KR20080106485A - (-)-쇄 ｒｎａ 바이러스 유전자의 재배열에 의한 (-)-쇄 ｒｎａ 바이러스의 조작 및 이의 약제학적 조성물 - Google Patents

(-)-쇄 ｒｎａ 바이러스 유전자의 재배열에 의한 (-)-쇄 ｒｎａ 바이러스의 조작 및 이의 약제학적 조성물 Download PDF

Info

Publication number
KR20080106485A
KR20080106485A KR1020087028976A KR20087028976A KR20080106485A KR 20080106485 A KR20080106485 A KR 20080106485A KR 1020087028976 A KR1020087028976 A KR 1020087028976A KR 20087028976 A KR20087028976 A KR 20087028976A KR 20080106485 A KR20080106485 A KR 20080106485A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
virus
gene
viruses
vsv
genes
Prior art date
Application number
KR1020087028976A
Other languages
English (en)
Inventor
게일 더블류 워츠
엘 앤드류 볼
Original Assignee
더 유에이비 리서치 파운데이션
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 더 유에이비 리서치 파운데이션 filed Critical 더 유에이비 리서치 파운데이션
Publication of KR20080106485A publication Critical patent/KR20080106485A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C12N7/04—Inactivation or attenuation; Producing viral sub-units
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/155—Paramyxoviridae, e.g. parainfluenza virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/205—Rhabdoviridae, e.g. rabies virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5254—Virus avirulent or attenuated
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
    • A61K2039/541—Mucosal route
    • A61K2039/543—Mucosal route intranasal
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/20011—Rhabdoviridae
    • C12N2760/20111—Lyssavirus, e.g. rabies virus
    • C12N2760/20161—Methods of inactivation or attenuation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/20011—Rhabdoviridae
    • C12N2760/20211—Vesiculovirus, e.g. vesicular stomatitis Indiana virus
    • C12N2760/20222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/20011—Rhabdoviridae
    • C12N2760/20211—Vesiculovirus, e.g. vesicular stomatitis Indiana virus
    • C12N2760/20234—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/20011—Rhabdoviridae
    • C12N2760/20211—Vesiculovirus, e.g. vesicular stomatitis Indiana virus
    • C12N2760/20241—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2760/20243—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/20011—Rhabdoviridae
    • C12N2760/20211—Vesiculovirus, e.g. vesicular stomatitis Indiana virus
    • C12N2760/20261—Methods of inactivation or attenuation

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 모노네가비랄레스 목의 바이러스에서 프로모터 원위 유전자의 발현을 증가시키는 방법 및 당해 방법에 의해 작제된 재조합 바이러스를 제공한다. 또한, 본 발명은 모노네가비랄레스 목의 바이러스를 약독화시키는 방법 및 백신에 유용한 약독화 바이러스를 작제하는 방법을 제공한다.
모노네가비랄레스 목 바이러스, 유전자 재배열, 재조합 바이러스, 약독화, 백신

