ES2278621T5 - Reconstrucción in vitro de virus arn segmentados de polaridad negativa. - Google Patents
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Abstract
Método para generar partículas virales infecciosas de un virus ARN segmentado de polaridad negativa que tiene más de 3 segmentos genómicos de ARNv, comprendiendo dicho método: introducir en células cultivadas vectores de expresión que expresan en dichas células los segmentos genómicos de ARNv completo de dicho virus, o los correspondientes ARNc completos de dicho virus, en el que dichas células soportan el crecimiento de dicho virus, proporcionando también dichas células una nucleoproteína y una ARN polimerasa dependiente de ARN mediante lo cual se forman los complejos de RNP que contienen los segmentos genómicos de ARNv de dicho virus y se producen dichas partículas virales infecciosas por dichas células en ausencia de un virus cooperador y en el que dichas células no producen interferón.
Description
Reconstrucción in vitro de virus ARN
segmentados de polaridad negativa.
La presente invención se refiere a la
reconstitución (rescate) de virus influenza A en células cultivadas
a partir de ADN recombinantes. Más particularmente, se refiere al
rescate del virus influenza A que tiene generalmente 8 segmentos
genómicos de ARNv, mediante un sistema dirigido completamente por
vectores, lo que evita la necesidad de un virus cooperador.
Los últimos cinco años han sido testigos del
rescate de la mayoría de los virus ARN no segmentados de polaridad
negativa importantes a partir de ADN recombinante. En primer lugar,
Schnell y otros, tuvieron éxito en la recuperación del virus de la
rabia a partir de ADN recombinante (EMBO J. (1994) 13,
4195-4203). Poco después, se desarrollaron sistemas
de rescate basados en plásmidos para el virus de la estomatitis
vesicular (Lawson y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995) 92,
4477-4481; Whelan y otros, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA (1995) 92, 8388-8392), virus respiratorio
sincitial (Collins y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995) 92,
11563-11567; Jin y otros, Virology
(1998)251, 206-214), virus del sarampión
(Radecke y otros, EMBO J. (1995) 14, 5773-5784) y
virus Sendai (Garcin y otros, EMBO J. (1995) 14,
6087-6094; Kato y otros, Genes Cells (1996) 1,
569-579). Más recientemente, se han desarrollado
sistemas de rescate basados en plásmidos para el virus parainfluenza
humano tipo 3 (Durbin y otros, Virology (1997) 235,
323-332; Hoffman y Banerjee, J. Virol. (1997) 71,
4272-4277), virus de la peste bovina (Baron y
Barrett, J. Virol. (1997) 71, 1265-1271), virus de
simio 5 (He y otros, Virology (1997) 237, 249-260),
virus respiratorio sincitial bovino (Buchholz y otros, J. Virol.
(1999) 73, 251-259) y virus de la enfermedad de
Newcastle (Peeters y otros, J. Virol. (1999) 73,
5001-5009).
Bridgen y Elliott (Proc. Natl. Acad. Sci. USA
(1996) 14, 15400-15404) han notificado el rescate
sin virus cooperador de un bunyavirus que tiene sólo 3 segmentos
genómicos de ARNv a partir de ADNc mediante la expresión de ARN
anti-genoma y proteínas virales bajo el control de
un promotor del bacteriófago T7. Sin embargo, hasta ahora no se ha
sabido si una estrategia basada totalmente en plásmidos puede
aplicarse satisfactoriamente para rescatar virus ARN segmentados de
polaridad negativa con un mayor número de segmentos de ARNv, tales
como el virus influenza, sin la ayuda de un virus cooperador.
La gripe sigue siendo una amenaza mundial
constante para la salud en seres humanos y, por tanto, hay una
necesidad particular para un método listo para generar virus
influenza modificados con mutaciones conocidas en cualquiera de los
segmentos genómicos del ARNv. La obtención mediante ingeniería
genética de los segmentos de ARNv del virus influenza para la
expresión de secuencias heterólogas también es de gran interés, por
ejemplo, en el desarrollo de nuevas vacunas eficaces contra el
virus influenza y un segundo agente patógeno. Se conocen tres tipos
de virus influenza designados como los tipos A, B y C. Hasta ahora,
el virus de la influenza A ha sido el principal centro de atención
en lo que se refiere a la manipulación genética. El genoma de un
virus influenza A de tipo natural consiste en 8 segmentos de ARN de
sentido negativo de cadena sencilla que codifica para 10
polipéptidos: las proteínas ARN polimerasas dependientes de ARN (PB
1, PB2, y PA), la nucleoproteína (NP), las proteínas de la matriz
(M1, M2), dos glucoproteínas de superficie que se proyectan desde la
envuelta lipoproteica (hemaglutinina (HA) y neuraminidasa (NA)) y
las proteínas no estructurales NS1 y NS2. Las proteínas HA, NA, NP
y polimerasa se codifican por segmentos genómicos
monocistrónicos.
En cuanto a otros virus ARN segmentados de
polaridad negativa, durante el ciclo de replicación de un virus
influenza, el genoma viral se transcribe a ARNm y se replica a ARN
complementario (ARNc). Para esto, es necesario que los segmentos
genómicos de ARNv formen complejos con la nucleoproteína y la ARN
polimerasa dependiente de ARN en complejos de ribonucleoproteína
(RNP) (Huang y otros, J. Virol. (1990) 64,
5669-5673; García-Sastre, Trends In
Biotechnology (1998) 16, 230-235). Inicialmente, con
el fin de manipular el genoma de un virus influenza, las RNP se
reconstituyeron in vitro de ARN transcrito a partir de ADN de
plásmido en presencia de las proteínas polimerasas PB1, PB2 y PA y
la nucleoproteína aislada del virus influenza purificado (Enami y
otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1990) 87,
3802-3805; Enami y Palese, J. Virol. (1991) 65,
2711-2713; Muster y García-Sastre,
Genetic manipulation of influenza viruses in Textbook of influenza
(1998), capítulo. 9, eds. Nicholson y otros). Las RNP
reconstituidas in vitro se transfectaron en células
infectadas con un virus influenza cooperador, que proporcionó los
segmentos de ARN y las proteínas virales requeridas restantes, dando
como resultado la generación de virus transfectantes. Esta técnica
ha sido extremadamente útil en el avance de la comprensión de la
biología molecular y la patogenicidad de los virus influenza. Sin
embargo, se basa en métodos de selección altamente especializados
para aislar los virus transfectantes del virus cooperador, lo que
limita su uso a ciertos segmentos de ARN de un número limitado de
cepas
virales.
virales.
