DE60033284T3 - In vitro-rekonstitution von segmentierten, negativstrang-rna-viren - Google Patents

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft die Rekonstitution (”Wiederherstellung”) von Influenza A-Viren in kultivierten Zellen von rekombinanten DNA's. Spezieller betrifft die Erfindung die Wiederherstellung von Influenza A-Viren mit in der Regel 8 genomischen vRNA-Segmenten mit Hilfe eines vollständigen vektorgesteuerten Systems, bei dem die Notwendigkeit für einen Helfer-Virus umgangen wird.
  • In den vergangenen 5 Jahren hat man die Wiederherstellung der meisten wichtigen nichtsekretierten Minus-Strang-RNA-Viren von rekombinanter DNA gesehen. Als erster hatten Schnell et al. Erfolg in der Gewinnung von Rabiesvirus von rekombinanter DNA (EMBO J. (1994) 13, 4195–4204). Kurz danach wurden für einen vesikulären Stomatitis-Virus Plasmid-basierende Wiederherstellungssysteme entwickelt. (Lawson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995) 92, 4477–4481; Whelan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995) 92, 8388–8392), wo auch für den respiratorischen Synzytium-Virus (Collins et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995) 92, 11563–11567; Jin et al., Virology (1998) 251, 206–214), Masernvirus (Radecke et al., EMBO J. (1995) 14, 5773–5784) und Sendai-Virus (Garcin et al., EMO J. (1995) 14, 6087–6094; Kato et al., Genes Cells (1996) 1, 569–579). In neuerer Zeit sind Plasmid-basierende Wiederherstellungssysteme für Human-Influenza Typ 3 entwickelt worden (Durbin et al., Virology (1997) 235, 323–332; Hoffman und Banerjee, J. Virol. (1997) 71, 4272–4277), Rinderpest-Virus (Baron und Barrett, J. Virol. (1997) 71, 1265–1271), Simian-Virus 5 (He et al., Virology (1997) 237, 249–260), bovine respiratory syncytial virus (Buchholz et al., J. Viro. (1999) 73, 251–259) und Newcastle-disease-Virus (Peeters et al., J. Virol. (1999) 73, 5001–5009).
  • Bridgen und Elliott (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1996) 14, 15400–15404) haben eine helfervirusfreie Wiederherstellung eines mit nur 3 genomischen vRNA-Segmenten von cDNA durch Exprimieren von Antigenom-RNA's und viralen Proteinen unter der Kontrolle eines bakteriophagen T7-Promotors veröffentlicht. Allerdings ist bis jetzt noch nicht bekannt geworden, ob eine vollständig Plasmid-basierende Strategie erfolgreich beim Wiederherstellen segmentierter Minus-Strang-RNA-Viren mit einer größeren Zahl von vRNA-Segmenten, wie beispielsweise Influenzaviren ohne die Hilfe eines Helfer-Virus angewendet werden kann.
  • Influenza bleibt eine bestehende weltweite Bedrohung für die Gesundheit des Menschen, weshalb es einen besonderen Bedarf für eine leichte Methode zum Erzeugen modifizierter Influenzaviren mit bekannten Mutationen in beliebigen genomischen vRNA-Segmenten gibt. Die gentechnische Bearbeitung von Influenza-vRNA-Segmenten zur Expression von heterologen Sequenzen ist ebenfalls von großem Interesse, beispielsweise in der Entwicklung neuer Impfstoffe, die gegen Influenzavirus und einem zweiten pathogenen Mittel wirksam sind. Es sind drei Typen von Influenzaviren bekannt, die bezeichnet werden als die Typen A, B und C. Bis zum gegenwärtigen Zeitpunkt war das Hauptaugenmerk im Zusammenhang mit einer gentechnischen Bearbeitung Influenza A. Das Genom eines Influenza A-Virus vom Wildtyp besteht aus 8 Segmenten von einsträngiger negativer Sense-RNA, die 10 Polypeptide codiert: die RNA-abhängige RNA-Polymeraseproteine (PB1, PB2 und PA), das Nucleoprotein (NP), die Matrixproteine (M1, M2), zwei Oberflächenglykoproteine, die von der Lipoproteinhülle stammen (Hämaglutinin (HA) und Neuraminidase (NA)) sowie die Nichtstrukturproteine NS1 und NS2. Die HA, NA, NP und Polymeraseproteine sind durch monocistronische Genomsegmente codiert.
  • Wie bei anderen segmentierten Minus-Strang-RNA-Viren wird das virale Genom während des Replikationszyklus eines Influenzavirus in die mRNA transkribiert und in die komplementäre RNA (cRNA) repliziert. Dafür müssen die genomischen vRNA-Segmente komplex mit dem Nucleoprotein und der RNA-abhängigen RNA-Polymerase in Ribonucleoprotein(RNP)-Komplexen gebunden werden (Huang et al., J. Virol. (1990) 64, 5669–5673; Garcia-Sastre, Trends In Biotechnology (1998) 16, 230–235). Anfangs wurden, um das Genom eines Influenzavirus zu manipulieren, die RNP's in vitro von RNA rekonstituiert, die von Plasmid-DNA in Gegenwart der Polymerase-Proteine PB1, PB2 und PA transkribiert wurde, und dessen Nucleoprotein aus dem gereinigten Influenzavirus isoliert (Enami et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1990) 87, 3802–3805; Enami und Palese, J. Virol. (1991) 65, 2711–2713; Muster and Garcia-Sastre, ”Genetic manipulation of influenza viruses” im Lehrbuch der Influenza (1998), Kapitel 9, Herausg. Nicholson et al.). Die in vitro rekonstituierten RNPs wurden in Zellen transfiziert, die mit einem Helfer-Influenzavirus infiziert waren, was die übrigen erforderlichen viralen Proteine und RNA-Segmente lieferte und zur Erzeugung von Transfektant-Viren führte. Diese Methode war in hohem Maße nützlich, um zu einem Verständnis der Molukarbiologie und Pathogenität der Influenzaviren zu gelangen. Allerdings beruht sie auf stark spezialisierten Selektionsmethoden zur Isolation der Transfektant-Viren aus dem Helfer-Virus, was die Anwendung auf bestimmte RNA-Segmente einer begrenzten Zahl von Virusstellen begrenzt.
  • Neuerdings hat sich die intrazellulare Rekonstitution eines RNP-Komplexes aus einem intrazellular transkribierten vRNA-Segment als möglich erwiesen, indem Plasmid-exprimierte NP- und Polymerase-Proteine verwendet werden (Neumann et al., Virology (1994) 202, 477–479, Zhang and Air. Biochem. Biophys. Res. Commun. (1994) 200, 95–101; Pleschka et al., J. Virol. (1996) 70, 4188–4192). Beispielsweise haben Pleschka et al. gezeigt, dass Influenza A PB1, PB2, PA und NP, exprimiert von Plasmiden, eine Influenzavirus-vRNA-ähnliche RNA enkapsidieren, transkribieren und replizieren kann, die ein Chloramphenizol-Azetyltransferase(CAT)-Reportergen in transfiziertem Human 293 enthält. Dieses vRNA-ähnliche Reportergen wurde in die ausgewählten Wirtszellen durch Transfektion einer Plasmid-DNA (pPOLI-CAT-RT) eingeführt, die einen abgestumpfen Human-RNA-Polymerase I-Promotor (Nucleotide –250 bis –1) hat in Position in Richtung oberhalb der vRNA-codierenden Region. Die Sequenz des Hepatitis-delta-Virus-Genom-Ribozyms war in Richtung abwärts zur vRNA-codierenden Region positioniert, um zu gewährleisten, dass die RNA-Bearbeitung das korrekte 3'-Ende der transkribierten vRNA ergibt. Von der selben Gruppe wurde ebenfalls veröffentlicht, dass der Austausch des Plamids, welches das CAT-Reportergen codiert, gegen ein Plasmid, welches ein authentisches Influenza A-vRNA-Segment codiert, intrazelluläre rekonstituierte RNP-Komplexe in transfizierte Viren bei Infektion der transfizierten Zellen mit einem Influenza-Helfer-Virus bereitet werden könnte. Ein derartiges auf Helfer-Virus basierendes Wiederherstellungssystem wurde von Pleschka et al. unter Einsatz von intrazellulären transkribierten mutanten Influenza A NA vRNA-Segmenten untersucht. Geht man zu einem gänzlich Plasmid-basierenden Wiederherstellungssystem für Influenzaviren über, stellen sich jedoch neue Fragen in Verbindung mit dem Erhalten einer angemessenen Expression aller erforderlicher Sequenzen und der korrekten Kooperation solcher Sequenzen zum Zusammenbau eines kompletten Virus.
