CN1441842A - 通过重排其基因操纵负链rna病毒及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种增加单链负义病毒目的病毒中启动子远端基因表达的方法，和用该方法构建的重排病毒。还提供了一种对单链负义病毒目的病毒减毒，和构建用于疫苗的减毒病毒的方法。

Description

通过重排其基因操纵负链RNA病毒及其用途
相关申请的交叉引用
本申请是2000年6月23日提交的美国专利申请流水号09/602,288的在后专利申请，并根据美国宪法120章35条要求其优先权的权益。
发明背景
发明领域
本发明一般涉及分子病毒学和疫苗学领域。更具体的，本发明涉及通过重排基因对负链RNA病毒进行减毒及其用途。
相关领域的描述
单链负义病毒目由4个科组成，弹状病毒科(Rhabdoviridae)、副粘病毒科(Paramyxoviridae)、线状病毒科(Filoviridae)和波尔纳病病毒科(Bornavidae)。这些科中的病毒具有单链无节段反义RNA，在鱼类、植物和哺乳动物中引起广泛的重要疾病(Wagner，1996)。这些病毒编码的基因表达由基因在基因组上相对于单3′启动子的顺序在转录水平控制。单链负义病毒家族的病毒具有一种高度简单的控制基因表达的方法。该家族的线性单链RNA基因组编码5-10个基因，其顺序在所有成员中是高度保守的。病毒基因组的转录是由依赖于病毒编码的RNA的RNA聚合酶进行的。RNA聚合酶在线性基因组上有一个进入位点，但是产生的病毒的mRNA并不是等摩尔的。
得到的证据表明，基因组上基因的线性顺序控制各基因的表达水平。转录从基因组3′末端的单个聚合酶进入位点开始，强制进行(Ball和White，1976)。通过聚合酶以3′到5′方向穿越基因组，在每个基因间连接处脱离(约30％的时间)，而控制各基因作为单顺反子mRNA的表达水平(Iverson和Rose，1981)。该转录机制导致转录物量随着基因离基因组3′末端的距离增加，而依次减少。相应的，需要以化学当量支持复制的基因产物，例如核衣壳(N)蛋白在所有情况下是在或靠近3′末端处编码的，并以最高的摩尔量表达(Villarreal等，1976，Ball和white，1976)。需要酶量的基因产物，例如RNA聚合酶是在离3′末端最远处编码的。在所有单链负义病毒目的病毒中，聚合酶基因都是最靠近5′端的基因，并且以最少量表达。蛋白质的精确摩尔比是最佳复制所必需的。为了成功复制，蛋白质必需以与基因组正常表达的相似的摩尔比表达(pattnaik和Wertz，1990)。
单链负义病毒家族的病毒不经过同源基因重组(Pringle，1987)。因此，除了缺少一部分基因组的缺陷干扰颗粒外，在自然界未观察到具有重排形式的整套互补基因的这些病毒的变体。
水疱性口炎病毒(VSV)是弹状病毒科的原型病毒。其11kb基因组具有5个基因，编码病毒的5种结构蛋白：核衣壳蛋白N，是衣壳包装复制的RNA以化学当量所需的；磷蛋白P，是RNA依赖性RNA聚合酶的辅助因子；L；基质蛋白M；和结合糖蛋白G。基因组中基因的顺序是3′-N-P-M-G-L-5′，先前的研究已经显示单个3′启动子的强制性依次表达(Ball和white，1976)。由于在各基因连接处减少，最靠3′的基因的转录比离启动子更远的其它基因要丰富得多(Iverson和Rose，1981)。
在自然界，VSV感染各种动物，其中马、牛和家猪是经济上最重要的。感染导致口、蹄和乳头周围出现病变。虽然疾病很少致命，它们导致肉和乳品生产损失，以及检疫和疫苗接种的支出。有两种主要的VSV血清型，Indiana(Ind)和NewJersey(NJ)。这些病毒在美国中部和南部的农村流行，并在美国境内爆发。美国最近的爆发发生在1997年，在马中流行，为Ind血清型，而1995年和1982-1983年鉴定的前一例是NJ血清型。这些病毒传播方便，并且其疾病症状与牛和家猪中的口蹄疫病毒导致的症状相似，使得VSV成为农业产业中受到关注的病原体。
能复制产生保护性体液和细胞介导的免疫应答，而不引起疾病症状的活的减毒病毒已被证明对于天花、黄热病和脊髓灰质炎病毒是有效的疫苗。然而在大多数情况下减毒的策略是凭经验的，不能重现用于广泛使用。另外，考虑RNA病毒的情况，例如RNA依赖性RNA聚合酶的高差错率，其缺乏可靠的阅读和RNA病毒群的亚物种性质(Domingo等，1996)，使用这大类医学上重要的病原体的活减毒病毒成为一个问题。这尤其对于基于有限数量的单碱基改变的疫苗病毒，因为转换成毒性是潜在的问题。例如，仅几个回复突变可恢复Sabin脊髓灰质炎3型病毒疫苗株的毒性(Wimmer等，1993)。
现有技术的缺陷在于缺乏单链负义病毒目的病毒减毒，和提高单链负义病毒目中的病毒的启动子远端基因表达的有效方法。本发明满足了本领域该长期存在的需要和需求。
发明简述
单链负义病毒目的无节段负链RNA病毒包括几种重要的人病原体。其基因的顺序是高度保守的，是基因表达的相对水平的主要决定因素。在病毒基因组上靠近单启动子位点的基因的转录水平比存在于更远的位置的要高。操纵原型水疱性口炎病毒(VSV)的感染性cDNA克隆重排5个病毒基因中的4个的顺序，同时保持病毒核苷酸序列的所有其它方面不变。在一组cDNA克隆中，编码磷蛋白P、基质蛋白M和糖蛋白G的中间三个基因重排成共6种可能的顺序。在另一组中，核衣壳蛋白N的基因从野生型的靠近启动子的位置移开，置于第二位、第三位或第四位。在最后一种重排中，编码主要表面抗原，作为中和性抗体的目标的G蛋白基因被置于最大表达位置的启动子隔壁。从这些重排cDNA每一种中回收感染性病毒，并检测其在细胞培养物中的基因表达水平和生长潜力，并在动物宿主中检测其免疫原性和毒性。重排改变了编码的蛋白质的表达水平，并同时在培养的细胞和动物中不同程度对病毒进行了减毒。提高G蛋白的表达增强并加速在接种的小鼠中的免疫应答。由于单链负义病毒不经过同源重组，基因重排应该是不可逆的，因此提供了开发针对该类病毒的安全减毒的活疫苗的合理方法。
在本发明的一个实施例中，提供了一种提高单链反义病毒的病毒中启动子远端基因表达的方法包括步骤：通过将启动子远端基因向野生型3′启动子附近的位点移动，重排病毒基因顺序。
在本发明的另一个实施例中，提供了一种具有重排基因组的单链负义病毒目的重组病毒，其中基因组是通过将启动子远端基因向野生型3′启动子附近的位点移动重排的。这样的重组病毒可用于加速和增强保护性免疫应答。
在本发明的另一个实施例中，提供了一种使单链负义病毒目的病毒毒性减弱的方法，该方法是通过将基因从其野生型位置移开重排病毒基因顺序，或通过将关键限制因素基因从其野生型3′启动子近侧位点移开重排病毒基因顺序。
在本发明的另一个实施例中，提供了一种构建用于疫苗的减毒病毒的方法，包括步骤：通过将基因从其野生型3′启动子近侧位置移开重排基因顺序，其中该基因是基因组复制的关键限制因素；和将编码免疫应答诱导抗原的基因放在最靠近病毒基因顺序3′末端的位置。
本发明的其它和另外的方面、特征和优点将从下面为了公开给出的本发明优选例的描述中明白。
附图简述
因此，获得的和可以详细理解的本发明的上述特征、优点和目的，以及其它将明白的内容，上面简述的本发明更具体的描述可根据在附图中说明的一些例子获得。这些图是说明书的一部分。然而应注意附图说明了本发明的优选例，不是限制其范围。
图1显示了重排的VSV基因组的基因顺序。
图2显示了产生重排的VSV基因组cDNA的步骤。
图3A显示了用于产生基因顺序重排的cDNA分子的限制性酶的切割专一性。使用PCR，将BspMI或BsaI位点置于VSV的P、M和G基因的两端，和N基因的3′端和L基因的5′端，例如对应于顺反子间连接的保守核苷酸中4个的粘性末端。图3B显示了用于基因顺序重排的克隆的VSV基因组片段。
图4显示了构建重组基因组N2、N3、N4和G1N2的策略。
图5A是VSV基因组的示意图，显示分别与N或L基因退火的PCR引物位置(箭头所示)和限制性酶切位点和预测的片段大小。图5B显示了用指定的酶消化病毒GMP、MGP、PGM、PMG、GPM和MPG的病毒RNA的cDNA后获得的产物(分别为泳道1-6)。在1％琼脂凝胶上，在溴乙锭存在下电泳分析片段。泳道M＝具有指定大小的标记的DNA片段。
图6显示了在被野生型和变体病毒感染的BHK-21细胞中合成的病毒RNA。病毒RNA用[3H]尿苷标记，在琼脂糖-脲凝胶上电泳分辨，并用荧光检测。感染的病毒在泳道上显示，病毒RNA在左侧标出。
图7显示了在被野生型和变体病毒感染的BHK-21细胞中合成的病毒蛋白质。病毒蛋白质用[35S]甲硫氨酸标记，在SDS-聚丙烯酰胺凝胶上电泳分辨，并用放射性自显影检测。感染的病毒在泳道上显示，病毒蛋白质标于左侧。Uninf是未感染的细胞。
图8显示了在被野生型和变体病毒感染的BHK-21细胞中合成的蛋白质的摩尔比。如图7所示标记蛋白质，在SDS-聚丙烯酰胺凝胶上电泳分辨，并用磷光显影定量。在对于各蛋白：N-14、P-5、M-11、G-10和L-60的甲硫氨酸含量定标后，计算摩尔比。
图9显示了野生型VSV和重排的变体在BSC-1细胞中的单步生长曲线。在37℃的三个独立单步生长实验中，一式两份在各时间点测定病毒滴度，算出结果平均数。
图10显示了野生型(wt)和变体病毒在鼻内接种到小鼠体内后的发病机制。显示了接受鼻内接种100FU各变体病毒的动物中发病率(灰色条)和致死率(黑色条)的时间过程。在所示时间期后没有其它变化发生。
图11显示了用重排病毒N1(wt)、N2、N3和N4感染的BHK-21细胞中合成的病毒特异性RNA。感染、标记和分析的条件如图6所示。
图12显示了用重排病毒N1(wt)、N2、N3和N4感染的BHK-21细胞中合成的VSV特异性蛋白的摩尔比。如图7所示分析蛋白质，如图8所示计算摩尔比。
图13显示了通过在BHK细胞中的单步生长，具有N基因转位的病毒的复制。
图14显示了病毒N1(wt)、N2、N3和N4对小鼠的相对致死率。
图15显示了对于病毒N1(wt)、N2、N3和N4的抗体产生和针对致死攻击的保护的能力比较。
图16显示了在被含有插入各VSV基因间连接的外源基因(I)的病毒感染的BHK-21细胞中合成的病毒特异性RNA。感染、标记和分析的条件如图6所示，除了标记的时间是感染后2-4.5小时。
图17显示了变体病毒：病毒N1G4(野生型)、G1N2、G3N4和G1N4的基因顺序。
图18显示了病毒蛋白质在被变体病毒感染的BHK-21细胞中的合成。在图18A中，以50MOI感染BHK-21细胞37℃孵育5小时，在放线菌素D(5微克/毫升)的存在下孵育最后2小时。然后不加甲硫氨酸，使感染的细胞饥饿30分钟，接触含有[35S]甲硫氨酸(30μCi/ml)的培养基1小时。用SDS-PAGE分析总感染细胞蛋白。在图18B中，BHK-21细胞以5MOI感染，并在感染后2.5-12小时接触[35S]甲硫氨酸(50μCi/ml)，然后从上清液分离病毒颗粒。在10％蔗糖中离心纯化病毒颗粒，并用SDS-PAGE测定蛋白含量。用磷光显影定量图18A和图18B所示的病毒蛋白质，并表达成图18C中的感染的BHK-21细胞的各病毒蛋白质的摩尔百分数，或图18D中的纯化的病毒颗粒中各蛋白的摩尔百分数。数据显示平均两个独立实验。泳道1，N1G4(wt)；2，G1N2；3，G3N4；4，G1N4；5，未感染细胞。
