. genetically engineered
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
- A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
- C12N7/04—Inactivation or attenuation; Producing viral sub-units
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2320/00—Applications; Uses
- C12N2320/10—Applications; Uses in screening processes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
- C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
- C12N2760/16132—Use of virus as therapeutic agent, other than vaccine, e.g. as cytolytic agent
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
- C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
- C12N2760/16161—Methods of inactivation or attenuation
- C12N2760/16162—Methods of inactivation or attenuation by genetic engineering
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Virology (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Oncology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Mycology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
(a)300〜600ヌクレオチド長のRNA、
(b)セグメント1、2又は3の5'及び3'末端由来の少なくとも100ヌクレオチド、
(c)前記セグメントのヌクレオチドの中央欠失、
を含み、前記欠陥干渉インフルエンザウイルスがインフルエンザAのセグメント1、2及び3からのRNA生産に干渉することができる、前記ウイルスを提供する。
本発明の様々な態様を以下に示す。
1.RNAが、コードされる任意のタンパク質の発現を防ぐように変異している、欠陥干渉ウイルスRNA。
2.一以上のAUG開始コドンが変異している、1に記載のDIウイルスRNA。
3.全てのAUG開始コドンが変異している、2に記載のDIウイルスRNA。
4.一以上のAUGがAUCに変異している、2又は3に記載のDIウイルスRNA。
5.DIウイルスが1/244である、1〜4のいずれかに記載のDIウイルスRNA。
6.1〜5のいずれかに記載のDIウイルスRNAを含む、DIウイルス。
7.インフルエンザA感染の治療又は予防方法における使用のための、6に記載のDIウイルス。
8.試験欠陥干渉インフルエンザウイルスRNAの存在下でインフルエンザAウイルスのセグメント1、2及び3からのRNAの生産をモニターすることを含む、抗ウイルス剤を同定するための方法であって、セグメント1、2及び3のそれぞれからのRNAの生産に干渉する欠陥干渉ウイルスRNAが抗ウイルス剤として同定される、前記方法。
9.宿主細胞において実施される、8に記載の方法。
10.宿主細胞に、インフルエンザウイルスのセグメント1、2及び3を含む核酸が遺伝子導入される、9に記載の方法。
11.前記セグメント1、2及び3のそれぞれが、別々のプラスミドにおいて提供される、10に記載の方法。
12.セグメント1、2及び3のそれぞれからのRNAの生産が、別々のアッセイでモニターされる、8又は9に記載の方法。
13.RNAがcRNA、mRNA及び/又はvRNAを含む、8〜12のいずれかに記載の方法。
14.cRNA及びmRNAの両方の生産がモニターされる、13に記載の方法。
15.セグメント1、2又は3の一以上が、該セグメントからのRNAの生産の低減がレポーター遺伝子の発現を低減させるように、コードされたレポーター遺伝子を有する構築物として提供される、8〜12のいずれかに記載の方法。
16.8〜15のいずれかに記載の方法により同定される、インフルエンザA感染の治療又は予防方法における使用のための、抗ウイルス剤。
17.セグメント1、2又は3に由来するRNAを含む、クローン化された又は組換え欠陥干渉インフルエンザAウイルスであって、前記RNAが:
(a)300〜600ヌクレオチド長のRNA、
(b)セグメント1、2又は3の5'及び3'末端由来の少なくとも100ヌクレオチド、
(c)前記セグメントのヌクレオチドの中央欠失、
を含み、前記欠陥干渉インフルエンザウイルスがインフルエンザAのセグメント1、2及び3からのRNA生産に干渉することができる、前記ウイルス。
18.DIウイルスが1/244ではない、17に記載の欠陥干渉ウイルス。
19.インフルエンザA感染の治療又は予防方法における使用のための、17又は18に記載の欠陥干渉ウイルス。
材料及び方法
プラスミド
A/WSN株及びA/WS/33の8つの遺伝子セグメントをコードするプラスミド、及びポリメラーゼタンパク質及びNPを発現するプラスミド(Neumann et al. 1999)、並びに1/244 DI RNA(図1)を発現するベクターは、以前記載した通り(Duhaut and Dimmock 2002;Dimmock et al. 2008)である。1/244 RNAは、395 ntを含み、A/プエルトリコ/8/34(H1N1)に由来した。セグメント1標的、セグメント1-GFPは、プライマー5'ATGGTCTCTACTGATGGTGAGCAAGGGCGAG及び5'ATGAAGACAATCTCTTACTTGTACAGCTCGTCCAを用いて、pEGFP-N1(Clontech)からのPCRによるGFP OCRの増幅によって作製した。産物を、GFP ORFがPB2 ORFとインフレームであるようにpPolI-220(Duhaut and Dimmock 2000)のBpiI及びEco31Iサイトの間に挿入し、セグメント1-GFP RNAを発現するプラスミドseg 1-GFPを得た(図1)。GFPレポーターは、セグメント1の正確な5'末端(220 nt)及び3'末端(48 nt)を維持し、1/244 DI RNAに対しコグネート(cognate)である。セグメント2 DI(2/265;ネガティブセンスコグネートRNAの5'末端の265 nt及び3'末端の187 ntを有する全長452 ntを含む)を、RT-PCR増幅によってDI A/ウマ/ニューマーケット/7339/79(H3N8)ウイルス調製物(図1)から単離し((Mann et al. 2006)、続いてpPolI-SapIT発現ベクターにクローニングした(Subbarao et al. 2003)。セグメント3 DI RNA(3/262;ネガティブセンスコグネートRNAの5'末端の262 nt及び3'末端の207 ntを有する全長469 ntを含む)をDI A/WSN調製物から単離し、増幅して上記の通りクローニングした(図1)。様々なプラスミドによってコードされるDI RNAは、それらが由来するウイルスのゲノムセグメントの末端の正確なヌクレオチド配列を維持し、複製又はパッケージングに影響を与えることが知られている位置にいかなる変異も含まない。