  • Bridgen und Elliott waren nicht in der Lage, Bunyamwera-Bunyarvirus unter Verwendung von Plasmiden wiederherzustellen, die auf Expression genomischer vRNA-Segmente gerichtet waren anstatt Antigenom-RNA's. Es ist jetzt jedoch entdeckt worden, dass eine helfervirusfreie Wiederherstellung eines Influenza A-Virus in eine Zellkultur durch Cotransfektion in kultivierte Zellen von 12 Plasmiden ausführbar ist, die zur Coexpression von 8 vRNA-Segmenten und der erforderlichen NP- und 3 RNA-Polymerase-Proteine zur Erzeugung von RNP-Komplexen in der Lage sind. Die gleiche Strategie lässt sich auf eine Vielzahl anderer segmentierter Minus-Strang-RNA-Viren mit einer großen Zahl von genomischen vRNA-Segmenten extrapolieren, beispielsweise mit 6 oder mehr und einschließlich beispielsweise Influenzaviren anderer Typen und anderer Mitglieder der Familie Orthomyxoviridae, wie beispielsweise die 6 vRNA-Segment-enthaltenden Thogotoviren. Während sowohl Influenza A-Viren vom Wildtyp als auch Influenza B-Viren 8 vRNA-Segmente haben, sind Influenza A-Viren beschrieben worden, die ein zusätzliches vRNA-Segment enthalten (Enami et al., Virology (1993) 185, 765–90) und Influenza C-Viren, die ein vRNA-Segment weniger haben.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung gewährt damit ein Verfahren zum Erzeugen von infektiösen Viruspartikeln eines Influenza A-Virus, welches Verfahren umfasst:
    Einführen von Expressionsvektoren in gezüchtete Zellen, wobei die Expressionsvektoren in diesen Zellen die vollständigen Genom-vRNA-Segmente dieses Virus exprimieren und wobei diese Zellen das Wachstum des Virus unterstützen und diese Zellen auch ein Nucleoprotein und eine RNA-abhängige RNA-Polymerase bereitstellen, wodurch RNP-Komplexe gebildet werden, die die Genom-vRNA-Segmente des Virus enthalten, und die infektiösen Viruspartikel durch diese Zellen in Abwesenheit eines Helfer-Virus erzeugt werden und wobei diese Zellen kein Interferon erzeugen.
  • Die gewählten Wirtszellen können beispielsweise zusätzlich in einen oder mehrere weitere Expressionsvektoren eingeführt worden sein, die zur direkten Expression in den Zellen eines oder mehrerer der erforderlichen viralen Proteine in der Lage sind. Beispielsweise kann ein zweiter Satz von Expressionsvektoren eingesetzt werden, um in den Wirtszellen alle Nucleoprotein- und RNA-abhängige Polymerase-Untereinheiten zu exprimieren. Beispielsweise lässt sich mühelos ein separater Expressionsvektor für jedes dieser Proteine einsetzen. Die gewählten Wirtszellen lassen sich beispielsweise alternativ gentechnisch so bearbeiten, dass sie eine oder mehrere der erforderlichen Nucleoprotein- und RNA-abhängigen RNA-Polymerase-Untereinheiten exprimieren. Wenn sämtliche entscheidende Proteine für die Enkapsidierung; Transkription und Replikation der vRNAs durch die Anfangswirtszellen bereitgestellt werden, so wird offensichtlich sein, dass lediglich der erste Satz von Expressionsvektoren benötigt wird. Darüber hinaus können die Ausgangswirtszellen solche Zellen sein, die so gentechnisch bearbeitet wurden, dass sie eins oder mehrere der genomischen vRNA-Segmente des gewünschten Virus exprimieren. Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens kann man offensichtlich die Wiederherstellung eines Influenza A-Virus ohne irgendeine virale Unterstützung erreichen, z. B. mit Hilfe einer gänzlich Plasmid-basierenden Methode.
  • In einem weiteren Aspekt gewährt die Erfindung ein Verfahren zum Erzeugen von infektiösen Viruspartikeln eines Influenza A-Virus in kultivierten Zellen, welches Verfahren umfasst:
    Bereitstellen einer ersten Population von Zellen, die in der Lage sind, das Wachstum des Virus zu unterstützen und die modifiziert worden sind, um (a) die Genom-vRNAs des Virus zu schaffen; (b) eine Nucleoprotein- und RNA-abhängiger RNA-Polymerase zu schaffen, wodurch RNP-Komplexe, die diese Genom-vRNAs enthalten, gebildet werden und die infektiösen Viruspartikel zusammengefügt werden, wobei die Genom-vRNAs direkt in diesen Zellen unter der Kontrolle eines Pol I-Promotors eines Vertreters der Säuger oder eines funktionellen Derivats davon in Abwesenheit eines Helfer-Virus exprimiert werden und
    wobei die Zellen kein Interferon erzeugen.
  • Es gilt als anerkannt, dass zur viralen Wiederherstellung entsprechend der vorstehenden Beschreibung modifizierte Wirtszellen einen wesentlichen Aspekt der vorliegenden Erfindung darstellen. Mit Hilfe der ersten Population von Zellen erzeugte Viruspartikel lassen sich mit Hilfe eines oder mehrerer weiterer Schritte der zellulären Infektion amplifizieren, wie beispielsweise unter Einsatz von kultivierten Zellen der gleichen oder einer anderen als der ersten Population von Zellen. Zum Gebrauch lassen sich die auf diese Weise erzeugten Viruspartikel isolieren.
  • Sofern die anfangs mit Hilfe der Wirtszellen erzeugten Viruspartikel nicht attenuiert worden sind, kann ein Schritt einer konventionellen Attenuierung oder einer Virusabtötung anschließend ausgeführt werden, beispielsweise vor der Formulierung zum Impfeinsatz. Die Viruspartikel, die gemäß der Erfindung erzeugt werden, können rekombinante Viruspartikel sein, die zur Expression einer heterologen Sequenz in der Lage sind. Diese Partikel können nach Erfordernis nach Zweckmäßigkeit nach der Attenuierung oder dem Abtöten ebenfalls für einen Impfeinsatz oder einen anderen therapeutischen Zweck formuliert werden.
  • Im Gegensatz zu früheren auf Helfer-Virus basierenden Wiederherstellungsmethoden für Influenzavirus lassen sich die erfindungsgemäßen Verfahren leicht zur Erzeugung eines infektiösen Influenzavirus des Typs A anwenden, der mehrfache Mutationen in mehreren verschiedenen Genen gleichzeitig hat. Eine solche Methode ermöglicht außerdem eine leichtere und direktere Erzeugung neukombinierter Influenza A-Virus-enthaltender vRNA-Segmente, die von mehr als einem Elternvirus abgeleitet sind. Konventionell werden neukombinierte Viren mit Hilfe eines Screenings von Viruspartikeln aus einer gemischten viralen Infektion von Zellen erhalten. Das erfindungsgemäße Verfahren ist besonders zur Erzeugung neukombinierter Influenza A-Viren von Vorteil, die sich schwer mit Hilfe von klassischen Methoden isolieren lassen.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUR
  • 1 ist eine schematische Darstellung einer Ausführungsform der Erfindung, wie sie eingebender in den Beispielen 1 bis 3 beschrieben wird und worin 12 Plasmide für die direkte Expression der vRNA-Segmente eines Influenza A-Virus und Expression eines Influenza A-Nucleoproteins und RNA-abhängiger RNA-Polymerase-Untereinheiten in kultivierte Vero-Zellen cotransfiziert sind (Nierenzellen afrikanischer Grüner Meerkatzen). In dieser Ausführungsform werden für den Plaque-Assay und für die Amplifikation von wiederhergestellten Viruspartikeln MDBK-Zellen (Madin-Darby-Rindernierenzellen) eingesetzt. Es wird jedoch offensichtlich sein, dass andere Zellen, die das Wachstum von Influenza A-Virus fördern, gleichermaßen für den Plaque-Assay und die Amplifikation eingesetzt werden können und einschließlich Vero-Zellen und MDCK-Zellen (Madin-Darby-Kaninchennierenzellen). In 1 bedeutet Pol I trunkierter Human-RNA-Polymerase I-Promotor, R = genomisches Hepatitis-Virus-Ribozym, MLP = Adenovirus-Typ 2-Haupt-Spätpromotor, verknüpft mit einer synthetischen Sequenz, die die gespleisste dreiteilige Hauptsequenz von Human-Adenovirus Typ 2 aufweist, und pA = Polyadenylierungssequenz von SV 40.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Vorzugsweise werden Expressionsvektoren eingesetzt, um genomische vRNA-Segmente des Influenza A-Virus direkt zu exprimieren. Dieses können vollständige vRNA-Segmente vom Wildtyp sein oder es kann mindestens ein vRNA-Segment vom Nicht-Wildtyp einbezogen sein, z. B. ein mutantes vRNA-Segment mit einer oder mehreren Nucleodid-Substitutionen, Insertionen oder Deletionen.
