ES2563402T3 - Señal para el empaquetamiento de vectores del virus de la gripe - Google Patents

Señal para el empaquetamiento de vectores del virus de la gripe Download PDF

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Abstract

Un vector del virus de la gripe para la expresión y empaquetamiento de ARNv recombinante, en el que el vector comprende: secuencias correspondientes a la región no codificante en 3' del ARNv de NA del virus de la gripe y secuencias codificantes de NA que incluyen secuencias de incorporación de NA en 3', un segmento de ácido nucleico heterólogo que comprende un marco de lectura abierto heterólogo, secuencias codificantes de NA que incluyen secuencias de incorporación de NA en 5' y la región no codificante en 5' del ARNv de NA. en el que las secuencias codificantes de NA que incluyen secuencias de incorporación de NA en 3' incluyen al menos de 21 nucleótidos hasta 250 nucleótidos correspondientes a los nucleótidos 1 a 21 a 1 a 250 de los nucleótidos codificantes en 5' para NA, y en el que las secuencias codificantes de NA que incluyen secuencias de incorporación de NA en 5' incluyen al menos de 39 nucleótidos a 250 nucleótidos correspondientes a los 39 nucleótidos más en 3' a los 250 nucleótidos más en 3' de los nucleótidos codificantes de NA en 3', y en el que el vector no codifica una NA funcional.

Description

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DESCRIPCION
Senal para el empaquetamiento de vectores del virus de la gripe Antecedentes de la invencion
El genoma de los virus de la gripe A y B esta compuesto por ocho segmentos de ARN monocatenarios de polaridad negativa, dos de los cuales codifican glicoprotemas de la cubierta, hemaglutinina (HA) y neuraminidasa (NA). La replicacion del virus de la gripe se inicia a traves de la union de las protemas HA del virus sobre la superficie del virion a los receptores celulares que contienen acido sialico. Despues de la union a los receptores, los viriones son captados por las celulas huesped mediante endocitosis. El ambiente acido en el endosoma tardfo desencadena cambios conformacionales en la HA y se inicia la fusion entre la cubierta viral y la membrana endosomica, y activa el canal ionico M2, lo que da como resultado la entrada de protones al interior del virion. Se piensa que la exposicion del interior del virion a pH bajo altera las interacciones sensibles a acido entre la protema M1 y el complejo de ribonucleoprotema (RNP), lo que culmina en la liberacion de RNP al citoplasma. A continuacion, el RNP es transportado al nucleo, donde el ARNm viral y el genoma viral se sintetizan. El ARNm entra en el citoplasma y se sintetizan las protemas virales. La nucleoprotema (NP) entra en el nucleo y encapsida el ARNv recien sintetizado y, junto con las tres protemas subunidades de la polimerasa (PA, PB1, PB2), forma el RNP. En presencia de las protemas M1 y NS2, se exporta el RNM hacia fuera del nucleo. Las tres protemas asociadas a la membrana plasmatica (HA, NA y M2) y el RNP interaccionan y forman nuevos viriones mediante gemacion. La NA es responsable de la liberacion del virus desde las celulas infectadas a traves de la eliminacion del acido sialico de los glicoconjugados celulares y las glicoprotemas virales (Lamb et al., 2000).
Los virus de tipo A se dividen en subtipos basados en las antigenicidades de HA (H1-H15) y NA (N1-N9). En las celulas infectadas con dos tipos diferentes de virus A se producen reagrupados intratfpicos que poseen varias combinaciones de segmentos genicos (Wright et al., 2000). No obstante, en la naturaleza no se han detectado reagrupados intertfpicos entre los virus de tipo A y de tipo B, aunque ambos virus circulan de forma conjunta en las poblaciones humanas.
Los investigadores han intentado sin exito generar reagrupados entre los virus de tipo A y B en el laboratorio (Kaverin et al, 1983; Mikheera et al., 1982; Tobita et al., l983). Muster et al. (1991) generaron un virus de tipo A mutante que contiene un segmento en el cual las regiones no codificantes de un segmento de NA se habfan sustituido por otras del gen no estructural (NS) del virus de tipo B. Aunque el virus mutante se replico mas lentamente y alcanzo tftulos mas bajos que el virus silvestre, la generacion de dicho virus sugirio que las regiones no codificantes del segmento NS de tipo B eran compatibles con los componentes del virus de la gripe de tipo A a nivel de transcripcion y replicacion del ARN. Por el contrario, un segmento de ARN que posee un segmento de codificacion extrano flanqueado por las regiones no codificantes en 3' y 5' de un segmento de ARN del virus de la gripe A no se mantuvo de forma estable en los viriones despues de un pase repetido (Luytjes et al., 1989). Muster et al. (1991) tambien divulgan que el virus mutante estaba atenuado en los ratones y que los animales infectados con el virus mutante eran resistentes a la exposicion con el virus silvestre.
Se conoce la secuencia del ARN del segmento 1 del virus de la gripe A (numero de acceso en UniProt NC_002023) y se ha descubierto que una region de aproximadamente 150 nucleotidos desde el extremo 5' del ARN del segmento 1 del virus de la gripe A es importante para mantener la estabilidad del genoma (Duhaut et al. 2000. Virology 275, 278-285). Tambien se ha descubierto que el ARNv de la neuraminidasa (NA) posee una senal que dirige la incorporacion de este segmento en los viriones (Fujii et al. 2003. PNAS 100, 2002-2007). Tambien se han notificado vectores para la expresion de las secuencias del virus de la gripe (documento WO 00/60050) y tambien se han introducido secuencias heterologas en los vectores de expresion de la gripe (Castrucci et al. 1994. J. Virol. 68, 3486-3490; Sastre et al. 1994. Dev. Biol. Stand. 82, 237-246). Tambien se han notificado canales ionicos virales mutantes y virus que comprenden dichos canales (documento WO 01/79273). No obstante, no se conocen secuencias espedficas del virus de la gripe para la incorporacion de secuencias unidas durante la replicacion viral y, por tanto, se necesita un metodo para identificar las secuencias del virus de la gripe para la incorporacion y/o mantenimiento de secuencias unidas durante la replicacion del virus de la gripe.
Sumario de la invencion
La invencion se refiere, en general, a una molecula de acido nucleico recombinante aislada (polinucleotido), por ejemplo un vector, que comprende secuencias de incorporacion (una “senal de empaquetamiento” o una senal de encapsidacion del ARNv) para el virus de la gripe para la expresion de un segmento de acido nucleico heterologo que comprende un marco de lectura abierto heterologo.
La presente invencion proporciona un vector viral de la gripe para la expresion y empaquetamiento de ARNv recombinante, en el que el vector comprende: secuencias correspondientes a la region no codificante en 3' del ARNv de NA del virus de la gripe y secuencias codificantes de NA que incluyen secuencias de incorporacion de NA en 3', un segmento de acido nucleico heterologo que comprende un marco de lectura abierto heterologo, secuencias codificantes de NA que incluyen secuencias de incorporacion de NA en 5' y la region no codificante en 5' del ARNv
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de NA, en las que las secuencias codificantes de NA que incluyen secuencias de incorporacion de NA en 3' incluyen al menos de 21 nucleotidos hasta 250 nucleotidos correspondientes a los nucleotidos de 1 a 21 a 1 a 250 de los nucleotidos codificantes en 5' para NA y en las que las secuencias codificantes de NA que incluyen secuencias de incorporacion de NA en 5' incluyen al menos 39 nucleotidos hasta 250 nucleotidos correspondientes a los 39 nucleotidos mas en 3' a los 250 nucleotidos mas en 3' de los nucleotidos codificantes en 3' para NA, y en las que el vector no codifica una NA funcional.
En general, las secuencias de incorporacion estan presentes en los aproximadamente 150 a aproximadamente 250 nucleotidos en uno o en cada extremo de la region codificante para cada segmento de ARNv de la gripe. En el caso de la NA, las secuencias de incorporacion del virus de la gripe comprenden secuencias correspondientes al extremo 3' del ARNv de NA, incluidas las secuencias correspondientes al extremo N de la region codificante de NA, por ejemplo 37 nucleotidos del extremo 3' del ARNv de NA de tipo A, incluidos 19 nucleotidos de la secuencia no codificante en 3' y al menos los nucleotidos correspondientes a los primeros 19 nucleotidos codificantes para NA y, opcionalmente, secuencias de incorporacion correspondientes al extremo 5' del ARNv de NA, incluidas las secuencias correspondientes al extremo C de la region codificante de NA, por ejemplo 67 nucleotidos del extremo 5' del ARNv de NA de tipo A, incluidos 28 nucleotidos de la secuencia no codificante en 5' y al menos 39 nucleotidos correspondientes a los 39 nucleotidos codificantes en 3' de NA.
De un modo analogo, las secuencias de incorporacion del virus de la gripe que comprenden secuencias correspondientes al extremo 3' del ARNv de NS incluyen secuencias correspondientes al extremo N de la region codificante de NS. En el presente documento tambien se describen secuencias de incorporacion del virus de la gripe que comprenden secuencias correspondientes al extremo 5' del ARNv de HA, incluidas las secuencias correspondientes al extremo C de la region codificante de HA, por ejemplo 135 nucleotidos del extremo 5' del ARNv de HA de tipo A, incluidos 45 nucleotidos de la secuencia no codificante en 5' y al menos 80 nucleotidos correspondientes a los 80 nucleotidos codificantes en 3' de HA y, opcionalmente, las secuencias de incorporacion correspondientes al extremo 3' del ARNv de HA, incluidas las secuencias correspondientes al extremo N de la region codificante de HA, por ejemplo 36 nucleotidos del extremo 3' del ARNv de HA de tipo A, incluidos 33 nucleotidos de la secuencia no codificante en 3' y al menos 3 nucleotidos correspondientes a los primeros 3 nucleotidos codificantes de HA. Tambien se describen las secuencias de incorporacion del virus de la gripe que comprenden secuencias correspondientes al extremo 5' del ARNv de PB, incluidas las secuencias correspondientes al extremo C de la region codificante de PB2. En otro aspecto, en el presente documento tambien se describen las secuencias de incorporacion del virus de la gripe que comprenden secuencias correspondientes al extremo 3' del ARNv de M, incluidas las secuencias correspondientes al extremo N de la region codificante M, por ejemplo 247 nucleotidos del extremo 3' del ARNv de M de tipo A, incluidos 26 nucleotidos de la secuencia no codificante en 3' y 221 nucleotidos de la secuencia correspondiente al extremo N de la region codificante de M, y las secuencias correspondientes al extremo 5' del ARNv de M, incluidas las secuencias de incorporacion correspondientes al extremo C de la region codificante de M, por ejemplo 242 nucleotidos del extremo 5' del ARNv de M de tipo A, incluidas 23 nucleotidos de la secuencia no codificante en 3' y 219 nucleotidos de la secuencia correspondiente a los ultimos 219 nucleotidos para el extremo C de la region codificante M. En el presente documento tambien se describen secuencias de incorporacion del virus de la gripe que comprenden secuencias correspondientes al extremo 5' del ARNv de NS, incluidas secuencias correspondientes al extremo N de la region codificante de NS, por ejemplo secuencias que incluyen la secuencia o codificante en 3' y al menos los 30 primeros nucleotidos correspondientes al extremo N de la region codificante de NS y secuencias correspondientes al extremo 5' del ARNv de NS, incluidas secuencias de incorporacion correspondientes al extremo C de la region codificante de NS, por ejemplo secuencias que incluyen la secuencia no codificante en 5' y al menos los ultimos 30 nucleotidos de la secuencia correspondiente al extremo C de la region codificante de NS. Tambien se describen secuencias de incorporacion del virus de la gripe que comprenden secuencias correspondientes al extremo 5' del ARNv de PB1, incluidas las secuencias correspondientes al extremo N de la region codificante de PB1 y las secuencias correspondientes al extremo 5' del ARNv de PB1, incluidas las secuencias de incorporacion correspondientes al extremo C de la region codificante de PB1. En otra divulgacion mas, tambien se describen secuencias de incorporacion del virus de la gripe que comprenden secuencias correspondientes al extremo 5' del ARNv de PA, incluidas las secuencias correspondientes al extremo N de la region codificante de PA y las secuencias correspondientes al extremo 5' del ARNv de PA, incluidas las secuencias de incorporacion correspondientes al extremo C de la region codificante de PA. Las “secuencias de incorporacion” del virus de la gripe, como se usa en el presente documento, son secuencias que, cuando estan presentes en el ARNv con las correspondientes regiones no codificantes en 3' y 5' (homologas), dan lugar a la incorporacion en los viriones de una molecula de acido nucleico que comprende dichas secuencias y al mantenimiento de dicha molecula en los viriones durante el pase repetido.
Como se describe mas adelante en el presente documento, usando genetica inversa basada en plasmidos se identificaron secuencias de incorporacion de NA en virus mutantes con un segmento de NA truncado. Las secuencias de incorporacion de NA estaban en una region que incluyo el extremo 3' del ARNv de NA, que se extendio en una porcion de la region codificante de NA. Por tanto, esta region es util para el empaquetamiento y mantenimiento del ARN de NA silvestre, asf como ARN de Na mutantes, por ejemplo ARN con deleciones y/o inserciones internas, incluidos ARN recombinantes, para la expresion de marcos de lectura abiertos de interes, por ejemplo un segmento de acido nucleico heterologo que comprende un marco de lectura abierto de interes.
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Como tambien se describe en el presente documento, para obtener informacion sobre la incompatibilidad intertfpica entre los virus de la gripe de tipo A y B, se uso genetica inversa para generar un reagrupado que contuviera un segmento de HA de tipo B intacto en un fondo de virus de tipo A. No obstante, no se produjo virus, a pesar del hecho de que el segmento de HA de tipo B se transcribio a traves del complejo de polimerasa de tipo A. Aunque un virus de tipo A con un segmento de HA quimerico compuesto por la totalidad de la secuencia codificante de HA de tipo B flanqueada por la secuencia no codificante de HA de tipo A era viable, unicamente se replico ligeramente. Se genero una serie de virus basados en el tipo A que conteman HA quimericas que posefan la region no codificante de tipo A junto con la secuencia codificante del peptido senal o la region transmembrana/citoplasmica del virus de tipo A, o ambas, y el resto de la region derivada de la HA de tipo B. Todos estos virus crecfan a mas de 106 dosis infecciosas en cultivo tisular5o/ml en cultivo celular, no obstante, los virus con mas de las secuencias de HA de tipo A se replicaron mejor, lo que sugiere que el papel de la interaccion protema-protema o la mayor incorporacion del segmento de HA en los viriones con un crecimiento viral eficiente. Todos estos virus A/B quimericos estaban atenuados en ratones en comparacion con los virus A y B silvestres. Ademas, todos los animales inmunizados por via intranasal con los virus quimericos sobrevivfan tras la exposicion a una dosis letal del virus de tipo B silvestre, lo que demuestra un prometedor abordaje para el diseno de un nuevo virus para vacuna con microorganismos vivos.
Por tanto, cuando se introduce una molecula de acido nucleico aislado como se ha descrito anteriormente que comprende secuencias de incorporacion para un segmento del virus de la gripe concreto, las secuencias no codificantes en 3' y 5' homologas (regiones) y un segmento de acido nucleico heterologo, en una celula en un vector para la produccion de ARNv y en presencia de protemas virales y/o vectores de codificacion de protema viral para una o mas de PA, PB1, PB2, NP, Ha, NA, M, por ejemplo M1 y/o M2, y/o NS, y ARNv o vectores para la produccion de ARNv para una o mas de PA, PB1, PB2, NP, hA, NA, M, por ejemplo M1 y M2, y/o NS, se produce virus recombinante. Por tanto, la presente invencion proporciona un virus recombinante que comprende un vector del virus de la gripe que comprende secuencias de incorporacion de NA como se describe en el presente documento.
A continuacion, el virus recombinante se puede usar para infectar una celula. Preferentemente, el ARNv correspondiente a la molecula de acido nucleico se incorpora en viriones con una eficiencia que es de al menos un 10 %, mas preferentemente al menos un 30 % e incluso mas preferentemente al menos un 50 % o mas, la de un ARNv silvestre correspondiente. La molecula de acido nucleico puede incluir secuencias correspondientes a un ARNv silvestre y un segmento de acido nucleico heterologo, en el que el segmento de acido nucleico heterologo se introduce en las secuencias en el ARNv correspondiente a la region codificante para dicho ARNv, cuya insercion preferentemente no altera sustancialmente las secuencias de incorporacion. Por ejemplo, el segmento de acido nucleico heterologo se puede introducir despues de una secuencia correspondiente a los primeros 300 nucleotidos de la region codificante de NA.
En una realizacion, las secuencias de incorporacion de NA en 3' corresponden a los nucleotidos 1 a 183, los nucleotidos 1 a 90, los nucleotidos 1 a 45, los nucleotidos 1 a 21, o cualquier numero entero entre 21 y 183, de la region codificante de NA en el extremo N, y puede incluir una mutacion en el codon de iniciacion de NA. En otra realizacion, , las secuencias de incorporacion de NA en 5' corresponden a secuencias en la region codificante en el extremo C de NA, las secuencias correspondientes a los nucleotidos 39, 78 o 157 mas en 3', o cualquier numero entero entre 39 y 157, para la region codificante de NA en el extremo C.
Las secuencias de incorporacion de HA en 5' descritas en el presente documento corresponden a secuencias en la region codificante en el extremo C de HA, las secuencias correspondientes a los nucleotidos 75, 80, 268, 291 o 518 mas en 3', o cualquier numero entero entre 1 y 518, para la region codificante de HA en el extremo C. Las secuencias de incorporacion de HA en 3' corresponden a los nucleotidos 1 a 3, 1 a 6, 1 a 9, 1 a 15, 1 a 216, 1 a 468 o cualquier numero entero entre 1 y 468, de la region codificante de HA en el extremo N. Las secuencias de incorporacion de PB1 en 3' descritas en el presente documento corresponden a los nucleotidos 1 a 250, los nucleotidos 1 a 200, los nucleotidos 1 a 150 o cualquier numero entero entre 1 y 250, de la region codificante de PB1 en el extremo N. Las secuencias de incorporacion de PB1 en 5' corresponden a los nucleotidos MAS EN 3', por ejemplo los nucleotidos 1 a 250 nucleotidos en 3', los nucleotidos 1 a 200, los nucleotidos 1 a 150 o cualquier numero entero entre 1 y 250, de la region codificante de PB1 en el extremo C. Las secuencias de incorporacion de PA en 3' descritas en el presente documento corresponden a los nucleotidos 1 a 250, los nucleotidos 1 a 200, los nucleotidos 1 a 150 o cualquier numero entero entre 1 y 250, de la region codificante de PA en el extremo N. Las secuencias de incorporacion de PA en 5' corresponden a los nucleotidos MAS EN 3', por ejemplo los nucleotidos 1 a 250 nucleotidos en 3', los nucleotidos 1 a 200, los nucleotidos 1 a 150 o cualquier numero entero entre 1 y 250, de la region codificante de PA en el extremo C. Las secuencias de incorporacion de M en 3' descritas en el presente documento corresponden a los nucleotidos 1 a 250, los nucleotidos 1 a 242, los nucleotidos 1 a 240 o cualquier numero entero entre 1 y 250, de la region codificante de M en el extremo N, y pueden incluir una mutacion en el codon de iniciacion de M. Las secuencias de incorporacion de M en 5' corresponden a secuencias en la region codificante en el extremo C de M, las secuencias correspondientes a los nucleotidos 50, 100 o 220 mas en 3', o cualquier numero entero entre 1 y 250, para la region codificante de M en el extremo C. Las secuencias de incorporacion de NS en 3' descritas en el presente documento corresponden a los nucleotidos 1 a 250, los nucleotidos 1 a 200, los nucleotidos 1 a 150, los nucleotidos 1 a 30, los nucleotidos 1 a 20 o cualquier numero entero entre 1 y 250, de la region codificante de NS en el extremo N, y pueden incluir una mutacion en el codon de iniciacion de NS. Las secuencias de incorporacion de NS en 5' corresponden a secuencias en la region codificante
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en el extremo C de M, las secuencias correspondientes a los nucleotidos 10, 30, 150, 200 o 250 o cualquier numero entero entre 1 y 250, para la region codificante de NS en el extremo C.
De acuerdo con lo anterior, la invencion proporciona vectores del virus de la gripe que incluyen la region no codificante en 3' del ARNv de NA, secuencias de incorporacion de ARNv de NA en 3' y 5', un segmento de acido nucleico heterologo y la region no codificante en 5' del ARNv de NA. Se usan dos secuencias de incorporacion en un vector y estan separadas por el segmento de acido nucleico heterologo. El vector se puede usar para preparar el ARNv para la introduccion en una celula o para expresar ARNv en una celula, en el que estan presentes otros ARNv del virus de la gripe y protemas necesarias
En una realizacion, el segmento de acido nucleico heterologo comprende secuencias correspondientes a un marco de lectura abierto para un gen marcador. En otra realizacion, el segmento de acido nucleico heterologo comprende secuencias correspondientes a un marco de lectura abierto para un gen terapeutico. En una realizacion adicional mas, el segmento de acido nucleico heterologo comprende secuencias correspondientes a un marco de lectura abierto para un peptido o protema inmunogenica de un patogeno o una celula tumoral, por ejemplo una util para inducir una respuesta inmunitaria protectora. Por ejemplo, el segmento de acido nucleico heterologo puede codificar un epttopo inmunogenico util en la terapia para el cancer o en una vacuna. El vector que comprende el segmento de acido nucleico heterologo se puede preparar de un modo tal que la transcripcion del ARNv del vector de como resultado un ARNm que codifique una protema de fusion con una protema de la gripe, tal como NA. Por tanto, se preve que el segmento DE acido nucleico heterologo se puede fusionar con secuencias de incorporacion virales para codificar una protema de fusion, por ejemplo una fusion con los 21 restos en el extremo N de NA. La protema de fusion puede comprender secuencias de dos protemas del virus de la gripe diferentes, incluidas las secuencias de dos protemas nA o HA diferentes. En otra realizacion, el segmento de acido nucleico heterologo puede comprender secuencias correspondientes a un IRES unido en 5' a un marco de lectura abierto.
