CN1780916A - 鸡rna聚合酶ⅰ启动子及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种显示出转录启动活性的新的多核苷酸、含有该多核苷酸的载体及其用于感兴趣的序列的转录的用途，例如用于制备未加帽的RNA病毒。本发明还涉及含有本发明的多核苷酸或载体的宿主细胞，该宿主细胞优选是禽类来源的。
Description
技术领域
本发明涉及一种具有转录启动活性的新的多核苷酸、含有该多核苷酸的载体及其用于感兴趣的序列的转录的用途，例如用于制备未加帽的病毒RNA。本发明还涉及到含有根据本发明的多核苷酸或载体的宿主细胞，该宿主细胞优选是禽类来源的。
背景技术
流感的预防主要依靠受强烈推荐的接种疫苗。例如，在法国对于可能患上流感的人，法国国家健康保险机构将承担100％的接种疫苗的费用，这样的人群主要是指65岁或65岁以上的人或患有慢性呼吸道疾病、心血管病、肾病和代谢疾病的人。通过产生针对表面糖蛋白，尤其是针对血凝素(HA)及神经氨酸酶(NA)的抗体获得了免疫后的免疫性。
I.目前的方法：用受精鸡卵制备及灭活
流感疫苗由3种不同的病毒株组成：两种A型(H3N2和H1N1)，一种B型。疫苗病毒株的选择每年都根据对流行的病毒株变异的监控数据进行重新评估，这是WHO推荐的并在二月中对北半球进行通告。现今所使用的疫苗，与过去30年一样，是由在受精鸡卵中制备的并随后被灭活的病毒组成(Manuguerra，2001，Repères sur lesinfections bronchopulmonaires，pp.328-324.Edited by P.Léophonte &Mouton：PIL)。
对于A型病毒，在受精卵中具有高复制能力并具有WHO所指出的HA和NA变异株的重排病毒被制备并提供给工业化疫苗生产商。生产一剂量的三价疫苗需要一个或两个受精卵。各个疫苗生产商进行不同的纯化步骤，但是都遵循这样一个相同的原则：尿囊液被取走且病毒在用超速离心法进行纯化之前通过用甲醛或β-丙内酯处理而失活。病毒可以用脂质和/或如Tween80这样的去污溶剂进行破碎。完整的或被破碎的病毒随后被调节为15μg HA/剂量疫苗/毒株的标准水平。在可透析去污剂的存在下的纯化步骤使得可以生成一亚单位疫苗，其只包含病毒的包膜糖蛋白(HA和NA)。由于包含完整病毒的疫苗的强反应原性，事实上今天只有被破碎的疫苗和亚单位疫苗被市场化了。在投入市场之前，疫苗的制备以及其质量经检测符合欧洲标准的时期大约为6个月。
由灭活的病毒组成，流感疫苗通常有很好的耐受性且只引起很小的副作用，例如在注射部位的局部反应和注射后48小时内的发热反应和头痛。流感疫苗接种的禁忌征限于对卵蛋白、主要是卵白蛋白过敏和对制备残留物或硫柳汞(Mercurothiolate)过敏。在不知道流感疫苗将会对胎儿发育产生什么样的影响的情况下，流感疫苗不被推荐给处于怀孕最初3个月的妇女使用。
由灭活病毒所组成的疫苗抗随后的流感传染的保护效应很难被评估，因为该效应可以在不同的季节差别很大，尤其是当其作为正在流行的病毒与那些包含在疫苗中的病毒之间的抗原相关程度的指标时；还因为该效应还依赖于被接种的人的免疫状态。在法国，疫苗覆盖面在1979-1999年间的增加伴随着与流感相关的死亡率的降低(在1979年每年大约死亡的人数为20,000人，自1985年以来每年死亡人数约为2,500人)，这表明了，即使不能证明，疫苗政策的积极影响。此外，来自众多研究的证据使得有可能估计到对老年人进行疫苗接种能够使得病毒性肺炎和住院治疗的人数减少一半以及使得因流感而至死的事件减少约70％(Large et al.，1995，Annals of InternalMedicine，123，518-527)。
II.流感疫苗的发展前景
为了以下目的，目前进行了几种研究方法的研究：1)提高强度、质量，对由流感疫苗引起的反应的耐受性，以及提高它们的特异性；和2)使得当病毒潜在的流行性亚型出现时能够迅速应答。以下概述了涉及到活疫苗的制备以及在细胞培养物中进行疫苗病毒的生产的工作。也应该注意到，在其它的研究方法中，辅剂、重组亚单位疫苗和多核苷酸疫苗的使用被。
活疫苗的制备
活流感疫苗有可能引发更广泛的、时间更持久的免疫性，尤其是它经过细胞介导增强了免疫性。活疫苗也可能更为普通人群所接受，因为它是经鼻而非注射的途径给药。目前可展望到两种类型的活疫苗：减毒活疫苗和重组活疫苗。
减毒活疫苗
通过流行的野生型毒株与一供体毒株的重排获得了减毒株，该供体毒株已通过冷适应进行了减毒化且其基因型也已被很好地表征，但是还未很好地建立起观察到的突变与表型(减毒、冷适应、热敏性)之间的关系(Keitel et al.，1998，Textbook of Influenza，pp.373-390.Editedby K.G.Nicholson，R.G.Webster & A.J.Hay.Oxford，England：BlackwellScience，Ltd.)。
在受精鸡卵中制备减毒活疫苗的方法与上面所描述的方法相类似，但是没有病毒失活步骤。近期由美国研究人员所进行的临床测试的结果表明通过鼻内途径给药的由减毒株组成的三价疫苗对于成年人、老人和儿童是无害的，只是在接种后的48小时内有咽喉疼痛和流鼻涕的副作用。它们可以比灭活疫苗具有更大的保护效力，尤其是由于它们诱导了粘膜免疫应答，但是其传染和逆转的可能性还有待证明。在俄罗斯，已经广泛地进行了用减毒的活病毒进行疫苗接种的实践几十年，但是由于所应用的条件的多样性很难得到一个令人信服的总结论。
重组活疫苗
最近在用于流感病毒的反求遗传学系统的发展(Neumann et al.，2001，Virology 287，243-50)使得有可能在特异性地引入了遗传修饰的基因组中进行重组病毒的生产，以获得充分减毒化和免疫原性的特性。该方法使得安全性增加(因为没有污染物，例如那些可能会在病毒株取样时带入的污染物；以及更容易地减小和控制疫苗病毒逆转的风险的可能性)，并将使得有可能更加特异性地对各种流行状况进行应答。现有的反求遗传学系统是基于人RNA聚合酶I转录系统的使用。由于RNA聚合酶I严格的物种特异性，其应用被限制于人类或灵长类来源的细胞。其可被用于在细胞培养物中生产重组疫苗病毒，但不能够用于在受精鸡卵中生产重组疫苗病毒。