  • Beispielsweise kann mindestens eines der vRNA-Segmente, die in den Wirtszellen bereitgestellt werden, ein chimäres vRNA-Segment sein, das zur Expression einer Sequenz in der Lage ist, die zu dem viralen Genom in den Targetzellen heterolog sind, die durch den wieder hergestellten Virus infiziert sind. Eine solche heterologische Sequenz kann ein Peptid oder ein Polypeptid codieren. Alternativ kann es eine Nucleinsäure codieren, wie beispielsweise ein Ribozym oder eine Antisense-Nucleinsäure. Die heterologische Sequenz kann auf einem vRNA-Segment bereitgestellt werden, das zusätzlich ein komplettes natives Virusprotein codiert, wie durch das in Beispiel 8 beschriebene chimäre vRNA-Segment beschrieben wird, oder kann in die codierende Sequenz für ein Virusprotein insertiert werden. Beispielsweise ist bekannt, dass das HA-Protein von Influenza A eine Epitrop-Aufpfropfung in der Antigenstelle B toleriert werden kann. Methoden zum Aufbau derartiger chimärer vRNA-Segmente finden sich beispielsweise bei Muster und Garcia-Sastre, Kapitel 9, Lehrbuch der Influenza (1998) und bei Palese et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1996) 93, 11354–11358. Strategien zum Aufbau von chimären Influenzavirus-vRNA-Segmenten wurden bereits beschrieben in der Internationalen Patentanmeldung WO 91/03552 .
  • Die in den Wirtszellen bereitgestellten vRNA-Segmente können zusätzlich oder alternativ eine oder mehrere attenuierende Mutationen einbauen. Beispielsweise können die vRNA-Segmente die vRNA-Segmente eines Influenza A-Virus mit attenuierender Basenpaar-Substitution in einer ”pan-handle”-Duplex-Promotorregion sein und speziell beispielsweise die bekannte attenuierende Basenpaar-Substitution von A für C und U für G an der Stelle 11–12' in der Duplex-Region der NA-spezifischen vRNA (Fodor et al., J. Virol. (1998) 6283–6290). Unter Anwendung des Wiederherstellungssystems der Erfindung können neue Attenuierungsmutationen identifiziert werden. Wie vorstehend ausgeführt, kann jedoch, wenn anfangs mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens nichtattenuierte Viruspartikel erzeugt werden, die Attenuation oder das Abtöten der Viruspartikel anschließend beispielsweise mit Hilfe klassischer Methoden erzielt werden.
  • Attenuierte oder abgetötete Viren, die erfindungsgemäß erzeugt wurden, können anschließend in eine Vakzin-Zusammensetzung in konventioneller Weise eingebaut werden. Sofern ein solcher Virus ein chimäres vRNA-Segment hat, wie es vorstehend diskutiert wurde, das an Fremd-Antigen codiert, kann es so formuliert werden, dass eine Impfung gegen mehr als ein Pathogen gleichzeitig erzielt wird. Attenuierte rekombinante Viren, die gemäß der Erfindung erzeugt werden und ein chimäres vRNA-Segment besitzen, können auch für andere therapeutische Anwendungen aufgebaut werden, z. B. als ein Antitumormittel oder ein Mittel zur Gentherapie, in welchem Fall der Erzeugung des Virus dessen Einbau in eine geeignete pharmazeutische Zusammensetzung zusammen mit einem pharmazeutisch unbedenklichen Träger oder Streckmittel folgt.
  • Wie ebenfalls vorstehend ausgeführt, ist die helfervirusfreie Wiederherstellung gemäß der Erfindung insbesondere günstig für die Erzeugung von reassortierten Viren und speziell reassortierten Influenzaviren, die für Impfzwecke gewünscht werden. Beispielsweise können mit Hilfe der Virus-Wiederherstellung gemäß der Erfindung die HA- und NA-vRNA-Segmente eines Influenzavirus, z. B. Influenza A/PR8/34, die für die Human-Verabreichung als geeignet anerkannt sind, mühelos mit HA- und NA-vRNA-Segmenten eines Influenzastammes in Verbindung mit einer epidemischen Influenzainfektion ergänzt werden. Die reassortierten Influenzaviren können beispielsweise für die Erzeugung eines abgetöteten Influenzaimpfstoffes in konventioneller Weise verwendet werden (siehe Beispiel 4 und 6).
  • Die zum Einsatz gelangenden Expressionsvektoren können vorzugsweise Plasmide sein, die zur Replikation in den gewählten Wirtszellen in der Lage sind. Es kann ein separater Expressionsvektor für die direkte Expression jedes erforderlichen vRNA-Segmentes oder der entsprechenden cRNA vorgesehen werden. Wie vorstehend bereits erwähnt, kann auch ein zweiter Satz von Expressionsvektoren für jedes Nucleoprotein und die einzelnen RNA-abhängigen RNA-Polymerase-Untereinheiten vorgesehen werden, z. B. die PB1-, PB2- und PA-Untereinheiten einer Influenzavirus-RNA-abhängigen RNA.-Polymerase. Allerdings kann, wie ebenfalls vorstehend ausgeführt wurde, alternativ eine Zelllinie eingesetzt werden, die zur Expression eines oder mehrerer dieser Proteine in der Lage ist, in welchem Fall der zweite Satz von Expressionsvektoren reduziert oder sogar eliminiert werden kann. Beispiel 7 veranschaulicht ein derartiges Verfahren für die helfervirusfreie Wiederherstellung eines Influenza A-Virus unter Einsatz einer Zelllinie, welche das Nucleoprotein stabil exprimiert.
  • Alle die erforderlichen Expressionsvektoren können vorzugsweise in die gewählten Wirtszellen in einem einzigen Schritt der Cotransfektion oder Cotransduktion eingeführt werden. Für diesen Zweck kann die liposomale Transfektion vorzugsweise zum Einsatz gelangen, und zwar beispielsweise unter Verwendung eines DOTAP-liposomalen Transfektionsreagens (Boeringer Mannheim) oder LipofectAMINE 2000 (Gibco BRL). Allerdings wird offensichtlich, dass mehr als ein Vektor-Transferschritt ausgeführt werden kann und andere bekannte Mittel zur Einführung von Vektoren in Säugerzellen eingesetzt werden können, beispielsweise die Elektroporation, DEAE-Dextran-Transfektion, Mikropartikelbeschuss und virale Transduktion, z. B. unter Verwendung von replikationsdefekten Retroviren. Ebenfalls bevorzugt ist eine Calciumphosphat-Ausfällung (siehe Beispiel 5). Beispielsweise kann man die Einführung in Wirtszellen-Expressionsvektoren zur Expression der NP- und Polymerase-Proteine vor den Expressionsvektoren zur Expression der vRNA-Segmente wählen. Die Wirtszelle, in die die benötigten Vektoren eingeführt werden, kann in einer Petrischale vorliegen oder auf andere geeignete Weise für die Vektortransfektion oder -transduktion aufgezogen werden.
  • Die Expression der vRNA-Segmente oder entsprechenden cRNAs wird bevorzugt unter der Kontrolle einer Promotersequenz erfolgen, die von einem Säuger-RNA-Pol I-Promotor abgeleitet ist. Besonders bevorzugt für diesen Zweck ist der trunkierte Human-RNA-Pol I-Promotor, der aus den Nucleotiden –250 bis –1 des entsprechenden nativen Promotors besteht oder einem funktionellen Derivat davon (Jones et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85, 669–673). Andere Promotoren können jedoch alternativ zum Einsatz gelangen und einschließlich beispielsweise ein T7-RNA-Polymerase-Promotor. Um das korrekte 3'-Ende jeder exprimierten vRNA oder cRNA zu gewährleisten, wird in jedem vRNA- oder cRNA-Expressionsvektor eine Ribozymsequenz oder geeignete Terminatorsequenz unterhalb der RNA-Codierungssequenz eingebaut. Dieses kann beispielsweise eine Hepatitis-Deltavirus-Genomribozym-Sequenz oder ein funktionelles Derivat davon sein. Alternativ kann beispielsweise ein Pol I-Terminator eingesetzt werden (Neumann et al., Virology (1994) 202, 477–479). Die RNA-Expressionsvektoren können in der gleichen Weise aufgebaut sein wie die vRNA-Expressionsvektoren, die von Pleschka et al., J. Virol. (1996) 70, 4188–4192, beschrieben wurden.