Para preparar el virus recombinante usando genetica inversa basada en plasmidos con una pluralidad de vectores del virus de la gripe, el ADN del virus de la gripe en un vector puede estar en orientacion sentido o antisentido respecto del promotor. Por tanto, un vector puede codificar una protema del virus de la gripe (sentido) o ARNv (antisentido) de una cepa o aislado del virus de la gripe A, B o C o un virus de la gripe recombinante (veanse los capttulos 45 y 46 de Fields Virology (Fields et al. (eds.), Lippincott-Raven Publ., Philadelphia, PA (1996)). Se puede usar cualquier promotor para expresar una protema viral y el vector resultante incluye un promotor unido operablemente a un ADN para una protema concreta del virus de la gripe. Promotores preferidos para los vectores que codifican el ARNv incluyen, entre otros, un promotor de la ARN polimerasa I, un promotor de la ARN polimerasa ll, un promotor de la ARN polimerasa III, un promotor de T7 y un promotor de T3. En una realizacion, el promotor de la ARN polimerasa I es un promotor de la ARN polimerasa I humana. Las secuencias de terminacion de la transcripcion preferidas para los vectores que codifican ARNv incluyen, entre otros, una secuencia de terminacion de la transcripcion de la aRn polimerasa I, una secuencia de terminacion de la transcripcion de la ARN polimerasa II o una secuencia de terminacion de la transcripcion de la ARN polimerasa III, o una ribozima. Por tanto, un vector para el ARNv incluye un promotor unido operablemente a un ADNc para una protema del virus de la gripe en orientacion antisentido respecto del promotor, que esta unido operablemente a una secuencia de terminacion de la transcripcion. Para producir virus recombinante con un vector de la invencion se pueden omitir determinados vectores de ARNv silvestre y se pueden sustituir determinados vectores de codificacion de protemas virales silvestres. Por ejemplo, para un vector de ARNv que comprende secuencias no codificantes en 3' y 5' de HA, secuencias de incorporacion en 5' de HA y un segmento de acido nucleico heterologo correspondiente a una secuencia codificante de la protema de virus que no son de la gripe, por ejemplo, la secuencia codificante de la protema G de VSV, se puede omitir el vector de ARNv de HA silvestre. Los vectores se pueden introducir en una celula secuencial o simultaneamente. Se puede proporcionar una composicion que comprende una pluralidad de los vectores mencionados anteriormente, una celula huesped en contacto con uno o mas de los vectores, virus preparado mediante el metodo y una celula infectada con el virus.
Una pluralidad de los vectores se puede unir ffsicamente o cada vector puede estar presente en un plasmido individual u otro, por ejemplo vehmulo de liberacion de acido nucleico lineal.
Las celulas huesped aumentadas con las moleculas de ADN recombinante como se ha descrito anteriormente en el presente documento son utiles para preparar virus de la gripe infecciosos de replicacion defectuosa. Por ejemplo, una celula huesped transformada de forma estable con moleculas de ADN recombinante que codifican HA, Na, M1, M2 y NS2 se puede poner en contacto con una pluralidad de vectores, es decir vectores que expresan ARNv que comprende PA, ARNv que comprende NP, ARNv que comprende PB1, ARNv que comprende PB2 y, opcionalmente, ARNv que comprende un gen de interes; y vectores que codifican PA, PB1, PB2 y NP.
Los metodos de produccion de virus descritos en el presente documento que no requiere infeccion con virus colaboradores son utiles en estudios de mutagenesis viral y en la produccion de vacunas (por ejemplo, para SIDA, gripe, hepatitis B, hepatitis C, rinovirus, filovirus, paludismo, herpes y la enfermedad de la fiebre aftosa) y vectores de terapia genica (por ejemplo, para cancer, SIDA, adenosina desaminasa, distrofia muscular, deficiencia de ornitina transcarbamilasa y tumores del sistema nervioso central).
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Por tanto, se puede usar un virus recombinante en terapia medica (por ejemplo, para una vacuna o terapia genica). Por ejemplo, se puede inmunizar a un individuo contra un patogeno, por ejemplo una bacteria, virus o parasito, o un tumor maligno mediante la administracion al individuo de una cantidad de al menos un virus aislado, opcionalmente en combinacion con un adyuvante, eficaz para inmunizar al individuo. El virus comprende ARNv que comprende un polipeptido codificado por el patogeno o un polipeptido espedfico de tumor.
Tambien se describe un metodo para aumentar o incrementar la expresion de una protema endogena en un mai^ero que tiene una indicacion o enfermedad caracterizada por una cantidad menor o una falta de la protema endogena. El metodo comprende administrar al mamffero una cantidad de un virus recombinante de la invencion eficaz para aumentar o incrementar la cantidad de la protema endogena en el mairnfero. Preferentemente, el mamffero es un ser humano.
Tambien se describe un metodo para inhibir la infeccion y/o replicacion del virus de la gripe. El metodo comprende poner en contacto una celula con una composicion que comprende una molecula de acido nucleico aislada que comprende secuencias de incorporacion del virus de la gripe para NA, M, HA, NS, NP, PB1, PB2, PA, o cualquier combinacion de dichas moleculas, en una cantidad eficaz para inhibir la infeccion y/o replicacion del virus de la gripe. La celula puede ser una celula no infectada o una que esta infectada con el virus de la gripe. Las secuencias de incorporacion pueden ser espedficas de uno o mas tipos de NA o HA. En un aspecto, la celula se pone en contacto adicionalmente con un inhibidor de canales de M2 o un inhibidor de la neuraminidasa.
Tambien se describe un metodo para identificar un agente que inhibe espedficamente o previene la incorporacion e ARN del virus de la gripe en viriones. El metodo comprende poner en contacto una celula infectada con el virus de la gripe con un agente y detectar o determinar si el agente inhibe espedficamente o previene la incorporacion del ARN del virus de la gripe, tal como ARNv de NA o ARNv de NA recombinante, en los viriones. Tambien se proporcionan agentes identificados mediante el metodo, y usos de los mismos, por ejemplo para inhibir o prevenir la replicacion del virus de la gripe.
La presente invencion tambien proporciona el uso de un vector de la invencion en la fabricacion de un medicamento para prevenir la infeccion por el virus de la gripe o del virus de la invencion en la fabricacion de un medicamento para prevenir o tratar una infeccion patogenica o cancer, o una enfermedad caracterizada por una cantidad menor o una falta de protema endogena.
Breve descripcion de las figuras
Figura 1. Union de lmeas celulares resistentes a la lectina. Para cada lmea celular, se incubaron las celulas con lectinas de Maakia amurensis (MAA) o Sambucus nigra (SNA) marcadas con digoxigenina, seguido de anticuerpo antidigoxigenina marcado con isotiocianato de fluorescema y, despues, se analizaron mediante FACS. Lmeas en negrita, union de la lectina de MAA; lmeas estrechas, union de la lectina de SNA; perfiles sombreados, control negativo (sin lectina anadida).
Figura 2. Estructuras de los genes de NA de los mutantes AL3(MaKS)-13 y K4(MaKS)-13. (A) El AL3(MaKS)-13 contiene una delecion de 936 nucleotidos (de las bases 220 a 1253) que elimina una gran porcion de la secuencia codificante del gen de NA. Esta mutacion tambien mete un codon de terminacion TAG dentro del marco dos bases mas alla de la delecion, de modo que el gen codifica unicamente un peptido de 66 aminoacidos, correspondiente a la cola citoplasmica, la region transmembrana, el tallo y una porcion de la cabeza de la NA. (B) El gen de NA K4(MaKS)-13 contiene una delecion de 1.066 nucleotidos (de las bases 130 a 1193) que elimina una gran porcion de la secuencia codificante del gen de NA. Esta mutacion tambien mete un codon de terminacion TAG dentro del marco cuatro bases mas alla de la delecion, de modo que el gen codifica unicamente un peptido de 38 aminoacidos, correspondiente a la cola citoplasmica y a la region transmembrana del gen de la NA.
Figura 3. Actividad de sialidasa de los virus AM2AL3 y K4 parentales y los mutantes AL3(MaKS)-13 y K4(MaKS)- 13. Para cada muestra, el virus (5 x 102 PFU) se incubo por duplicado durante 1 hora a 37 °C en presencia de un sustrato para la sialidasa fluorogenica (acido 4-metilumbeliferil-Gr-W-acetilneurammico). La fluorescencia de la 4- metilumbeliferona se determino con un fluorometro (Labsystems Fluoroskan II) con excitacion a 360 nm y emision a 460 nm.
Figura 4A. Esquema de los vectores silvestre y NAFLAG.
Figura 4B. Esquema del metodo para la produccion del virus NAFLAG.
Figura 4C. Inmunotincion de celulas MDCK infectadas con el virus NAFLAGWT o el virus NA (-). Las celulas se tineron con anticuerpo monoclonal (AcMo) anti-FLAG M2 o anticuerpo policlonal anti-WSN.
Figura 5. Esquema del analisis de competicion para un segmento 7 recombinante del virus de la gripe y el virus NAFLAG.
Figura 6A. Esquema de los vectores NAFLAG y NAFLAGM (-) ("-ATG")
Figura 6B. Inmunotincion de celulas MDCK infectadas con el virus NAFLAGM (-). Las celulas se tineron con anticuerpo monoclonal anti-FLAG M2 o anticuerpo policlonal anti-WSN.
Figura 7A. Analisis mediante hibridacion in situ de celulas infectadas con NAFLAG y NAFLAGM (-) para la secuencia FLAG.
Figura 7B. Eficiencia de la replicacion del virus NAFLAGWT o el virus NAFLAGM (-).
Figura 8A. Esquema de virus con delecion de NA.
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Figura 8B. Tasa de empaquetamiento de los virus con delecion de NA.
Figura 9. Tttulo vmico en el tiempo para los virus de la gripe con 6, 7 o 8 segmentos.
Figura 10. Esquema que muestra las senales de incorporacion para los segmentos del virus de la gripe (punteado). Figura 11A. Tomograffa de microscopio electronica de viriones de la gripe.
Figuras 11B-F. Imagenes en color de bastones encontrados mediante tomograffa por microscopio electronico de un virion de la gripe.
Figura 12. A) Segmentos virales para un virus de la gripe de tipo A y un virus de tipo A cuya secuencia de codificacion de HA esta sustituida por la de la HA de tipo B. B) Viriones para un virus de la gripe de tipo A y un virus de tipo A cuya secuencia de codificacion de HA esta sustituida por la de la HA de tipo B.
Figura 13. Diagrama de construcciones de HA quimerica A/B. Las construcciones de HA quimerica se produjeron entre la HA del virus A/WSN silvestre (pPolI-WSN-HA) y del virus B/Lee silvestre (pPolI-B-HA) en un plasmido basado en pPoll (pHH21) como se describe en Neumann et al. (1999).
Figura 14. Expresion de virus de HA de tipo B y virus quimericos HA A/B. Las celulas MDCK infectadas con cada virus se fijaron 24 horas despues de la infeccion y se inmunotineron con anticuerpos anti-A/HA, anti-B/HA o anti— A/NP.
Figura 15. Propiedades del crecimiento de virus quimericos de HA A/B. Las celulas MDCK se infectaron con cada virus a una MDI de 0,01 DICT50 y se vigilo el crecimiento del virus. Se muestra uno de dos experimentos independientes con resultados similares.
Figura 16. Respuesta de anticuerpos al virus de tipo B en ratones a los que se ha inoculado virus quimericos de HA A/B. A) A los ratones (3 ratones/grupo) se les inoculo por via intranasal cada virus (DICT50 103). Tres semanas despues de la inoculacion se tomaron lavados nasales/traqueales y muestras de suero de los ratones y se analizaron los anticuerpos IgA (lavado nasal/traqueal) o IgG (suero) anti-B espedficos de virus en un ensayo de ELISA. B) Tambien se analizaron los fftulos de HI en muestras de suero. Cada barra indica el raton individual infectado con el virus quimerico.
Figura 17. Diagrama esquematico de los ARNv de HA mutantes y su eficiencia de la incorporacion en el virion. Todos los ARN de HA mutantes se muestran en orientacion de sentido negativo. Cada mutante contiene el marco de lectura abierto de GFP (insertado en el marco con el marco de lectura abierto de HA) flanqueado por un codon de terminacion, 3 nucleotidos de la region no codificante en 3' y 45 nucleotidos de la region no codificante en 5' del ARNv de HA (barras negras). Los mutantes se disenaron de acuerdo con el numero de nucleotidos derivados de las regiones codificantes de HA. Las regiones codificantes de HA se muestran como barras de color gris. La lmea discontinua horizontal indica una delecion. Las longitudes de las regiones no se escalan. La eficiencia de la incorporacion del ARNv de HA mutante en VLP se determino dividiendo el numero de celulas que expresan GFP por el de las celulas que expresan NP en las celulas infectadas por VLP despues de fijar las celulas 16 horas despues de la infeccion.
Figura 18. Niveles de ARNv en celulas 293T transfectadas con plasmidos que expresan ARNv de HA mutantes. Las celulas 293T se transfectaron con pPolIHA(0)GFP(0) o pPolIHA(9)GFP(80) y plasmidos que expresan PA, PB1, PB2 y NP.
Figura 19. Las celulas infectadas por el virus VSVG(HA)GFP(NA) expresan VSV G y GFP. Las celulas MDCK se infectaron con el virus VSVG(HA)GFP(NA) o el virus WSN y se cubrieron con 1,0 % de agarosa. Las celulas infectadas se incubaron durante 48 horas a 37 °C y las placas se fotografiaron (A, B) con luz normal y (C, D) con luz fluorescente junto con luz normal limitada para identificar las placas. Las celulas se fijaron y permearon con 0,1 % de Triton—X100 en 3 % de solucion de formaldehffdo. Las protemas virales se detectaron mediante inmunotincion con el anticuerpo monoclonal anti—VSV G (E, F), el anticuerpo monoclonal anti—HA (G, H) o el anticuerpo monoclonal anti— NP (I, J) como anticuerpo primario y anticuerpo secundario biotinilado, usando el kit Vectastain ABC (Vector, Burlingame, CA).
Figura 20. Incorporacion de la protema VSV G en el virus VSVG(HA)GFP(NA). Los virus WNS, VSVG(HA)GFP(NA) y VSV concentrados se lisaron en un tampon de muestra. Las protemas virales se trataron con 2-mercaptoetanol, se separaron mediante SDS—PAGE al 10 %, se transfirieron a una membrana de PVDF y se incubaron con anticuerpo monoclonal anti—VSV G o el anticuerpo monoclonal anti—WSN—HA. Las masas moleculares de las protemas marcadoras se muestran a la izquierda.
Figura 21. Curvas de crecimiento del virus VSVG(HA)GFP(NA) en las celulas BHK, CHO, y MDCK. Las celulas BHK (A), CHO (B), y MDCK (C) se infectaron con el virus a una MDI de 0,001. A los tiempos indicados tras la infeccion, el tftulo del virus en el sobrenadante se determino usando celulas MDCK. Los valores son las medias de los experimentos por duplicado.
Figura 22. Diagrama esquematico de los ARNv de NS mutantes y su eficiencia de la incorporacion.
Figura 23. Diagrama esquematico de los ARNv de M mutantes y su eficiencia de la incorporacion.
Figura 24. Esquema de A) segmentos virales y B) viriones que expresan dos protemas heterologas.
Figura 25. Esquema del virus de la gripe con segmentos virales para dos protemas heterologas, V gp160 y gag del VIH.
Figura 26. Esquema de la produccion de virus de replicacion incompetente usando Cre/lox.
Descripcion detallada de la invencion
Como se usa en el presente documento, los terminos “aislado y/o purificado” hacen referencia a la preparacion, aislamiento y/o purificacion in vitro de una celula huesped o virus de la invencion, de forma que no este asociado consustancias in vivo, o esta sustancialmente purificado a partir de sustancias in vitro. Como se usa en el presente
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documento, “sustancialmente puro” significa que una especie objeto es la especie predominate presente (es dedr, en base molar es mas abundante que cualquier otra especie individual en la composicion) y, preferentemente, una fraccion sustancialmente purificada es una composicion en la que la especie objeto comprende al menos aproximadamente el 50 por ciento (en base molar) de todas las especies macromoleculares presentes. En general, una composicion sustancialmente pura comprendera mas de aproximadamente 50 por ciento, mas preferentemente mas de aproximadamente 80 por ciento de todas las especies macromoleculares presentes en la composicion e, incluso mas preferentemente, mas de aproximadamente 85 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 95 % y aproximadamente 99 %. Lo mas preferentemente, la especie objeto esta purificada hasta homogeneidad esencial (las especies contaminantes no se pueden detectar en la composicion mediante metodos de deteccion convencionales).
Como se usa en el presente documento, la expresion “acido nucleico recombinante” o “secuencia o segmento de ADN recombinante” hace referencia a un acido nucleico, por ejemplo a ADN, que se ha obtenido o se ha aislado de una fuente, que puede alterarse posteriormente qmmicamente in vitro, de forma que su secuencia no es de origen natural o corresponde a secuencias de origen natural que no estan colocadas como lo estanan en el genoma nativo. Un ejemplo de ADN “derivado” de una fuente sena una secuencia de ADN que se identifica como un fragmento util o se ha transcrito de forma inversa a partir de ARN y que despues se sintetiza en forma esencialmente pura. Un ejemplo de este ADN “aislado” de una fuente sena una secuencia de ADN util que se escinde o elimina de dicha fuente por medios qmmicos, por ejemplo mediante el uso de endonucleasas de restriccion, de forma que se puede manipular adicionalmente, por ejemplo amplificar, para su uso en la invencion, mediante la metodologfa de ingeniena genetica. El virus recombinante se prepara a partir de acido nucleico recombinante.
Como se usa en el presente documento, un segmento o molecula de acido nucleico “heterologo” significa que el segmento, secuencia o molecula deriva de una fuente que es diferente de un segmento, secuencia o molecula de acido nucleico de referencia. Por ejemplo, un segmento de virus de la gripe de tipo A o una porcion del mismo es heterologo del correspondiente segmento de virus de la gripe de tipo B o una porcion del mismo, un segmento o serotipo viral de NA de una cepa de la gripe es heterologo de un segmento viral de NA de una cepa o serotipo diferente y una molecula de acido nucleico de virus distinto de la gripe, por ejemplo, la gp160 del VIH es heterologa de una molecula de acido nucleico del virus de la gripe. Por el contrario, un segmento de acido nucleico homologo se obtiene de la misma fuente que un segmento de acido nucleico de referencia. Por tanto, la molecula de acido nucleico de la invencion es una molecula quimerica que incluye una region no codificante en 3', al menos una secuencia de incorporacion y una secuencia no codificante en 5' que son homologas entre sf.
La frase “replicacion eficiente” en el contexto de la presente invencion se define como produccion de tftulos de alta infectividad en sistemas de cultivo tisular in vitro, tales como 104-1010 UFP/ml y, preferentemente, 106-109 UFP/ml. La deteccion selectiva de virus de la gripe para su uso en replicacion o produccion de vacuna se puede analizar usando cualquier ensayo conocido y/o adecuado, como se sabe en la tecnica. Dichos ensayos (individualmente o en cualquier combinacion) que son adecuados para la deteccion selectiva incluyen, entre otros, replicacion viral, medicion cuantitativa y/o cualitativa de la inactivacion (por ejemplo, mediante antisueros), transcripcion, replicacion, traduccion, incorporacion de viriones, virulencia, actividad de hA o NA, rendimiento viral y/o morfogenesis, usando procedimientos tales como genetica inversa, reagrupacion, complementacion y/o infeccion. Por ejemplo, se pueden usar ensayos de replicacion de virus para la deteccion selectiva de la atenuacion o inactivacion del virus. Vease, por ejemplo, Krug, R.M., ed., The Influenza Viruses, Plenum Press, New York, (1989).
“Acido sialico” hace referencia a una familia de aminoazucares que contienen 9 o mas atomos de carbono, por ejemplo derivados N- y O-sustituidos del acido neurammico.
Como se usa en el presente documento, se pretende que “recombinacion espedfica de sitio” incluya los tres acontecimientos siguientes: 1) delecion de un segmento de ADN diana flanqueado por sitios o secuencias de recombinacion espedfica de sitio, por ejemplo sitios lox; 2) inversion de la secuencia de nucleotidos de un segmento de ADN diana flanqueado por sitios o secuencias de recombinacion espedfica de sitio, por ejemplo sitios lox; y 3) intercambio redproco de segmentos de ADN diana proximos a los sitios o secuencias de recombinacion espedfica de sitio, por ejemplo sitios lox localizados en moleculas de ADN diferentes. Los sistemas de recombinasa espedfica de sitio incluyen, entre otros, el sistema Cre/lox del bacteriofago P1 (patente de Estados Unidos n.° 5.658.772), el sistema FLP/FRT de levaduras (Golic y Lindquist, 1989), la Gin recombinasa de Mu (Maeser et al., 1991), la Pin recombinasa de E. coli (Enomoto et al., 1983), y el sistema R/RS del plasmido pSR1 (Araki et al., 1992).
Lmeas celulares y virus de la gripe que se pueden usar en la presente invencion
De acuerdo con la presente invencion, en la invencion se puede usar cualquier celula que soporte una replicacion eficiente del virus de la gripe, incluidas celulas mutantes que expresan niveles reducidos o disminuidos de uno o mas acidos sialicos que son receptores para el virus de la gripe. Los virus obtenidos mediante los metodos se pueden convertir en un virus reagrupado.