-疫苗病毒在细胞培养物中的生产
在生产疫苗流感病毒中使用受精鸡卵的最首要的优点是：i)病毒产量大量增加；和ii)被对人有致病性的制剂污染的风险最小，尤其是在非灭活疫苗的制备中。对于在缺乏血清的培养基中所培养的细胞中制备疫苗病毒的可能性也进行了研究。Baxter和Solvay公司近期分别验收通过了用于生产疫苗病毒的衍生自Vero和MDCK细胞系的细胞库。在MDCK细胞中生产的灭活疫苗在2001年获得了市场许可但还未被商业化。
几种类型的流感疫苗，灭活疫苗和活疫苗，在受精鸡卵中制备的疫苗和在细胞培养物中制备的疫苗将可能共存于未来的市场上。这些疫苗中的某些可能显示出对于某一类个体的接种是尤其适合的，而对于另一类个体则不是那么适合。当流感爆发时，将需要动用所有可用的制备方法，即应用受精鸡卵或细胞培养物的方法。
本发明是针对于这些需求和其它对于阅读本发明说明书的技术人员来说显而易见的需求。
发明内容
本发明涉及一种多核苷酸、含有所述多核苷酸的重组DNA，及其用途，尤其是用于制备那些用于疫苗中的未加帽的RNA病毒的用途。
更特别地，本发明的一个目的是一种分离的或纯化的多核苷酸，其包含图1中所示的序列SEQ ID NO：1，或其片段，其优选具有转录启动活性。
本发明还涉及一种分离的或纯化的多核苷酸，其包含图2中所示的序列SEQ ID NO：2，或其片段，其优选具有转录启动活性。
本发明还涉及：一种重组DNA，其包含根据本发明的一种多核苷酸，或其片段；一种载体，其包含根据本发明的一种多核苷酸或重组DNA或重组DNA的片段；一种宿主细胞和禽类来源的受精卵，其包含根据本发明的多核苷酸和/或重组DNA。
本发明还涉及至少一种以下成分在制备感兴趣的序列中的用途，感兴趣的序列例如为未加帽的重组RNA病毒：
-根据本发明的多核苷酸；
-根据本发明的重组DNA；
-根据本发明的载体；
-根据本发明的宿主细胞；和
-根据本发明的禽类来源的受精卵。
在一个具体的实施方式中，本发明涉及一种通过反求遗传学来制备未加帽的重组病毒的方法，该方法包括以下步骤：
a)将一种或几种载体导入细胞或禽类来源的受精卵中，所述载体含有根据本发明的重组DNA和表达病毒RNA转录/复制所必需的蛋白质DNA；
b)在使得重组病毒能够表达的条件下培养a)中所获得的细胞或卵；和
c)回收b)中所获得的重组病毒。
在一个优选的实施方式中，本发明提出了一种通过反求遗传学来制备重组流感病毒的方法，该方法包括以下步骤：
a)将至少一种含有一种由本发明的优选方法所提供的重组DNA的载体和表达流感病毒的PA、PB1、PB2和NP蛋白的载体导入禽类细胞或受精鸡卵中；
b)在使得重组流感病毒能够表达的条件下培养a)中所获得的细胞或卵；和
c)回收b)中所获得的重组流感病毒。
本发明的一个目的是获得一种包括药学上可接受的载体和由根据本发明的方法所制备的重组病毒的组合物。
本发明的一个特别的目的是获得一种包括药学上可接受的载体和由根据本发明的制备方法所制备的重组流感病毒的抗流感组合物。
本发明还涉及一种包括由根据本发明的多核苷酸所转录的序列的治疗性组合物。
有利地，克隆鸡RNA聚合酶I启动子使得有可能开发适于在受精鸡卵中生产重组疫苗病毒的反求遗传学系统，该系统可能尤其适于活疫苗的制备。
附图说明
图1表示的是对应于AgeI-SacI鸡基因组DNA片段的序列(SEQID NO：1)，所述片段包含鸡RNA聚合酶I启动子。
图2表示的是包含鸡RNA聚合酶I启动子的SEQ ID NO：2的序列的鸡基因组DNA的第二片段(BsaI-SacI)。
图3表示的是用于使用衍生自C3-18粘粒的序列来分析CAT序列的转录效率的程序。
图4表示的是得自衍生自C3-18粘粒的PacI-NotI片段的限制片段的重复分析的结果。
图5表示的是平行进行的测序和引物延伸反应的结果，该结果证明了用于由鸡RNA聚合酶I启动转录的主要位点位于图1中所描述的AgeI-SacI片段中。
图6是表示在被编码位于人或鸡PolI启动子的控制下的假流感RNA的质粒所转染的细胞的细胞质提取物中所测量的CAT水平的图表。
发明详述
本发明的独创性涉及一种主要在禽类细胞中的，优选拥有转录启动活性的多核苷酸序列。本申请的发明人将该启动序列鉴定为鸡RNA聚合酶I。
本发明还涉及应用该多肽制备感兴趣的序列，例如由反求遗传学系统所提供的重组流感病毒。
1.多核苷酸与重组DNA
本发明的第一方面是一种分离的或纯化的多核苷酸，其包括图1中所示的SEQ ID NO：1的序列或图2中所示的SEQ ID NO：2的序列，或其片段。优选，该多核苷酸或它的一个片段拥有转录启动活性。
对于片段，所述片段优选是包括序列SEQ ID NO：1或SEQ IDNO：2的至少10、12、15、18、20、25、30、35、40、45、50、60、75或100个连续核苷并具有转录启动活性的序列。
尽管根据本发明的所述多核苷酸和启动子优选通过这样一个事实进行表征，即他们在禽类细胞中拥有转录启动活性，这一启动子特别拥有启动家禽细胞中的转录的能力，更特别地在鸡细胞中。
对于核苷酸序列、核酸、核苷序列或核酸序列、多核苷酸、多核苷酸序列，所有这些术语都将用于本发明，是想要表示精确的核苷酸序列，经修饰的或未经修饰的，这使得有可能定义含或不含非天然核苷酸的某一多核苷酸的片段或区域，其也可以对应于双链DNA或单链DNA。这样的术语还包括DNA分子、RNA分子、cDNA、人工序列、及其所有的片段。即使没有给出定义，术语“衍生物”、“变异体”和“突变体”也适用于本发明的多核苷酸。所有经化学、酶学或代谢修饰但仍保留了原始的多核苷酸的特性，即在禽卵中的转录启动活性的多核苷酸都包括在本发明的范围内。
必须理解，本发明不涉及存在于其天然染色体环境中的核苷酸序列，即不涉及自然状态下的核苷酸序列。本发明涉及已经被分离和/或纯化的序列，也就是说它们是直接地或间接地被获得，例如通过克隆、扩增和或化学合，且其环境至少已经被部分修饰。必须理解，通过转化、遗传操纵或其它任何重组的方法而被导入生物体的多核苷酸是被分离的，即使它存在与前述的生物体中。