图19显示了单步生长分析。测定病毒通过在BHK-21细胞中37℃下单步生长复制的能力。细胞以感染复数3被感染，在指定的时间点收集上清液培养基的样品。用蚀斑试验在Vero-76细胞上一式两份滴定样品。感染后24小时测定每个细胞的平均病毒产率(inset)。
图20显示了小鼠中的发病机制。以1000PFU/小鼠的剂量对一组6只小鼠鼻内施用所示病毒，每天监测动物的发病率和死亡率。在12天后未见进一步的变化。
图21显示了用重排的病毒接种的小鼠平均重量。用系列10倍稀释的N1G4(wt)、G1N2、G3N4或G1N4，以从10,000-1pfu/只动物鼻内接种一组6只小鼠。对照小鼠单独接受接种介质。垂直的虚线表示用5.4×106pfu/小鼠的野生型病毒攻击的天数。对于各组，一起称重全部活的动物，并确定平均重量。↓，10,000pfu；1,000pfu；□，100pfu，≤10pfu；＜1pfu；+，介质。
图22显示了对用重排和野生型病毒接种反应，产生抗体的动力学。用系列10倍稀释的N1G4(wt)、G1N2、G3N4或G1N4，以从10,000-1pfu/只动物鼻内接种一组6只小鼠。对照小鼠单独接受接种介质。垂直的虚线表示用5.4×106pfu/小鼠的野生型病毒攻击的天数。每隔一周从2-4只小鼠尾部取血，收集血清，合并血清并通过在ELISA中，在去污剂裂解的VSV-感染的细胞抗原上滴定，测定针对VSV的抗体水平。抗体水平表示成log10滴度。↓10,000pfu；1,000pfu；□，100pfu，≤10pfu；＜1pfu；+，介质。
图23显示了用系列10倍稀释的N1G4(wt)、G1N2、G3N4或G1N4，以从10,000-1pfu/只动物鼻内接种一组6只小鼠。对照小鼠单独接受接种介质。如通过蚀斑减少试验在攻击日的血清样品测量的方法，评估小鼠的中和性抗体水平(图23A)。中和性抗体水平表达成在Vero-76细胞上的野生型病毒蚀斑中减少50％的最高稀释度的倒数。*给予1PFU或10PFU的N1G4或G1N2的病毒的动物血清具有背景水平的中和性抗体。还评估了小鼠被5.4×106PFU的N1G4病毒鼻内攻击存活的能力(图23B)。虚线显示了该剂量在未接种的，年龄相当的，对照动物中攻击21天后的死亡率。
图24显示了用具有如各表格下方所示的基因顺序重排(“le”和“tr”各表示3’前导和5’尾随序列)的基因工程改造的VSV接种后第3天的猪嘴。麻醉猪，施用2.5×107PFU的指定的病毒。用N1G4(WT)、G1N2、G3N4或G1N4感染动物(分别是图24A-24D)。
图25显示了每组4只动物在用重排的病毒接种后各自的临床评分。用2.5×107PFU病毒接种猪，每天评估病变的形成。临床评分基于得到的病变的大小和位置。各符号代表各动物。
图26显示了用重排的病毒接种后猪的病毒分离。用2.5×107PFU病毒接种猪。如所示取得鼻和食道探管拭子。滴定样品，通过37℃3天(对于N1G4(WT)和G1N2)或31℃4天(对于G3N4和G1N4)在BHK-21细胞上培养，回收病毒。各方块代表一只动物，显示了对于病毒CPE是阳性(■)或阴性()的样品。用RT-PCR确定病毒的存在和基因顺序。
图27显示了用重排病毒接种后的血清中和性抗体滴度。用2.5×107PFU病毒接种猪。每隔7天收集血清，确定中和性抗体的水平。在第28天用5.7×106PFU增强免疫给予G1N4的动物。条表示各组的平均数和范围。虚线表示试验的灵敏度极限。
图28显示了在用N1G4(WT)病毒攻击后的猪的临床评分。麻醉猪，在最初施用病毒后的36天施用4.2×107PFU野生型病毒攻击。每天监测病变的形成。临床评分基于得到的病变的大小和位置。各符号代表各动物。
图29显示了在用N1G4(WT)病毒攻击后猪的病毒分离。在施用攻击的病毒后，在指定的时间点采集鼻内和食道探管的拭子。如下滴定样品。各方块代表一只动物，显示了对于病毒CPE是阳性(■)或阴性()的样品。用RT-PCR确定病毒的存在和基因顺序。
图30显示了用N1G4(WT)病毒攻击后的血清中和性抗体滴度。在指定的时间点，在施用病毒攻击后收集血清，用终点试验测定中和性抗体水平。条表示各组的平均数和范围。虚线表示试验的灵敏度极限。
发明详述
本发明说明了在负链RNA病毒的基因组中引入特定的变化，使得核衣壳(N)蛋白的基因转位到基因组上的随后位置，并直接证明基因相对于启动子的位置决定了表达水平。N蛋白合成的水平控制RNA复制水平。与此一致，本发明证明N mRNA的水平和被病毒N2、N3和N4感染的细胞中蛋白质合成减少，基因组RNA复制的水平也减少。相应的，细胞培养物中感染性病毒的产生随着病毒N4减少了4个数量级。最后，与降低的复制能力一致，病毒N2、N3和N4对于IN接种后的小鼠的致死率也分别相对于野生型病毒下降了大约1、2或3个数量级。在病毒的天然宿主中也观察到了类似的复制和保护结果。
这些数据显示，对于复制重要的一个基因转位到病毒基因组下游的连续位点，使得细胞培养物中的生长可能性和动物模型中和天然宿主中以分步形式病毒致死率下降。然而，病毒在小鼠和天然宿主中引发保护性免疫应答的能力不随着毒性的减弱而改变。因此，由于所有病毒都含有基因的野生型互补体，所有都能复制(尽管水平减弱)，复制水平足够诱导保护性宿主应答。因此，对于一些重排的病毒，保护性剂量和致死剂量差1000倍，与野生型病毒中致死剂量和保护性质量重叠相反。合起来，这些数据提示以能确定最佳减毒水平的可预测、增加的方式，对无节段负链RNA病毒进行减毒，以避免疾病产生，也不丧失能诱导足够免疫应答的复制能力的方法。
本发明还证明可以提高启动子远端基因，例如G基因(编码结合糖蛋白)的表达，通过将其移动到启动子近侧位点。为了显示感染中G蛋白产生的增加可引起更大的保护性免疫应答，在VSV基因组的感染性cDNA克隆中工程改造引入改变，回收了两种新颖的病毒，其中糖蛋白基因从其正常的第四位移动到基因顺序的第一位。一个病毒具有基因顺序3’-G-N-P-M-L-5’(G1N2)，第二个具有3’-G-P-M-N-L-5’(G1N4)。评估了这些病毒的体外和体内特征，并与具有基因顺序3’-P-M-G-N-L-5’(G3N4)和3’-N-P-M-G-L-5’(N1G4)的病毒比较，后者是野生型基因顺序。在这些病毒在细胞培养物中复制，小鼠中的致死率、抗体产生的动力学和水平，及其抵抗致死剂量的VSV的攻击的能力中观察到差异。
由于未观察到单链负义病毒目病毒经历同源重组，预测基因重排是不可逆的，因此，本发明提供了一种开发针对无节段单链单一RNA病毒的稳定的减毒活疫苗的合理的另选方法。另外，基于基因组织的密切相似和基因表达的控制，该产生减毒病毒的方法应该用于单链负义病毒的整个家族，它包括弹状病毒例如狂犬病病毒，副粘病毒例如麻疹、腮腺炎、呼吸道合胞病毒，和副流感病毒I-IV，和丝状病毒例如埃博拉和马尔堡病毒。这些代表了问题最大的病毒病原体中的一些。
在本发明的一个实施例中，提供了一种在单链负义病毒目的病毒中提高启动子远端基因表达的方法，包括步骤：通过将启动子远端基因朝野生型3’-启动子近侧位点移动重排基因顺序优选远端基因编码表面糖蛋白。对于水疱性口炎病毒，一个编码表面糖蛋白的远端基因是结合糖蛋白G的基因。对于呼吸道合胞病毒，编码表面糖蛋白的远端基因称为结合糖蛋白(G)基因；另一个编码表面糖蛋白的远端基因是呼吸道合胞病毒融合(F)蛋白基因。对于麻疹病毒，编码表面糖蛋白的远端基因是H(红细胞凝集素)基因。对于腮腺炎和副流感病毒，编码表面糖蛋白的远端基因是HN(红细胞凝集素/神经酰胺)基因。本领域普通技术人员应不难识别，对于单链负义病毒目的各具体病毒，为了进行本发明的方法应操纵哪个编码表面糖蛋白的远端基因。
在本发明的另一个实施例中，提供了具有重排基因组的单链负义病毒目的重组病毒，其中通过将启动子远端基因朝野生型3’-启动子近侧位点移动重排基因组。这种重组病毒可用于加速和增强保护性免疫应答。
在本发明的另一个实施例中，提供了一种减弱单链负义病毒目的病毒毒性的方法，通过将基因从其野生型位置移开重排病毒基因顺序，或通过将关键限制因素基因从其野生型3′启动子近侧位点移开重排病毒基因顺序。优选该基因在病毒基因顺序中置于最后的位置隔壁。另外，优选作为基因组复制的关键限制因素的基因是核衣壳(N)基因。单链负义病毒目的病毒的代表性例子是弹状病毒，例如狂犬病病毒或水疱性口角炎病毒；副粘病毒，例如麻疹、腮腺炎、副流感病毒或呼吸道合胞病毒(人和牛)，或丝状病毒，例如埃博拉或马尔堡病毒。本发明还包括根据该方法减毒的病毒。
在本发明的另一个实施例中，提供了一种构建用于疫苗的减毒病毒的方法，包括步骤：通过将基因移离其野生型3′启动子近侧位点，重排病毒基因顺序，其中该基因是基因组复制的关键限制因素；和将编码免疫应答诱导抗原的基因置于最靠近病毒基因顺序的3′末端的位置。优选关键限制因素基因是核衣壳(N)基因，基因置于病毒基因顺序的最后位置隔壁。优选编码免疫应答诱导抗原的基因可以是结合糖蛋白(G)基因，融合基因或红细胞凝集素/神经酰胺基因。本领域普通技术人员不难替换合适的免疫应答诱导抗原。本发明还包括根据本发明减毒的病毒。
根据本发明，可使用技术领域中的常规分子生物学、微生物学、和重组DNA技术。这些技术在文献中有完整的解释。见例如Maniatis，Fritsch & Sambrook，“Molecular Cloning：A laboratory Manual”(1982)；“DNA Cloning：A PracticalApproach，”卷I和II(D.N.Glover编，1985)；“Oligonucleotide Synthesis”(M.J.Gait编，1984)；“Nucleic Acid Hybridization”[B.D.Hames & S.J.Higgins编(1985)]；“Transcription and Translation”[B.D.Hames & S.J.Higgins编(1984)]；“Animal Cellculture”[R.I.Freshney编(1986)]；“Immobilized Cell And Enzymes”[IRL Press，(1986)]；B.Perbal，“A Practical Guide To molecular Cloning”(1984)。因此，如果在本文中出现，下列术语应具有下面列出的定义。
本文所用的术语“减毒”定义为一种遗传学机制，涉及转录的预成熟终止，用于调节基因表达，或免疫学上的机制，使得病原性微生物丧失毒性。
本文所用的术语“致死剂量”定义为使宿主死亡所需的病毒接种量。
本文所用的术语“保护性剂量”定义为产生对病毒的足够免疫应答，但不导致死亡的病毒接种量。
本文所用的术语“重排”定义为重排病毒基因组内的基因顺序，例如基因和基因间区仍然是野生型的，仅改变相对于3′末端的顺序。
本文所用的术语“负链RNA病毒”定义为一类RNA病毒，其中基因组包含RNA分子的负链。
给出了下列例子以说明本发明的各个实施例，但不是为了以任何方式限制本发明。
实施例1
病毒和细胞
VSV的Indiana血清型的San Juan分离物提供了用于本文的大部分cDNA克隆的最初模板。然而，编码G蛋白的基因最初衍生自VSV Indiana的Orsay分离物(Whelan等，1995)。用幼仓鼠肾(BHK-21)细胞回收来自cDNA和用于单步生长试验的病毒，放射性同位素标记RNA和蛋白质。非洲绿猴肾细胞(BSC-1和BSC-40)或Vero-76细胞系用于蚀斑试验。
实施例2
感染性病毒的质粒构建和回收