Preferentemente, las celulas son lmeas celulares continuas certificadas, o certificates, por la OMS. Los requisitos para certificar dichas lmeas celulares incluyen caracterizacion con respecto a al menos uno de la genealogfa,
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caractensticas de crecimiento, marcadores inmunologicos, susceptibilidad de los virus, tumorigenicidad y condiciones de almacenamiento, as^ como mediante ensayos en animales, huevos y cultivo celular. Dicha caracterizacion se usa para confirmar que las celulas carecen de agentes inesperados detectables. En algunos pafses tambien puede ser necesaria una cariologfa. Ademas, preferentemente se analiza la tumorigenicidad en celulas que estan al mismo nivel de pase que las usadas para la produccion de vacunas. El virus se purifica, preferentemente, mediante un proceso que se ha demostrado que da resultados consistentes, antes de la inactivacion o atenuacion para la produccion de vacunas (vease, por ejemplo, Organizacion Mundial de la Salud, 1982).
Se prefiere establecer una caracterizacion completa de las lmeas celulares que se van a usar, de forma que se pueden incluir ensayos adecuados para la pureza del producto final. Los datos que se pueden usar para la caracterizacion de una celula que se va a usar en la presente invencion incluye (a) informacion sobre su origen, derivacion e historial de pases; (b) informacion sobre su crecimiento y caractensticas morfologicas; (c) resultados de ensayos de agentes inesperados; (d) caractensticas distintivas, tales como patrones bioqmmicos, inmunologicos y citogeneticos que permiten reconocer claramente a las celulas entre otras lmeas celulares; y (e) resultados de los ensayos de tumorigenicidad. Preferentemente, el nivel del pase, o la duplicacion de la poblacion, de la celula huesped usada es lo mas bajo posible.
Se prefiere que el virus producido en la celula este altamente purificado antes de la formulacion de la vacuna o la terapia genica. En general, los procedimientos de purificacion tendran como resultado una extensa eliminacion del ADN celular, otros componentes celulares y agentes inesperados. Tambien se pueden usar procedimientos que degradan o desnaturalizan extensamente el ADN. Vease, por ejemplo, Mizrahi, 1990.
Vacunas
Una vacuna puede comprender protemas inmunogenicas, incluidas glicoprotemas de cualquier patogeno, por ejemplo una protema inmunogenica de una o mas bacterias, virus, levaduras u hongos. Por tanto, en una realizacion, los virus de la gripe de la invencion pueden ser vectores de vacuna para virus de la gripe u otros patogenos virales, incluyendo, entre otros, lentivirus tales como VIH, virus de la hepatitis B, virus de la hepatitis C, virus del herpes, tales como CMV o VHS o virus de la enfermedad de la fiebre aftosa.
Una vacuna de virion completa se concentra mediante ultrafiltracion y despues se purifica mediante centrifugacion zonal o mediante cromatograffa. Se inactiva antes o despues de la purificacion usando formalina o beta- propiolactona, por ejemplo.
Una vacuna de subunidad comprende glicoprotemas purificadas. Dicha vacuna se puede preparar del siguiente modo: usando suspensiones virales fragmentadas mediante tratamiento con detergente, los antfgenos de superficie se purifican mediante ultracentrifugacion, por ejemplo. Por tanto, las vacunas de subunidad contienen, principalmente, protema HA, y tambien NA. El detergente usado puede ser un detergente cationico, por ejemplo tal como bromuro de hexadeciltrimetilamonio (Bachmeyer, 1975), un detergente anionico, tal como desoxicolato amonico (Laver & Webster, 1976); Webster et al., 1977); o un detergente no ionico tal como el comercializado con el nombre TRITON X100. La hemaglutinina tambien se puede aislar tras el tratamiento de los viriones con una proteasa tal como bromelina, despues purificar mediante un metodo tal como el descrito por Grand y Skehel (1972).
Una vacuna fraccionada comprende viriones que se han sometido a tratamiento con agentes que disuelven lfpidos. Una vacuna fraccionada se puede preparar del siguiente modo: Una suspension acuosa del virus purificado obtenida como anteriormente, inactivada o no, se trata, con agitacion, mediante disolventes lipfdicos tales como eter etflico o cloroformo, asociada con detergentes. La disolucion de los lfpidos de la cubierta viral tiene como resultado la fragmentacion de las partfculas virales. Se recupera la fase acuosa, que contiene la vacuna fraccionada, constituida principalmente por hemaglutinina y neuraminidasa con su ambiente lipfdico original eliminado, y el nucleo o sus productos de degradacion. Despues, las partmulas infecciosas residuales se inactivan si todavfa no se ha realizado.
Vacunas inactivadas. Las vacunas con el virus de la gripe inactivado se proporcionan inactivando los virus replicados de la invencion mediante el uso de metodos conocidos, tales como, entre otros, tratamiento con formalina o p-propiolactona. Los tipos de vacuna con microorganismo inactivado que se pueden usar en la invencion pueden incluir vacunas con virus enteros (VE) o vacunas de subviriones (SV) (fraccionadas). La vacuna VE contiene virus inactivados intactos mientras que la vacuna SV contiene virus purificados fragmentados con detergentes que solubilizan la cubierta viral que contiene lfpidos, seguido de inactivacion qrnmica de virus residuales.
Ademas, las vacunas que se pueden usar incluyen las que contienen las protemas de superficie HA y NA aisladas, que se denominan vacunas con antfgeno de superficie o de subunidades. En general, las respuestas a las vacunas Sv y con antfgeno de superficie (es decir, hA o NA purificadas) son similares. Una vacuna de VE inactivados experimental que contema un antfgeno NA relacionado inmunologicamente con el virus epidemico y una HA no relacionada parece ser menos eficaz que las vacunas convencionales (Ogra et al., 1977). Se prefieren las vacunas inactivadas que contienen ambos antfgenos de superficie relevantes.
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Vacunas con virus atenuados vivos. Las vacunas con virus de la gripe atenuados vivos tambien se pueden usar para prevenir o tratar la infeccion por el virus de la gripe, de acuerdo con etapas del metodo conocido. La atenuacion se logra, preferentemente, en una unica etapa mediante transferencia de genes atenuados desde un virus donante atenuado a un aislado replicado o virus reagrupado de acuerdo con metodos conocidos (vease, por ejemplo, Murphy, 1993). Dado que la resistencia al virus de la gripe A esta mediada por el desarrollo de una respuesta inmunitaria frente a las glicoprotemas HA y NA, los genes que codifican estos antigenos de superficie deben proceder de los virus reagrupados o aislados clmicos de alto crecimiento. Los genes atenuados derivan del padre atenuado. En este abordaje, los genes que confieren la atenuacion preferentemente no codifican las glicoprotemas HA y NA. De otro modo, estos genes no podnan transferirse a reagrupados portadores de los antfgenos de superficie del aislado vmco clmico.
Se ha evaluado la capacidad de los virus donantes para atenuar de forma reproducible los virus de la gripe. Como ejemplo no limitante, se puede usar el virus donante adaptado al fno (af) A/Ann Arbor(AA)/6/60 (H2N2) para la produccion de vacunas atenuadas (vease, por ejemplo, Edwards, 1994; Murphy, 1993). Adicionalmente, las vacunas con virus vivos reagrupados atenuados se pueden generar mediante apareamiento del donante af con un virus replicado virulento de la invencion. Despues, se selecciona la progenie reagrupada a 25 °C (restrictiva para la replicacion del virus virulento), en presencia de un anticuerpo de H2N2, que inhibe la replicacion de los virus portadores de los antfgenos de superficie del virus donante af A/AA/6/60 (H2N2).
Se ha evaluado una gran serie de reagrupados H1N1 y H3N2 en seres humanos y se ha encontrado que son satisfactoriamente: (a) infecciosos, (b) atenuados para ninos seronegativos y adultos sensibilizados inmunologicamente, (c) inmunogenicos y (d) geneticamente estables. La inmunogenicidad de los reagrupados af es paralela a su nivel de replicacion. Por tanto, la adquisicion de los seis genes transferibles del virus donante af mediante nuevos virus silvestres ha atenuado de forma reproducible estos virus para su uso en la vacunacion de adultos y ninos susceptibles.
Otras mutaciones atenuantes se pueden introducir en genes del virus de la gripe mediante mutagenesis dirigida a tipo para rescatar los virus infecciosos portadores de estos genes mutantes. Las mutaciones atenuantes se pueden introducir en regiones no codificantes del genoma, asf como en regiones codificantes. Dichas mutaciones atenuantes tambien se pueden introducir en genes distintos de HA y NA, por ejemplo, el gen de la PB2 polimerasa (Subbarao et al., 1993). Por tanto, tambien se pueden generar nuevos virus donantes portadores de mutaciones atenuantes introducidas mediante mutagenesis dirigida a sitio y dichos nuevos virus donantes se pueden usar en la reduccion de los candidatos a vacunas reagrupadas de H1N1 y H3N2 de un modo analogo al descrito anteriormente para el virus donante af A/AA/6/60. De un modo similar, otras cepas de donantes atenuados adecuadas y conocidas se pueden reagrupar con el virus de la gripe de la invencion para obtener vacunas atenuadas adecuadas para su uso en la vacunacion de mairnferos (Ewami et al., 1990; Muster et al., 1991; Subbarao et al., 1993).
Se prefiere que dichos virus atenuados mantengan los genes del virus que codifican los determinantes antigenicos sustancialmente similares a los de los aislados clmicos originales. Esto es porque la finalidad de la vacuna atenuada es proporcionar sustancialmente la misma antigenicidad que el aislado clmico original del virus, mientras que al mismo tiempo carece de infectividad en la medida que la vacuna causa un cambio mmimo en la induccion de una afeccion patogenica grave en el mai^ero vacunado.
Por tanto, el virus se puede atenuar o inactivar, formular y administrar de acuerdo con metodos conocidos, como una vacuna para inducir una respuesta inmunitaria en un animal, por ejemplo un mai^ero. En la tecnica se conocen bien los metodos para determinar si dichas vacunas atenuadas o inactivadas han mantenido una antigenicidad similar a la del aislado clmico o cepa de alto crecimiento de la que deriva. Dichos metodos conocidos incluyen el uso de antisueros o anticuerpos para eliminar los virus que expresan determinantes antigenicos del virus donante; seleccion qmmica (por ejemplo, amantadina o rimantadina); actividad e inhibicion de HA y NA; y deteccion selectiva de ADN (tal como hibridacion con sonda o PCR) para confirmar que los genes donantes que codifican los determinantes antigenicos (por ejemplo, los genes de HA o NA) no estan presentes en los virus atenuados. Vease, por ejemplo, Robertson et al., 1988; Kilbourne, 1969; Aymard-Henry et al., 1985; Robertson et al., 1992.
Composiciones farmaceuticas
Las composiciones farmaceuticas, adecuadas para inoculacion o para administracion parenteral u oral, comprenden virus de la gripe atenuados o inactivados, que comprenden adicionalmente soluciones acuosas o no acuosas esteriles, suspensiones o emulsiones. Las composiciones pueden ademas comprender agentes auxiliares o excipientes, como se conoce en la tecnica. Vease, por ejemplo, Berkow et al., 1987; Goodman et al., 1990; Avery's Drug Treatment, 1987; Osol, 1980; Katzung, 1992. La composicion de la invencion generalmente se presenta en forma de dosis individuales (dosis unitarias).
Las vacunas convencionales generalmente contienen de aproximadamente 0,1 a 200 |jg, preferentemente de 10 a 15 jg, de hemaglutinina de cada una de las cepas que entran en su composicion. La vacuna que forma el constituyente principal de la composicion de vacuna de la invencion puede comprender un virus de tipo A, B o C, o cualquier combinacion de los mismos, por ejemplo al menos dos de los tres tipos, al menos dos de diferentes
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subtipos, al menos dos del mismo tipo, al menos dos del mismo subtipo, o uno o mas aislados o reagrupados diferentes. El virus de la gripe humana de tipo A incluye los subtipos H1N1, H2N2 y H3N2.
Las preparaciones para administracion parenteral incluyen soluciones acuosas o no acuosas esteriles, suspensiones y/o emulsiones, que pueden contener agentes auxiliares o excipientes conocidos en la materia. Los ejemplos de disolventes no acuosos son propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales tales como aceite de oliva, y esteres organicos inyectables tales como oleato de etilo. Se pueden usar vehmulos o vendajes oclusivos para aumentar la permeabilidad de la piel y potenciar la absorcion del antigeno. Las formas de dosificacion lfquida para administracion oral pueden comprender, en general, una solucion liposomica que contiene la forma de dosificacion lfquida. Las formas adecuadas para suspender liposomas incluyen emulsiones, suspensiones, soluciones, jarabes y elixires que contienen diluyentes inertes de uso habitual en la materia, tales como agua purificada. Ademas de los diluyentes inertes, dichas composiciones tambien pueden incluir adyuvantes, agentes humectantes, agentes emulsionantes y de suspension, o agentes edulcorantes, aromatizantes o perfumantes. Vease, por ejemplo, Berkow et al., 1992; Goodman et al., 1990; Avery's, 1987; Osol, 1980; y Katzung, 1992.
Cuando una composicion se usa para administracion un individuo, puede comprender adicionalmente sales, tampones, adyuvantes u otras sustancias que son deseables para mejorar la eficacia de la composicion. Para vacunas, se pueden usar adyuvantes, sustancias que pueden aumentar una respuesta inmunitaria espedfica. Normalmente, el adyuvante y la composicion se mezclan antes de la presentacion al sistema inmunitario o se presentan por separado pero en el mismo lugar del organismo que esta siendo inmunizado. Los ejemplos de materiales adecuados para su uso en las composiciones de vacuna se proporcionan en Osol (1980).
La heterogeneidad en una vacuna se puede proporcionar mezclando virus de la gripe replicados para al menos dos cepas del virus de la gripe, tales como 2-50 cepas o cualquier intervalo o valor entre ellos. Se prefieren las cepas del virus de la gripe A o B que tienen una composicion antigenica moderna. De acuerdo con la presente invencion, las vacunas se pueden proporcionar para variaciones en una sola cepa de un virus de la gripe usando tecnicas conocidas en la materia.
Una composicion farmaceutica puede ademas o adicionalmente comprender al menos un compuesto quimioterapeutico, por ejemplo, para terapia genica, inmunosupresores, agentes antiinflamatorios o potenciadores inmunitarios y, para vacunas, agentes quimioterapeuticos incluyendo, entre otros, gamma globulina, amantadina, guanidina, hidroxibencimidazol, interferon-a, interferon-p, interferon-Y, factor alfa de necrosis tumoral, tiosemicarbarzonas, metisazona, rifampicina, ribavirina, un analogo de pirimidina, un analogo de purina, foscarnet, acido fosfonoacetico, aciclovir, didesoxinucleosidos, un inhibidor de proteasa, o ganciclovir. Vease, por ejemplo, Katzung (1992), y las referencias citadas en el mismo en las paginas 798-800 y 680-681, respectivamente.
La composicion tambien puede contener cantidades variables pero pequenas de formaldelmdo libre de endotoxinas, y conservantes, que se han encontrado que son seguros y no contribuyen a la aparicion de efectos indeseables en el organismo al que se administra la composicion.
Fines farmaceuticos
La administracion de la composicion (o del anticuerpo que produce) puede ser para fines “profilacticos” o “terapeuticos”. Cuando se proporciona profilacticamente, las composiciones de las invenciones que son vacunas se proporcionan antes de que cualquier smtoma de una infeccion patogenica se manifieste. La administracion profilactica de la composicion sirve para prevenir o atenuar cualquier infeccion posterior. Cuando se proporciona terapeuticamente, la vacuna viral atenuada o inactivada se proporciona tras la deteccion de un smtoma de infeccion real. La administracion terapeutica del o los compuestos sirve para atenuar cualquier infeccion real. Vease, por ejemplo, Berkow et al., 1992; Goodman et al., 1990; Avery, 1987; y Katzung, 1992.
Por tanto, una composicion de vacuna atenuada o inactivada puede proporcionarse antes del inicio de la infeccion (para prevenir o atenuar una infeccion anticipada) o tras el inicio de una infeccion real.
De un modo similar, para la terapia genica, la composicion se puede proporcionar antes de que se manifieste cualquier smtoma de un trastorno o enfermedad o despues de que se detecten uno o mas smtomas.
Se dice que una composicion es “farmaceuticamente aceptable” si su administracion puede ser tolerada por un paciente receptor. Se dice que dicho agente se administra en una “cantidad terapeuticamente eficaz” si la cantidad administrada es fisiologicamente significativa. Una composicion de la presente invencion es fisiologicamente significativa si su presencia produce un cambio detectable en la fisiologfa de un paciente receptor, por ejemplo potencia al menos una respuesta inmunitaria primaria o secundaria, humoral o celular contra al menos una cepa de un virus de la gripe infeccioso.
La “proteccion” proporcionada no tiene que ser absoluta, es decir la infeccion de gripe no tiene que prevenirse o erradicarse totalmente si hay una mejora estadfsticamente significativa en comparacion con una poblacion control o
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un conjunto de pacientes. La proteccion se puede limitar a mitigar la gravedad o la rapidez del inicio de los smtomas de la infeccion por el virus de la gripe.
Administracion farmaceutica
Una composicion confiere resistencia a uno o mas patogenos, por ejemplo una o mas cepas del virus de la gripe, mediante inmunizacion pasiva o inmunizacion activa. En la inmunizacion activa, una composicion de vacuna con microorganismos vivos inactivados o atenuados se administra profilacticamente a un huesped (por ejemplo, un mairnfero) y la respuesta inmunitaria del huesped a la administracion protege contra la infeccion y/o la enfermedad. Para la inmunizacion pasiva, los antisueros producidos se pueden recuperar y administrar a un receptor del que se sospecha que tiene una infeccion causada por al menos una copia del virus de la gripe.
Como alternativa, la vacuna se proporciona a un marnffero hembra (durante o antes del embarazo o el parto), en condiciones de tiempo y cantidad suficientes para dar lugar a la produccion de una respuesta inmunitaria que sirve para proteger tanto a la hembra como al feto o neonato (mediante incorporacion pasiva de los anticuerpos a traves de la placenta o en la leche de la madre).
En el presente documento se describen metodos para prevenir o atenuar un trastorno o enfermedad, por ejemplo una infeccion por al menos una cepa de patogeno. Como se usa en el presente documento, se dice que una vacuna previene o atenua una enfermedad si su administracion da lugar a la atenuacion total o parcial (es decir, supresion) de un smtoma o afeccion de la enfermedad) o en la inmunidad total o parcial del individuo frente a la enfermedad.
Al menos un virus de la gripe, inactivado o atenuado, o una composicion del mismo, de la presente invencion, se puede administrar por cualquier medio que logre los fines previstos usando una composicion farmaceutica como se ha descrito anteriormente.
Por ejemplo, la administracion de dicha composicion puede ser mediante diversas vfas parenterales tales como las vfas subcutanea, intravenosa, intradermica, intramuscular, intraperitoneal, intranasal, oral o transdermica. La administracion parenteral puede realizarse mediante inyeccion en bolo o mediante perfusion gradual en el tiempo. Un modo preferido de usar una composicion farmaceutica de la presente invencion es mediante aplicacion intramuscular o subcutanea. Vease, por ejemplo, Berkow et al., 1992; Goodman et al., 1990; Avery, 1987; y Katzung, 1992.
Un regimen tfpico para prevenir, suprimir o tratar una patologfa relacionada con el virus de la gripe comprende la administracion de una cantidad eficaz de una composicion de vacuna como se describe en el presente documento, administrada como un tratamiento unico o repetida como dosis potenciadoras o de refuerzo, en un periodo de hasta, e incluido, entre una semana y aproximadamente 24 meses, o cualquier intervalo o valor entremedias.
De acuerdo con la presente invencion, una “cantidad eficaz” de una composicion de vacuna es una que es suficiente para alcanzar un efecto biologico deseado. Se entiende que la dosificacion eficaz dependera de la edad, el sexo, la salud y el peso del receptor, tipo de tratamiento concurrente, en su caso, frecuencia del tratamiento y la naturaleza del efecto deseado. Los intervalos de dosis eficaces proporcionados mas adelante no se pretende que limiten la invencion y representan los intervalos de dosis preferidos. No obstante, la dosificacion mas preferida se adaptara al sujeto individual, como entiende y puede determinar un experto en la materia. Vease, por ejemplo, Berkow et al., 1992; Goodman et al., 1990; Avery's, 1987; Ebadi, 1985; y Katsung, 1992
La dosificacion de una vacuna de virus atenuado para un mamffero (por ejemplo, un ser humano) u organismo adulto aviar puede ser de aproximadamente 103-107 unidades formadoras de placas (UFP)/kg o cualquier intervalo o valor entremedias. La dosis de vacuna inactivada puede variar de aproximadamente 0,1 a 200, por ejemplo 50 yg de protema hemaglutinina. No obstante, la dosificacion debera ser una cantidad segura y eficaz tal como se determina mediante metodos convencionales usando las vacunas existentes como punto de partida.
La dosificacion de la HA inmunorreactiva en cada dosis de vacuna de virus replicado se puede normalizar de modo que contenga una cantidad adecuada, por ejemplo 1-50 yg o cualquier intervalo o valor entremedias, o la cantidad recomendada por el servicio de salud publica de EE.UU. (PHA), que normalmente es de 15 yg, por componente para ninos mayores >3 anos de edad y de 7,5 yg por componente para ninos mayores <3 anos de edad. La cantidad de NA tambien se puede normalizar, aunque esta glicoprotema puede ser labil durante la purificacion y almacenamiento del procesador (Kendal et al., 1980; Kerr et al., 1975). Cada dosis de 0,5 ml de vacuna contiene, preferentemente, aproximadamente 1-50 billones de partfculas vmcas y, preferentemente, 10 billones de partfculas.