ヒト293T細胞に、以前記載した通りに遺伝子導入した(Dimmock et al. 2008)。手短には、ノーザンブロット分析については、12ウェルプレート中の70%コンフルエントの293T細胞に、TransIT LT1トランスフェクション試薬(Mirus)を用いて、ウイルスセンスRNAコードする8 PolI発現プラスミド、及びPB2、PB1、PA及びNPタンパク質の発現のためのcRNAプラスミドを、pPolI-244と共に、又はpPolI-244なしで遺伝子導入した。その後、遺伝子導入した細胞を、25 cm2フラスコでMDCK細胞と共培養する前に、37℃で一晩インキュベートした。全細胞RNAを、共培養の1、2、及び3日後にサンプルごとに2 mlのTrizol試薬(Invitrogen)で抽出し、同時に組織培養液をウイルス力価測定及びRNA抽出のために回収した。ビリオンを、限外濾過によって精製した。RNAを、フェノール/クロロホルムで抽出し、その後エタノール沈殿させた。遺伝子導入については、70%コンフルエントの293T細胞を含む6ウェルプレートの各ウェルに、PB2、PB1、PA及びNP cDNA発現プラスミド各1 μgと、様々な量のDIプラスミド又はpPolI-NAを、1 μgの標的プラスミド共に遺伝子導入した。37℃での2日間のインキュベーション後、上清を捨て、RNAをTrizolで抽出した。
96ウェルプレートのMDCK細胞単層に、先に記載した通りにレスキューしたA/WSNを含む上清を感染させた(Scott et al. 2011)。ウイルスの付着の1時間後、単層をPBSで洗浄し、維持培地において33℃で一晩インキュベートした。その後、細胞を4%(v/v)ホルムアルデヒドで固定し、PBS中の5%(w/v)ミルク粉末でブロッキングした。感染した細胞を、0.1 % Tween 20を含むPBS中で、A/WSNのHAに特異的なモノクローナル抗体でプローブした。洗浄後、0.1 % Tween 20を含むPBS中のヤギ抗マウスIgGアルカリホスファターゼコンジュゲート(Sigma)を添加し、感染細胞をトリスバッファー塩化マグネシウム及び塩化ナトリウム(0.1 M、pH 9.5)中で、ニトロテトラゾリウムブルークロリド/BCIP(Sigma)により検出した。感染力価を、三つ組のウェルのそれぞれにおいて、適切な希釈で少なくとも50の陽性染色細胞(フォーカス)を数えることによって決定した。カウントの平均値を、フォーカス形成単位(f.f.u.)ml-1で力価を表すために決定した。
全細胞RNAを、遺伝子導入の48時間後にTrizolにより細胞から抽出し、プライマー伸長分析に用いた(Rehwinkel et al. 2010)。2 μgの全RNAを、13 μlの全容量で[32P]5'末端標識プライマー及びdNTPと混合した。混合物を65℃で5分間加熱し、1分間氷上に置いた。2×ファーストストランドバッファー、20 mM DTT、及び100 UのSuperScript III逆転写酵素(Invitrogen)を添加し、55℃でさらに1時間インキュベートした。反応を、ゲルローディングダイII(Ambion)と共に95℃で5分間加熱することによって終了させた。転写産物を、TBEバッファー中に7M尿素を含む6%(w/v)ポリアクリルアミドゲルで分離し、蛍光画像によって検出した。用いたプライマーを表1に示し、様々な標的RNAに対するこれらの位置を、図1に示す。
各サンプルから、10 μgの全細胞RNA又は精製されたウイルスRNAの産物の50%を、グリオキサール−アガロースゲル電気泳動のために用いた。RNAを、20×SSCを用いて、一晩ハイボンドNメンブレン(Hybond-N membrane)(GE Healthcare)に移した。その後、膜を80℃で2時間乾燥させ、ジゴキシゲニン(DIG)標識プローブを一晩ハイブリダイズした。全長ポジティブセンスDIG標識セグメント1、セグメント2及びセグメント7プローブを、T7プロモーターを含むPCR産物から、DIG-UTP(Roche)の存在下でin vitroで転写した。ジオキシゲニン特異的アルカリホスファターゼコンジュゲートFAb抗体フラグメント及び化学発光CSPD基質を有するRocheの系を検出に用いた。ブロットを、望ましい強度が達成されるまでFuji X線フィルムに暴露し、バンドを、Image Jを使用するデンシトメトリー(NIH)によって定量した。
293T細胞にセグメント1-GFP RNA発現プラスミド、PB1、PB2、PA及びNPタンパク質を発現するプラスミド、並びにDI RNA (1/244、2/265及び3/262)又は全長RNA(セグメント4又は6)を発現する追加の増加量のPolIプラスミドを遺伝子導入した。遺伝子導入2日後、培養物をGFP発現について試験した。位相差及び落射蛍光顕微鏡によって、細胞単層のデジタル画像を得た。GFPを発現する可視化エリアの部分について、HCイメージソフトウェア(Hamamatsu)を用いて5つの視野の蛍光画像を無作為に選択及び分析した。可視化によって、様々なレベルのレポータープラスミドを遺伝子導入され得た細胞を含む、ある範囲のGFPレベルを発現する細胞を検出する。単層ごとにGFP陽性エリアの割合を得るために、平均値を計算した。
1/244 DI RNAは、セグメント1のパッケージングに干渉する