Más recientemente, se ha demostrado que es
posible la reconstitución intracelular de un complejo de RNP a
partir de un segmento de ARNv transcrito intracelularmente
utilizando proteínas polimerasas y NP expresadas en plásmidos
(Neumann y otros, Virology (1994) 202, 477-479;
Zhang y Air, Biochem. Biophys. Res. Commun. (1994) 200,
95-101; Pleschka y otros, J. Virol. (1996) 70,
4188-4192). Por ejemplo, Pleschka y otros
demostraron que PB 1, PB2, PA y NP del virus influenza A expresadas
a partir de plásmidos podían encapsidarse, transcribirse y replicar
un ARN similar al ARNv del virus influenza que contiene un gen
indicador ("reporter") de la cloranfenicol acetiltransferasa
(CAT) en células 293 humanas transfectadas. Este gen indicador
similar al ARNv se introdujo en las células huésped escogidas
mediante la transfección de ADN de plásmido
(pPOLI-CAT-RT) que tiene un promotor
truncado de la ARN polimerasa I humana (nucleótidos -250 a -1)
colocado en el sentido de 5' de la región codificante del ARNv. La
secuencia de la ribozima genómica del virus de la hepatitis delta se
colocó en el sentido de 3' de la región codificante del ARNv con el
fin de garantizar el procesamiento del ARN para dar el extremo 3'
correcto del ARNv transcrito. El mismo grupo también notificó que
sustituyendo el plásmido que codifica para el indicador de la CAT
por un plásmido que codifica para un segmento de ARNv del virus
influenza A auténtico, podrían rescatarse complejos de RNP
reconstituidos intracelularmente en virus transfectados con la
infección de las células transfectadas con un virus influenza
cooperador. Pleschka y otros investigaron un sistema de rescate de
este tipo basado en un virus cooperador, empleando segmentos de ARNv
de NA del virus influenza A mutante transcritos intracelularmente.
Sin embargo, volviendo a un sistema de rescate basado enteramente
en plásmidos para el virus influenza, surgen nuevas consideraciones
en lo que se refiere a obtener la expresión adecuada de todas las
secuencias requeridas y la cooperación correcta de estas secuencias
para ensamblar un virus completo.
Brigen y Elliot fueron incapaces de rescatar el
bunyavirus Bunyamwera usando plásmidos que dirigen la
expresión de segmentos genómicos de ARNv más que ARN
anti-genoma. Sin embargo, se ha descubierto que el
rescate sin virus cooperador de un virus influenza A en cultivo
celular es factible mediante contransfección en células cultivadas
de 12 plásmidos que pueden coexpresar 8 segmentos de ARNv y las
proteínas NP y 3 ARN polimerasas necesarias para la formación de
complejos de RNP. Puede extrapolarse esta misma estrategia a una
variedad de otros virus ARN segmentados de polaridad negativa que
tienen un gran número de segmentos genómicos de ARNv, por ejemplo 6
o más, incluyendo, por ejemplo virus influenza de otros tipos y
otros miembros de la familia Orthomyxoviridae tales como los
thogotovirus que contienen 6 segmentos de ARNv. Mientras que los
virus de tipo natural tanto influenza A como influenza B tienen 8
segmentos de ARNv, se ha descrito que los virus influenza A
modificados contienen un segmento de ARNv adicional (Enami y otros,
Virology (1993) 185, 765-90) y los virus influenza
C tienen un segmento de ARNv menos.
Así la presente invención proporciona un método
para generar partículas virales infecciosas de un virus influenza
A, comprendiendo dicho método:
- introducir en células cultivadas vectores de expresión que expresan en dichas células los segmentos genómicos de ARNv completo de dicho virus, en el que dichas células soportan el crecimiento de dicho virus, proporcionando también dichas células una nucleoproteína y una ARN polimerasa dependiente de ARN, mediante lo cual se forman los complejos de RNP que contienen los segmentos genómicos de ARNv de dicho virus y se producen dichas partículas virales infecciosas por dichas células en ausencia de un virus cooperador y en el que dichas células no producen interferón.
Adicionalmente, las células huésped escogidas
pueden, por ejemplo, tener introducidos uno o más vectores de
expresión adicionales que pueden dirigir la expresión en las células
de una o más de las proteínas virales necesarias. Por ejemplo,
puede emplearse un segundo conjunto de vectores de expresión para
expresar en las células huésped todas las subunidades de polimerasa
dependiente de ARN y nucleoproteína. Convenientemente, por ejemplo,
puede usarse un vector de expresión diferente para cada una de esas
proteínas. Alternativamente, las células huésped elegidas pueden,
por ejemplo, obtenerse por ingeniería genética para expresar una o
más de las subunidades de ARN polimerasa dependiente de ARN y
nucleoproteína necesarias. Si todas las proteínas esenciales para
la encapsidación, transcripción y replicación de los ARNv se
proporcionan mediante las células huésped de partida, entonces se
apreciará que sólo se necesita el primer conjunto de vectores de
expresión. Es más, las células huésped de partida elegidas pueden
ser células obtenidas por ingeniería genética para expresar uno o
más de los segmentos genómicos de ARNv del virus deseado. Por medio
de un método de la invención, se apreciará que el rescate de un
virus influenza A puede lograrse sin ninguna asistencia viral, por
ejemplo mediante un método totalmente basado en plásmi-
dos.
dos.
En un aspecto adicional, la invención
proporciona un método para generar en células cultivadas partículas
virales infecciosas de un virus influenza A, comprendiendo dicho
método:
- proporcionar una primera población de células que sea capaz de soportar el crecimiento de dicho virus y que se han modificado para proporcionar (a) el ARNv genómico de dicho virus y (b) una nucleoproteína y una ARN polimerasa dependiente de ARN, mediante lo cual se forman los complejos de RNP que contienen dichos ARNv genómicos y se ensamblan dichas partículas virales infecciosas, expresándose directamente dichos ARNv genómicos en dichas células bajo el control del promotor Pol I de mamífero o un derivado funcional del mismo en ausencia de un virus cooperador, y en el que dichas células no producen interfe- rón.
Se apreciará que las células huésped modificadas
para el rescate viral, tal como se describió anteriormente,
constituyen un aspecto adicional de la presente invención. Las
partículas virales producidas por dicha primera población de
células pueden amplificarse mediante una o más etapas de infección
celular adicionales, por ejemplo, empleando células cultivadas
iguales o diferentes de dicha primera población de células. Para su
uso, las partículas virales así producidas pueden aislarse.
Cuando las partículas virales inicialmente
producidas por las células huésped no se atenúan, puede llevarse a
cabo posteriormente una etapa de atenuación o inactivación viral
convencional, por ejemplo, antes de la formulación para su uso como
vacuna. Las partículas virales generadas según la invención pueden
ser partículas virales recombinantes que pueden expresar una
secuencia heteróloga. Tales partículas, si fuese necesario tras la
atenuación o inactivación según sea apropiado, también pueden
formularse para su uso como vacuna u otro fin terapéutico.
A diferencia de las técnicas de rescate basadas
en virus cooperador anteriores para el virus influenza, los métodos
de la invención pueden usarse fácilmente para la generación de virus
influenza infecciosos del tipo A con múltiples mutaciones en varios
genes diferentes al mismo tiempo. Un método de este tipo también
permite una producción más sencilla y más directa de un virus
influenza A reasortante que contiene segmentos de ARNv derivados de
más de un virus original. Convencionalmente, se obtienen virus
reasortantes mediante la selección de partículas virales de una
infección viral mixta de células. Un método de la invención es
particularmente ventajoso para la producción de un virus influenza
A reasortante que es difícil de aislar mediante métodos
clásicos.