La invencion se describira adicionalmente mediante los siguientes ejemplos no limitantes.
Ejemplo 1 (solo para ilustracion)
Materiales y procedimientos
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Virus y celulas. Los virus de H3N2 de humanos aislados de un solo paciente, bien en huevos de pollo embrionados (A/Tottori/AT1/AM2AL3/94; AM1AL3) de celulas de rinon canino Madin-Darby (A/Tottori/872/K4/94; K4) se obtuvieron de T. Ito (Tottori University, Tottori, Japon). Las reservas de virus cultivados en huevos de pollo embrionados de 10 dfas de edad (virus AMZAL3) o en celulas MDCK (virus K4) en medio mmimo esencial (MEM) suplementado con 0,3 % de seroalbumina bovina y 0,5 mg de tripsina/ml. Las celulas MDCK se mantuvieron en mEm suplementado con 5 % de suero bovino de neonato (Sigma, St. Louis, MO.).
Generacion de lrneas celulares resistentes a lectina. Las celulas MDCK cultivadas hasta una confluencia del 75 % se lavaron tres veces con solucion salina tamponada con fosfato y se incubaron con lectina de Maakia amurensis (MAA(100 mg/ml; Boehringer Mannheim, Mannheim, Alemania) o lectina de Sambucus nigra (SNA) (100 mg/ml; Boehringer Mannheim) en MEM que contiene 0,3 % de seroalbumina bovina. Tras una incubacion de 48 horas se sustituyo el medio por medio de crecimiento (MEM - 5 % de suero bovino fetal). La seleccion de la lectina se repitio como anteriormente dos veces adicionales. A continuacion, las colonias de celulas supervivientes se clonaron y las lineas celulares seleccionadas con SNA y MAA se denominaron MDCK-Sn10 y MDCK-Ma, respectivamente.
Metodo HPLC fluorometrico para la determinacion del contenido en acido sialico. El contenido en acido sialico (acido W-acetilneurammico [NeuAc] y acido N-gliconeurammico [NeuGc]) de ambas lineas celulares y el virus purificado se determino fluorometricamente mediante cromatograffa de lfquidos de alto rendimiento, como se describe en Suzuki et al. (1997). Cada muestra se coloco en un vial con tapa de cristal molido de 5 ml y se mezclo con 100 gl (25 mM) de acido sulfurico. Despues, los viales se calentaron a 60 °C durante 12 horas para hidrolizar cadenas de sialo- azucar. Despues de enfriar, se anadieron 50 gl de 1,2-diamino-4,5-metilenodioxibenceno a 50 gl del hidrolito y la mezcla se calento a 60 °C durante 2,5 horas en oscuridad para desarrollar la fluorescencia del acido sialico. Despues se inyecto una alfcuota de 10 gl de la solucion resultante en un cromatografo de lfquidos de alto rendimiento 880-PU (JASCO, Tokio Japon) equipado con una valvula inyectora de muestras (modelo 7125; Reodyne) y un espectrofotometro fluorescente (650-105; Hirachi, Tokio, Japon) con una celda de flujo de 20-gl y un registrador (Chromatopac C-RSA; Shionadzu, Kyoto, Japon). El espectrofotometro fluorescente se coloco a una longitud de onda de excitacion de 373 nm y una longitud de emision de 448 mn. Se usaron mezclas estandar (200 pmol/gl) de NeuAc (Sigma) y NeuGc (Sigma) para establecer curvas de calibracion.
Ensayo fluorometrico de la actividad sialidasa La actividad sialidasa del virus (5 x 105 UFP) se midio con acido 2'-(4- metilumbeliferil)-ar-D-A/-acetilneurammico (Sigma) como sustrato como se describe en Hara et al. (1987). En resumen, el sustrato fluorogenico, diluido a 1:2 con acetato sodico 0,5 M (pH 4,6), se anadio a un volumen igual de muestras de virus y se incubo durante 30 minutos a 37 °C. Las reacciones se detuvieron con 200 ml de Na2CO2 0,5 M (pH 10,7) y despues se incubo la fluorescencia a una longitud de onda de excitacion de 360 nm y una longitud de onda de emision de 460 nm. Todas las reacciones se realizaron por duplicado.
Analisis de la secuencia de los genes NA y HA. El ARN viral (ARNv) total se obtuvo de la muestra de virus con el uso del kit de purificacion de ARNv de Qiappin segun las instrucciones del fabricante (Qiagen, Inc., Valencia, Calif.). Para la produccion de ADNc, el oligonucleotido Uni-12, complementario de los 12 nucleotidos de ARNv en el extremo 3' de los segmentos genicos del virus de la gripe A, se uso como cebador para la reaccion con la transcriptasa inversa del virus de la leucemia murina de Moloney (Promega, Madison, WI). El ADNc del gen de NA se amplifico durante 30 rondas de PCR con los cebadores espedficos del gen de NA JN2-43 (secuencia sentido en 5' de ARNc: 5'-TGGCTCGTTTCTCTCACTATTGCC-3'; SEC ID N° 1) y JN2-1410r (secuencia antisentido en 3' de ARNc: 5'-TTATATAGGCATGAGATTGATGTCCG -3'; SEC ID N° 2) y 10 U de la ADN polimerasa Pwo (Boehringer Mannheim). Los productos de PCR resultantes se subclonaron en el vector pCR21 (Invitrogen, Carlsbad, Calif.) y se usaron para secuenciacion fluorescente automatica. El gen de HA se clono de un modo similar con los cebadores espedficos del gen de HA JH3-Up (secuencia del cebador sentido en 5' del ARNc, 5'- AGCAAAAGCAGGGGATAATTCTATTAACCATGAAGAC-3'; SEC ID N° 3) y JH3-Down (secuencia del cebador antisentido en 3' del ARNc 5'-AGTAGAAACAAGGGTGTTTTTAATTAATGCACTC-3'; SEC ID N° 4). Para cada aislado se examinaron tres clones para obtener las secuencias consenso de NA y HA.
Resultados
Generacion de lineas celulares resistentes a lectina. Para producir lrneas celulares con un menor nivel de expresion de acido sialico en la superficie celular se usaron dos lectinas, SNA y MAA, que difieren en la especificidad de union al acido sialico. La lectina MAA se une al acido sialico unido a galactosa mediante enlaces or(2,3) (Wang et al., 1988), mientras que la lectina SNA es espedfica de los acidos sialicos unidos a galactosa o a W-acetilgalactosamina mediante enlaces or(2-6) (Shibuya et al., 1987). La lmea celular MDCK, que soporta el crecimiento de los virus de la gripe, se uso como celula parental para la seleccion de lectina. Cuando se incubo en presencia de cualquier lectina, la mayona de las celulas murio en un plazo de una semana. Despues, los clones celulares resistentes se cultivaron para cultivos de reserva. Las lrneas celulares resultantes de la seleccion de la lectina MAA y SNA se denominaron MDCK-Ma y MDCK-Sn10, respectivamente.
La clasificacion celular activada por fluorescencia (FACS) con las lectinas MAA y SNA marcadas con digoxigenina (Figura 1A) demostro niveles elevados de union de las celulas MDCK a ambas lectinas, como se ha indicado anteriormente (Ito et al., 1997). Las celulas MDCK-Sn10 seleccionadas con lectina espedfica de enlaces a(2,6)
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conservaron una fuerte union a la lectina MAA espedfica de or(2,3) pero mostraron union a la lectina SNA mas debil que la de las celulas MDCK parentales. Por el contrario, las celulas MDCK-Ma seleccionadas con la lectina espedfica del enlace a(2-3) se unieron a las lectinas mucho mas debilmente que las celulas MDCK.
Crecimiento viral en las lineas celulares MDCK-Sn10 y MDCK-Ma Para saber como los virus de la gripe se adaptan a las celulas con menor expresion del receptor se eligieron dos variantes del virus de la gripe AM2AL3 y K4) con una especificidad de union al receptor de acido sialico conocida (Ito et al., 1997). El virus K4 reconoce espedficamente el NeuAc unido a galactosa mediante enlaces a(2-6) [NeuAca(2-6)Gal], mientras que el virus AM2AL3 es espedfico de NeuAca(2-3)Gal. Ambos virus se replicaron casi tan bien en las celulas MDCK-Sn10 como en las celulas MDCK (Tabla 1). No obstante, los tftulos de ambos virus en las celulas MDCK-Ma fueron 1 log menores que en las celulas MDCK. Asimismo, tras la infeccion con cualquiera de los virus, incluso a una multiplicidad de infeccion de 10, un pequeno porcentaje de celulas MDCK-Ma siguio creciendo hasta la confluencia sin ningun efecto citopatico. La produccion de virus no se pudo detectar en estas celulas supervivientes mediante ensayo de hemaglutinacion tras la sustitucion del medio con otro que contiene tripsina, que estimula el crecimiento del virus. Las celulas tambien fueron negativas mediante tincion inmunoqmmica para los virus de la gripe y las protemas HA y NP (datos no mostrados), de modo que se demuestra que las celulas no estaban infectadas de forma persistente. Las celulas supervivientes se denominaron MaKS.
Tabla 1. Replicacion de virus de la gripe en lineas celulares resistentes a lectina*
Lmea celular
Tftulo (DICT50/ml)
AM2AL3 K4
MDCK
1,8 x 109 5,6 x 104
MDCK-Sn10
5,6 x 108 3,2 x 104
MDCK-Ma
1,8 x 108 5,6 x 103
*La susceptibilidad de cada lmea celular se determino mediante la infeccion de celulas con AM2AL3 o K4 con virus y determinando la dosis requerida para infectar el 50 % de las celulas en cultivo tisular (DICT50).
El analisis FACS con las lectinas SNA y MAA demostro que las celulas MaKS, como las celulas MDCK-Ma de las que derivaron, se unieron a la lectina SNA espedfica de a(2,6) mucho mas debilmente que las celulas MDCK (Figura 1B). Ademas, el pico de union a la lectina MAA de las celulas MaKS fue mucho mas estrecho que en de la lmea celular MDCK-Ma, con una perdida de un pico de hombro pequeno que representa una poblacion de union a MAA mas alta (Figura 1).
Para determinar si cantidades reducidas de acido sialico eran responsables de la menor union a la lectina de las celulas MaKS, los niveles de acido sialico presentes en las celulas MaKS se cuantificaron mediante analisis cromatografico de ftquidos. La lmea de celulas MaKS mostro niveles mucho mas bajos tanto de NeuAc como de NeuGc (8,2 y 0,4 pmol/ug de protema, respectivamente) que las celulas MDCK(216,0 y 2,5 pmol/ug de protema), aunque el contenido NeuGc fue mucho menor. Estos datos demuestran una extensa reduccion del determinante del receptor de acido sialico en las celulas MaKS.
Adaptacion del virus en celulas MaKS. Para determinar como se propagan los virus AM2AL3 y K4 y se adaptan al crecimiento en celulas que expresan niveles muy bajos del receptor del virus, ambos virus se sometieron a pases en serie en celulas MaKS en cultivo ftquido. Dado que ambos virus se replicaron peor en las celulas MaKS que en las celulas MDCK (Tabla 2), los pases 1 a 3 se realizaron sin dilucion y los pases 4 a 13 se realizaron a una dilucion de 1:1.000. Tras el pase 8, el diametro de las placas producidas por cualquier variante habfa cambiado de grande (mas de 3 mm) a mas pequeno (aproximadamente 1 nm). A los pases 10 y mayores, solo habfa placas mas pequenas cuando los virus se analizaron con celulas MDCK (datos no mostrados). Despues de 13 pases en serie, ambos virus pudieron crecer en celulas MaKS tan bien o mejor que en las celulas MDCK (Tabla 2). Las reservas de virus producidas de cualquier variante despues del pase 13 fueron AL3(MaKS)-13 y K4(MaKS)-13 amplificados y disenados, respectivamente.
Tabla 2. Replicacion de virus adaptados para crecer en celulas seleccionadas con lectina*
Lmea celular
Tftulo (DICT50/ml)
AM2AL3
AL3(MaKS)-13 K4 K4(MaKS)-13
MDCK
1,8 x 109 5,6 x 104 5,6 x 104 5,6 x 104
MaKS
5,6 x 106 5,6 x 104 1,8 x 103 1,8 x 103
Resina, tftulo de MDCK/Tftulo de MaKS
321 1 31 0,3
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Lmea celular ___________________Titulo (DICTso/ml)___________________
________________________________________AM2AL3 AL3(MaKS)-13 K4________K4(MaKS)-13
*La susceptibilidad de cada lmea celular se determino infectando las celulas con AM2AL3 (cultivadas en huevos), K4 (cultivadas en celulas MDCK). Virus de reserva AL3(MaKS)-13 (cultivados en celulas MaK3) o K4(MaKS)-13 (cultivados en celulas MaKs) y determinacion de la dosis requerida para infectar el 50 % de las celulas de cultivo tisular (DICT50). Observese que ambos virus adaptados en las celulas MaKS crecen en estas celulas, asf como [AL3(MaKS)-13] o mejor que [K4(MaKS)-13] en las celulas MDCK, mientras que los virus originales crecen mejor en celulas MDCK._________________________________________________________
Analisis mutacional de los genes HA y NA de los virus AL3(MaKS)-13 y K4(MaKS)-13. Para determinar la base molecular de la adaptacion del virus a un ambiente celular caracterizados por una concentracion menor del receptor, los genes de HA de los virus AL3(MaKS)-13 y K4(MaKS)-13 se sometieron a transcripcion inversa, los ADNc se amplificaron mediante PCR y los productos resultantes se secuenciaron. Ninguno de los genes conteman mutaciones por comparacion con los genes de HA correspondientes de los dos virus parentales.
Dado que los cambios en la actividad de NA sialidasa probablemente influyen sobre la actividad de union al receptor y se determino la secuencia de NA de los virus AL3(MaKS)-13 y K4(MaKS)-13. El analisis de la secuencia de los genes de NA de ambas variantes revelo grandes deleciones internas (Figura 2). En AL3(MaKS)-13, la delecion se extendio desde los nucleotidos 220 a 1253, desplazando un marco de lectura y, por tanto, generando un codon de terminacion inmediatamente despues de la delecion. La capacidad de codificacion de esta NA es de 66 aminoacidos, correspondiente a la cola citoplasmica, el dominio transmembrana, la region del tallo y una porcion corta de la region de cabeza de NA. De un modo similar, el aislado K4(MaKS)-13 contema una delecion en el gen de NA de las bases 130 a 1193, llevando un codon de terminacion en el marco al codon 39. Como el virus AL3(MaKS)-13, el gen ya no codifico una region de cabeza catalttica completa. Por tanto, los virus pasados en una lmea celular con una expresion muy baja del receptor perdieron su actividad catalftica de NA.
Para confirmar este resultado, las variantes AL3(MaKS)-13 y K4 (MaKS)-13 se analizaron para determinar la actividad sialidasa usando un sustrato sialidasa fluorescente [acido 2'(4-metilumbeliferil)-Gr-D-W-acetilneurammico]. Al contrario que los virus parentales, ninguno de los mutantes de delecion de NA tema actividad sialidasa detectable (Figura 3).
Extension de la sialilacion de glicoprotemas virales. Durante la infeccion normal, los virus con menor actividad sialidasa no pueden crecer con eficiencia y agregarse en la superficie celular (Palese et al., 1974; Shibata et al., 1993). Entonces, ^por que los virus AL3(MaKS)-13 y K4(MaKS)-13, que carecen de actividad sialidasa, crecen en las celulas MaKS? Una posible explicacion sena que dado que el contenido en acido sialico de estas celulas es bajo, la extension de la sializacion de los oligosacaridos HA y NA tambien puede ser baja, lo que impide la agregacion de los virus en la superficie de las celulas infectadas, incluso cuando no hay actividad de sialidasa viral. Para analizar esta hipotesis, el contenido en acido sialico en preparaciones de virus purificadas se comparo entre los virus AM2AL3 y K4 cultivados en las celulas MDCK y los virus AL3(MaKS)-13 cultivados en celulas MaKS. El contenido en NeuAc fue similar entre las muestras de virus, aunque los virus AM2AL3 teman menor contenido de acido sialico (0,9 pmol de NeuAc/g de protema) que las otras muestras (A/Tottori/872/K4/94, 3,8 pmol de NeuAc/g de protema; AL3(MaKS)-13, 2,6 pmol de NeuAc/g de protema).
Por tanto, los virus que carecen de actividad sialidasa pueden crecer con eficiencia en las celulas que expresan un nivel reducido de acido sialico porque las glicoprotemas virales no se sialilan extensamente en comparacion con aquellas en las lmeas de celulas normales y no se unen a la HA, de modo que impide la agregacion viral.
Discusion
En Estudios anteriores, el pase de los virus de la gripe A en presencia de una actividad sialidasa bacteriana exogena y anticuerpos frente a la NA viral condujo a la delecion del gen de NA viral (Liu et al., 1993; Liu et al., 1995; Yang et al., 1997). Ademas, los mutantes de NA obtenidos mediante dicho pase pudieron crecer en cultivos celulares que carecen de actividad sialidasa exogena, asf como en huevos y ratones, como resultado de mutaciones compensatorias en la protema HA que reducen la afinidad de la molecula por los residuos de acido sialico (Hughes et al., 2000). Como se ha descrito en el presente documento, los virus de la gripe A pueden adaptarse para crecer en celulas con una expresion del receptor considerablemente reducida mediante mutaciones grandes por delecion del gen NA que anulan la actividad sialidasa. Incluso aunque la reduccion de los receptores virales podfan afectar en teona a la protema HA que se une al receptor solo se altero el gen de NA.
^Cual es la base molecular de este hallazgo? En ambientes celulares normales en los que los receptores de acido sialico son abundantes, la perdida de actividad de NA se puede compensar mediante la reduccion de la afinidad de HA viral por acido sialico, lo que permite la liberacion eficiente de la progenie de la superficie de la celula huesped e impide la agregacion de viriones (Hughes et al., 2000). En ausencia de niveles altos de receptores virales, como en nuestras celulas MaKS, no es necesaria una reduccion de la afinidad de HA para liberar la progenie viral y permitir el crecimiento de mutantes por delecion de NA. De hecho, la union de alta afinidad de la protema HA debe mantenerse
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para la replicacion viral en celulas que expresan niveles bajos del receptor viral. No obstante, la actividad sialidasa no se requiere para la liberacion de viriones y la prevencion de la agregacion de viriones en dicho ambiente, ya que las cantidades de acidos sialico sobre las moleculas de la superficie celular son bastante bajas y los contenidos de acido sialico de los viriones con delecion de NA son similares a los de los viriones silvestres. De hecho, es probable que la actividad sialidasa sea perjudicial para el crecimiento viral porque ademas elimina el acido sialico determinante del receptor de la superficie celular. Recientemente, se demostro que el virus de la gripe A que carece de un tallo de NA y, por tanto, incapaz de crecer en huevos, adquirio una insercion en el tallo de hasta 22 aminoacidos mediante recombinacion ARN-ARN no homologa (Mitnau et al., 2000). En conjunto, estos hallazgos indican que los virus de la gripe se pueden adaptar a nuevos ambientes del huesped sometiendose a cambios geneticos radicales, incluyendo inserciones y deleciones grandes.
En este y otros estudios previos (Hughes et al., 2000; Liu et al., 1993), los virus perdieron actividad sialidasa mediante deleciones internas en el segmento genico NA que no tema los extremos del segmento que codifican la cola citoplasmica y la region transmembrana. Por tanto, las regiones conservadas del gen NA en estos mutantes pueden ser necesarias para funciones tales como la morfogenesis y la estabilidad de los viriones.
Las celulas MaKS tienen un contenido de acido sialico menor que sus celulas parentales (MDCK). Aunque se han producido lmeas celulares similares a partir de celulas CHO (Ray et al., 1991), no se ha demostrado que sean utiles para los estudios del virus de la gripe por su incapacidad para soportar virus de la gripe eficientes. Por el contrario, las celulas MaKS derivaron de las celulas MDCK, una lmea celular estandar en estudios de virus de la gripe y debenan ser utiles en analisis basados en receptores. Por ejemplo, dado que se sabe que los gangliosidos anadidos de forma exogena se incorporan en las membranas de la celula huesped (Carroll et al., 1985), por consiguiente, se podnan incubar gangliosidos conocidos con celulas MaKS y analizar su capacidad para servir como receptores virales.
Durante el siglo pasado, se produjeron tres pandemias de virus de la gripe A cuando los genes de HA o tanto de HA como de NA de virus emergentes se introdujeron en una poblacion humana. Estudios comparativos de virus de diferentes animales huesped sugieren que estas cepas pandemicas se introdujeron mutaciones en el gen de HA (Bean et al., 1992). Si se requieren mutaciones similares en la NA para permitir que el virus cruce las barreras de las especies huesped; no obstante, la especificidad de sustrato del virus humano N2 NA, que derivo de un virus aviar cambio gradualmente durante su replicacion en seres humanos (Baum et al., 1991). Los resultados descritos anteriormente en el presente documento indican que las mutaciones de NA pueden, de hecho, contribuir a la capacidad de los virus de la gripe A para adaptarse a nuevos ambientes. Por ejemplo, un virus reagrupado con NA del virus humano y el resto de los genes de un virus de pato no se replico en patos (Hinshaw et al., 1983), aunque la NA del virus humano se origino en un virus aviar (Scholtissek et al., 1978). Esto sugiere que es probable que las mutaciones se produjeran en el gen de NA durante la adaptacion en seres humanos. Los estudios comparativos de NA virales de diferentes huespedes animales, junto con la genetica inversa basada en plasmidos recien desarrollada (Fodor et al., 1999; Neumann et al., 1999) pueden proporcionar informacion util en como estas glicoprotemas de superficie contribuyen a los cambios adaptativos entre los virus de la gripe en la naturaleza.