  • Wo ein oder mehrere Portein-Expressionsvektoren zum Exprimieren viraler Proteine für die RNP-Komplexbildung benötigt werden, exprimieren diese vorzugsweise das/die benötigte virale Protein(e) zu dem gewünschten Virushomolog. Die Expression der Nucleoprotein- und der RNA-abhängigen Polymerase-Untereinheiten kann bevorzugt beispielsweise unter der Kontrolle einer regulatorischen Sequenz erfolgen, die den Adenovirus 2-Haupt-Spät-Promotor verknüpft mit der gespleissten dreiteiligen Führungssequenz des Human-Adenovirus Typ 2 entsprechend der Beschreibung von Berg et al. aufweist, BioTechniques, 14, 972–978, oder ein funktionelles Derivat dieser regulatorischen Sequenz. Allerdings können alternative Promotorsequenzen, die in Säugerzellen wirksam sind, möglicherweise ergänzt werden, wie beispielsweise ein anderer viraler Promotor, so z. B. der Human-Cytromegalovirus(CMV)-Früh-Promotor oder ein T7-Polymerasepromotor. Geeignete Plasmide zur Expression der NP- und Polymerase-Untereinheiten kann beispielsweise beginnen von dem Plasmid pGT-h aufgebaut werden, der ebenfalls in der vorstehend erwähnten Veröffentlichung von Berg et al. beschrieben wurde.
  • Die Erfindung wird nachfolgend eingehender unter spezieller Bezugnahme auf die Wiederherstellung von Influenza A-Viren beschrieben. Für die Aufgabe der Influenza A-Wiederherstellung mit Hilfe der erfindungsgemäßen Strategie unter Nutzung von Plasmiden, welche die benötigten vRNAs direkt exponieren, hat sich beispielsweise die Verwendung von Vero-Zellen (Nierenzellen afrikanischer Meerkatzen) erwiesen, obgleich andere Zellen, die das Wachstum der Influenzaviren fördern, zum Einsatz gelangen können, wie beispielsweise vorzugsweise 293T-Human-Embryo-Nierenzellen (293T-Zellen werden hier als technische Referenz offenbart). Diese Zellen können vorzugsweise auf die Oberfläche einer entsprechenden Petrischale transfiziert werden.
  • Es ist bekannt, dass Vero-Zellen eine mangelhafte Interferon-Expression haben (Diaz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1998) 85, 5259–5263), die ein Faktor beim Erzielen einer guten Viren-Wiederherstellung sein könnte. Es wird damit daraus extrapoliert, dass Vero-Zellen und andere Zellen mit Mangel an Interferonaktivität oder Reaktion, die das wachstumsegmentierter Minus-Strang-RNA-Viren fördert, in der Praxis der Erfindung verwendbar sind.
  • Entsprechende Beträge und Verhältnisse von Vektoren zur Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens lassen sich mit Hilfe von routinemäßigen Versuchen ermitteln. Als Anleitung kann man im Fall von liposomaler Transfektion oder Calcium-Ausfällung von Plasmiden in Wirtszellen ins Auge fassen, dass jedes Plasmid mit nur wenigen Mikrogrammen, wie beispielsweise 1 bis 10 μg, verdünnt bis zu einer abschließenden DNA-Gesamtkonzentration von etwa 0,1 μg/ml vor dem Mischen mit dem Transfektionsreagens in konventioneller Weise eingesetzt werden kann. Vorzugsweise kann man Vektoren verwenden, die NP- und/oder RNA-abhängige RNA-Polymerase-Untereinheiten bei einer höheren Konzentration exprimieren, als solche, die vRNA-Segmente exprimieren.
  • Nach bestimmten Aspekten gewährt die vorliegende Patentanmeldung auch ein Verfahren, um in kultivierten Zellen infektiöse Viruspartikel eines Influenza A-Virus zu erzeugen, welches Verfahren umfasst:
    • (i) Bereitstellen einer ersten Population von Zellen, die in der Lage sind, das Wachstum des Virus zu unterstützen und die modifiziert worden sind, so dass sie in der Lage sind, (a) die Genom-vRNAs des Virus in Abwesenheit eines Helfer-Virus zu schaffen und (b) ein Nucleoprotein und RNA-abhängige RNA-Polymerase zu schaffen, wodurch RNP-Komplex oder -Komplexe, die diese vRNAs enthalten, gebildet werden können, und diese Viruspartikel zusammengefügt werden können, wobei dieses Genom-RNAs direkt in diesen Zellen unter Kontrolle eines Pol I-Promotors eines Säugers oder eines funktionellen Derivats davon, z. B. den trunkierten Human Pol I-Promotor, wie vorstehend bereits ausgeführt wurde, exprimiert werden, und
    • (ii) Inkulturnehmen dieser Zellen, wodurch die Viruspartikel erzeugt werden.
  • Diese Virus erzeugenden Zellen können beispielsweise bevorzugt Vero-Zellen oder andere Zellen mit Mangel an Interferonaktivität oder Reaktion sein, die das Wachstum eines segmentierten Minus-Strang-RNA-Virus fördert. Alle oder einige der codierenden Sequenzen für die Genom-vRNAs, Nucleoprotein- und RNA-abhängige RNA-Polymerasen können in den gewählten Wirtszellen bereitgestellt werden, indem Expressionsvektoren in die Zelle eingeführt werden.
  • Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung unter Bezugnahme auf die helfervirusfreie Wiederherstellung eines Influenza A-Virus. Allerdings kann, wie vorstehend bereits ausgeführt wurde, die Offenbarung auf andere segmentierte Minus-Strang-RNA-Viren und speziell beispielsweise Influenzaviren anderer Typen angewendet werden.
  • BEISPIELE
  • BEISPIEL 1
  • HERSTELLUNG VON PLASMIDEN, WELCHE DIE VRNA-SEGMENTE EINES INFLUENZA A-VIRUS CODIEREN
  • Es wurden 8 Plasmide, die jeweils ein anderes vRNA-Segment von Influenza A/WSN/33 exprimieren, verwendet (pPOL1-PB2-RT, pPOL1-PB1-RT, pPOL1-PA-RT, pPOL1-HA-RT, pPOL1-NP-RT, pPOL1-NA-RT, PPOL1-M-RT und pPOL1-NS-RT). Diese waren pUC19- oder pUC18-basierende Plasmide analog der Struktur zum Modell-vRNA-Segment-codierenden Plasmid pPOL1-CAT-RT, beschrieben von Pleschka et al. (1996) J. Virol, 70, 4183–4192, abgesehen von der Substitution der cDNA, die das vRNA-CAT-Reportergen-Segment codiert (ein offenes Leseraster für Chloramphenicol-Acetyltransferase in negativer Polarität, flankiert von den nicht codierenden Regionen des NS codierenden vRNA-Segments von Influenza A/WSN/33) durch cDNA codierendes negatives vRNA-Segment von Influenza A/WSN/33. In jedem dieser Plasmide wurde ein trunkierter Human-RNA-Pol I-Promotor (Positionen –250 bis –1) fusioniert mit dem Ende des vRNA-Segments, das cDNA codiert, um das korrekte 5'-Ende der transkribierten vRNA zu gewährleisten. Ebenfalls wurde in dem jeweiligen vRNA-Segment, das Plasmide codiert, die Sequenz des Hepatitis-Deltavirus-Genom-Ribozyms bereitgestellt, um ebenfalls das korrekte 3'-Ende der transkribierten vRNA zu sichern.
  • Beispiele von Influenza A/WSN/33 für die Herstellung der cDNA-Inserts der vorstehend beschriebenen Plasmide lassen sich beispielsweise aus dem WHO Collaborating Centre, Division of Virology, National Institute for Medical Research, London, UK, erhalten.
  • BEISPIEL 2
  • HERSTELLUNG VON PLASMIDEN ZUR EXPRESSION DER PB1-, PB2-, PA- UND NP-PROTEINE VON INFLUENZA A/WSN/33
  • Es wurden zusätzlich vier Expressionsplasmide (pGT-h-PB1, pGT-h-PB2, pGT-h-PA und p-GT-h-NP) hergestellt, die jeweils in der Lage waren, ein anderes aus den erforderlichen PB1-, PB2-, PA- und NP-Proteinen ausgewähltes Protein unter der Kontrolle des Adenovirus-2-Haupt-Spät-Promotors verknüpft mit einer synthetischen Sequenz zu expremieren, die die gespleisste dreiteilige Führungssequenz von Human-Adenovirus Typ 2 aufwies. Dieser Promotor soll nach früheren Veröffentlichungen eine Expression von Proteinen in Zellen in großer Menge ergeben, die auf eine serumfreie Suspensionskultur angepasst sind (Berg et al. (1993) Bio Techniques, 14, 972–978). Die pGT-h-Reihe von Protein-Expressionsplasmiden wurde aufgebaut, indem die offenen Leserahmen für die PB1-, PB2-, PA- und NP-Proteine in die BclI-Klonierungsstelle des pGT-h-Plasmids insertiert wurden (Berg et al. (1993), ibid).