La figura 1 es una representación esquemática de
una realización de la invención, tal como se describe adicionalmente
en los ejemplos 1 a 3, en los que se cotransfectan 12 plásmidos
para la expresión directa de los segmentos de ARNv de un virus
influenza A y la expresión de subunidades de ARN polimerasa
dependiente de ARN y nucleoproteína de influenza A en células Vero
cultivadas (células de riñón de mono verde africano). En esta
realización, se emplean células MDBK (de riñón bovino
Madin-Darby) para un ensayo de placas de lisis y la
amplificación de partículas virales rescatadas. Sin embargo, se
apreciará que pueden emplearse igualmente otras células que
soportan el crecimiento del virus influenza A para el ensayo de
placas de lisis y para la amplificación incluyendo células Vero y
MDCK (riñón canino Madin-Darby). En la figura 1, POL
I = promotor de ARN polimerasa I humano truncado, R= ribozima
genómica del virus de la hepatitis, MLP= promotor tardío principal
de adenovirus tipo 2 unido a una secuencia sintética que comprende
la secuencia líder tripartita de corte y empalme del adenovirus
humano tipo 2 y pA= secuencia de poliadenilación de SV40.
Se prefiere emplear vectores de expresión para
expresar directamente segmentos genómicos de ARNv del virus
influenza A. Estos pueden ser segmentos de ARNv totalmente de tipo
natural o pueden incluir al menos un segmento de ARNv de tipo no
natural, por ejemplo, un segmento de ARNv mutante con una o más
sustituciones, inserciones o deleciones de nucleótidos.
Por ejemplo, al menos un segmento de ARNv
proporcionado en las células huésped puede ser un segmento de ARNv
quimérico que puede expresar una secuencia heteróloga al genoma
viral en células diana infectadas por el virus rescatado. Dicha
secuencia heteróloga, puede codificar para un péptido o un
polipéptido. Alternativamente, puede codificar para un ácido
nucleico tal como una ribozima o un ácido nucleico antisentido. La
secuencia heteróloga puede proporcionarse en un segmento de ARNv
que adicionalmente codifica para una proteína viral nativa completa
tal como se ilustra mediante el segmento de ARNv quimérico descrito
en el ejemplo 8 o puede insertarse en la secuencia codificante para
una proteína viral. Por ejemplo, se sabe que la proteína HA del
virus influenza A puede tolerar un injerto de epítopos en el sitio
antigénico B. Se revisan métodos para construir tales segmentos de
ARNv quiméricos, por ejemplo en, Muster y
García-Sastre, Cap. 9, Textbook of Influenza (1998)
y Palese y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1996) 93,
11354-11358. También se han descrito previamente
estrategias para construir segmentos de ARNv de virus influenza
quiméricos en la solicitud de patente internacional publicada WO
91/03552.
Los segmentos de ARNv proporcionados en las
células huésped pueden incorporar adicional o alternativamente una
o más mutaciones atenuantes. Por ejemplo, los segmentos de ARNv
pueden ser los segmentos de ARNv de un virus influenza A con una
sustitución de par de bases atenuante en una región promotora dúplex
"pan-handle" (estructura con forma de mango de
sartén), en particular, por ejemplo, la sustitución de par de bases
atenuante conocida de A por C y U por G en la posición
11-12' en la región dúplex del ARNv específico de NA
(Fodor y otros, J. Virol. (1998) 6283-6290). Usando
el sistema de rescate de la invención, pueden identificarse nuevas
mutaciones atenuantes. Tal como se indica anteriormente, cuando las
partículas virales no atenuadas se producen inicialmente mediante
un método de la invención, la atenuación o inactivación de las
partículas virales puede, sin embargo, lograrse secuencialmente,
mediante métodos clásicos.
Los virus atenuados o inactivados producidos
según la invención pueden incorporarse posteriormente a la
composición de vacuna de una manera convencional. Cuando tal virus
tiene un segmento de ARNv quimérico, tal como se trató
anteriormente, que codifica para un antígeno foráneo, puede
formularse para lograr la vacunación frente a más de un patógeno
simultáneamente. Los virus recombinantes atenuados producidos según
la invención, que tienen un segmento de ARNv quimérico también
pueden diseñarse para otros usos terapéuticos, por ejemplo un agente
antitumoral o una herramienta para terapia génica, en cuyo caso la
producción de virus vendrá seguida de su incorporación en una
composición farmacéutica apropiada junto con un vehículo o diluyente
farmacéuticamente aceptable.
También, tal como se indicó anteriormente, el
rescate sin virus cooperador según la invención está particularmente
favorecido para la generación de virus reasortantes, especialmente
virus influenza reasortantes deseados para su uso como vacuna. Por
ejemplo, por medio de un rescate viral según la invención, los
segmentos de ARNv de NA y HA de un virus influenza, por ejemplo,
influenza A/PR8/34 que se reconoce como adecuado para la
administración a seres humanos, pueden sustituirse fácilmente por
los segmentos de ARNv de NA y HA de una cepa de virus influenza
asociada con una infección epidémica de gripe. Tales virus influenza
reasortantes pueden, por ejemplo, usarse para la producción de una
vacuna de virus influenza inactivo de la manera convencional (véanse
los ejemplos 4 y 6).
Los vectores de expresión empleados pueden ser
preferiblemente plásmidos que pueden dar la replicación en las
células huésped elegidas. Puede proporcionarse un vector de
expresión diferente para la expresión directa de cada segmento de
ARNv requerido o el ARNc correspondiente. Tal como ya se ha
mencionado anteriormente, puede proporcionarse un segundo conjunto
de vectores de expresión para cada una de las subunidades de ARN
polimerasa dependiente de ARN y la nucleoproteína, por ejemplo, las
subunidades PB1, PB2 y PA de una ARN polimerasa dependiente de ARN
de un virus influenza. Sin embargo, tal como se indicó también
anteriormente, puede usarse alternativamente una línea celular que
puede expresar una o más de estas proteínas, en cuyo caso puede
reducirse o incluso eliminarse el segundo conjunto de vectores de
expresión. El ejemplo 7 ilustra un método de este tipo para el
rescate sin virus cooperador de un virus influenza A empleando una
línea celular que expresa de manera estable la nucleoproteína.
Todos los vectores de expresión necesarios
pueden introducirse preferiblemente en la célula huésped elegida en
una única etapa de cotransfección o cotransducción. Con este fin,
puede emplearse preferiblemente la transfección liposomal, por
ejemplo usando el reactivo de transfección liposomal DOTAP
(Boehinger Mannheim) o LipofectAMINE 2000 (Gibco BRL).
Sin embargo, se apreciará que puede llevarse a
cabo más de una etapa de transferencia de vector, y otros medios
conocidos para la introducción de vectores en las células de
mamíferos empleadas, por ejemplo, electroporación, transfección con
DEAE-dextrano, bombardeo de micropartículas y
transducción viral, por ejemplo, el uso de retrovirus defectuosos
en la replicación. También se prefiere particularmente la
precipitación con fosfato de calcio (véase el ejemplo 5). Puede
elegirse, por ejemplo para introducir en las células huésped
vectores de expresión para la expresión de las proteínas NP y
polimerasa antes de los vectores de expresión para la expresión de
los segmentos de ARNv. Las células huésped en la que los vectores
requeridos se introducen puede estar en una placa de cultivo o
cultivados de otras formas apropiadas para la transfección o
transducción de vectores.