1/244 DI RNAが存在する唯一のDI RNAであったインフルエンザウイルス調製物を作製するために、本発明者はプラスミドレスキューシステムを用いた(Dimmock et al. 2008)。セグメント1からのDI RNA 1/244の誘導を、図1に示す。これを、感染細胞及び共培養の1〜3日後の精製されたウイルス粒子におけるセグメント1、2及び7のvRNAのレベルに対する増加量の1/244 DI DNAの効果を調べるために用いた。以前に、全てのウイルスRNAポリメラーゼ成分が存在する場合にのみインフルエンザvRNAが検出可能であることが示されており、これはvRNAがウイルスポリメラーゼによって作製されることを示している(Duhaut and Dimmock 2002)。1/244 DI RNA(395 nt)は、1/244プラスミドを遺伝子導入した培養物においてのみ観察され、実験中他のセグメント1 DI RNA配列が生成されなかったことを確認している(図2a)。遺伝子導入における1/244 DIプラスミドDNAの量が増加するにしたがって、試験した3日間のそれぞれで細胞において検出されるセグメント7 vRNAのレベルの漸減が認められた。3日間のそれぞれで増加する1/244プラスミドと共に観察されたウイルス感染力価の低下により、1/244 DI RNA媒介干渉が起こっていたことを確認した(図2b)。1/244 DIプラスミドの入力が増加するにしたがって、ウイルス粒子中のセグメント1 vRNAのレベルは劇的に低下し、1 μgの1/244プラスミドが遺伝子導入された場合検出不可能であった(図2a、下部パネル)。定量により、1/244 RNAの存在下で、セグメント1:セグメント7 vRNAの比が、細胞抽出物におけるものよりもビリオンにおいてかなり低かったことが示された。これは、(セグメント1に由来する)1/244 DI RNAが、少なくとも部分的に、後代ウイルス粒子からの全長セグメント1 vRNAを選択的に排除することによって作用することを証明した。ビリオンのセグメント2 vRNAの量は、増加量の遺伝子導入1/244プラスミドの存在下で低減されず(図2c、d)、これにより1/244 RNAによるセグメント1のパッケージングの阻害が特異的であることが確認され、他のポリメラーゼ成分にコードされるRNAセグメントには拡張されなかった。
DI RNAの、RNAパッケージング由来のウイルスRNA合成への潜在的な影響を分けるために、本発明者は、GFPコードネガティブセンス標的RNA(セグメント 1-GFP;図1)の転写及び複製が、PB1、PB2、PA及びNPタンパク質を発現するプラスミドの共遺伝子導入によって可能となったGFP発現アッセイを考案した。このシステムは、重要な構造タンパク質(HA、NA、M1及びM2)をコードするプラスミドが除かれたため、ウイルスRNA合成を可能とするが、ウイルス粒子形成を可能としない。共遺伝子導入したDI RNAをコードするプラスミドの効果を、GFP蛍光をモニターすることによって評価した。PB2タンパク質をコードするプラスミドの非存在下では、GFP発現は全く検出されなかった(データ示さず)。図3aは、1 μgの空ベクターを遺伝子導入した培養物に比べて、1/244 DIプラスミドが、用量依存的に蛍光を強く阻害したことを示す。阻害は、細胞に全長セグメント4又はセグメント6 vRNAを合成するプラスミドを遺伝子導入した場合、あまり顕著でなかった。定量により、0.1 μgの1/244 DIプラスミドがGFP蛍光を70%阻害した一方、同様の阻害レベル(61〜69%)を達成するために約10倍より多いセグメント6プラスミドが必要であったことが示された(図3b)。統計分析は、1/244 DI RNAの阻害効果が、セグメント6 RNAの効果に対して高度に有意に異なることを示した(図3b)。したがって、1/244 DI RNAは、セグメント1標的RNAからの発現を強く阻害する。さらに、アッセイは、セグメント2由来のDI RNA(2/265)及びセグメント3由来のDI RNA(3/262)(3/262)もまたセグメント1由来標的からのGFP蛍光を強く阻害した一方で、全長セグメント4 vRNAが、セグメント6 vRNAと同様に、弱い阻害性のみであったことを示した(図3a)。用いたプラスミドDNAの最も高い濃度で(1 μg)、セグメント4 vRNAは、セグメント1由来遺伝子発現を対照レベルの75%まで低減させ、2/265及び3/262 DI RNAは、それぞれ対照の2%及び6%まで発現を低減させた。
セグメント1-GFP PolIプラスミドからのGFPの発現は、ネガティブセンスv RNAのmRNAへの転写に依存する。しかしながら、vRNAはまた、次にさらなるvRNAの生産のための鋳型として作用するcRNAの鋳型でもある。インフルエンザウイルスmRNAは、宿主mRNAから切断された約12ntの5'伸長を有するため(Palese and Shaw 2007)、mRNA及びcRNA産物はサイズによって識別され得る。vRNA、mRNA及びcRNAのレベルを検出するプライマー伸長アッセイを用いて、本発明者は、1/244 DI RNAが干渉する標的RNA合成のステージを同定した(図4a、c)。遺伝子導入されたプラスミドDNAから直接合成されたvRNAの基礎レベルは、図4のパネルb及びdに示されるデータにおいて提示される値から差し引いた。まとめると、図3及び4のデータは、増加量のDI RNAの存在下でのセグメント1-GFPコードmRNAのレベルの低減が、GFP蛍光の低減と強く正に相関していたことを示し(R2 = 0.90;データ示さず)、これにより蛍光がmRNA合成の正確なマーカーであることを確認した。これらのデータの定量により、mRNA及びcRNAのレベルが、0.1 μg〜0.5 μgの1/244プラスミドDNAの存在下でvRNAよりかなり大きく影響されたことが示された(図4b)。0.1 μgの1/244プラスミドDNAの添加は、対照の13%及び10%までmRNA及びcRNAのレベルをそれぞれ低減した一方、vRNAのレベルは61%までしか低減されなかった。しかしながら、1 μgの1/244 DI RNAでは、セグメント1から合成される全ての新規なRNAのレベルが>99%低減された。したがって、1/244 DI RNAは、セグメント1標的から合成される全てのRNAに顕著な効果を有するが、ポジティブ鎖及びネガティブ鎖RNAのレベルに差次的に影響を与える。
1/244 DI RNAのセグメント1コードRNAのレベルを差次的に低減する能力を考慮して、本発明者は同じシステムにおける1/244 DI RNAから合成されるポジティブ及びネガティブセンスRNAのレベルもまた影響を受けたかを調べた。これらのRNAを分析するために用いたゲルは、共移動するcRNA及びmRNAを分離することはできなかった。図7(a)及び(b)は、セグメント1-GFP標的の存在下で、遺伝子導入した1/244DIプラスミドの量が増加するにつれて、1/244 DIポジティブセンスRNAレベルが増加したことを示す。したがって、セグメント1-GFP mRNA及びcRNAレベルが最小となるサンプルの最大値があった(図4a、b)。これは、1/244 DI RNAがインフルエンザポリメラーゼ依存性転写の全てを阻害しないことを明確に示している。しかしながら、1/244 DI特異的vRNAのレベルは、0.1 μgの1/244プラスミドDNAで再現よく最大であり、0.5 μgのプラスミドで最大値の13%まで、1 μgのプラスミドで4%まで低減され(図7b)、これは高濃度の1/244 DI RNAが自身の新規生産vRNAのレベルを低減することを示している。1/244プラスミドDNAが、任意の標的RNAの非存在下で細胞において力価測定された場合、得られる1/244ポジティブセンスRNA及びvRNAのレベルは、セグメント1標的RNAの存在下におけるものと同様であった(図7c、d)。