VSV的5个基因各侧接同样序列的18个核苷酸。因此，可以构建单个分子的克隆，其中可通过用合适的限制性内切核酸酶消化释放准确的包含各基因的DNA片段。用在远离其识别序列的位置切割的限制性内切核酸酶产生具有对应于保守顺反子间区的4个相同核苷酸(ACAG)的粘性末端的基因节段。用这种方法，可以将任何所需的顺序重新装配含有所有5个基因的DNA节段，以建立一类DNA质粒，它们的核苷酸序列准确对应于野生型VSV，但是其基因重排过。图2、3和4显示了重排病毒基因组N1(wt)、GMP、MGP、PGM、GPM、MPG、N2、N3、N4、G1N2和G1N4的构建中涉及的步骤图。在基因组中没有其它改变，除了在P基因下游的基因间区中有一个核苷酸改变。该变化从3’-CA-5’变成“3’-GA-5’对转录几乎没有影响。
为了从重排的cDNA克隆中回收感染性病毒，用表达T7 RNA聚合酶(vTF7-3)的重组痘病毒感染BHK-21细胞(Fuerst等，1986)。一小时后，用重排的VSV cDNA和三个表达反基因组RNA衣壳包装和复制必需的N、P和L蛋白的质粒转染细胞(Whelan等，1995)。从上清液收集感染性病毒，在BHK-21细胞中以低感染复数(MOI)扩增，以避免形成DI颗粒，并在胞嘧啶阿糖苷(25微克/毫升)的存在下抑制痘病毒的复制。上清液滤过0.2μM膜，病毒在15-45％蔗糖速度梯度上形成条带，将其与任何残留的vTF7-3痘病毒分开。通过用反转录和PCR扩增基因组的重排部分，然后用限制性酶分析确定回收的病毒基因顺序(图5)。
实施例3
单轮病毒复制
用单个病毒以3的进入复数感染106 BHK-21、BSC-40或BSC-1细胞的单层培养物。吸收1小时后，除去接种物，洗涤两次培养物，加入新鲜培养基并在31℃或37℃培养。在36小时后的指定的间隔收集样品，并用蚀斑试验在汇合的BSC-40细胞或Vero-76细胞单层上定量病毒复制。
实施例4
病毒RNA和蛋白质合成的分析
用各病毒以进入复数为5PFU/细胞感染汇合的BHK-21细胞单层培养物，并使其吸收1小时。为了分析病毒RNA合成，用放线菌素D(5微克/毫升)在感染后1.5小时处理培养物30分钟，然后加入[3H]-尿苷(30μCi/ml)，标记2或4小时。收集细胞，制各胞质抽提物，并在1.75％琼脂糖-脲凝胶上如所述(Pattnaik和Wertz，1990)分析RNA。在感染后4小时，通过在无甲硫氨酸的培养基中培养30分钟，然后加入[35S]-甲硫氨酸(40μCi/ml)标记30分钟，分析蛋白质合成。制备胞质提取物，在10％聚丙烯酰胺凝胶上如前所述(Pattnaik和Wertz，1990)分析蛋白质。用放射性自显影的密度分析，使用装有Pdi Quantity One软件的HowteckScanmaster 3定量各RNA或蛋白质，并随后计算摩尔比。
另外，在以50MOI感染的BHK-21细胞中测定了各变体病毒指导的病毒蛋白质合成，在感染后3小时加入放线菌素D(5微克/毫升)。感染后5小时，洗涤细胞并在无甲硫氨酸的培养基中培养30分钟。细胞接触[35S]甲硫氨酸(30μCi/ml，sp act mCi/ml)1小时。直接将细胞单层收集入凝胶负荷的缓冲液中，在对于相等的每分钟计数(cpm)标定后在10％聚丙烯酰胺凝胶上用低二硫(bis)对丙烯酰胺比分离P和N蛋白。用磷光显影仪定量病毒蛋白质并计算摩尔比。
为了评估各蛋白在成熟病毒颗粒中的数量，以5MOI感染BHK-21细胞。在2小时后，洗涤细胞并在无甲硫氨酸的培养基中培养30分钟。用[35S]甲硫氨酸(50μCi/ml，sp act10.2mCi/ml)标记细胞过夜，加入冷甲硫氨酸至10％正常培养基水平。收集上清液，离心除去细胞碎片，用10％蔗糖离心收集病毒。在标定cpm后，将病毒颗粒重新悬浮在凝胶负荷缓冲液中，在10％聚丙烯酰胺凝胶上分离病毒颗粒蛋白质。用磷光显影仪定量病毒颗粒蛋白，测定摩尔比。
实施例5
小鼠中的毒性
在从Taconic Farms获得的3-4周龄的雄性Swiss-Webster小鼠中测试各病毒的致死率。用稀释液(PBS)或系列10倍稀释的各病毒，通过以30微升体积在颅内，或15微升体积在鼻内接种多组5-6只的轻微麻醉(开他敏/甲苯噻嗪)的动物。另外，用开他敏/甲苯噻嗪轻微麻醉6只小鼠组，用10微升等份的系列10倍稀释的各病毒在Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)中的稀释液鼻内接种。给予对照动物相似体积的DMEM。每天观察动物，用Reed和Muench法(1938)计算各病毒的50％致死剂量(LD50)。
实施例6
小鼠的保护
用稀释液接种对照小鼠组，或鼻内接种非致死剂量的各病毒，通过尾部取血监测小鼠的中和性血清抗体产生。在接种后第14日，用15微升1.3□106PFU的野生型病毒(称为N1)在如上轻度麻醉下鼻内施用，以攻击小鼠。观察受到攻击的动物21天。
实施例7
重排单链负义病毒基因的通用方法
为了重排VSV基因而不在病毒基因组中引入其它改变，使用聚合酶链式反应(PCR)来构建N、P、M和G基因的各cDNA克隆，它们侧接在识别序列外侧切开的限制性酶的位点。为了侧接P、M和G基因，使用BspM1位点，而为了侧接N基因，使用Bsa1位点(N含有内部BspM1位点)。设计PCR引物来安排这些限制性位点，使得在内切核酸酶消化后留下对应于ACAG(SEQ ID NO：13)序列的4个碱基粘性末端，它对应于存在于各VSV mRNA起始位置的保守5’AACAG...3’(SEQ ID NO：14)，(见图3A)。例如：
5’...ACCTGCACTA ACAG......AAAAAAACTA ACAGAGATGCAGGT...3’(SEQ ID NO：1)，其中用有义书写的VSV序列用斜体表示，BspM1识别位点是黑体，BspM1消化后留下的4个碱基粘性末端是下划线的。就此，4个基因和它们各自的基因间连接在具有相容的粘性末端的各DNA片段上重现(图3A和3B)。来自野生型序列的唯一细微差别是未转录的基因间二核苷酸在所有连接处是5’-CT-3’，包括在P基因之后的野生型序列是5’-CT-3’。该突变明显是沉默的(Barr等，1997)。为了避免在PCR中产生的假突变作用，对克隆的基因末端进行测序，将其内部用感染性克隆的对应DNA片段替换。
需要两个另外的起始质粒来重新构建重排的全长克隆：一个含有噬菌体T7启动子，然后是VSV前导序列，安排有一个独特的BspM1位点，在N基因起始处的5’(A)ACAG(SEQ ID NO：14)中切割：5’...GAAACTTTA ACAGTAATGCAGGT...3’(SEQ IDNO：2)。另一个质粒含有L基因起始的420个核苷酸，并具有独特的BspM1位点，在L的起始处切割相同的序列：5’...ACCTGCACTA ACAGCAATCATG...3’(SEQ ID NO：3)。N、P、M和G基因片段单向连接入这些质粒的独特的BspM1位点，分步从3’或5’末端开始重建病毒基因组。插入各基因重建野生型的基因间连接，并留下独特的BspM1位点来接受下一个基因。
质粒构建的最后一步是加入来自感染性克隆的DNA片段，它含有L基因剩下的6kb，病毒基因组的5’末端和复制竞争性转录物胞内合成所需的核酶和T7终止子(Pattnaik等，1992)。该方法可用于任何在其基因间连接具有保守序列的单链负义病毒。图1显示了以该方法建立的重排的基因顺序。为了证实该克隆策略，并证明各基因编码功能性蛋白，与重排的cDNA克隆平行建立了含有野生型基因组的质粒。从该质粒回收的病毒用作野生型(N1，见图1)。在所有情况下，基因间保留保守的23个核苷酸的基因间区。
实施例8
产生在中间三个基因中具有重排的病毒
VSV基因组cDNA的最初重排是保守的，因为单链负义病毒家族的所有病毒基因组高度保守，而且了解对于复制需要VSV核衣壳(N)蛋白、磷蛋白(P)和RNA聚合酶(L)蛋白的精确摩尔比。最靠3’的基因N和最靠5’的基因L最初留在其天然位置，而VSV三个中间的基因P、M和G基因以所有可能的组合重排，产生6种基因组顺序(N1(wt)、GMP、MGP、PGM、GPM和MPG)，如图1所示。野生型基因顺序N1如上所述产生，用于测试是否所有的cDNA元件有功能。在特化的T7表达质粒中构建各cDNA，该质粒是设计用于产生具有精确5’和3’末端的RNA的(Pattnaik等，1992)。
通过将具有编码VSV N、P和L蛋白来衣壳包装从cDNA克隆转录的RNA，和形成上述功能性核糖核衣壳(Whelan等，1995)的6种重排的cDNA各自转染入被表达T7聚合酶的痘病毒(Fuerst等，1986)感染的BHK细胞，证实重排的cDNA产生功能性RNA基因组的能力。以不同效率从全部6种cDNA构建物中回收病毒，并在胞苷阿糖苷(25微克/毫升)的存在下扩增，然后滤过0.2微米滤膜以除去用于表达cDNA转录所需的T7聚合酶的重组痘病毒，以得到RNA病毒。
实施例9
回收的RNA病毒的基因顺序反映了产生其的cDNA的顺序
在细胞培养物中传代三次后确定回收的病毒的基因顺序，通过反转录和PCR扩增含有病毒基因组重排部分的4.1kb片段，然后限制性酶分析PCR产物。用位于N和L基因中的引物进行PCR。在用限制性内切核酸酶切割AccI、BglI或PstI(分别在P、M或G基因中独特切割)后，发现消化的产物的大小恰如预测的(图5A和5B)。数据显示回收的病毒的基因顺序与回收的cDNA克隆相对应。没有在变体中重现野生型基因顺序的证据。
实施例10
病毒RNA和蛋白质的合成
接着检测回收病毒基因表达的水平。通过在感染细胞中代谢掺入[3H]尿苷或[35S]甲硫氨酸，并通过凝胶电泳分析放射性标记的产物，检测变体病毒合成的病毒RNA和蛋白质。在被野生型病毒，和各变体感染的细胞中产生同类的病毒RNA：11.16kb的基因组RNA和代表L、G、N、P和M基因的mRNA(图6)。后两种mRNA大小相似，在电泳中一起迁移。在被变体病毒感染的细胞中未发现新颖或异常的RNA，说明病毒制备物没有DI颗粒(图6)。另外，RNA情况的相似支持了观点，即转录过基因间连接时病毒聚合酶的行为是通过在这些位置的局部序列元件专门确定的，没有可检测的长期影响。根据RNA模式，变体病毒产生的病毒蛋白质也和野生型感染过程中产生的病毒蛋白质数量相似(图7)。
虽然被野生型和变体病毒感染的细胞RNA和蛋白质的情况在数量上相似，对不同RNA和蛋白质相对水平的测定显示，变体病毒表达基因的摩尔比与野生型和彼此都不同(图8)。将各蛋白的表达标定到各变体病毒启动子近侧N基因的表达显示，一种基因的相对表达水平主要依赖于其在基因组中的位置，和它离启动子的距离，如进行性转录减毒模型所预测的。通过比较野生型(PMG)和变体GMP(其中中间基因顺序相反)表达的蛋白质的摩尔比，清楚的例证了该结论(图8)。由于没有分辨M和P mRNA，类似的mRNA情况定量分析是复杂的(图6)，但测量L、G和N mRNA水平进一步确定了结论，贴近病毒基因组3’末端的基因是其转录水平的主要决定簇。例如，G mRNA中的相对丰度差异反映了G基因的位置(图6)。RNA情况还显示RNA复制的水平，如通过11.1kb基因组和反基因组RNA的丰度测量的，基本上在变体之间是不同的(图6)。
实施例11
具有中间三个基因的重排的病毒复制