La expresión de los segmentos de ARNv o los
correspondientes ARNc estará preferiblemente bajo el control de una
secuencia promotora derivada de un promotor Pol I de ARN de
mamífero. Particularmente preferido para este fin es el promotor
Pol I de ARN humano truncado que consiste en los nucleótidos -250 a
-1 del promotor nativo correspondiente o un derivado funcional del
mismo (Jones y otros, Proc. Natl. Acad. Sci EE.UU. (1998) 85,
669-673). Sin embargo, alternativamente pueden
usarse otros promotores, incluyendo, por ejemplo, un promotor de
ARN polimerasa T7. Para garantizar el extremo 3' correcto de cada
ARNv o ARNc expresado, cada vector de expresión de ARNv o ARNc
incorporará una secuencia de ribozima o la secuencia de terminación
apropiada en sentido 3' de la secuencia codificante de ARN. Esto
puede ser, por ejemplo, la secuencia de ribozima genómica del virus
de la hepatitis delta o un derivado funcional de la misma.
Alternativamente, por ejemplo, puede emplearse un terminador Pol I
(Neumann y otros, Virology (1994) 202, 477-479). Los
vectores de expresión de ARN pueden construirse de la misma manera
que los vectores de expresión de ARNv descritos en Pleschka y otros,
J. Virol. (1996) 70, 4188-4192.
Cuando se necesitan uno o más vectores de
expresión de proteínas para expresar proteínas virales para la
formación de complejos de RNP, éstos expresarán preferiblemente las
proteína(s) viral(es) requerida(s)
homóloga(s) al virus deseado. La expresión de las
subunidades de la polimerasa dependiente de ARN y la nucleoproteína
puede estar preferiblemente, por ejemplo, bajo el control de una
secuencia reguladora que comprende el promotor tardío principal del
adenovirus 2 unido a la secuencia líder tripartita de corte y
empalme de adenovirus humano tipo 2, tal como se describe por Berg
y otros, BioTechniques, 14, 972-978, o un derivado
funcional de dicha secuencia reguladora. Sin embargo, pueden
sustituirse posiblemente secuencias de promotor alternativas
operativas en células de mamíferos tales como, por ejemplo, otro
promotor viral tal como, por ejemplo, el promotor precoz de
citomegalovirus (CMV) humano o un promotor de polimerasa T7.
Plásmidos apropiados para la expresión de subunidades de polimerasa
y NP pueden construirse, por ejemplo, partiendo del plásmido
pGT-h tal como también se describe en el artículo
anteriormente citado de Berg y otros.
La descripción se describirá adicionalmente a
continuación con referencia específica al rescate de virus influenza
A. Con el fin del rescate del virus influenza A mediante la
estrategia de la invención utilizando plásmidos que expresan
directamente los ARNv requeridos, ha resultado favorable, por
ejemplo, usar células Vero (riñón de mono verde africano), aunque
pueden emplearse otras células que soportan el crecimiento de virus
influenza, por ejemplo, preferiblemente células de riñón
embrionario humano 293T, las células 293T se divulgan aquí como
referencia técnica. Tales células pueden transfectarse
preferiblemente sobre la superficie de una placa de cultivo
adecuada.
Se sabe que las células Vero son deficientes en
la expresión de interferón (Diaz y otros, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA (1998) 85, 5259-5263), lo que puede ser un
factor para alcanzar un buen rescate viral. Por tanto, se extrapola
que las células Vero y otras células deficientes en la actividad o
respuesta de interferón que soportarán el crecimiento de virus ARN
segmentados de polaridad negativa son útiles en la práctica de la
invención.
Pueden determinarse cantidades y razones
apropiadas de vectores para llevar a cabo un método de la invención
mediante experimentación rutinaria. Como guía, en el caso de
transfección liposomal o precipitación con calcio de plásmidos en
células huésped, se prevé que cada plásmido puede emplearse con unos
cuantos \mug, por ejemplo de 1 a 10 \mug, por ejemplo diluido
hasta una concentración final de ADN total de aproximadamente 0,1
\mug/ml antes de mezclarlo con el reactivo de transfección de la
manera convencional. Puede preferirse usar vectores que expresan
subunidades de ARN polimerasa dependiente de ARN y/o NP a una
concentración superior que aquellos que expresan segmentos de
ARNv.
Según ciertos aspectos, la presente memoria
descriptiva también proporciona un método para generar en células
cultivadas partículas virales infecciosas de un virus influenza A,
comprendiendo dicho método:
- (i)
- proporcionar una población de células que pueden soportar el crecimiento de dicho virus y que se modifican de modo que sean capaces de proporcionar (a) los ARNv genómicos de dicho virus en ausencia de un virus cooperador y (b) una nucleoproteína y ARN polimerasa dependiente de ARN mediante lo cual pueden formarse el complejo o complejos de RNP que contienen dichos ARNv genómicos y pueden ensamblarse dichas partículas virales, expresándose directamente dichos ARN genómicos en dichas células bajo el control de un promotor Pol I de mamífero o un derivado funcional del mismo, por ejemplo, el promotor Pol I humano truncado tal como se indicó anteriormente y
- (ii)
- cultivar dichas células, mediante lo cual se producen dichas partículas virales.
Dichas células productoras de virus pueden, por
ejemplo, ser preferiblemente células Vero u otras células
deficientes en actividad o respuesta de interferón que soportarán el
crecimiento de un virus ARN segmentado de polaridad negativa.
Pueden proporcionarse todas o algunas de las secuencias codificantes
para dichos ARNv genómicos, nucleoproteína y ARN polimerasa
dependiente de ARN, en las células huésped elegidas introduciendo
vectores de expresión en las células.
Los siguientes ejemplos muestran la invención
con referencia al rescate sin virus cooperador de un virus influenza
A. Sin embargo tal como se indicó anteriormente, la divulgación
puede aplicarse a otros virus ARN segmentados de polaridad
negativa, especialmente, por ejemplo virus influenza de otros
tipos.
Se usaron ocho plásmidos cada uno expresando un
segmento de ARNv diferente del virus influenza A/WSN/33
(pPOL1-PB2-RT,
pPOL1-PB1-RT,
pPOL1-PA-RT,
pPOL1-HA-RT,
pPOL1-NP-RT,
pPOL1-NA-RT,
pPOL1-M-RT y
pPOL1-NS-RT). Éstos eran plásmidos
basados en pUC19 o pUC18 análogos en estructura al plásmido que
codifica para el segmento de ARNv modelo,
pPOL-CAT-RT, descrito en Pleschka y
otros, (1996) J. Virol., 70, 4183-4192, aparte de la
sustitución del ADNc que codifica para el segmento del gen
indicador CAT del ARNv (un marco de lectura abierto para
cloranfenicol acetiltransferasa en polaridad negativa flanqueado
por las regiones no codificantes del segmento de ARNv que codifica
para NS del virus influenza A/WSN/33) mediante un ADNc que codifica
para un segmento de ARNv nativo del virus influenza A/WSN/33. En
cada uno de estos plásmidos, un promotor Pol I de ARN humano
truncado (posiciones -250 a -1) se fusionó con el extremo del ADNc
que codifica para un segmento de ARNv para garantizar el extremo 5'
correcto del ARNv transcrito. También se proporciona en cada uno de
los plásmidos que codifican para un segmento de ARNv, la secuencia
de la ribozima genómica del virus de la hepatitis delta para
garantizar también el extremo 3' correcto del ARNv transcrito.
Pueden obtenerse muestras del virus influenza
A/WSN/33 para la preparación de los insertos de ADNc de los
plásmidos descritos anteriormente, por ejemplo, a partir de W.H.O.