根据本发明的启动序列优选拥有一段DNA序列，其与图1或图2中所示的序列SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2中的其中一个序列的相同性百分比大于70％。更特别地，根据本发明的启动序列与图1或图2中所示的序列SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2中的其中一个序列或其片段的相同性百分比大于80％，更优选大于90％。术语“相同性百分比”是指表示两条核酸序列在其全长上具有的相同性程度。如果序列被认为具有不同的大小，则相同性百分比被表示成最短的序列的全长的函数。为计算相同性百分比，可在允许存在间隔区的情况下，将两条序列相互重叠以使相同的碱基数最大；然后，用最短序列总的碱基数除相同碱基数，以计算出相同性百分比。
本发明的另以方面涉及一种重组DNA，其包括如上述所定义的多核苷酸。
该重组DNA可包含，例如，图1中所示的启动序列SEQ ID NO：1或图2中所示的启动序列SEQ ID NO：2，或其衍生物，其中所述序列被插入了一个克隆位点以有利于该序列作为“便携式”启动子的应用。根据本发明的一个优选方法，本发明的重组DNA还额外包含一待转录的序列。术语“待转录的序列”或“感兴趣的序列”的意思是指能被用做合成RNA分子，例如vRNA的底物的序列。优选地，待转录的序列是未加帽RNA病毒的cDNA，也就是说转录终产物不应含有额外的核苷酸。更优选地，待转录的序列是负极性RNA病毒(negative-polarity RNA virus)，例如正粘病毒和副粘病毒。举例来说，正粘病毒可以是流感病毒，优选是A型流感病毒；而副粘病毒可以优选地选自腮腺炎病毒(Rubulavirus)属(优选腮腺炎病毒或新城疫病毒)、麻疹病毒属(优选麻疹病毒)、肺病毒属(优选呼吸道合胞病毒)或梅塔肺病毒(Metapneumovirus)属中的一种。在本发明的一个优选方法中，该重组DNA的特征是其表达正粘病毒vRNA，例如流感病毒，vRNA优选选自流感病毒vRNA片段1-8中的一个片段。“待转录的序列”或“感兴趣的序列”对于反义RNA的制备也是有用的，也就是说，通过与靶序列(例如负极性RNA病毒)杂交，其结构确保了对病毒RNA的翻译或转录的抑制或对相应的蛋白质产物的表达的抑制。
本发明还涉及到载体，其包含上述重组DNA。这些载体使得将要在宿主细胞中被转录的序列能够被导入甚至表达。载体的例子包括质粒表达系统、病毒载体、整合载体和常染色体载体。更特别地，本发明的一种载体是质粒pGEM-ChPolI-C15。这一质粒含于菌株pGEM-ChPolI-C15-E.Coli 1305中，该菌株根据布达佩斯条约于2003年2月24日被保藏在法国微生物保藏中心CNCM，巴斯德研究院，28，rue du Dr.Roux，75724巴黎(法国)，保藏号为I-2976。质粒pGEM-ChPolI-C15衍生自质粒pGEM52F+(Promega)。来自编码细菌氯霉素乙酰转移酶(CAT)的序列的一个524bp的EaeI限制性片段被克隆pGEM52F+的NotI位点。衍生自C13-18粘粒的一个AgeI-SacI限制性片被克隆到pGEM52F+的EcoRI位点，CAT插入的上游。这一1260bp的片段含有本发明的最小的鸡RNA聚合酶I启动子。
本发明还涉及转基因禽类的生产，该转基因禽在PolI启动子控制下表达一种RNA，该RNA授予对由病源微生物所引起的传染的抗性，尤其是对禽流感病毒的抗性。
2.细胞和禽类来源的受精卵
另一方面，本发明涉及由上述的一种多核苷酸，和/或一种重组DNA，和/或一种载体转化的细胞。优选地，如此转化的宿主细胞是禽类来源的。根据本发明的一个优选的变化形式，所述宿主细胞是家禽细胞，更优选是鸡细胞。可以理解在本发明的意义上来说，所述宿主细胞以一种稳定方式被转化。但是，有可能以一种瞬时方式来提供转化细胞。
本发明的另一个相关的方面还涉及“被转染的”家禽来源的受精卵(优选来自母鸡)。更特别地，本发明的受精卵包括上述的一种多核苷酸，和/或一种重组DNA，和/或一种载体。
本发明用于将上述的一种多核苷酸，和/或一种重组DNA，和/或一种载体导入到宿主细胞或受精卵中的方法是基于细胞转染和卵孵育领域技术人员的公知常识，因此不再对这些方法进行详述。
3.方法和程序
本发明的另一方面，还涉及感兴趣的序列的制备，例如重组疫苗病毒；更特别地，还涉及未加帽重组RNA病毒的制备。此外，本发明的目的还有至少一种以下成分在制备感兴趣的序列中的用途，例如，未加帽的重组RNA病毒：
-根据本发明的多核苷酸；
-根据本发明的重组DNA；
-根据本发明的载体；
-根据本发明的宿主细胞；和
-根据本发明的禽类来源的受精卵。
本发明的另一个相关的方面还提供了一种用于制备未加帽重组病毒的方法。这种制备是基于前述的重组病毒的反求遗传学系统。更特别地，本发明的包括以下步骤：
a)将一种或几种载体导入细胞或禽类来源的受精卵中，所述载体含有根据本发明的重组DNA和表达病毒RNA转录/复制所必需的蛋白质(例如流感病毒的PA、PB1、PB2和NP蛋白)的DNA；
b)在使得重组病毒能够表达的条件下培养a)中所获得的细胞或卵；和
c)回收b)中所获得的重组病毒。
能够理解在步骤a)中，所有的DNA(根据本发明的重组DNA，该DNA表达病毒RNA转录/复制所必需的蛋白质)可以由单一一种载体、两种载体或更多种载体所携带。
在一个优选的实施方式中，本发明还提供了一种制备重组流感病毒的方法，该方法包括以下步骤：
a)将至少一种优选含有一种表达流感病毒vRNA的重组DNA的载体和表达流感病毒的PA、PB1、PB2和NP蛋白的载体导入禽类细胞或受精鸡卵中，流感病毒例如优选地是A型流感病毒；
b)在使得重组流感病毒能够表达的条件下培养a)中所获得的细胞或卵；和
c)回收b)中所获得的重组流感病毒。