  • Die Expressionsplasmide, die die viralen Nucleoprotein- und 3 Protein-Untereinheiten der viralen RNA-abhängigen RNA Polymerase codieren wurden in Human-293-Zellen oder Vero-Zellen mit dem Expressionsplamid pPOL1-CAT-RT cotransfiziert. Sowohl in den transfizierten Human-293-Zellen als auch in den Vero-Zellen konnte eine CAT-Aktivität nachgewiesen werden. Es wurden Vero-Zellen für die helfervirusfreie Erzeugung von Influenza A/WSN/33 aus transfizierten vRNA-Segmenten gewählt, wie eingehender nachfolgend beschrieben wird, da sie das Wachstum von Influenza A/WSN/33 besser unterstützen als Human-293-Zellen (etwa um eine log-Differenz im Virus-Titer).
  • BEISPIEL 3
  • HELFERVIRUSFREIE WIEDERHERSTELLUNG VON INFLUENZA A/WSN/33
  • Für eine Virus-Wiederherstellung wurden in Schalen mit einem Durchmesser von 8,5 cm nahezu konfluente Vero-Zellen (etwa 107 Zellen bedecken etwa 90% der Schale) mit den vier Protein-Expressionsplasmiden und den 8 vRNA Transkriptionsplasmiden, wie vorstehend beschrieben wurde, cotransfiziert. Für diesen Schritt der Cotransfektion wurden 5 μg jedes der Polymerase-Protein-Expressionsplasmide, 10 μg des NP-exprimierenden Plasmids und 3 μg jedes der 8 vRNA-codierenden Plasmide bis zu einer Konzentration von 0,1 μg/μl in 20 mM Hepes-Puffer (pH 7,5) verdünnt. Die DNA-Lösung wurde dem verdünnten DOTAP-liposomalen Transfektionsreagens (Boehringer Mannheim) zugegeben, das 240 μl DOTAP und 720 μl des 20 mM Hepes-Puffer (pH 7,5) enthielt. Die Transfektionsmischung wurde bei Raumtemperatur für 15 Minuten inkubiert und mit 6,5 ml ”Minimal Essential Medium” (MEM) gemischt, die 0,5% fötales Kälberserum (FCS), 0,3% Rinderserum Albumin (BSA), Penicillin und Streptomycin enthielt. Diese Mischung wurde den Vero-Zellen, gewaschen mit PBS, zugegeben. Nach 24 Stunden wurde das Transfektionsmedium von den Zellen entfernt und gegen 8 ml frisches Medium (MEM) ausgetauscht, das 0,5% FCS, 0,3% BSA, Penicillin und Streptomycin enthielt. Die transfizierten Vero-Zellen wurden für mindestens vier Tage nach der Transfektion in Kultur genommen. Das Medium von den transfizierten Zellen wurde jeden Tag gesammelt und auf Vorhandensein von Influenzavirus durch Aufziehen eines 0,5 ml-Aliquots auf MDBK-Zellen in konventioneller Weise assayiert. Der Rest des Mediums wurde in Fläschchen mit 75 cm2 von subkonfluenten MDBK-Zellen zur Amplifikation etwaiger wiederhergestellter Vieren gegeben. Die ursprünglich transfizierten Zellen wurden nach Zugabe von 8 ml frischem Medium weiter inkubiert.
  • Diese Prozedur führte zu der Wiederherstellung des infektiösen Influenzavirus am Tag 4 nach der Transfektion. Es wurden aus einer 8,5 cm-Schale, die näherungsweise 107 Zellen enthielt etwa 10 bis 20 plaquebildende Viruspartikel erhalten. Der wiederhergestellte Virus zeige eine spezifische Eigenschaft, die für den InfluenzaA/WSN/33-Virus charakteristisch ist, das heißt des bildete Plaque auf MDBK-Zellen in Abwesenheit von Trypsin. Die von dem wiederhergestellten Virus gebildeten Plaques waren in der Größe mit denen vergleichbar, die mit einer authentischen Kontroll-A/WSN/33-Virusprobe gebildet wurden, die auf den gleichen MDBK-Zellen aufgezogen wurden.
  • Um zu bestätigen, dass die auf den MDBK-Zellen beobachteten viralen Plaques, die mit von dem Kulturmedium transfizierter Zellen geernteten Virus von den geklonten cDNAs deriviert sind, wurden in 2 der 8 vRNA-Segmente cDNA genetische Markierungen eingeführt. Es wurde eine cDNA aufgebaut, die ein HA-vRNA-Segment mit einer Mutation von 6 Nucleotiden nahe dem 3'-Ende des Segmentes codiert. Es wurden die Nucleotide 31 bis 35 von dem 3'-Ende (3'-UUUUG-5') gegen 3'-AAAAC-5' ausgetauscht, was zu einer Aminosäure-Substitution an der Aminosäure 4 (K → F) und an der Aminosäure 5 (L → V) in der Nähe des N-Terminus von HA innerhalb des Signalpeptids führte. Darüber hinaus wurde eine stille C → U-Mutation am Nucleotid 40 geschaffen. Mit diesen Änderungen wurden mehrere neue Restriktionsorte eingeführt, einschließend ein einmaliger SpI-Ort. Die das NA-Segment codierende cDNA wurde so mutiert, dass sie ein NA-Segment codiert, das zwei stille Mutationen an dem Nucleotiden 1358 und 1360 enthielt, um so einen neuen einmaligen SacI Restriktionsort einzuführen (Plaschke et al., J. Virol (1996) 70, 4188–4192).
  • Zur Isolation von vRNA wurde Medium von MDBK-Zellen verwendet, die mit dem wiederhergestellten Transfektionsvirus infiziert waren. Es wurden 100 μl des Mediums mit 5 u RNase-freier DNase behandelt, um jegliche mitgeschleppte restliche Plasmid-DNA zu entfernen. Nach 15 Minuten bei 37°C wurde die vRNA unter Verwendung eines RNeasy Mini Kit (Qiagen) isoliert. Kurze Regionen der HA- und NA-vRNAs' von denen zu erwarten war, dass sie die genetischen Markierungen enthielten, wurden mit Hilfe von RT-PCR amplifiziert und anschließend durch Digerierung mit SpeI- und SacI-Restriktionsenzymen analysiert. Eine Kontrolle der gleichen Regionen der HA- und NA-Segmente wurde von vRNA, isoliert aus authentischem Influenza A/WSN/33 Virus unter Verwendung der gleichen RT-PCR-Primer amplifiziert.
  • Die aus dem wieder hergestellten Virus erhaltenen PCR-Produkte und das Kontrollvirus waren von gleicher Größe. Diejenigen, die aus den HA- und NA-Segmenten des wiederhergestellten Virus stammten, konnten mit SpeI und SacI digeriert werden. Allerdings wurden die PCR-Produkte, die dem Kontrollvirus entsprachen, mit den gleichen Enzymen erwartungsgemäß nicht digeriert. Das Weglassen reverser Transkriptase in Kontroll-RT-PCR-Reaktionen führte zu keinerlei wahrnehmbaren PCR-Produkten.
  • BEMERKUNGEN
  • Die verstehend beschriebenen Untersuchungen zeigen, dass es möglich ist, einen Influenza A-Virus durch Cotransfektion von 8 Transkriptionsplasmiden für die einzelnen vRNA-Segmente und 4 Expressionsplasmide wiederherzustellen, die die erforderlichen NP-, PB1-, PB2- und PA-Proteine in Vero-Zellen in Abwesenheit von jeglichem Helfervirus zu codieren.
  • Aus den vorstehend ausgeführten Untersuchungen geht hervor, dass durch Exprimieren von Minus-Sense-vRNA-Segmenten Influenza-Virus erzeugt wurde. Dieses scheint im Widerspruch zu früheren Untersuchungen zu stehen, bei denen die Bedeutung der Verwendung von Plus-Strang-RNA zur Wiederherstellung von Minus-Strang-RNA-Viren betont wurde und einschließlich dem Bunyamwera-Virus, dessen Genom 3 Segmente hat (Schnell et al. (1994) EMBOJ., 13, 4195–4203; Roberts und Rose (1998) Virology 247, 1–6; Bridgen und Elliot (1996) 93, 15400–15404). In jüngerer Zeit sind jedoch auch erfolgreiche Wiederherstellungen von nichtsegmentierten Minus-Strang-RNA-Viren von Minus-Sense-RNA veröffentlicht worden (Kato et al. (1996) Genes Cells 1, 569–579; Durbin et al. (1997) Virology 235, 323–332).