DIインフルエンザウイルスを研究するのに費やされた多くの年月にもかかわらず、in vitroでの干渉作用のメカニズム、及びin vivoでの疾患からの防御の理解は、未解明のままである。広く提唱されている仮説は、小さなサイズのDI RNAがより速い複製速度のために全長ゲノムを打ち負かすことを可能とし、DIゲノムを含むウイルス粒子の割合が、単純に感染細胞中に存在するDI及びインタクトなゲノムの相対的なレベルを反映しているというものである(Roux et al. 1991; Marriott and Dimmock 2010)。第二の仮説は、DI RNAが、ウイルス又は宿主因子の制限について競合する上で利点を有することである。しかしながら、一般的に、DIゲノムについてこれらの仮説のいずれかを指示する実験的証拠はあまりなく、インフルエンザDIウイルスについては全くない。より最近では、第三の仮説が、インフルエンザウイルスDI RNAが、ゲノムRNAをビリオンにパッケージングするレベルにおいて干渉することを示唆している((Duhaut and McCauley 1996)。さらに、この根底には、異なるインフルエンザDI配列が、異なる生物学的特徴を有するという疑いがある(Duhaut 1998;Dimmock et al. 2008)。干渉プロセスを理解することは、DIゲノムに基づく新規な抗ウイルス剤(antiviral)の開発の新規なアプローチを提供する可能性を有し、以下の考察は、本報告において提示されたデータがどのようにDIインフルエンザウイルスの理解を進めたかを示すものである。
図2は、1/244 DI RNAが、そのコグネート全長セグメント1RNAの新生ビリオンへのパッケージングに特異的に干渉することを示している。したがって、1/244 DI RNAは、限界希釈継代によって濃縮された非クローン化ウイルス集団におけるセグメント1由来317 DI RNAについて(Duhaut and McCauley 1996)、又はクローン化された317 DIウイルスについて(Duhaut and Dimmock 2002)報告されたのと同様のセグメント特異的様式で作用する。これは、インフルエンザウイルスゲノムセグメントのパッケージングが、各ゲノムセグメントの単一コピーからなるアレイ又は複合体の形成を必要とすること、及びこれらのアレイが新たなウイルス粒子にパッケージングされる単一の構造として作用することを示す現在のモデルと一致する(Harris et al. 2006;Noda et al. 2006)。本発明者のデータは、コグネート全長ゲノムRNAとのパッケージングの競合が、全てのインフルエンザウイルスDI RNAの共通の特徴である可能性が高いことを示し、DI RNAの優先的なパッケージングが感染性ウイルスを犠牲にしてDIウイルス粒子の集団を濃縮することを示している。
ウイルス粒子合成の非存在下における、直接的に、又はレポーター遺伝子の発現をモニターすることによって測定した、DIゲノムのセグメント1標的ゲノムRNAからのmRNA合成に対する効果の分析は、1/244 DI RNAが、セグメント1由来標的によって指示されるRNA合成に干渉したことを示す(図3a、b)。全長セグメント4(図3a)又はセグメント6 vRNA(図3a、b)によって媒介されるかなり弱いレベルの阻害によって、この効果がDI RNAに特異的であることが確認された。ゲノムセグメント4及び6を発現する増加レベルのプラスミドにより認められたDNA阻害は、遺伝子導入細胞におけるウイルスポリメラーゼ複合体などの制限因子について競合する高レベルのこれらのRNAによるものであり得る。したがって、インフルエンザDI RNAは、セグメント特異的パッケージング以外の、及びこれに加えたメカニズムによって干渉し得る。
ポジティブ(mRNA及びcRNA)及びネガティブセンス(vRNA)ウイルスRNAの合成は、一方又は他方の機能を消失する特異的な変異体の効果によって実証される様に、異なるプロセスであり(Jorba et al. 2009;Yuan et al. 2009)、本明細書で提示されるデータは、1/244 DI RNAが、その標的によって発現される異なるRNA産物の標準状態レベルに差次的に影響を与えることを示している。増加量の遺伝子導入1/244 DI RNAは、vRNAレベルにはあまり効果を有さず、全長セグメント1由来mRNA及びcRNAレベルの劇的な低減をもたらした;mRNA及びcRNAと同じレベルまでvRNAを低減するためには、4倍より多いプラスミドDNAが必要であった(図4a、b)。したがって、セグメント1由来1/244 DI RNAは、ネガティブセンスvRNAにはかなり低い効果を有し、コグネート標的から作製されるポジティブセンスRNAのレベルを特異的及び優先的に低減した。先の報告に由来するこの相違は、セグメント1由来317 DIウイルスがRNA合成を阻害しなかったということであるが、この研究は分子的にクローン化されたDIウイルスを用いなかった(Duhaut and McCauley 1996)。驚くべきことに、1/244 DI RNAはまた、セグメント2及び3からのmRNA合成を強く阻害し(図6)、これは(ウイルスRNAポリメラーゼの成分をコードする)ゲノムセグメント1〜3が、セグメント1 DI RNAの阻害作用を可能とする共通の特徴を有することを示唆している。これは、DI RNA 2/265及び3/262もまたセグメント1標的からのGFP発現を阻害したことから(図3a)、相互的であると思われる。これは、インフルエンザDI RNAが、その由来となったゲノムセグメント以外のゲノムセグメントからの遺伝子発現に劇的に影響を与え得ることの、初めての証明である。セグメント1からの標的mRNAのレベルを強く低減した1/244 DI RNAのレベルで、それ自身のポジティブセンスRNAレベルは最大であった(図7a、b)。したがって、用量依存的に、1/244 DI RNAは標的セグメント1 RNAからの合成を抑制しながら自身からの転写を優先的に可能とする。
主要なオープンリーディングフレームのAUG開始コドンを維持するDI mRNAは、幾つかのセグメント1由来DI RNAについて示されているように(Akkina et al. 1984)、トランケートされたPB2ペプチドに翻訳される可能性を有し、PB1のPAタンパク質結合ドメインを含む同様の短いポリペプチドは、ウイルスRNAポリメラーゼ活性を強く阻害した((Wunderlich et al. 2009; Manz et al. 2011)。したがって、原則として、1/244 DI RNAに由来するトランケートされたPB2関連ポリペプチドもまた、ウイルスポリメラーゼ活性に支配的な負の効果を発揮し得る。しかしながら、本発明者は、PB2のAUG開始コドン、及びPB2 ORFからの短いポリペプチドの合成を指示し得るさらに下流の2つのインフレームAUGコドンを変異させた1/244 DI RNAの形態を作製することによってこの可能性を除外した(Meng et al、論文投稿済)。本発明者は、この1/244 AUGノックアウトDI RNAが、効果において親1/244 DI RNAのものと区別不能であることを確かめた。それは1/244 DI RNAと同等のレベルのvRNA及びmRNAを生成し、1/244 DI RNAで認められたのと同様にセグメント1からのGFPの発現を阻害した。さらに、1/244 AUGノックアウトRNAを含むDIウイルスは、インフルエンザウイルスのチャレンジ後の疾患から、1/244 DIウイルスと同様にマウスを防御した。これらのデータは、1/244 DIの活性がもっぱらRNAに基づく現象であることを示す。