Collaborating Centre, Division of Virology, National Institute for
Medical Research (Centro colaborador de la OMS, División de
Virología, Instituto Nacional para la Investigación Médica),
Londres, R.U.).
Adicionalmente, se prepararon 4 plásmidos de
expresión (pGT-h-PB1,
pGT-h-PB2,
pGT-h-PA y
p-GT-h-NP) que
pueden expresar cada uno una proteína distinta seleccionada de las
proteínas PB1, PB2, PA y NP requeridas bajo el control del promotor
tardío principal de adenovirus 2 unido a la secuencia sintética que
comprende la secuencia líder tripartita de corte y empalme del
adenovirus humano tipo 2. Se notificó anteriormente que este
promotor daba una expresión de alto nivel de proteínas en células
adaptadas para el cultivo en suspensión sin suero (Berg y otros,
(1993) BioTechniques, 14, 972-978). El conjunto de
pGT-h de plásmidos de expresión de proteínas se
construyó insertando los marcos de lectura abiertos para las
proteínas PB1, PB2, PA y NP en el sitio de clonación Bcl I del
plásmido pGT-h (Berg y otros (1993)
ibíd.).
Los plásmidos de expresión que codifican para la
nucleoproteína viral y 3 subunidades de proteína de la ARN
polimerasa dependiente de ARN se cotransfectaron en células 293
humanas o células Vero con el plásmido de expresión
pPOL1-CAT-RT. Tanto en las células
293 humanas como Vero transfectadas, pudo detectarse actividad CAT.
Se eligieron células Vero para la generación sin virus cooperador
del virus influenza A/WSN/33 a partir de segmentos de ARNv
transfectados tal como se describe adicionalmente más adelante dado
que soportan un mejor crecimiento del virus influenza A/WSN/33 que
las células 293 humanas (aproximadamente una diferencia de un log
en el título viral máximo).
Para el rescate viral, se cotransfectaron
células Vero casi confluentes en placas de 8,5 cm de diámetro
(aproximadamente 10^{7} células que cubren aproximadamente el 90%
de la placa) con los cuatro plásmidos de expresión de proteínas y
los ocho plásmidos de transcripción de ARNv descritos anteriormente.
Para esta etapa de cotransfección, se diluyeron 5 \mug de cada
uno de los plásmidos de expresión de proteína polimerasa, 10 \mug
del plásmido de expresión de NP y 3 \mug de cada uno de los 8
plásmidos que codifican para ARNv hasta una concentración de 0,1
\mug/\mul en tampón Hepes 20 mM (pH 7,5). La disolución de ADN
se añadió al reactivo de transfección liposomal DOTAP diluido
(Boehringer Mannheim) que contiene 240 \mul de DOTAP y 720 \mul
de tampón Hepes 20 mM (pH 7,5). Se incubó la mezcla de transfección
a temperatura ambiente durante 15 min. y entonces se mezcló con 6,5
ml de medio esencial mínimo (MEM) que contiene un 0,5% de suero de
ternero fetal (FCS), un 0,3% de albúmina de suero bovino (BSA),
penicilina y estreptomicina. Se añadió esta mezcla a las células
Vero lavadas con PBS. Se eliminó el medio de transfección después
de 24 horas de las células y se sustituyó con 8 ml de medio fresco
(MEM) que contenía un 0,5% de FCS, un 0,3% de BSA, penicilina y
estreptomicina. Las células Vero transfectadas se cultivaron
durante al menos 4 días tras la transfección. Cada día, se recogía
el medio de las células transfectadas y se analizaba para
determinar la presencia de virus influenza mediante un cultivo de
placas de lisis de una alícuota de 0,5 ml sobre células MDBK de la
manera convencional. El resto del medio se transfirió a matraces de
75 cm^{2} de células subconfluentes para la amplificación de
cualquier virus rescatado. Las células transfectadas originales se
incubaron adicionalmente después de añadir 8 ml de medio nuevo.
Este procedimiento dio como resultado la
recuperación del virus influenza infeccioso en el día 4 tras la
transfección. Se obtuvieron aproximadamente de 10 a 20 partículas
virales formadoras de placas de lisis de una placa de 8,5 cm que
contiene aproximadamente 10^{7} células. El virus rescatado mostró
una propiedad específica característica del virus influenza
A/WSN/33, es decir, formó placas de lisis sobre las células MDBK en
ausencia de tripsina. Las placas de lisis formadas por el virus
rescatado son comparables en tamaño con aquellas formadas mediante
la muestra de virus A/WSN/33 auténtico de control que se hizo crecer
sobre las mismas células MDBK.
Para confirmar que las placas de lisis virales
observadas sobre las células MDBK tratadas con virus recogido del
medio de cultivo de células transfectadas se derivaban de los ADNc
clonados, se introdujeron etiquetas genéticas en dos de los 8 ADNc
de segmento de ARNv. Se construyó un ADNc que codifica para un
segmento de ARNv HA con una mutación de 6 nucleótidos cerca del
extremo 3' del segmento. Los nucleótidos 31 a 35 del extremo 3'
(3'-UUUUG-5') se sustituyeron por
3'-AAAAC-5' dando como resultado una
sustitución de aminoácido en el aminoácido
4(K\rightarrowF) y en el aminoácido
5(L\rightarrowV) cerca del extremo
N-terminal de HA dentro del péptido señal. Además,
se creó una mutación silenciosa C\rightarrowU en el nucleótido 40.
Estos cambios introdujeron varios sitios de restricción nuevos,
incluyendo un sitio SpeI único. El ADNc que codifica para el
segmento NA se mutó para codificar para un segmento NA que contiene
dos mutaciones silenciosas en los nucleótidos 1358 y 1360 de modo
que se introduzca un sitio de restricción SacI único nuevo (Pleschka
y otros, J. Virol. (1996) 70, 4188-4192).
Se usó medio de células MDBK infectadas con el
virus transfectante rescatado para aislar ARNv. Se trataron 100
\mul de medio con 5 u de ADNasa sin ARNasa para eliminar cualquier
ADN de plásmido residual remanente. Después de 15 min. a 37ºC, se
aisló ARNv usando el kit RNeasy Mini Kit (Qiagen). Se amplificaron
regiones cortas de los ARNv de HA y NA que se esperaba que
contuviesen las etiquetas genéticas mediante RT-PCR
y después se analizaron mediante digestión con las enzimas de
restricción SpeI y SacI, respectivamente. Como control, también se
amplificaron las mismas regiones de los segmentos HA y NA a partir
del ARNv aislado del virus influenza A/WSN/33 auténtico usando los
mismos cebadores de la RT-PCR.
Los productos de la PCR obtenidos a partir del
virus rescatado y del virus de control eran del mismo tamaño.
Aquellos que provenían de los segmentos HA y NA del virus rescatado
pudieron digerirse con SpeI y SacI respectivamente. Sin embargo,
los productos de la PCR correspondientes al virus de control, tal
como se esperaba, no se digirieron por las mismas enzimas. La
omisión de la transcriptasa inversa en las reacciones de
RT-PCR de control no dio como resultado productos
de la PCR visibles.