Description

(-)-쇄 ＲＮＡ 바이러스 유전자의 재배열에 의한 (-)-쇄 ＲＮＡ 바이러스의 조작 및 이의 약제학적 조성물{Manipulation of negative stranded RNA viruses by rearrangement of their genes and pharmaceutical composition thereof}
본 발명은 일반적으로는 분자 바이러스학 및 백신학의 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 본 발명은 (-)-쇄 RNA 바이러스 유전자의 재배열에 의한 (-)-쇄 RNA 바이러스의 약독화 및 이의 용도에 관한 것이다.
모노네가비랄레스(Mononegavirales) 목은 4가지의 라브도비리대(Rhabdoviridae), 파라믹소비리대(Paramyxoviridae), 필로비리대(Filoviridae) 및 보르나비리대(Bornaviridae) 과로 이루어져 있다. 상기 과의 바이러스는 비분절화된 (-)-센스 RAN의 일본쇄를 함유하고, 어류, 식물 및 동물에서의 광범위한 상당한 질환에 대한 원인이 된다[참조: Wagner, 1996]. 상기 바이러스에 의해 암호화된 유전자의 발현은 단일 3' 프로모터에 대한 게놈 상에서의 유전자의 순서에 의한 전사 수준으로 조절된다. 모노네가비랄레스 과의 바이러스는 이들의 유전자의 발현을 조절하는 적절하게 간단한 수단을 보유한다. 이들 과의 선형의 일본쇄 RNA 게놈은 5개 내지 10개의 유전자를 암호화하며, 이의 순서는 모든 구성원 사이에서 고도로 보존된다. 바이러스 게놈의 전사는 바이러스-암호화 RNA 의존성 RNA 폴리머라제에 의해 수행된다. RNA 폴리머라제에 대한 선형 게놈 상에 단일 진입 부위는 존재하나, 바이러스의 mRNA는 아직 등몰량으로 생성되지 않는다.
유용한 증거는 게놈 상의 유전자의 선형적 순서가 각각의 유전자의 발현 수준을 조절함을 나타낸다. 전사는 게놈의 3' 말단에서의 단일 폴리머라제 진입 부위에서 개시되어, 강제적으로 진행된다[참조: Ball and White, 1976]. 모노시스트론 mRNA로서의 각각의 유전자의 발현 수준은 이들이 3'에서 5' 방향으로 게놈을 횡단할 때 각각의 유전자간 연결부에서 폴리머라제의 이탈(기간의 약 30%)에 의해 조절된다[참조: Iverson and Rose, 1981]. 이러한 전사 메카니즘은 게놈의 3' 말단으로부터의 유전자의 거리가 증가함에 따라 후속적인 전사물의 양을 감소시킨다. 상응하게는, 복제를 지지하기 위해 화학량론적 양으로 필요한 유전자 산물, 예를 들어, 뉴클레오캡시드(N) 단백질은 모든 경우에 3' 말단에 또는 근처에 암호화되어 있고, 가장 높은 몰량으로 발현된다[참조: Villarreal et al., 1976, Ball and White, 1976]. 효소량으로 필요한 유전자 산물, 예를 들어, RNA 폴리머라제는 3' 말단으로부터 가장 먼 부위에 암호화되어 있다. 모든 모노네가비랄레스에서, 폴리머라제 유전자는 5'-최외곽 유전자이고, 이는 가장 적은 양으로 발현된다. 단백질의 정확한 몰비는 최적의 복제를 위해 필요하다. 성공적인 복제를 위해, 단백질을 게놈으로부터 통상적으로 발현되는 비율에 근접한 몰비로 발현시켜야만 한다[참조: Pattnaik and Wertz, 1990].
모노네가비랄레스 과의 바이러스는 상동 유전자 재조합을 겪지 않는다[참조: Pringle, 1987]. 따라서, 게놈의 일부가 결여된 결손 간섭 입자 외에, 재배열된 포맷에서 유전자의 전체 상보체를 갖는 상기 바이러스의 변이체는 천연에서는 관찰되지 않았다.
수포성 구내염 바이러스(VSV)는 라브도비리대의 원형 바이러스이다. 이의 11킬로베이스 게놈은 바이러스의 5종의 구조 단백질: 복제된 RNA의 캡시드화를 위해 화학량론적 양으로 필요한 뉴클레오캡시드 단백질, N; RNA-의존성 RNA 폴리머라제, L의 조인자인 인단백질, P; 매트릭스 단백질, M; 및 부착 당단백질, G를 암호화하는 5개의 유전자를 갖는다. 게놈에서의 유전자의 순서는 3'-N-P-M-G-L-5'이고, 선행 연구는 발현이 단일 3' 프로모터로부터 강제적으로 순차적임을 보였다[참조: Ball and White, 1976]. 각각의 유전자 연결부에서의 약독화로 인해, 3'-최외곽 유전자는 프로모터 원거리에 있는 것 보다 풍부하게 전사된다[참조: Iverson and Rose, 1981].
실제적으로, VSV는 가장 경제적으로 중요한 말, 소 및 사육용 돼지와 같은 광범위한 동물을 감염시킨다. 이러한 감염은 구강, 발굽 및 유두 주변에서의 병소의 발현을 유발한다. 질환이 드물게 치명적이더라도, 이는 검역하고 백신 접종함에 따라 육류 및 밀크 생산에서 손실을 유발한다. 2종의 주요 VSV 혈청형, 인디애나(Ind) 및 뉴저지(NJ)가 존재한다. 이들 바이러스는 중남미 국가에서 풍토성이며, 미국내에서 돌발한다. 미국에서의 최근 돌발은 말에서 1997년에 Ind 혈청형으 로 발생한 한편, 1995년 및 1982-1983년에 확인된 이전 경우는 NJ 혈청형이었다. 이들 바이러스가 소 및 사육용 돼지에서의 구제역 바이러스에 의해 발병된 질환에 대한 질환의 증상의 유사성과 함께 전염되는 용이함은 VSV를 농업에 대해 중요한 병원체가 되도록 한다.
질환 증상을 발생시키지 않으면서, 방어 체액 면역 반응뿐만 아니라, 세포 매개된 면역 반응을 생성시키기 위해 복제할 수 있는 생 약독화 바이러스는 천연두, 황열 및 회백수염과 같은 바이러스에 대해 유효한 백신인 것으로 입증되었다. 그러나, 약독화에 관한 방책은 대부분의 경우에 실험적으로 증명되어 있으나, 일반적인 사용을 위해서는 재현가능하지 않았다. RNA 의존성 RNA 폴리머라제의 높은 오차율, 이들의 교정의 결여 및 RNA 바이러스 집단의 유사-종 특성과 같은 RNA 바이러스의 경우에서의 추가의 고려 사항[참조: Domingo et al., 1996]은 의학적으로 중요한 병원체의 상기 다수의 그룹에 대한 생 약독화 바이러스의 사용을 불확실하게 한다. 이는 병독성에 대한 복귀가 잠재적인 문제이기 때문에 백신 바이러스를 한정된 수의 단일 염기 변화를 기초로 할 경우에 특히 들어맞는다. 예를 들어, 단지 수회의 복귀 돌연변이만이 사빈 폴리오바이러스 3형 백신 균주에 대한 병독성을 복귀시킬 수 있다[참조: Wimmer et al., 1993].
선행 기술은 모노네가비랄레스 목의 바이러스를 약독화시키고 모노네가비랄레스 목의 바이러스에서 프로모터 원거리 유전자의 발현을 증가시키는 유효한 수단의 결여에 있어서 결함이 있다. 본 발명은 당해 분야에서의 오랫 동안의 요구 및 요망을 충족시킨다.
모노네가비랄레스 목의 비분절화된 (-)-쇄 RNA 바이러스는 수개의 중요한 사람 병원체를 포함한다. 고도로 보존되어 있는 이들 유전자의 순서는 유전자 발현의 상대적 수준의 주요 결정기이다. 바이러스 게놈 상의 단일 프로모터 부위에 근접한 유전자는 보다 원거리에 위치한 것들보다 높은 수준으로 전사된다. 원형 수포성 구내염 바이러스(VSV)의 감염성 cDNA 클론을 조작하여, 5개의 바이러스 유전자 중 4개의 순서를 재배열하는 한편, 나머지 바이러스 뉴클레오타이드 서열은 그대로 유지시킨다. cDNA 클론의 한 세트에 있어서, 인단백질 P, 매트릭스 단백질 M 및 당단백질 G를 암호화하는 중앙의 3개의 유전자를 모든 6가지의 가능한 순서로 재배열한다. 또 다른 세트에 있어서, 뉴클레오캡시드 단백질 N에 대한 유전자를 이의 야생형 프로모터-근접 위치로부터 멀리 이동시켜, 제2, 제3 또는 제4 위치에 위치시킨다. 최종 재배열에 있어서, 주요 표면 항원 및 중화 항체에 대한 표적을 암호화하는 G 단백질 유전자를 최대 발현을 위해 프로모터 다음 위치에 배치시킨다. 감염성 바이러스를 이들 재배열된 cDNA의 각각으로부터 회수하고, 세포 배양물내에서의 이들의 유전자 발현 수준 및 성장 잠재력에 대해 조사하고, 이들의 면역원성 및 병독성을 동물 숙주내에서 조사한다. 재배열은 암호화된 단백질의 발현 수준을 변화시키고, 바이러스를 배양된 세포내 및 동물내 모두에서 상이한 정도로 약독화시킨다. G 단백질의 발현을 증가시키는 것은 접종된 마우스에서의 면역 반응을 증강시키고 촉진시킨다. 모노네가비랄레스는 상동 재조합을 겪지 않기 때문에, 유전자 재배열은 비가역적이어야 하고, 따라서 상기 유형의 바이러스에 대해 안전하게 약독화된 생 백신을 개발하기 위한 합리적인 방법을 제공한다.
본 발명의 한 양태에 있어서, 프로모터 원거리 유전자를 야생형 3' 프로모터 근접 부위로 이동시킴으로써 모노네가비랄레스 목의 바이러스의 유전자 순서를 재배열하는 단계를 포함하여, 모노네가비랄레스 목의 바이러스에서 프로모터 원거리 유전자의 발현을 증가시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 있어서, 모노네가비랄레스 목의 재조합 바이러스의 프로모터 원거리 유전자를 야생형 3' 프로모터 근접 부위로 이동시킴으로써 재배열된 게놈을 갖는 모노네가비랄레스 목의 재조합 바이러스를 제공한다. 이러한 재조합 바이러스는 방어 면역 반응을 촉진시키고 증강시키기 위해 사용할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 있어서, 유전자를 이의 야생형 위치로부터 멀리 이동시킴으로써 모노네가비랄레스 목의 바이러스의 유전자 순서를 재배열하거나, 필수 제한 인자 유전자를 이의 야생형 3' 프로모터 근접 위치 부위로부터 멀리 이동시킴으로써 모노네가비랄레스 목의 바이러스의 유전자 순서를 재배열함으로써, 모노네가비랄레스 목의 바이러스를 약독화시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 있어서, 게놈 복제에 대한 필수 제한 인자인 유전자를 이의 야생형 3' 프로모터 근접 부위로부터 멀리 이동시킴으로써 바이러스의 유전자 순서를 재배열하는 단계 및 면역 반응 유도 항원을 암호화하는 유전자를 바 이러스의 유전자 순서의 3' 말단에 가장 근접한 위치에 위치시키는 단계를 포함하여, 백신에 유용한 약독화 바이러스를 작제하는 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 및 추가의 국면, 특징 및 이점은 설명의 목적으로 제공된 본 발명의 현재 바람직한 양태의 하기 설명으로부터 명백할 것이다.
본 발명은 (-)-쇄 RNA 바이러스의 게놈으로의 특이적 변화의 도입은 뉴클레오캡시드(N) 단백질에 대한 유전자의 게놈 상의 연속적인 위치로의 전위를 가능하게 함을 설명하며, 프로모터에 대한 유전자의 위치가 발현 수준을 결정함을 직접적으로 입증하였다. N 단백질 합성의 수준은 RNA 복제의 수준을 조절한다. 이와 일관되게, 본 발명은 바이러스 N2, N3 및 N4로 감염된 세포내에서의 N mRNA 및 단백질 합성의 수준이 감소함에 따라, 게놈 RNA 복제의 수준이 또한 감소함을 입증한다. 상응하게는, 세포 배양물에서의 감염성 바이러스의 생산은 바이러스 N4를 사용한 크기의 4차수 정도의 증분으로 감소한다. 최종적으로, 감소된 복제 잠재력과 부수적으로, IN 접종 후의 마우스에 대한 바이러스 N2, N3 및 N4의 치사율은 야생형 바이러스와 비교하여 각각 크기의 약 1차수, 2차수 또는 3차수로 감소한다. 복제 및 방어의 유사한 결과가 또한 바이러스의 천연 숙주에서 관찰된다.
이들 데이터는 복제에 필수적인 단일 유전자의 바이러스 게놈 아래의 연속적인 위치로의 전위가 세포 배양에서의 성장 잠재력 및 동물 모델과 천연 숙주내의 단계적 방식에서의 바이러스의 치사율을 저하시킴을 입증한다. 그러나, 마우스 및 천연 숙주에서의 방어 면역 반응을 유발하는 바이러스의 능력은 병독성에서의 감소와 일치하여 변화하지 않는다. 따라서, 바이러스 모두가 유전자의 야생형 상보체를 함유하고, 이들 모두가 복제 능력이 있기 때문에, 감소된 수준에도 불구하고, 복제의 수준은 방어 숙주 반응을 유도하기에 충분하다. 따라서, 몇몇 재배열된 바이러스의 경우에, 방어량 및 치사량은 치사량과 방어량이 일치하는 야생형 바이러스를 사용하는 상황과 대조하여 1,000배 차이가 난다. 함께 고려하면, 이들 데이터는 충분한 면역 반응을 유도하는 복제 잠재력의 손상없이 발병을 방지하기에 적합한 약독화 수준을 결정하도록 하는 예측가능한 증분 방식으로 비분절화된 (-)-쇄 RNA 바이러스를 약독화시키는 수단을 제시한다.
또한, 본 발명은 프로모터 원거리 유전자, 예를 들어, 부착 당단백질을 암호화하는 G 유전자를 프로모터 근접 부위로 이동시킴으로써 이의 발현을 증가시킬 수 있음을 입증한다. 감염 동안의 G 단백질의 생산에서의 증가가 보다 큰 방어 면역 반응을 유발할 수 있음을 제시하기 위해, 변화를 VSV 게놈의 감염성 cDNA 클론내로 조작하고, 당단백질이 이의 정상의 제4 위치로부터 유전자 순서에서 제1 위치로 이동된 2개의 신규한 바이러스를 회수한다. 제1 바이러스는 유전자 순서 3'-G-N-P-M-L-5'(G1N2)를 가지고, 제2 바이러스는 3'-G-P-M-N-L-5'(G1N4)를 갖는다. 이들 바이러스의 시험관내 및 생체내 특성을 평가하고, 유전자 순서 3'-P-M-G-N-L-5'(G3N4) 및 야생형 유전자 순서인 3'-N-P-M-G-L-5'(N1G4)를 갖는 바이러스의 것들과 비교한다. 세포 배양물에서의 이들 바이러스의 복제, 마우스에서의 치사율, 항체 생산에서의 동력학 및 수준, 및 VSV의 치사량으로의 챌린지에 대해 방어하는 이 들의 능력에서 차이가 관찰된다.
모노네가비랄레스는 상동 재조합을 겪는 것으로 관찰되지 않기 때문에, 유전자 재조합은 비가역적인 것으로 추정되고, 따라서, 본 발명은 비분절화된 (-)-쇄 RNA 바이러스에 대한 안정하게 약독화된 생 백신을 개발하는 합리적인 대체 방법을 제공한다. 또한, 게놈 구성의 근접한 유사성 및 유전자 발현의 조절을 기초로 하여, 약독화 바이러스를 생성시키는 접근법은 광견병과 같은 라브도비리대, 홍역, 볼거리, 호흡기 합포체 바이러스 및 파라인플루엔자 바이러스 I-IV와 같은 파라믹소비리대, 및 에볼라 및 마르부르크 바이러스와 같은 필로비리대를 포함하는 모노네가비랄레스의 전체 과에 적용가능하여야 한다. 이들은 특정의 가장 문제시되는 바이러스 병원체 범위를 나타낸다.
본 발명의 한 양태에 있어서, 프로모터 원거리 유전자를 야생형 3' 프로모터 근접 부위로 이동시킴으로써 모노네가비랄레스 목의 바이러스의 유전자 순서를 재배열하는 단계를 포함하여, 모노네가비랄레스 목의 바이러스에서 프로모터 원거리 유전자의 발현을 증가시키는 방법을 제공한다. 바람직하게는, 원거리 유전자는 표면 당단백질을 암호화한다. 수포성 구내염 바이러스의 경우에, 표면 당단백질을 암호화하는 특정의 원거리 유전자는 부착 당단백질 G에 대한 유전자이다. 호흡기 합포체 바이러스의 경우에, 표면 당단백질을 암호화하는 특정의 원거리 유전자를 부착 당단백질(G) 유전자로 칭하며; 표면 당단백질을 암호화하는 또 다른 원거리 유전자는 호흡기 합포체 바이러스 융합(F) 단백질 유전자이다. 홍역 바이러스 경우에, 표면 당단백질을 암호화하는 원위 유전자를 H(헤마글루티닌) 유전자로 칭한 다. 볼거리 및 파라인플루엔자 바이러스의 경우에, 표면 당단백질을 암호화하는 원위 유전자를 HN(헤마글루티닌/뉴라미니다제) 유전자로 칭한다. 당해 분야의 숙련가는 모노네가비랄레스 목의 각각의 특정 바이러스에 대해 본 발명의 방법을 수행하기 위해 표면 당단백질을 암호화하는 원거리 유전자를 조작할 수 있음을 용이하게 인지할 것이다.
본 발명의 또 다른 양태에 있어서, 모노네가비랄레스 목의 바이러스의 프로모터 원거리 유전자를 야생형 3' 프로모터 근접 부위로 이동시킴으로써 재배열된 게놈을 갖는 모노네가비랄레스 목의 재조합 바이러스를 제공한다. 이러한 재조합 바이러스를 방어 면역 반응을 촉진시키고 증강시키기 위해 사용할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 있어서, 유전자를 이의 야생형 위치로부터 멀리 이동시킴으로써 모노네가비랄레스 목의 바이러스의 유전자 순서를 재배열하거나, 필수 제한 인자 유전자를 이의 야생형 3' 프로모터 근접 부위로부터 멀리 이동시킴으로써 모노네가비랄레스 목의 바이러스의 유전자 순서를 재배열함으로써, 모노네가비랄레스 목의 바이러스를 약독화시키는 방법을 제공한다. 바람직하게는, 유전자를 바이러스의 유전자 순서에서 마지막 위치 다음에 위치시킨다. 또한, 게놈 복제에 대한 필수 제한 인자인 유전자는 뉴클레오캡시드(N) 유전자인 것이 바람직하다. 모노네가비랄레스 목의 바이러스의 대표적인 예는 광견병 또는 수포성 구내염 바이러스와 같은 라브도비리대, 홍역, 볼거리, 파라인플루엔자 바이러스 또는 호흡기 합포체 바이러스(사람 및 소)와 같은 파라믹소비리대, 또는 에볼라 또는 마르부르크 바이러스와 같은 필로바이러스이다. 또한, 본 발명은 당해 방법에 따라 약독 화된 바이러스를 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태에 있어서, 게놈 복제에 대한 필수 제한 인자인 유전자를 이의 야생형 3' 프로모터 근접 부위로부터 멀리 이동시킴으로써 바이러스의 유전자 순서를 재배열하는 단계 및 면역 반응 유도 항원을 암호화하는 유전자를 바이러스의 유전자 순서의 3' 말단에 가장 근접한 위치에 위치시키는 단계를 포함하여, 백신에 유용한 약독화 바이러스를 작제하는 방법을 제공한다. 바람직하게는, 필수 제한 인자는 뉴클레오캡시드(N) 유전자이고, 당해 유전자는 바이러스의 유전자 순서에서 마지막 위치 다음에 위치시킨다. 보다 바람직하게는, 면역 반응 유도 항원을 암호화하는 유전자는 부착 당단백질(G) 유전자, 융합 유전자 또는 헤마글루티닌/뉴라미니다제 유전자일 수 있다. 당해 분야의 숙련가는 적합한 면역 반응 유도 항원을 용이하게 치환할 수 있을 것이다. 또한, 본 발명은 당해 방법에 따라 약독화된 바이러스를 포함한다.
본 발명에 따라서, 당해 분야의 기술내에서 통상의 분자 생물학, 미생물학 및 재조합 DNA 기술을을 사용할 수 있다. 이러한 기술은 문헌에 상세하게 설명되어 있다[참조예: Maniatis, Fritsch & Sambrook, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982); "DNA Cloning: A Practical Approach," Volumes I and II (D.N. Glover ed. 1985); "Oligonucleotide Synthesis" (M.J. Gait ed. 1984); "Nucleic Acid Hybridization" [B.D. Hames & S.J. Higgins eds. (1985)]; "Transcription and Translation" [B.D. Hames & S.J. Higgins eds. (1984)]; "Animal Cell Culture" [R.I. Freshney, ed. (1986)]; "Immobilized Cells And Enzymes" [IRL Press, (1986)]; B. Perbal, "A Practical Guide To Molecular Cloning" (1984)]. 따라서, 본원에 게재될 경우에, 하기 용어는 아래에 설명된 정의를 가져야 한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "약독화"는 유전자의 발현을 조절하는데 사용되는 전사의 조기 종료를 포함하는 유전자 메카니즘, 또는 면역학적으로 병원성 미생물이 이의 병독성을 상실하는 과정으로서 정의한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "치사량"은 숙주 상에서 치사율을 부여하는데 필요한 바이러스 접종물의 양으로서 정의한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "방어량"은 치사율을 유발하지 않으면서 바이러스에 대해 충분한 면역 반응을 발생시키는 바이러스 접종물의 양으로서 정의한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "재배열"은 유전자 및 유전자간 영역이 야생형으로 유지되고, 단지 3' 말단과 관련된 순서만이 변형되도록 하는 바이러스 게놈내에서의 재정리로서 정의한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "(-)-쇄 RNA 바이러스"는 게놈이 RNA 분자의 (-)-쇄를 포함하는 RNA 바이러스의 부류로서 정의한다.
본원 발명에서는 프로모터에 근접한 뉴클레오캡시드 단백질 유전자 N의 재배치에 따른 바이러스의 약독화와는 별개로, 수포성 구내염 바이러스 (VSV)의 제4위 치에 있는 표면 당단백질 유전자 G를 제1 위치로 재배치시킨 본원 발명의 재조합 바이러스가 야생형 VSV에 필적할 만한 수준으로 강한 방어 면역반응을 일으킴을 보여주고 있습니다.
하기 실시예는 본 발명의 다양한 양태를 예시하기 위한 목적으로 제공한 것이지, 본 발명을 어떠한 방식으로든 한정하고자 하는 것은 아니다.
실시예 1
바이러스 및 세포
VSV의 인디애나 혈청형의 산 후안(San Juan) 분리물은 본원에 사용되는 대부분의 cDNA에 대한 본래의 주형을 제공한다. 그러나, G 단백질을 암호화하는 유전자는 본래에 VSV 인디애나의 오르세이(Orsay) 분리물로부터 유래한다[참조: Whelan et al., 1995]. 어린 햄스터 신장(BHK-21) 세포를 사용하여 cDNA로부터 바이러스를 회수하고, 1단계 증식 실험을 수행하고, RNA 및 단백질을 방사성 동위원소 표지화시킨다. 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포(BSC-1 및 BSC-40) 또는 Vero-76 세포주를 플라크 검정법에 대해 사용한다.
실시예 2
플라스미드 작제 및 감염성 바이러스의 회수
VSV의 5개 유전자를 각각 18개 뉴클레오타이드의 공통 서열에 의해 플랭킹시킨다. 따라서, 각각의 유전자를 정확하게 포함하고 있는 DNA 단편을 적합한 제한 엔도뉴클레아제로 분해하여 방출시킬 수 있는 각각의 분자 클론을 작제할 수 있다. 인식 서열로부터 원거리에 있는 부위를 분해하는 제한 엔도뉴클레아제를 사용하여, 보존된 시스트론간 영역의 동일한 4개의 뉴클레오타이드(ACAG)에 상응하는 점착성 말단을 갖는 유전자 절편을 작제한다. 이러한 방법으로, 5개의 유전자 각각을 포함하는 DNA 절편을 임의의 목적하는 순서로 재조립하여, 유전자가 재배열되어 있다는 사실을 제외하고는 뉴클레오타이드 서열이 야생형 VSV의 서열과 정확하게 상응하는 일군의 DNA 플라스미드를 작제할 수 있다. 재배열된 바이러스 게놈 N1(wt), GMP, MGP, PGM, GPM, MPG, N2, N3, N4, G1N2 및 G1N4의 작제에 포함되는 단계의 도표를 도 2, 3 및 4에 도시한다. P 유전자의 유전자간 영역 하류내의 하나의 뉴클레오타이드를 제외하고는 게놈을 변형시키지 않는다. 3'-CA-5'로부터 3'-GA-5'로의 변형은 전사에 거의 영향을 미치지 않는다.
재배열된 cDNA 클론으로부터 감염성 바이러스를 회수하기 위해, T7 RNA 폴리머라제(vTF7-3)를 발현시키는 재조합 우두 바이러스로 BHK-12 세포를 감염시킨다[참조: Fuerst, et al., 1986]. 1시간 후에, 항-게놈 RNA의 캡시드화 및 복제에 필요한 N, P 및 L 단백질을 발현시키는 3개의 플라스미드와 함께 재배열된 VSV cDNA로 세포를 형질감염시킨다[참조: Whelan et al., 1995]. 감염성 바이러스를 상등 배지로부터 수거하고, 낮은 감염 다중도(MOI)로 BHK-21 세포에서 증폭시켜 DI 입자의 형성을 방지하고, 시토신 아라비노사이드(25㎍/ml)의 존재하에 우두 바이러 스의 복제를 억제한다. 상등 배지를 0.2μM 필터를 통해 여과하고, 바이러스를 15 내지 45% 슈크로스 속도 농도 구배시켜 이를 임의의 잔여 vTF7-3 우두 바이러스로부터 분리한다. 회수된 바이러스의 유전자 순서를 역전사 및 PCR에 이어서 제한 효소 분석을 사용하여 게놈의 재배열된 부분을 증폭시켜 확인한다(도 5).
실시예 3
단일 사이클 바이러스 복제
접종시 다중도를 3으로 하여 각각의 바이러스로 단층 배양물의 106 BHK-21, BSC-40 또는 BSC-1 세포를 감염시킨다. 1시간의 흡착 기간 후에, 접종물을 제거하고, 배양물을 2회 세척하고, 신선한 배지를 첨가하고, 31℃ 또는 37℃에서 배양한다. 36시간에 걸쳐 지시된 간격으로 샘플을 수거하고, BSC-40 세포 또는 Vero-76 세포의 컨플루언트(confluent) 단층 상에서의 플라크 검정에 의해 바이러스 복제를 정량화시킨다.
실시예 4
바이러스 RNA 및 단백질 합성의 분석
BHK-21 세포의 컨플루언트 단층 배양물을 세포당 5PFU의 접종시 다중도에서 각각의 바이러스로 감염시키고, 1시간 동안 흡착시킨다. 바이러스 RNA 합성을 분석하기 위해, 배양물을 감염 후 1.5시간째에 악티노마이신 D(5㎍/ml)로 처리한 후, [3H]-우리딘(30μCi/ml)을 2 또는 4시간의 표지화 기간 동안 첨가한다. 세포를 수거하고, 세포질 추출물을 제조하고 문헌[참조: Pattnaik and Wertz, 1990]에 기술된 바와 같이 1.75% 아가로스 우레아 겔 상에서 RNA를 분석한다. 메티오닌 비함유 배지에서의 30분간 배양 후에 30분간의 표지화 기간 동안 [35S]-메티오닌(40μCi/ml)을 첨가함으로써 단백질 합성을 분석한다. 세포질 추출물을 제조하고, 선행 문헌[참조: Pattnaik and Wertz, 1990]에 기술된 바와 같이 단백질을 10% 폴리아크릴아미드 겔 상에서 분석한다. Pdi 정량 원 소프트웨어(Pdi Quantity One software)가 장착된 Howteck Scanmaster 3을 이용한 자가방사선술의 밀도측정 분석에 의해 각각의 RNA 또는 단백질을 정량화시키고, 이어서 몰비를 계산한다.