Ejemplo 2
Materiales y metodos
Celulas. Las celulas de rinon embrionario humano 293T se mantuvieron en medio de Dulbecco suplementado con 10 % de suero bovino fetal (FCS) y las celulas de rinon canino Madin-Darby (MDCK) se mantuvieron en medio Eagle suplementado con 5 % de suero bovino de neonato.
Genetica inversa basada en plasmidos. Los virus de la gripe A se generaron usando plasmidos que poseen el ADNc de los genes virales A/WSN/33(H1N1) bajo el control de un promotor y terminados de la ARN polimerasa I (denominados plasmidos Poll) y plasmidos pCAGGS/MCS que expresan protemas virales de la gripe como se describe en Neumann et al. (1999) (Figura 4B). En resumen, los plasmidos Pol 1 y los plasmidos de expresion proteica se mezclaron con un reactivo de transfeccion, Trans IT LT-1 (Panvera, Madison, WI), se incubaron a temperatura ambiente durante 10 minutos y se anadieron a 1 x 106 celulas 293T cultivadas en Opti-MEM (GIBCO/BRL). Cuarenta y ocho horas despues de la transcripcion se anadieron 0,5 |jg por ml de tripsina al medio para activar la protema HA, seguido de incubacion durante 1 hora a 37 °C. Despues se recogio el sobrenadante.
Plasmidos. El gen NAFLAG contiene la region no codificante en 5' del ARNc de NA; 51 codones de NA correspondientes a la cola citoplasmica (6 aminoacidos), region transmembrana (29 aminoacidos) y del tallo (16 aminoacidos) (Figura 4A); el epftopo FLAG (Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys; SEC ID N° 5); dos codones de terminacion secuenciales (TAA TAG; SEC ID N° 6); y 185 bases de la secuencia en el extremo 3' del ARNc de NA. Esta longitud de la secuencia en el extremo 3' es la mas corta hallada en un segmento de NA truncado (Yang et al., 1997). pPol1-NAFLAGWT, que produce ARN de NAFLAG sentido negativo, se produjo delecionando los nucleotidos 173 a 1070 (en el sentido positivo) del gen WSN de NA en pT7Blue-NA (que contiene el gen A/WSN/33 NA de longitud completa flanqueado por sitios BsmB1) e insertando las secuencias FLAG, dos codones de terminacion y un
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sitio StuI mediante PCR. Este fragmento se digirio mediante StuI y se produjo autoligacion. El gen NAFLAG se escindio con BsmBI y se inserto en el sitio BsmBI de pHH21.
pPoll-NAFLAGM(-), para la produccion de ARNv de NAFLAGM(-), carece del codon de iniciacion para la protema NA. Esto se consiguio cambiando el codon de iniciacion ATG para la protema NAFLAG truncada a GCG mediante un sistema de mutagenesis dirigida a sitio in vitro (GeneEditor, Promega).
pPol1NA-(183)GFP(157), que genera ARN que contiene el extremo no codificante en 3' del ARNv de NA y la secuencia complementaria que codifica una protema de fusion con 61 codones de NA en el extremo NA, potencio la protema fluorescente verde (eGFP, Clontech), y185 bases del extremo 5' del ARNv de NA, se produjo mediante sustitucion de los nucleotidos 203 a 1109 (en sentido positivo) del gen WSN de NA en pT7Blue-NA con un sitio BglII mediante PCR inversa. El gen eGFP se clono en este sitio BglII y el sitio StuI en la posicion 1226 (en el gen NA silvestre) en marco con la protema NA. El gen NA-(183)GFP(157) se inserto despues en el sitio BsmBI de pHH21.
El gen NA(0)GFP(0), que contiene la region no codificante en 3' del ARNv de NA, la secuencia codificante complementaria de eGFP, y la region no codificante en 5' del ARNv de NA, se produjo mediante PCR con cebadores oligonucleotidicos que poseen un sitio BbsI. Este fragmento de PCR se digirio mediante BbsI y se inserto en el sitio BsmBI de pHH21, de forma que tras la introduccion del plasmido en las celulas, se sintetiza el ARN que contiene la secuencia codificante de eGFP en la orientacion de sentido negativo flanqueada por regiones de ARNv de NA no codificantes en 5' y 3'.
Se produjo una serie de mutantes por delecion mediante mutagenesis por PCR. Los mutantes por delecion de la protema de fusion NA-eGFP se produjeron a partir del gen NA-(183)GFP(157) en el vector pT7blue. El gen NA-
(183)GFP(0), que carece de todo el extremo en 3' (sentido positivo) de la region codificante de NA de NA-
(183)GFP(157), se produjo mediante mutagenesis con PCR. Esta mutante contiene la region no codificante en 5' (sentido positivo), 61 aminoacidos de la secuencia de NA, el gen eGFP, dos codones de terminacion y la region no codificante en 3'. Los mutantes de PCR, NA-(90)GFP(0), NA-(45)GFP(0), NA-(21)GFP(0) y NA-(18)GFP(0)
contienen 30, 15, 7, o 6 deleciones de aminoacidos en el extremo N de la region codificante de NA de NA-
(183)GFP(0), respectivamente.
El gen NA0G185, que contiene la region no codificante en 5', el en eGFP, dos codones de terminacion y 185 nucleotidos del extremo 3' de NA (sentido positivo) se produjo del mismo modo a partir del gen NA(61)GFP. Este mutante tiene la region no codificante en 5' del ARNv de NA (28 nucleotidos) y 157 nucleotidos de la region codificante en 5' de NA del ARNv. Los mutantes NA-(183)GFP(78) y NA-(183)gFP(39) son mutantes por delecion de NA0G185, que tienen una mitad o un cuarto de la region codificante en 5' de Na como NA0G185, respectivamente.
Inmunotincion. Para detectar el epftopo FLAG unido al extremo C de la protema NA truncada, las celulas MDCK se infectaron con virus que poseen este epftopo y se cubrieron con 0,6 % de agarosa que contiene 0,5 |jg por ml de tripsina y 100 jU por ml de sialidasa de Vibrio Cholerae (GIBCO/BRL). Las celulas infectadas se fijaron con 3 % de solucion de formaldehndo, se permearon mediante 0,1 % Triton-X100 en 3 % de solucion de formaldehndo. Despues, el epftopo FLAG se detecto usando un kit Vectastain ABC (Vector, Burlingame, CA) y el anticuerpo monoclonal antiFLAG M2 (Sigma) como anticuerpo primario e IgG anti-raton biotinilada como anticuerpo secundario. Para identificar celulas infectadas por el virus WSN se uso un suero anti-WSN de conejo como anticuerpo primario.
Hibridacion in situ. Las celulas infectadas se hibridaron con sonda marcada con digoxigenina (DIG) y se tineron usando un kit de deteccion de acido nucleico DIG (Roche) conforme al protocolo del fabricante. Un oligonucleotido (100 pmol) complementario a la secuencia de nucleotidos que codifica el epftopo FLAG (GACTACAAGGACGACGATGACAAG; SEC ID N° 7) se marco mediante el kit DIG Oligonucleotide Tailing (Roche) a 37 °C durante 6 horas. Las celulas infectadas por virus se fijaron con 3 % de solucion de formaldetndo, se permearon mediante 0,1 % Triton-X 100 en 3 % de solucion de formaldehndo y se prehibridaron a 65 °C durante 30 minutos en tampon de prehibridacion (5x SSC, 1 % de reactivo de bloqueo del kit de deteccion, 0,1 % de N- lauroilsarcosina, 0,02 % de dodecilsulfato sodico [SDS]) que contiene 0,1 mg/ml de Poli(A)-ADN del kit de deteccion). Las sondas oligonucleotfdicas (10 pmol) se anadieron al tampon de prehibridacion y se hibridaron a 55 °C durante 1 hora. Las celulas hibridadas se lavaron durante 5 minutos con tampon de lavado (acido maleico 0,1 M, NaCl 0,15 M, 0,3 % de Tween 20, pH 7,5), se bloquearon con 1 % de reactivo de bloqueo durante 30 minutos a temperatura ambiente y se incubaron con anticuerpo anti-DIG (1:500) conjugado con fosfatasa alcalina durante 30 minutos a temperatura ambiente. Despues, las celulas se lavaron con el tampon de lavado y se incubaron con cloruro de tetrazolo nitroazul/5-bromo-4-cloro-3-indolil-fosfato (NBT/BCIP) en el tampon de deteccion (Tris-HCl 0,1 M, NaCl 0,1 M, pH 9,5) a temperatura ambiente durante 3 horas en oscuridad.
Pases competitivos. Los virus NAFLAGWT o NAFLAGM(-) (300 unidades formadoras de placa [UFP]) se mezclaron con 3 x 104 UFP de virus NA(-) y se usaron para infectar las celulas MDCK subclonfluentes (multiplicidad de infeccion de 0,01) y se incubaron durante 72 horas en medio que contiene 0,5 jg por ml de tripsina y 100 jU por ml de sialidasa de Vibrio cholerae. Los virus recolectados se usaron para infectar las celulas MDCK. Este proceso se repitio 5 veces.
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Resultados
Un virus de la gripe A que carece del segmento genico de NA es viable. El mantenimiento del gen de NA truncado despues de pases repetidos sugirio su importancia para la replicacion viral. Para generar un virus de la gripe A mutante sin el segmento de ARN de NA, celulas 293T se transfectaron con plasmidos para la produccion de ARNv, con la excepcion de ARNv de NA y aquellos para la expresion de nueve protemas estructurales. Tras la incubacion del sobrenadante del cultivo de celulas 293T con celulas MDCK en presencia de sialidasa de Vibrio Cholerae se observaron placas (diametros 189 ± 15,6 pm). En cultivo lfquido, este virus (denominado NA(-)) crecio hasta 105 UFP/ml. Por tanto, fue viable un virus de la gripe A con solo 7 segmentos de ARNv.
Un segmento de NA truncado se requiere para el crecimiento viral eficiente. Para entender la base molecular para el mantenimiento estable del gen de NA truncado tras pases repetidos, el crecimiento de virus que contiene un gen de NA truncado se comparo con el virus que carece del codon de iniciacion para el gen de NA, de modo que codifica el virus NA(-). Se genero un virus mutante, NAFLAGWT, mediante genetica inversa. NAFLAGWT tiene un gen de NA con una delecion interna y una secuencia del epttopo FLAG fusionada con el gen de NA truncado. NAFLAGWT crecio hasta 105 UFP/ml y produjo placas en presencia de una sialidasa bacteriana. Las placas se inmunotineron con anticuerpo monoclonal anti-FLAG o anticuerpo policlonal anti-WSN (Figura 4C). Las placas producidas por el virus NA(-) o NAFLAGWT se tineron con el anticuerpo anti-WSN, pero solo las del ultimo virus se tineron con el anticuerpo anti-FLAG.
Para determinar la diferencia en la capacidad de replicacion, los virus NA(-) y NAFLAGWT se mezclaron a una proporcion de 100:1 y esta mezcla se incubo con las celulas MDCK (Figura 5). A las 48 horas de la infeccion, se retiro el sobrenadante y se uso para la produccion de placas, que se inmunotineron con el anticuerpo monoclonal anti-FLAG. La prevalencia del virus con el segmento de NA truncado se determino calculando el porcentaje de placas positivas para FLAG entre las placas totales. Este procedimiento se repitio 4 veces mas. Como se muestra en la Figura 7B, las placas positivas para FLAG en la poblacion se aumento gradualmente durante los pases, alcanzando casi el 90 % al quinto pase. Este resultado muestra que un virus con 8 segmentos (aunque el gen de NA truncado no codifica una sialidasa funcional) se cultiva mejor que un virus con 7 segmentos.
El ARN viral es importante para un crecimiento viral eficiente. Para determinar su una protema NA truncada o ARN viral es importante para una replicacion viral eficiente se construyo un gen NAFLAGM(-) que carece del codon de iniciacion de NA y otro codon ATG en marco (el codon numero quince) (Figura 6A). Las placas producidas por el virus NAFLAGM(-) no se detectaron mediante el anticuerpo anti-FLAG (Figura 6B), lo que indica que la protema no se habfa traducido. Para garantizar que el virus NAFLAGM(-) posee el gen NAFLAGM(-) se realizo hibridacion in situ sobre placas producidas por este virus usando una sonda espedfica de la secuencia FLAG. Estas placas reaccionaron con la sonda, lo que confirma la presencia del gen NAFLAGM(-) en este virus. La capacidad de replicacion de este virus se comparo despues con el virus de 7 segmentos descrito anteriormente. El porcentaje de placas marcadas con la sonda espedfica de la secuencia FLAG aumento gradualmente (Figura 7B) y casi el 80 % de las placas se convirtio en positiva para la secuencia FLAG al quinto pase (Figura 7A). No hubo revertientes a aquellos que expresan la protema NA truncada durante el pase, como demuestra la falta de tincion con el anticuerpo anti-FLAG Por tanto, el propio ARN viral parece desempenar un papel importante en la replicacion viral eficiente, aunque la protema NA truncada tambien puede desempenar un papel en la replicacion viral eficiente ya que la tasa a la cual NAFLAGM(-) se hizo dominante en la infeccion mixta fue menor que la del virus NAFLAGWT.
Una senal de empaquetamiento del ARN viral de NA se extiende a la secuencia de codificacion. Incluso despues de un pase extenso de los virus CK2-29 y E17E (Hughes et al., 2000), el gen de NA truncado se mantuvo, lo que sugiere que la senal para la incorporacion de ARNv en los viriones (es decir, senal de empaquetamiento) esta presente en la region de codificacion del segmento de ARN de NA. Para comprobar esta hipotesis se inserto una secuencia de codificacion de eGFP en el gen de NA truncado en marco, en el que se habfa delecionado la secuencia de NA. Por tanto, este en recombinante, denominado NA-(183)GFP(157), posee el extremo no codificante en 3' del ARNv de NA y 61 codones de la region codificante de NA en el extremo N, una region codificante de eGFP y 185 nucleotidos del extremo 5' del ARNv de NA. Se preparo un virus que posee el gen NA- (183)GFP(157) en lugar del correspondiente gen de NA silvestre y se realizaron ensayos de placas (Figura 8A). Mas del 90 % de las placas expresaron eGFP, lo que indica que el gen NA-(183)GFP(157) se habfa incorporado en los viriones y se mantuvo durante la replicacion viral (Figura 8B). Este hallazgo fue interesante considerando que la secuencia CAT flanqueada por las secuencias no codificantes de NS no se mantema durante mas de 5 pases (Luytjes et al., 1989).
Dado que la diferencia entre las construcciones NA-(183)GFP(157) y CAT es la presencia de la secuencia codificante viral se genero un gen similar a la construccion CAT, NA(0)GFP(0), que contiene la secuencia codificante eGFP flanqueada por las regiones no codificantes de NA en 3' y 5'- Esta construccion carece de la secuencia codificante de NA. Aunque el virus generado con este gen produjo placas, solo una poblacion minoritaria (0,1 %) de placas tema una o dos celulas que expresan eGFP, lo que indica que el gen NA(0)GFP(0) no se mantema en el virus durante la replicacion viral. En las celulas 293T transfectadas con plasmidos, incluyendo uno que expresa el gen NA(0)GFP(0) para la produccion vial, eGFP se expreso en menor medida en comparacion con las transfectadas con el plasmido que expresa NA(61)GFP. La cantidad del plasmido Poll para NA(0)GFP(0) se multiplico por 10, lo
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que tuvo como resultado un numero similar de celulas 293T que expresan eGFP como las celulas transfectadas con el plasmido Poll para NA(61)GFP. Incluso con la cantidad 10 veces mayor del plasmido Poll para este gen, solo el 1 % de las placas producidas por el virus NA(0)GFP(0) contema celulas positivas para eGFP y solo unas pocas celulas en estas placas expresaban eGFP. Estos resultados indicaron que la senal de empaquetamiento del aRn de Na viral se extiende en la secuencia codificante de NA.
El papel de los segmentos de ARN en la produccion eficiente de viriones. El papel de los segmentos de ARN en la produccion eficiente de viriones. Para producir un virus de 8 segmentos, las celulas 293T se transfectaron con plasmidos de expresion proteica para las 9 protemas estructurales y 8 plasmidos Poll para la produccion viral normal. Asimismo, se uso un plasmido NS Poll que tiene dos mutaciones que eliminan la produccion de NS2; por tanto, los virus producidos en celulas 293T no sufren multiples ciclos de replicacion. Ademas, se usaron los plasmidos Poll de HA y NA que tienen mutaciones que eliminan la produccion de las protemas HA y NA, respectivamente, de forma que el efecto de la eliminacion de los segmentos genicos solo esta restringida al segmento de ARN, no al producto genico. Para la produccion de un virus de 7 segmentos, el plasmido Poll para el gen de NA se elimino, aunque se incluyo un plasmido para la expresion de la protema NA. Para preparar un virus con 6 segmentos, los plasmidos para los ARN de HA y NA se omitieron, aunque se incluyeron plasmidos para la expresion de las protemas HA y NA.
Para comparar la produccion de viriones entre estos virus, el numero de viriones infecciosos producidos a partir de celulas transfectadas con plasmidos se titulo mediante infeccion de las celulas MDCK con estos virus y las celulas infectadas inmunotenidas con el anticuerpo anti-WSN 48 horas despues de la infeccion. Como se muestra en la figura 9, la eficiencia de la produccion de viriones infecciosos se correlaciono con el numero de segmentos de ARN viral; cuanto mayor es el numero se segmentos de ARN viral, mejor es la produccion de viriones. Estos resultados indican el papel de los segmentos de ARN viral en producciones eficientes de viriones.
El extremo 3' del ARNv de NA es importante para su empaquetamiento en viriones. Para estrechar la senal de empaquetamiento en el ARNv de NA se prepararon virus que teman genes de NA truncados con deleciones adicionales en la region codificante en 3' o 5' (ARNv sentido) (Figura 8A). Aproximadamente el 40 % de las placas producidas por el virus NA-(183)GFP(0), que carece del extremo 5' de la region codificante de NA, expreso eGFP, aunque solo el 1,8 % de las placas producido por el virus NA0G185 que carece el extremo 3' de la region codificante de NA expreso eGFP. Estos datos indican que el extremo 3' de a region codificante de ARNv de NA es importante para el empaquetamiento de viriones (Figura 8).
Discusion
Al producir construcciones por delecion se determino la region codificante de NA que tuvo como resultado la incorporacion del segmento de NA en los viriones. Se descubrio que ambos extremos de las regiones codificantes eran importantes, pero el extremo 3' del ARNv correspondiente al extremo 5' de la region codiciante de NA fue mas consecuencial que el otro extremo. Para el segmento de NS, el extremo 3' del ARNv correspondiente al extremo 5' de la region codiciante de NS parece mas importante que el otro extremo para incorporacion (Figura 22). Por el contrario, para los sgmentos de HA, M y NP, ambos extremos son importantes, y para PB2, es importante el extremo 5' del ARNv correspondiente al extremo 3' de la region codiciante de PB2. Estos resultados muestran que las secuencias importantes para la incorporacion del segmento de ARNv se localizan en las regiones codificantes y, por tanto, son unicas de cada segmento. Posiblemente, dichas regiones interaccionan con otros ANR virales mediante apareamiento de bases, lo que conduce al reclutamiento de un conjunto de 8 segmentos de ARNv en un virion. Dado que la interaccion entre ARNv y los componentes virales es espedfica del virus, dicha interaccion puede ser una diana para el desarrollo de compuestos antivirales.
Ejemplo 3 (solo para ilustracion)
Para obtener una imagen verdadera de los contenidos del virus se realizo tomograffa con microscopio electronico (Figura 11A). Se recolecto una imagen de viriones con un espesor de 50 nm. Despues se realizo un analisis de uno de los viriones y se reconstituyeron las imagenes 3D del contenido de viriones. Las estructuras (barras) dentro de la partmula estan coloreadas para distinguir cada estructura (Figuras 11B-F, que muestran vistas desde arriba, laterales y desde abajo). La mayona de estas vistas para los bastones se cortan para una vista, en la que los bastones se cortaron por el medio, se muestra toda la molecula. No obstante, todas las vistas muestran interacciones entre bastones.
Segun los resultados resumidos anteriormente, incluyendo los datos que soportan que cada segmento viral contiene una secuencia unica que es importante para la incorporacion en viriones, que probablemente contribuya a la formacion de las caractensticas morfologicas unicas de los contenidos virales, es probable que los segmentos de ARNv se incorporen de forma selectiva en los viriones de la gripe. Esta informacion es util no solo para identificar las dianas para desarrollar compuestos antivirales, sino tambien para la preparacion de vacunas con microorganismos vivos atenuados, ya que la alteracion de las interacciones espedficas de virus puede inhibir la replicacion viral y conducir a la atenuacion.
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Ejemplo 4 (solo para ilustracion)
Materiales y metodos
Celulas. Las celulas de rinon embrionario humano 293T y las celulas COS-7 se mantuvieron en medio mmimo esencial de Eagle modificado con Dulbecco (DMEM) con 10 % de suero bovino fetal y antibioticos. Las celulas de rinon canino Madin-Derby (MDCK) se cultivaron en MEM con 5 % de suero bovino de neonato y antibioticos. Las celulas se mantuvieron a 37 °C y 5 % de CO2.