材料及び方法
リバースジェネティックスによるプラスミド及び感染性ウイルスの生産
A/WSN株及びA/WS/33の8つの遺伝子セグメントをコードするプラスミド、及びポリメラーゼ及びNPタンパク質を発現するプラスミド(Neumann et al. 1999)、並びにPolI プロモーターから1/244 DI RNAを発現するベクターは、以前に記載した(Dimmock et al. 2008;Duhaut and Dimmock 2002)。244 RNAは、395 ntであり、A/プエルトリコ/8/34(H1N1)のセグメント1に由来した。セグメント1標的、セグメント1-GFPは、PCRによってGFP OCRを増幅し、これを、GFP ORFがPB2 ORFとインフレームであるようにpPolI-220(Duhaut and Dimmock, 2000)に挿入することによって作製し、セグメント1-GFP RNAを発現するプラスミドseg 1-GFPを得た(Meng et al. 2012)。GFPレポーターは、セグメント1の正確な5'末端(220 nt)及び3'末端(48 nt)を維持している。ヒト293T細胞に、以前記載した通りにプラスミドを遺伝子導入した(Dimmock et al. 2008)。手短には、12ウェルプレート中の70%コンフルエントの293T細胞に、TransIT LT1トランスフェクション試薬(Mirus)を用いて、ウイルスセンスRNAをコードする8 PolI発現プラスミド、及びPB2、PB1、PA及びNPタンパク質の発現のためのcDNAプラスミドを、pPolI-244又はpPolI-244ノックアウトと共に又はなしで遺伝子導入した。その後、遺伝子導入した細胞を、25 cm2フラスコでMDCK細胞と共培養する前に、37℃で一晩インキュベートした。最後に、組織培養液中のウイルスを、有胚鶏卵に一度継代し、ウイルスストックを生産するために尿膜液を回収した(Dimmock et al. 2008)。
部位特異的変異誘発の2つの連続的ステップを、244 DI RNAの3つの開始コドンを変異させるために行った。pPolI-244プラスミドを鋳型として、及びpfu DNAポリメラーゼ(Promega)を用いた最初のAUGをAUCに変換するための部位特異的変異誘発のために、一対のプライマーを用いた。変異をシーケンシングにより確認した。部位特異的変異誘発の第一ラウンドで生産された構築物を用いて、第二及び第三の開始コドンを変更するプライマーを用いて、部位特異的変異誘発の第二ラウンドを行った。得られた構築物を再びシーケンシングにより確認した。
全細胞RNAを、Trizolを用いてDI感染細胞から単離した。ポリAを含むmRNAを、製造業者の指示に従って、GenElute Direct mRNA調製キット(Sigma)を用いて選択した。mRNA調製中にカラムに結合しなかった非ポリアデニル化RNAを保持した。全RNA、mRNA及び非ポリアデニル化RNAの一定量をギリオキサール−アガロースゲル電気泳動により分離した。電気泳動後、RNAを、20×SSCを用いて、一晩ハイボンドNメンブレン(Hybond-N membrane)(GE Healthcare)に移した。その後、膜を80℃で2時間乾燥させた。全長ネガティブセンスセグメント1プローブを、バクテリオファージT7プロモーターを含むPCR産物から、DIG-UTP(Roche)の存在下でin vitro転写により調製した。膜を、DIG標識プローブで一晩ハイブリダイズし、シグナルを、ジオキシゲニン特異的AP FAb抗体フラグメント及びCSPD基質(Roche)を用いて検出した。
全細胞RNAについてプライマー伸長分析を行った(Rehwinkel et al. 2010)。全RNA(2 μg)を13 μlの全容量で[32P]5'末端標識プライマー及びdNTPと混合した。混合物を65℃で5分間加熱し、1分間氷上に置いた。2×ファーストストランドバッファー、20 mM DTT、及び100 UのSuperScript III逆転写酵素(Invitrogen)を添加し、55℃でさらに1時間インキュベートした。反応を、ゲルローディングダイII(Ambion)と共に95℃で5分間加熱することによって終了させた。転写産物を、TBEバッファー中に7M尿素を含む6%(w/v)ポリアクリルアミドゲルで分離し、蛍光画像によって検出した。
293T細胞にセグメント1-GFP RNA発現プラスミド、PB1、PB2、PA及びNPタンパク質を発現するプラスミド、並びに244 DI又は244 AUGノックアウトDI RNAを発現する追加の増加量のPolIプラスミドを遺伝子導入した。遺伝子導入2日後、培養物をGFP発現について試験した。位相差及び落射蛍光顕微鏡によって、細胞単層のデジタル画像を得た。GFPを発現する可視化エリアの部分について、HCイメージソフトウェア(Hamamatsu)を用いて5つの視野の蛍光画像を無作為に選択及び分析した。可視化によって、様々なレベルのレポータープラスミドを遺伝子導入され得た細胞を含む、ある範囲のGFPレベルを発現する細胞を検出する。単層ごとにGFP陽性エリアの割合を得るために、平均値を計算した。
DIウイルスにより提供される防御の程度を評価するため、C3H/He-mgマウスに、A/WSN単独(10 LD50又は1000 ffu)、A/WSN+活性DIウイルス、又はA/WSN+不活性化DIウイルスの混合物を、エーテル麻酔(light ether anaesthesia)下で鼻腔内接種した。次に、マウスを、本発明者の標準的なプロトコルに従って臨床疾患について、及び以前記載した通りに体重減少についてモニターした(Dimmock et al. 2008)。感染の3週間後に、生存マウスに、高用量のA/WSN(10,000 LD50)をチャレンジし、その免疫状態を決定した。
244 DI RNAのコードポテンシャル