能够理解在本发明方法的回收重组病毒的步骤c)可以在细胞裂解后直接在细胞中进行，或者从上清液中回收。如果使用的受精卵，本领域技术人员将会知道使用何种方法来回收重组病毒。
4.组合物
本发明还涉及这些多核苷酸和重组DNA，和/或含有它们的载体在制备将被用做疫苗的组合物中的用途。更特别地，本发明的组合物还包括由上述的多核苷酸转录的序列。在一个优选的实施方式中，本发明涉及重组病毒在制备疫苗组合物中的用途。
在另一个优选的实施方式中，本发明的组合物还含有一种药学上可接受的载体和一种获自本发明的制备方法的重组病毒。
本发明的组合物典型地可以固体或液体形式给药，也就是说，给药形式可以包括例如液体、凝胶和其它任何允许例如控释的介质。在这些可用的组合物中，尤其要注意的是可注射的的组合物，尤其是想要用于注射到人循环系统中的组合物。
本领域技术人员将能够制备药学上可接受的组合物，并以其作为几个因子的函数确定出最佳的给药方法和必须的给药量。这些因子可以影响这一选择，包括：组合物中所含有的活性或灭活成分的精确特性、病毒性疾病的类型、患者的状况、年龄和体重等等。
以下的实施例将举例说明本发明的其它特点和优点。
实施例
以下实施例将用以举例说明本发明的应用范围而非对本发明范围的限制。可以在不偏离本发明的精神和范围的前提下可对本发明进行修饰和变形。尽管以下发现的其它等价的方法和产物可以用以检测或实施本发明，本申请还是对优选的材料和方法进行了描述。
用以从cDNA克隆获得重组流感病毒的反求遗传学系统是基于位于人RNA聚合酶I的控制之下的编码病毒RNA(vRNA)的质粒的转染(Neumann et al.，PNAS 96：9345-50，1999；Fodor et al.，J.Virol.73：9679-82，1999；Hoffman et al.，PNAS 97：6108-13，2000)。这一启动子的使用通过以下这一事实被证明是有效的：转录终产物不含有额外的核苷(如果含有额外的核苷，则位于vRNA非编码5’和3’末端的转录/复制信号将不再有功能)。
人RNA聚合酶I启动子的使用确保了转录在精确的位点被启动，从而确保在被转染的细胞中所合成的的vRNA的5’末端的精确性。但是由于RNA聚合酶I启动子严格的物种特异性(Heix and Grummt，Curr.Op.Gent.Dev.5：652-56，1995)，这类启动子仅可被应用于人或猿来源的细胞。
然而，适用于禽类细胞的分类筛选系统的应用可以开启用于在受精的鸡卵中制备重组流感疫苗的手段，所述受精的鸡卵是目前在美国唯一被获准用于制备流感疫苗的手段。今天，接种疫苗构成了预防流感的唯一方式，也被强烈推荐在某些患上流感的物种上使用。该疫苗的制备是基于疫苗株在受精卵中的复制，并要求每一个新制剂选择典型的流行中的具有HA和NA片段的重排病毒，其它的片段来自适于在卵中生长的供体株。将受精卵中这一漫长而不确定的过程用通过分类筛选进行重排病毒的制备取代具有优势。
因此，从在禽类细胞中通过分类筛选开发重组流感病毒生产系统的前景来看，本申请的发明人首先开始克隆鸡RNA聚合酶I启动子。通过基于目前为止克隆到的PolI启动子的核苷序列间的同源性的PCR的克隆是不可能的，因为PolI转录系统在物种之间的差异很大。因此，本申请的发明人首先开始筛选鸡基因组。
1)获得粘粒C13-18
鸡基因组作图表明编码核糖体RNA的基因(NOR基因座)位于16号染色体上，靠近组织相容性复合物基因(Schmid et al.，Cytogenet.Cell Genet.，90：169-218，2000)。在1988年，工作涉及到主要组织相容性复合物的H Auffray教授的实验室公开了关于含有30kb鸡基因组DNA的重组粘粒(C13-18)的数据，所述DNA包括主要组织相容性复合物基因、NOR基因座的几个转录单位以随后至少一个拷贝的PolI启动子(Guillemot et al.，EMBO J.，7：2775-85，1988)，该实验室部分工作在位于维勒瑞夫的Gustave Roussy研究院。该粘粒由R.Zoorob友情提供。
2)C13-18粘粒的southern印迹分析
在分别或者联合使用限制性酶NOtI、PacI和SfiI消化后，通过southern印迹对C13-18粘粒进行分析，并用做探针寡核苷酸，该寡核苷酸是在鸡核糖体RNA的部分测序数据的基础上选择的，所述RNA可获自以下数据库：
寡核苷酸28S/+/2：5’-GAGTCAGCCCTCGACACAAGCTTTTG-3’(SEQ ID NO：3)；
寡核苷酸18S/-/1.5：5’-CTACTGGCAGGATCAACCAGGT-3’(SEQ IDNO：4)；和
寡核苷酸18S/-/4：5’-TAGAGGAGAACGCGACCTCGAGAC-3’(SEQID NO：5)。
这一分析使得有可能构建一个C13-18粘粒的粗略的限制性图谱并将18S和28S核糖体RNA定位于粘粒上的多个限制性位点。这一分析还导致鉴定到一约为16kb的PacI-NotI片段，对应于基因间区域的大部分，因而极有可能含有一个拷贝的PolI启动子序列。
3)将PacI-NotI限制性片段克隆到一“报道”载体中并证明PacI-NotI限片段中转录启动子的存在
为了检测PolI启动子序列是否存在于PacI-NotI限制性片段中，本申请发明人试图克隆一报道序列的这一限制性片段上游。
针对这一目的，具有一个SalI克隆位点的pTCF粘粒(Grosveld etal.，1982，Nucleic Acids Res.，10，6715-32)通过将一含有多克隆位点(StuI-PacI-NotI-PmeI)的合成序列插入SalI位点到而被修饰。
所述衍生自C13-18粘粒的16kb的PacI-NotI片段被克隆到所述经修饰的pTCF粘粒中，在新引入的PacI和NotI位点。对两个pTCF-(PacI-NotI)重组粘粒克隆进行选择(nos.2.5和2.7)。然后，将得自细菌氯霉素乙酰转移酶(CAT)基因的500bp的EaeI限制性片段从两个方向上克隆到pTCF-(PacI-NotI)粘粒的NotI位点中。选择出了四个重组粘粒克隆：no.2.5.3和no.2.7.13(CAT在正向)，no.2.5.4和no.2.7.16(CAT在负向)。