Construccion de plasmidos. La generacion de construcciones de plasmidos para la produccion de ARN viral (denominados pPoll) que contienen los genes de HA de los virus A/WSN/33 (H1N1) silvestre (denominados pPolI- WSN-HA) y B/Lee/40 (pPolI-B-HA) silvestre flanqueados por el promotor de la ARN polimerasa I humana y el terminador de la ARN polimerasa de raton se describio en Neumann et al. (1999). Una serie de construcciones de HA pPoll quimericas A/B se produjo mediante amplificacion por PCR con los cebadores y la polimerasa ProofStart (QiAGEN) y la posterior union usando construcciones de HA silvestres (Figura 13). Todas las construcciones se secuenciaron para garantizar que no se habfan incluido las mutaciones indeseadas.
Ensayos biologicos de HA expresadas en cultivo celular. Cada construccion HA pPoll quimerica A/B (1 |jg) se transfecto en celulas COS-7 usando el reactivo Trans IT (Mirus) junto con los otros cuatro plasmidos basados en pCAGGS (1 jg de cada uno) que expresan tres subunidades de polimerasa (PA, PB1, y PB2) y la nucleoprotema (NP) del virus A/WSN (Neumann et al., 1991). A las 48 horas de la transfeccion se trataron las celulas con sialidasa de Vibrio cholerae (10 U/ml) y TPCK-tripsina (2,5 jg/ml) a 37 °C durante 30 minutos. Despues, las celulas se fijaron con 4 % de paraformaldetndo y se inmunotineron usando el anticuerpo anti-B/HA y un kit de deteccion de ABC comercial (Vector laboratory). Asimismo se realizaron ensayos de hemadsorcion para evaluar las propiedades de union al receptor de cada Ha. En resumen, las celulas transfectadas se incubaron en una suspension de globulos rojos de pollo al 1 % en solucion salina tamponada con fosfato (PBS) a temperatura ambiente durante 30 minutos y despues se lavaron 5 veces antes de la observacion. Adicionalmente se llevaron a cabo ensayos de fusion. En resumen, las celulas transfectadas se incubaron en tampon HEPES (pH 5,0) a 37 °C durante 5 minutos, seguido de incubacion en medio de cultivo durante 7 horas. Tras la fijacion con metanol frio, las celulas fusionadas se inmunotineron como se ha descrito anteriormente.
Genetica inversa. El virus se genero mediante sistemas de genetica inversa de A/WSN o B/Lee basados en plasmidos como se describe en Neumann et al. (1999). Los virus con genotipos silvestres producidos a partir de plasmidos se denominaron A/WSN-R o B/Lee-R, respectivamente, y se usaron como controles para comparacion. Para producir virus quimericos A/B, se usaron construciones HA Poll quimericas en lugar de pPoll-WSN-HA. Los virus producidos a partir de celulas 293T se clonaron biologicamente mediante dilucion lfmite una vez y los virus de reserva se produjeron en celulas MDCK.
Infeccion experimental. Para analizar la patogenicidad de los virus, se infecto a ratones BALB/c hembra de cuatro semanas de edad anestesiadas con sevoflurano, por via intranasal con los virus quimerico A/B o silvestre (105 DICT50/50 jl). La mortalidad y los pesos corporales se monitorizaron durante 14 dfas despues de la infeccion. Tres dfas despues de la infeccion, se sacrifico a algunos de los ratones infectados para la determinacion de los tttulos de virus en organos.
Para evaluar la eficacia de la vacuna de cada virus quimerico contra la exposicion al silvestre, se infecto a los ratones por via intranasal con los virus quimerico o silvestre (103 DICT50/50 jl). Tres semanas despues se sacrifico a un grupo de ratones para obtener los sueros y lavados traqueo-nasales para detectar anticuerpos IgA o IgG espedficos de virus. Cuatro semanas despues de la infeccion, los ratones restantes fueron expuestos intranasalmente con anestesia a 50 DL50 del virus silvestre (B/Lee-R) y se les monitorizo para determinar la mortalidad y el peso corporal durante 14 dfas.
Deteccion de anticuerpo especifico de virus. Las muestras de suero y de lavados traqueo-nasales se analizaron para determinar los anticuerpos IgA o IgG mediante un ensayo de inmunoabsorcion ligado a enzimas (ELISA) como se describe en Kida et al. (1982). Los anticuerpos HI tambien se analizaron usando muestras de suero tras el tratamiento con la enzima destructora del receptor (RDEII: Denka Seiken).
Resultados
Construccion de genes de HA quimericos A/B. Para determinar la compatibilidad de la HA de tipo B con los componentes virales de tipo A se construyo una serie de genes quimericas entre los genes A/WSN y B/Lee (Figura 14). Dado que las secuencias no codificantes en ambos extremos de los segmentos de ARN es probable que sean intercambiables entre los virus de tipo A y B para la transcripcion y replicacion del ARN (Crescenzo-Chaigne et al., 1999; Desselberger et al., 1980; Muster et al., 1981), se preparo un gen de HA quimerico que contema las secuencias no codificantes del virus de tipo A y la totalidad de la secuencia codificante del virus de tipo B (Figura 14A, ANBH). Esta construccion producina protema HA de tipo B intacta. Despues, se preparo un gen quimerico en el que la region de la secuencia senal de la secuencia codificante de HA de tipo B y la secuencia no codificante se
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cambiaron al del virus de tipo A (ANSBH). Esta construccion tambien producina HA intacta de tipo B tras la eliminacion del peptido senal de tipo A mediante la peptidasa de la senal celular. De un modo similar se preparo un gen quimerico en el que la secuencia codificante de las regiones citoplasmicas y transmembrana de la HA se cambio del tipo B al tipo A (ANTBH), de modo que codifica una protema HA quimerica A/B. Se preparo un gen quimerico en el que las secuencias codificantes de las regiones senal y transmembrana/citoplasmica se cambiaron del tipo B al tipo A (ANSTBH). Esta construccion producina la misma protema HA quimerica que ANTBH, tras la eliminacion del peptido senal. Ademas, se preparo una quimera que contema todas las secuencias cadena arriba de la region correspondiente al sitio de escision del tipo B y la region cadena abajo del virus de tipo A en la secuencia codificante de HA (ANBW). Esta construccion producina una protema HA quimerica que comprende la region HA1 del virus de tipo B y la region HA2 del virus de tipo A. Por ultimo, se preparo un gen quimerico en el que la secuencia senal se cambio del tipo B al tipo A dentro de la construccion AnBw, que dana como resultado la misma protema HA quimerica que ANBW.
Propiedades biologicas de las HA quimericas A/B expresadas en cultivo celular. Para evaluar la funcionalidad de las HA quimericas, cada construccion pPoll HA se transfecto a celulas COS-7 junto con los plasmidos que expresan PA-, PB1-, PB2- y NP del virus de tipo A. Todas las construcciones de HA quimericas se expresaron en la superficie celular. Para analizar las actividades de union al receptor de estas HA se realizaron ensayos de hemadsorcion. Antes del ensayo, las celulas transfectadas se trataron con sialidasa bacteriana para eliminar el acido sialico terminal en las cadenas laterales de oligosacaridos de la HA, lo que interferina con su capacidad de union al receptor (Luo et al., 1999). Las celulas que expresan ANBH-, ANSbH-, ANTBH- y ANSTB se hemadsorbieron, mientras que las que expresan las otras dos (ANBW y ANSBW) no lo hicieron (Tabla 3). De un modo similar, las HA anteriores indujeron la fusion celular, aunque la ultima no. Estos resultados indicaron que las quimeras de HA anteriores eran biologicamente funcionales, mientras que las ultimas dos no se debieron, posiblemente, a alteraciones estructurales. Como se ha previsto a partir de informes previos, la HA de tipo B funcional se produjo a partir de segmentos intactos de HA de tipo B silvestre por tipo de complejo de polimerasa A y NP (Tabla 3), lo que confirma la compatibilidad entre las estructuras del promotor de tipo B y el complejo de la polimerasa A.
Tabla 3. Propiedades de las HA quimericas A/B expresadas en celulas y virus que las poseen.
Construccion de HA
Propiedad en cultivo celulara) Generacion de virus que poseen este genb) Tftulo vmco en el sobrenadante de celulas transfectadas b) (DICTao/ml) Tftulo vmco de la reserva c) (DICTa0/ml)
Expresion en la superficie celular
Hemadsorcion Fusion
HA silvestre
WSN-HA
+ + + + 3,2 x 107 6,3 x 107
B-HA
+ + + - NA d)
Quimerico de HA A/B
ANBH
+ + + + 2,0 x 10 6,3 x 102
ANSBH
+ + + + 1,1 x 102 2,0 x 106
ANTBH
+ + + + 2,0 x 104 6,3 x 106
ANSTBH
+ + + + 1,1 x 106 3,6 x 106
ANBW
+ - - - NA
ANSBW
+ - - - NA
a) Cada construccion de HA se transfecto en celulas COS-7 junto con plasmidos que expresan polimerasa y NP de tipo A. A las 48 horas de la transfeccion se analizaron las propiedades biologicas de cada HA.
b) La generacion de virus que poseen el gen de HA silvestre o quimerico junto con otros genes del virus de la gripe A se realzo mediante un sistema de genetica inversa basado en plasmidos. A las 48 horas de la transfeccion, el sobrenadante de celulas 294T transfectadas se recolecto y se titulo para determinar la infectividad.
c) La reserva de virus se preparo con celulas MDCK. Los virus se recogieron cuando los efectos citopaticos estaban avanzados.
d) NA: no disponible.__________________________________________________________________________
Produccion de virus con HA quimericas. Para determinar si los genes de HA quimericos funcionan durante la infeccion con el virus de la gripe A se preparo un virus WSN mutante en el que el gen de HA se reemplazo por un gen quimerico de HA A/B. La genetica inversa basada en plasmidos permitio la generacion de virus silvestre con un tftulo de aproximadamente 107 DICTso/ml (Tabla 3). Cuando se uso pPolI-B-HA en lugar de pPolI-WSN-HA no se genero virus infeccioso. Las cuatro construcciones de HA quimericas biologicamente funcionales (Tabla 3) se rescataron con exito en el virus de tipo A infeccioso, aunque con diferentes eficiencias, como se juzga mediante los tftulos de virus en los sobrenadantes de celulas transfectadas con plasmidos. El virus que pose la ANBH HA se replico solo marginalmente, mientras que el virus con la ANSTBH HA se produjo con la eficiencia mas alta y crecio a
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mas de 106 DICT50/1T1L Los otros dos genes de HA quimericos que no expresaron protemas biologicamente funcionales no soportaron crecimiento viral. Los virus quimericos A/B se denominan virus ANBH, ANSBH, ANTBH y ANSTBH.
Para confirmar que los virus que se produjeron de verdad conteman el ectodominio de la HA de tipo B, las celulas MDCK se infectaron con estos virus y se analizo su reactividad con los anticuerpos de la HA de los virus de tipo A o B (Figura 14). Las celulas infectadas con los virus que contienen construcciones de HA quimericas reaccionaron con los anticuerpos anti-B/HA, asf como los anticuerpos anti-A/NP, pero no con el anticuerpo anti-A/HA, lo que confirma que estos virus contienen ectodominios de HA de tipo B.
Caracteristicas de crecimiento de los virus quimericos AB en cultivo celular. Para determinar las propiedades de replicacion de los virus quimericos de HA A/B, se infecto a las celulas con los virus a una MDI de 0,01 y los virus resultantes se analizaron para determinar su cinetica de crecimiento (Figura 15). Aunque ninguno de los virus con las HA quimericas crecio mejor que los virus A silvestres, los virus quimericos ANSTBH y ANTBH crecieron hasta casi 106 DICT5o/ml. Al contrario que los virus de tipo A y B, todos estos virus quimericos formaron placas en forma de alfiler, que podfan detectarse unicamente con inmunotincion (datos no mostrados),
Replicacion de los virus quimericos A/B en ratones. La replicacion restringida de los virus quimericos A/B en cultivo celular sugirio que estos virus pueden estar atenuados in vivo. Por tanto, se inoculo a los ratones por via intranasal con los virus quimericos de hA A/B (105DICT50/50|jl). El virus ANBH no se analizo, dado que el tftulo de la reserva era demasiado bajo (de aproximadamente 103DIcT50/ml). Ninguno de los otros tres virus quimericos analizados fue mortal para los ratones, mientras que la misma dosis del virus A silvestre mato a todos los ratones infectados al tiempo que la misma dosis del virus B silvestre mato a siete de ocho ratones infectados (Tabla 4). Los virus quimericos se recuperaron de los pulmones y los cornetes nasales el dfa 3 despues de la inoculacion, lo que indica que estos virus se replicaban en ratones. Es interesante el hecho de que la replicacion de los virus quimericos estaba mas restringida en los pulmones y menos restringida en los cornetes nasales en comparacion con las de los virus silvestres. Esto sugiere una posible relacion entre el nivel de replicacion del virus en los pulmones y la letalidad. Los ratones infectados con los virus quimericos ANTBH y ANSTBH perdieron peso, aunque en menor medida en comparacion con los de los virus A silvestres. En conjunto, estos datos indican que los virus quimericos de HA A/B estan atenuados en los ratones.
Tabla 4. patogenicidad de los virus quimericos A/B en ratones.
Virusa)
Replicacion en organosb) Cambio de peso corporal (%)c) Letalidad (%) (n.° de muertos/n.° de analizados)
Cornetes nasales
Pulmones Dfa 5 Dfa 14
Virus silvestre
A/WSN-R
5,0 ± 0,3 8,2 ± 0,1 -27,4 ± 1,1 NAc) 100 (8/8)
B/Lee-R
4,7 ± 0,1 5,6 ± 0,1 -19,3 ± 7,9 NA 87,5 (7/8)
Virus quimerico A/B
ANSBH
4,0 ± 0,3 2,8 ± 0,3 2,6 ± 1,0 4,6 ± 1,2 0(0/8)
ANTBH
5,3 ± 0,3 4,9 ± 0,1 -17,3 ± 0,7 -8,3 ± 0,4 0(0/8)
ANTSTBH
5,3 ± 0,4 4,6 ± 0,1 -20,9 ± 0,3 -6,2 ± 8,8 0(0/8)
Control (PBS) d)___________
ND ND 2,9 ± 1,3 7,1 ± 0,2 0(0/8)
a) A los ratones se inoculo por via intranasal el virus (106 DICT50) y se les monitorizo durante 14 dfas. El cambio del peso corporal se expreso como el valor medio ± desviacion estandar (SD (n=3).
b) Los tttulos vmcos se determinaron en los organos a los 3 dfas de la inoculacion y se expresaron como el valor medio ± SD (n=3) del log-10 de DICT50/g.
c) NA: no disponible.
d) Se inoculo a los ratones control de forma simulada solucion salina tamponada con fosfato (PBS).__________
Proteccion de ratones inmunizados con los virus quimericos de HA A/B tras infeccion con el virus silvestre. Dado que los virus quimericos de HA A/B expresan un ectodominio de HA que deriva del virus de tipo B, se previo que estos virus proporcionanan una respuesta inmunitaria protectora a la infeccion por el virus B silvestre, Antes de los experimentos de exposicion se determino si los anticuerpos anti-B se produdan en ratones tras la infeccion con los virus quimericos. A las tres semanas de la inoculacion, se detectaron IgA espedfica del virus de tipo B en muestras de lavado nasal/traqueal y anticuerpos IgG en muestras de suero de ratones infectados con virus quimericos mediante una prueba de ELISA (Figura 16A). Los anticuerpos HI tambien se detectaron en muestras de suero de ratones infectados por el virus quimerico de HA A/B (Figura 16B). Por tanto, las respuestas de anticuerpo espedficas se demostraron en todos los ratones infectados con los virus quimericos, aunque el virus ANSBh provoco una respuesta inmunitaria menos eficiente.
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Los ratones inmunizados con virus quimericos fueron expuestos a 5ODL50 del virus B silvestre 4 semanas despues de la inmunizacion (Tabla 5). Todos los ratones sobrevivieron despues de la exposicion, mientras que todos los ratones inmunizados de forma simulada control murieron y solo 2 de 8 ratones inmunizados con el virus WSN a una
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dosis sustancial (10 DECT50) sobrevivieron tras la exposicion al virus B silvestre, lo que indica un efecto protector espedfico de la inmunizacion del virus quimerico contra la infeccion por virus B silvestre. Ademas, el virus de tipo B no se recupero de los cornetes nasales ni de los pulmones de ratones preinmunizados con virus quimericos, con la excepcion de un raton, que recibio virus ANSBH 3 dfas despues de la exposicion (datos no mostrados).
Tabla 5. Proteccion de ratones inmunizados con virus quimericos A/B contra la exposicion al virus B silvestre.
Postexposicionb)
Virus usado para la inmunizaciona)
Cambio de peso corporal ___________(%)___________ Tasa de supervivencia (%) (n.° de supervivientes/n.° analizados)
Dfa 5 Dfa 14
Virus silvestre
A/WSN-R
-17,5 ± 3,6 NDc) 25 (2/8)
B/Lee-R
1,8 ± 0,9 1,4 ± 0,6 100 (8/8)
Virus quimerico A/B
ANSBH
-5,6 ± 0,8 -0,7 ± 0,7 100 (8/8)
ANTBH
0,9 ± 0,9 1,9 ± 0,9 100 (8/8)
ANSTBH
1,5 ± 0,2 2,9 ± 0,7 100 (8/8)
Control (PBS)d)
-20,8 ± 0,5 NA 0(0/8)
a) Se infecto a los ratones por via intranasal con cada virus indicado
b) Cuatro semanas despues de la inmunizacion se expuso a los ratones por via intranasal el virus B/Lee-R silvestre (5ODL50) y fueron monitorizados durante 14 dfas tras la exposicion. El cambio del peso corporal se expreso como el valor medio ± SD (n=3).
c) NA: no disponible
d) Los ratones control fueron inmunizados de forma simulada con PBS y fueron expuestos.________________
Discusion
Como se ha descrito en el presente documento, por primera vez se genero un virus de la gripe que posee el tipo B, y no el tipo A, HA en el fondo del virus de tipo A, de modo que posee las protemas virales de ambos tipos A y B. ^Que es esencial para la generacion de virus quimericos de HA A/B? Los genes quimericos deben transcribirse y replicarse para su mantenimiento en los viriones. Aunque estan conservadas entre el mismo tipo de virus, las secuencias terminales en ambos extremos de las regiones no codificantes, que contienen las secuencias promotoras necesarias para la transcripcion y replicacion de ARN (Luytjes et al., 1989), difieren entre los segmentos de ARN de tipo A y de tipo B (Crescenzo-Chaigne et al., 1999; Desselberger et al., 1980). No obstante, en un estudio previo se ha demostrado que un gen indicador flanqueado por la secuencia no codificante del segmento NS del virus de tipo B se transcribio y replico mediante una polimerasa de tipo A (Muster et al., 1991). Adicionalmente, se produjo un virus de la gripe quimerico A/B (NA/B-NS) que contema un gen quimerico que comprende la secuencia codificante de la NA del virus de tipo A y la secuencia no codificante de NS del virus de tipo B (Muster et al., 1991). Estos datos indicaron que el complejo de la polimerasa de tipo A reconoda la secuencia promotora del gen de NS del tipo B, aunque en menor medida que el promotor homologo de los genes del virus de tipo A.
La secuencia no codificante de cada segmento de ARN incluye dos regiones estructurales. secuencias terminales que se conservan entre los ocho segmentos de ARN y secuencias espedficas del segmento interno. Dado que la actividad del promotor viene determinada principalmente por la region anterior (Portela et al., 1999), todos los segmentos genicos de tipo B probablemente se transcriban y repliquen mediante el complejo de la polimerasa de tipo A. De hecho, este concepto esta avalado por los datos que muestran que la HA de tipo B se expresaba en celulas cotransfectadas con regiones no codificantes de tipo B que contienen pPolI-B-HA y plasmidos que expresan complejo de polimerasa de tipo A y NP (Tabla 3). Por tanto, la incapacidad para generar un virus que contiene un segmento de HA de tipo B intacto, es decir un reagrupado intertfpico de HA, no se puede explicar por la ausencia de transcripcion y replicacion del ARN.
La restriccion de la generacion de los virus quimericos puede originarse al nivel de la incorporacion del segmento de ARN en los viriones; para la generacion de virus, el segmento generico debe empaquetarse en viriones. Aunque se notifico que la region no codificante del segmento NS de tipo A contema una senal de empaquetamiento de ARN (Luytjes et al., 1989), el mecanismo de empaquetamiento de los segmentos de ARN del virus de la gripe todavfa no se ha aclarado del todo. Las secuencias de caractensticas estructurales de los segmentos de ARN requeridas para la incorporacion en viriones eran en gran medida desconocidas, aunque recientemente se ha mostrado que el segmento A NA RNA posee sus senales de incorporacion a los viriones en ambos extremos de las regiones de codificacion (Fujii et al., 2002 y Ejemplo 2). En este estudio, el virus ANSBH se replico con mas eficiencia que el
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virus ANBH (Figura 14 y Tabla 3). Dado que las protemas HA expresadas en estos dos virus de^an ser identicas, a diferencia en la eficiencia de replicacion puede ser el resultado de una eficiencia de empaquetamiento de ARN. Es decir, una caractenstica estructural requerida para un empaquetamiento eficiente del ARN puede existir en la region de codificacion de la secuencia senal de la hA. De un modo similar, esto tambien puede explicar la diferencia en la eficiencia de la replicacion entre los virus ANTBH y ANSTBH, que tambien expresan protemas HA identicas. De hecho, las senales de empaquetamiento para el segmento HA de tipo A reside en ambos extremos de las regiones no codificantes (datos no publicados). Es interesante el hecho de que un gen de NA quimerico que contema las secuencias no codificantes del virus NA de tipo A y la secuencia codificante de la NA de tipo B no rescato en el virus de tipo A (Ghate et al., 1999). Este fallo se puede explicar por la falta de una region codificante de NA de tipo A que contiene una senal de empaquetamiento del ARN, consistente con el reciente hallazgo mencionado anteriormente (Fujii et al., 2002).