395ヌクレオチドの分子の244 DI RNAは、PR8のセグメント1から、ポジティブセンスRNAの3'末端の244ヌクレオチド及び5'末端の151ヌクレオチドを残す一以上の欠失イベントのの結果として生じた(Dimmock et al. 2008)。244 RNAは、mRNAの転写を指示するゲノムセグメントの末端のシグナルを維持する(図1a)。複製中、インフルエンザウイルスは、二つの形態のポジティブセンスRNAを作製する。複製は、感染性ウイルスのゲノムvRNAのポジティブセンス(cRNA)コピーの合成を含み、これが続いて新たなvRNAの合成の鋳型として用いられる(Palese and Shaw, 2007)。インフルエンザウイルスmRNA合成は、インフルエンザウイルスmRNA合成は、宿主mRNAのキャップされた5'末端から切断されたプライマーを用いて開始され、その合成は、ポリアデニル化の前に、鋳型vRNAの末端の前で終わる(Dias et al. 2009;Fechter et al. 2003;Guilligay et al. 2008;Plotch et al. 1981)。したがって、mRNAは、primerに由来する5'伸長を有し、トランケートされ、3'末端がポリアデニル化されている点でポジティブセンス複製中間体であるcRNAとは異なる。244 DI RNAがmRNAの合成を指示し得ることを確かめるために、244 DIウイルスを感染させた細胞に存在するRNAを調べた。ポジティブセンスRNAを検出する、セグメント1特異的プローブを用いるノーザンブロット分析により、感染細胞中に二つのポリアデニル化ウイルスmRNAを同定した(図2a)。約2.3 kbのより大きなmRNAは、ヘルパーウイルスによって提供される全長ゲノムセグメント1由来のmRNAと一致する。約500塩基のより小さなmRNAは、244 DI RNAがmRNAの合成を指示することを示す。非ポリアデニル化RNA画分で見られたポジティブセンスRNAはcRNAであり、予測される通り、これは244 DI由来mRNAよりもわずかに小さいように見られた。244 DI RNAによって転写されるmRNAは、PB2オープンリーディングフレーム1(ORF-1)の転写開始コドンを含み、これは欠失の結果として作製される異なるリーディングフレームから翻訳される21アミノ酸残基に融合されるPB2の最初の41アミノ酸残基を含むタンパク質をコードする能力を244 DI RNAに与え、全長62残基のタンパク質が作製される(図9b)。この予測タンパク質は、残基1〜35の全PB1結合ドメイン(Sugiyama et al. 2009)及び残基1〜22のミトコンドリア局在ドメインを含む(Carr et al. 2006)。PB2 ORFは、3つの考えられるAUG開始コドンを有する。第一のAUG(PB2の真正の開始コドン)の配列文脈は非常に良いが、第二及び第三は不十分である。しかしながら、翻訳開始が起こらないことを確実にするために、本発明者は3つの考えられる開始コドンの全てを(AUCに)変異させ;その後その配列を確認した。新たなRNAは、244 AUGノックアウトDI RNAとして知られる。
PB2、PB1、PA及びNPタンパク質を発現するプラスミドと一緒に、244 DI RNA又は244 AUGノックアウトDI RNAのいずれかをコードするプラスミドを293T細胞に遺伝子導入した2日後に、RNAを回収した。プライマー伸長分析は、同程度の量のmRNA及びvRNAが、244及び244 AUGノックアウトDI RNAにより合成されたことを示し、これにより転写が244 AUGノックアウトDI RNAにおける変異によって影響されなかったことを確認した(図10b)。
本発明者は、チャレンジウイルスとしてA/WSNを用いる本発明者のC3H/He-mgマウスモデル(Dimmock et al. 2008)において244 DI及び244 AUGノックアウトDI RNAの防御活性を比較した。マウスに、A/WSN単独、又はA/WSN+244 DIウイルス、又はA/WSN+244 AUGノックアウトDIウイルスを、エーテル麻酔(light ether anaesthesia)下で鼻腔内接種した。他の感染グループには、DI防御活性を破壊し、DIウイルス接種のあらゆる非特異的効果を制御するために8分間UV照射を行ったDIウイルスを供した。マウスを、臨床疾患及び体重減少についてモニターした。図12a、bは、ウイルス感染対照マウスは、全て実質的な体重減少を伴う深刻な病気になり、淘汰されるべきであったことを示す。対照的に、244 DIウイルス又は244 AUGノックアウトDIウイルスで処置したいずれのマウスも、いかなる臨床疾患のサインも発症しなかった。244 DIウイルス及び244 AUGノックアウトDIウイルスで処置したマウスは、両方とも体重の一過的な減少を示した(図12b)。体重減少は、疾患のより敏感な基準であり、いずれかの臨床疾患の非存在下でこの範囲のばらつきが見られることはまれである。以前のデータから予測される通り(Dimmock et al. 2008)、UV不活性化DIウイルスで処置したマウスは防御されなかった。本発明者は、これまでに、感染性ウイルスと同時に244 DIウイルスで処置した動物が、さらなるDIウイルスによる処置の非存在下で高用量の同じウイルスの後のチャレンジ後の疾患を防ぐ防御免疫を生じさせることを示している(Dimmock et al. 2008)。244ノックアウトDIウイルスで処置した動物は、高用量のA/WSNによるさらなるチャレンジに対し十分に免疫的であり、それらが臨床疾患のいかなるサインも発症しないにも関わらず、感染していたことを示す(図12c、d)。
DIインフルエンザウイルスは60年以上もの間知られていたが、そのin vitroでの干渉活性又はin vivoでの防御活性が機能する分子メカニズムについては、あまり示唆がなかった。最初、天然のDIウイルス調製物が多様な欠陥RNA配列を含み、したがって個々のDI配列の生物学的特徴が解析できなかったため、この課題は解決できなかった。しかしながら、リバースジェネティクスを用いて作製されたクローン化されたウイルスの使用により、本発明者がこの課題を解決することが可能となった。本発明者の最近の研究は、ゲノムセグメント1に由来する244 DI RNAが、3つの方法、すなわち:コグネート全長セグメントとのパッケージングの競合、ポリメラーゼコード全長ウイルスRNAセグメント1、2及び3の合成及び/又は蓄積への干渉、並びにin vivoでのI型インターフェロンの刺激、によって干渉することを示している。本明細書では、本発明者は、インフルエンザ 244 DI RNAがポリアデニル化mRNAの合成を指示することを示した(図10a)。mRNAは、全てのインフルエンザウイルスmRNAについて予期された通り、ポジティブセンスcRNAより大きく、これはDI RNAが転写の鋳型であることを示している。したがって、244 DI RNAから生産されるmRNAは、5'キャップ及びポリAテイルを含み、タンパク質への翻訳に潜在的に利用可能である。244 DI RNAの配列は、DI mRNAがPB2のアミノ末端41アミノ酸残基を共有するタンパク質に翻訳され得ることを予測する。PB2のこの領域は、ポリメラーゼ複合体のPB1タンパク質に結合することが示されており、宿主細胞ミトコンドリアにも局在する(Carr et al. 2006;Sugiyama et al. 2009)。
Claims (8)
- インフルエンザAウイルスのセグメント1、2又は3に由来する試験欠陥干渉インフルエンザウイルスRNAの存在下でインフルエンザAウイルスのセグメント1、2及び3からのRNAの生産をモニターすることを含む、抗ウイルス剤を同定するための方法であって、セグメント1、2及び3のそれぞれからのRNAの生産に干渉する欠陥干渉ウイルスRNAが抗ウイルス剤として同定される、前記方法。
- 宿主細胞において実施される、請求項1に記載の方法。