为了检测PolI启动子序列是否存在于PacI-NotI限制性片段中，用pTCF-(PacI-NotI)-(CAT+)和pTCF-(PacI-NotI)-(CAT-)粘粒转染来自QT6鹌鹑纤维肉瘤细胞系的细胞。转染24小时后，用制剂TriZol(Gibco-BRL)从细胞提取RNA；然后用DNA酶(不含RNA酶的DNA酶，Ambion)处理以除去会污染RNA制剂的粘粒分子。将RNA以5μg/点沉积在尼龙膜(Hybond N+，Amersham)上，并与对应于CAT(+)序列的32P标记的核糖探针杂交。由pTCF-(PacI-NotI)-(CAT-)粘粒no.2.5.4和no.2.7.16转染的细胞制备的RNA得到阳性信号，这表明PolI启动子序列存在于PacI-NotI片段中。但是，在这些首先进行的实验中，背景信号与噪音的比率相当低。在以下的实验中，在优化了RNA在DNA酶中的处理条件(在8单位酶存在的条件下于37℃处理1小时，两遍)以及杂交和膜洗涤条件(在含50％甲酰胺、5×SSC、5×Denhart’s、0.5％SDS的缓冲液中，于65℃杂交过夜；在含有2×SSC、0.1％SDS的缓冲液中于室温洗涤10分钟，两遍；继以在含有0.2×SSC、0.1％SDS的缓冲液中于65℃洗涤10分钟，两遍)后，上述比率被提高了。该方法被概述于图3中，所述方法随后被应用于以一种重复的方式检测在来自PacI-NotI片段的限制性片段中是否存在转录启动子。所获得的结果在以下被详述并且被概述于图4中。
4)在克隆到的报道载体的PacI-NotI限制性片段中产生能够部分缺失并证明转录启动子存在于一大约6kb的SfiI-NotI片段中
为了鉴定出含有所述启动子的于PacI-NotI片段的更精确的区域，通过用PacI-SfiI和SfiI-NotI酶的组合消化粘粒pTCF-(PacI-NotI)-CAT(-)no.2.5.16和pTCF-(PacI-NotI)-CAT(+)no.2.7.13(SfiI位点位于PacI-NotI片段中)、用E.Coli PolI DNA的Kleenow亚单位补充到末端、将所获得的分子与它们自身重新连接而获得了PacI-NotI片段的部分缺失。用上面所描述的方法(QT6细胞的转染以及通过与CAT探针杂交对提取自被转染的细胞的RNA进行分析)检测受检粘粒中是否存在转录启动子。所获得的结果表明转录启动子存在于粘粒中，所述粘粒保留了PacI-NotI片段的SfiI-NotI部分(约6kb)。
5)对得自SfiI-NotI片段的限制性片段的再分析并证明转录启动子存在于一1200kb的AgeI-SacI片段中
为了采用相同的方法继续对得自SfiI-NotI片段的限制性片段进行分析，又构建了一新的报道载体。实际上，该被分析的限制性片段的大小仍然足够小，能被克隆到质粒中。
新的报道载体由质粒Pgem-5-zf+(Promega)构建，其中得自细菌CAT基因的500bp的EaeI片段被克隆到单一NotI位点的(+)向。仅有报道载体中的CAT序列的这一方向被使用，因为前述实验已经表明CAT(+)报道序列/CAT(-)核糖体探针对所得结果比CAT(-)报道序列/CAT(+)核糖体探针对所得结果更具有特异性和再现性。
StuI-SacI限制性片段(实际中，StuI-SacI片段包括SfiI-SacI)和衍生自SfiI-NotI片段的SacI-NotI限制性片段被亚克隆到pGEM-CAT(+)载体(克隆编号：9)，该位点位于CAT报道序列的上游。通过上面所描述的方法，证明了转录启动子存在于被克隆到质粒pGEM-(StuI-SacI)-CAT(+)(克隆编号：12)中的StuI-SacI片段中。
在用SmaI和AgeI限制性酶消化pGEM-(StuI-SacI)-CAT(+)编号12的质粒的基础上建立起了StuI-SacI片段的限制性图谱。两个SmaI-SmaI限制性片段、一个AgeI-AgeI限制性片段和由该AgeI-AgeI限制性片段删除下来的StuI-SacI片段被亚克隆到载体pGEM-CAT(+)载体(克隆编号：9)的EcoRV位点。转录启动子被证明存在于从被克隆到已知被简称为V12-AgeI(克隆编号：9)中的限制性片段删除下来的StuI-SacI片段中。
被删除的StuI-SacI片段被切成两个片段，StuI-AgeI和AgeI-SacI，它们分别是通过用NcoI+AgeI限制性酶(StuI-AgeI片段)和AgeI+NotI限制性酶(AgeI-SacI片段)消化质粒V12-AgeI(克隆号29)而获得的。这两个片段中的每一个都被亚克隆到pGEM-CAT(+)载体的EcoRV位点。转录启动子被证明存在于1200kb的AgeI-SacI片段中，该片段被克隆到质粒pGEM-(AgeI-SacI)-CAT(+)(克隆编号：15)中。
6)对AgeI-SacI片段进行测序并通过引物延伸技术确定转录启始点
被克隆到质粒pGEM-(AgeI-SacI)-CAT(+)(克隆编号：15)中的AgeI-SacI片段被测序。该序列如图1中所示(SEQ ID NO：1)。
离该序列800bp远处含有一约90个核苷的序列的8个重复，该重复是polI的特征。实际上，转录启始位点的重复激活序列上游的存在已经在来自其它物种的一些polI启动子中有所描述(Paule M.，1998，Promoter Structure of Class I Gene.In Transcription of RibosomalRNA Genes by Eukaryotic RNA Polymerase I.Edited by M.R.Paule：Springer-Verlag and R.G.Landes Company)。