  • Nach einem Protokoll der Erfindung, wie vorstehend veranschaulicht wurde, coexistiert in Frühstufen die Post-Transfektion-Plus-Sense-mRNA von vier Protein-Expressionsplasmiden mit nackter Minus-Sense-Genom-vRNA, transkribiert von den Transkriptionsplasmiden. Damit können sich doppelsträngige RNA bilden. Die Bildung einer solchen doppelsträngigen RNA in Human-Zellen könnte möglicherweise zur Einleitung von interferon-vermittelten antiviralen Reaktionen führen und dementsprechend das Wachstum jeglichen wiederhergestellten Virus unterdrücken. Allerdings ist eine solche Interferon-Einleitung als ein Problem in Vero-Zellen überflüssig, da diese Zellen einen Mangel an Interferon-Expression haben.
  • BEISPIEL 4
  • HELFERVIRUS – FREIE WIEDERHERSTELLUNG VON A/PR/8/34-INFLUENZA (CAMBRIDGE-VARIANTE)
  • Um aus rekombinanter DNA A/PR/8/34 vollständig wiederherzustellen, wurden Plasmide erzeugt. Die 12 Plasmide sind analog zu den in der Wiederherstellung von A/WSN/33-Virus beschriebenen (siehe vorstehend die Beispiele 1 und 2) mit einigen Modifikationen. Die für die Synthese von 8 vRNA-Segmenten durch zelluläre RNA-Polymerase 1 erforderlichen 8 Plasmide, haben eine murine rDNA-Terminatorsequenz (GenBank, Zugriffsnummer M12074) anstelle des Hepatitis-Delta-Virus-Ribozyms, um das exakte 3'-Ende der vRNA-Segmente zu erzeugen. Die 4 Protein-Expressionsplasmide für die A/PR/8/34-Polymerase-Untereinheiten (PB1, PB2, PA) und das Nucleoprotein (NP) basieren auf kommerziell verfügbare pcDNA3 (Invitrogen, Catalogue Nr. V790-20), die über einen Cytomegalovirus(CMV)-Promotor und eine BGH(bovines Wachstumshormon)-Poly(A)-Stelle verfügt.
  • AUFBAU DES PLASMIDS pPolISapIT
  • Um ein leichtes Klonen der 8 vRNA-Segmente zu ermöglichen, wurden ein neuer allgemeiner Klonierungsvektor, pPolISapIT, aufgebaut. In diesem neuen Konstrukt befindet sich die murine rDNA-Terminatorsequenz (Positionen +572 bis +715) unterhalb des Pol I-Promotors. Der Pol I-Promotor und die Terminatorsequenzen sind durch eine 24 bp Linkersequenz (5'-AGAAGAGCCAGATCTGGCTCTTCC-3') getrennt, die SapI-Restriktionsstellen enthält.
  • Es wurde das Plasmid pPolISapIT deriviert von pPolI-CAT-RT (ursprünglich beschrieben von Pleschka et al., J Virol 70, 4188–4192, 1996). Von pPolI-CAT-T wurde ein DNA-Fragment, das einer Region der murinen rDNA-Terminatorsequenz enthielt (Positionen +335 bis +715, GenBank, Zugriffsnummer M12074) in den SaII-Ort von pPolI-CAT-RT insertiert, um pPolI-CAT-T zu erzeugen. Danach wurden unter Anwendung einer inversen PCR-Methode das CAT-Gen, das Ribozym und ein Teil der murinen rDNA-Terminatorsequenz (Positionen +335 bis +571) aus dem pPolI-CAT-T deletiert. Gleichzeitig wurde die vorstehend angegebene 24 bp Linkersequenz durch die PCR-Primer zwischen dem Pol I-Promotor und der murinen rDNA-Terminatorsequenz eingeführt.
  • AUFBAU DER VRNA-EXPRESSIONSVECTOREN
  • Es wurde mit Hilfe der RT-PCR aus von Influenza A/PR/8/34-Virus (Cambridge-Variante) isolierter vRNA eine cDNA erzeugt, indem PCR-Primer mit SapI-Überhängen verwendet wurden. Nach der SapI-Digestion wurden die PCR-Produkte in mit SapI digeriertes pPolISapIT geklont.
  • VIRUS-WIEDERHERSTELLUNG
  • Eine Cotransfektion der 12 Plasmide in Vero-Zellen unter Verwendung von DOTAP-Transfektionsreagenz und unter Einhaltung des in Beispiel 3 gegebenen Protokolls (siehe auch Foder et al., J. Virol (November 1999) 73, 9679–9682) führte zur Wiederherstellung von infektiösen Influenza A/PR/8/34-Partikeln am Tag 4 der Post-Transfektion. Es wurden an MDCK-Zellen in Gegenwart von 0,5 μg/ml Trypsin-Plaque-Assays und virale Virus-Amplifikation ausgeführt.
  • BEMERKUNGEN
  • Diese Ergebnisse zeigen, dass ein Influenza A/PR8/34-Virus erfolgreich mit Hilfe der erfindungsgemäßen helfervirusfreien Methode wieder aufgebaut werden kann. Dieses ist deshalb von besonderem Interesse, da Influenza A/PR8/34 dafür bekannt ist, gegenüber Menschen avirulent zu sein (Beare et al. (1975) ”Trials in man with live recombinants made from A/PR8/34 (HON1) and wild H3 N2 influenza viruses”, Lancet (ii) 729–732), während Influenza A/WSN/33 für die Verabreichung an Menschen wegen seines bekannten Neurotropismus in Mäusen als ungeeignet angesehen wird. Es wird daher vorgeschlagen, dass Influenza A/PR8/34 in einer geeigneten attenuierten Form als ein Elternvirus für die Entwicklung von Lebendimpfstoff geeignet sein würde. Beispielsweise ließe sich die helfervirusfreie Viruswiederherstellung gemäß der Erfindung anwenden, um ein attenuiertes, neukombiniertes Virus beginnend mit Expressionsvektoren für die vRNAs von Influenza A/PR8/34 abseits der Substitution der HA- und NA-Genomsegmente von A/PRS/34-Virus mit den HA- und NA-Genomsegmenten eines Influenzastammes in Verbindung mit einer epidemischen Influenzainfektion zu erzeugen. Eine weitere Veranschaulichung für die Anwendung der helfervirusfreien Viruswiederherstellung gemäß der Erfindung zur Erzeugung neukombinierter Influenzaviren ist in dem nachfolgenden Beispiel 6 gegeben.
  • BEISPIEL 5
  • VERBESSERTE PROTOKOLLE FÜR DIE HELFERVIRUSFREIE WIEDERHERSTELLUNG VON INFLUENZA A/WSN/33
  • Die 4 in Beispiel 2 angegebenen Protein-Expressionsplasmide wurden gegen die in Beispiel 4 angegebenen und von pcDNA3 derivierten Protein-Expressionsplasmide ausgetauscht. Unter Verwendung dieser 4 Protein-Expressionsplasmide zusammen mit den 8 vRNA-Transkriptionsplasmiden die in Beispiel 1 angegeben wurden (siehe ebenfalls Forder et al., J. Virol (1999) 73, 9679–9682), die in den nachfolgenden 3 Protokollen ausgeführt sind, wurden zwischen 100 und 10.000 Plaque-bildende Viruspartikel von 106 Zellen am Tag 2 der Nachtransfektion erhalten. Dieses sind mindestens um das Hundertfache mehr Viren, als mit Hilfe der Transfektionsuntersuchungen erhalten wurden, von denen in Beispiel 3 berichtet wurde.
  • PROTOKOLL (A): TRANSFEKTION VON 293T-ZELLEN UNTER VERWENDUNG VON TRANSFEKTIONSREAGENZ ”LIPOFECTAMINE 2000”
  • Es wurde 1 μg jedes der 12 Plasmide vereint und das Volumen durch Zugabe von OPTIMEM-Medium (Gibco BRL) auf 50 μl eingestellt. In einem Polystyrol-Röhrchen wurden 12 μl LipofectAMINE 2000 (Gibco BRL, Katalognummer 11 668–027) und 238 μl OPTIMEM-Medium vereint und die Mischung für 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die DNA-Mischung wurde sodann tropfenweise zu dem verdünnten Transfektionsreagenz LipofectAMINE 2000 gegeben. Nach Inkubieren der DNA-Lipofectamine-Mischung bei Raumtemperatur für etwa 20 Minuten wurde die Mischung tropfenweise in 293T-Zellsuspension gegeben (etwa 106 Zellen in 1 ml DMEM mit einem Gehalt von 10% FCS ohne Antibiotika). Nach etwa 16 bis 24 Stunden nach der Transfektion wurde die Transfektionsmischung entfernt und durch 1 ml DMEM ersetzt, die 0,5% FCS, 0,3% BSA, Penicillin und Streptomycin enthielt. 24 bis 48 Stunden später wurde das wiederhergestellte Virus einem Screening durch Aufziehen von 100 μl des Mediums von den transfizierten 293T-Zellen auf MDBK-Zellen und indem der Rest des Mediums auf einem 25 cm2 semikonfluenten MDBK-Kolben geschickt wurde, unterzogen. Den transfizierten 293T-Zellen wurde 1 ml DMEM zugegeben, das 0,5% FCS, 0,3% BSA, Penicillin und Streptomycin enthielt zugegeben und die Inkubation für weitere 2 bis 3 Tage fortgesetzt, bevor die Plaquewertbildung und Amplifikation auf MDEK-Zellen fortgesetzt wurde.