Tambien puede haber interacciones cruciales a nivel proteico para la generacion de virus quimericos de HA A/B; protemas quimericas se deben empaquetar en viriones y deben ser funcionales para la replicacion del virus. La protema nA tipo B suministrada en trans puede reemplazar la funcion de una NA de tipo A e incorporarse en viriones de tipo A, lo que soporta multiples ciclos de replicacion de un virus de tipo A defectuoso en nA en cultivo celular (Ghate et al., 1999 No obstante, como se ha mencionado anteriormente, no se ha generado un virus de tipo A que contiene tambien NA de tipo B. Aunque se generaron virus quimericos de HA A/B, se atenuaron en comparacion con el virus silvestre. Esta atenuacion puede proceder de un equilibrio suboptimo entre la actividad de union al receptor de HA de tipo B y la actividad sialidasa de NA de tipo A. Ademas, la sustitucion del peptido senal y / o los dominios transmembrana / citoplasmico en las HA puede haber alterada su estructura. Por ejemplo, los dominios citoplasmaticos / transmembrana en la HA puede interaccionar con otros componentes virales tales como M1 que conducen a un ensamblaje del virion eficiente (Ali et al., 2000; Cenami et al., 1996; Jin et al., 1997; Zhang et al., 2000). Por lo tanto, la incapacidad de generar virus de tipo A que posea segmentos de ARN de tipo B intactos o viceversa puede explicarse por la restriccion a nivel de aRn la incorporacion del segmento o el nivel de interaccion funcional de las protemas, o ambos.
Los virus quimericos de HA A/B se atenuaron en ratones con replicacion restringida en pulmones y confirieron inmunidad protectora a los ratones contra la infeccion por el virus b silvestre, lo que sugiere un nuevo abordaje para el desarrollo de vacunas contra la gripe. En la actualidad, la administracion subcutanea de las vacunas de la gripe inactivadas trivalente en el mundo, aunque sus eficacias son suboptimas. Esto se debe principalmente a la induccion insatisfactoria de la inmunidad mucosa en el tracto respiratorio superior, donde los virus de la gripe invaden inicialmente (Wavening et al., 2001). Por lo tanto, estas vacunas no previenen la infeccion viral, aunque disminuyen la gravedad de la enfermedad. A diferencia de las vacunas inactivadas, las vacunas vivas inducen respuestas inmunes tanto mucosa como citotoxica de linfocitos T. El estudio descrito en el presente documento sugiere que la manipulacion quimerica del gen de HA podfa controlar la atenuacion del virus en diversos grados. Por lo tanto, este abordaje permitina la produccion de cepas de vacunas vivas con un equilibrio adecuado entre atenuacion e inmunogenicidad. Como alternativa, las Ha quimericas A / B pueden ser incorporadas en el virus de la gripe A adaptada al cuya mutaciones atenuantes estan bien caracterizadas (Maassab et al., 1999). Las vacunas adaptadas al fno actuales son mezclas de los virus de tipo A y de tipo B. Potencialmente, la interferencia entre los dos virus afecta a la eficacia de la vacuna, aunque este problema se ha abordado mediante el ajuste de la relacion de dosis virales. Un virus de tipo A con la HA quimerica A / B permitina la produccion de vacunas contra la gripe con microorganismos vivos basadas en un unico virus atenuado en lugar de dos virus atenuados, lo que elimina la potencial interferencia entre los virus de tipos A y B.
Por lo tanto, al contrario que con una vacuna con microorganismos vivos atenuados que tiene una mezcla de los virus de tipo A y B, con informacion limitada sobre las mutaciones atenuantes para la cepa de vacuna de tipo B, se puede producir un virus que contiene HA y NA de tipo B en el fondo del virus de tipo A. Este abordaje permite la produccion de vacunas basadas en una cepa de vacuna maestra con mutaciones atenuantes bien definidas para la expresion de HA y NA tipo A, asf como de tipo B. Por otra parte, el conocimiento de las senales de empaquetamiento para los segmentos virales tambien estimula el desarrollo de vacunas contra la gripe con microorganismos vivos atenuados mejoradas.
Ejemplo 5
Materiales y metodos
Celulas y virus. Las celulas de rinon embrionario humano 293T (un derivado de la lmea 293 en el que se inserto el gen del antfgeno 40T del virus de simio) se mantuvieron en medio Eagle modificado de Dulbecco suplementado con suero bovino fetal (FCS) al 10 %. Para las celulas de rinon de hamster neonato (BHK), celulas de ovario de hamster chino (CHO) y celulas de rinon canino Madin-Darby (MDCK) se usaron DMEM que contiene 5 % de FCS y MEM que contiene 10 % y 5 % de suero bovino de neonato, respectivamente. Todas las celulas se mantuvieron a 37 °C y 5 % de CO2. El virus A/WSN/33 (H1N1) (WSN) se genero mediante genetica inversa como se describe en Neumann et al. (1999) y se propagaron en celulas MDCK. La cepa Indiana de VSV generada por genetica inversa se propago en las celulas BHK.
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Genetica inversa. Para la generacion de partmulas similares al virus de la gripe (VLP) y virus mutantes de la gripe A, se usaron plasmidos que poseen el ADNc de los genes virales WSN bajo el control del promotor de la ARN polimerasa I humana y el terminador de la ARN polimerasa I de raton (denominados plasmidos Poll) y el vector de expresion de protemas eucariotas pCAGGS/MCS (controlado por el promotor de la p-actina de pollo). En resumen, los plasmidos Poll y los plasmidos de expresion proteica se mezclaron con un reactivo de transfeccion, Trans IT LT- 1 (Panvera, Madison, Wl), se incubaron a temperatura ambiente durante 15 minutos y se anadieron a 1 x 106 celulas 293T cultivadas en Opti-MEM (GIBCO/BRL). Seis horas mas tarde, la mezcla de reactivos de transfeccion de ADN se reemplazo con Opti-MEM I que contiene 0,3 % de BSA y 0,01 % de FCS. Cuarenta y ocho horas mas tarde, se recogieron las VLP o los virus mutantes de la gripe A en el sobrenadante. Los transfectantes generados en este estudio contienen todos un segmento de ARNV de HA mutante junto con otros segmentos de ARNv del virus WSN u se designan con el nombre del segmento de ARNv de HA mutante (por ejemplo, una VLP que contiene el segmento de ARN HA(0)GFP(0) se designa la VLP de HA(0)GFP(0)).
Plasmidos de construccion. Se uso pPolIHA(0)GFP(0) para producir ARN de sentido negativo que contiene la region no codificante en 3' del ARNv de Ha, la secuencia codificante complementaria de la protema fluorescente verde (GFP, Clontech) potenciada y la region no codificante en 5' del ARNv de HA. En resumen, el gen GFP se amplifico mediante PCR con cebadores que contienen los sitios BsmBI y la secuencia no codificante en 3 'o 5' de HA, se digirio con BsmBI y se clono en el sitio BsmBI del plasmido Poli. La introduccion de este plasmido en las celulas da lugar a un ARN que contiene la secuencia de codificacion de GFP en orientacion de sentido negativo, flanqueada por las regiones no codificantes en 5 'y 3' de ARNv de HA.
El plasmido pPolIHA(468)GFP(513) se produjo del siguiente modo: para la produccion de ARNv de WSN el pPolIHA se amplifico primero mediante PCR inversa usando los cebadores en orientacion inversa-inversa Bam500R (5'- GCGGATCCTCCCCTATGGGAGCATGATAC-3'; SEC ID N° -9) y Xba1218F (5'- GCTCTAGAAACTCTGTTATCGAGAAAATG-3'; SEC ID N° 10). El producto de la PCR se digirio con BantHI y XbaI, y, a continuacion, el gen GFP se clono en el sitio BantHI y XbaI. El plasmido resultante, pPolIHA(468)GFP(513), se utilizo para la produccion de ARN de sentido negativo, que contiene la region no codificante en 3' y 468 bases de la region codificante de ARNv de HA, la secuencia codificante de GFP, 513 bases de la region codificante en 5' y la region no codificante en 5' de ARNv de HA. Una serie de mutantes de delecion de HA tambien se produjo mediante PCR inversa de la misma manera. Los mutantes se designaron de acuerdo con el numero de nucleotidos derivados de la region codificante de HA, por ejemplo, el segmento de ARN HA(9)GFP(80) contiene la region no codificante de HA en 3', 9 nucleotidos de la secuencia codificante de HA que corresponden a la region en el extremo N, el marco de lectura abierto de GFP, 80 nucleotidos de la secuencia codificante de HA corresponde a la region en el extremo C Y la secuencia no codificante de HA en 5'. Todas las construcciones de plasmidos se secuenciaron para garantizar que las mutaciones no deseadas no se introdujeron mediante la PCR.
Mediante PCR se produjo pPolIHA(0)VSVG(0), que se utilizo para producir RNA de sentido negativo que contiene la region no codificante del ARNv de HA en 3', la secuencia de codificacion complementaria de V SVG y la region no codificante en 5' del ARNv de HA. En resumen, el gen G de VSV se amplifico mediante PCR utilizando pCAGGS- VSVG como molde y los cebadores que contienen los sitios BsmBI y la secuencia no codificante de HA en 3' y 5'. A continuacion, se digirio el producto de la PCR con BsmBI y se clono en el sitio BsmBI del vector pHH21. El plasmido pPolIHA(9)VSVG(80) se produjo mediante la clonacion de las secuencias codificantes de VSV G en el sitio BamHI y el sitio XbaI de pPolIHA(9)GFP(80). El pPolINA(183)GFP(157), que contiene los extremos no codificantes en 3' del ARNv de NA y una secuencia complementaria que codifica una protema de fusion que posee 61 codones de NA en el extremo B y GFP, dos codones de terminacion consecutivos (TAA-TAG) y 185 bases del extremo 5' del ARNv de NA, se produjo del siguiente modo. La region correspondiente a los nucleotidos 203 a 1109 (sentido positivo) del gen de NA de wSn en pT7Blue-DNA se sustituyo primero con un sitio BglII mediante PCR inversa. El gen de GFP se clono despues en este sitio BglII y el sitio StuI en la posicion 1226 (en el gen NA silvestre) en marco con la protema NA. El gen NA-(183)GFP(157) se inserto despues en el sitio BsmBI de un plasmido Poll, pHH21.
El plasmido pPolINA(183)GFP(157)Met(-), utilizado para la produccion de ARN de NA(183)GFP(157)Met(-) de sentido negativo, que carece del codon de iniciacion para la protema de NA, se genero de la siguiente manera. El codon de iniciacion ATG y otro ATG en el codon decimoquinto del gen NA(183)GFP(157) en pPolINA(183)GFP(157) se cambio a GCG mediante mutagenesis dirigida a sitio in vitro (GeneEditor, Promega). La construccion resultante, pPolINA(183)GFP(157)Met(-) contiene la region no codificante en 3' (19 nucleotidos), 183 nucleotidos correspondientes a la region codificante de NA en el extremo N, el marco de lectura abierto de GFP, dos codones de terminacion consecutivos (TAA-TAG), 157 nucleotidos correspondientes a la region codificante de NA en el extremo C y la region no codificante de NA en 5' (28 nucleotidos), bajo el control del promotor de la ARN polimerasa I humana y el terminador de la ARN polimerasa I de raton.
Ensayo de inmunotincion. Dieciseis horas despues de la infeccion con VLP DE LA GRIPE, las celulas se lavaron dos veces con solucion salina tamponada con fosfato (PBS) y se fijaron con 3,7 % de formaldetndo (en PBS) durante 20 minutos a temperatura ambiente, seguido de tratamiento con 0,1 % Triton X-100 y SE procesaron. Para examinar la eficacia de la generacion de VLP, 106 celulas se incubaron con 0,1 ml del sobrenadante del cultivo de las celulas 293T transfectadas con el plasmido y el numero de celulas positivas para NP, tal como se detecta mediante el ensayo de inmunotincion, se registro a las 16 horas de la infeccion.
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Transferencia de tipo western. Las VLP o virus mutantes se centrifugaron durante 1,5 horas a 50.000 x g a 4 °C. Las VLP concentradas o los virus se resuspendieron en tampon de lisis (KCl 0,6 M, Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, 0,5 % de Triton X-100). Los lisados se colocaron en geles de SDS-poliacrilamida al 15 %, se electrotransfirieron a una membrana de difluoruro de polivinilideno (PVDF), se bloquearon durante la noche a 4 °C con 5 % de leche descremada en PBS y se incubaron con el anticuerpo policlonal anti-virus WSN, el anticuerpo monoclonal anti-HA o el anticuerpo monoclonal anti-VSVG durante 1 hora a temperatura ambiente. La membrana se lavo tres veces con PBS que contema 0,05 % de Tween-20. Los anticuerpos unidos se detectaron con un kit VECTASTAIN ABC (Vector) y el kit de inmunotincion Konica (Konica).
Hibridacion de tipo Northern. El ARNv presente en las celulas 293T transfectadas con los plasmidos Poll se extrajo con el kit de extraccion de ARN Isogen (Nippon Gene, Tokio, Japon) 24 horas despues de la transfeccion. Los ARN se glioxalaron en tampon de glioxal / DMSO / fosfato a 50 °C durante 1 hora y se separaron por electroforesis en gel de agarosa al 1,0 % en tampon fosfato 10 mM (pH 7,0). Los ARN se transfirieron a una membrana de nylon y se hibridaron con una sonda oligonucleotidica complementaria a la secuencia de
GFP(ATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGG; SEC ID N° 8) (10 pmol), que se marco usando un kit DIG Oligonucleotide Tailing (Roche) a 37 °C durante 30 minutos. La hibridacion se realizo utilizando la sonda de GFP en Easy Hyb (Roche) durante la noche a 42 °C. Las bandas de ARN se detectaron mediante el uso del kit de deteccion de acido nucleico DIG (Roche). En resumen, la membrana hibridada se lavo con un tampon de lavado (acido maleico 0,1 M, NaCl 0,15 M, 0,3 % de Tween 20, pH 7,5), se bloquearon con 1 % de reactivo de bloqueo durante 30 minutos a temperatura ambiente y se incubaron con anticuerpo anti-DIG (1:5000) conjugado con fosfatasa alcalina durante 30 minutos a temperatura ambiente. Despues, se lavo la membrana con el tampon de lavado y se incubaron con cloruro de tetrazolo nitroazul/5-bromo-4-cloro-3-indolil-fosfato (NBT/BCIP) en el tampon de deteccion (Tris- HCl 0,1 M, NaCl 0,1 M, pH 9,5) a temperatura ambiente en oscuridad. Las bandas de ARN se detectaron usando el kit de deteccion de acido nucleico DIG (Roche). El ARN control se extrajo de celulas 293T transfectadas de forma simulada.
Propiedades de replicacion de los virus transfectantes. Las celulas BHK, CHO, o MDCK en pocillos por duplicado de placas de 24 pocillos se infectaron con un virus, se cubrieron con medio MEM que contiene 0,01 % de FCS y se incubaron a 37 °C. En diferentes momentos, los sobrenadantes se analizaron para detectar el virus infeccioso en ensayos de placas en celulas MDCK.
Resultados
La region codificante del ARNv de HA se requirio para la incorporacion del segmento de HA en viriones. Para determinar si son necesarias las regiones codificantes de ARNv de HA para su incorporacion al virion como para ARNv de NA, se construyeron dos plasmidos: pPolIHA(0)GFP(0) que solo contiene las regiones no codificantes en 3' y 5' del ARNv de NA y la secuencia codificante de GFP y pPolIHA(468)GFP(513) en el que la secuencia codificante de GFP se inserto en marco del gen de HA tras la delecion de la secuencia de HA en las posiciones nucleotidicas 500-1218 (en orientacion de sentido positivo) (Figura 17). Esta ultima construccion posee la region no codificante en 3' de HA (33 nucleotidos), 468 nucleotidos correspondientes a la region codificante en el extremo N, el marco de lectura abierto de GFP con un codon de terminacion, 513 nucleotidos correspondientes a la region codificante de HA en el extremo C y la region no codificante de HA en 5' (45 nucleotidos). La protema de fusion resultante contiene los 156 aminoacidos en el extremo N de HA y la totalidad de la secuencia de GFP.
Para generar VLP que poseen estos ARNv de HA mutantes, las celulas 293T se transfectaron con pPolIHA(0)GFP(0) o pPolIHA(468)GFP(513), y 7 plasmidos de ARN de Poli para la produccion de los segmentos de ARN viral de la gripe restantes y los plasmidos de expresion de protemas para nueve protemas virales (es decir, PA, PB1, PB2, NP, HA, NA, M1, M2 y NS2). Cuarenta y ocho horas despues de la transfeccion, las VLP en los sobrenadantes de los cultivos de celulas 293T se recogieron y se usaron para infectar las celulas MDCK. Dado que las VLP resultantes posefan HA mutante, expresaron GFP y todas las protemas virales excepto HA. En consecuencia, no se genero ningun virus progenie infeccioso (datos no mostrados). La eficiencia de la incorporacion en el virion del ARNv de HA mutante se determino dividiendo el numero de celulas que expresan GFP (es decir, el numero de VLP que posefa el segmento que codifica el gen de GFP) con el de celulas que expresan NP (es decir, el numero de todas las VLP infecciosas) a las 16 horas de la infeccion. El tftulo de todas las VLP infecciosas en el sobrenadante del cultivo de las celulas 293T transfectadas con pPolIHA(468)GFP(513) (es decir, el numero de celulas positivas para NP) era 7,4 x 105 VLP infecciosas / ml y el tftulo de VLP que contienen ARN de HA HA(468)GFP(513) (es decir, el numero de celulas positivas para GFP) fue de 3,2 x 105 / ml VLP/ml. Estos resultados indicaron que el 42,8 % de todas las VLP infecciosas genera albergaba ARNv de HA mutante (Figura 18). Por el contrario, solo el 3,9 % de las VLP posefa el segmento de ARN HA(0)GFP(0) (Figura 18). Estos resultados sugirieron que se requieren las regiones codificantes del ARNv de HA para la incorporacion de un segmento de HA en viriones de la gripe.
Ambos extremos 3' y 5' de la region codificante del ARNv de HA son importantes para la incorporacion del segmento de HA en viriones. Previamente se demostro que el extremo 33 de la region codificante de ARNv de NA desempena un papel mas crucial en la incorporacion al virion que el extremo 5'. Por lo tanto, se determino si 3', 5' o ambos extremos eran importantes para incorporacion al virion del segmento de ARNv de HA. Para abordar esta cuestion,
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se preparo el gen HA(0)GFP(1011), que careda del extremo 3' de la region codificante del ARNv de HA y el y el gen HA(966)GFP(0), que careda del extremo 5' de la region codificante de ARNv de HA (Figura 17) y la incorporacion del virion de estos ARNv de H se analizo como se ha descrito anteriormente. Aunque las cantidades de ambos ARNv en las celulas transfectadas con plasmido fueron comparables a las del ARNv de HA(468)GFP(513) (datos no mostrados), la eficiencia de la incorporacion del segmento tanto de HA(0)GFP(1011) como de HA(966)GFP(0) fue de solamente 6,8 % y 8,4 %, respectivamente (Figura 17), lo que indica que ambos extremos 3' y 5' de la region codificante del ARNv de HA desempenaban un papel importante en la incorporacion al virion de segmento HA.
Para definir aun mas la region cntica en el ARNv de HA para su incorporacion en los viriones, se genero una serie de VLP, que poseen ARNv de HA truncados con una delecion adicional en la region codificante en el extremo 3' y / o 5' (Figura 17). Despues se determino la eficiencia de la incorporacion del ARNv de HA mutante en las VLP. Dado que la delecion adicional en el extremo 3' que deja solo 15 nucleotidos y en el extremo 5' que deja 268 nucleotidos no afecto a la eficacia de la incorporacion del ARNv de HA (comparese Ha(468)GFP(513) con HA(15)GFP(268)), se prepararon construcciones con delecion adicionales utilizando pPolIHA(15)GFP(268), que posee 15 nucleotidos del extremo 3' y 268 nucleotidos de el extremo 5' de la region codificante de HA. Aunque el alcance de la incorporacion del ARNv se redujo gradualmente a medida que las deleciones aumentaron, 80 nucleotidos de la region codificante en 5' de HA paredan mmimamente necesarios para la incorporacion eficiente al virion del ARNv de HA (comparese HA(15)GFP(80) con HA(15)GFP(75)). Otro analisis de delecion demostro que HA(9)GFP(80) que deja 9 residuos de nucleotidos de la region codificante de HA en el extremo 3' dio lugar a la incorporacion eficiente en el virion de un ARNv de HA (mas del 65 %), aunque el nivel de ARNv de HA(9)GFP(80) presente en las celulas transfectadas no difirio apreciablemente de la del ARNv de HA(0)GFP(0) (figuras 17 y 18). Estos resultados indican que se requieren 9 nucleotidos en el extremo 3' y 80 nucleotidos en el extremo 5' de la region codificante de HA para una incorporacion eficiente del ARNv de HA en los viriones.