比较了变体病毒在蚀斑形成和一轮生长条件下复制的能力。虽然一些病毒，例如MGP和MPG不能与N1野生型病毒(PMG)在这些试验中区分开来，其它例如GMP、GPM和PGM比野生型在BSC-1细胞单层上形成显著小得多的蚀斑(表1)。另外，当野生型病毒和其它变体大小仍然增加时，GMP蚀斑在24小时后停止生长(表1)。GMP、GPM和PGM的受损复制也在BSC-1细胞上生长一轮中被证明。在感染后17小时，变体增加的产率对于三个独立生长取平均数，并表示成野生型的百分数如下：对于MGP，107％；对于MPG，51％；对于GMP，23％；对于PGM，21％；和对于GPM，1.6％(表2)。
表1
蚀斑直径(平均±标准误差)a
 病毒   24小时    30小时
 PMG(野生型)   4.02±0.12    4.81±0.19
 GMP   3.08±0.17    3.10±0.18
 MGP   3.96±0.19    4.97±0.18
 PGM   3.36±0.12    3.86±0.14
 GPM   2.29±0.09    3.16±0.13
 MPG   3.85±0.18    5.43±0.17
a从约两倍放大在BSC-1细胞单层上37℃形成的50(24小时)或70(30小时)个病毒蚀斑所拍的照片中测量的蚀斑直径。
实施例12
在中间三个基因中具有重排的病毒毒性
野生型VSV在小鼠的颅内或鼻内接种导致致命脑炎。从1938年起，当Sabin和Olitsky首先描述了小鼠对于VSV脑炎的神经病变和相当的敏感性作为年龄和接种途径的函数后，用幼小鼠作为便利和敏感的小动物模型，用于比较VSV及其突变株的致死率(Sabin和Olitsky，1938；Wagner，1974)。如此检测了小鼠中的变体病毒的发病机理。
野生型VSV鼻内接种入3-4周龄的小鼠导致脑炎，并在7-11天后麻痹和死亡(Sabin和Olitsky，1938)，LD50剂量为约10PFU。通过鼻内用系列10倍稀释液(0.1-1,000PFU/剂)接种小鼠，并一天观察两次，比较变体病毒的毒性。用图5A和5B所示的方法，从接种小鼠的大脑中，在死亡后补救回收病毒，证实了病毒基因顺序。在每一种情况下，回收的病毒的基因顺序相当于接种物的基因顺序(数据未显示)。
变体病毒的LD50剂量与野生型的相似，而病毒GPM、GMP和MGP需要稍高(1.5-到2-倍)剂量(表2)。这些实验重复三次，代表性实验的结果显示了在100PFU剂量/小鼠出现疾病和死亡的时间。野生型感染的动物首先在接种后第6天出现疾病，迅速瘫痪，并在两周内死亡。重组GMP和MGP引起可重复的更快的发病，症状比野生型感染的动物产生早24-36小时，而MPG和GPM感染发生死亡要晚24-36小时(图10)。一般野生型VSV感染典型的瘫痪在变体病毒中出现较不明显，但没有如一些M蛋白突变体产生的(Barr等，1997)持续神经系统疾病的证据。
小鼠中的毒性不能从变体病毒的细胞培养物表型中预测(表2)。在细胞培养物中复制的最受损的三种重组株(GMP、PGM和GPM)中，一种(GPM)比野生型需要2倍多的病毒LD50，并显示小鼠的杀死稍延迟，而GMP诱导更快的症状和死亡，PGM与野生型不能区别。在细胞培养物中病毒的行为和其在动物中的特性之间缺乏联系是在不同的动物病毒之间常见的，但是在该情况下有趣的是病毒之间的唯一区别是表达的野生型蛋白质的相对水平。
表2
变体病毒的性质总结
基因顺序 相对蚀斑大小a 相对裂解大小b  LD50值c  症状发生d
PMG(wt)  1.00  1.00   14   6.0
 GMP  0.64  0.23   21   4.5
 MGP  1.03  1.07   21   5.5
 PGM  0.80  0.21   12   5.5
 GPM  0.66  0.016   30   5.5
 MPG  1.13  0.51   11   5.5
a在感染后30小时测量(见表1)。
b在感染后17个小时测量(见图9)。
c每只小鼠鼻内接种的PFU。
d每只小鼠100PFU鼻内接种后的天数(见图10)。
实施例13
N基因重排的病毒
受到基于感染性病毒的回收，VSV对三个中间基因重排显示相对耐受的鼓励，进行了进一步重排，改变核衣壳蛋白N基因的位置。N蛋白是在RNA复制中以化学剂量量支持新生基因组RNA衣壳包装必需的(Patton等，1984)。RNA复制依赖于N蛋白的稳定合成，抑制N蛋白合成导致复制终止。如果通过将N基因从其启动子近侧位点移开(从而降低N基因表达水平)，而降低N蛋白合成的水平，将导致基因组复制的水平下降。如此，通过从最靠近3’的位置(导致合成最大量的N mRNA)移开N基因，至随后的各中间位置，如图1所示，建立N2(PNMGL)、N3(PMNGL)和N4(PMGNL)，导致在cDNA水平改变VSV基因组。N1对应于野生型重排。还产生了第四和第五种变化，其中G基因从第二个移到最后，置于N基因前(图1)。这得到G1N2(GNPML)和G1N4(GPMNL)，其中G和N基因的位置交换。
N1-N4和G1N2和G1N4的cDNA如上所述转染入细胞，并分析其产生活病毒的能力。从N2、N3和G1N2中相当容易的回收病毒。即使用标准转染条件在37℃反复尝试也没有从N4和G1N4中回收到病毒。通过降低转染和随后传代的温度至31℃，回收到对应于N4和G1N4的病毒。
实施例14
具有N基因重排的病毒的RNA合成
将N基因沿基因组向下游移动对复制和N mRNA合成的水平具有显著效应(图11)。随着N基因在病毒N2、N3和N4依次远离启动子，N mRNA合成的水平从野生型水平显著降低(分别是野生型的36％、6％和3％；图11)。与此一致，用病毒N4观察到G mRNA量上升，其中G基因的位置比N基因离启动子近一个位置，而N基因代替它作为在基因顺序中的倒数第二个(图11)。N2、N3和N4的基因组RNA复制量相对于野生型下降(分别是50％、28％和4％；图11)，与N基因的表达下降一致，如N蛋白的合成限制复制所预测的。总的转录水平随着N基因向启动子远端移动下降，可能是由于基因组模板数量减少的二次效应。
实施例15
具有N基因重排的病毒的蛋白质合成
在被重排的病毒感染的细胞中表达全部5个VSV蛋白，它们全部与野生型病毒的蛋白一起共迁移。然而，N蛋白合成随着其基因从3’位置移开下降。图12中表示的数据显示了蛋白质的摩尔量如何随着其在野生型病毒N1中离3’末端的距离而下降。当N基因转位时，图12的数据显示N蛋白相对于磷蛋白P的摩尔比随着N基因在基因顺序中从第一个移到第二个、第三个或第四个而下降。这些结果确定了从先前VSV中基因表达的分析和转录的依次性质的预测。另外，这些数据直接证明基因的位置确定其表达水平。在分离的成熟N1-N4病毒颗粒中检测蛋白质水平显示，蛋白质在成熟病毒颗粒中的相对摩尔比仍然是基本与野生型病毒相同的。然而，从N2-4感染产生的病毒较少，对应于基因组RNA复制的水平下降。
实施例16
N基因重排的病毒复制能力
具有N基因重排的病毒的复制随着N基因从其正常启动子近侧位置向下游移动而越来越差。用单步生长曲线分析了生长能力。N2和G1N2的病毒产率在37℃约下降了15倍；与野生型病毒的复制能力相比，N3下降了50倍而N4下降了20,000倍(图13)。31℃病毒生长的比较显示相似的逐渐下降，然而效果比37℃较不明显，而且总的说，该温度更适合生长(图13，内部)。在31℃，N4复制与野生型相比约下降了100倍。每种病毒在31℃和37℃的PFU/细胞的裂解大小，显示了随着N基因沿着基因组下游移动到各连续的位置，产率/细胞以分步方式下降(图13)。病毒的相对蚀斑大小也改变；N4的蚀斑与野生型相比(在感染后42小时直径小于0.5mm，与3mm相比)。这些数据表明虽然N2、N3、N4的基因是野生型的，基因的重排和随后改变蛋白质摩尔比，使得病毒复制过程的一些步骤变得特别对温度敏感。
实施例17
N基因重排的病毒的致死率
以详细描述了野生型、温度敏感性或蚀斑大小变体病毒颅内或鼻内接种，VSV在小鼠中的生长、神经病变和对脑炎的敏感性(Sabin和Olitsky，1937；Shechmeister等，1967；Wagner，1974；Younger和Wertz，1968)。检测了病毒N2、N3和N4对于小鼠的致死率，与野生型病毒N1同时比较颅内和鼻内接种途径。各途径的致死剂量(LD50)所需的病毒量如表3所示。通过颅内接种，各病毒的LD50剂量是1-5pfu，虽然死亡的平均时间比N4病毒长两倍。这些数据显示当直接注射入脑时，避免了主要的宿主防御，重排病毒最终可导致致命脑炎。
相反，鼻内接种显示致死剂量所需的病毒量显著不同(表3)。虽然野生型病毒通过IN施用的LD50剂量是约10pfu，N2、N3和N4病毒值逐渐增大。与野生型相比N2需要高20倍的病毒，N3是500倍，而N4需要3000倍的病毒，即对于LD50需要30,000PFU。出现疾病(皱状皮毛、嗜睡、后肢瘫痪)的时间和死亡的程度与野生型相比，在被病毒N2、N3、N4感染后逐渐增加(图14)，死亡率的程度随着剂量增加(表3)。这些数据显示当通过周围途径施用时，细胞培养中观察到的病毒复制的逐渐下降与小鼠中死亡率的下降有关。
表3
小鼠LD50数据的野生型或重排VSV病毒的致死率*
  pfu/小鼠(死亡的平均天数)
  颅内接种  鼻内接种
N1 NPMGL(WT)   1(3-6)  11(5-10)
N2 PNMGL   5(3-7)  250#(9-12)
N3 PMNGL   5(3-8)  5,400#(7-9)
N4 PMGNL   1(4-11)  30,000(10-12)
*从用5个系列10倍稀释的病毒IC或IN接种的5-7只小鼠组的死亡率计算对于各接种途径的LD50。显示了来自单个内部对照实验的数据；对于每个施用途径重复实验是相似的。
#该病毒的死亡率数据得到钟形死亡曲线；从曲线最低部分计算LD50剂量。在括号中显示了死亡的天数。
实施例18
具有N基因重排的病毒抵抗野生型攻击的能力
IC接种所有病毒是致命的观察结果表明甚至最减毒的病毒能在小鼠中复制。这与鼻内施用后观察到减毒的结果联系，提出了减毒的病毒也能引起保护性免疫应答的可能性。为了测试该可能性，通过IN接种系列10倍稀释的野生型N1或变体病毒N2、N3或N4免疫小鼠。存活的动物在14天后通过IN接种1.3□106PFU的野生型病毒攻击。在攻击中存活的动物百分数是免疫剂量的函数，与先前的研究一致(Wagner，1974)。对于病毒N2、N3和N4，300PFU/小鼠是得到100％存活的最低剂量30PFU得到80-90％存活率；3-6PFU得到45-85％存活率；低于3-6PFU/小鼠的剂量得到与年龄相当的未免疫对照的不显著差异的存活率(图15，系列A中的虚线)。对于野生型病毒，致死剂量和保护剂量是相似的，但是总的说，保护了在3-6PFU病毒施用中存活的80-85％动物。
在第14天攻击前测量血清抗体显示，尽管小鼠中毒性弱化，用病毒N2、N3和N4免疫的动物血清中存在的中和性抗体水平高于在3-6PFU的野生型病毒接种后存活的动物中观察到的抗体，并且通常以剂量依赖型方式增加(图15B)。野生型病毒的致死率不能直接比较更高剂量的抗体滴度，但是在用病毒N1-N4接种，然后用1□106PFU的野生型病毒攻击的动物中中和性抗体滴度的范围是从1∶625-1∶3125。这些数据显示尽管它们在动物中的复制和致死率已经下降，N重排的病毒引起的保护性应答与野生型病毒相比，毫不减弱。
实施例19
组织基因以开发最佳疫苗病毒