다른 방법으로서, MOI 50으로 감염시키고 감염시킨지 3시간째에 악티노마이신 D(5㎍/ml)를 첨가한 BHK-21에서 변이된 바이러스 각각에 의해 지시된 바이러스 단백질 합성을 측정한다. 감염시킨지 5시간째에, 세포를 세척하고, 30분 동안 메티오닌 비함유 배지에서 배양한다. 세포를 1시간 동안 [35S]메티오닌(30μCi/ml, 비활성 10.2 mCi/ml)에 노출시킨다. 세포 단층을 직접 겔 로딩 완충액으로 수거하고, 분당 계수(cpm)를 동일하게 하기 위해 정규화시킨 후에, 낮은 비스 대 아크릴아미드 비율을 사용한 10% 폴리아크릴아미드 겔 상에서 바이러스 단백질을 분리하여 P 및 N 단백질을 분리한다. 바이러스 단백질을 형광체 영상화기를 사용하여 바이러스 단백질을 정량화시키고 몰비를 계산한다.
성숙한 비리온내 단백질 각각의 양을 평가하기 위해, MOI 5로 BHK-21 세포를 감염시킨다. 2시간 후에, 세포를 세척하고, 30분 동안 메티오닌 비함유 배지에서 배양한다. 냉각 메티오닌을 표준 배지 수준의 10%로 첨가하면서, 세포를 [35S]메티오닌(50μCi/ml, 비활성 10.2 mCi/ml)으로 밤새 표지화시킨다. cpm을 정규화시킨 후에, 바이러스 펠렛을 겔 로딩 완충액에 재현탁시키고, 비리온 단백질을 10% 폴리아크릴아미드 겔 상에서 분리한다. 비리온 단백질을 형광체 영상화기를 사용하여 정량화시키고 몰비를 측정한다.
실시예 5
마우스에서의 병독성
각각의 바이러스에 대한 치사율을 공급원(Taconic Farms)으로부터 수득한 3주 내지 4주령 수컷 스위스-웹스터 마우스에서 측정한다. 5마리 또는 6마리의 약하게 마취된(케타민/크실라진) 동물 그룹에 희석제(PBS) 또는 각각의 바이러스의 연속 10배 희석물을 30㎕의 투여량으로 두개내 경로로 또는 15㎕의 투여량으로 비내로 접종한다. 또는, 6마리의 마우스 그룹을 케타민/크실라진으로 약하게 마취시키고, 둘베코 변형 이글 배지(DMEM)내에 각각의 바이러스의 연속 10배 희석물의 10㎕ 분액을 비내에 제공한다. 대조군 동물에게 유사한 투여량의 DMEM을 제공한다. 동물을 매일 관찰하고, 바이러스 각각에 대한 50% 치사량(LD50)을 리드(Reed) 및 무엔크(Muench)(1938)의 방법으로 계산한다.
실시예 6
마우스의 방어
희석제가 접종되거나 비치사량의 각각의 바이러스가 비내에 접종된 대조군 마우스 그룹을 꼬리 채혈하여, 중화 혈청 항체 생산에 대해 모니터링한다. 접종 후 제14일에, 상기한 바와 같이 약하게 마취된 상태하에서 야생형 바이러스(N1으로서 명명) 1.3 x 106PFU를 15㎕로 투여하여 마우스를 챌린지시킨다. 챌린지된 동물을 21일 동안 관찰한다.
실시예 7
모노네가비랄레스의 유전자를 재배열하기 위한 일반적인 접근법
바이러스 게놈에 어느 다른 변화를 도입하지 않고 VSV의 유전자를 재배열하기 위해, 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)을 사용하여, 인식 서열의 바깥 부위를 분해하는 제한 효소에 대한 부위에 의해 플랭킹되어 있는 N, P, M 및 G 유전자의 각각의 cDNA 클론을 작제한다. P, M 및 G 유전자를 플랭킹시키기 위해 BspM1 부위를 사용하는 반면에, N 유전자를 플랭킹시키기 위해 Bsa1 부위를 사용한다(N은 내부 BspM1 부위를 포함한다). 엔도뉴클레아제 분해 후 잔류하는 4개의 염기 점착 말단이 각각의 VSV mRNA의 개시부에서 발생하는 보존된 5' AACAG...3'(서열번호 14)의 ACAG(서열번호 13)에 상응하도록 제한 부위를 위치시켜 PCR 프라이머를 고안한다(도 3a 참조). 예를 들어, 5'...ACCTGC ACTA ACAG .....AAAAAAACTA ACAG AGAT GCAGGT...3'(서열번호 1)에서, (+)-센 스로 기재된 VSV 서열은 이탤릭체이고, BspM1 인식 부위는 굵은 문자이고, BspM1 분해에 의해 잔류하는 4개의 염기 점착 말단은 밑줄쳐 있다. 상기 방식으로, 각각의 유전자간 연결과 함께 4개의 유전자를, 양립 가능한 점착 말단을 갖는 각각의 DNA 단편 상에서 회수한다(도 3a 및 3b). 야생형 서열로부터의 단지 고의의 이탈은 야생형 서열이 5'-GT-3'인 P 유전자에 이어서 포함되는 모든 연결부에 전사되지 않는 유전자간 디뉴클레오타이드인 5'-CT-3'를 생성시킨다. 당해 돌연변이는 명백하게 사일런트이다[참조: Barr et al., 1997]. PCR 동안에 발생하는 위조된 돌연변이의 영향을 모면하기 위해, 클로닝된 유전자의 말단을 서열 분석하고 이의 내부를 감염성 클론 기원의 상응하는 DNA 단편으로 대체한다.
2개의 다른 출발 플라스미드가, 재배열된 전장 클론을 재구성하는데 필요하다: N 유전자 개시부(5'...GAAACTTTA ACAG TAAT GCAGGT...3')(서열번호 2)에서 5'(A)ACAG(서열번호 14) 범위내에서 분해되도록 위치된 유일한 BspM1 부위를 갖는, 박테리오파아지 T7 프로모터에 이어서 VSV 리더 서열을 포함하는 플라스미드. 또 다른 플라스미드는 L 유전자의 처음 420개의 뉴클레오타이드를 포함하고, L의 개시부(5'...ACCTGC ACTA ACAG CAATCATG...3')(서열번호 3)에서 동일 서열 범위내에서 분해되도록 위치된 유일한 BspM1을 갖고 있다. N, P, M 및 G 유전자 단편을 이들 플라스미드의 유일한 BspM1 부위에 한방향으로 연결하여 3' 말단 또는 5' 말단으로부터 단계적 방식으로 바이러스 게놈을 재작제한다. 각각의 유전자의 삽입은 야생형 유전자간 연결부를 생성하고, 유일한 BspM1 부위를 잔류시켜, 다음 유전자를 수용한다.
플라스미드 작제의 마지막 단계는 L 유전자의 잔여 6kb, 바이러스 게놈 5' 말단, 및 복제능 전사물의 세포내 합성에 필요한 리보자임 및 T7 터미네이터를 포함하는 감염성 클론으로부터의 DNA 단편을 첨가하는 것이다[참조: Pattnaik et al., 1992]. 당해 접근법은 유전자간 연결부에서 보존된 서열을 보유하는 임의의 모노네가비랄레스에 적용시킬 수 있다. 당해 방법으로 생성된 재배열된 유전자 순서를 도 1에 도시한다. 당해 클로닝 방책을 유효화하고, 각각의 유전자가 기능성 단백질을 암호화하고 있다는 것을 입증하기 위해, 재배열된 cDNA 클론과 상응하게 야생형 게놈을 포함하는 플라스미드를 작제한다. 당해 플라스미드로부터 회수된 바이러스를 야생형(N1, 도 1 참조)으로서 사용한다. 모든 경우에, 보존된 23개의 뉴클레오타이드 유전자간 영역을 유전자 사이에 유지시킨다.
실시예 8
중앙의 3개의 유전자가 재배열된 바이러스의 제조
모노네가비랄레스 과의 모든 바이러스 게놈의 고도로 보존적인 특성 및 VSV 뉴클레오캡시드(N) 단백질, 인단백질(P) 및 RNA 폴리머라제(L) 단백질의 정확한 몰비가 복제에 요구된다는 지식을 고려하여, VSV 게놈의 cDNA의 초기 재배열은 보존적이다. 3'-최외곽 유전자 N 및 5'-최외곽 유전자 L은 본래대로 이들의 천연 위치에 유지시키고, VSV의 3개의 중앙 유전자인 P, M 및 G 유전자는 모든 가능한 조합으로 재배열하여 도 1에 도시된 바와 같이 6가지 게놈 순서(N1(야생형), GMP, MGP, PGM, GPM 및 MPG)를 생성시킨다. 야생형 유전자 순서 N1을 상기된 바와 같이 생성 시켜 모든 cDNA 요소들이 기능성인 시험물로서 작용한다. 각각의 cDNA를, 정확한 5' 및 3' 말단을 갖는 RNA를 생성하도록 고안된 특정화된 T7 발현 플라스미드내에 작제한다[참조: Pattnaik et al., 1992].
기능성 RNA 게놈을 생성시키는 재배열된 cDNA의 능력은, 상기한 바와 같이 cDNA 클론으로부터 전사된 RNA를 캡시드화하고 기능성 리보뉴클레오타이드를 형성하는 VSV N, P 및 L 단백질을 암호화하는 cDNA[참조: Whelan et al., 1995]와 부수적으로, T7 폴리머라제를 발현시키는 우두 바이러스로 감염된 BHK 세포내에서 6개의 재배열된 각각의 cDNA[참조: Fuerst et al., 1986]로 형질감염시킴으로써 입증한다. 모든 6개의 cDNA 작제물로부터 다양한 효능을 갖는 바이러스를 회수하고, 0.2㎛ 필터를 통해 여과시켜 RNA 바이러스를 수득하기 위해 cDNA를 전사하는데 요구되는 T7 폴리머라제를 발현시키는데 사용되는 재조합 우두 바이러스를 제거한 후에 시토신 아라비노사이드(25㎍/ml)의 존재하에 바이러스를 증폭시킨다.
실시예 9
회수된 RNA 바이러스의 유전자 순서는 이들이 제조된 cDNA의 유전자 순서를 반영한다
역전사 및 PCR를 사용하여 바이러스 게놈의 재배열된 부분을 포함하는 4.1kb 단편을 증폭시킨 후, PCR 생성물을 제한 효소 분석하여 세포 배양으로 3회 계대한 후에 회수된 바이러스의 유전자 순서를 결정한다. N 및 L 유전자에 위치하는 프라이머를 사용하여 PCR을 수행한다. P, M 또는 G 유전자를 각각 유일하게 분해하는 제한 엔도뉴클레아제 AccI, BglI 또는 PstI으로 분해한 후에, 분해 산물의 관찰된 크기가 예상되는 바와 동일한 것으로 밝혀졌다(도 5a 및 5b). 데이터는 회수된 바이러스의 유전자 순서가 이들이 회수된 cDNA 클론에 상응함을 제시한다. 변이체 중에서 야생형 유전자 순서가 재출현하였다는 증거는 없다.
실시예 10
바이러스 RNA 및 단백질의 합성
이어서, 회수된 바이러스에서 이들의 유전자 발현 수준을 조사한다. 변이체 바이러스에 의한 바이러스 RNA 및 단백질의 합성을 감염된 세포내로 [3H]우리딘 또는 [35S]메티오닌을 대사적으로 유입하고, 겔 전기영동에 의해 방사선 표지된 생성물을 분석함으로써 조사한다. 동일한 종의 바이러스 RNA가 야생형 바이러스 및 변이체 각각으로 감염된 세포에서 제조된다: L, G, N, P 및 M 유전자를 제시하는 11.16kb 게놈 RNA 및 mRNA(도 6). 후자의 2개의 mRNA는 크기가 유사하고 전기영동 동안에 함께 이동한다. 어떠한 신규하거나 비정상적인 RNA 종이 변이체 바이러스로 감염된 세포에서 발견되지 않는 것으로 보아 바이러스 제제는 DI 입자를 함유하지 않음을 나타낸다(도 6). 더욱이, RNA 패턴에 있어서의 유사성은 유전자간 연결부를 횡단하는 전사 동안에 바이러스 폴리머라제의 작용이 전적으로 국부 서열 요소들에 의해 결정되고, 어떠한 검출가능한 장거리 영향을 주지 않는다는 견해를 강화한다. RNA 패턴에 따라, 변이체 바이러스에 의해 합성되는 바이러스 단백질은 또한 야생형 감염 동안에 합성된 것들과 정성적으로 유사하다(도 7).
야생형 및 변이체 바이러스로 감염된 세포의 RNA 및 단백질 프로파일이 정성적으로 유사하지만, RNA 및 단백질의 상대적으로 상이한 수준의 측정은 변이체 바이러스가 이들의 유전자를 야생형과 서로간에 상이한 몰비로 발현시킴을 제시한다(도 8). 각각의 단백질의 발현을 각각의 변이체 바이러스에 대한 프로모터 근접 N 유전자의 발현과 정규화시키는 경우, 진행성 전사 약독화의 모델에 의해 바로 예상되는 바와 같이, 유전자의 상대적 발현 수준이 주로 게놈내 이의 위치에 의존하고 따라서 프로모터와의 거리에 의존함을 제시한다. 이는 야생형(PMG)에 의해 발현된 단백질의 몰비와 내부 유전자의 순서가 역전된 변이형 GMP의 몰비의 비교에 의해 명백하게 실증된다(도 8). mRNA 프로파일의 유사한 정성적 분석은 M 및 P mRNA의 분석의 결여에 의해 곤란하지만(도 6), L, G 및 N mRNA 수준의 측정은 바이러스 게놈의 3' 말단에의 유전자의 근접이 전사 수준의 주요 결정인자라는 결론을 강화한다. 예를 들어, G mRNA의 상대적 풍부에서의 차이가 G 유전자의 위치를 반영한다(도 6). 또한, RNA 프로파일은 11.1kb의 게놈 및 항게놈 RNA의 풍부함에 의해 측정된 바와 같은 RNA 복제 수준이 변이체들간에 상당히 상이함을 제시한다(도 6).
실시예 11
중앙의 3개의 유전자가 재배열된 바이러스의 복제
플라크 형성 및 단일 사이클 성장 조건하에 변이체 바이러스들간의 복제하는 능력을 비교한다. MGP 및 MPG와 같은 몇몇 바이러스가 이들 검정법에서 N1 야생형 바이러스(PMG)와 구별될 수 없지만 GMP, GPM 및 PGM과 같은 나머지 바이러스가 BSC-1 세포의 단층 상에서 야생형보다 상당히 적은 플라크를 형성한다(표 1). 더욱이, 야생형 바이러스 및 기타 변이체 바이러스의 플라크의 크기는 여전히 증가하고 있는 가운데 GMP 플라크는 24시간 후에 크기가 정지한다(표 1). BSC-1 세포상에서 단일 사이클 증식 동안에 GMP, GPM 및 PGM의 복제가 또한 손상됨을 입증한다(도 9). 감염된지 17시간 후에, 야생형의 백분율로서 표현되고 3개의 독립적인 증식에 대한 평균 변이체의 증분 수율은 다음과 같다: MGP의 경우 107%; MPG의 경우 51%; GMP의 경우 23%; PGM의 경우 21% 및 GPM의 경우 1.6%(표 2).
플라크 직경(평균 ± 표준 오차)a
바이러스 24시간 30시간
PMG(야생형) 4.02±0.12 4.81±0.19
GMP 3.08±0.17 3.10±0.18
MGP 3.96±0.19 4.97±0.18
PGM 3.36±0.12 3.86±0.14
GPM 2.26±0.09 3.16±0.13
MPG 3.85±0.18 5.43±0.17
a 플라크 직경은 BSC-1 세포의 단층 상에 37℃에서 형성된 50개(24시간) 또는 70개(30시간)의 바이러스 플라크의 그룹을 약 2배 확대시켜 촬영한 사진으로부터 측정한다
실시예 12
중앙에 3개의 유전자가 재배열된 바이러스의 병독성
야생형 VSV를 마우스의 뇌내 또는 비내로 접종하는 경우, 치명적인 뇌염을 유발한다. 사빈(Sabin)과 올리츠키(Olitsky)가 처음으로 나이 및 접종 경로의 함수로서 VSV 뇌염에 대한 마우스의 신경병리학 및 상대적인 감수성을 기술한 1938년 이후부터, VSV와 이의 돌연변이체의 치사율을 비교하기 위해 간편하고 민감한 소형 동물 모델로서 어린 마우스가 사용되었다[참조: Sabin and Olitsky, 1938; Wagner, 1974]. 따라서, 마우스내에서의 변이체 바이러스의 발병기전을 조사한다.
야생형 VSV의 3주 내지 4주령 마우스로의 비내 접종은 7일 내지 11일 후에 뇌염, 마비 및 사망을 초래하고[참조: Sabin and Olitsky, 1938], LD50 투여량은 약 10PFU이다. 마우스 그룹의 비강내에 투여당 0.1 내지 1,000PFU의 범위에 달하는 연속 10배 희석물을 접종하고, 이들을 매일 2회 관찰함으로써 변이체 바이러스의 병독성을 비교한다. 도 5a 및 5b에 도시된 방법을 사용하여 접종된 마우스의 뇌로부터 사망 직후 회수된 바이러스에서 바이러스 유전자 순서를 확인한다. 각각의 경우에, 회수된 바이러스의 유전자 순서는 접종물의 유전자 순서에 상응한다(데이터는 제시하지 않음).
변이체 바이러스에 대한 LD50 투여량은 야생형의 것과 유사하고 바이러스 GPM, GMP 및 MGP는 약간 높은(1.5 내지 2배) 투여량을 요구한다(표 2). 이들 실험을 3회 반복하고, 대표적인 실험의 결과는 마우스당 100PFU의 투여량에서 질병이 발병하고 사망하는 시간을 제시한다(도 10). 야생형 감염된 동물은 먼저 접종한지 6일 후에 이환되고, 신속하게 마비되며, 2주내에 사망한다. 재조합체 GMP 및 MGP는 재현적으로 보다 신속하게 발병기전을 유발하고, 야생형 감염된 동물보다 24시간 내지 36시간 빠르게 증상이 발현되는 반면에, MPG 및 GPM으로 감염된지 24 내지 36시간 후에 사망하기 시작한다(도 10). 일반적으로, 야생형 VSV로의 감염에 전형적인 마비는 변이체 바이러스에서는 그보다 명백하지 않지만, 몇몇 M 단백질 돌연변이체에 의해 나타나는 바와 같은 지속적 신경계 질환에 대한 징후가 없다[참조: Barr et al., 1997].
마우스에서의 병독성은 변이체 바이러스의 세포 배양 표현형으로부터 예측할 수 없다(표 2). 세포 배양에서 복제가 가장 손상된 3개의 조합체(GMP, PGM 및 GPM) 중에서, 1종(GPM)은 LD50에 있어서 야생형보다 2배 이상의 바이러스를 요구하고 마우스의 사망이 약간 지연되는 것으로 나타나는 반면에, GMP는 증상 및 사망을 보다 빠르게 개시하고 PGM은 야생형과 구분될 수 없다. 세포 배양에서의 바이러스의 거동과 동물내에서의 이들의 특성간의 관련성의 결여는 상이한 동물 바이러스 중에서의 통상의 관찰이지만, 바이러스들간에 유일한 차이가 이들이 발현시키는 야생형 단백질의 상대적인 수준이라는 점에서 흥미롭다.
변이체 바이러스의 특성 요약
유전자 순서 상대적 플라크 크기a 상대적 방출수b LD50 값c 증상 발현d
PMG(wt) 1.00 1.00 14 6.0
GMP 0.64 0.23 21 4.5
MGP 1.03 1.07 21 5.5
PGM 0.80 0.21 12 5.5
GPM 0.66 0.016 30 5.5
MPG 1.13 0.51 11 5.5
a 감염시킨지 30시간 후에 측정(표 1 참조) b 감염시킨지 17시간 후에 측정(도 9 참조) c 마우스당 비내 접종된 PFU d 마우스당 100PFU의 비내 접종 후 일수(도 10 참조)
실시예 13
N 유전자가 재배열된 바이러스
감염성 바이러스의 회수를 기준으로 하여 3개의 내부 유전자의 재배열에 대해 VSV가 나타내는 상대적 내성에 의해 촉진되어, 뉴클레오캡시드 단백질 N에 대한 유전자의 위치를 변형시키는 추가의 재배열을 수행한다. N 단백질은 RNA 복제 동안에 초기 게놈 RNA의 캡시드화를 지지하기 위한 화학량론적 양으로 요구된다[참조: Patton et al., 1984]. RNA의 복제는 N 단백질의 연속적인 합성에 의존하고, N 단백질 합성의 억제는 복제를 종료시킨다. N 단백질 합성 수준이 이의 프로모터 근접 부위로부터 점진적으로 이동시킴으로써 저하되는 경우(따라서, N 유전자 발현 수준이 저하됨), 이에 따라 게놈 복제 수준이 저하된다. 이와 같이, N 유전자를 3'-최외곽 위치로부터 도 1에 도시된 바와 같은 각각의 연속적인 내부 위치로 이동시킴으로써(N mRNA의 가장 많은 양의 합성을 유발시킨다) VSV의 게놈을 cDNA 수준으로 변형시켜, N2(PNMGL), N3(PMNGL) 및 N4(PMGNL)을 생성시킨다. N1은 야생형 배열에 상응한다. G 유전자를 순서에 있어서 마지막 다음 위치로부터 이동시켜, N 유전자 앞쪽에 위치시키는 제4 및 제5 변이를 또한 생성시킨다(도 1). 이는 G 및 N 유전자의 위치가 교환된 G1N2(GNPML) 및 G1N4(GPMNL)를 생성시킨다.
N1-N4, G1N2 및 G1N4에 대한 cDNA를 상기한 바와 같이 세포로 형질감염시켜, 생존가능한 바이러스를 생산하는 능력에 대해 분석한다. 바이러스는 N2, N3 및 G1N2로부터 비교적 용이하게 회수된다. 37℃에서 표준 형질감염 조건을 사용하여 반복적으로 실험을 수행하여도 N4 및 G1N4로부터는 바이러스가 회수되지 않는다. N4 및 G1N4에 상응하는 바이러스는 형질감염의 온도를 저하시킴에 이어서 31℃로 계대시킴으로써 회수한다.
실시예 14
N 유전자가 재배열된 바이러스에 의한 RNA 합성
N 유전자의 게놈 하부로의 연속적 이동은 복제 수준 및 N mRNA 합성 수준에 대해 현저한 효과를 나타낸다(도 11). N 유전자를 프로모터로부터 연속적으로 멀리 이동시킴으로써 바이러스 N2, N3 및 N4(각각 야생형의 36%, 6% 및 3%; 도 11)에서의 N mRNA 합성 수준은 야생형 수준으로부터 상당히 감소한다. 이와 일관되게, G 유전자가 이를 대체한 N 유전자가 유전자 순서에서 마지막 다음 위치로 가도록 프로모터에 근접한 한 위치로 이동된 바이러스 N4에서 G mRNA 양의 증가가 관찰된다(도 11). N2, N3 및 N4의 게놈 RNA 복제의 양은 N 단백질 합성이 복제를 위해 제한되는 경우에서 예측되는 바와 같이 N 유전자의 발현이 저하되는 것과 일치하여 야생형에 상대적으로 감소한다(각각 50%, 28% 및 4%; 도 11). 또한, N 유전자가 점진적으로 프로모터에서 멀리 이동함에 따라, 추정적으로 게놈 주형의 수가 감소함으로 인한 부수 효과로서 전사의 총 수준이 감소한다.
실시예 15
N 유전자가 재배열된 바이러스의 단백질 합성
5개의 VSV 단백질 모두를 재배열된 바이러스로 감염된 세포에서 발현시키고, 이들은 모두 야생형 바이러스의 단백질과 함께 이동한다. 그러나, N 단백질 합성량은 이의 유전자가 3' 위치로부터 멀리 이동함에 따라 감소한다. 도 12에 제시된 데이터는 야생형 바이러스 N1에서 어느 정도의 몰량의 단백질이 3' 말단으로부터의 거리의 함수로서 감소하는지를 나타낸다. N 유전자가 전위되는 경우, 도 12의 데이터는 인단백질 P에 대한 N 단백질의 몰비가 N 유전자가 첫번째로부터 두번째, 세번째 또는 네번째의 유전자 순서로 이동함에 따라 점차 감소됨을 나타낸다. 이들 결과는 VSV에서의 유전자 발현 및 전사의 순차적 특성의 이전의 분석으로부터 예상을 입증한다. 또한, 이들 데이터는 유전자의 위치가 이의 발현 수준을 결정한다는 것을 직접적으로 입증한다. 분리된 성숙한 N1-N4 비리온내 단백질 수준의 조사는 성숙한 바이러스 입자내의 단백질의 상대적 몰비가 필수적으로 야생형 바이러스의 단백질의 상대적 몰비와 동일하게 유지된다는 것을 제시한다. 그러나, 저하된 수준의 게놈 RNA 복제와 상호관련하여, 보다 적은 전반적인 바이러스가 N2-4의 감염으로부터 생성된다.
실시예 16
N 유전자가 재배열된 바이러스의 복제 능력
N 유전자 재배열을 갖는 바이러스는 N 유전자가 이의 정상 프로모터 근접 위치의 하류로 이동함에 따라 점차 덜 복제한다. 성장 잠재력을 단일 단계 성장 곡선에 의해 분석한다. N2 및 G1N2는 야생형 바이러스와 비교하여 바이러스 수율이 37℃에서 약 15배 감소하고, N3은 복제 능력이 50배 감소하고, N4는 20,000배 감소한다(도 13). 31℃에서 바이러스 성장의 비교는 유사한 점진적 감소를 나타내나, 이러한 효과는 37℃에서보다 덜 확실하며, 전반적으로 상기 온도는 보다 증식 허용성이다(도 13, 삽입 그림). 31℃에서, N4 복제는 야생형과 비교하여 약 100배 감소한다. 31℃ 및 37℃에서 각각의 바이러스에 대한 세포당 PFU로서의 방출 크기는 세포당 수율이 N 유전자가 게놈 하부의 각각의 연속적 위치로 이동함에 따라 단계적 방식으로 감소하는 것으로 나타난다(도 13). 또한, 바이러스의 상대적 플라크 크기가 다양하다: N4의 플라크를 야생형의 플라크와 비교한다(감염 후 42시간째에 야생형의 플라크의 직경이 3mm인데 비해 N4 플라크의 직경은 0.5mm 미만이다). 당해 데이터는, N2, N3 및 N4의 유전자가 야생형이라 해도 유전자의 재배열 및 후속적인 단백질 몰비의 변경으로 바이러스 복제 과정의 일부 단계가 부분적으로 온도 민감성이 된다는 것을 나타낸다.
실시예 17
N 유전자가 재배열된 바이러스의 치사율
마우스에서의 VSV의 성장, 야생형의 뇌내 및 비내 접종에 의한 신경병리학 및 뇌염에 대한 감수성, 온도 민감성 또는 플라크 크기 변이체 바이러스는 상세히 기술된 바 있다[참조: Sabin and Olitsky, 1937; Shechmeister et al., 1967; Wagner, 1974; Youngner and Wertz, 1968]. 마우스에 대한 바이러스 N2, N3 및 N4의 치사율을 뇌내 및 비내 접종 경로 둘 다에 대해 야생형 바이러스 N1과 비교하여 조사한다. 각각의 경로에 의한 치사량(LD50)에 필요한 바이러스의 양은 표 3에 제시되어 있다. 사망까지의 평균 시간은 N4 바이러스의 경우에 약 2배 길지만, 뇌내 접종에 의한 각각의 바이러스에 대한 LD50은 1 내지 5pfu이다. 당해 데이터는 뇌에 직접 주사한 경우에 재배열된 바이러스가 대다수의 숙주 방어를 회피함으로써 결국에 치명적 뇌염을 유발한다는 것을 제시한다.
대조적으로, 비내 접종은 치사량에 필요한 바이러스의 양에 있어 현저한 차이를 나타낸다(표 3). IN 투여에 의한 야생형 바이러스에 대한 LD50 투여량은 약 10pfu인 반면에, N2, N3 및 N4 바이러스에 대한 값은 점차 증가한다. N2는 LD50의 경우 야생형, 즉 30,000PFU보다 20배 이상의 바이러스를 필요로 하며, N3은 500배 이상의 바이러스를, N4는 3000배 이상의 바이러스를 필요로 한다. 질병(솟구친 털, 기면증, 하지 마비증) 발병까지의 시간 및 사망 범위는 바이러스 N2, N3 및 N4로의 감염 후에 야생형과 비교하여 점차 증가하며(도 14), 사망율의 정도는 투여량의 함수이다(표 3). 당해 데이터는 말초 경로를 통해 투여한 경우에 바이러스 복제의 점진적 감소가 마우스에서의 감소된 치사율과 상호관련하여 세포 배양시에 관찰된다는 것을 제시한다.
마우스에 대한 야생형 또는 재배열된 VSV 바이러스의 치사율
LD50 데이터*
pfu/마우스(사망까지의 평균 일수)
두개내 비내
N1 NPMGL(WT) 1(3-6) 11(5-10)
N2 PNMGL 5(3-7) 250#(9-12)
N3 PMNGL 5(3-8) 5,400#(7-9)
N4 PMGNL 1(4-11) 3,000(10-12)
* 각각의 접종 경로에 대한 LD50은 연속 5배 내지 10배의 바이러스 희석액으로 IC 또는 IN 접종한 5 내지 7마리 마우스의 그룹 간의 사망률로부터 계산한다. 1회의 내부 조절된 실험으로부터 데이터를 제시한다; 각각의 투여 경로에 대해 수행한 2회의 실험은 유사하다. # 당해 바이러스에 대한 사망율 데이터는 종모양의 사망 곡선을 산출한다; LD50 투여량은 보다 하부의 곡선으로부터 계산한다. 사망까지의 일수는 괄호로 나타낸다.
실시예 18