Los estudios descritos anteriormente muestran
que es posible rescatar un virus influenza A mediante cotransfección
de 8 plásmidos de transcripción para los segmentos ARNv
individuales y 4 plásmidos de expresión que codifican para las
proteínas NP, PB1, PB2 y PA requeridas en células Vero en ausencia
de cualquier virus cooperador.
Se destaca que en los estudios mencionados
anteriormente, el virus influenza se generó expresando segmentos de
ARNv de sentido negativo. Esto parece contradecir algunos estudios
anteriores que enfatizan la importancia de usar ARN de polaridad
positiva para rescatar virus ARN de polaridad negativa, incluyendo
virus Bunyamwera cuyo genoma está en 3 segmentos (Schnell y
otros, (1994) EMBO J., 13, 4195-4203; Roberts y Rose
(1998), Virology 247, 1-6; Bridgen y Elliot (1996)
93, 15400-15404). Sin embargo, se han notificado
recuperaciones exitosas más recientes de virus ARN no segmentados
de polaridad negativa a partir de ARN de sentido negativo (Kato y
otros, (1996) Genes Cells 1, 569-579; Durbin y otros
(1997) Virology, 235, 323-332).
En un protocolo de la invención, tal como se
ilustró anteriormente, en las fases iniciales tras la transfección,
coexiste ARNm de sentido positivo procedente de los 4 plásmidos de
expresión de proteínas con ARNv genómico desnudo de sentido
negativo transcrito a partir de los plásmidos de transcripción. Por
tanto, puede formarse ARN de doble cadena. La formación de tal ARN
de doble cadena en células humanas podría conducir posiblemente a
la inducción de respuestas antivirales mediadas por interferón y
consecuentemente a la supresión del crecimiento de cualquier virus
rescatado. Sin embargo, tal inducción de interferón se obvia como un
problema en las células Vero dado que tales células son deficientes
en la expresión de interferón.
Con el fin de rescatar A/PR/8/34 completamente
de ADN recombinante, se generaron 12 plásmidos. Los 12 plásmidos
son análogos a los descritos para el rescate del virus A/WSN/33
(véanse los ejemplos 1 y 2 anteriormente), con unas cuantas
modificaciones. Los 8 plásmidos requeridos para la síntesis de los 8
segmentos de ARNv, mediante ARN polimerasa 1 celular, tienen una
secuencia de terminación de ADNr murino (Gen-Bank,
número de registro M12074) en lugar del ribozima del virus de la
hepatitis delta para generar el extremo 3' exacto de los segmentos
de ARNv. Los 4 plásmidos de expresión de proteínas para las
subunidades de polimerasa de A/PR/8/34 (PB1, PB1, PA) y la
nucleoproteína (NP) se basan en el pcDNA3 disponible comercialmente
(Invitrogen, nº de catálogo V790-20), que tiene un
promotor de citomegalovirus (CMV) y un sitio de poli(A) de la
hormona de crecimiento bovina (HCB).
Con el fin de permitir la fácil clonación de los
8 segmentos de ARNv, se construyó un nuevo vector de clonación
básico, pPolISapIT. En este nuevo constructo, la secuencia de
terminación de ADNr murino (posiciones +572 a +715) se sitúa en
sentido 3' del promotor Pol I. El promotor Pol I y las secuencias de
terminación están separadas por una secuencia de ligador de 24 pb
(5'-AGAAGAGCCAGATCTGGCTCTTCC-3'),
que contiene sitios de restricción SapI.
Se derivó el plásmido pPolISapIT de
pPolICAT-RT (descrito originalmente en Pleschka y
otros, J. Virol. 70, 4188-4192, 1996). Se insertó
un fragmento de ADN que contiene una región de la secuencia de
terminación de ADNr murino (posiciones +335 a +715, número de
registro de GenBank M12074) en el sitio SalI de
pPolI-CAT-RT para generar
pPolI-CAT-T. Posteriormente, usando
una técnica de PCR inversa, se eliminaron el gen CAT, la ribozima y
parte de la secuencia de terminación de ADNr murino (posiciones +335
a +571) de pPolI-CAT-T. Al mismo
tiempo, se introdujo la secuencia de ligador de 24 pb dada
anteriormente a través de los cebadores de PCR entre el promotor
Pol I y la secuencia de terminación de ADNr murino.
Se generó ADNc mediante RT-PCR a
partir de ARNv aislado del virus influenza A/PR/8/34 (variante
Cambridge) usando los cebadores de PCR con proyecciones SapI. Tras
la digestión con SapI, se clonaron los productos de la PCR en
pPolISapIT digerido con SapI.
La cotransfección de los 12 plásmidos en células
Vero usando el reactivo de transfección DOTAP y siguiendo el
protocolo facilitado en el ejemplo 3 (véase también Fodor y otros,
J. Virol. (noviembre de 1999) 73, 9679-9682) dio
como resultado el rescate de partículas infecciosas del virus
influenza A/PR/8/34 en el día 4 tras la transfección. Los ensayos
de placas de lisis y la amplificación viral se realizaron sobre
células MDCK en presencia de tripsina 0,5 \mug/ml.
Estos resultados demuestran que el virus
influenza A/PR8/34 puede rescatarse satisfactoriamente mediante el
método sin virus cooperador de la invención. Esto es de particular
interés puesto que se sabe que el virus influenza A/PR8/34 es
avirulento para los seres humanos (Beare y otros (1975) Trials in
man with live recombinants made from A/PR8/34 (HON1) and wild H3 N2
influenza viruses, Lancet (ii) 729-732) mientras que
el virus influenza A/WSN/33 no se considera adecuado para la
administración a seres humanos por su conocido neurotropismo en
ratones. Así, se propone que el virus influenza A/PR8/34, en una
forma atenuada de manera adecuada, sería adecuado como virus
original para el desarrollo de una vacuna viva. Por ejemplo, el
rescate viral sin virus cooperador según la invención podría usarse
para generar un virus reasortante atenuado partiendo de vectores de
expresión para los ARNv del virus influenza A/PR8/34 aparte de la
sustitución de los segmentos genómicos HA y NA del virus A/PR8/34
por los segmentos genómicos HA y NA de una cepa de virus influenza
asociada con una infección epidémica de gripe. A continuación, en
el ejemplo 6 se facilitan ejemplos adicionales del uso del rescate
viral sin virus cooperador según la invención para generar virus
influenza reasortantes.
Los 4 plásmidos de expresión de proteínas
especificados en el ejemplo 2 se sustituyeron por los plásmidos de
expresión de proteínas especificados en el ejemplo 4 derivados de
pcDNA3. Usando estos cuatro plásmidos de expresión de proteínas
junto con los ocho plásmidos de transcripción de ARNv especificados
en el ejemplo 1 (véase también Fodor y otros, J. Virol. (1999) 73,
9679-9682) en los 3 protocolos expuestos a
continuación, se obtuvieron entre 100-10.000
partículas virales formadoras de placas de lisis a partir de
10^{6} células en el día 2 tras la transfección. Esto es al menos
100 veces más virus que el obtenido mediante los estudios de
transfección notificados en el ejemplo 3.