本发明说明了单链负义病毒中的基因顺序确定基因表达的水平。另外，这些数据显示，将重要的核衣壳(N)基因从其正常3’启动子近侧位置移开，提供了一种依次产生更减毒的病毒的方法。减毒的最大水平发生于N基因被置于基因顺序的倒数第二个时。表达的最高水平发生在最靠3’的基因。因此，在构建经过减毒、并表达与保护有关的高水平抗原的疫苗载体中，理想的重排是N4(3’-PMGNL-5’)或G1N2(3’-GNPML-5’)或G1N4(3’-GPMNL-5)的组合。在这些构建物中，N4被最大程度的减毒，G1N2得到最高水平的免疫应答重要的结合糖蛋白。基于该条件，G1N4(3’-GPMNL-5’)应该是最大程度被减毒并产生最高水平的G蛋白。
实施例20
能表达额外的外源基因，从而用位置调节外源基因的水平的疫苗载体
VSV基因组可以容纳并表达额外的外源基因，如果插入基因间区，和如果保留保守的基因起始、基因末端和基因间区(图16)(Schen11等，1996)。另外，插入VSV基因组中的外源基因的表达水平可通过基因插入基因组的位置控制。在VSV基因组的全长cDNA中的每个连续的基因连接中，以保留保守基因间序列的方式插入被保守VSV基因起始和基因末端序列包围的噬菌体PhiX174基因组的660核苷酸序列。这些构建体的基因顺序分别是：NIP(3’-NIPMGL-5’)、PIM(3’-NPIMGL-5’)、MIG(3’-NPMIGL-5’)或GIL(3’-NPMGIL-5’)，其中I代表插入(I)的外源基因。从上述各cDNA通过上述转染回收病毒。
用在基因组的各个位置插入具有外源基因序列的病毒感染BHK-21细胞，并用[3H]-尿苷在放线菌素D存在下代谢标记，分析RNA合成。从所有回收的病毒中表达了VSV基因组RNA和5个VSV特异性mRNA(图16)。另外，在全部4种情况下，还观察到从插入的外源基因物质预期大小的mRNA合成。外源基因的表达水平随着其插入的位置离基因组3’末端的距离而变化。最高的表达水平来自NIP，然后是PIM、MIG和GIL(图16)。因此，这些数据显示外源基因可插入VSV基因组，如果保守的VSV基因起始和终止信号包围外源基因，将表达外源基因。最重要的是，该数据显示外源基因的表达水平受到插入基因组的基因的位置控制。
分析各表达外源基因的病毒的生长潜力，显示插入的外源基因的位置确定是否对病毒生长有效果。NIP的病毒产率与野生型相比减少了10倍，而PIM、MIG和GIL都以与野生型病毒相等的水平复制。因此，这些数据显示可以插入外源基因，而对病毒不是致命的，而且根据插入的位置可减弱复制。
实施例21
血清抗体水平和中和滴度的测定
病毒接种后，在2-4只动物组中以每周间隔收集血液。合并血清并在57℃加热40分钟，灭活补体。用VSV野生型(N1G4)感染细胞单层，并用去污剂缓冲液(1％NP40，0.4％脱氧胆酸钠、66mM EDTA、10mM Tris-HCl pH7.4)裂解未感染的BHK-21细胞，并在直接酶联免疫吸附分析(ELISA)中作为抗原。系列稀释样品，用与辣根过氧化物酶偶联的山羊α小鼠Ig检测。在450nm阅读光密度(OD)，并通过线性回归分析光密度对血清稀释度图计算抗体滴度。推测终点滴度(log10)的OD是预免疫样品的1.5倍。在攻击日，用标准蚀斑减少试验，在Vero76细胞上确定血清中和性抗体滴度，该滴度表示成得到50％中和的稀释度的倒数。
实施例22
野生型攻击的小鼠的保护
用1-10,000蚀斑形成单位(PFU)的各病毒在DMEM中的剂量鼻内免疫小鼠。用5.4□106PFU的N1G4野生型病毒鼻内攻击接受各变体病毒非致死剂量的接种21天后的小鼠组。监测攻击动物和对照另21天。在每周的间隔尾部放血收集血液用于血清抗体滴定。
实施例23
具有重排A和G基因的病毒的产生和回收
在本研究中，产生了cDNA克隆，其中G基因从其正常在基因顺序中的第四位移动到了第一位，最靠近启动子的位置，以增加其表达。产生了两种新的基因重排：一种是其中G基因移动到基因顺序的第一位，而剩下的四个基因不动，产生顺序3’-GNPML-5’(G1N2)，第二种是其中G和N基因的位置交换，产生顺序3’-GPMNL-5’(G1N4)(图17)。这些cDNA转染入细胞，同时回收病毒。回收的病毒分别根据N和G基因在重排的基因顺序中的位置，称为G1N2和G1N4。检测这些病毒的性质，与用于重新产生野生型基因顺序(N1G4)的相同基因重排方法建立的衍生自cDNA克隆的病毒，和具有基因顺序3’-P-M-G-N-L-5’(G3N4)的病毒比较。
实施例24
基因重排对在具有重排的N和G基因的病毒中病毒蛋白表达的作用
用具有重排基因组的病毒感染BHK-21细胞，并用[35S]甲硫氨酸在感染5小时后标记1小时，检测病毒蛋白质合成的相对水平。总细胞蛋白用SDS-PAGE分辨，通过放射性自显影显像。典型的凝胶如图18A所示。用野生型VSV感染，重排的变体导致宿主蛋白合成迅速抑制，可以直接检测病毒N、P、M、G和L蛋白。G蛋白的合成相对于其它的病毒蛋白在被G1N2和G1N4病毒感染的细胞中，与野生型(N1G4)感染的细胞中的比率相比(图18，泳道1)，显著增加(图18，泳道2和4)。
用磷光显影定量蛋白质。1小时标记期内，合成的G蛋白的摩尔百分数在G1N2感染的细胞中比野生型病毒感染的细胞中高2.3倍，G1N4感染的细胞高1.7倍。类似的，在病毒G1N2、G3N4和G1N4中N基因从其启动子近侧位置转位到更远的位置，降低了N蛋白合成的比率(图18C)。由于合成的相对比例中的这些改变，病毒蛋白的摩尔比在被不同病毒感染的细胞中是不同的，特别是已知对于最佳RNA复制关键的N∶P的比例(Pattnaik和Wertz，1990)(图18C)。
还检测了纯化的病毒颗粒的蛋白质含量，来测定细胞中蛋白质合成的改变是否影响蛋白质装配成病毒颗粒。BHK-21细胞被各种病毒感染，用[35S]甲硫氨酸标记过夜，从上清液收集病毒颗粒，并离心通过10％蔗糖从细胞碎片中分离。用SDS-PAGE分析病毒颗粒蛋白(图18B)显示相对蛋白含量没有明显的差异。磷光显影仪定量确定了尽管蛋白质在感染细胞中的相对水平改变，病毒颗粒中的蛋白质量与野生型病毒是相似的，除了病毒G1N2，其中G的水平比野生型或其它重排的病毒高1.6倍(图18D)。
实施例25
具有重排的N和G基因的病毒复制
在以3MOI感染，然后在37℃培养的培养的BHK-21细胞中检测在一步生长条件下复制重排的病毒。在不同时间收集上清液，用蚀斑试验测定得到的病毒产率。N基因从启动子近侧位置转位离开导致复制随着基因离第一的位置越来越远分步下降。N移到第二个位置(G1N2)使复制下降3倍，而N移到第四个位置(G3N4)使复制下降了多达1,000倍(图19)。然而，在第四个位置具有N的两种病毒(G3N4和G1N4)的复制水平在单步生长条件下非常不同，可能是由于G1N4中对于最佳复制关键的N∶P摩尔比的改变的干扰比G3N4中小。在感染后5小时测定蛋白质合成的胞内比，显示被G1N4(3’-GPMNL-5’)感染的细胞中N∶P的摩尔比为1∶1.6，而G3N4(3’-PMGNL-5’)感染的细胞中N∶P比是1∶1.8(图18C)。1∶0.5和1∶1之间的N∶P摩尔比对于复制是最佳的，如野生型感染的细胞(N1G4)中的1∶0.7和G1N2感染的细胞中的1∶0.8所示。野生型病毒和G1N2都有N后面直接跟P的基因顺序(图17)。太高或太低的P∶N都导致复制显著下降；因此在被病毒G3N4感染的细胞中不仅是N限制性的而且N∶P的摩尔比比最佳值高两倍。与野生型和G1N2比较显示G3N4和G1N4的复制动力学。与N1G4和G1N2的12小时相比，G3N4和G1N4的单步生长直到感染后24小时仍未完成。似乎不是感染细胞中G的过量引起了复制延迟，因为G1N2相对于野生型病毒不显示复制延迟。
实施例26
具有重排的N和G基因的病毒的致死率
幼小鼠提供了研究VSV及其突变株导致的神经病变的敏感动物模型(Sabin和Olitsky，1938；Wagner，1974)，并用野生型VSV通过鼻内途径接种小鼠，导致致命的脑炎。在鼻内接种3-4周龄Swiss-Webster小鼠后，重排变体病毒的发病机制与野生型病毒的比较。表4显示了构成各病毒LD50的剂量。
表4
具有重排基因顺序的病毒对于小鼠的LD50剂量
 病毒 pfu
 N1G4(wt) 100
 G1N2  50
 G3N4 ＞100,000
 G1N4  19,000
*用系列10倍稀释的重排病毒鼻内接种每组6只小鼠，从观察到的死亡率计算LD50值。用Vero-76细胞上的蚀斑试验确定病毒滴度。显示了来自一个单一的内部控制实验的数据。
全部病毒对于小鼠是致命的，如果以足够高的剂量施用，虽然这些实验中施用的G3N4剂量未达到先前见到的LD50。一般N基因的位置、N∶P比和得到的病毒复制水平是致死的主要决定因素。N基因从启动子移开的病毒更需要提高剂量来达到LD50。这些结果肯定了先前用病毒N1-N4的观察结果，其中N基因依次移动。然而，这里所示的结果显示，对于N在第四位的病毒(G3N4和G1N4)，其复制能力和LD50值还受到G基因位置的影响。
这里报道的Ld50值表达成Vero-76细胞上的病毒滴度，比在BSC-40细胞上的滴度高约10倍。改变细胞系，因为重排VSV的基因顺序可能影响各种病毒与干扰素系统的相互作用。BSC-40细胞能在感染后产生干扰素，而Vero细胞不能。因此换成Vero细胞后避免了干扰素诱导或灵敏度的可能差异。
疾病的第一症状(驼背和后肢瘫痪)出现在N1G4和G1N2病毒接种后5天，虽然N1G4接种的第一例死亡出现要早(图20)。N在第四位的病毒诱导症状更缓慢，剂量为1,000PFU/小鼠，G3N4如前观察到的，不诱导发病或死亡。在尝试检测疾病的亚临床表征中，小鼠组在研究期内每天称重(图21)。然而，虽然显示症状的小鼠都体重下降并死亡，那些不显示症状的小鼠不显示与未接种的对照小鼠有重量差异(图21)。在用野生型病毒攻击接种的小鼠后观察到类似的结果：所有产生症状的动物都随后死亡，而那些不产生症状的动物也不显示体重下降。
实施例27
用含有重排的N和G基因的病毒接种的小鼠中的血清抗体
为了评估用具有重排G基因的病毒接种对体液免疫应答的效果，用系列10倍稀释的各变体病毒鼻内接种小鼠。每周通过尾部取血收集血液，用ELISA确定血清抗体水平。由于接种的存活对于该实验是先决条件，仅使用等于或低于LD50的剂量。G基因的转位改变了抗体应答的动力学和数量级(图22)。用野生型病毒接种的小鼠在21天内产生勉强可检测水平的抗体，而接受100PFU G1N2的动物在14天内产生显著的滴度，接种G1N4的在接种后7天具有显著的滴度。该加速和增强的应答通过与接受100PFU的小鼠比较更加清楚(图22)。该结果证明G基因从第四位转位到第一位增强了对VSV的体液免疫应答。接受G1N4的小鼠合成抗体比接受G3N4的更早，水平更高。这进一步肯定了将G基因置于基因顺序的第一位增加了VSV的免疫原性的观察。
接种后21天，用5.4□106PFU的野生型VSV攻击小鼠。在接受N1G4或G1N2的动物中观察到抗体滴度的迅速增加，虽然对于在攻击用G3N4或G1N4接种的小鼠之前已经具有的高滴度没有进一步提高。
实施例28
用含重排的N和G基因的病毒接种后的中和性抗体滴度
测量攻击时间的血清中的中和性抗体水平。在小鼠和牛中，中和性抗体是抵抗VSV感染的重要元素。在攻击日，小鼠放血并在Vero-76细胞上的标准蚀斑减少试验中，测试血清样品中和野生型VSV的能力。计算得到50％噬斑数减少的最高稀释度的倒数，确定血清的中和性滴度。