N 유전자가 재배열된 바이러스의 야생형 챌린지에 대한 방어 능력
IC 접종한 경우에 모든 바이러스가 치사성이라는 관찰은 심지어 가장 약독화된 바이러스도 마우스에서 복제할 수 있다는 것을 나타낸다. 이는 비내 투여 후에 관찰되는 약독화와 결부시킬 경우에 약독화된 바이러스가 그럼에도 불구하고 방어 면역 반응을 유도할 수 있다는 가능성을 증가시킨다. 이러한 가능성을 시험하기 위해, 마우스를 야생형 N1 또는 N2, N3 또는 N4의 연속 10배 희석액으로 IN 접종시켜 면역화시킨다. 생존 동물을 14일 후에 야생형 바이러스 1.3×106PFU로 접종시켜 챌린지시킨다. 챌린지에서 생존한 동물의 백분율은 이전의 연구[참조: Wagner, 1974]와 일치하는 면역화 투여량의 함수이다. 바이러스 N2, N3 및 N4의 경우, 마우스당 300PFU는 100% 생존율을 제공하는 최저 투여량이다; 30PFU는 80% 내지 90% 생존율을 산출한다; 3 내지 6PFU는 45 내지 85% 생존율을 제공하며, 마우스당 3 내지 6PFU 이하의 투여량은 연령이 일치하는 비면역화된 대조군(도 15, 패널 A의 점선)의 생존율과 현저하게 상이하다는 결과를 제공한다. 야생형 바이러스에 있어, 치사량 및 방어량은 근소하나, 일반적으로 3 내지 6PFU의 바이러스 투여에서 생존한 동물의 80 내지 85%가 방어된다.
제14일에 챌린지에 앞선 혈청 항체의 측정은 마우스에서 병원성의 약독화에도 불구하고, 바이러스 N2, N3 및 N4로 면역화된 동물의 혈청 중에 존재하는 중화 항체의 수준이 3 내지 6PFU의 야생형 바이러스의 접종에서 생존한 동물에서 관찰되는 수준보다 높으며, 일반적으로 투여량 의존 방식으로 증가한다는 것을 제시한다(도 15B). 방어된 야생형 바이러스의 치사율은 보다 고투여량에서 항체 역가와의 비교는 불가능하나, 바이러스 N1 내지 N4로 접종한 다음, 야생형 바이러스 1×106PFU로 챌린지시킨 포유동물 둘 다에서 중화 항체의 역가는 1:625 내지 1:3125이다. 이들 데이터는 동물에서 복제 및 치사율이 감소었음에도 불구하고, N-재배열된 바이러스가 야생형 바이러스의 방어 반응과 비교하여 저하되지 않은 방어 반응을 유도한다는 것을 제시한다.
실시예 19
최적의 백신 바이러스를 개발하기 위한 유전자의 구성
본 발명은 모노네가비랄레스에서 유전자 순서가 유전자 발현 수준을 결정한다는 것을 설명한다. 또한, 당해 데이터는 중요한 뉴클레오캡시드(N) 유전자가 이의 정상 3' 프로모터 근접 위치로부터 멀리 이동하는 것이 순차적으로 보다 약독화된 바이러스를 생성하는 수단을 제공한다는 것을 제시한다. 최대 약독화 수준은 N 유전자가 유전자 순서상 마지막의 다음에 위치하는 경우에 발생한다. 가장 높은 발현 수준은 3' 말단의 유전자로부터 발생한다. 따라서, 약독화되고 방어와 관련된 고수준의 항원을 발현시키는 백신 벡터를 작제하는데 있어, 이상적 배열은 N4(3'-PMGNL-5') 또는 G1N2(3'-GNPML-5') 또는 G1N4(3'-GPMNL-5')의 조합이다. 이러한 작제물에서, N4는 최대로 약독화되고 G1N2는 면역 반응에 중요한 가장 고수준의 부착 당단백질을 산출한다. 이러한 척도를 기초로 하여, G1N4(3'-GPMNL-5')는 최대로 약독화되고 가장 높은 수준의 G 단백질을 산출할 수 있다.
실시예 20
추가의 외래 유전자를 발현시켜 외래 유전자의 수준을 위치에 의해 조절할 수 있는 백신 벡터
VSV의 게놈은 유전자간 영역에 삽입된 경우와 보존된 유전자 출발, 유전자 종결 및 유전자간 영역이 유지되는 경우에 추가의 외래 유전자를 수용하고 발현시킬 수 있다(도 16)[참조: Schnell et al., 1996]. 또한, VSV 게놈내에 삽입된 외래 유전자의 발현 수준은 유전자가 삽입된 게놈내의 위치에 의해 조절될 수 있다. 보존된 VSV 유전자 출발 및 유전자 종결 서열로 둘러싸인, 박테리오파지 Phi X174 게놈의 660개의 뉴클레오타이드 서열을 보존된 유전자간 서열이 유지되는 방식으로 VSV 게놈의 전장 cDNA의 각각의 연속적 유전자 연결부내로 삽입한다. 이들 작제물의 유전자 순서는 각각 다음과 같다: NIP(3'-NIPMGL-5'), PIM(3'-NPIMGL-5'), MIG(3'-NPMIGL-5') 또는 GIL(3'-NPMGIL-5')(여기서, I는 (I)nserted(삽입된) 외래 유전자를 나타낸다).
게놈내의 각 위치에 외래 유전자 서열이 삽입된 바이러스를 각각 사용하여 BHK-21 세포를 감염시키고, RNA의 합성을 악티노마이신 D의 존재하에 [3H]-우리딘으로 대사성 표지화시켜 분석한다. VSV 게놈 RNA 및 5개의 VSV 특이적 mRNA는 회수된 바이러스 모두에서 발현된다(도 16). 또한, 4가지의 모든 경우에서, 삽입된 외래 유전자 물질로부터 예상되는 크기의 mRNA의 합성도 관찰된다. 외래 유전자의 발현 수준은 게놈의 3' 말단으로부터 이의 삽입 위치에 따라 다양하다. 가장 높은 발현 수준은 NIP에서 나타나며, 이어서 PIM, MIG 및 GIL 순이다(도 16). 따라서, 당해 데이터는 외래 유전자가 VSV의 게놈내로 삽입될 수 있으며, 외래 유전자가 보존된 VSV 유전자 출발 및 종결 시그널에 의해 둘러싸이는 경우 발현될 수 있음을 제시한다. 가장 중요하게는, 당해 데이터는 외래 유전자의 발현 수준이 유전자가 게놈내로 삽입된 위치에 의해 조절된다는 것을 제시한다.
외래 유전자를 발현시키는 각각의 바이러스의 성장 잠재력의 분석은 외래 유전자의 삽입 위치가 바이러스 성장에 효과를 미치는지의 여부를 결정한다는 것을 제시한다. NIP는 야생형 바이러스와 비교하여 바이러스 수율이 10배 감소된 반면에, PIM, MIG 및 GIL은 모두 야생형 바이러스의 수준과 동등한 수준까지 복제한다. 따라서, 당해 데이터는 외래 유전자의 삽입이 가능하며, 외래 유전자의 삽입이 바이러스에 대해 치사성이 아니며, 유전자의 삽입이 삽입 위치에 따라 복제율을 감쇠시킬 수 있다는 것을 제시한다.
실시예 21
혈청 항체 수준 및 중화 역가의 측정
바이러스를 접종한 후, 혈액을 1주 간격으로 2 내지 4마리의 동물 그룹으로부터 수집한다. 혈청을 풀링하고, 57℃에서 40분 동안 가열하여, 보체를 불활성화시킨다. 세포 단층을 VSV 야생형(N1G4)로 감염시키고, 비감염된 BHK-21 세포를 세제 완충액(1% NP40, 0.4% 나트륨 데옥시콜레이트, 66mM EDTA, 10mM 트리스-HCl pH 7.4)에 용해시켜, 직접적인 효소결합 면역흡착 검정법(ELISA: enzyme-linked immunosorbent assay)에서 항원으로 사용한다. 샘플을 연속 희석하고, 고추냉이 퍼옥시다제에 접합된 염소 α-마우스 Ig를 사용하여 검출한다. 광학 밀도(OD)를 450nm에서 판독하고, 항체 역가를 광학 밀도 대 혈청 희석액의 플롯의 선형 회귀 분석법으로 계산한다. 종료점 역가(log10)를 예비면역 샘플의 1.5배의 OD에서 추론한다. 챌린지 당일의 혈청 중화 항체 역가를 Vero 76 세포에서 표준 플라크 감소 검정법으로 측정하고, 역가를 50% 중화를 제공하는 희석율의 역수로 표현한다.
실시예 22
야생형 챌린지로부터 마우스의 방어
마우스를 DMEM에서 1 내지 10,000 플라크 형성 단위(pfu) 범위의 각 바이러스의 투여량으로 비내 면역화시킨다. 접종 후 제20일에, 각각의 변이체 바이러스의 비치사량을 투여한 마우스의 그룹을 N1G4 야생형 바이러스 5.4×106PFU로 비내 챌린지시킨다. 챌린지 동물 및 대조군을 추가로 21일 동안 모니터링한다. 혈청 항체 적정을 위해, 혈액을 1주일 간격으로 꼬리로부터 채혈한다.
실시예 23
N 및 G 유전자가 재배열된 바이러스의 제조 및 회수
본 연구에서는, G 유전자가 유전자 순서상 정상적인 제4 위치로부터 프로모터 위치와 가장 근접한 제1 위치로 이동한 cDNA 클론을 제조하여 이의 발현을 증가시킨다. 2가지의 새로운 유전자 재배열을 생성시킨다: G 유전자가 유전자 순서상 제1 위치로 이동되고, 나머지 4개의 유전자가 그대로 유지되어 순서 3'-GNPML-5'(GIN2)를 생성시키는 첫번째 유전자 배열 및 G 및 N 유전자의 위치가 바뀌어 순서 3'-GPMNL-5'(G1N4)를 생성하는 두번째 유전자 배열(도 17). 두 경우에서 상기 cDNA를 세포내로 형질감염시키고, 바이러스를 회수한다. 회수된 바이러스를 재배열된 유전자 순서의 N 및 G 유전자의 위치에 따라 각각 G1N2 및 G1N4로 명명한다. 이들 바이러스의 특성을 야생형 유전자 순서(N1G4)를 재생하는 동일한 유전자 재배열 방법을 사용하여 생성된 cDNA 클론으로부터 유래된 바이러스(NIG4) 및 유전자 순서 3'-P-M-G-N-L-5'를 갖는 바이러스(G3N4)와 비교하여 조사한다.
실시예 24
N 및 G 유전자가 재배열된 바이러스에서 바이러스 단백질 발현에 대한 유전자 재배열의 효과
BHK-21 세포를 재배열된 게놈을 갖는 바이러스로 감염시키고, 바이러스 단백질 합성의 상대적 수준을 감염 후 5시간째에 [35S]메티오닌으로 1시간 동안 표지화시켜 조사한다. 총 세포 단백질을 SDS-PAGE로 분리하고, 자가방사선술로 가시화한다. 전형적인 겔을 도 18a에 도시한다 야생형 VSV에 의한 감염 및 재배열된 변이체는 숙주 단백질 합성을 신속히 억제하여 바이러스 N, P, M, G 및 L 단백질이 직접적으로 검출되도록 한다. G 단백질의 합성은 야생형(N1G4)으로 감염된 세포(도 18, 레인 1)에서의 속도와 비교하여, G1N2 및 G1N4 바이러스로 감염된 세포(도 18, 레인 2 및 4)내의 다른 바이러스 단백질에 비례하여 현저하게 증가한다.
단백질을 형광체 영상화에 의해 정량화시킨다. 1시간의 표지화 시간 동안 합성된 G 단백질의 몰 백분율은 야생형 바이러스로 감염된 세포에서보다 G1N2로 감염된 세포에서 2.3배 높으며, G1N4로 감염된 세포에서 1.7배 높다. 유사하게는, 바이러스 G1N2, G3N4 및 G1N4에서 N 유전자의 이의 프로모터 근접 위치로부터 보다 말단 위치로의 전위는 N 단백질 합성 속도를 감소시킨다(도 18c). 상대적 합성 속도에 있어 이러한 변화의 결과로서, 바이러스 단백질의 몰비, 특히 최적 RNA 복제에 중요한 것으로 공지된 N 대 P의 비는 변이체 바이러스로 감염된 세포마다 상이하다[참조: Pattnaik and Wertz, 1990](도 18c).
또한, 정제된 바이러스 입자의 단백질 합량을 조사하여 세포내의 단백질 합성량의 변화가 비리온으로의 단백질 어셈블리에 영향을 미치는지를 결정한다. BHK-21 세포를 각각의 바이러스로 감염시키고, 밤새 [35S]메티오닌으로 표지화시키고, 비리온을 상등액으로부터 수거하고 10% 슈크로즈를 통해 원심분리하여 세포 파편으로부터 분리한다. SDS-PAGE에 의한 비리온 단백질의 분석(도 18b)은 상대적 단백질 함량이 현저하게 상이하지 않음을 나타냈다. 형광체 영상화 정량화는 감염된 세포에서 상대적 단백질 합성 수준이 변경되었음에도 불구하고, G 수준이 야생형 또는 다른 재배열된 바이러스에서보다 1.6배 높은 G1N2를 제외하고는 비리온내의 단백질의 양이 야생형 바이러스의 단백질의 양과 유사하다는 것을 입증한다(도 18d).
실시예 25
N 및 G 유전자가 재배열된 바이러스의 복제
단일 단계 성장 조건하에 재배열된 바이러스의 복제를 MOI 3으로 감염시킨 후, 37℃에서 배양함으로써 배양된 BHK-21 세포에서 조사한다. 상등액을 다양한 시간에서 수거하고, 바이러스 수율은 플라크 검정법으로 측정한다. N 유전자의 프로모터 근접 위치로부터 멀리 떨어진 곳으로의 전위는 유전자가 제1 위치로부터 보다 이동함에 따라 복제를 단계적으로 감소시킨다. N의 제2 위치로의 이동(G1N2)은 복제를 3배 감소시키는 반면에, N의 제4 위치로의 이동(G3N4)은 복제를 1,000배 감소시킨다(도 19). 그러나, 제4 위치에 N을 갖는 2종의 바이러스(G3N4 및 G1N4)는 최적 복제에 중요한 N:P의 몰비가 G3N4에서 보다 G1N4에서 덜 변동되었기 때문에 단일 단계 성장 조건하에서 상이한 수준으로 복제될 수 있다. 감염시킨지 5시간 후의 세포내 단백질 합성 속도의 측정은 G3N4(3'-PMGNL-5')로 감염된 세포에서 N:P의 몰비가 1:1.8인데 비해 G1N4(3'-GPMNL-5')로 감염된 세포에서 N:P의 몰비가 1:1.6임을 제시한다(도 18c). 야생형-감염된 세포(N1G4)에서 1:0.7의 N:P의 비 및 G1N2로 감염된 세포에 대한 1:0.8의 N:P의 비에 의해 제시되는 바와 같이, 1:0.5 내지 1:1의 N:P 몰비가 복제에 최적이다. 야생형 바이러스 및 G1N2는 둘 다 유전자 순서상 N 바로 다음에 P를 갖는다(도 17). N에 비해 매우 과량이거나 매우 소량의 P는 복제를 현저하게 감소시키므로, 바이러스 G3N4로 감염된 세포에서는 N이 제한될 뿐만 아니라 N:P의 몰비가 최적치의 2배 이상이다. G3N4 및 G1N4의 복제의 동력학은 야생형 및 G1N2에 비해 지연된다. G3N4 및 G1N4의 단일-단계 성장은 N1G4 및 G1N2의 경우에 감염시킨지 12시간째까지 완결되는 것에 비해 감염시킨지 24시간째까지 완결되지 않는다. G1N2가 야생형 바이러스에 비해 복제의 지연을 나타내지 않기 때문에, 감염된 세포내의 과량의 G가 이러한 복제의 지연을 초래할 가능성은 없다.
실시예 26
N 및 G 유전자가 재배열된 바이러스의 치사율
어린 마우스는 VSV 및 이의 돌연변이주에 의해 유발되는 신경병리학 연구용의 감수성 동물 모델[참조: Sabin and Olitsky, 1938; Wagner, 1974]을 제공하고, 마우스를 비내 경로를 통해 야생형 VSV로 접종시키면 치명적 뇌염을 초래한다. 재배열된 변이체 바이러스의 발병기전을 비내 접종 후에 3 내지 4주령의 스위스-웹스터 마우스에서 야생형 바이러스의 발병기전과 비교한다. 각각의 바이러스에 대한 LD50을 구성하는 투여량은 하기 표 4에 제시한다.
재배열된 유전자 순서를 갖는 바이러스의 마우스에 대한 LD50 투여량
바이러스 pfu
N1G4(wt) 100
G1N2 50
G3N4 >100,000
G1N4 19,000
* LD50 값은 재배열된 바이러스의 연속 10배 희석액으로 비내 접종시킨 6마리의 마우스의 그룹 간에 관찰된 사망율로부터 계산한다. 바이러스 역가는 Vero-76 세포에서 플라크 검정법으로 측정한다. 1회의 내부 조절된 실험으로부터의 데이터를 제시한다.
당해 실험에서 투여된 G3N4의 투여량이 앞서 제시한 LD50에 도달하지는 않으나, 모든 바이러스는 충분히 높은 투여량을 투여한 경우에 마우스에 대해 치사성이다. 일반적으로는, N 유전자의 위치, N:P 비 및 수득되는 바이러스 복제 수준은 치사성에 중요한 결정요소이다. N 유전자가 프로모터로부터 멀리 이동한 바이러스는 LD50을 구성하는 상당히 증가된 투여량을 요한다. 당해 결과는 바이러스 N1 내지 N4에서 N 유전자가 순차적으로 이동된다는 이전의 관찰을 입증한다. 그러나, 본원에서 제시하는 결과는 제4 위치에 N 유전자를 갖는 바이러스(G3N4 및 G1N4)의 경우 복제 능력 및 LD50 값은 둘 다 G 유전자의 위치에 의해서 또한 영향을 받는다는 것을 제시한다.
본원에서 보고하는 LD50 값은 BSC-40 세포 상의 바이러스 역가보다 약 10배 이상 높은 Vero-76 세포 상의 바이러스 역가와 관련하여 표현한다. VSV의 유전자 순서의 재배열이 변이체 바이러스와 인터페론 시스템의 상호작용에 영향을 미칠 수 있기 때문에 세포주를 교환한다. BSC-40 세포는 감염 후 인터페론을 생산하는 수용능이 있는 반면에 Vero 세포는 그렇지 않다. 따라서, Vero 세포로 교환하여 인터페론 유도 또는 감수성에 있어서 가능한 차이를 회피한다.
첫번째 사망이 N1G4로 접종한 동물에서 먼저 발생하나, 질병(구부정한 자세 및 하지 마비증)의 제1 증상은 N1G4 및 G1N2 바이러스 둘 다로 접종 후 제5일에 나타난다(도 20). 앞서 관찰된 바와 같이, 제4 위치에 N을 갖는 바이러스는 마우스당 1,000PFU의 투여량에서 보다 천천히 증상을 유도하며 G3N4는 이환율뿐만 아니라 사망율을 유도하지 않는다. 질병의 준임상적 징후를 검출하려는 시도에 있어서, 마우스의 그룹을 연구 기간 내내 매일 칭량한다(도 21). 그러나, 증상을 나타내는 마우스는 일정하게 체중이 감소하여 사망하는 반면에, 증상을 나타내지 않은 마우스는 접종되지 않은 대조군 동물과의 체중 차이를 나타내지 않는다(도 21). 유사한 결과는 접종된 마우스를 야생형 바이러스로 챌린지시킨 후 관찰된다: 증상을 나타낸 모든 동물은 이후에 사망하며, 증상을 나타내지 않은 동물은 또한 체중 손실을 나타내지 않는다.
실시예 27
재배열된 N 및 G 유전자를 함유하는 바이러스로 접종한 마우스내의 혈청 항체
체액 면역 반응에 대한 재배열된 G 유전자를 갖는 바이러스 접종의 효과를 평가하기 위해, 마우스를 각각의 변이체 바이러스의 연속 10배 희석액으로 비내 접종시킨다. 혈액을 1주일 간격으로 꼬리로부터 채혈하고, 혈청 항체의 수준을 ELISA에 의해 측정한다. 접종체의 생존이 당해 실험의 필요조건이기 때문에, LD50 이하의 투여량만을 사용한다. G 유전자의 전위는 항체 반응의 동력학 및 크기를 변화시킨다(도 22). 야생형 바이러스로 접종된 마우스는 21일 이내에 거의 검출할 수 없는 수준의 항체를 생성하는 반면에, G1N2 100PFU를 투여받은 동물은 접종 후 14일까지 현저한 역가를 나타내며, G1N4를 투여받은 동물은 접종 후 7일까지 현저한 역가를 나타낸다. 이러한 촉진되고 증강된 반응은 100PFU를 투여받은 마우스를 비교함으로써 가장 명백해질 수 있다(도 22). 당해 결과는 G 유전자의 제4 위치로부터 제1 위치로의 전위가 VSV에 대한 체액 면역 반응을 증가시킨다는 것을 입증한다. G1N4를 투여받은 마우스는 G3N4를 투여받은 마우스보다 먼저 고수준으로 항체를 합성한다. 이는 G 유전자를 유전자 순서상 가장 먼저 위치시키는 것이 VSV의 면역원성을 증가시킨다는 관찰결과를 입증한다.
접종 후 제21일에, 마우스를 야생형 VSV 5.4×106PFU로 챌린지시킨다. G3N4 또는 G1N4로 접종된 마우스에서 챌린지 이전에 이미 달성된 높은 역가가 추가로 상승되지는 않으나, 항체 역가의 신속한 증가가 N1G4 또는 G1N2를 투여받은 동물에서 는 관찰된다.
실시예 28
재배열된 N 및 G 유전자를 함유하는 바이러스의 접종 후 중화 항체 역가
챌린지 시점에서 혈청 중의 중화 항체의 수준을 측정한다. 마우스 및 소에서, 중화 항체는 VSV 감염을 방어하는 중요한 인자이다. 챌린지 당일에 마우스에서 채혈하여, 혈청 샘플을 Vero-76 세포에서 표준 플라크-감소 검정시 야생형 VSV를 중화시키는 이의 능력에 대해 검정한다. 플라크 수를 50% 감소시키는 최대 희석율의 역수를 계산하여 혈청의 중화 역가를 측정한다.
재배열된 게놈을 갖는 모든 바이러스는 마우스내에서 혈청 중화 항체를 생성시킨다(도 23a). 중화 항체는 N1G4 또는 G1N2의 1 또는 10pfu/마우스의 투여량에서 검출되지 않으나, 바이러스 둘 다는 100pfu의 투여량에서 검출가능한 역가를 유도하고, G1N2에 대한 반응은 야생형 바이러스의 것보다 10배 높다. 따라서, N1G4 및 G1N2의 경우에 중화 항체의 수준은 세포 배양물에서의 바이러스 복제와 관련되어 있지 않으며, 여기서, 야생형 바이러스는 G1N2보다 2 및 3배 더 풍부하게 복제한다(도 19). 이러한 결과는 복제능력이 현저하게 감소함에도 불구하고 야생형 바이러스보다 대략 10배 더 높은 역가를 유도하는 G3N4 및 G1N4에 대한 반응에 의해 강화된다.
요약하면, 감염 세포내에서 과발현된 G 및 저발현된 N을 갖는 바이러스는 비내 접종 후 야생형 바이러스(N1G4)와 비교할 때 중화 항체의 수준이 증가한다. 과발현되는 G 및 저발현되는 N의 조합은 중화 항체의 상응하는 보다 높은 역가를 유도하는 투여량의 투여를 가능하도록 하는 면역원성을 바이러스 약독화와 더불어 증가시킨다. 더우기, 이들 바이러스의 보다 낮은 치사율로 인하여, 100배 이상의 바이러스가 손상없이 투여될 수 있으며, 이러한 조건하에서 이들은 야생형 바이러스와 반응시 획득가능한 것보다 100배 이상의 중화 항체를 유도한다.
실시예 29
야생형 바이러스를 사용한 챌린지로부터 마우스의 방어
이들 결과는 G 단백질을 과발현시키는 바이러스의 비병원성 투여량이 마우스에서 현저한 체액 면역 반응을 유도할 수 있음을 입증한다. 재배열된 바이러스를 사용한 면역화가 VSV 질병에 대해 방어할 수 있는지를 알아보기 위해, 재배열된 바이러스 각각을 사용하여 접종시켜 생존한 동물을 5.4 X 106PFU의 야생형 바이러스로 21일 후에 챌린지시킨다. 이러한 투여량은 비접종된 동일-연령 대조군 동물을 83% 사멸시키기에 충분한 양이다.
재배열된 게놈을 갖는 모든 바이러스는 방어능을 부여하며, 이의 수준은 접종량에 따라 변한다(도 23b). N1G4 및 G1N2에 의해 유도된 방어 수준은 서로 유사하며, 이는 이미 기술된 상기 바이러스의 비교가능한 수준의 복제율 및 치사율을 반영한다(도 19 및 표 4). 유사하게는, G1N4에 의해 부여된 방어는 G3N4의 것과 유사하다. 접종 후 제21일까지, 바이러스 둘 다는 마우스당 1,000PFU의 투여량에서 완전한 면역원성을 유도한다. 중요하게는, 이들 완전 방어량은 상응하는 LD50 값보다 20 내지 100배 적다. 이러한 사실은 유전자 재배열이 VSV의 표현형을 체계적으로 변화시켜 약독화 생 백신의 요구되는 특성을 최적화시키는데 효과적인 방법임을 입증한다.
논의
본 발명은 (-)-쇄 RNA 바이러스내 유전자 순서가 유전자 발현 수준을 결정한다는 사실을 입증한다. 유전자 순서는 재배열할 수 있으며, 재배열된 바이러스 유전자의 발현 수준은 전사에서 3' 프로모터에 대해 상대적인 이의 위치를 반영한다. N(뉴클레오캡시드) 유전자와 같은 복제에 필수적인 단일 유전자를 바이러스 게놈 하류의 연속적인 위치로 재배열시킴에 의해, 세포 배양물에서 성장 잠재력 및 마우스에 대한 바이러스 치사율에 단계적 방식으로 영향을 미칠 수 있다. 따라서, 이러한 데이터는 단계적 방식으로의 이들 바이러스의 약독화 수단을 입증한다. N4(3'-PMGNL-5')와 같은 약독화된 바이러스는, 약독화 백신 후보물로서 바람직한 특성인, 바이러스의 치사량 및 방어량이 1000배 이상으로 차이난다.
또한, 본 발명은 곤충 외래 유전자를 (-)-쇄 바이러스의 게놈내로 삽입시킬 수 있고, 외래 유전자를 발현시키는 감염성 바이러스를 회수할 수 있음을 입증한다. 외래 유전자의 발현 수준은 유전자가 삽입된 3' 말단에 대해 상대적인 게놈내 위치에 의해 조절할 수 있다. 외래 물질을 제공하기 위한 이러한 바이러스의 능력은 이들이 나선형 리보뉴클레오캡시드를 보유함으로써, 뉴클레오캡시드 및 바이러스 둘 다가 게놈 크기가 증가함에 따라 더욱 커질 수 있다는 사실에 가장 기초한다.
본 발명의 방법은 백신용의 약독화된 바이러스를 개발하는데 사용할 수 있으며, 당해 방법은 게놈 조직화 및 과 구성원에 대한 유전자 발현의 조절 메카니즘에 대한 밀접한 유사성을 기초로 모노네가비랄레스의 다수 구성원에 적용가능하다. 모노네가비랄레스는 광견병과 같은 라브도바이러스, 홍역, 파라인플루엔자바이러스 및 호흡기 합포체 바이러스와 같은 파라믹소바이러스, 및 에볼라 및 마르부르크와 같은 필로바이러스를 포함한다.
모노네가비랄레스의 cDNA 클론으로부터 감염성 바이러스의 회수는 바이러스 게놈의 실험적 조작을 허용한다. 이들 바이러스내 유전자 발현은 바이러스 게놈의 3' 말단에서 단일 프로모터에 대한 유전자의 순서에 의해 전사 수준으로 조절된다. 게놈에 다른 변화를 도입시키지 않고 유전자 순서를 재배열하는 방법은 개발되어 있다. 유전자 재배열은 예상되는 바와 같이 바이러스 단백질의 상대적인 합성 수준을 변경시키고, 각종의 상이한 표현형을 갖는 감염성 바이러스를 생산한다. 현재의 연구는 유전자 순서에 있어 프로모터와 근접한 위치에서 첫번째로의 바이러스의 주요 중화 에피토프를 암호화하는 G 단백질 유전자의 이동 결과를 시험한다. 감염 세포내에서 G 단백질의 발현은 이의 유전자가 제4 위치에서 제1 위치로 이동하는 경우에 현저히 증가한다. 그러나, 정제된 바이러스 입자의 단백질 함량은 바이러스 유전자 순서의 변화에 의해 크게 영향받지 않는다.
이러한 바이러스에 의한 G 단백질의 과발현은 이들이 동물내 변경된 체액 면역 반응을 유도하는지를 조사하도록 한다. 도 22의 데이터는 100pfu의 접종량에서, 야생형 바이러스와 비교할 때 프로모터에 근접한 위치로 이동한 G를 갖는 바이러스로 감염시킨 동물에서 보다 신속하고 높은 농도로 항체가 생성됨을 나타낸다. 100PFU보다 높은 투여량은 이들의 치사율로 인하여 N1G4 야생형 및 G1N2 바이러스에 대해 검정될 수 없다. 100pfu의 투여량에서 비교할 때, 바이러스 G1N2, G3N4 및 G1N4 모두는 야생형 바이러스보다 더욱 신속하게 보다 높은 항체 역가를 유도한다. G1N4 및 G3N4 바이러스의 감소된 치사율은 투여될 용량을 더욱 높이며, 이 경우에 항체 농도는 낮은 투여량보다 더욱 신속하게 증가한다.
G가 프로모터와 근접한 위치로 이동된 3개의 바이러스 모두가 마우스에서 향상된 체액 면역 반응을 생성한다는 관찰은 이러한 시스템에서 방어 면역원성의 이해와 관련된다. 비록 면역 반응의 유도에 가장 관련되어 있는 세포내 다양한 접종물의 상대적인 접종 수준은 공지되어 있지 않으나, 이들은 적어도 정성적으로 세포 배양물에서 관찰되는 상대적인 복제 수준을 반영하는 것으로 여겨진다. 이 경우, G1N2, G3N4 및 G1N4는 제1회의 복제 동안에만 접종된 마우스당 보다 높은 농도의 G 단백질을 발현시킨다. 이후, 야생형 바이러스의 더욱 강한 복제는 이의 보다 약한 G 단백질 합성에 대해 상쇄되는 것보다 더욱 높다. 마우스당 100PFU의 동일한 접종량에서, 변이체 바이러스는 야생형 바이러스가 접종된 동물과 비교하여 증진되고 촉진된 체액 면역 반응을 생성한다. 감염된 세포에서 G 단백질 합성율의 최적의 증가는 바이러스 복제가 실질적으로 약독화되는 경우에도, 면역 반응에 있어 현저한 효과를 발휘한다.