从而通过引物延伸技发现鸡polI启动子转录启始位点的精确位点位于AgeI-SacI片段400bp远处。将与由质粒pGEM-(AgeI-SacI)-CAT(+)转录的CAT序列互补的寡核苷酸序列(序列SEQ ID NO：6：5’-ATGTTCTTTACGATGCGATTGGG-3’)用32p在其5’末段用T4噬菌体多核苷酸激酶(Biolabs)进行标记，并用于以下两个平行反应中：1)在逆转录酶(SuperScript II，Invitrogen)存在的条件下，用于与提取自被质粒pGEM-(AgeI-SacI)-CAT(+)(克隆编号：15)转染的QT6细胞的CATRNA互补的DNA的延伸引物；和2)用做采用“T7测序试剂盒”(Pharmacia Biotech)对质粒pGEM-(AgeI-SacI)-CAT(+)(克隆编号：15)进行测序的引物。在因物延伸反应中检测到一个单独的转录产物，这证实了的确存在着非常精确的转录启始位点。这一位点被定位于富含A和T的区域，与得自其它物种的polI启动子所得的数据相一致，来自该寡核苷酸的大约200bp被用做引物。
平行地，对得自AgeI-SacI片段的限制性片段的进行了分析以划出最小的启动子的区域(对应于其它物种的polI启动子的约250bp的一个区域)(参见图5)。AgeI-SacI片段被切成3个片段，AgeI-BsaI、BsaI-BsaI和BsaI-SacI，它们分别是通过用NcoI+BsaI限制性酶(AgeI-BsaI和BsaI-BsaI片段)和BsaI+NotI限制性酶(BsaI-SacI片段)消化质粒pGEM-(AgeI-SacI)-CAT(+)(克隆编号：15)而获得的。这三个片段中的每一个都被亚克隆到pGEM-CAT(+)载体的EcoRV位点。只有被克隆到质粒pGEM-(BsaI-SacI)-CAT(+)(克隆编号：16)的大约600bp的BsaI-SacI片段(图2)允许CAT报道序列的转录，这与这样的一个事实非常吻合：其为定位有转录启始位点的最接近的片段。
使用被定位启始区域下游的约50个碱基对的寡核苷酸，通过引物延伸技术测定了第1个核苷到转录启始位点的距离(见图5)。SEQID NO：7的寡核苷酸序列(5’-GGCCGGTCAACCCTGCTC-3’)用32P在其5’末段用T4噬菌体多核苷酸激酶(Biolabs)进行标记，并用于以下两个平行反应中：1)在逆转录酶(SuperScript II，Invitrogen)存在的条件下，用于与提取自被质粒pGEM-(AgeI-SacI)-CAT(+)(克隆编号：15)转染的QT6细胞的CAT RNA互补的DNA的延伸引物；和2)用做采用“T7测序试剂盒”(Pharmacia Biotech)”对质粒pGEM-(AgeI-SacI)-CAT(+)(克隆编号：15)进行测序的引物。对主要产物进行了检测，对应于所得序列的共有的特征核苷序列(带下画线的核苷)的启始位点，该共有序列由其它物种的PolI启动子序列而确定：
+1
TTATATGTTCGTC
TG
T*
AGGAGCGA
GTGAG*G*ACTCGGCT(SEQ ID NO：8)
但是，应当注意到在该引物延伸实验中检测到了其它3个占少数的转录产物类型，对应于在核苷-1、+13和+14处的启始的转录产物(上面标有星号的核苷)。
用人PolI启动子，以Pleschka et al.设计的模型质粒pPolI-CAT-Rz为基础构建了用以表达假流感病毒RNA的、携带有位于鸡PolI启动子控制下的CAT基因报道序列的质粒(1996，J.Viro1.，70：4188-92)：这些质粒(pPR7-C16-CAT-Rz和pPR7-ΔC16-CAT-Rz)含有编码CAT基因的序列，所述序列被反义克隆，其侧翼为得自人A型流感病毒的NS基因片段的非编码5’和3’序列；所述非编码5’末端位于从鸡PolI启动子的-1位核苷酸起的下游，并在3’末端插入有δ肝炎病毒核酶序列，以确保转录产物末端的精确性。质粒pPR7-C16-CAT-Rz含有鸡PolI启动子和-1至-425位核苷，而质粒pPR7-ΔC16-CAT-Rz只含有-1至-246位核苷(对于其它物种而言，PolI启动子的最小的大小估计大约为250个核苷)。
质粒PolI-CAT-Rz(人PolI启动子)、pPR7-C16-CAT-Rz，和pPR7-ΔC16-CAT-Rz(禽PolI启动子)被同时用编码流感病毒蛋白PB1、PB2、PA和NP的质粒转染到禽QT6细胞和灵长类COS-1细胞中。如果被转染的细胞在非编码5’和3’末端同时表达正确的类流感RNA和蛋白PB1、PB2、PA和NP，所述类流感RNA可以被转录和复制，转录/复制过程的效力可以通过测量在转染细胞中的CAT蛋白的水平而估计出来。因此，通过ELISA测量在转染后24小时制备的转染细胞的细胞质提取物中的CAT蛋白水平。
在质粒PolI-CAT-Rz存在的条件下测量的CAT水平为200ng/106个被转染的COS-1细胞；但是CAT水平在QT6细胞中却非常的低(＜0.06ng/106个转染细胞)(图6)。
相反地，在质粒pPR7-C16-CAT-Rz和pPR7-ΔC16-CAT-Rz存在的条件下测量的CAT在COS-1细胞中的水平非常的低(＜0.06ng/106个转染细胞)；但在QT6细胞中，两种质粒所对应的CAT水平分别为200和100ng/106个细胞。
这些结果表明克隆到质粒pPR7-C16-CAT-Rz和pPR7-ΔC16-CAT-RzPolI的鸡启动子序列允许在被转染到禽类来源的细胞中后发生小复制子的体内转录，所述复制子包含A型流感病毒复制信号。因此，它们开启了用于开发分类筛选系统的手段，所述筛选系统使得有可能从培养的禽类细胞中或直接在受精卵中获得重组流感病毒。
序列表
<110>巴斯德研究院
国立科学研究中心
德尼·狄德罗-巴黎第七大学
<120>鸡RNA聚合酶I启动子及其用途
<130>D21975
<150>CA 2 421 086
<151>2003-02-28
<160>8
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>1261
<212>DNA
<213>Gallus gallus
<220>