Se combinaron 1 \mug de cada uno de los 12
plásmidos y se ajustó el volumen a 50 \mul añadiendo medio
OPTIMEM (Gibco BRL). En un tubo de poliestireno, se combinaron 12
\mul de LipofectAMINE 2000 (Gibco BRL, nº de cat. 11
668-027) y 238 \mul de medio OPTIMEM y se incubó
la mezcla durante 5 minutos a temperatura ambiente. Entonces se
añadió gota a gota la mezcla de ADN al reactivo de transfección
LipofectAMINE 2000 diluido. Tras incubar la mezcla de
ADN-Lipofectamine a temperatura ambiente durante
aproximadamente 20 minutos, se añadió gota a gota la mezcla a una
suspensión de células 293T (aproximadamente 10^{6} células en 1 ml
de DMEM que contiene un 10% de FCS sin antibióticos).
Aproximadamente a las 16-24 horas tras la
transfección, se retiró la mezcla de transfección y se sustituyó
por 1 ml de DMEM que contiene un 0,5% de FCS, un 0,3% de BSA,
penicilina y estreptomicina. 24-48 horas después, se
seleccionó el virus rescatado mediante cultivo de placas de lisis
de 100 \mul del medio de las células 293 T transfectadas sobre
células MDBK y haciendo pasar el resto del medio sobre un matraz de
MDBK semiconfluentes de 25 cm^{2}. Se añadió 1 ml de DMEM que
contiene un 0,5% de FCS, un 0,3% de BSA, penicilina y
estreptomicina a las células 293T transfectadas y se continuó la
incubación durante otros de 2 a 3 días antes de repetir el cultivo
de placas de lisis y la amplificación sobre células MDBK.
Para la transfección usando precipitación con
fosfato de calcio, se combinaron 1 \mug de cada uno de los 12
plásmidos y se añadió la mezcla del plásmido a 250 \mul de tampón
2x HEBS (Hepes 40 mM, NaCl 280 mM, KCl 10 mM, Na_{2}HPO_{4} 2
mM, glucosa 10 mM, pH 7,05). Luego se añadieron 250 \mul de
CaCl_{2} 250 mM y se mezcló vigorosamente el contenido del tubo.
Tras 20-30 min. a temperatura ambiente, se mezcló el
precipitado con 1 ml de DMEM que contiene un 10% de FCS, penicilina
y estreptomicina y se añadió a una suspensión de células 293T
(aproximadamente 10^{6} células en 1 ml de DMEM que contiene un
10% de FCS sin antibióticos). Aproximadamente a las
16-24 horas tras la transfección, se retiró la
mezcla de transfección y se sustituyó por 1 ml de DMEM que contiene
un 0,5% de FCS, un 0,3% de BSA, penicilina y estreptomicina.
24-48 horas después, se seleccionó el virus
rescatado como en el protocolo (a) anterior.
Se combinaron 1 \mug de cada uno de los 12
plásmidos y se ajustó el volumen a 120 \mul añadiendo Hepes 20 mM
(pH 7,5) para dar una concentración de ADN de aproximadamente 0,1
\mug/\mul. Entonces, se añadió la disolución de ADN a reactivo
de transfección DOTAP diluido (Boehringer) que contiene 60 \mul de
DOTAP y 200 \mul de Hepes 20 mM (pH 7,5) en un tubo de
poliestireno. Tras la incubación de la mezcla de
ADN-DOTAP a temperatura ambiente durante
aproximadamente 15-20 minutos, se añadió gota a gota
la mezcla en una suspensión de células Vero (aproximadamente
10^{6} células en 1 ml de MEM que contiene un 10% de FCS,
penicilina y estreptomicina). Aproximadamente a las
16-24 horas tras la transfección, se retiró la
mezcla de transfección y se sustituyó por 1 ml de MEM que contiene
un 0,5% de FCS, un 0,3% de BSA, penicilina, y estreptomicina.
24-48 horas después, se seleccionó el virus
rescatado mediante cultivo de placas de lisis de 100 \mul del
medio de las células Vero transfectadas sobre células MDBK y
haciendo pasar el resto del medio sobre un matraz de MDBK
semiconfluentes de 25 cm^{2}. Se añadió 1 ml de MEM que contiene
un 0,5% de FCS, un 0,3% de BSA, penicilina y estreptomicina a las
células Vero transfectadas y se continuó la incubación durante otros
de 2 a 3 días antes de repetir el cultivo de placas de lisis y la
amplificación sobre células MDBK.
Se ha usado satisfactoriamente el rescate basado
en plásmidos según la invención para generar virus influenza
reasortantes. Se generaron los siguientes virus reasortantes:
- (i)
- A/WSN/33 con el segmento PA derivado de A/PR/8/34
- (ii)
- A/WSN/33 con el segmento NP derivado de A/PR/8/34
- (iii)
- A/WSN/33 con el segmento M derivado de A/PR/8/34
- (iv)
- A/WSN/33 con el segmento PB2 derivado de A/FPV/Dobson/34
Estos ejemplos demuestran la utilidad del método
sin virus cooperador para aislar virus reasortantes. Se requieren
virus reasortantes basados en A/PR8/34 (u otras cepas adecuadas)
para la producción de vacunas inactivadas convencionales porque
crecen hasta alto título en óvulos de gallina fecundados, usados en
la producción comercial de vacunas inactivadas de gripe. Tal como
se indicó previamente en lo anterior, se observa así que una
importante aplicación del rescate viral sin virus cooperador según
la invención es que es un aislamiento más sencillo y más directo de
virus reasortantes que mediante el método clásico de aislamiento de
virus reasortantes a partir de una infección mixta de células con
dos virus vivos. De manera importante, usando un método de la
invención, se obvia la necesidad de seleccionar muchos posibles
virus reasortantes antes de que se aísle el requerido.
Se ha conseguido el rescate del virus influenza
A/WSN/33 sobre células EcR-293NP, una línea celular
que expresa de manera estable el virus influenza NP, transfectando
11 plásmidos.
Las células EcR-293NP se derivan
de la línea celular disponible comercialmente
EcR-293 (Invitrogen, nº de catálogo
R650-07) que expresa de manera constitutiva las
subunidades VgEcR y RXR del receptor de la ecdisona. La expresión
del virus influenza NP en tales células puede inducirse en respuesta
a ponasterona A. Se usó el mismo protocolo que el especificado en
el ejemplo 5(a) empleando el reactivo de transfección
LipofectAMINE 2000 excepto en que se omitió
pcDNA-NP, puesto que la proteína NP para la
encapsidación inicial de los segmentos de ARNv la proporcionaron
las células EcR-293NP.
Se generó el plásmido
pPOL1-E6N18-2A-NA
que puede expresar un segmento de ARNv quimérico basado en el
segmento de ARNv NA del virus influenza A/WSN/33. Se insertó la
secuencia codificante de ARNv modificada entre secuencias
correspondientes a un promotor Pol I humano truncado y a un ribozima
del virus de la hepatitis delta como para la preparación de los
plásmidos de expresión Pol I descritos en el ejemplo 1. El gen
quimérico resultante contenía un marco de lectura abierto largo
(ORF) que codifica para los primeros 88 aminoácidos de la proteína
E6 de papilomavirus humano 18 (VPH 18), seguido por 17 aminoácidos
correspondientes al motivo de autoescisión de la proteasa 2A del
virus de la fiebre aftosa (VFA), seguido por la secuencia de
aminoácidos del NA del virus influenza A/WSN/33. La región
codificante estaba flanqueada por las regiones no codificantes del
gen NA del virus A/WSN/33. De esta manera, se generó un gen del
virus influenza quimérico que codifica para una poliproteína que
experimenta autoescisión, dando como resultado la generación de un
polipéptido derivado de VPH y la proteína NA. Previamente se ha
descrito una estrategia similar para la expresión de antígenos
foráneos mediante vectores de virus influenza generados mediante la
transfección con RNP clásica (T. Muster y A.