所有具有重排基因组的病毒在小鼠中引起血清中和性抗体(图23A)。在1或10pfu/小鼠的N1G4或G1N2剂量处未检测到中和性抗体，但两种病毒在100pfu的剂量都引起可检测的滴度，对G1N2的应答比野生型的高10倍。因此对于N1G4和G1N2，中和性抗体水平与病毒复制在细胞培养物中无关，而野生型病毒复制比G1N2丰富2-3倍(图19)。G3N4和G1N4的应答进一步巩固了该结论，其中引起比野生型病毒高约10倍的滴度，尽管复制能力大大下降。
总的说，具有过度表达的G和表达不足的N的病毒在感染细胞中得到在鼻内接种后与野生型病毒(N1G4)相比提高的中和性抗体水平。过度表达的G和表达不足的N的组合将该增强的免疫原性与病毒减毒联系起来，使得可使用更高剂量，相应引起更高的中和性抗体滴度。另外，由于这些病毒的致死率较低，可施用100倍多的病毒，而不导致损害，在这些条件下它们引起比野生型病毒应答可获得的多100倍的中和性抗体。
实施例29
保护小鼠抵抗野生型病毒攻击
这些结果建立了病毒的非致病性剂量，即过度表达的G蛋白可在小鼠中引起显著的体液免疫应答。为了观察用重排的病毒免疫是否赋予针对VSV疾病的保护，用各种重排的病毒接种动物，在21天后用5.4□106PFU的野生型病毒攻击存活的动物。该剂量足够杀死83％未接种的年龄相当的动物对照组。
全部具有重排基因组的病毒赋予保护，其水平随着接种的剂量变化(图23B)。N1G4和G1N2的引起的保护水平是相似的，反映了先前描述的这些病毒的复制和死亡率的可比较水平(图19和表4)。类似的，G1N4赋予的保护与G3N4相似。在接种后21天，两种病毒在1,000PFU/小鼠的剂量引起强大的免疫力。重要的是这些完全保护剂量比对应的LD50值小20-100倍。这强调了基因重排是有效的系统性改变VSV表型的方法，以优化活减毒疫苗所需的性质的结论。
讨论
本发明证明了负链RNA病毒的基因顺序确定了基因表达的水平。基因顺序可以被重排，重排病毒基因的表达水平反映了它们相对于转录的3’启动子的位置。通过重排对于复制重要的基因，例如N(核衣壳)基因，向病毒基因组下游的位置移动，可以一步步影响细胞培养物中的生长能力和病毒对于小鼠的致死率。依次，这些数据证明了一步步减弱这些病毒毒性的方法。减毒病毒例如N4(3’-PMGNL-5’)的致死剂量和保护性剂量差1000倍以上，是减毒的候选疫苗理想的性质。
另外，本发明证明了可以将外源基因插入负链病毒的基因组，并回收表达外源基因的感染性病毒。外源基因的表达水平可受到在基因组中相对于3’末端的基因插入位置的控制。这些病毒接受外源物质的能力最可能是由于它们具有螺旋核糖核衣壳，例如核衣壳和病毒随着基因组大小增加变得更大。对于可插入的外源物质的量没有限制。
本发明的方法可用于开发疫苗的减毒病毒，这些方法可用于单链负义病毒家族的所有成员，基于该家族成员基因组组织和基因表达控制机制的密切相似性。单链负义病毒目包括弹状病毒，例如狂犬病病毒，副粘病毒，例如麻疹病毒、副流感病毒和呼吸道合胞病毒，和丝状病毒例如埃博拉和马尔堡病毒。
从单链负义病毒目的cDNA克隆回收感染性病毒，导致实验性操纵病毒基因组。这些病毒中的基因表达在转录水平受到相对于病毒基因组3’末端的启动子的基因顺序的控制。开发了一种重排基因顺序，而不在基因组中引入其它改变的方法。如预测的，基因重排改变病毒蛋白质合成的相对水平，并产生具有各种不同表型的感染性病毒。本研究检测了将编码病毒主要中和性表位的G蛋白基因，从其启动子远端位置移动到基因顺序中第一个的后果。当其基因从第四位移动到第一位时，G蛋白在感染的细胞中的表达显著提高。然而，纯化的病毒颗粒的蛋白含量几乎不受病毒基因顺序改变的影响。
这些病毒对G蛋白的过度表达能够检测它们是否在动物中引起体液免疫应答的改变。图22的数据显示了在100pfu的接种剂量，在被G移动到启动子近侧位置的病毒感染的动物中，与野生型病毒比较，产生抗体更迅速，水平更高。对于N1G4野生型和G1N2病毒未测试高于100PFU的剂量，因为它们致死。当在100pfu的剂量比较时，病毒G1N2、G3N4和G1N4都比野生型病毒更迅速的引起更高的抗体滴度。G1N4和G3N4病毒的下降的致死率允许施用更高的剂量，并在这些情况下抗体水平比较低的剂量增加的更迅速。
所有三种G移动到启动子近侧位置的病毒在小鼠中引起增强的体液免疫应答，对于理解该系统的保护性免疫有暗示。虽然不知道对于诱导免疫应答最相关的在细胞中变体接种物的复制的相对水平，似乎它们与在细胞培养物中所见的复制相对水平至少在质量上相同。如果是这样，G1N2、G3N4和G1N4仅在第一轮复制中在每只接种的小鼠中表达更高水平的G蛋白。然后，野生型病毒的更强复制可补偿其较弱的G蛋白合成。但是在相同的100PFU/小鼠的接种剂量，变体病毒与野生型接种的动物相比引起更强和更快的体液免疫应答。值得注意的是G蛋白合成在感染细胞中比率的稍微提高应对免疫应答产生显著的效果，即使面对病毒复制显著弱化。
这些结果提示体液免疫应答的动力学和数量级在感染中很早就已建立。在免疫应答规模确定不可变更时，存在短的临时上下限(window)，或对VSV感染的免疫应答是某种程度上由每个感染的细胞的G蛋白合成水平，而不是聚集的免疫原性负荷确定的。通过用重组的canarypox载体的疫苗在不能复制的条件下的效力提出了类似的结论。用高度弱化的载体强烈合成抗原，似乎是确保进一步利用的有效疫苗策略。
N基因的位置和N蛋白表达的水平与复制效率有关，因为N蛋白是以化学计量量由基因组RNA复制必需的。野生型病毒N1G4复制到达最高的滴度，然后是病毒G1N2和病毒G1N4和G3N4，它们复制的较差。然而病毒G1N4显著复制比病毒G3N4好，虽然它们都在第四位具有N基因。这两种病毒都显示复制动力学延迟，如可能预计的如果子代病毒的形成受到N蛋白供应的限制。
已知N和P蛋白的相对水平和N蛋白的绝对数量对有效复制是关键的。P蛋白的一个功能是将N蛋白维持在可溶性状态，从而使其能够支持新复制的RNA的衣壳包装。与此一致的是，病毒G1N2，虽然N蛋白表达减少(图18A和18C)，也具有与野生型病毒N1G4相同的N和P基因相对顺序(图17)。因此，G1N2与野生型以相似的相对比例表达N和P蛋白，分别是1∶0.8和1∶0.7。与此一致，病毒G1N2的复制仅比野生型病毒稍低。更进一步，虽然病毒G1N4和G3N4都在第四位具有N，G1N4的复制比G3N4高得多(图19)。N和P蛋白合成比率在这两种病毒中都与野生型无法相比。然而在具有第一位的P的病毒G3N4在感染细胞中具有1∶1.8的N∶P比，而被G1N4(P在第二位)感染的细胞中N∶P比是1∶1.6，与野生型病毒更接近。这两种病毒在G蛋白表达率之间也有差异，可能G蛋白水平提高对病毒G1N4提供了复制上的优势。
具有基因重排的病毒的致死率减少还与复制能力的下降有关。复制下降又与上面讨论的N蛋白的总表达水平和N∶P比有关。明显任何使G基因置于第一位的基因重排将把N基因从其野生型位置移开从而降低N蛋白的表达。还改变了蛋白质的摩尔比，其彼此相对的基因位置被所讨论的重排改变。预计两种类型的改变都改变复制效率和致死率。表4的数据显示复制最好的病毒野生型和G1N2，仅需要50-100PFU来达到LD50剂量，而G1N4和G3N4分别需要200-1000倍来达到致死剂量。
此处显示的数据显示基因的重排能操纵病毒表型的两个重要方面：致死率和中和性抗体的刺激。通过减少N蛋白表达和改变N∶P比，可以降低复制能力和对于动物的致死率；通过提高G蛋白表达可以改变抗体合成的动力学和水平。
这些结果显示可用基因重排产生具有新颖有益表型的病毒。该方法提供了一步步改变表型，实现所需的减毒水平，或改变特定基因的表达的方法。减毒和免疫原性水平可以分别和系统性调节，恰是产生和操纵活减毒候选疫苗所需的。该方法应该可用于其它单链负义病毒目的成员，它们都具有相同的基因表达控制机制，即通过从一个3’启动子开始被动顺序转录。另外，未发现单链负义病毒目的病毒经历同源重组，因此对基因顺序的改变应该不能由天然过程逆转。从VSV表达了几个外源基因，在一个研究中，保护小鼠抵抗相应的病原体。VSV的这些性质使它成为卓越的候选物，其中产生针对VSV本身或针对其它病原体的未来疫苗。设计用于在天然宿主中评估G1N2、G3N4和G1N4病毒的发病机制和免疫原性的研究正在进行。
实施例30
在水疱性口炎病毒(VSV)中重排基因消除了天然宿主中的临床疾病
开发亚单位或DNA介导的VSV疫苗的尝试获得有限的成功。仅在紧急条件下尝试用活的野外病毒株免疫。然而对于VSV还未使用活的减毒疫苗，尽管有针对另一种弹状病毒，狂犬病病毒的活减毒疫苗的成功和使用。目前没有针对VSV感染的满意的疫苗。
在下列实施例中检测了重排VSV基因在VSV的三种天然宿主之一，猪中对于病毒复制、致病、引起保护性免疫应答的作用。结果显示将核衣壳蛋白基因从单转录启动子移开弱化并最终消除了病毒导致疾病的能力。将该改变和重新定位表面糖蛋白基因结合，得到抵抗野生型VSV攻击的疫苗。通过增加操纵病毒的性质，基因重排提供了一种产生针对该类病毒的活减毒疫苗的新方法。
从当地饲养场获得的20只雌性Yorkshire猪(8-10周龄，25-30kg)随机分成5组，每组4只，各组置于生物安全水平3(BL-3)分离条件下的Plum Island动物疾病中心的分隔房间内。所有动物基于血清中和抗体试验是VSV阴性的。每天监测动物的体温和行为，如下每隔一段时间通过个人在进入各分离室之前换穿防护服和使用便携式HEPA呼吸器收集病毒分离的样品和抗体滴度。
具有重排的基因组的病毒3’G-N-P-M-L-5’(G1N2)、3’P-M G-N-L-5’(G3N4)和3’-G-P-M-N-L-5’(G1N4)衍生自上述VSV-IN的感染性cDNA克隆。从37℃转染的细胞回收到病毒N1G4(WT)和G1N2；仅从31℃转染的细胞回收到病毒G3N4和G1N4。如前报道的，N基因离开启动子的病毒复制不同程度上根据基因的顺序是温度敏感性的。在各温度下进行这些病毒在细胞培养物中的所有随后研究，除非另外说明。
用双头皮肤测试涂药器(Duotip-Test；Lincoln Diagnostics，Decatur，Ill.)戳刺用赛拉嗪-开他敏-telazol增进的动物喙表皮20次，将2.5□107PFU病毒的100微升Dulbecco改良Eagles培养液(DMEM)置于划破的区域上。然后重新进行划破步骤重新敏化接种物，将动物维持在静止位置直到接种物进入位点。对照动物以相同方式处理，仅用100微升DMEM。接种程序后，病毒制备物都在原始滴度的4倍之内。在病毒接种前后，在不同的时间用改良的咽或食管刮具获得食管-咽液(OPF)。在病毒接种前后的不同时间收集鼻拭子和血清样品。也取得出现的任何病变的拭样并测试病毒分离。将拭样和OPF样品收集到含抗生素的DMEM中。
在初次接种36天后，用4.2□107PFU/动物的N1G4通过划伤喙表皮攻击猪并如上所述接种。每天监测动物的体温和行为，如上所述收集OPF、鼻和血清样品。
离心充分澄清样品后，通过接种入96孔板中BHK-21细胞单层上，分析鼻部拭样和OPF和病变拭样的病毒存在。系列稀释上清液，并一式四份加到孔中。接受N1G4和G1N2的动物的样品在37℃培养3天，而来自G1N4和G3N4的样品在31℃培养4天。