이러한 결과는 체액 면역 반응의 동역학 및 크기가 감염의 매우 초기에 확립됨을 제시한다. 면역 반응 정도가 비가역적으로 확립되는 동안 짧은 일시적 윈도우가 존재하거나, VSV 감염에 대한 면역 반응이 전체 면역원성에 의해서라기 보다는 오히려 감염된 세포당 G 단백질 합성 수준에 의해 어느 정도 결정된다. 유사한 결론이, 이들이 복제 불가능한 조건하에서 재조합 카나리폭스 벡터를 사용하는 백신의 효능에 의해 제안된다. 고도로 약독화된 벡터에 의한 항원의 강한 합성은 추가의 연구를 보증하는 효과적인 백신 방법인 것으로 여겨진다.
N 유전자의 위치 및 N 단백질 발현 수준은 복제율과 관련되는데, 이는 N 단백질이 게놈 RNA 복제를 위해 화학량론적 양으로 요구되기 때문이다. 야생형 바이러스 N1G4는 최고 역가로 복제하며, 이어서 바이러스 G1N2 및 바이러스 G1N4와 G3N4는 최소한 잘 복제한다. 그러나, 바이러스 G1N4 및 바이러스 G3N4가 제4 위치에 N 유전자를 보유한다 하더라도 바이러스 G1N4가 바이러스 G3N4보다 더욱 현저히 복제한다. 이들 바이러스 모두는 자손 바이러스의 형성이 N 단백질의 공급에 의해 제한되는 경우 예상될 수 있는 바와 같이 지연된 복제 동역학을 나타낸다.
절대량의 N 단백질 외에, N 및 P 단백질의 상대적 수준은 효율적인 복제에 있어 중요하다. P 단백질의 하나의 기능은 가용성 상태의 N 단백질을 유지함으로써, 새로이 복제된 RNA의 캡시드화를 보조하는 것이다. 이와 일치하여, 바이러스 G1N2는 N 단백질 발현이 감소되어 있지만(도 18a 및 18c), 야생형 바이러스 N1G4와 동일한 상대적 순서로 N 및 P 유전자를 갖는다(도 17). 따라서, G1N2는 N 및 P 단백질을 야생형 바이러스와 동일한 상대적 비, 즉 각각 1:0.8 및 1:0.7의 비로 발현시킨다. 이와 일치하여, 바이러스 G1N2는 야생형 바이러스보다 단지 약간만 복제한다. 이외에 추가로, 바이러스 G1N4 및 G3N4 둘 다가 제4 위치에 N을 보유하지만, G1N4는 G3N4보다 실질적으로 더욱 우수하게 복제한다(도 19). N 및 P 단백질의 합성율간의 비는 이들 단백질 모두에서 야생형으로부터 구별된다. 그러나, 제1 위치에서 P를 보유하는 바이러스 G3N4는 감염된 세포내에서 1:1.8의 N 대 P의 비를 갖지만, P가 제2 위치에 있는 경우에 G1N4로 감염된 세포내에서 N:P의 비는 야생형 바이러스와 거의 근접하는 1:1.6이다. 또한, G 단백질 발현율에 있어서 이들 2개의 바이러스는 차이가 있으며, G 단백질의 증가된 농도가 바이러스 G1N4의 복제에 이점을 제공할 수 있다.
유전자가 재배열된 바이러스의 감소된 치사율은 또한 마우스에서 치사율의 감쇠가 복제능 감소와 관련되어 있음을 나타내는 사실과 일치한다. 감소된 복제는 최종적으로 상기 기술한 바와 같이 N 단백질의 총 발현 수준 및 N 대 P 비율과 관련된다. 명백하게는, 제1 위치로 G 유전자를 이동시키는 특정 유전자 재배열은 야생형 위치로부터 N 유전자를 교체시킬 것이므로, N 단백질 발현을 감소시킨다. 이는 또한 서로 관련되어 있는 단백질 유전자 위치가 문제의 재배열에 의해 변경되어 단백질의 분자비를 변경시킬 것이다. 변화 유형 모두는 복제율 및 치사율을 변경시킬 것으로 예상된다. 표 4의 데이터는 가장 우수하게 복제하는 바이러스인 야생형 바이러스 및 G1N2가 LD50 투여량을 달성하기 위해 단지 50 내지 100PFU만을 필요로 하는 반면, 치사량의 경우에는 200 내지 1,000배 이상의 G1N4와 G3N4 바이러스가 각각 요구됨을 나타낸다.
본원에 제시된 자료는, 유전자의 재배열이 바이러스 표현형의 2가지 중요한 국면, 즉 치사율 및 중화 항체의 자극의 조작을 허용함을 나타낸다. N 단백질 발현을 감소시키고, N:P의 비를 변경시킴에 의해, 동물에 대한 복제율 및 치사율을 감소시키는 것이 가능하며, G 단백질 발현을 증가시킴에 의해, 동역학 및 항체 합성 수준을 변경시키는 것이 가능하다.
이러한 결과는 유전자 재배열을 사용하여 신규의 유리한 표현형을 갖는 바이러스를 생성할 수 있음을 입증한다. 이러한 접근법은 표현형을 단계별 방식으로 변경시켜 바람직한 수준으로 약독화시키거나 특정 유전자의 발현을 변경할 수 있는 능력을 제공한다. 이는 약독화된 생 백신 후보물을 생성하고 조작하는데 요구되는 약독화 수준 및 면역원성 수준이 독립적으로 및 체계적으로 조절되도록 한다. 이러한 접근법은 단일의 3' 프로모터로부터 기원하는 강제적인 후속적 전사를 통해 유전자 발현을 조절하는 통상의 메카니즘을 갖는 모노네가빌라레스의 다른 모든 구성 바이러스에도 적용가능하여야 한다. 더우기, 모노네가비랄레스의 바이러스는 상동 재조합을 겪지 않는 것으로 밝혀졌으므로, 유전자 순서에 대해 이루어진 변화는 천연 공정에 의해서는 비가역적이어야 한다. 수개의 외래 유전자가 VSV로부터 발현되어 있으며, 한 연구에서는 상응하는 병원체에 대해 마우스를 방어하였다. VSV의 이러한 특성은 VSV 자체에 대해 지시되거나 다른 병원체에 대해 지시된 미래의 백신을 생성하는 탁월한 후보물이 되도록 한다. 천연 숙주에서 G1N2, G3N4 및 G1N4 바이러스의 병원성 및 면역원성을 평가하기 위해 고안된 연구는 하기 방식으로 수행한다.
실시예 30
수포성 구내염 바이러스(VSV)에서의 유전자의 재배열은 천연 숙주에서의 임상 질환을 제거한다
VSV에 대한 서브유니트- 또는 DNA-매개된 백신을 개발하기 위한 노력은 한정된 성공을 거두었다. 생 야생 균주로의 면역화는 응급 상태하에서만 시도하였다. 그러나, 생 약독화 백신은 또 다른 라브도바이러스, 광견병 바이러스에 대한 생 약독화 바이러스의 성공 및 사용에도 불구하고 VSV에 대해 연구되지 않았다. 현재, VSV 감염에 대한 만족스러운 백신은 존재하지 않는다.
VSV의 3종의 천연 숙주 중 하나인 돼지에서 복제하고, 발병시키고, 방어 면역 반응을 유발하는 능력에 대한 VSV의 유전자의 재배열의 효과를 하기 실시예에서 조사하였다. 결과는, 뉴클레오캡시드 단백질 유전자를 단일 전사 프로모터로부터 멀리 이동시키면, 질환을 일으키는 바이러스의 잠재력이 약독화되고 궁극적으로 제거된다는 것을 보여준다. 이러한 변화와 표면 당단백질 유전자의 재배치와의 조합으로 야생형 VSV로의 챌린지에 대해 방어된 백신을 수득한다. 바이러스 특성의 증분 조작에 의해, 유전자 재배열은 상기 부류의 바이러스에 대한 생 약독화 백신을 생성시키는 신규한 접근법을 제공한다.
지역 사육자로부터 구입한 20마리의 암컷 요크셔 돼지(8 내지 10주령 및 25 내지 30kg)를 4마리 동물의 5그룹으로 무작위로 분배하고, 각각의 그룹을 플럼 아일랜드 질병 센터에서 생물안전도 3(BL-3) 분리 조건하에 격리실에 수용한다. 모든 동물은 혈청 중화 항체 검정법을 기초로 하여 VSV에 대해 음성이다. 동물의 체온 및 행동을 매일 모니터링하고, 바이러스 분리 및 항체 적정을 위한 샘플을 각각의 격리실에의 참가자에 대해 변경시킨 개체에게 방어 의류 및 휴대용 HEPA 호흡기를 착용하게 함으로써 하기한 바와 같은 간격으로 수집한다.
재배열된 게놈, 3'-G-N-P-M-L-5'(G1N2), 3'-P-M-G-N-L-5'(G3N4) 및 3'-G-P-M-N-L-5'(G1N4)를 갖는 바이러스는 상기한 바와 같은 VSV-IN의 감염성 cDNA 클론으로부터 유래한다. 바이러스 N1G4(WT) 및 G1N2를 37℃에서 형질감염된 세포로부터 회수하고; 바이러스 G3N4 및 G1N4를 단지 31℃에서 형질감염된 세포로부터 회수한다. 이전에 보고된 바와 같이, N 유전자가 프로모터 원위로 이동된 바이러스의 복제는 유전자의 순서에 따라 다양한 정도로 온도 민감성이다. 세포 배양물내에서 상기 바이러스를 사용하는 모든 후속적인 작업은 달리 명시하지 않는 한 각각의 온도에서 수행한다.
크실라진-케타민-테라졸로 진정시킨 동물의 코의 표피를 듀얼-팁 스킨 테스트 어플리케이터(Duotip-Test; Lincoln Diagnostics, Decatur, I11.)를 사용하여 20회 벗겨내고, 바이러스 2.5 x 107PFU를 둘베코 변형 이글 배지(DMEM) 100ul 중의 난절된 부위에 위치시킨다. 난절 과정을 반복함으로써 접종물하의 부위를 재감작화시키고, 동물을 접종물이 부위에 유입될 때까지 고정된 위치에 감금시킨다. 대조군 동물을 동일한 방식으로 처리하고, DMEM 100ul를 단독으로 제공한다. 바이러스 제제는 모두 접종 과정 후에 원 역가의 4배 이내이다. 식도-인두액(OPF)을 변형된 인두 또는 프로방 스크레이퍼를 이용하여 바이러스 접종 전후에 여러 시점에서 획득한다. 비강 스왑 및 혈청 샘플을 바이러스 접종 전후에 여러 시점에서 취한다. 발현된 임의의 병소의 스왑을 또한 취하고, 바이러스 분리에 의해 시험한다. 스왑 및 OPF 샘플을 항생제-함유 DMEM내로 수집한다.
1차 접종 후 제36일에, 상기한 바와 같은 코 상피의 난절 및 접종에 의해 N1G4의 동물당 4.2 x107PFU로 돼지를 챌린지시킨다. 동물의 체온 및 행동을 매일 기준으로 모니터링하고, 혈청 샘플을 상기한 바와 같이 수집한다.
샘플을 원심분리에 의해 청정화시킨 후에 96-웰 플레이트내에서 BHK-21 세포 단층 상에 접종함으로써, 비강 스왑, OPF 및 병소 스왑을 바이러스의 존재에 대해 분석한다. 상등액을 연속 희석하고, 사중 웰에서 세포에 첨가한다. N1G4 및 G1N2가 제공된 동물로부터의 샘플을 37℃에서 3일 동안 배양하는 한편, G1N4 및 G3N4로부터의 샘플을 31℃에서 4일 동안 배양한다.
혈청을 수집하여, 56℃에서 30분 동안 가열 불활성화시킨다. 혈청의 12배 연속 희석액을 ml당 N1G4의 50% 조직 배양 감염량으로 37℃에서 1시간 동안 배양한다. 샘플을 96-웰 플레이트내에서 사중 검정법으로 BHK-21 세포에 첨가하고, 37℃에서 3일 동안 배양하고, 10% 포름알데히드로 고정화시키고, 크리스탈 바이올렛으로 염색한다. 야생형 N1G4 VSV의 CPE의 100% 억제율을 제공하는 희석율의 역수를 기록한다.
세포병변 효과에 대해 양성인 배양 웰을 수집하고, 바이러스 분리물의 동정을 VSV-특이적 프라이머를 사용하는 RT-PCR에 의해 확인한다. VSV 프라이머는 이들이 재배열된 바이러스 게놈 사이에서 판별가능하도록 고안한다. 유전자 표적(N, P, M, G 또는 L), 뉴클레오타이드 위치 및 센스, 즉 정방향(f) 또는 역방향(r) 표시 뒤에 명명된 프라이머는 야생형 순서에 대해 N-1314f/P-1956r 및 M-2844f/G-3198r, G1N2에 대해 G-4284f/N-121r 및 M-2844f/L4925r, G3N4에 대해 G-4284f/N-121r 및 N-1314f/L-4925r, 및 G1N4에 대해 G4284f/P-1956r이다.
상이한 바이러스로의 접종으로부터 발병된 질환의 범위는 생성된 병소의 크기 및 위치를 기준으로 하는 임상 득점 시스템을 이용하여 병소 형성을 판단함으로써 평가한다. 0점은 가시적 병소의 부재를 지시하고, 1점은 접종 부위에서 발생하고 직경이 2cm 미만인 병소에 대해 제공되고; 2점은 직경이 2cm보다 큰 병소 또는 접종 부위에서의 다수의 병소를 지시하고; 3점은 비접종 부위에서의 2cm 미만의 병소를 지시하고; 4점은 2cm보다 큰 병소 또는 비접종 부위에서의 다수의 병소를 지시한다. 4점보다 큰 점수는 단일 동물에서 발생하는 1종 이상의 병소(들)로부터 축적할 수 있다.
실시예 31
돼지에서의 조작된 바이러스의 발병기전
도 24에 도식된 바와 같이 유전자 순서에서 첫번째로부터 두번째 또는 네번째로 이동된 N 유전자 및 유전자 순서에서 네번째로부터 첫번째 또는 세번째로 이동된 G 유전자를 갖는 바이러스의 발병성을 VSV의 천연 숙주인 돼지에서 야생형 유전자 순서를 갖는 바이러스의 것과 비교한다. 4마리의 어린 수컷 요크셔 돼지의 그룹을 다음의 바이러스: N1G4(WT), G1N2, G3N4 또는 G1N4 중 하나의 동물당 2.5 x 107PFU로 코의 난절에 의해 피내로 접종한다. 제5 그룹을 배양 배지 단독으로 접종하고, 모의-감염된 대조군으로서 유지시킨다. 각각의 그룹을 BL-3 조건하에 별개의 격리실에 유지시키고, VSV 감염의 특성인 수포성 병소의 형성에 대해 및 직장 체온에 대해 매일 모니터링한다.
접종 후 제2일경에, 직경이 2cm 미만인 수포가 야생형 N1G4 바이러스가 제공된 모든 동물의 접종 부위에서 발병된다. 이후, N1G4-접종된 동물에서의 병소가 접종 후 제3일 및 제4일경에 직경 2cm보다 큰 크기로 증가하고, 다수의 병소가 발병된다. 병소가 접종 후 제3일에 코에서 발현될 때 상기 병소의 예를 도 24a에 도시한다. 4종의 상이한 바이러스 중 하나로 접종된 각각의 돼지의 경시적 임상 점수를 도 25에 요약한다. 임상 점수는 상기한 바와 같이 발생된 병소의 크기, 수 및 분포에 의해 결정한다. 4마리의 N1G4-접종된 돼지 중 3마리에서, 병소는 코에 국한되어 잔류한다(도 24a 및 도 25a). 그러나, N1G4-접종된 돼지 중 1마리는 이의 발굽 상에서 수포를 발현하고, 또 다른 1마리는 혀에서 수포를 발현하여, 이의 임상 점수를 6으로 증가시킨다(도 25a). 일반적으로는, 이들 병소의 크기, 분포 및 중증도는 VSV-IN의 야생 분리물에 의해 야기된 것과는 식별가능하지 않다. N1G4 야생형 VSV-IN을 본 발명의 cDNA 클론으로부터 회수하여, 회수 이후 재조합 바이러스가 세포 배양에서 다수의 시점에서 증식하고 동물을 통해 계대하지 않은 사실에도 불구하고, VSV-IN의 야생 분리물과 동등한 임상을 야기하는 상기 연구에서 사용함은 주목할 만하다.
G1N2 바이러스로의 접종은 모든 돼지에서 제2일경에 접종 부위에서 소형 수포(<2cm)의 형성을 야기한다. 그러나, 야생형 N1G4 바이러스에 의해 야기된 발병기전과는 대조적으로, G1N2 접종된 돼지에서 존재하는 수포는 시간에 따라 크기가 증가하지 않으며, 다수의 병소도 발현되지 않는다. 또한, G1N2-접종된 동물에서의 병소는 접종 부위에 국한된다. N1G4- 및 G1N2-접종된 동물 양쪽의 경우에, 병소는 제2일에 발병되기 시작한다. 병소는 N1G4 야생형 바이러스로 접종된 동물에서 제9일까지 가시적으로 잔류하며, 이후에 감염된 조직의 치유가 명백해진다. 대조적으로, G1N2-감염된 동물에서의 병소는 제6일경에 완전히 치유된다. 전반적으로, G1N2 감염으로부터 유발된 임상 징후는 야생형 바이러스에 의해 유발된 것보다 덜 중증이며, 이는 G1N2 바이러스가 부분적으로 약독화되었음을 제시한다.
야생형 또는 G1N2-접종된 동물로부터 관찰된 결과와는 대조적으로, G3N4 또는 G1N4가 제공된 동물에서는 수포가 전혀 관찰되지 않으며(도 24 및 25, C 및 D), 이는 이들 바이러스가 고도로 약독화되었음을 제시한다. 매일의 직장 체온에서의 변화는 어떠한 동물에서도 관찰되지 않는다(데이터 제시하지 않음). 이는 거의 발열시키지 않는 야생 VSV 분리물의 피내 접종의 이전 결과와 일치한다. DMEM이 단독 제공된 모의-접종된 동물은 접종 과정에 대한 부작용을 전혀 나타내지 않는다(데이터 제시하지 않음).
요약하면, 제1 위치에서 N을 갖는 야생형 바이러스, N1G4는 VSV 인디애나 야생 분리물에서 관찰되는 것과 유사한 질환을 발병시키는 반면, 제2 위치에서 N을 갖는 G1N2는 감소된 임상 증상을 유발한다. 제4 위치에서 N을 갖는 바이러스, G1N4 또는 G3N4는 검출가능한 질환을 발병시키지 않는다. 함께 고려하면, 이들 결과는 N 유전자의 프로모터로부터 떨어진 연속 위치로의 전위가 임상 질환의 점진적 감소를 유도함을 제시한다.
실시예 32
돼지에서의 접종 후의 바이러스 분리
바이러스의 투여 후의 복제 능력에 대해 조사하기 위해, 감염의 신뢰가능한 지표인 비강 스왑 및 OPF를 상기한 바와 같이 바이러스에 대해 검정한다. 바이러스를 N1G4(WT)가 제공된 모든 동물로부터의 비강 스왑 및 OPF 샘플로부터 제1일 내지 제6일에 회수한다(도 26). 또한, 바이러스를 감염 후 제1일에 시작하여 G1N2가 제공된 모든 동물로부터 회수한다. 그러나, 제7일에 하나의 샘플을 제외하고는, G1N2 바이러스는 일반적으로 제5일 후에 분리하지 않는다. 비강 및 OPF 샘플 이외에, 바이러스를 N1G4가 제공된 모든 동물에서 제6일에 이르기까지 접종 부위로부터 취한 스왑으로부터 동정한다. 이는 바이러스가 1마리 동물의 코로부터 분리되지 않는 G1N2 제공된 그룹과는 대조적이고, 어떠한 바이러스도 나머지 동물에서 제3일 내지 제4일 이후에 코에서 발견되지 않으며, 이는 다시 한번 이들 바이러스에 대해 약독화된 표현형을 제시한다.
N1G4 및 G1N2를 유사한 샘플에서 검출할 수 있는 상대적 용이함에도 불구하고, 바이러스가 G3N4 또는 G1N4가 제공된 동물로부터 OPF 또는 비강 샘플로부터 회수되지 않는다(도 26). 또한, G3N4 또는 G1N4 바이러스는 코의 접종 부위의 스왑으로부터 회수되지 않는다(데이터는 제시하지 않음). 이들 데이터는 이들 바이러스가 돼지에서 복제에 대해 고도로 약독화되어 있음을 제시한다.
N1G4- 및 G1N2-감염된 동물로부터 회수된 바이러스가 생체내 계대 후에 유전자적으로 안정한지의 여부를 시험하기 위해, 바이러스-양성 배양물의 선택으로부터의 바이러스 RNA를 추출하고, 각각의 바이러스에 유일한 유전자 말단 및 유전자 연결부를 프라이머의 특이적 세트를 사용하는 RT-PCR에 의해 증폭시킨다. PCR 산물을 관련된 유전자 연결부에 걸쳐 서열 분석한다. 유전자 순서에서 또는 유전자 말단 또는 유전자가 연결부의 서열에서 어떠한 변화도 관찰되지 않으며(데이터 제시하지 않음), 이는 재배열된 유전자 순서가 천연 숙주내에서의 복제 동안 안정함을 제시한다.
실시예 33
재배열된 바이러스로 접종된 돼지에서의 체액 면역 반응
체액 면역 반응을 자극하는 야생형 및 재배열된 바이러스의 능력을 혈청에 존재하는 중화 항체의 수준을 접종 후 여러 시점에서 평가함으로써 측정한다. N1G4(WT)-접종된 동물의 혈청 중의 중화 항체 수준은 2.5 내지 4.0 log10의 범위이며, 면역화 후 제7일경에 2.9 log10의 평균 역가를 갖는다(도 27a). 중화 항체의 이들 수준은 관찰 4주 동안 계속 유지된다. G1N2가 제공된 동물은 유사하게 높은 역가를 가지며, 제7일경에 2.9 log10의 평균 역가를 가지고, 역가는 연구 기간 전체에 걸쳐 높게 유지된다(도 27b). G3N4가 제공된 동물은 중화 항체 역가의 2.0 log10의 평균 값으로의 상승을 나타낸다. 이들 값은 N1G4 또는 G1N2 접종 후에 관찰되는 역가보다 10배 낮지만 G3N4 바이러스가 비강 스왑 또는 OPF 샘플에서의 검출가능한 수준의 복제 바이러스의 부재하에 단일 접종에 대한 체액 반응을 자극할 수 있음을 제시한다(도 27c).
G1N4 바이러스가 제공된 동물은 배경값 수준을 초과하는 단지 검출가능한 역가에서의 매우 낮은 상승을 나타내고, 이들 역가는 시간에 따라 실질적으로 증가하지 않는다(도 27d). 이러한 불량한 반응의 결과로서, 이들 그룹내의 동물을 돼지당 G1N4 바이러스 5.7 X 107PFU로 제28일에 재접종한다. 어떠한 임상 증상도 이들 동물에서 검출되지 않는다. 혈청을 제7일 이후에 수집하며, 모든 4마리 동물에서 3.3 log10로의 급격한 역가 상승이 관찰된다(도 27d). 이들 데이터는 상기 동물에서 복제하는 바이러스를 검출하는 본 발명자들의 무능력에도 불구하고 이들 동물이 면역화 후의 제7일에 N1G4 야생형 바이러스를 사용하여 관찰되는 크기와 동일하거나 이보다 더 큰 추가 접종 후의 제7일에 면역 반응을 갖도록 프라이밍되었음을 제시한다.
실시예 34
재배열된 유전자 순서를 갖는 바이러스는 천연 숙주에서의 야생형 바이러스 챌린지에 대해 방어하는 능력을 갖는다
재배열된 바이러스의 백신 잠재력을 평가하기 위해, 모든 바이러스-접종된 동물 및 모의-접종된 대조군을 바이러스의 1차 투여 후 제36일에 및 G1N4 그룹의 2차 접종 후 제7일에 돼지당 야생형 N1G4 바이러스 4.2 X 107PFU로 챌린지시킨다. 챌린지 경로는 1차 접종에 대해 사용되는 것과 동일하며, 즉 코의 상피의 난절을 통해서이다. 동물을 임상 증상에 대해 관찰하고, 상기한 바와 같이 점수를 매긴다. 또한, 비강 스왑 및 OPF 샘플을 챌린지 후 제1주 동안 매일 취하고, 바이러스의 존재에 대해 검정한다.
챌린지 후에, N1G4, G1N2 또는 G1N4로 접종된 그룹으로부터의 동물 중 어느 것에서도 어떠한 병소도 검출되지 않으며, 이는 이들 동물이 임상 질환으로부터 완전하게 방어하였음을 제시한다(도 28a, b 및 d). G3N4가 제공된 동물에서는 부분 방어가 획득되며, 2마리의 동물에서 챌린지 후 제2일 내지 제4일에 병소가 가시적으로 발현되기 시작한다. 병소는 한 경우에는 소형(<2cm)이고, 나머지 경우에서는 >2cm이다. 양쪽 경우에서, 병소는 단지 접종 부위에서 존재하고, 제5일경에 완전하게 치유된다(도 28c).
대조적으로, 비백신화 대조군의 모든 동물은 병소를 챌린지 후 제1일 및 제2일에 시작하여 제5일까지 지속적으로 발현된다(도 28e). 초기에, 병소는 소형(<2cm)이나, 이들은 모든 경우에 >2cm로 증가한다. 4마리의 동물 중 3마리에서, 병소는 접종 부위 이외의 부위에서 존재하고; 2가지 경우에 병소는 혀에서 발현되고, 나머지에서 이들은 발굽의 관상대 상에서 발현된다.
바이러스는 제1일에 시작하여 제5일까지 연장하여 챌린지된 비백신화 대조군 동물 모두의 비강 스왑 또는 OPF로부터 회수되고, 이는 임상 데이터를 입증한다(도 29). 바이러스를 챌린지 후에 코에서 병소를 발현하는 2마리의 G3N4-접종된 동물의 비강 스왑으로부터 제1일 내지 제3일에 회수하며; 어떠한 병소도 가지지 않는 G3N4-접종된 동물로부터 챌리지 후에 바이러스는 회수되지 않는다(도 29). 챌린지 후에 2마리의 G3N4-면역화 동물로부터 회수된 바이러스가 N1G4 챌린지 바이러스인지 면역화 G3N4 유전자형인지를 결정하기 위해, 바이러스 RNA를 조직 배양 샘플로부터 추출하여, 유전자간 연결부를 RT-PCR에 의해 분석한 다음, 서열 분석한다. 양쪽 동물의 경우에, 회수된 바이러스는 N1G4 챌린지 바이러스인 것으로 밝혀졌다(데이터는 제시하지 않음).
바이러스를 챌린지 후 제1일에 단일 시점에서 N1G4-면역화 그룹으로부터 임상 징후없이 1마리의 동물의 비강 스왑으로부터 배양한다(도 29). 이것이 유입 챌린지 바이러스의 회수물인지 챌린지 바이러스의 복제물인지의 여부는 알 수 없다.
함께 취한 이들 데이터는 임상 증상으로부터의 방어와 중화 항체 역가간의 강력한 연관을 제시한다. 챌린지 후에 질환을 발현하지 않는, G3N4로 면역화된 2마리의 동물은 챌린지 이전에 보다 높은 항체 역가를 갖는다(2.1 및 2.3 log10).
중화 항체 역가를 챌린지 당일 및 이후 제3일, 제5일 및 제7일에 모든 동물에 대해 분석한다. 챌린지 시점에 이미 높은, N1G4로 면역화된 동물의 역가는 그 당시 수준 근처로 유지되며, 경미하게 증가한다(도 30a). G1N2로 초기에 면역화된 동물은 챌린지 후 제5일 내지 제7일경에 역가가 N1G4를 사용하여 관찰된 것과 거의 유사한 수준으로 약 10배 상승함을 경험한다(도 30b). 챌린지 시점에서 가장 낮은 역가(1.9 log10)를 갖는, G3N4로 면역화된 동물은 챌린지 후 제3일 내지 제5일에 야생형을 사용하여 관찰된 것과 동등한 수준으로 거의 100배 증가된 역가를 나타낸다(도 30c). 제28일에 낮은 역가를 가지고, 챌린지 7일 전에 2차 면역화가 제공된 G1N4-면역화된 동물은 추가 접종에 의해 달성된 높은 역가를 유지하나, 챌린지 후의 추가의 상승을 경험하지 않는다(도 30d).
논의
위에서 제시된 데이터는 VSV의 뉴클레오캡시드 유전자를 이의 발현을 하향조절하는 연속적인 프로모터-원거리 위치로 이동하는 것이 천연 숙주에서 임상 질환의 계통적 및 단계적 감소를 유발함을 제시한다. 이는 (-)-쇄 RNA 바이러스에 의해 발병된 임상 질환의 증분 조작을 가능하게 하는 접근법의 최초 보고이다.
두드러지게, 본원에 기재된 cDNA 클론으로부터 회수된 VSV-IN은 야생 분리물에 의한 감염으로부터 관찰된 것과 동등한 가축용 돼지에서의 임상 질환을 발병시킨다. 이는 cDNA 클론으로부터 유래된 VSV를 사용하여 천연 숙주에서 유도된 최초의 임상 질환이다. 또한, cDNA 클론의 유전자를 재배열하여 N 유전자 프로모터를 제2 위치로 원위로 이동시키는 것(G1N2)은 감염된 돼지에서 임상 병소의 범위에서 감소를 유발한다(도 24-25). 돼지에서의 이들 바이러스의 복제는 또한 당해 바이러스가 N1G4 바이러스의 경우보다 짧은 기간 동안 코, 비강 및 OPF 스왑으로부터 회수되었기 때문에 경미하게 약독화된 것으로 보인다(도 26). G1N2 바이러스는 또한 프로모터에 보다 근접하게 이동된 G 유전자를 갖는다. G1N2 바이러스로 감염된 돼지에서의 면역 반응은 야생형의 경우에서 관찰된 것과 거의 동일하다. 이들 발견은 이들 바이러스의 질환 잠재력의 약독화가 N 유전자 발현에서의 감소 및 감소된 복제 잠재력으로 인한 것임을 제시한다. G 유전자의 정방향으로의 이동은 감소된 복제 잠재력을 보충하는데 도움을 주어, 야생형 바이러스로의 접종 후에 수득된 것과 유사한 중화 항체 수준을 달성하는데 일조할 수 있다.