- 宿主細胞に、インフルエンザウイルスのセグメント1、2及び3を含む核酸が遺伝子導入される、請求項2に記載の方法。
- 前記セグメント1、2及び3のそれぞれが、別々のプラスミドにおいて提供される、請求項3に記載の方法。
- セグメント1、2及び3のそれぞれからのRNAの生産が、別々のアッセイでモニターされる、請求項1又は2に記載の方法。
- RNAがcRNA、mRNA及び/又はvRNAを含む、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- cRNA及びmRNAの両方の生産がモニターされる、請求項6に記載の方法。
- セグメント1、2又は3の一以上が、該セグメントからのRNAの生産の低減がレポーター遺伝子の発現を低減させるように、コードされたレポーター遺伝子を有する構築物として提供される、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
GB1400752.0 | 2014-01-16 | ||
GB1400752.0A GB2522615A (en) | 2014-01-16 | 2014-01-16 | Assay and medicament |
PCT/GB2015/050094 WO2015107357A1 (en) | 2014-01-16 | 2015-01-16 | Assay and medicament |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2017504331A JP2017504331A (ja) | 2017-02-09 |
JP2017504331A5 JP2017504331A5 (ja) | 2018-02-22 |
JP6781045B2 true JP6781045B2 (ja) | 2020-11-04 |
Family
ID=50239057
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2016546969A Active JP6781045B2 (ja) | 2014-01-16 | 2015-01-16 | アッセイ及び薬剤 |
Country Status (8)
Country | Link |
---|---|
US (3) | US20160333321A1 (ja) |
EP (2) | EP4085917A1 (ja) |
JP (1) | JP6781045B2 (ja) |
DK (1) | DK3094338T3 (ja) |
ES (1) | ES2913063T3 (ja) |
GB (1) | GB2522615A (ja) |
PL (1) | PL3094338T3 (ja) |
WO (1) | WO2015107357A1 (ja) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP4046689A1 (en) * | 2021-02-18 | 2022-08-24 | Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | Influenza virus defective interfering particles for use in the prophylactic or therapeutic treatment of coronaviridae infection |
Family Cites Families (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB0408424D0 (en) * | 2004-04-15 | 2004-05-19 | Univ Warwick | Viral assay |
US20080292658A1 (en) | 2004-11-11 | 2008-11-27 | Emmie De Wit | Defective Influenza Virus Particles |
PL2019685T3 (pl) * | 2006-05-24 | 2015-04-30 | Univ Warwick | Defektywny interferujący wirus |
GB2437799B (en) * | 2006-05-24 | 2008-08-13 | Univ Warwick | Defective interfering virus |
GB0822672D0 (en) * | 2008-12-12 | 2009-01-21 | Univ Warwick | Anti-viral protection with viruses containing a defective genome |
US20130156733A1 (en) * | 2011-12-20 | 2013-06-20 | Philip I. Marcus | Influenza virus populations, methods of use and methods of making thereof |
-
2014
- 2014-01-16 GB GB1400752.0A patent/GB2522615A/en not_active Withdrawn
-
2015
- 2015-01-16 JP JP2016546969A patent/JP6781045B2/ja active Active
- 2015-01-16 EP EP22162159.2A patent/EP4085917A1/en active Pending
- 2015-01-16 DK DK15701244.4T patent/DK3094338T3/da active
- 2015-01-16 EP EP15701244.4A patent/EP3094338B1/en active Active
- 2015-01-16 WO PCT/GB2015/050094 patent/WO2015107357A1/en active Application Filing
- 2015-01-16 US US15/111,615 patent/US20160333321A1/en not_active Abandoned
- 2015-01-16 ES ES15701244T patent/ES2913063T3/es active Active
- 2015-01-16 PL PL15701244.4T patent/PL3094338T3/pl unknown
-
2018
- 2018-12-21 US US16/230,114 patent/US11339374B2/en active Active
-
2022
- 2022-04-21 US US17/725,982 patent/US20220325251A1/en active Pending
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2017504331A (ja) | 2017-02-09 |
WO2015107357A1 (en) | 2015-07-23 |