  • PROTOKOLL (B): TRANSFEKTION VON 293T-ZELLEN UNTER ANWENDUNG DER CALCIUM-PHOSPHAT-AUSFÄLLUNG
  • Zur Transfektion unter Anwendung der Calciumphosphat-Ausfällung wurden 1 μg jedes der 12 Plasmide vereint und die Plasmidmischung zu 250 μl zweimal HEBS-Puffer gegeben (40 mM Hepes, 280 mM NaCl, 10 mM KCl, 2 mM Na2HPO4, 10 mM Glukose, pH 7,05). Sodann wurden 250 μl von 250 mM CaCl2 zugegeben und die Inhaltsstoffe des Röhrchens heftig gemischt. Nach 20 bis 30 Minuten bei Raumtemperatur wurde der Niederschlag mit 1 ml DMEM gemischt, das 10% FCS enthielt, Penicillin und Streptomycin, und wurde zu einer 293T-Zellsuspension gegeben (etwa 106 Zellen in 1 ml DMEM, das 10% FCS ohne Antibiotika enthielt). Nach etwa 16 bis 24 Stunden nach der Transfektion wurde die Transfektionsmischung entfernt und ersetzt durch 1 ml DMEM, das 0,5% FCS, 0,3% BSA, Penicillin und Streptomycin enthielt. 24 bis 48 Stunden später wurde das wiederhergestellte Virus nach dem vorstehend ausgeführten Protokoll (a) einem Screening unterzogen.
  • PROTOKOLL (C): TRANSFEKTION VON VERO-ZELLEN UNTER VERWENDUNG EINES DOTAP-TRANSFEKTIONSREAGENZES
  • Es wurden 1 μg jedes der 12 Plasmide vereint und das Volumen durch Zugabe von 20 mM Hepes (pH 7,5) auf 120 μl eingestellt, um eine DNA-Konzentration von etwa 0,1 μg/ml zu erhalten. Anschließend wurde die DNA-Lösung zu einem verdünnten DOTAP-Transfektionsreagenz (Boehringer) gegeben, das 60 μl DOTAP und 200 μl von 20 mM Hepes (pH 7,5) in einem Polystyrol-Röhrchen enthielt. Nach Inkubation der DNA-DOTAP-Mischung bei Raumtemperatur für etwa 15 bis 20 Minuten wurde die Mischung tropfenweise in eine Suspension von Vero-Zellen gegeben (etwa 106 Zellen in 1 ml MEM mit einem Gehalt von 10% FCS, Penicillin und Streptomycin). Nach etwa 16 bis 24 Stunden nach der Transfektion wurde die Transfektionsmischung entfernt und ersetzt durch 1 ml MEM mit einem Gehalt von 0,5% FCS, 0,3% BSA, Penicillin und Streptomycin. 24 bis 48 Stunden später wurde des wiederhergestellte Virus einem Screening unterzogen, indem man 100 μl des Mediums von den transfizierten Vero-Zellen auf MDBK-Zellen aufzog und den Rest des Mediums auf einen 25 cm-halbkonfluenten MDBK-Kolben gab. Es wurden 1 ml von MEM mit einem Gehalt von 0,5% FCS, 0,3% BSA, Penicillin und Streptomycin den transfizierten Vero-Zellen zugegeben und die Inkubation für weitere 2 bis 3 Tage fortgesetzt, bevor die Plaquebildung und Amplifikation auf MDBK-Zellen wiederholt wurde.
  • BEISPIEL 6
  • HELFERVIRUSFREIE WIEDERHERSTELLUNG VON NEUKOMBINIERTEN INFLUENZAVIREN
  • Die plasmidbasierende Wiederherstellung gemäß der Erfindung ist erfolgreich zur Erzeugung von neukombinierten Influenzaviren angewendet worden. Es wurden die folgenden neukombinierten Viren erzeugt:
    • (i) A/WSN/33 mit dem PA-Segment deriviert von A/PR/8/34
    • (ii) A/WSN/33 mit dem NP-Segment deriviert von A/PR/8/34
    • (iii) A/WSN/33 mit dem M-Segment deriviert von A/PR/8/34
    • (iv) A/WSN/33 mit dem PB2-Segment deriviert von A/FPV/Dobson/34
  • Diese Beispiele demonstrieren den Nutzen der helfervirusfreien Methode zur Isolierung der Reassortanten. Neukombinierte Viren basierend auf A/PR8/34 (oder andere geeignete Stämme) sind für die Erzeugung konventioneller abgetöteter Impfstoffe erforderlich, da sie zu einem hohen Titer in embryonierten Hühnereiern wachsen – verwendet in der kommerziellen Produktion von abgetöteten Influenza-Impfstoffen. Wie vorstehend bereits ausgeführt wurde, lässt sich auf diese Weise erkennen, dass eine bedeutende Anwendung einer helfervirusfreien Virus-Wiederherstellung gemäß der vorliegenden Erfindung eine leichtere und direktere Isolation von neukombinierten Viren ist, als mit Hilfe der klassischen Methode des Realisolierens von Reassortanten aus einer gemischten Infektion von Zellen mit zwei Lebendviren. Was entscheidend ist, unter Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das notwendige Screening vieler potentieller Reassortanten, bevor die benötigten isoliert werden, überflüssig gemacht.
  • BEISPIEL 7
  • HELFERVIRUSFREIE WIEDERHERSTELLUNG VON INFLUENZA A/WSN/33 AUF ECR-293-ZELLEN
  • Es ist die Wiederherstellung von Influenza A/WSN/33 auf EcR-293NP-Zellen erreicht worden, eine Zelllinie, mit der stabil Influenza NP durch Transfizieren von 11 Plasmiden exprimiert wird.
  • EcR-293NP-Zellen wurden von der kommerziell verfügbaren Zelllinie EcR-293 (Invitrogen, Katalog-Nummer R650-07) deriviert, die konstitutiv die VgEcR- und RXR-Untereinheiten des Ecdysone-Rezeptors exprimiert. Die Influenza NP-Expression in derartigen Zellen ist als Reaktion auf Ponasteron A induzierbar. Es wurde das gleiche Protokoll verwendet, wie in Beispiel 5(a) ausgeführt wurde, indem ein LipofectAMINE 2000-Transfektionsreagenz mit der Ausnahme eingesetzt wurde, dass pcDNA-NP weggelassen wurde, da das NP-Protein für die anfängliche Enkapsidierung der vRNA-Segmente durch die EcR-293NP-Zellen bereitgestellt wurde.
  • BEISPIEL 8
  • HELFERVIRUSFREIE WIEDERHERSTELLUNG EINES REKOMBINANTEN INFLUENZAVIRUS, DAS EIN FREMDANTIGEN EXPRIMIERT
  • Es wurde das Plasmid pPOL1-E6N18-2A-NA erzeugt, dass zum Exprimieren eines chimären vRNA-Segmentes auf der Basis des NA-vRNA-Segmentes von Influenza A/WSN/33-Virus in der Lage ist. Die modifizierende vRNA-codierende Sequenz wurde zwischen Sequenzen insertiert, die einem trunkierten Human-PolI-Promotor und Hepatitis-Delta-Virus-Ribozym entsprach wie bei der Herstellung von Pol I-Expressionsplasmiden entsprechend der Beschreibung in Beispiel 1. Das resultierende chimäre Gen enthielt einen langen offenen Leserahmen (ORF), der die ersten 88 Aminosäuren des E6-Proteins von Human-Papillomavirus 18 (HPV 18) codiert, gefolgt von 17 Aminosäuren entsprechend dem Selbstspaltungsmotiv der 2A-Protease des Maul- und Klauenseuchenvirus (FMDV, ”foot-and-mouth-desease-virus”), gefolgt von der Aminosäuresequenz der NA von Influenza A/WSN/33. Die codierende Region wurde flankiert von den nichtcodierenden Regionen des NA-Gens von A/WSN/33-Virus. Auf diese Weise wurde ein chimäres Influenzavirus-Gen erzeugt, das ein Polyprotein codiert, welches einer Selbstspaltung unterliegt und die Erzeugung eines HPV-derivierten Polypeptids und des NA-Proteins zufolge hat. Eine ähnliche Strategie für die Expression von Fremdantigenen durch Influenzavirus-Vektoren, die durch klassische RNP-Transfektion erzeugt wurden, sind früher bereits beschrieben worden (T. Muster und A. Garcia-Sastre, Genetic manipulation of influenza viruses, im Lehrbuch der Influenza, K. G. Nicholson, R. G. Webster & A. J. Hay, Herausgeber Seite 93–106 (1998), Blackwell Science Ltd, Oxford, UK.)