N 유전자의 프로모터로부터 더 멀리 제4 위치로의 이동은 바이러스 G3N4 및 G1N4를 산출하나, 이들 중 어느 것도 천연 숙주에서 임상 질환을 발병시키지 않는다. 이들은 또한 어떠한 바이러스도 접종 후에 코, 비강 또는 OPF 샘플에서 검출할 수 없기 때문에 돼지에서 복제하는 능력에서 감소한다. 이와 부수적으로, 상기 바이러스의 단일 접종에 대한 면역 반응은 N1G4 또는 G1N2의 경우에 관찰되는 것보다 낮은 중화 항체 반응을 유발한다(도 27). 그러나, 돼지에서 극심하게 감소된 복제 잠재력에도 불구하고, 이들 바이러스는 여전히 면역 반응을 유도할 수 있다. G3N4 바이러스는 투여 후에 항체 수준에서 온화한 증가를 나타낸다. 또한, 제36일에 야생형 바이러스로의 챌린지시, G3N4 동물은 5일 이후에 항체 역가에서 100배 증가하여 신속하게 반응한다. 유사하게는, G1N4 바이러스는 1차 접종 후에 낮은 항체 역가를 유도한다. 그러나, G1N4의 2차 추가 접종을 제28일에 투여할 경우에, 1차 투여 후 제7일에 야생형을 사용한 경우에 관찰되는 것과 동등하거나 보다 높은 신속한 반응이 존재한다(도 27).
야생형 바이러스로의 챌린지 후에, N1G4 또는 G1N2로의 단일 접종 또는 G1N4로의 2회 접종이 제공된 어느 동물에서도 어떠한 임상 질환은 관찰되지 않는다. 이들 3그룹에서 존재하는 중화 항체 역가는 모두 챌린지 당일에 높고(도 27), 다양한 경로를 통한 VSV의 야생 분리물로의 가축용 돼지의 접종 후에 보고된 중화 항체 역가와 동일하거나 보다 높다. 4마리의 G3N4-면역화 동물 중 2마리는 챌리지에 대해 방어한다. 이들 동물은 챌린지 전에 가장 높은 중화 항체 역가를 나타내는 것들로 입증되었다. 이들 데이터는 중화 항체 역가와 임상 질환으로부터의 방어와의 강력한 연관을 제시한다. 유사한 발견은 소를 면역화시키는 VSV-G를 발현시키는 재조합 우두 바이러스를 사용하여 보고되어 있다.
또한, 이들 데이터는 이의 감소된 질환 잠재력에도 불구하고 G1N2 바이러스가 단일 접종만으로 야생형 바이러스만큼 강한 방어 면역 반응을 유도할 수 있음을 제시한다. 천연 숙주에서 완전하게 약독화된, 제4 위치에서 N을 갖는 바이러스는 단일 접종 후에 보다 낮은 면역 반응을 나타낸다. 그러나, G1N4로의 단일의 추가 접종은 야생형 바이러스에 의해 유도된 것과 동일한 면역 반응을 유도한다. 따라서, 이들 데이터는 유전자 재배열에 의해 질환 잠재력을 감소시키고, 임상 질환의 부재하에 방어 면역 반응을 유도하기에 충분하도록 복제할 수 있는 바이러스를 여전히 보유할 수 있음을 제시한다.
수포성 구내염은 의무 신고 질환이므로, 모든 생-약독화 백신은 안전하고 유효하여야 할 뿐만 아니라, 가축에서 이의 사용에 대해 승인받기 위해 야생 균주와 식별가능하여야만 한다. 본원에 기재된 데이터는 재배열된 게놈을 갖는 바이러스가 유전자간 영역의 RT-PCR에 의해 야생 균주로부터 용이하게 식별가능함을 제시한다. 또한, cDNA 유래된 바이러스를 사용함으로써, 백신 접종된 동물을 천연적으로 감염된 동물과 식별하기 위해 혈청학적 시험에 사용할 수 있는 특이적 항원 결정기를 결실시키는 것과 같이 특이적 변화를 게놈으로 도입하는 것이 가능하다. 요약하면, 위에서 제시된 데이터는 유전자 재배열이 비분절화된 (-)-쇄 RNA 바이러스에 대해 안정하게 약독화된 생 백신을 개발하는 합리적인 대체 방법을 제공한다.
다음의 참조문헌이 본원에서 인용된다:
Ball, L. A. 1992. J. Virol. 66, 2335-2345.
Ball, L. and C. White. 1976. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73, 442-446.
Barr, J. N. et al., 1997. J. Virol. 71,1797-1801.
Domingo, E. et al., 1996. The FASEB Journal 10, 859-864.
Ferran, M. and J. M. Lucas-Lenard. 1997. J. Virol. 71, 371-377.
Fuerst, T. et al., 1986. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 8122-8126.
Iverson, L. and J. Rose. 1981. Cell 23, 477-484.
Lyles, D. S. et al., 1996. Virology 217, 76-87.
Pattnaik, A. K. and G.W. Wertz. 1990. J. Virol. 64, 2948-2957.
Pattnaik, A. K. et al., 1992. Cell 69, 1011-1020.
Patton, J. P. et al., 1984. J. Virol. 49, 303-309.
Peluso, R. W., and S. A. Moyer. 1988. Virology 162, 369-376.
Pringle, C. R. et al., 1981. J. Virol. 39, 377-389.
Pringle, C. R., and A. J. Easton, 1997. Semin. Virol. 8, 49-57.
Reed, E. J. and H. Muench. 1938. Am. J. Hyg. 27, 493-497.
Sabin, A. and P. Olitsky. 1938. J. Exp. Med. 67, 201-227.
Schnell, M. J. et al., 1996. J. Viol. 70, 2318-2323.
Shechmeister, et al., 1967. Arch. Ges. Virusforsch. 21, 127-132.
Villareal, L. P. et al., 1976. Biochem. 15, 1663.
Wagner, R. 1974. Infection and Immunity 10, 309-315.
Wagner, R. 1996. In Fields Virology (Fields, B. N. and D. M. Knipe eds.) 3rd edition; Lippincott-Raven Press.
Whelan, S. P. J. et al., 1995. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 8388-8392.
Wimmer, E. et al., 1993. Ann. Rev. Genetics. 27, 353-436.
Youngner, J. S. and G. Wertz. 1968. J. Virol. 2, 1360-1361.
본 명세서에서 언급된 모든 특허 또는 공보는 본 발명이 속하는 분야의 숙련가의 수준의 지표이다. 이들 특허 및 공보는 각각의 개별 공보가 참고로 인용됨을 구체적으로 및 개별적으로 나타낸 바와 동일한 정도로 본원에 참고로 인용한다.
당해 분야의 숙련가라면 본 발명은 목적을 수행하고 언급된 목표 및 이점뿐만 아니라 본원에서 본질적인 것을 획득하도록 충분히 적합화되어 있음을 용이하게 인지할 것이다. 본원에 기술된 방법, 과정, 처리, 분자 및/또는 구체적 화합물과 함께 본 실시예는 현재 대표적인 바람직한 양태이고, 예시를 위한 것이며, 본 발명의 범주를 한정하기 위한 것은 아니다. 청구의 범위에 의해 한정된 바와 같은 본 발명의 취지내에 포함되는 이들의 변화 및 다른 용도는 당해 분야에 숙련가에게 상기될 것이다.
본 발명의 상기한 특징, 이점 및 목적뿐만 아니라, 분명하게 밝혀질 기타 사항이 획득되는 내용을 상세하게 이해할 수 있도록, 위에서 간략하게 요약된 본 발명의 보다 상세한 설명은 첨부된 도면에서 도시된 이의 특정한 양태를 참조로 할 수 있다. 이들 도면은 명세서의 일부를 형성한다. 그러나, 첨부된 도면은 본 발명의 바람직한 양태를 예시하는 것이므로, 이들의 범주를 제한하는 것으로 고려하여서는 안됨을 유의하여야만 한다.
도 1은 재배열된 VSV 게놈의 유전자 순서를 도시한다.
도 2는 재배열된 VSV 게놈 cDNA의 생성에 대한 단계적 과정을 도시한다.
도 3a는 유전자 순서 재배열에 대한 cDNA 모듈을 생성시키는데 사용되는 제한 효소의 절단 특이성을 도시한다. PCR을 사용하여, BspMI 또는 BsaI 부위를 VSV의 P, M 및 G 유전자의 각각의 말단과 N 유전자의 3' 말단 및 L 유전자의 5' 말단에 위치시키고, 이에 따라 점착성 말단은 시스트론간 연결부에서 보존된 뉴클레오타이드 중 4개에 상응한다. 도 3b는 유전자 순서 재배열에 대해 클로닝된 VSV 게놈의 단편을 도시한다.
도 4는 재배열된 게놈 N2, N3, N4 및 G1N2의 작제에 대한 방책을 도시한다.
도 5a는 N 또는 L 유전자에 각각 어닐링된 PCR 프라이머의 위치(화살표로 지시함) 및 제한 효소 절단 부위 및 추정된 단편 크기를 나타내는 VSV 게놈의 모식도를 도시한다. 도 5b는 바이러스 GMP, MGP, PGM, PMG, GPM 및 MPG로부터의 바이러스 RNA의 cDNA의 제시된 효소로의 분해 후의 생성물(각각 레인 1-6)을 도시한다. 단편을 에테듐 브로마이드의 존재하에 1% 아가로스 겔 상에서의 전기영동에 의해 분석한다. 레인 M = 제시된 바와 같은 크기를 갖는 마커 DNA 단편.
도 6은 야생형 및 변이체 바이러스로 감염된 BHK-21 세포에서 합성된 바이러스 RNA를 도시한다. 바이러스 RNA를 [3H]우리딘으로 표지화시키고, 아가로스-우레아 겔 상에서의 전기영동에 의해 분리하고, 형광촬영술에 의해 검출한다. 감염성 바이러스는 레인 상에 나타나고, 바이러스 RNA는 좌측에서 동정된다.
도 7은 야생형 및 변이체 바이러스로 감염된 BHK-21 세포에서 합성된 바이러스 단백질을 도시한다. 바이러스 단백질을 [35S]메티오닌으로 표지화시키고, SDS-폴리아크릴아미드 겔 상에서의 전기영동에 의해 분리하고, 자가방사선술에 의해 검출한다. 감염성 바이러스는 레인 상에 나타나고, 바이러스 단백질은 좌측에서 동정된다. Unif = 비감염된 세포.
도 8은 야생형 및 변이체 바이러스로 감염된 BHK-21 세포에서 합성된 단백질의 몰비를 도시한다. 단백질을 표지화시키고, 도 7에 도시된 바와 같이 SDS-폴리아크릴아미드 상에서 분리하고, 형광체 영상화에 의해 정량화한킨다. 몰비는 각각의 단백질: N-14, P-5, M-11, G-10 및 L-60의 메티오닌 함량에 대해 정규화시킨 후에 산출한다.
도 9는 BSC-1 세포에서의 야생형 VSV 및 재배열된 변이체의 단일 단계 성장 곡선을 도시한다. 바이러스 역가를 37℃에서의 3회의 독립적인 단일 단계 성장 실험 동안 각각의 시점에서 이중으로 측정하고, 결과를 평균한다.
도 10은 마우스로의 비내 접종 후의 야생형(wt) 및 변이체 바이러스의 발병기전을 도시한다. 변이체 바이러스 각각의 100PFU를 비내 접종한 동물에서의 시간 경과적 이환율(회색 막대) 및 사망률(흑색 막대)을 도시한다. 시간 경과 후에 어떠한 추가의 변화도 나타나지 않는다.
도 11은 재배열된 바이러스 N1(wt), N2, N3 및 N4로 감염된 BHK-21 세포에서 합성된 바이러스 특이적 RNA를 도시한다. 감염, 표지화 및 분석의 조건은 도 6에 기술된 바와 같다.
도 12는 재배열된 바이러스 N1(wt), N2, N3 및 N4로의 감염 후의 BHK-21 세포에서 합성된 VSV 특이적 단백질의 몰비를 도시한다. 단백질을 도 7에 기술된 바와 같이 분석하고, 몰비를 도 8에 기술된 바와 같이 산출한다.
도 13은 BHK 세포에서의 단일 단계 성장에 의한 N 유전자 전위를 갖는 바이러스의 복제를 도시한다.
도 14는 마우스에 대한 바이러스 N1(wt), N2, N3 및 N4의 상대적 치사율을 도시한다.
도 15는 항체 생성 및 바이러스 N1(wt), N2, N3 및 N4에 대한 치사 감염에 대해 방어하는 능력의 비교를 도시한다.
도 16은 각각의 VSV 유전자간 연결부에서 삽입된 외래 유전자(I)를 함유하는 바이러스로 감염된 BHK-21 세포에서 합성된 바이러스 특이적 RNA를 도시한다. 감염, 표지화 및 분석의 조건은 표지화 시간이 감염 후 2 내지 4.5시간인 것을 제외하고는 도 6에 기술된 바와 같다.
도 17은 변이체 바이러스: N1G4(야생형), G1N2, G3N4 및 G1N4의 유전자 순서를 도시한다.
도 18은 변이체 바이러스로 감염된 BHK-21 세포에서의 바이러스 단백질의 합성을 도시한다. 도 18a에 있어서, BHK-21 세포를 MOI 50으로 감염시키고, 최종 2시간 동안 악티노마이신 D(5㎍/ml)의 존재하에 37℃에서 5시간 동안 배양한다. 다음, 감염된 세포를 30분 동안 메티오닌에 대해 절식시키고, [35S]메티오닌(30μCi/ml)을 함유하는 배지에 1시간 동안 노출시킨다. 전체 감염된 세포 단백질을 SDS-PAGE에 의해 분석한다. 도 18b에 있어서, 비리온을 MOI 5로 감염된 BHK-21 세포의 상등액으로부터 분리하고, [35S]메티오닌(50μCi/ml)에 감염 후 2.5 내지 12시간 동안 노출시킨다. 바이러스 입자를 10% 슈크로스를 통한 원심분리에 의해 정제하고, 이들의 단백질 함량을 SDS-PAGE에 의해 측정한다. 도 18a 및 18b에 도시된 바이러스 단백질을 형광체 영상화에 의해 정량화시키고, 도 18c에서의 감염된 BHK-12 세포 중의 각각의 바이러스 단백질의 몰 백분율 또는 도 18d에서의 정제된 비리온 중의 각각의 단백질의 몰 백분율로서 나타낸다. 도시된 데이터는 2회의 독립적인 실험을 평균한다. 레인: 1, N1G4(wt); 2, G1N2; 3, G3N4; 4, G1N4; 5, 비감염된 세포.
도 19는 단일 단계 성장 분석을 도시한다. 바이러스를 BHK-21 세포에서의 37℃에서의 단일 단계 성장을 복제하는 이들의 능력에 대해 검정한다. 세포를 감염 다중도 3으로 감염시키고, 상등 배지의 샘플을 지시된 시점에서 수거한다. 샘 플을 Vero-76 세포 상에서 플라크 검정법에 의해 이중으로 적정한다. 세포당 평균 바이러스 수율을 감염 후 24시간째에 측정한다(삽입 그림).
도 20은 마우스에서의 발병기전을 도시한다. 도시된 바이러스를 마우스당 1,000PFU의 투여량으로 6마리의 마우스의 그룹에게 비내 투여하고, 동물을 이환율 및 사망률의 징후에 대해 매일 모니터링한다. 제12일 이후에 추가의 변화는 발생하지 않는다.
도 21은 재배열된 바이러스로 접종된 마우스의 평균 체중을 도시한다. 6마리의 마우스의 그룹을 10,000 내지 1pfu/동물 범위의 N1G4(wt), G1N2, G3N4 또는 G1N4의 연속 10배 희석액으로 비내 접종시킨다. 대조군 마우스에게는 접종 배지만을 제공한다. 수직 점선은 야생형 바이러스의 5.4 X 106pfu로의 챌린지 기일을 지시한다. 각각의 그룹에 대해, 모든 생존 동물을 함께 칭량하고, 평균 체중을 측정한다. ↓, 10,000pfu; , 1,000pfu; □, 100pfu; ≤, 10pfu; <, 1pfu; +, 배지.
도 22는 재배열된 바이러스 및 야생형 바이러스로의 접종에 대해 반응한 항체 생성의 동력학을 도시한다. 6마리의 마우스의 그룹을 10,000 내지 1pfu/동물 범위의 N1G4(wt), G1N2, G3N4 또는 G1N4의 연속 10배 희석액으로 비내 접종시킨다. 대조군 마우스에게는 접종 배지만을 제공한다. 수직 점선은 야생형 바이러스의 5.4 X 106pfu로의 챌린지 기일을 지시한다. 혈청을 매주 간격으로 2 내지 4마리의 동물로부터 꼬리 채혈에 의해 수집하고, 혈청을 풀링하고, VSV에 대해 생성된 항체의 수준을 ELISA로 세제-용해된 VSV-감염된 세포 항원 상에서의 적정에 의해 측정 한다. 항체 수준을 log10 역가로서 나타낸다. ↓, 10,000pfu; , 1,000pfu; □, 100pfu; ≤, 10pfu; <, 1pfu; +, 배지.
도 23은 6마리의 마우스의 그룹을 10,000 내지 1pfu/동물 범위의 N1G4(wt), G1N2, G3N4 또는 G1N4의 연속 10배 희석액으로 비내 접종시킴을 도시한다. 대조군 마우스에게는 접종 배지만을 제공한다. 마우스를 플라크 감소 검정법에 의해 감염일에 혈청 샘플에서 측정된 바와 같은 중화 항체 수준에 대해 검정한다(도 23a). 중화 항체 수준은 Vero-76 세포 상에서의 야생형 바이러스 플라크에서 50% 감소율을 제공하는 가장 높은 희석율의 역수로서 나타낸다. * N1G4 또는 G1N2 바이러스의 1PFU 또는 10PFU가 제공된 동물로부터의 혈청은 중화 항체의 배경값 수준을 갖는다. 또한, 마우스를 N1G4 바이러스의 5.4 X 106PFU에 의해 비내 감염을 견디는 능력에 대해 검정한다(도 23b). 점선은 감염 후 제21일에 비백신화, 동일-연령의 대조군 동물에서의 상기 투여량의 치사율(83%)을 도시한다.
도 24는 각각의 패널 아래에 도시된 바와 같이 재배열된 유전자 순서를 갖는 조작된 VSV로 미리 제3일에 접종된 돼지의 코를 도시한다("le" 및 "tr"은 각각 3' 리더 및 5' 트레일러 서열을 나타낸다). 돼지를 마취시키고, 지시된 바이러스 2.5 x 107PFU를 적용시킨다. 동물을 N1G4(WT), G1N2, G3N4, G1N4로 접종시킨다(각각 도 24a 내지 24d).
도 25는 재배열된 바이러스로의 접종 후 그룹당 4마리의 동물 각각에 대한 임상 점수를 도시한다. 돼지를 바이러스 2.5 x 107PFU로 접종시키고, 병소 형성을 매일 평가한다. 임상 점수는 생성된 병소의 크기 및 위치를 기준으로 한다. 각각의 기호는 별개의 동물을 표시한다.
도 26은 재배열된 바이러스로의 접종 후의 돼지로부터의 바이러스 분리를 도시한다. 돼지를 바이러스 2.5 x 107PFU로 접종시킨다. 비강 및 프로방 스왑(swab)을 지시한 바와 같이 취한다. 샘플을 적정하고, 바이러스를 N1G4(WT) 및 G1N2에 대해 37℃에서 3일 동안 또는 G3N4 및 G1N4에 대해 31℃에서 4일 동안 BHK-21 세포 상에서의 배양에 의해 회수한다. 각각의 박스는 별개의 동물을 표시하고, 바이러스 CPE에 대해 양성(■) 또는 음성( )인 샘플을 제시한다. 바이러스의 존재 및 유전자 순서를 RT-PCR에 의해 확인한다.
도 27은 재배열된 바이러스로의 접종 후의 혈청 중화 항체 역가를 도시한다. 돼지를 바이러스 2.5 x 107PFU로 접종시킨다. 혈청을 7일 간격으로 수집하고, 중화 항체의 수준을 측정한다. G1N4가 제공된 동물을 제28일에 5.7 x 107PFU로 추가 접종시킨다. 막대는 각각의 그룹의 평균 및 범위를 나타낸다. 점선은 검정의 감수성의 한계를 나타낸다.
도 28은 N1G4(WT) 바이러스로의 챌린지 후의 돼지에서의 임상 점수를 도시한다. 돼지를 마취시키고, 야생형 바이러스 4.2 x 107PFU로의 바이러스의 최초 투여 후 제36일에 챌린지시킨다. 임상 점수는 생성된 병소의 크기 및 위치를 기준으로 한다. 각각의 기호는 별개의 동물을 표시한다.
도 29는 N1G4(WT) 바이러스로의 챌린지 후의 돼지로부터의 바이러스 분리를 도시한다. 챌린지 바이러스의 투여 후, 비강 및 프로방 스왑을 지시된 시점에서 취한다. 샘플을 하기한 바와 같이 적정한다. 각각의 박스는 별개의 동물을 표시하고, 바이러스 CPE에 대해 양성(■) 또는 음성( )인 샘플을 제시한다. 바이러스의 존재 및 유전자 순서를 RT-PCR에 의해 확인한다.
도 30은 N1G4(WT) 바이러스로의 챌린지 후의 혈청 중화 항체 역가를 도시한다. 혈청을 챌린지 바이러스 투여 후의 지시된 시점에서 수집하고, 중화 항체의 수준을 종료점 검정법에 의해 측정한다. 막대는 각각의 그룹의 평균 및 범위를 제시한다. 점선은 검정법의 감수성의 한계를 나타낸다.
<110> The UAB Research Foundation <120> Manipulation of negative stranded RNA viruses by rearrangement of their genes and uses thereof <130> DS936CIPPCT-D <150> US 09/602,288 <151> 2000-06-23 <160> 14 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <221> primer <223> PCR primer used to construct individual cDNA clones of VSV genes <400> 1 acctgcacta acagaaaaaa actaacagag atgcaggt 38 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> starting plasmid to reconstruct the rearranged full-length clones of N gene, containing a bacteriophage T7 promoter followed by the VSV leader sequence <400> 2 gaaactttaa cagtaatgca ggt 23 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> starting plasmid to reconstruct the rearranged full-length clones of L gene, containing the first 420 nucleotides of the L gene <400> 3 acctgcacta acagcaatca tg 22 <210> 4 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <221> primer <222> 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7,8 <223> primer used to position BspM1 sites ends of VSV P, M, G, N, and L genes; n = a or g or c or t <400> 4 nnnnnnnngc aggt 14 <210> 5 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <221> primer <222> 1, 2, 3, 4, 5 <223> primer used to position Bsa1 sites ends of VSV P, M, G, N, and L genes; n = a or g or c or t <400> 5 nnnnngagac c 11 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <221> primer <222> 24, 25, 28, 29, 30 <223> upstream primer containing BspM1 site and ACAG sequence for the P, M and G genes of VSV; n = a or g or c or t <400> 6 gggaagctta cctgcactaa cagnnatnnn 30 <210> 7 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <221> primer <222> 19, 20, 23, 24, 25 <223> primer for VSV intercistronic junction; n = a or g or c or t <400> 7 tatgaaaaaa actaacagnn atnnn 25 <210> 8 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <221> primer <222> 16, 17 <223> downstream primer containing BspM1 site and TGTC sequence for the P, M and G genes of VSV; n = a or g or c or t <400> 8 ctttttttga ttgtcnntac gtccagggcc cacg 34 <210> 9 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <221> primer <223> downstream primer for P gene of VSV <400> 9 gcacccggga cctgcatatc tgttactttt tttc 34 <210> 10 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <221> primer <223> downstream primer for M gene of VSV <400> 10 gcacccggga cctgcatctc tgttagtttt tttc 34 <210> 11 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <221> primer <223> downstream primer for G gene of VSV <400> 11 gcacccggga cctgcattgc tgttagtttt tttc 34 <210> 12 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <221> primer <223> consensus sequence for downstream primers of P, M and G genes of VSV <400> 12 gcacccggga cctgcatatc tgttagtttt tttc 34 <210> 13 <211> 4 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> sequence of cohesive ends remaining after endonuclease digestion in P, M, G, N genes of VSV <400> 13 acag 4 <210> 14 <211> 5 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> conserved sequence at the start of VSV mRNA <400> 14 aacag 5