收集血清并在56℃热灭活30分钟。血清的两倍系列稀释液以N1G4的50％组织培养物感染剂量/ml37℃培养1小时。将样品一式四份加到96孔板的BHK-21细胞上，37℃培养3天，用10％甲醛固定并用结晶紫染色。记录导致野生型N1G4VSV100％CPE抑制的稀释度的倒数。
收集细胞病变效果阳性的培养孔，并用VSV-特异性引物通过RT-PCR肯定病毒分离物的身份。VSV引物设计成它们能够分辨重排的病毒基因组。根据其基因靶标(N、P、M、G或L)、核苷酸位置和正负链，即正向(f)或反向(r)命名的引物对于野生型顺序是N-1314f/P-1956r和M-2844f/G-3198r，G1N2是G-4284f/N-121r和M-2844f/L4925r，G3N4是G-4284f/N-121r和N-1314f/L-4955r，和G1N4是G4284f/P-1956r。
通过使用临床评分系统(基于得到的病变的大小和位置)评估病变形成，来评价不同病毒接种导致的疾病程度。评分0表示没有可见的病变；评分1表示接种位置存在病变，但直径小于2cm；评分2表示接种位置病变直径大于2cm或多个病变；评分3表示在非接种位置小于2cm的病变；评分4表示在非接种位置病变直径大于2cm或多个病变。大于4的评分将从发生在一只动物上的多类一个或多个病变累积。
实施例31
工程改造的病毒对猪的发病机制
N基因在基因顺序中从第一移到第二或第四，G基因在基因顺序中从第四移到第一或第三的病毒，如图24所示的发病机制与具有野生型基因顺序的病毒在猪，一种VSV天然宿主中的比较。通过用2.5□107PFU/动物的下列病毒之一划伤喙，皮下接种一组4只的Yorkshire幼猪：N1G4(WT)、G1N2、G3N4或G1N4。第五组单独用培养基接种，并维持作为模拟感染对照。各组置于BL-3条件下的单独的隔离室内，每天监视VSV感染的口角病变的特征和直肠温度。
接种后第二天，在所有接受野生型N1G4病毒的动物的接种区域产生小于2cm直径的小泡。然后N1G4接种的动物的病变在接种后3和4天增大到直径大于2cm，并产生多个病变。图24A显示了接种后3天喙上出现的这些病变的例子。图25总结了4种不同病毒之一接种的各猪随时间的临床评分。临床分数由大小、数量和上述得到的病变的分布确定。在4只N1G4接种的猪中3只的病变保持位于喙(图24A和25A)。然而，一只N1G4接种的猪在其蹄上产生了一个小泡，另一个在舌头上产生了小泡，将其临床评分提高到了6(图25A)。一般这些病变的大小、分布和严重程度不能和由VSV-IN的野生型分离物导致的病变区分开来。注意到从我们的cDNA克隆回收，并用于这些研究的N1G4野生型VSV-IN产生了与VSV-IN野生型分离物相等的临床疾病，尽管事实是重组病毒在细胞培养物中从回收开始已增殖了许多次，并没有在动物中传代过。
用G1N2病毒接种导致在第2天，在所有的猪的接种位点形成小泡(＜2cm)(图24B和25B)。然而与野生型N1G4病毒导致的病例相反，存在于G1N2接种的猪身上的小泡不随时间变大，也不产生多个病变。另外，G1N2接种的动物的病变仅限于接种位点。对于N1G4和G1N2接种的动物，病变都从第2天开始。在用N1G4野生型病毒接种的动物中直到第9天也可见病变，然后感染组织开始明显治愈。相反，G1N2感染的动物中产生的病变在第6天完全治愈。总的说，G1N2感染的临床表现比野生型病毒导致的轻得多，表明G1N2病毒部分减毒。
与野生型或G1N2-接种动物观察到的结果相反，在接受G3N4或G1N4(图24和25，C和D)的动物中未观察到小泡，表明这些病毒是高度减毒的。在任何动物中每天观察的直肠温度没有改变(数据未显示)。这与先前皮下接种野生型VSV分离物，很少导致发烧的结果一致。单独接受DMEM的模拟接种的动物不显示对接种程序的不良反应(数据未显示)。
总的说，在第一位具有N的野生型病毒N1G4导致与VSV Indiana野生分离物中所见的相似的疾病，而在第二位具有N的G1N2导致减弱的临床症状。N在第四位的病毒G1N4和G3N4不导致可检测的疾病。合起来，这些结果表明N基因转移到离开启动子的后随位置导致临床疾病一步步减弱。
实施例32
接种猪后的病毒分离
为了检测病毒在施用后复制的能力，对于病毒如上所述测试了作为感染的可靠指标的鼻部拭样和OPF。感染后1-6天从所有接受N1G4(WT)的动物的鼻部拭样和OPF样品回收病毒(图26)。从所有接受G1N2的动物，并在感染后第一天起回收病毒。然而，除了第7天的一个样品，G1N2病毒通常在5天后不分离。除了鼻部和OPF样品，在所有施用N1G4的动物中，在接种区域6天时收集的拭子鉴定出病毒。这与给予G1N2的组相反，后者没有从一只动物的喙分离到病毒；并且在剩余动物3-4天后的喙上没有检测到病毒，再次提示该病毒的减毒表型。
没有从给予G3N4或G1N4的动物的OPF或鼻部样品中回收到病毒，尽管在相似的样品中可较简便的检测到N1G4和G1N2(图26)。另外，G3N4或G1N4也不能从喙的接种区域的拭样上回收(数据未显示)。这些数据表明这些病毒在猪中的复制被大大弱化。
为了测试从N1G4和G1N2感染的动物回收的病毒在体内传代后是否基因稳定，提取来自一套病毒阳性培养物的病毒RNA，用特异引物组通过RT-PCR扩增基因末端和基因间连接区。随着相对基因连接测序PCR产物。在基因顺序或基因末端序列或基因间连接中未观察到改变(数据未显示)，表明重排基因顺序在天然宿主中复制时是稳定的。
实施例33
用重排病毒接种的猪中的体液免疫应答
通过评估接种后不同时间存在于血清中的中和性抗体水平，测定了野生型和重排的病毒刺激体液免疫应答的能力。N1G4(WT)接种的动物血清中中和性抗体水平的范围在免疫后7天是2.5-4.0log10，平均滴度是2.9log10(图27A)。在4周的整个观察期维持这些中和性抗体水平。接受G1N2的动物具有相似的高滴度，第7天的平均滴度是2.9log10，在研究期内维持高滴度(图27B)。接受G3N4的动物显示中和性抗体滴度提高，达到2.0log10的平均值。该值虽然比N1G4或G1N2接种后所见的滴度低10倍，显示G3N4病毒能够在鼻拭样或OPF样品中不存在可检测水平的复制性病毒的情况下，以一次接种刺激体液应答(图27C)。
接受G1N4的动物显示滴度上升非常小，仅能与背景水平区分，这些滴度不随时间上升(图27D)。作为该弱应答的结果，该组中的动物在第28天重新用5.7□107PFU/只猪的G1N4接种。在这些动物中未检测到临床症状。7天后收集血清，在全部4只动物中观察到滴度迅速上升到3.3log10(图27D)。这些数据显示尽管我们不能在这些动物中检测到复制性病毒，提出这些动物能够在增强免疫7天后产生免疫应答，它的数量级与N1G4野生型病毒免疫7天后见到的相等或更大。
实施例34
具有重排基因顺序的病毒能保护天然宿主抵抗野生型病毒攻击
为了评估重排病毒的疫苗性能，用4.2□107PFU的野生型N1G4/猪在最初施用病毒后36天攻击全部病毒接种的动物和模拟接种的对照组，并在G1N4组第二次接种7天后攻击。攻击的途径与最初接种所用的相同，即通过划伤喙表皮。观察动物的临床症状并如上评分。另外，在攻击后的第一周每天收集鼻拭样和OPF样品，并检测病毒的存在。
攻击后，在任何来自被N1G4、G1N2或G1N4接种的组的动物中未观察到任何病变，表明这些动物受到了完全的保护抵抗临床疾病(图28A、B和D)。在给予G3N4的动物中获得了部分保护，在攻击后第2-4天在两只动物中可见病变。病变在一只动物中小(＜2cm)，在第二只中大于2。在两种情况下病变都仅存在于接种的位点，并在第5天被完全治愈(图28C)。
相反，在未免疫的对照组中所有动物在攻击后的第1和2天开始产生病变，并持续经过第5天(图28E)。最初病变小(＜2cm)，但它们在所有情况下都增大到超过2cm。在4只动物的3只中，病变存在于除了接种位点外的位点；在两种情况下，病变出现在舌头上，在另一个情况下病变出现在蹄的冠状带上。
从所有受攻击的未免疫对照动物中，从第1天直到第5天，从鼻拭样和OPF回收病毒，确认临床数据(图29)。从两只攻击后在喙上显示病变的G3N4-接种的动物鼻拭样在第1-3天回收到病毒；在G3N4-接种的攻击后没有病变的动物中未分离到病毒(图29)。为了确定从两只G3N4免疫的动物在攻击后回收到的病毒是N1G4攻击的病毒，或免疫G3N4基因型，从组织培养物样品中提取病毒RNA，并通过RT-PCR分析基因间连接，然后进行序列分析。对于两只动物，发现回收的病毒是N1G4攻击病毒(数据未显示)。
在攻击后第1天的一个时间点，取得没有临床症状的来自N1G4-免疫组的一只动物的鼻部拭样，培养其中的病毒(图29)。不可能知道回收的是输入攻击的病毒还是攻击病毒的复制物。
这些数据合起来显示临床症状的保护和中和性抗体滴度之间有强烈的关联。用G3N4免疫，在攻击后不显示疾病的两种动物在攻击前具有高抗体滴度(2.1和2.3log10)。
在攻击日和此后第3、5和7天分析所有动物的中和性抗体滴度。用N1G4免疫的动物滴度在攻击时已经很高，攻击后接近该水平并稍微增加(图30A)。原来用G1N2免疫的动物在攻击后5-7天滴度增加了约10倍，接近用N1G4所见的水平(图30B)。用G3N4免疫的动物，在攻击时具有最低的滴度(1.9log10)，显示滴度在攻击后3-5天之间增加了近100倍，达到与野生型所见的相等的滴度(图30C)。G1N4-免疫的动物在第28天具有低滴度，在攻击前7天接受第二次免疫，通过增强免疫维持高滴度，但在攻击后不再进一步上升(图30D)。
讨论
上述数据显示了将VSV的核衣壳基因依次移动到离启动子远端的位置，下调其表达，并导致天然宿主中临床疾病系统性和分步下降。这是能够增量操作负链RNA病毒导致的临床疾病的方法的首次报道。
明显的，从本文公开的cDNA克隆回收的VSV-IN在家猪中导致与用野生型分离物感染观察到的相当的临床疾病。这是首次用衍生自cDNA克隆的VSV在天然宿主中诱导临床疾病。另外，该cDNA克隆的基因重排，将N基因向启动子远端移动，到第二个位置(G1N2)，导致感染的猪中临床病变的程度下降(图24-25)。该病毒在猪中的复制还似乎轻微减弱，因为从喙、鼻和OPF拭样回收的病毒持续时间比N1G4病毒短(图26)。G1N2病毒还具有更靠近启动子的G基因。用G1N2病毒感染的猪的免疫应答几乎和野生型所见的相同。这些发现提示该病毒致病能力的减弱是由于N基因表达的减少，和复制能力的下降。G基因向前移动可能帮助补偿了减弱的复制能力，来帮助实现与野生型病毒接种后获得的相似的中和性抗体水平。
N基因离开启动子到达第四位的运动得到病毒G3N4和G1N4，它们在天然宿主中都不导致临床疾病。它们在猪中的复制能力还下降，因为接种后在喙、鼻或OPF样品中未检测到病毒。与此一致，对于这些病毒接种一次得到的免疫应答比N1G4或G1N2可见到的中和性抗体应答低(图27)。然而尽管猪中的复制能力显著下降，这些病毒仍然能诱导免疫应答。G3N4病毒显示在施用后抗体水平轻微上升。另外，在第36日用野生型病毒攻击后，G3N4动物迅速在5日后反应，抗体滴度上升了100倍。类似的，G1N4病毒在第一次接种后诱导低抗体滴度。然而当在第28日第二次增强接种G1N4后，产生迅速应答，与用野生型病毒最初施用后第7天见到的相比相等或更高(图27)。