  • Der rekombinante Influenzavirus-Vektor, der das HPV18-derivierte Antigen exprimiert wurde erzeugt durch Cotransfektion in 293T-Zellen pPOL1-E6N18-2A-NA zusammen mit 7 PoII-Expressionsvektoren, die virale RNAs vom Wildtyp codieren, das heißt PB2, PB1, PA, HA, NP, M und NS entsprechend der Beschreibung in Beispiel 1, und zusammen mit den 4 Pol II-Expressions-Vektoren, die entsprechend der Beschreibung in Beispiel 5 die PB2-, PB1-, PA- und NP-Proteine codieren. Das wiederhergestellte Virus hatte die korrekte Nucleotidsequenz, was mit Hilfe der Sequenzanalyse seiner NA-spezifischen viralen RNA bestätigt wurde.

Claims (33)

  1. Verfahren zum Erzeugen von infektiösen Viruspartikeln eines Influenza A-Virus, welches Verfahren umfasst: Einführen von Expressionsvektoren in kultivierte Zellen, die in diesen Zellen die vollständigen genomischen vRNA-Segmente dieses Virus exprimieren und wobei diese Zellen das Wachstum des Virus unterstützen und diese Zellen auch ein Nukleoprotein und eine RNA-abhängige RNA-Polymerase bereitstellen, wodurch RNP-Komplexe gebildet werden, die die genomischen vRNA-Segmente dieses Virus enthalten, und die infektiösen Viruspartikel durch diese Zellen in Abwesenheit eines Helfervirus erzeugt werden und wobei diese Zellen kein Interferon erzeugen.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem ein oder mehrere weitere Expressionsvektoren in diesen Zellen eingesetzt werden, um ein oder mehrere Proteine zu exprimieren, die aus dem Nukleoprotein und den Untereinheiten der RNA-abhängigen RNA-Polymerase ausgewählt sind.
  3. Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, bei dem eine Zell-Linie eingesetzt wird, die in der Lage ist, ein oder mehrere des Nukleoproteins und der Untereinheiten der RNA-abhängigen RNA-Polymerase zu exprimieren.
  4. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3, bei dem das Virus ein reassortantes Virus ist, das über vRNA-Segmente verfügt, die von mehr als einem parentalen Virus abgeleitet sind.
  5. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 4, bei dem die Zellen Vero-Zellen sind.
  6. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 5, bei dem die in Anspruch 1 definierten Expressionsvektoren genomische vRNA-Segmente dieses Virus exprimieren.
  7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, ferner umfassend das Amplifizieren der gebildeten Viruspartikel durch einen oder mehrere nachfolgende zelluläre Infektionsschritte, bei dem der gleiche oder verschiedene Zelltypen eingesetzt werden.
  8. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 7, ferner umfassend das Isolieren infektiöser Viruspartikel.
  9. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 8, ferner umfassend einen Schritt der viralen Attenuation oder Abtötung.
  10. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 9, bei dem alle erforderlichen Expressionsvektoren durch Verwendung eines liposomalen Transfektionsreagens, Calciumphosphat-Ausfällung oder Elektroporation in die Zellen cotransfiziert werden.
  11. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis bis 10, bei dem die Expressionsvektoren alle Plasmide sind.
  12. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis bis 11, bei dem die in Anspruch 1 definierten Expressionsvektoren aus separaten Expressionsvektoren zur Expression jedes vRNA-Segments des Virus bestehen.
  13. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis bis 12, bei dem die Expression jedes vRNA-Segments unter der Kontrolle einer Promotorsequenz steht, die von einem Pol I-Promotor eines Säugers abgeleitet ist.
  14. Verfahren nach Anspruch 14, bei dem die Promotorsequenz eine trunkierte humane Pol I-Promotorsequenz ist, die aus Nukleotiden –250 bis –1 des entsprechenden nativen Promotors oder einem funktionellen Derivat davon besteht.
  15. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 14, bei dem der kodierenden Sequenz für jedes vRNA-Segment in den Expressionsvektoren eine Ribozym-Sequenz oder Transkriptionsterminator folgen, der an jeder RNA ein korrektes 3'-Ende erzeugen.
  16. Verfahren nach Anspruch 2, bei dem die Expression von einem oder mehreren viralen Proteinen aus den weiteren Expressionsvektoren unter der Kontrolle einer regulatorischen Sequenz steht, die ausgewählt ist aus dem Adenovirus 2-Major Late Promotor, verknüpft mit der gespleißten, Tripartite-Leadersequenz von humanem Adenovirus Typ 2 oder dem humanen Cytomegalovirus-Immediate-Early Promotor oder einem funktionellen Derivat dieser regulatorischen Sequenz.
  17. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, ferner umfassend das Inkorporieren eines attenuierten oder abgetöteten Virus in einer Vakzin-Zusammensetzung.
  18. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17, bei dem das Virus mindestens ein vRNA-Segment hat, das in der Lage ist, die Expression einer zu dem Virus heterologen Sequenz in Targetzellen zu dirigieren, die mit diesem Virus infiziert sind.
  19. Verfahren nach Anspruch 18, bei dem die zu dem Virus heterologe Sequenz ein antigenes Peptid oder antigenes Polypeptid codiert und welches Verfahren ferner das Inkorporieren dieses Virus in eine Vakzin-Zusammensetzung umfasst.
  20. Modifizierte Zellen, wie in Anspruch 1 oder Anspruch 5 hergestellt.
  21. Verfahren zum Erzeugen infektiöser Viruspartikel eines segmentierten Minus-Strang-Virus, welches Verfahren das Kultivieren modifizierter Zellen nach Anspruch 20 umfasst.
  22. Verfahren zum Erzeugen infektiöser Viruspartikel eines Influenza A-Virus in kultivierten Zellen, welches Verfahren umfasst: Bereitstellen einer ersten Population von Zellen, die in der Lage sind, das Wachstum des Virus zu unterstützen und die modifiziert worden sind, um (a) die genomischen vRNA's des Virus und (b) ein Nukleoprotein und RNA-abhängige RNA-Polymerase bereitzustellen, wodurch RNP-Komplexe, die diese genomischen vRNA's enthalten, gebildet werden und die infektiösen Viruspartikel zusammengefügt werden, wobei die genomischen vRNA's direkt in diesen Zellen unter der Kontrolle eines Pol I-Promotors eines Säugers oder eines funktionellen Derivats davon in Abwesenheit eines Helfervirus exprimiert werden und wobei die Zellen kein Interferon erzeugen.
  23. Verfahren nach Anspruch 22, ferner umfassend das Amplifizieren der zusammengefügten Viruspartikel mit Hilfe eines oder mehrerer nachfolgender zellulärer Infektionsschritte unter Einsatz desselben oder eines anderen Zelltyps.
  24. Verfahren nach Anspruch 22 oder Anspruch 23, ferner umfassend das Isolieren von infektiösen Viruspartikeln.
  25. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 22 bis 24, ferner umfassend einen Attenuierungs- oder viralen Abtötungsschritt.
  26. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 22 bis 25, das ferner das Inkorporieren von attenuierten oder abgetöteten Viruspartikeln in eine Vakzin-Zusammensetzung umfasst.
  27. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 22 bis 25, bei dem das Virus mindestens ein vRNA-Segment hat, das in der Lage ist, die Expression einer zu dem Virus heterologen Sequenz in Targetzellen zu dirigieren, die mit diesem Virus infiziert sind, wobei das Verfahren ferner das Inkorporieren des Virus, wenn geeignet nach der Attenuation oder nach dem Abtöten, in eine pharmazeutische Zusammensetzung gemeinsam mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger oder Verdünnungsmittel umfasst.
  28. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 22 bis 27, bei dem die Zellen Vero-Zellen sind.
  29. Modifizierte Zellen wie in Anspruch 22 oder Anspruch 28 hergestellt.
  30. Verfahren zum Herstellen infektiöser Viruspartikel eines segmentierten Minus-Strang-Virus, das das Kultivieren modifizierter Zellen nach Anspruch 29 umfasst.
  31. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 7 bis 15 und 17 bis 19, bei dem die zur Amplifikation verwendeten Zellen MDBK-Zellen oder MDCK-Zellen sind.
  32. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 23 bis 28, bei dem die zur Amplifikation verwendeten Zellen MDBK-Zellen oder MDCK-Zellen sind.
  33. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 19, 21 bis 28 oder 30 bis 32, bei dem die Zellen EcR-293NP-Zellen sind.
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