Claims (1)

  1. 수포성 구내염 바이러스 (VSV: Vesicular Stomatitis Virus)의 표면 당단백질 유전자 (G 유전자)를 유전자 순서상 이의 정상 위치인 제4위치로부터 제1위치로 이동시키고, 추가로 뉴클레오캡시드 단백질 유전자 (N 유전자)를 유전자 순서상 이의 정상 위치인 제1위치로부터 제4위치로 이동시킴으로써 재배열된 게놈을 갖는 재조합 VSV의 약리학적 유효량을 포함하는, 상기 VSV의 천연 숙주에 사용하기 위한 수포성 구내염 바이러스에 대한 백신.
KR1020087028976A 2000-06-23 2001-06-22 (-)-쇄 ｒｎａ 바이러스 유전자의 재배열에 의한 (-)-쇄 ｒｎａ 바이러스의 조작 및 이의 약제학적 조성물 KR20080106485A (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US09/602,288 US6596529B1 (en) 1997-05-02 2000-06-23 Manipulation of negative stranded RNA viruses by rearrangement of their genes and uses thereof
US09/602,288 2000-06-23

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020027017583A Division KR20030071482A (ko) 2000-06-23 2001-06-22 (-)-쇄 ｒｎａ 바이러스 유전자의 재배열에 의한 (-)-쇄ｒｎａ 바이러스의 조작 및 이의 용도