用野生型病毒攻击后，在任何接受一次N1G4、G1N2或两次G1N4接种的动物中未观察到临床疾病。存在于这三组中的中和性抗体滴度在攻击日都高(图27)，相当于或高于通过各种途径用VSV野生分离物接种家猪报道的中和性抗体滴度。4只G3N4免疫的动物中的两只抵抗攻击。证明这些动物是在攻击前显示最高中和性抗体滴度的动物。这些数据显示中和性抗体滴度和抵抗临床疾病之间有强烈关联。报道了用表达VSV-G的重组痘病毒免疫牛获得的相似的发现。
另外，这些数据显示尽管其致病能力下降，G1N2病毒仅用一次接种可诱导与野生型病毒一样强的保护性免疫应答。在第四位具有N的病毒在天然宿主中完全减毒，显示在一次接种后较低的免疫应答。然而，再次用G1N4接种后诱导等于野生型病毒诱导的免疫应答。因此，这些数据显示可以通过基因重排减弱致病能力，但仍然维持可充分复制，在不存在临床疾病的情况下诱导保护性免疫应答的病毒。
由于水疱性口炎是一种强制性报告的疾病，任何活减毒疫苗不仅必需是安全有效的，而且必需与野生型病毒株可以区分，以获得在饲养动物中使用的许可。本文公开的数据显示，具有重排的基因组的病毒可轻易的与野生型病毒株通过基因间区的RT-PCR区分。另外，通过使用cDNA衍生的病毒，它可以在基因组中引入特异性改变，例如缺失特定的抗原性决定簇，这些决定簇可用于血清学测试，以区别接种的和天然感染的动物。总的说，上述数据显示基因重排提供了开发针对无节段负链RNA病毒的稳定减毒活疫苗的合理的另选方法。
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本说明书中提到的任何专利和出版物表明了本发明所涉及领域的技术人员的水平。这些专利和出版物在本文中以相同程度引入以供参考，如同各出版物具体和分别表明再次引入以供参考。
本领域技术人员不难理解本发明可很好的实现目的并获得提到的目标和优点，和本身固有的那些。本文中描述的例子和方法、过程、治疗、分子和/或特定的化合物代表了优选例，是示范性的，并不是要限制本发明的范围。对于本领域技术人员发生中的改变和其它用途，包含在权利要求定义的本发明的精神之内。
          序列表<提交申请时未提供><400>3acctgcacta acagcaatca tg                                        22<210>4<211>14<212>DNA<213>人工序列<220><221>引物<222>1，2，3，4，5<223>用于定位VSV P、M、G、N和L基因的BspM1位点末端的引物；n＝a或g或c或t<400>4nnnnnnnngc aggt                                                   14<210>5<211>11<212>DNA<213>人工序列<220><221>引物<222>1，2，3，4，5<223>用于定位VSV P、M、G、N和L基因的Bsa1位点末端的引物；n＝a或g或c或t<400>5nnnnngagac c                                                    11<210>6<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><221>引物<222>24，25，28，29，30<223>含有BspM1位点和VSV的P、M和G基因ACAG序列的上游引物；n＝a或g或c或t<400>6gggaagctta cctgcactaa cagnnatnnn                               30<210>7<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><221>引物<222>19，20，23，24，25<223>VSV顺反子间连接的引物；n＝a或g或c或t<400>7tatgaaaaaa actaacagnn atnnn                                     25<210>8<211>34<212>DNA<213>人工序列<220><221>引物<222>16，17<223>含有BspM1位点和VSV的P、M和G基因TGTC序列的下游引物；n＝a或g或c或t<400>8ctttttttga ttgtcnntac gtccagggcc cacg                             34<210>9<211>34<212>DNA<213>人工序列<220><221>引物<223>VSV P基因的下游引物<400>9gcacccggga cctgcatatc tgttactttt tttc                             34<210>10<211>34<212>DNA<213>人工序列<220><221>引物<223>VSV M基因的下游引物<400>10gcacccggga cctgcatctc tgttagtttt tttc                             34<210>11<211>34<212>DNA<213>人工序列<220><221>引物<223>VSV G基因的下游引物<400>11gcacccggga cctgcattgc tgttagtttt tttc                            34<210>12<211>34<212>DNA<213>人工序列<220><221>引物<223>VSV P、M和G基因的下游引物的共有序列<400>12gcacccggga cctgcatatc tgttagtttt tttc                          34<210>12<211>4<212>DNA<213>人工序列<220><223>VSV P、M、G、N基因内切核酸酶消化后剩余的粘性末端序列<400>13acag                                                          4<210>14<211>5<212>DNA<213>人工序列<220><223>VSV mRNA起始处的保守序列<400>14aacag                                                          5

Claims (37)

1.一种提高单链负义病毒目的病毒启动子远端基因表达的方法，其特征在于，该方法包括步骤：
通过将所述启动子远端基因向野生型3′启动子近侧位点移动，从而重排所述病毒的基因顺序。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述远端基因是表面糖蛋白基因。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述单链负义病毒目的病毒是弹状病毒。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述弹状病毒选自狂犬病病毒和水疱性口炎病毒。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述单链负义病毒目的病毒是副粘病毒。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述副粘病毒选自麻疹、腮腺炎、副流感病毒和呼吸道合胞病毒。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述呼吸道合胞病毒选自人呼吸道合胞病毒和牛呼吸道合胞病毒。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述单链负义病毒目的病毒是丝状病毒。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述丝状病毒选自埃博拉病毒和马尔堡病毒。
10.一种具有重排的基因组的单链负义病毒目的重排病毒，其特征在于，所述基因组是通过将所述病毒的启动子远侧基因向野生型3’启动子近侧位点移动而重排的。
11.如权利要求10所述的重组病毒，其特征在于，所述启动子远端基因是表面糖蛋白基因。
12.如权利要求10所述的重组病毒，其特征在于，所述单链负义病毒目的病毒是弹状病毒。
13.如权利要求12所述的重组病毒，其特征在于，所述弹状病毒是狂犬病病毒或水疱性口炎病毒。
14.如权利要求10所述的重组病毒，其特征在于，所述单链负义病毒目的病毒是副粘病毒。
15.如权利要求14所述的重组病毒，其特征在于，所述副粘病毒选自麻疹、腮腺炎、副流感病毒和呼吸道合胞病毒。
16.如权利要求15所述的重组病毒，其特征在于，所述呼吸道合胞病毒选自人呼吸道合胞病毒和牛呼吸道合胞病毒。
17.如权利要求10所述的重组病毒，其特征在于，所述单链负义病毒目的病毒是丝状病毒。
18.如权利要求17所述的重组病毒，其特征在于，所述丝状病毒选自埃博拉病毒和马尔堡病毒。
19.一种在需要治疗的个体中加速和增强保护性免疫应答的方法，包括步骤：
对所述个体施用药物学有效剂量的权利要求10所述的重组病毒。
20.一种对单链负义病毒目的病毒减毒的方法，包括步骤：
通过将基因从其野生型位置移开而重排基因顺序。
21.一种对单链负义病毒目病毒进行减毒的方法，其特征在于，该方法包括步骤：
通过将基因从所述病毒的野生型3’启动子近侧位点移开，从而重排基因顺序，其中所述基因是基因组复制的关键限制因素。
22.如权利要求21所述的方法，其特征在于，关键限制因素基因是核衣壳基因。
23.如权利要求21所述的方法，其特征在于，关键限制因素基因被置于所述病毒基因顺序倒数第二个位置。
24.一种用权利要求21所述的方法减毒的病毒。
25.一种构建用于疫苗的单链负义病毒目的减毒病毒的方法，其特征在于，该方法包括步骤：
通过将基因从其野生型3’启动子近侧位点移开，从而重排所述病毒的基因顺序，其中所述基因是基因组复制的关键限制因素；和
将编码免疫应答诱导抗原的基因置于最靠近所述病毒基因顺序的3’末端的位置，从而构建用于疫苗的减毒病毒。
26.如权利要求25所述的方法，其特征在于，关键限制因素基因是核衣壳基因。
27.如权利要求25所述的方法，其特征在于，所述关键限制因素基因被置于所述病毒基因顺序中倒数第二个位置。
28.如权利要求25所述的方法，其特征在于，编码免疫应答诱导抗原的基因选自结合糖蛋白基因、融合基因或红细胞凝集素/神经酰胺酶基因。
29.一种根据权利要求25所述的方法减毒的病毒。
30.如权利要求25所述的方法，其特征在于，所述单链负义病毒目的病毒是弹状病毒。
31.如权利要求30所述的方法，其特征在于，所述弹状病毒是狂犬病病毒和水疱性口炎病毒。
32.如权利要求25所述的方法，其特征在于，所述单链负义病毒目的病毒是副粘病毒。
33.如权利要求32所述的方法，其特征在于，所述副粘病毒选自麻疹、腮腺炎、副流感病毒和呼吸道合胞病毒。
34.如权利要求33所述的方法，其特征在于，所述呼吸道合胞病毒选自人呼吸道合胞病毒和牛呼吸道合胞病毒。
35.如权利要求25所述的方法，其特征在于，所述单链负义病毒目的病毒是丝状病毒。
36.如权利要求35所述的方法，其特征在于，所述丝状病毒选自埃博拉病毒和马尔堡病毒。
37.如权利要求25所述的方法，其特征在于，所述用于疫苗的减毒病毒被减毒，使得该病毒的致死剂量和保护性剂量相差约1000倍。
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