<223>Promoter sequence of the chicken RNA polymerase I
<400>1
ccggtggtcc cggccccgtc cgactcggtc gcttcgcgga ggtggctgga ggtcgctgcc 60
gtggcggctg gggcacggcg gaacggtcta accggctccg gcgggccccg tccgcctcgg 120
tcgctgctcg gcggctgcta ggggtcgctg ccggggtggc tggggcacgg cggaacggtc 180
tacccgggtc cggcgggcgc cgtccggctc ggtcgctccg cggaggaggc taggggtcgc 240
tgccggggcg tctcggaaac ggcggaacgg tctacccggc tccggcgggc cccgtccgcc 300
tcggtcgctc cgcgccggcg gcggctagag gtcgctgccg tgtcggctcg gaaacggcgg 360
aacggtctac ccggctccga cgggcgccgt ccggctcggt agctccgcgg cggcggctag 420
aggtcgctgc cgtgtcggct cggaaacggc ggaacggtct acccggctcc ggcgggcgcc 480
gtccggctcg gtctctccgc ggcggcggct agaggtcgct gccgtgtcgg ctcggaaacg 540
gcggaacggt ctacccgggt ccgacgggcg ccgtccggct cggtctctcc gcggcggcgg 600
ctagaggtcg ctgccgtgtc ggctcggaaa cggcggaacg gtctacccgg ctccgacggg 660
ccccgtccgg ctcggtcgct ccgcggcggc ggctaggggt cgctgccggg gcgtctcgga 720
aacggcggaa cggtctaccc gggtgctacc gactcgcgct ctccgcggcg gcggctagag 780
gtcgctgccg gggcggcttg cgatccgcgt ccaggtctac ccggtttcgg attgtcttgg 840
ccgctctggc tgtggggggg ggcgctacag ctccggagct gccagaggcg tcgctgtaat 900
tttgtacctc cagttacgtc gaggtaaacc tcggctgccg tcggagccgc tgccggtagt 960
cggcgcctat ggggctagaa cgtttttttc ggatgcctta tatgttcgtc tgtaggagcg 1020
agtgaggact cggctccggt agtggcggtg agcgggcgct cgcgagcagg gttgaccggc 1080
cggccgccta gagaggggat cggcggcggc ggcggcggct ttctcgggca tcggttcgtt 1140
cgatcggtcc ggtcgcttcg gtttgtccgt cgctcctcat cccgcagctc tgtcctgggc 1200
taaggcggtt ttgcaggcga gcagcgaaaa aaagccggag aaggcgatca ctagtgcggc 1260
c 1261
<210>2
<211>674
<212>DNA
<213>Gallus gallus
<220>
<223>Promoter sequence of the chicken RNA polymerase I
<400>2
tccgcggcgg cggctagagg tcgctgccgt gtcggctcgg aaacggcgga acggtctacc 60
cggctccgac gggccccgtc cggctcggtc gctccgcggc ggcggctagg ggtcgctgcc 120
ggggcgtctc ggaaacggcg gaacggtcta cccgggtgct accgactcgc gctctccgcg 180
gcggcggcta gaggtcgctg ccggggcggc ttgcgatccg cgtccaggtc tacccggttt 240
cggattgtct tggccgctct ggctgtgggg gggggcgcta cagctccgga gctgccagag 300
gcgtcgctgt aattttgtac ctccagttac gtcgaggtaa acctcggctg ccgtcggagc 360
cgctgccggt agtcggcgcc tatggggcta gaacgttttt ttcggatgcc ttatatgttc 420
gtctgtagga gcgagtgagg actcggctcc ggtagtggcg gtgagcgggc gctcgcgagc 480
agggttgacc ggccggccgc ctagagaggg gatcggcggc ggcggcggcg gctttctcgg 540
gcatcggttc gttcgatcgg tccggtcgct tcggtttgtc cgtcgctcct catcccgcag 600
ctctgtcctg ggctaaggcg gttttgcagg cgagcagcga aaaaaagccg gagaaggcga 660
tcactagtgc ggcc 674
<210>3
<211>26
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Oligonucleotide derived from chicken ribosomal RNA
<400>3
gagtcagccc tcgacacaag cttttg 26