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20080106485A true KR20080106485A (ko) 2008-12-05

Family

ID=24410755

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020027017583A KR20030071482A (ko) 2000-06-23 2001-06-22 (-)-쇄 ｒｎａ 바이러스 유전자의 재배열에 의한 (-)-쇄ｒｎａ 바이러스의 조작 및 이의 용도
KR1020087028976A KR20080106485A (ko) 2000-06-23 2001-06-22 (-)-쇄 ｒｎａ 바이러스 유전자의 재배열에 의한 (-)-쇄 ｒｎａ 바이러스의 조작 및 이의 약제학적 조성물

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020027017583A KR20030071482A (ko) 2000-06-23 2001-06-22 (-)-쇄 ｒｎａ 바이러스 유전자의 재배열에 의한 (-)-쇄ｒｎａ 바이러스의 조작 및 이의 용도

Country Status (11)

Country Link
US (3) US6596529B1 (ko)
EP (1) EP1292329A4 (ko)
JP (1) JP2004501639A (ko)
KR (2) KR20030071482A (ko)
CN (1) CN1441842A (ko)
AU (1) AU2001270056A1 (ko)
BR (1) BR0112390A (ko)
CA (1) CA2413800A1 (ko)
IL (1) IL153388A0 (ko)
MX (1) MXPA03000061A (ko)
WO (1) WO2002000868A1 (ko)

Families Citing this family (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2003262824B2 (en) 2002-08-22 2007-08-23 Applied Biosystems Inc. Method for characterizing biomolecules utilizing a result driven strategy
CN1871355B (zh) 2003-06-09 2011-12-14 惠氏 从cDNA中回收非节段性负链RNA病毒的改进方法
CA2553976C (en) * 2004-01-22 2013-09-24 Dnavec Research Inc. Method for producing minus-strand rna viral vectors using hybrid promoter comprising cytomegalovirus enhancer and chicken .beta.-actin promoter
BRPI0509683A8 (pt) * 2004-04-09 2015-12-22 Wyeth Corp Vírus de estomatite vesicular geneticamente modificado, vetor de vírus da estomatite vesicular geneticamente modificado, composição imunogênica, e, métodos para imunizar um hospedeiro mamífero contra infecção bacteriana e contra infecção viral
US7385186B2 (en) * 2005-05-13 2008-06-10 Applera Corporation Methods of operating ion optics for mass spectrometry
US7405396B2 (en) * 2005-05-13 2008-07-29 Applera Corporation Sample handling mechanisms and methods for mass spectrometry
US7351959B2 (en) * 2005-05-13 2008-04-01 Applera Corporation Mass analyzer systems and methods for their operation
US20070185025A1 (en) * 2005-09-11 2007-08-09 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Filoviral immunosuppressive peptides and uses thereof
CN105441483B (zh) * 2005-10-14 2019-05-10 美国政府健康及人类服务部，疾病控制和预防中心 狂犬病病毒组合物和方法
EP2839837B1 (en) * 2006-09-15 2019-05-08 Children's Hospital of Eastern Ontario Research Institute Inc. Oncolytic farmington rhabdovirus
EP2415783B1 (en) 2006-10-16 2016-12-14 Genelux Corporation Modified vaccinia virus strains for use in a diagnostic and therapeutic method
EP2069485A4 (en) * 2007-07-13 2011-05-25 Medimmune Llc PREPARATION OF NEGATIVE STRAND RNA VIRUSES BY ELECTROPORATION
JP5045416B2 (ja) * 2007-12-17 2012-10-10 富士通株式会社 光導波路素子およびそれを用いた光学装置
US20090175900A1 (en) * 2007-12-20 2009-07-09 Wyeth Methods for packaging propagation-defective vesicular stomatitis virus vectors
US20090162321A1 (en) * 2007-12-20 2009-06-25 Wyeth Methods for packaging propagation-defective vesicular stomatitis virus vectors using a stable cell line that expresses g protein
JP2011507523A (ja) * 2007-12-21 2011-03-10 ワイス・エルエルシー 遺伝子改変した弱毒化水疱性口内炎ウイルス、組成物およびその使用方法
US9610346B2 (en) * 2012-03-23 2017-04-04 International Aids Vaccine Initiative Recombinant viral vectors
EP3387120B1 (en) 2015-12-11 2022-07-27 The U.S.A. as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services Recombinant respiratory syncytial virus strains comprising ns1 and ns2 gene shifts
CN107557340A (zh) * 2017-09-26 2018-01-09 南京普菲科医药科技有限公司 一种可诱导性拯救弹状病毒的细胞系及其构建方法与应用

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6923971B2 (en) * 1995-09-27 2005-08-02 The United States Of America As Represented By The Department Of Health & Human Services Respiratory syncytial virus vaccines expressing protective antigens from promoter-proximal genes
AU727923B2 (en) * 1995-09-27 2001-01-04 Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, The Production of infectious respiratory syncytial virus from cloned nucleotide sequences
BR9710363A (pt) * 1996-07-15 2000-01-11 Us Gov Health & Human Serv "vìrus sincicial respirátorio recombinante infeccioso isolado, partìcula do mesmo, processos para estimular o sistema imunológico de um indivìduo para induzir proteção contra o vìrus sincicial respiratório e para produzir uma partìcula de vìrus sincicial respiratório recombinante, vacina para induzir proteção contra o vìrus sincicial respiratório recombinante composição e ceta de vìrus sincicial respiratório recombinante"
WO1998050529A1 (en) * 1997-05-02 1998-11-12 The Uab Research Foundation Attenuation of negative stranded rna viruses by rearrangement of their genes and uses thereof

Also Published As

Publication number Publication date
AU2001270056A1 (en) 2002-01-08
EP1292329A1 (en) 2003-03-19
US6596529B1 (en) 2003-07-22
EP1292329A4 (en) 2005-11-16
BR0112390A (pt) 2003-09-23
JP2004501639A (ja) 2004-01-22
MXPA03000061A (es) 2004-09-13
WO2002000868A1 (en) 2002-01-03
US20040235135A1 (en) 2004-11-25
CA2413800A1 (en) 2002-01-03
KR20030071482A (ko) 2003-09-03
CN1441842A (zh) 2003-09-10
US6777220B2 (en) 2004-08-17
US20030166254A1 (en) 2003-09-04
IL153388A0 (en) 2003-07-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Fu Rabies and rabies research: past, present and future
US7544791B2 (en) Attenuated rabies virus with nucleoprotein mutation at the phosphorylation site for vaccination against rabies and gene therapy in the CNS
KR20080106485A (ko) (-)-쇄 ｒｎａ 바이러스 유전자의 재배열에 의한 (-)-쇄 ｒｎａ 바이러스의 조작 및 이의 약제학적 조성물
Ge et al. Newcastle disease virus-vectored rabies vaccine is safe, highly immunogenic, and provides long-lasting protection in dogs and cats
US6136585A (en) Attenuation of negative stranded RNA viruses by rearrangement of genes and uses thereof
JP3816126B2 (ja) 組換え伝染性非セグメント化陰性鎖ｒｎａウイルス
KR100801180B1 (ko) 약독화된 재조합 뉴캐슬병 바이러스 및 이를 함유하는뉴캐슬병 백신
EA004796B1 (ru) Инфекционные клоны вируса ньюкаслской болезни, вакцины и диагностические анализы
KR20090007706A (ko) 조류 인플루엔자 바이러스의 ｈ5 헤마글루티닌을 발현하는 재조합 뉴캐슬병 바이러스
RU2441070C2 (ru) Рекомбинантный вирус болезни ньюкастла, экспрессирующий н5 гемаглютинин вируса птичьего гриппа (avian ineluenza)
CN106063932A (zh) 使用仙台病毒作为载体的抗结核杆菌疫苗
JP2010539093A (ja) イヌ、ネコ及びウマにおけるインフルエンザ感染を予防するための組成物及び方法
PL198980B1 (pl) Mutant NDV, żywa szczepionka przeciwko chorobie Newcastle, inaktywowana szczepionka przeciwko chorobie Newcastle i zastosowanie mutanta NDV
SINGH et al. Rabies: A Neurotropic Disease

Legal Events

Date Code Title Description
A107 Divisional application of patent
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E601 Decision to refuse application