Garcia-Sastre, Genetic manipulation of influenza
viruses, en Textbook of Influenza, K.G. Nicholson, R.G. Webster
& A.J. Hay, eds., págs. 93-106 (1998),
Blackwell Science Ltd, Oxford, RU.).
Se generó el vector del virus influenza
recombinante que expresa el antígeno derivado de VPH18 mediante la
cotransfección en células 293T de
pPOL1-E6N18-2A-NA
junto con 7 vectores de expresión de PolI que codifican para los
ARN virales de tipo natural, es decir, PB2, PB1, PA, HA, NP, M y NS
según se describe en el ejemplo 1 y los 4 vectores de expresión de
PolII que codifican para las proteínas PB2, PB1, PA y NP según se
describe en el ejemplo 5. El virus rescatado tiene la secuencia de
nucleótidos correcta confirmada mediante el análisis de secuencia
de su ARN viral específico de NA.
Claims (33)
1. Método para generar partículas virales
infecciosas de un virus influenza A, comprendiendo dicho método:
- introducir en células cultivadas vectores de expresión que expresan en dichas células los segmentos genómicos de ARNv completo de dicho virus, en el que dichas células soportan el crecimiento de dicho virus, proporcionando también dichas células una nucleoproteína y una ARN polimerasa dependiente de ARN mediante lo cual se forman los complejos de RNP que contienen los segmentos genómicos de ARNv de dicho virus y se producen dichas partículas virales infecciosas por dichas células en ausencia de un virus cooperador y en el que dichas células no producen interferón.
2. Método según la reivindicación 1, en el que
se emplean uno o más vectores de expresión adicionales en dichas
células para expresar una o más proteínas seleccionadas de dicha
nucleoproteína y las subunidades de dicha ARN polimerasa
dependiente de ARN.
3. Método según la reivindicación 1 o la
reivindicación 2, en el que se emplea una línea celular que puede
expresar una o más de dicha nucleoproteína y las subunidades de
dicha ARN polimerasa dependiente de ARN.
4. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho virus es un virus
reasortante que tiene segmentos de ARNv derivados de más de un
virus original.
5. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en el que dichas células son células
Vero.
6. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en el que dichos vectores de expresión
definidos en la reivindicación 1 expresan segmentos genómicos de
ARNv de dicho virus.
7. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, que comprende además amplificar dichas
partículas virales formadas mediante una o más etapas de infección
celular posteriores empleando el mismo o diferente tipo de
células.
8. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, que comprende además aislar partículas
virales infecciosas.
9. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, que comprende además una etapa de
inactivación o atenuación viral.
10. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9, en el que todos los vectores de expresión
requeridos se cotransfectan en dichas células usando un reactivo de
transfección liposomal, precipitación con fosfato de calcio o
electroporación.
11. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 10, en el que dichos vectores de expresión son
todos plásmidos.
12. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 11, en el que dichos vectores de expresión
definidos en la reivindicación 1 consisten en vectores de expresión
separados para la expresión de cada segmento de ARNv de dicho
virus.
13. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 12, en el que la expresión de cada segmento de
ARNv está bajo el control de una secuencia promotora derivada de un
promotor PolI de mamífero.
14. Método según la reivindicación 13, en el que
dicha secuencia promotora es una secuencia promotora Pol I humana
truncada que consiste en los nucleótidos -250 a -1 del
correspondiente promotor nativo o un derivado funcional del
mismo.
15. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 14, en el que la secuencia codificante para
cada segmento de ARNv en dichos vectores de expresión está seguida
por una secuencia de ribozima o terminador de la transcripción que
produce un extremo 3' correcto de cada uno de dichos ARN.
16. Método según la reivindicación 2, en el que
la expresión de una o más proteínas virales a partir de dichos
vectores de expresión adicionales está bajo el control de una
secuencia reguladora seleccionada del promotor de expresión tardía
principal de adenovirus 2 unido a la secuencia líder tripartita de
corte y empalme del adenovirus humano de tipo 2 o el promotor de
expresión precoz de citomegalovirus humano, o un derivado funcional
de dicha secuencia reguladora.
17. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 16, que comprende además incorporar un virus
atenuado o inactivado en una composición de vacuna.
18. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 17, en el que dicho virus tiene al menos un
segmento de ARNv que puede dirigir la expresión de una secuencia
heteróloga a dicho virus en células diana infectadas por dicho
virus.
19. Método según la reivindicación 18, en el que
dicha secuencia heteróloga a dicho virus codifica para un péptido
antigénico o polipéptido antigénico y que comprende además
incorporar dicho virus en una composición de vacuna.
20. Células modificadas según se producen en la
reivindicación 1 o la reivindicación 5.
21. Método de producción de partículas virales
infecciosas de un virus segmentado de polaridad negativa que
comprende cultivar células modificadas según la reivindicación
20.
22. Método para generar en células cultivadas
partículas virales infecciosas de un virus influenza A,
comprendiendo dicho método:
- proporcionar una primera población de células que son capaces de soportar el crecimiento de dicho virus y que se han modificado para proporcionar (a) los ARNv genómicos de dicho virus y (b) una nucleoproteína y ARN polimerasa dependiente de ARN mediante lo cual se forman complejos de RNP que contienen dichos ARNv genómicos y se ensamblan dichas partículas virales infecciosas, expresándose directamente dichos ARNv genómicos en dichas células bajo el control de un promotor Pol I de mamífero o un derivado funcional del mismo en ausencia de un virus cooperador, y en el que dichas células no producen interferón.
23. Método según la reivindicación 22, que
comprende además amplificar dichas partículas virales ensambladas
mediante una o más etapas de infección celular posteriores empleando
el mismo o diferente tipo de células.
24. Método según la reivindicación 22 o la
reivindicación 23, que comprende además aislar partículas virales
infecciosas.
25. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 22 a 24, que comprende además una etapa de
atenuación o de inactivación viral.
26. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 22 a 25, que comprende además incorporar partículas
virales atenuadas o inactivadas en una composición de vacuna.
27. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 22 a 25, en el que dicho virus tiene al menos un
segmento de ARNv que puede dirigir la expresión de una secuencia
heteróloga a dicho virus en células diana infectadas por dicho
virus y que comprende además incorporar dicho virus, si es apropiado
tras la atenuación o inactivación, en una composición farmacéutica
junto con un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.
28. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 22 a 27, en el que dichas células son células
Vero.
29. Células modificadas según se producen en la
reivindicación 22 o la reivindicación 28.
30. Método de producción de partículas virales
infecciosas de un virus segmentado de polaridad negativa que
comprende cultivar células modificadas según la reivindicación
29.
31. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 7 a 15 y 17 a 19, en el que las células usadas para
la amplificación son células MDBK o células MDCK.
32. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 23 a 28, en el que las células usadas para la
amplificación son células MDBK o células MDCK.
33. Método según las reivindicaciones 1 a 19, 21
a 28 ó 30 a 32, en el que las células son células
EcR-293NP.
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