<210>4
<211>22
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Oligonucleotide derived of chicken ribosomal RNA
<400>4
ctactggcag gatcaaccag gt 22
<210>5
<211>24
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Oligonucleotide derived from chicken ribosomal RNA
<400>5
tagaggagaa cgcgacctcg agac 24
<210>6
<211>23
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Complementary oligonucleotide of the CAT sequence
transcribed from pGEM-(AgeI-SacI)-CAT(+)plasmid
<400>6
atgttcttta cgatgcgatt ggg 23
<210>7
<211>18
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Primer derived from promoter of the chicken RNA
polymerase I
<400>7
ggccggtcaa ccctgctc 18
<210>8
<211>38
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>oligonucleotide derived from a transcription product
corresponding to an initiation site of the chicken RNA
polymerase I promoter
<400>8
ttatatgttc gtctgtagga gcgagtgagg actcggct 38
Claims (25)
1.一种分离的或纯化的多核苷酸，其包括序列SEQ ID NO：1或其片段，所述片段由序列SEQ ID NO：1的至少10个连续的核苷酸组成，且所述多核苷酸具有转录启动活性。
2.一种分离的或纯化的多核苷酸，其包括序列SEQ ID NO：2或其片段，所述片段由序列SEQ ID NO：2的至少10个连续的核苷酸组成，且所述多核苷酸具有转录启动活性。
3.权利要求1或2的多核苷酸，其中所述多核苷酸具有转录启动活性。
4.权利要求3的多核苷酸，其中所述多核苷酸在禽类细胞中，优选在家禽细胞中，更优选在鸡的细胞中，具有转录启动活性。
5.一种重组DNA，其包括权利要求1-4中任一项中所定义的多核苷酸。
6.权利要求5的重组DNA，其还包括待转录的序列。
7.权利要求6的重组DNA，其中所述待转录的序列是未加帽RNA病毒的cDNA。
8.权利要求7的重组DNA，其中所述待转录的序列是负极性RNA病毒的cDNA。
9.权利要求8的重组DNA，其中所述负极性RNA病毒是正粘病毒或副粘病毒。
10.权利要求9的重组DNA，其中所述正粘病毒是流感病毒，优选A型流感病毒。
11.权利要求10的重组DNA，其表达流感病毒的vRNA，所述流感病毒例如是正粘病毒，且优选表达选自流感病毒vRNA片段1-8中的vRNA。
12.权利要求9的重组DNA，其中所述副粘病毒选自腮腺炎病毒属，例如腮腺炎病毒和新城疫病毒；麻疹病毒属，例如麻疹病毒；肺病毒属，例如呼吸道合胞病毒；和梅塔肺病毒属(genusMetapneumovirus)。
13.一种载体，其包括根据权利要求1-4中任一项的多核苷酸和/或根据权利要求5-12中任一项的重组DNA。
14.一种宿主细胞，其包括根据权利要求1-4中任一项的多核苷酸和/或根据权利要求5-12中任一项的重组DNA和/或权利要求13的载体。
15.权利要求14的宿主细胞，其中所述细胞是禽类来源的。
16.权利要求15的宿主细胞，其中所述细胞是家禽细胞，更特别的是鸡的细胞。
17.一种受精卵，其包括根据权利要求1-4中任一项的多核苷酸和/或根据权利要求5-12中任一项的重组DNA和/或权利要求13的载体。
18.至少以下一种成分在负极性重组RNA病毒的制备中的用途：
-根据权利要求1-4中任一项的多核苷酸；
-根据权利要求5-12中任一项的重组DNA；
-根据权利要求13的载体；
-根据权利要求14-16中任一项的宿主细胞；和
-根据权利要求17的是受精卵。
19.一种通过反求遗传学制备重组流感病毒的方法，该方法包括以下步骤：
a)将至少一种含有如权利要求10中所定义的重组DNA的载体和表达流感病毒蛋白PA、PB1、PB2和NP的载体导入禽类细胞或受精卵中；
b)在使得重组病毒能够表达的条件下培养a)中所获得的细胞或卵；和
c)回收b)中所获得的重组流感病毒。
20.权利要求19的方法，其中所述细胞是家禽细胞、更特别地是鸡的细胞。
21.权利要求19的方法，其中所述流感病毒优选为A型。
22.一种通过反求遗传学制备未加帽的重组病毒的方法，该方法包括以下步骤：
a)将一种或几种含有本发明的重组DNA和表达病毒RNA的转录/复制所必需的蛋白质的DNA的载体导入细胞或禽类来源的受精卵中；
b)在使得重组病毒能够表达的条件下培养a)中所获得的细胞或卵；和
c)回收b)中所获得的重组流感病毒。
23.一种组合物，其还包括一种药学上可接受的载体，和通过例如权利要求19-22中任一项所定义的制备方法所制备的重组病毒。
24.一种治疗用的组合物，其包括根据权利要求1-4中任一项的多核苷酸所转录的序列。
25.权利要求1或2的多核苷酸，其含于菌株pGEM-ChPolI-C15-E.Coli 1305中，该菌株于2003年2月24日保藏在CNCM，保藏号为I-2976。
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