Generacion de un nuevo virus de la gripe A cuyos genes de HA y NA contienen las secuencias codificantes de genes extranos. Dado que se habfa determinado las secuencias necesarias para la incorporacion del segmento de HA en los viriones, se examino si un gen extrano flanqueado por dichas secuencias podna incorporarse en los virus de la gripe A y se manteman durante el pase repetido. Como un gen extrano modelo, la secuencia codificante de VSV G se inserto en los sitios BamHI y Xbal de pPolIHA(9)GFP(80) en lugar de la secuencia de GFP. La construccion resultante se denomino pPolIHA(9)VSVG(80), que posee la region no codificante en 3' de HA (33 nucleotidos), 9 nucleotidos correspondientes a la region codificante en el extremo N, el marco de lectura abierto de VSV G con un codon de terminacion (1552 nucleotidos), 80 nucleotidos correspondientes a la region codificante de HA en el extremo C y la region no codificante de HA en 5' (45 nucleotidos). Como control, se construyo un vector, pPolIHA(0)VSVG(0), que posee solamente las regiones no codificantes en 3' y 5', pero no la region codificante del ARNv de HA. Dado que la protema G de VSV se debe sustituir para las protemas Ha y NA, la region codificante de NA puede sustituirse por un gen extrano. Por tanto, pPolINA(183)GFP(157)Met(-) se construyo para la produccion de un segmento de ARN de NA recombinante que contiene la secuencia codificante de GFP y las secuencias codificantes de NA requeridas para la incorporacion eficiente al virion del segmento de NA. En esta construccion, el codon de iniciacion para el marco de lectura abierto de NA se destruyo mediante la sustitucion de ATG por GCG. Por lo tanto, la lectura abierta de GFP se traducina a partir de su propio codon de iniciacion.
Las celulas 293T se transfectaron con plasmidos para la produccion de los segmentos HA(9)VSVG(80) y NA(183)GFP(157)Met(-) recombinantes y los 6 segmentos de ARN viral restantes, asf como los plasmidos para la expresion de las protemas polimerasa del virus de la gripe, NP, M1, M2, NS2 y G de VSV. A las 72 horas despues de la transfeccion, se recogieron los sobrenadantes de las celulas 293T y los ensayos de placas se llevaron a utilizando celulas MDCK. Un virus transfectante que aloja el segmento de ARN HA(9)VSVG(80) y el segmento de ARN NA(183)GFP(157)Met(-) (designado virus VSVG(Ha)GFP(NA)) era viable y produjo placas que expresaban GFP en ausencia de tripsina (Figura 19). La inmunotincion confirmo la expresion de G de vSv, pero no de HA, que contiene placas (Figura 19). Las celulas infectadas con el virus VSVG(HA)GFP(NA), pero el virus WSN control, tambien expresaron GFP. Por el contrario, no se observaron placas cuando se uso el plasmido pPolIHA(0)VSVG(0) en lugar de pPolIHA(9)VSVG(80), aunque se detectaron celulas individuales que expresan GFP y / o protema NP en celulas MDCK (datos no mostrados). Por otra parte, se observo que tanto VSVg como GFP siguieron expresandose en las celulas MDCK infectadas con el virus VSVG(HA)GFP(nA) despues de cinco pases consecutivos (datos no mostrados). No se detecto ninguna mutacion en la region de HA restante del segmento de ARN de HA(9)VSVG(80) del virus VSVG(HA)GFP(NA) despues de cinco pases. Sin embargo, se encontraron tres mutaciones, Ile a Leu en la posicion 57, Gln a His en la posicion 95 y Gln a terminacion en la posicion 499 en las secuencias de aminoacidos de VSVG. Aunque la protema G de VSV silvestre tiene 29 residuos de dominio citoplasmico, los ultimos 13 residuos de este dominio se delecionaron debido a la mutacion de Gln a terminacion en la posicion 499.
Propiedades biologicas del virus VSVG(HA)GFP(NA). Para determinar si la protema G de VSV de verdad se incorpora en los viriones compuestos de otras protemas virales de la gripe se realizo un analisis de transferencia de tipo Western con virus VSVG(HA)GFP(NA) y WSN (control) concentrados. Como se muestra en la Figura 20, la protema G de VS, pero no HA, se detecto en viriones de VSVG(HA)GFP(NA), lo que confirma la incorporacion de la protema G de VSV.
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Despues, se analizaron las propiedades de crecimiento del virus VSVG(HA)GFP(NA) en las celulas BHK, CHO, o MDCK. Las celulas se infectaron a una MDI de 0,001 y los rendimientos de virus en el sobrenadante del cultivo se determinaron en diferentes momentos despues de la infeccion a 37 °C mediante ensayo de placas en celulas MDCK. Aunque menor que el del virus WSN, el tftulo maximo del virus VSVG(HA)GFP(NA) en las celulas BHK y MDCK alcanzo al menos 106 UFP por ml (Figura 21). Al contrario del mal crecimiento del virus WSN en las celulas CHO, el virus VSVG(HA)GFP(NA) crecio tan bien en estas celulas, como en las otras dos lmeas celulares analizadas (Figura 21). Por otra parte, durante la replicacion en cada una de las lmeas de celulas, las celulas infectadas con el virus VSVG(HA)GFP(NA) expresaron GFP.
Estos resultados indicaron que los segmentos HA(9)VSVG(80) y NA(183)GFP(157)Met(-) se incorporaron de manera eficiente en los viriones de la gripe y que dos genes extranos podfan mantenerse de forma estable en el virus de la gripe A durante el pase repetido.
Discusion
La determinacion de los mecanismos de empaquetamiento del es cntica para la comprension del ciclo de vida del virus de la gripe, asf como para el desarrollo de vectores basados en el virus de la gripe para la expresion de protemas extranas. En este estudio se demostro que eran necesarias secuencias en ambos extremos 3' y 5' de las regiones codificantes en el ARNv de HA para la incorporacion eficiente de este segmento en los viriones. Por otra parte, usando este conocimiento se genero un nuevo virus basado en la gripe que posefa dos segmentos de ARN recombinantes que contienen las secuencias codificantes de G de VSV y de gFp flanqueadas por las secuencias necesarias para la incorporacion en los viriones del ARNv de HA y del ARNv de nA, respectivamente, lo que demuestra la expresion estable de dos genes extranos.
Se han notificado varios enfoques para el desarrollo de vectores de vacuna basados en el virus de la gripe A para la expresion de genes o partes de genes a partir de de agentes infecciosos no relacionados. Se han insertado polipeptidos cortos en los sitios antigenicos de HA, lo que da lugar a respuestas inmunologicas positivas contra los peptidos insertados. Para la expresion de polipeptidos y protemas mas largos, los genes extranos se han insertado en uno de los genes del virus de la gripe, en el que las protemas extranas se expresaron mediante la utilizacion de sitios internos de entrada al ribosoma (IRES) o la proteasa 2A del virus de la enfermedad de la fiebre aftosa. En este documento se ha establecido un nuevo sistema para la expresion de una protema extrana, explotando las senales de incorporacion en los viriones en accion cis en los ARNv de NA y HA. Este sistema permitio que el virus basado en la gripe incorporara mas de 1,5 kb de un gen extrano (por ejemplo, G de VSV), lo que demuestra el potencial de este sistema de vector. Como se ha demostrado la eficacia de vacuna de las VLP de la gripe de replicacion incompetente en ratones, las VLP basadas en la gripe de replicacion incompetente con un segmento de ARN recombinante que contiene un gen de un patogeno no relacionado pueden servir como una vacuna prometedora. Este potencial es especialmente atractivo para la vacunacion contra el VIH, la enfermedad de la fiebre aftosa y otras infecciones, en el que cualquier inversion de virus vivos para vacuna al silvestre es absolutamente inaceptable o en el que la eficacia de las vacunas inactivadas puede ser limitada debido a la induccion limitada de respuestas de inmunidad mucosa y citotoxica de linfocitos T. Por lo tanto, mediante el uso de este enfoque se puede usar un virus de la gripe como un vector de vacuna. Por ejemplo, se puede hacer un virus que contenga una region de codificacion de gp160 del VIH en lugar de HA y una region de codificacion de gag en lugar de NA (Figuras 24 y 25). Por otra parte, si G de VSV reemplaza a hA, M2 ya no es necesaria y, por lo tanto, tres genes virales pueden reemplazarse por genes heterologos. Por ejemplo, HA puede reemplazarse por gp160 del VIH, NA por gag y M2 por nef. El virus de la gripe recombinante resultante se puede usar como vacuna o como un refuerzo para la otra vacuna contra el VIH, por ejemplo, una vacuna de aDn del VIH, para mejorar o inducir inmunidad, incluyendo inmunidad mucosa. Como alternativa, una vacuna puede ser una vacuna multivalente basada en un virus de la gripe recombinante en el que el segmento de codificacion de NA se sustituye por el de otro patogeno, por ejemplo, la glicoprotema D del virus del herpes, cuya vacuna puede dar lugar a una respuesta inmunitaria protectora frente a las infecciones por el virus de la gripe y por el virus del herpes.
Los vectores virales derivados de adenovirus, retrovirus y virus de la viruela introducen eficientemente genes extranos en las celulas diana. Dado que estos virus contienen ADN, o tienen intermedios de la replicacion de ADN que podnan integrarse en el cromosoma huesped, no se puede eliminar el riesgo de resultados adversos. Por el contrario, tal integracion es improbable en los virus de la gripe debido a la falta de una fase de ADN en las celulas infectadas. Ademas, dado que el virus VSVG(HA)GFP(NA) no requiere tripsina para la escision de HA, a diferencia de los virus tfpicos de la gripe, puede presentar un uso mas amplio. Ademas, se puede generar el virus recombinante con tropismo celular deseado mediante la alteracion de una glicoprotema en la superficie del virion. Por lo tanto, el sistema que utiliza las senales que actuan en cis en los segmentos de ARNv para la incorporacion al virion permite el diseno de vectores de virus basados en virus de la gripe recombinantes que pueden liberar multiples genes extranos en las celulas diana.
El ensamblaje y la liberacion de los virus de las celulas epiteliales se polarizan en algunos virus, que se producen de manera selectiva ya sea en la superficie apical o basolateral. Se piensa que la gemacion de virus polarizados desempena un papel en la determinacion de la patogenia de las infecciones virales. El virus de la gripe A produce gemacion apicalmente a partir de las celulas epiteliales infectadas y las protemas HA, NA, y m2 expresadas
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individualmente tambien se dirigen a la superficie apical de las celulas. Por otro lado, el VSV se libera desde la superficie basolateral de las celulas infectadas y la protema G de VSV se transporta a la superficie basolateral. En el presente estudio, un virus VSVG(HA)GFP(NA) recombinante, que posee G de VSV en lugar de las protemas HA y NA, se ha generado con exito. Sin embargo, la protema G de VSV de este virus recombinante careda de los ultimos 13 restos del dominio citoplasmatico debido a una mutacion puntual. Se sabe que la delecion de estos 13 residuos en el dominio citoplasmico produce una protema que se transporta de manera mas eficiente a la superficie apical de la superficie basolateral. Por lo tanto, es probable que la mutacion introducida en la protema G de VSV en el virus VSVG(HA)GFP(NA) estimule su transporte eficiente a la superficie apical, lo que da lugar a una gemacion eficiente del VSVG(HA)GFP(NA).
Las pandemias de gripe generalmente se producen cuando un virus cuyas HA y / o NA son inmunologicamente distintas de las de la cepa circulante anterior aparece tras la reagrupacion de los segmentos del ARN del virus de la gripe. Las secuencias en los extremos 3 'y 5' de las regiones codificantes dentro de los ARNv de HA, NA, M y S son necesarias para su incorporacion eficiente en los viriones. El empaquetamiento de los segmentos del ARNv (mas probablemente como un complejo de ribonucleoprotema viral) esta mediado por las interacciones ARN-ARN que ocurren en trans entre los segmentos de ARN viral. Si es asf, las senales de incorporacion espedficas dentro de cada segmento pueden restringir el reagrupamiento de los segmentos de ARN. Empmcamente, se sabe que los segmentos de ARN viral no se reagrupan al azar. Se piensa que las interacciones funcionales entre las protemas (por ejemplo, la formacion del complejo de la polimerasa, HA-NA y asociaciones funcionales HA-M2 escindibles) se restringen la reagrupacion aleatoria. Ademas de estas restricciones al reagrupamiento a nivel de protemas, puede existir una restriccion similar a nivel de ARN. En este contexto, es interesante observar que, tanto en las pandemias de 1957 como de 1968, el gen PB1, ademas de los genes de HA y / o NA se introdujeron en los virus humanos a partir de virus aviares, lo que sugiere una posible relacion entre los segmentos de ARN de HA y de PB1. La caracterizacion adicional de las regiones cnticas para la incorporacion al virion de otros segmentos de ARN puede proporcionar una clave para entender el reagrupamiento de segmentos de ARN, lo que lleva a la prediccion de la aparicion de nuevas cepas pandemicas del virus de la gripe A.
En resumen, con la informacion sobre las senales de empaquetamiento de ARNv se pueden desarrollar nuevas vacunas contra la gripe y vectores de vacunas basados en la gripe.
Ejemplo 6 (solo para ilustracion)
Como se ilustra en la Figura 26, se puede fabricar una lmea celular que expresa constitutivamente un ARN similar al del virus de la gripe que codifica una protema, por ejemplo, NS2, aunque este ARN carece de una senal de incorporacion. Tambien se puede preparar un virus que bloquea la secuencia de codificacion de NS2 (NS2 KO) tambien (Neumann et al., 2000; Watanabe et al., 2002). Cuando el virus NS2 KO infecta las celulas normales no se producira virus progenie, ya que el virus carece de NS2. Por el contrario, cuando el virus NS2 KO infecta las celulas que expresan un ARN similar al del virus de la gripe que codifica NS2 pero que carece de una senal de incorporacion, NS2 se expresa tras la infeccion viral y se produce progenie del virus NS2 KO. Sin embargo, el ARN similar al del virus de la gripe que codifica NS2 no sera incorporado en el virus NS2 KO porque carece de una senal de incorporacion al virion. Por lo tanto, NS2 KO sigue siendo incompetente para la replicacion en las celulas normales. Este sistema se puede usar para la produccion de celulas productoras de virus incompetentes para la replicacion. Usando este sistema, se pueden producir celulas productoras que expresan protemas virales, cuya toxicidad para las celulas tfpicamente prohibina la generacion de lmeas celulares que las expresan constitutivamente. Por lo tanto, en esta solicitud, el conocimiento de las senales de incorporacion al virion puede emplearse para disenar un sistema que no permita que un segmento espedfico se incorpore en los viriones.
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LISTADO DE SECUENCIAS
<110> Wisconsin Alumni Research Foundation Kawaoka, Yoshihiro <120> Senal para el empaquetamiento de vectores del virus de la gripe
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<130> 27.33.85511
<140> EP 03716017.3 <141>
<150> US 60/356.538 <151>
<160> 10
<170> FastSEQ para Windows version 4.0
<210> 1 <211> 24 <212>ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador espedfico del gen de NA sintetizado <400> 1
tggctcgttt ctctcactat tgcc 24
<210> 2 <211> 26 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador espedfico del gen de NA sintetizado <400> 2
ttatataggc atgagattga tgtccg 26
<210> 3 <211> 37 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador espedfico del gen de HA sintetizado <400> 3
agcaaaagca ggggataatt ctattaacca tgaagac 37
<210> 4 <211> 34 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador espedfico del gen de HA sintetizado <400> 4
agtagaaaca agggtgtttt taattaatgc actc 34
<210> 5 <211>8 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Epftopo FLAG sintetizado <400> 5
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Asp
1
Tyr Lys Asp
Asp Asp Asp Lys 5
<210>6 <211>6 <212>ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Dos codones de terminacion secuenciales sintetizados
<400>6 taatag 6
<210>7 <211> 24 <212>ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Oligonucleotido sintetizado complementario a la secuencia de nucleotidos que codifica el epttopo FLAG <400>7
gactacaagg acgacgatga caag 24
<210>8 <211> 31 <212>ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Sonda oligonucleotidica sintetizada complementaria a la secuencia de la GFP <400>8
atggccgaca agcagaagaa cggcatcaag g 31
<210>9 <211> 29 <212>ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador de PCR sintetizado <400>9
gcggatcctc ccctatggga gcatgatac 29
<210> 10 <211> 29 <212>ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador de PCR sintetizado <400> 10
gctctagaaa ctctgttatc gagaaaatg 29

Claims (26)

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    REIVINDICACIONES
    1. Un vector del virus de la gripe para la expresion y empaquetamiento de ARNv recombinante, en el que el vector comprende:
    secuencias correspondientes a la region no codificante en 3' del ARNv de NA del virus de la gripe y secuencias codificantes de NA que incluyen secuencias de incorporacion de NA en 3', un segmento de acido nucleico heterologo que comprende un marco de lectura abierto heterologo, secuencias codificantes de NA que incluyen secuencias de incorporacion de NA en 5' y la region no codificante en 5' del ARNv de NA.
    en el que las secuencias codificantes de NA que incluyen secuencias de incorporacion de NA en 3' incluyen al menos de 21 nucleotidos hasta 250 nucleotidos correspondientes a los nucleotidos 1 a 21 a 1 a 250 de los nucleotidos codificantes en 5' para NA, y en el que las secuencias codificantes de NA que incluyen secuencias de incorporacion de NA en 5' incluyen al menos de 39 nucleotidos a 250 nucleotidos correspondientes a los 39 nucleotidos mas en 3' a los 250 nucleotidos mas en 3' de los nucleotidos codificantes de NA en 3', y en el que el vector no codifica una NA funcional.
  2. 2. El vector de la reivindicacion 1, en el que las secuencias codificantes de NA que incluyen secuencias de incorporacion de NA en 3' incluyen al menos 90 nucleotidos correspondientes a los nucleotidos 1 a 90 de los nucleotidos codificantes de NA en 5'.
  3. 3. El vector de la reivindicacion 1 o 2, en el que las secuencias codificantes de NA que incluyen secuencias de incorporacion de NA en 3' incluyen al menos 183 nucleotidos correspondientes a los nucleotidos 1 a 183 de los nucleotidos codificantes de NA en 5'.
  4. 4. El vector de la reivindicacion 1 o 2, en el que las secuencias codificantes de NA que incluyen secuencias de incorporacion de NA en 3' incluyen hasta 183 nucleotidos correspondientes a los nucleotidos 1 a 183 de los nucleotidos codificantes de NA en 5', y en el que las secuencias codificantes de NA que incluyen secuencias de incorporacion de NA en 5' incluyen hasta 157 nucleotidos correspondientes a los 157 nucleotidos mas en 3' de los nucleotidos codificantes de NA en 3'.
  5. 5. El vector de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el segmento de acido nucleico heterologo comprende ademas una secuencia interna de entrada al ribosoma.
  6. 6. El vector de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el marco de lectura abierto heterologo comprende secuencias correspondientes a un marco de lectura abierto para un gen marcador.
  7. 7. El vector de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el marco de lectura abierto heterologo comprende secuencias correspondientes a un marco de lectura abierto para una protema o peptido inmunogenico de un patogeno o una protema terapeutica.
  8. 8. El vector de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que las secuencias de incorporacion son de un virus de la gripe de tipo A.
  9. 9. El vector de una cualquiera de las reivindicaciones 1a 4, en el que las secuencias de incorporacion son de un virus de la gripe de tipo B.
  10. 10. El vector de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el marco de lectura abierto heterologo codifica una protema de fusion.
  11. 11. Un virus de la gripe recombinante que comprende un ARNv correspondiente al vector de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
  12. 12. El virus recombinante de la reivindicacion 11, en el que el marco de lectura abierto heterologo comprende secuencias correspondientes a un marco de lectura abierto para un gen marcador.
  13. 13. El virus recombinante de la reivindicacion 11, en el que el marco de lectura abierto heterologo comprende secuencias correspondientes a un marco de lectura abierto para una protema o peptido inmunogenico de un patogeno.
  14. 14. El virus recombinante de la reivindicacion 11, en el que el marco de lectura abierto heterologo codifica una protema HA.
  15. 15. El virus recombinante de la reivindicacion 11, en el que el marco de lectura abierto heterologo comprende secuencias correspondientes a un marco de lectura abierto para una protema transmembrana.
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  16. 16. El virus recombinante de la reivindicacion 11, en el que el marco de lectura abierto heterologo comprende secuencias correspondientes a un marco de lectura abierto para una protema con actividad de fusion con la membrana.
  17. 17. El virus recombinante de la reivindicacion 11, en el que el marco de lectura abierto heterologo comprende secuencias correspondientes a un marco de lectura abierto para una protema de la capside viral.
  18. 18. El virus recombinante de la reivindicacion 11, en el que el marco de lectura abierto heterologo comprende secuencias correspondientes a un marco de lectura abierto para una protema G del virus de la estomatitis vesicular.
  19. 19. El virus recombinante de la reivindicacion 13, en el que el marco de lectura abierto heterologo comprende secuencias correspondientes a un marco de lectura abierto para una protema terapeutica.
  20. 20. El virus recombinante de la reivindicacion 14, en el que la protema HA es una protema HA de tipo B.
  21. 21. Un metodo para expresar un marco de lectura abierto heterologo en una celula, que comprende: infectar una celula con el virus recombinante de la reivindicacion 11 in vitro y detectar o determinar si un producto codificado por el marco de lectura abierto heterologo se expresa en la celula.
  22. 22. El vector de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 o el virus de una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 20 para su uso en terapia.
  23. 23. El virus de cualquiera de las reivindicaciones 13, 15 o 17 para su uso en la prevencion, la inhibicion o el tratamiento de una infeccion por patogenos o cancer.
  24. 24. El vector de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, 8 o 9 para su uso en la prevencion o inhibicion de la infeccion por el virus de la gripe.
  25. 25. El virus de la reivindicacion 11 o la reivindicacion 19 para su uso en la prevencion o el tratamiento de una enfermedad caracterizada por una disminucion de la cantidad o una falta de una protema endogena.
  26. 26. Uso del vector de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en la fabricacion de un medicamento para prevenir la infeccion por el virus de la gripe, o del virus de la reivindicacion 11 en la fabricacion de un medicamento para prevenir o tratar la infeccion por patogenos o el cancer, o una enfermedad caracterizada por una disminucion de la cantidad o una falta de una protema endogena.
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