US20160333321A1 (en) | 2016-11-17 |
EP4085917A1 (en) | 2022-11-09 |
US20200231939A1 (en) | 2020-07-23 |
EP3094338B1 (en) | 2022-04-13 |
ES2913063T3 (es) | 2022-05-31 |
GB201400752D0 (en) | 2014-03-05 |
PL3094338T3 (pl) | 2022-08-08 |
US20220325251A1 (en) | 2022-10-13 |
EP3094338A1 (en) | 2016-11-23 |
US11339374B2 (en) | 2022-05-24 |
DK3094338T3 (da) | 2022-05-23 |
GB2522615A (en) | 2015-08-05 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Marriott et al. | Defective interfering viruses and their potential as antiviral agents | |
US11384339B2 (en) | Influenza viruses with mutant PB2 gene segment as live attenuated vaccines | |
US6974686B2 (en) | Recombinant tryptophan mutants of influenza | |
US11180737B2 (en) | Generation of infectious influenza viruses from virus-like particles | |
JPH11507510A (ja) | インフルエンザの新規組換え温度感受性変異体 | |
Wu et al. | A live bivalent influenza vaccine based on a H9N2 virus strain | |
WO2008147496A2 (en) | Neuraminidase-deficient live influenza vaccines | |
Meng et al. | Unexpected complexity in the interference activity of a cloned influenza defective interfering RNA | |
US9119810B2 (en) | Compositions and vaccines against influenza A and influenza B infections | |
US20220325251A1 (en) | Assay and medicament | |
Abbas et al. | Proteins of Influenza Virus: A Review | |
US10272149B2 (en) | Modified bat influenza viruses and their uses | |
Wu et al. | Characterization of influenza A virus with nine segments: Effect gene segment on virus property | |
Feder | Internal viral RNA sequences of the PB2 genome segment of influenza A virus are required for efficient generation of fully infectious particles | |
Moreira | Bat influenza viruses: insights in the molecular biology and characterization of infectious viruses | |
Won | Reverse genetics system and fucntion of NSM protein of Rift Valley fever virus (family Bunyaviridae, genus phlebovirus) | |
Atasheva | Finding a cure for Venezuelan equine encephalitis virus infection: The search for antiviral genes and vaccine development | |
Abbas et al. | Special Issues |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
RD01 | Notification of change of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7426 Effective date: 20161118 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20161118 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20180112 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20180112 |
|
A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20181114 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20181120 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20190214 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20190520 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20191023 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20200110 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20200422 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20200915 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20201015 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6781045 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |