MXPA04007914A

MXPA04007914A - Senal para empaquetado de vectores de virus de influenza.

Info

Publication number: MXPA04007914A
Application number: MXPA04007914A
Authority: MX
Inventors: Kawaoka Yoshihiro
Original assignee: Wisconsin Alumni Res Found
Priority date: 2002-02-13
Filing date: 2004-08-13
Publication date: 2004-10-15
Also published as: IL211324A0; KR101113432B1; AU2003219745B2; CN103540614B; US20070141699A1; US20090311669A1; HUE027448T2; ES2806412T3; BRPI0307679A2; ES2563402T3; AU2008203186B2; JP2005535288A; US8298805B2; EP1572910A2; AU2003219745A1; CN103540614A; IL163546A0; US7226774B2; AU2008203186A1; HUE050222T2

Abstract

La presente invencion se refiere a una senal de empaquetado (incorporacion), para vectores del virus de influenza, y metodos para usar la senal para transmitir y mantener la influenza viral y acido nucleico extranos en virus y celulas.

Description

SEÑAL PARA EMPAQUETADO DE VECTORES DE VIRUS DE INFLUENZA Antecedentes de la Invención El genoraa de los virus de influenza A y B está compuesto de ocho segmentos de AR de hebra única de polaridad negativa, dos de los cuales codifican las glicoproteínas de envoltura, hemaglutinina (HA) ' y neuraminidasa (NA) . La replicación del virus de influenza se inicia por el enlace de las proteínas HA virales en la superficie del virión a ácido siálico celular que contiene receptores. Después del enlace a los receptores, los viriones se toman en las células hospederas por endocitosis . El ambiente ácido en el endosoma tardío activa los cambios conformacionales de HA, iniciando la fusión entre la envoltura viral y la membrana endosomal, y activa en canal de ion M2 , resultando en el influjo de protones en el interior del virión. La exposición del interior del virión- a pH bajo es completamente para interrumpir las interacciones ácido-lábil entre la proteína MI y complejo de ribonucleoproteína (RNP) , culminando en la liberación de RNP en el citoplasma. La RNP luego se transporta al núcleo, donde el ARNm viral y el genoma viral se sintetizan. El ARNm entra al citoplasma y las proteínas virales se sintetizan. La nucleoproteína (NP) entra al núcleo y encapsida nuevamente el ARNv sintetizado y, conjuntamente con las tres proteínas de subunidad polimerasa REF. : 158110 (PA, PB1, PB2). , forma la RNP . En la presencia de proteínas MI y NS2, la RNP - se exporta del núcleo. Las tres proteínas asociadas a la membrana de plasma (HA, NA y M2) y la RNP interactúan y forman nuevos viriones por gemación. La NA es responsable de la liberación viral de células infectadas removiendo los ácidos siálicos de los glicoconjugados celulares y glicoproteínas virales (Lamb et al., 2000) . Los virus tipo A se dividen en subtipos basados en antigenicidades HA (H1-H15) y NA (N1-N9) . En las células infectadas con dos diferentes virus tipo A, los reclasificadores intratípicos que poseen varias combinaciones de segmentos de genes se producen (Wright et al., 2000) . Sin embargo, los reclasificadores intertípicos entre los virus tipo A y B no se han detectado en la naturaleza, aunque ambos virus son cocirculantes en las poblaciones humanas. Los investigadores han propuesto generar reclasificadores entre los virus tipo A y B en el laboratorio sin éxito (Kaverin et al, 1983; Mikheera et al., 1982; Tobita et al., 1983) . Muster et al. (1991) generó un virus tipo A mutante que contiene un segmento en el cual las regiones no codificantes de un segmento de NA se remplazaron con aquellas de los genes no estructurales (NS) de virus tipo B. Aunque el virus mutante se replicó más lentamente y logró concentraciones inferiores que el virus tipo nativo, la generación de tal virus sugirió que las regiones no codificantes del segmento de NS de tipo B fueron compatibles con los componentes tipo A del virus de influenza al nivel de replicación y transcripción de ARN. En contraste, un segmento de ARN que posee un segmento codificante extraño flanqueado por las regiones no codificantes 3' y 5' de un segmento de ARN viral de influenza A, no fue mantenido de forma estable en los viriones después del paso repetido (Luytjes et al., 1989) . Muster et al. (1991) también describe que el virus mutante fue atenuado en ratones, y que los animales infectados con el virus mutante fueron resistentes a la prueba de inmunidad con el virus tipo nativo. Los que se necesita es un método para identificar secuencias de virus de influenza para la incorporación y/o mantenimiento de secuencia enlazada durante la replicación de virus de influenza. Sumario de la Invención La invención proporciona una molécula de ácido nucleico recombinante aislada (polinucleótido) , por ejemplo, un vector, que comprende secuencias de incorporación (una "señal de empaquetado" o una señal de encapsidacion de ARNv) para el virus de influenza y opcionalmente un segmento de ácido nucleico heterólogo. Generalmente, las secuencias de incorporación están presentes en los aproximadamente 150 a aproximadamente 250 nucleótidos en uno o cada extremo de la región codificante para cada segmento de ARNv de influenza.

En una modalidad, las secuencias de incorporación de virus de influenza comprenden secuencias que corresponden al extremo 3 ' de ARNv de NA que incluye las secuencias correspondientes al N-término de la región codificante de NA, por ejemplo, 37 nucleotidos del extremo 3 ' de ARNv de NA tipo A que incluye 19 nucleotidos de la secuencia no codificante 3' y al menos nucleotidos correspondientes a los primeros 19 nucleotidos codificantes para NA y, opcionalmente, las secuencias de incorporación correspondientes al extremo 5' de ARNv de NA que incluye las secuencias correspondientes al C-término de la región codificante de NA, por ejemplo, 67 nucleotidos del extremo 5' de ARNv de NA tipo A que incluye 28 nucleotidos de la secuencia no codificante 5' y al menos 39 nucleotidos correspondientes a los 39 nucleotidos codificantes 3' de NA. En otra modalidad, las secuencias de incorporación de virus de influenza comprenden secuencias correspondientes al extremo 3 ' de ARNv de NS que incluye las secuencias correspondientes al N-término de la región codificante NS . En todavía otra modalidad, las secuencias de incorporación de virus de influenza comprenden secuencias correspondientes al extremo 5 ' de ARNv de HA que incluye las secuencias correspondientes al C-término de la región codificante de HA, por ejemplo, 135 nucleotidos del extremo 5' de ARNv de HA tipo A que incluye 45 nucleotidos de la secuencia no codificante 5' y al menos 80 nucleotidos correspondientes a los 80 nucleótidos codificantes 3' de HA y, opcionalmente, las secuencias de incorporación correspondientes al extremo 3' de ARNv de HA, que incluye las secuencias correspondientes al N-término de la región codificante de HA, por ejemplo, 36 nucleótidos del extremo 3' de ARNv de HA tipo A que incluye 33 nucleótidos de la secuencia no codificante 3 ' y al menos 3 nucleótidos correspondientes a los primeros 3 nucleótidos codificante de HA. En una modalidad adicional, las secuencias de incorporación de virus de influenza comprenden las secuencias correspondientes al extremo 5' de ARNv de PB2 que incluye las secuencias correspondientes al C-término de la región codificante de PB2. En otra modalidad, las secuencias de incorporación de virus de influenza comprenden secuencias correspondientes al extremo 3' de ARNv de M que incluye las secuencias correspondientes al N-término de la región codificante de M, por ejemplo, 247 nucleótidos del extremo 3' de ARNv de M tipo A que incluye 26 nucleótidos de la secuencia no codificante 3' y 221 nucleótidos de la secuencia correspondiente al N-término de la región codificante de M, y las secuencias correspondientes al extremo 5' de ARNv de M que incluye las secuencias de incorporación correspondientes al C-término de la región codificante de M, por ejemplo, 242 nucleótidos del extremo 5' de ARNv de M tipo A que incluye 23 nucleótidos de la secuencia no codificante 3' y 219 nucleótidos de la secuencia correspondiente a los últimos 219 nucleótidos para el C-término de la región codificante de M. En otra modalidad, las secuencias de incorporación de virus de influenza comprenden secuencias correspondientes al extremo 5' de A Nv de NS que incluye las secuencias correspondientes al N-término de la región codificante NS, por ejemplo, las secuencias que incluyen la secuencia no codificante 3' y al menos los primeros 30 nucleótidos correspondientes al N-término de la región codificante de NS, y las secuencias correspondientes al extremo 5 ' de ARNv de NS que incluye las secuencias de incorporación correspondientes al C-término de la región codificante de NS, por ejemplo, las secuencias que incluyen la secuencia no codificante 5' y al menos los últimos 30 nucleótidos de la secuencia correspondiente al C-término de la región codificante de NS . En una modalidad, las secuencias de incorporación de virus de influenza comprenden lás secuencias correspondientes al extremo 5' de ARNv de PBl que incluye las secuencias correspondientes al N-término de la región codificante de PBl y las secuencias correspondientes al extremo 5' de ARNv de PBl que incluye las secuencias de incorporación correspondientes al C-término de la región codificante de PBl. En todavía otra modalidad, las secuencias de incorporación de virus de influenza comprenden las secuencias correspondientes al extremo 5 ' de ARNv de PA que incluye las secuencias correspondientes al N-término de la región codificante dé PA y las secuencias correspondientes al extremo 5' de ARNv de PA que incluye las secuencias de incorporación correspondientes al C-término de la región codificante de PA. Las "secuencias de incorporación" de virus de influenza, como se usa en la presente, son secuencias las cuales, cuanto están presentes en el ARNv con regiones no codificantes 3' y 5' (homologas) correspondientes, resultan en la incorporación de una molécula de ácido nucleico que comprende aquellas secuencias en los viriones y el mantenimiento de esta molécula en viriones durante el paso repetido . Como se describe posteriormente, las secuencias de incorporación de NA se identificaron en virus mutantes con un segmento de NA truncado usando genética inversa a base de plásmido. Las secuencias de incorporación de NA estuvieron en una región la cual incluye el extremo 3 ' de ARNv de NA, que se extendió en una porción de la región codificante de NA. Por consiguiente, esta región es útil para el empaquetado y mantenimiento de ARN de NA tipo nativo así como los ARN de NA mutantes, por ejemplo, ARN con supresiones y/o inserciones internas incluyendo ARN recombinantes para la expresión de estructuras de lectura abiertas de interés, por ejemplo, segmento de ácido nucleico heterólogo que comprende una estructura de lectura abierta de interés . Como también se describe en la presente, para ganar perspicacia en la incompatibilidad intertípica entre los virus de influenza tipo A y B, la genética inversa se empleó para generar un reclasificador que contiene un segmento de HA tipo B intacto en un antecedente de virus tipo A. Sin embargo, ningún virus se produjo, además del hecho que el segmento de HA tipo B se transcribió por el complejo de polimerasa tipo A. Aunque un virus tipo A con un segmento de HA quimérica compuesto de la secuencia codificante completa de HA tipo B flanqueada por la secuencia no codificante de HA tipo A fue viable, este se replicó solamente marginalmente . Una serie de virus a base de tipo A se generó conteniendo HA quiméricas que poseen la región no codificante tipo A conjuntamente ya sea con la secuencia que no codifica el péptido de señal o región de transmembrana/citoplásmica de virus tipo A, o ambas, y el resto de la región derivada de HA tipo B. Todos estos virus crecieron a más de 10s dosis infecciosa de cultivo de tejido50/ml de cultivo celular, sin embargo, los virus con más de las secuencias de HA tipo A se replicaron mejor, sugiriendo el papel de la interacción proteína-proteína o la incorporación de segmento de HA incrementada en los viriones en crecimiento viral eficiente . Todos estos virus quiméricos A/B fueron atenuados en ratones cuando se compararon con los virus tipo A o B nativos. Además, todos los animales inmunizados intranasalmente con los virus quiméricos sobrevivieron en la prueba de inmunidad con una dosis letal de virus tipo B tipo nativo, demostrando una propuesta prometedora para el diseño de una nueva vacuna de virus vivos . Por consiguiente, cuando una molécula de ácido nucleico aislada de la invención que comprende secuencias de incorporación para un segmento de virus de influenza particular, las secuencias no codificantes 3' y 5' homologas (regiones) y un segmento de ácido nucleico heterologo, se introduce a una célula en un vector para la producción de ARNv y en la presencia de proteínas virales y/o vectores que codifican la proteína viral para una o más de PA, PB1, PB2 , NP, HA, NA, M, por ejemplo, MI y/o M2 , y/o NS, y ARNv o vectores para la producción de ARNv para una o más de PA, PB1, PB2, NP, HA, NA, M, por ejemplo, MI y M2 , y/o NS, se produce el virus recombinante . El virus recombinante luego se puede usar para infectar una célula. Preferiblemente, el ARNv correspondiente a una molécula de ácido nucleico de la invención se incorpora en viriones a una eficiencia que es al menos 10%, más preferiblemente al menos 30%, y aún más preferiblemente al menos 50% o más, que de un ARNv tipo nativo correspondiente. En una modalidad, la molécula de ácido nucleico incluye secuencias correspondientes a un ARNv tipo nativo y un segmento de ácido nucleico heterologo, en donde el segmento de ácido nucleico heterologo se introduce a las secuencias en el ARNv correspondiente a la región codificante para este ARNv, la inserción preferiblemente no interrumpe sustancialmente las secuencias de incorporación. Por ejemplo, el segmento de ácido nucleico heterólogo se introduce después de una secuencia correspondiente a los primeros 300 nucleotidos de la región codificante de NA. En otra modalidad, las secuencias de incorporación de NA 3' corresponden a los nucleotidos 1 a 183, nucleotidos 1 a 90, nucleotidos 1 a 45, nucleotidos 1 a 21, nucleotidos 1 a 19 o cualquier numero entero entre 19 y 183, de la región codificante de NA N-terminal, y pueden incluir una mutación en el codón de iniciación de NA. En otra modalidad, las secuencias de incorporación de NA 5' corresponden a las secuencias en la región codificante C-terminal de Na, las secuencias correspondientes a la mayoría de los 39, 78, ó 157, o cualquier número entero entre 1 y 157, nucleotidos 3' para la región codificante de NA C-terminal. En otra modalidad, las secuencias de incorporación de HA 5' corresponden a las secuencias en la región codificante C-terminal de HA, las secuencias correspondientes a la mayoría de los 75, 80, 268, 291, ó 518, o cualquier numero entero entre 1 y 518, nucleotidos 3' de la región codificante de HA C-terminal. Las secuencias de incorporación de HA 3' corresponden a los nucleotidos 1 a 3, 1 a 6, 1 a 9, l a 15, 1 a 216, 1 a 468, o cualquier numero entero entre 1 y 468, de la región codificante de HA N-terminal. En una modalidad, las secuencias de. incorporación de PB1 3 ' corresponden a los nucleótidos 1 a 250, nucleótidos 1 a 200, nucleótidos 1 a 150, o cualquier numero entero entre 1 y 250, de la región codificante de PB1 N-terminal. En una modalidad, las secuencias de incorporación de PB1 5' corresponden a la mayoría de los nucleótidos 3', por ejemplo, los 1 a 250 nucleótidos, 1 a 200 nucleótidos, nucleótidos 1 a 150 3', o cualquier numero entero entre 1 y 250, de la región codificante de PB1 C-terminal. En una modalidad, las secuencias de incorporación de PA 3' corresponden a los nucleótidos 1 a 250, nucleótidos 1 a 200, nucleótidos 1 a 150, o cualquier numero entero entre 1 y 250, de la región codificante de PA N-terminal. En una modalidad, las secuencias de incorporación de PA 5' corresponden a la mayoría de los nucleótidos 3', por ejemplo, los 1 a 250 nucleótidos, 1 a 220 nucleótidos, nucleótidos 1 a 150 3', o cualquier numero entero entre 1 y 250, de la región codificante de PA C-terminal. En otra modalidad, las secuencias de incorporación de 3 ' corresponden a los nucleótidos 1 a 250, nucleótidos 1 a 242, nucleótidos 1 a 240, o cualquier numero entero entre 1 y 250, de la región codificante de N-terminal, y pueden incluir una mutación en el codón de iniciación de M. En otra modalidad, las secuencias de incorporación de M 5' corresponden a las secuencias en la región codificante C-terminal de M, las secuencias correspondientes a la mayoría de los 50, 100, ó 220, o cualquier numero entero entre 1 y 250, nucleótidos 3' para la región codificante de M C-terminal. En otra modalidad, las secuencias de incorporación de NS 3' corresponden a los nucleótidos 1 a 250, nucleótidos 1 a 200, nucleótidos 1 a 150, nucleótidos 1 a 30, nucleótidos 1 a 20 o cualquier numero entero entre 1 y 250, de la región codificante de NS N-terminal, y pueden incluir una mutación en el codón de iniciación de NS . En otra modalidad, las secuencias de incorporación de NS 5' corresponden a las secuencias en la región codificante C-terminal de NS, las secuencias correspondientes a la mayoría de los 10, 30, 150, 200 ó 250, o cualquier numero entero entre 1 y 250, nucleótidos 3' para la región codificante de NS C-terminal. Por consiguiente, la invención proporciona vectores de virus de influenza los cuales incluyen secuencias correspondientes a las regiones no codificantes 3' y 5-' de un ARNv particular, las secuencias de incorporación del ARNv correspondiente, y un segmento de ácido nucleico heterólogo. Por consiguiente, en una modalidad, el vector incluye la región no codificante 3' de ARNv de NA, secuencias de incorporación de ARNv de NA 3' ó 5', y opcionalmente ambas secuencias de incorporación de NA 3' y 5', un segmento de ácido nucleico heterólogo, y la región no codificante 5' de ARNv de NA. En otra modalidad, el vector incluye la región no codificante 3 ' de ARNv de HA, secuencias de incorporación de ARNv de HA 5' 6 3' o ambas secuencias de incorporación de HA 5' y 3', un segmento de ácido nucleico heterologo, y la región no codificante 5' de ARNv de HA. En otra modalidad, el vector incluye la región no codificante 3' de ARNv de NS, secuencias de incorporación de NS, un segmento de ácido nucleico heterologo, y la región no codificante 5' de ARNv de NS . En otra modalidad, el vector incluye la región no codificante 3' de ARNv de , secuencias de incorporación de M 5' ó 3' o ambas secuencias de incorporación de M 5' y 3', un segmento de ácido nucleico heterologo, y la región no codificante 5' de ARNv de . En todavía otra modalidad, el vector incluye la región no codificante 3 ' de ARNv de PB2 , un segmento de ácido nucleico heterologo, secuencias de incorporación de PB2 , y la región no codificante 5' de ARNv de PB2. Cuando dos secuencias de incorporación se emplean en un vector, las mismas preferiblemente se separan por el segmento de ácido nucleico heterologo. Cada vector se puede emplear para preparar el ARNv para la introducción a una célula, o para expresar el ARNv en una célula, en la cual otros ARNv de virus de influenza y proteína necesarias para la · producción de virus, están presentes. En una modalidad, el segmento de ácido nucleico heterologo comprende secuencias correspondientes a una estructura de lectura abierta para un gen marcador. En otra modalidad, el segmento de ácido nucleico heterólogo comprende secuencias correspondientes a una estructura de lectura abierta para un gen terapéutico. En todavía una modalidad adicional, el segmento de ácido nucleico heterólogo comprende las secuencias correspondientes a una estructura de lectura abierta para una proteína o péptido inmunogénico de un patógeno o una célula de tumor, por ejemplo, uno útil para inducir una respuesta inmuno protectora. Por ejemplo, el segmento de ácido nucleico heterólogo puede codificar un epítope inmunogénico útil en la terapia de cáncer o una vacuna. El vector que comprende el segmento de ácido nucleico heterólogo se puede preparar de modo que la transcripción del AR v de vector resulta en el ARNm que codifica una proteína de fusión con una proteína de influenza tal como NA. Por consiguiente, se prevee que el segmento de ácido nucleico heterólogo se puede fusionar con las secuencias de incorporación virales para codificar una proteína de fusión, por ejemplo, una fusión con el residuo 21 N-terminal de NA. La proteína de fusión puede comprender secuencias de dos diferentes proteínas de virus de influenza que incluyen secuencias de dos diferentes proteínas de NA o HA. En otra modalidad, el segmento de ácido nucleico heterólogo puede comprender secuencias correspondientes a un IRES enlazado 5' a una estructura de lectura abierta. Para preparar virus recombinante usando genética inversa a base de plásmido con una pluralidad de vectores de virus de influenza, el ADN de virus de influenza en un vector puede estar en la orientación de sentido o antisentido con relación al promotor. Por consiguiente, un vector puede codificar una proteína de virus de influenza (sentido) , o AR v (antisentido) de un virus de influenza A, B, o C, cepa o aislado, o un virus de influenza recombinante (véase Capítulos 45 y 46 de Fields Virology (Fields et al. (eds.), Lippincott-Raven Publ . , Philadelphia, PA (1996), la cual se incorpora específicamente para referencia en la presente) . Cualquier promotor se puede emplear para expresar una proteína viral y el vector resultante incluye un promotor operablemente enlazado a un ADN para una proteína de virus de influenza particular. Los promotores preferidos para los vectores que codifican el ARNv incluyen, pero no se limitan a, un promotor de polimerasa I de ARN, un promotor de polimerasa II de ARN, un promotor de polimerasa III de ARN, un promotor T7, y un promotor T3. En una modalidad, el promotor de polimerasa I de ARN es un promotor de polimerasa I de ARN humano. Las secuencias de terminación de transcripción preferidas para los vectores que codifican el ARNv incluyen, pero no se limitan a, una secuencia de terminación de transcripción de polimerasa I de ARN, una secuencia de terminación de transcripción de polimerasa II de ARN, o una secuencia de terminación de transcripción de polimerasa III de ARN, o una ribozima. Por consiguiente, un vector para ARNv incluye un promotor operablemente enlazado a un ADNc para una proteína de virus de influenza en la orientación antisentido con relación al promotor, el cual es operablemente enlazado a una secuencia de terminación de transcripción. Para producir virus recombinante con un vector de la invención, ciertos vectores de ARNv tipo nativo se pueden omitir y ciertos vectores que codifican la proteína viral tipo nativo se pueden reemplazar. Por ejemplo, para un vector de ARNv que comprende secuencias no codificantes 3' y 5' de HA, secuencias de incorporación de HA 5' y un segmento de ácido nucleico heterólogo correspondiente a una secuencia que codifica la proteína de virus de no influenza, por ejemplo, secuencia que codifica la proteína VSV G, se puede omitir el vector de ARNv tipo nativo. Los vectores de la invención se pueden introducir a una célula consecutivamente o simultáneamente. También se proporciona una composición que comprende una pluralidad de los vectores mencionados anteriormente, una célula hospedera en contacto con uno o más de los vectores, virus preparados por el método, y una célula infectada con el virus . Una pluralidad de los vectores de la invención se puede enlazar físicamente o cada vector puede estar presente en un plásmido individual u otro, por ejemplo, vehículo de suministro de ácido nucleico lineal.

Las células hospederas aumentadas con las moléculas de ADN recombinante como se describió anteriormente son útiles para preparar virus de influenza defectivo de replicación, infeccioso. Por ejemplo, una célula hospedera establemente transformada con las moléculas de ADN recombinante que codifican la HA, NA, MI, M2 y NS2 se puede poner en contacto con una pluralidad de vectores, es decir, vectores los cuales expresan el ARNv que comprende PA, ARNv que comprende NP, ARNv que comprende PBl, ARNv que comprende PB2, y opcionalmente, ARNv que comprende un gen de interés; y vectores los cuales codifican la PA, PBl, PB2 , y NP. Los métodos de producción de virus descritos en la presente, los cuales no requieren infección de virus auxiliar, son útiles en los estudios de mutagénesis viral, y en la producción de vacunas (por ejemplo, para SIDA, influenza, hepatitis B, hepatitis C, rinovirus, filovirus, malaria, herpes y fiebre aftosa) y vectores de terapia de genes (por ejemplo, para cáncer, SIDA, adenosina desaminasa, distrofia muscular, deficiencia de ornitina transcarbamilasa y tumores de sistema nervioso central). Por consiguiente, se proporciona un virus recombinante para el uso en terapia médica (por ejemplo, para una terapia de genes o vacuna) . Por ejemplo, la invención proporciona un método para inmunizar un individuo contra un patógeno, por ejemplo, una bacteria, virus, o parásito, o un tumor maligno. El método comprende administrar al individuo una cantidad de al menos un virus aislado de la invención, opcionalmente en combinación con un adyuvante, efectiva para inmunizar al individuo. El virus comprende ARNv que comprende un polipéptido codificado por el patógeno o un polipéptido especifico de tumor. También se proporciona un método para aumentar o incrementar la expresión de una proteína endógena en un mamífero que tiene un signo o enfermedad caracterizada por una cantidad disminuida o una carencia de la proteína endógena. El método comprende administrar al mamífero una cantidad de un virus recombinante de la invención, efectiva para aumentar o incrementar la cantidad de la proteína endógena en el mamífero. Preferiblemente, el mamífero es un humano . Adicionalmente , se proporciona un método para inhibir la replicacion y/o infección de virus de influenza. El método comprende poner en contacto una célula con una composición que comprende una molécula de ácido nucleico aislada que comprende secuencias de incorporación de virus de influenza para NA, M, HA, NS, NP, PB1, PB2, PA, o cualquier combinación ' de tales moléculas, en una cantidad efectiva para inhibir la replicacion y/o infección de virus de influenza. La célula puede ser una célula no infectada o una la cual está infectada con el virus de influenza. Las secuencias de incorporación pueden ser específicas para uno o más tipos de NA y HA. En una modalidad, la célula se pone en contacto adicionalmente con un inhibidor de canal M2 o un inhibidor de neuraminidasa . También se proporciona un método para identificar un agente el cual específicamente inhibe o previene la incorporación de ARN de virus de influenza en viriones. El método comprende poner en contacto una célula infectada con el virus de influenza con un agente; y detectar o determinar si el agente específicamente inhibe o previene la incorporación del ARN de virus de influenza, tal como ARNv de NA o ARNv de NA recombinante, en viriones. También se proporcionan los agentes- identificados por el método, y usos de los mismos, por ejemplo, para inhibir o prevenir la replicación de virus de influenza. Breve Descripción de las Figuras Figuras 1A-1B. Enlace de líneas celulares resistentes a lectina. Para cada línea celular, las células ¦ se incubaron con lectinas Maakia amurensis (???) o Sambucus nigra (SNA) etiquetadas con digoxigenina , seguido por anticuerpo de antidigoxigenina etiquetado con isotiocianato de fluoresceína, y luego se analizaron por CCFA. Ambas líneas, enlace de lectina MAA; líneas estrechas, enlace de la lectina SNA; perfiles sombreados, control negativo (lectina no agregada) .

Figura 2. Las estructuras de los genes de NA de los mutantes AL3 (MaKS) -13 y K4 ( aKS) -13. (A) El AL3 (MaKS) -13 contiene una supresión de 936 nucleótidos (de bases 220 a 1253) que remueve una porción larga de la secuencia de codificación de genes de NA. Esta mutación también produce un codón de terminación TAG en las dos bases de estructura más allá de la supresión, de modo que los genes codifican solamente un péptido de 66 aminoácidos, correspondiente a la cola citoplásmica, región de transmembrana, tronco, y una porción de la cabeza de NA. (B) El gen de NA de K4 (MaKS) -13 contiene una supresión de 1,066 nucleótidos (de bases 130 a 1193) que remueve una porción larga de la secuencia de codificación de genes de NA. Esta mutación produce un codón de terminación TAG en las cuatro bases de estructura más allá de la supresión, de modo que los genes codifican solamente un péptido de 38 aminoácidos, correspondiente a la cola citoplásmica y región de transmembrana de los genes de NA. Figura 3. Actividad de sialidasa de los virus AM2AL3 y K4 parentales y los mutantes AL3 (MaKS) -13 y K4 (MaKS) -13. Para cada muestra, el virus (5 x 102 PFU) se incubó por duplicado por 1 hora a 37°C en la presencia de un sustrato de sialidasa fluorogénica (ácido 4-metilumbeliferil-a-?-acetilneuramínico) . La fluorescencia de 4-metilumbeliferona liberada se determinó con un fluorómetro (Labsystems Fluoroskan II) con excitación a 360 nm y emisión a 460 nm. Figura 4A. Esquema de vectores de NAFLAG y tipo nativo . Figura 4B . Esquema de método para producció de virus NAFLAG. Figura 4C. Inmunomanchado de células RCMD infectadas con virus NAFLAGWT o virus NA(-). Las células se mancharon con anticuerpo monoclonal anti-FLAG (Ac ) M2 o anticuerpo policlonal anti-WSN. Figura 5. Esquema de análisis de competición para un virus de influenza de segmento 7 recombinante y virus NAFLAG . Figura 6A. Esquema de vectores de NAFLAG y NAFLAGM (- ) ("-ATG") . Figura 5B . Inmunomanchado de células RCMD infectadas con virus NAFLAGM ( - ) . Las células se mancharon con anticuerpo monoclonal anti-FLAG M2 o anticuerpo policlonal anti-WSN. Figura 7A. Análisis de hibridación in situ de células infectadas con NAFLAG y NAFLAGM (-) para secuencia de FLAG. Figura 7B. Eficiencia de replicación de virus NAFLAGWT o virus NAFLAGM (- ) . Figura 8A. Esquema de virus de supresión de NA. Figura 8B . Proporción de empaquetado de virus de supresión de NA. Figura 9. Concentración de virus extra para virus de influenza con 6 , 7 u 8 segmentos . Figura 10. Esquema que muestra las señales de incorporación para segmentos virales de influenza (punteados) . Figura 11A. Tomografí de microscopio electrónico de viriones de influenza. Figura 11B-F. Imágenes de color de varillas encontradas por tomografía de microscopio electrónico de un virión de influenza. Figura 12A. Segmentos virales para un virus de influenza tipo A y un virus tipo A cuya secuencia de codificación de HA se reemplaza con HA tipo B. Figura 12B Viriones para un virus de influenza tipo A y un virus tipo A cuya secuencia de codificación de HA se reemplaza con HA tipo B. Figura 13. Diagrama de constructos de HA quiméricos A/B. LOS constructos de HA quiméricos se produjeron entre virus de HA A/WSN tipo nativo (pPolI- SN-HA) y virus de HA B/Lee tipo nativo (pPolI-B-HA) en un plásmido a base de pPolI (pHH21) como se describe en Neumann et al. (1999) . Figura 14. Expresión de HA tipo B por virus quiméricos de HA A/B. Las células RC D infectadas con cada virus se fijaron 24 horas post-infección y se inmunomancharon con anticuerpos anti-A/HA, anti-B/HA, o anti-A/NP. Figura 15. Propiedades de crecimiento de virus quiméricos de HA A/B. Las células RC D se infectaron con cada virus a un MOI de 0.01 TCID50 y se verificaron para el crecimiento de virus . Se muestra uno de dos experimentos independientes con resultados similares. Figuras 16A-16B. Respuesta de anticuerpo a virus tipo B en ratones inoculados con virus quiméricos de HA A/B. Figura 16A Ratones (3 ratones/grupo) se inocularon intranasalmente con cada virus (103TCID50) . Tres semanas post-inoculación, lavados nasales/traqueales y muestras de suero se tomaron de ratones y se probaron para anticuerpos IgC (suero) o IgA (lavado nasal/traqueal) específico de virus anti-B en un ensayo de ELISA. Figura 16B Las concentraciones de HI en muestras de suero también se probaron. Cada barra indica ratón individual infectado con el virus quimérico. Figura 17. Diagrama esquemático de ARNv de HA mutantes y sus eficiencias de incorporación de virión. Todos los ARNv de HA mutantes se muestran en orientación de sentido negativo. Cada mutante contiene la estructura de lectura abierta GFP (insertada en la estructura con la estructura de lectura abierta de HA) flanqueada por un codón de terminación, 33 nucleótidos de la región no codificante 3' y 45 nucleótidos de la región no codificante 5' de ARNv de HA (barras negras) . Los mutantes se diseñaron de acuerdo con el numero de nucleótidos derivado de las regiones de codificación de HA. Las regiones de codificación de HA se muestran como barras grises. La línea interrumpida horizontal indica una supresión. Las longitudes de las regiones no son a escala. La eficiencia de incorporación de ARNv de HA mutante en VLP se determinó dividiendo el numero de células que expresan GFP con aquellas células que expresan NP en las células infectadas con VLP después de fijar las células 16 horas post-infección. Figura 18. Niveles de ARNv en células 293T transfectadas con plásmidos que expresan ARNv de HA mutantes. Las células 293T se transfectaron con pPolIH (0) GFP (0) o pPolIHA (9) GFP (80) y plásmidos que expresan PA, PB1, PB2 , y NP. Figura 19. Las células infectadas con virus VSVG (HA) GFP (NA) expresan VSV G y GFP. Las células RCMD se infectaron con virus VSVG (HA) GFP (NA) o virus SN y se cubrieron con 1.0% de agarosa. Las células infectadas se incubaron por 48 horas a 37°C, y las plaquetas se fotografiaron (A, B) bajo luz normal y (C, D) bajo luz fluorescente conjuntamente con luz normal limitada para identificar las plaquetas. Las células se fijaron y permearon con 0.1% Triton-X100 en 3% de solución de formaldehído. Las proteínas virales se detectaron por inmunomanchado con anticuerpo monoclonal anti-VSV G (E, F) , anticuerpo monoclonal anti-HA (G, H) , o anticuerpo monoclonal anti-NP (I, J) como el anticuerpo primario y anticuerpo secundario biotinilado, usando el kit Vectastain ABC (Vector, Burlingame , CA) . Figura 20. Incorporación de la proteína VSV G en virus VSVG (HA) GFP (NA) . Los virus WNS , VSVG (HA) GFP (NA) , y VSV concentrados fuero sometidos a lisis en un amortiguador de muestra. Las proteínas virales se trataron con 2-mercaptoetanol , se separaron por 10% de SDS-PAGE, se transfirieron a una membrana PVDF, y se incubaron con anticuerpo monoclonal anti-VSV G o anticuerpo monoclonal anti-WSN-HA. Las masas moleculares de las proteínas marcadoras se muestran a la izquierda. Figuras 21A-21C. Curvas de crecimiento de virus VSVG (HA) GFP (NA) en células BHK, CHO, y RCMD. Las células BHK (A) , CHO (B) , y RCMD (C) se infectaron con virus a un MOI de 0.001. En los tiempos indicados después de la infección, la concentración de virus en el sobrenadante se determinó usando células RCMD. Los valores son promedios de experimentos duplicados. Figura 22. Diagrama esquemático de ARNv de NS mutantes y sus eficiencias de incorporación. Figura 23. Diagrama esquemático de ARNv de M mutantes y sus eficiencias de incorporación. Figura 24. Esquema de A) segmentos virales y B) viriones que expresan dos proteínas heterólogas . Figura 25. Esquema de virus de influenza con segmentos virales para dos proteínas heterólogas, VIH gp 160 Y gag- Figuras 26A-26B. Esquema de producción de virus incompetente de replicación usando Cre/lox. Descripción Detallada de la Invención Como se usa en la presente, los términos "aislada y/o purificada" se refiere a la preparación, aislamiento y/o purificación in vitro de una célula hospedera o virus de la invención, de modo que no se asocia con sustancias in vivo, o está sustancialmente purificada de sustancias in vitro. Como se usa en la presente, "sustancialmente pura" significa una especie objeto que es la especie predominante presente (es decir, en una base molar que es más abundante que cualquier otra especie individual en la composición) , y preferiblemente una fracción sustancialmente purificada es una composición en donde la especie objeto comprende al menos aproximadamente 50 por ciento (en una base molar) de todas las especies macromoleculares presentes. Generalmente, una composición sustancialmente pura comprenderá más de aproximadamente 50 por ciento, más preferiblemente más de aproximadamente 80 por ciento de todas las especies macromoleculares presentes en la composición, y aún más preferiblemente más de aproximadamente 85%, aproximadamente 90%, aproximadamente 95%, y aproximadamente 99. Más preferiblemente, la especie objeto se purifica a homogeneidad sustancial (las especies contaminantes no se pueden detectar en la composición por métodos de detección convencionales) . Como se usa en la presente, el término "ácido nucleico recombinante" o "segmento o secuencia de ADN recombinante" se refiere a un ácido nucleico, por ejemplo, a ADN, que se ha derivado o aislado de una fuente, que puede ser posteriormente sustancialmente alterada in vitro, de modo que su secuencia no se origine naturalmente, o corresponda a secuencias originadas naturalmente que no se posicionen cuando las mismas podrían ser posicionadas en el genoma nativo. Un ejemplo de ADN "derivado" de una fuente, podría ser una secuencia de ADN que se identifica como un fragmento útil, o transcrito inverso de ARN, y que luego se sintetiza esencialmente en forma pura. Un ejemplo de tal ADN "aislado" de una fuente podría ser una secuencia de ADN útil que se escinde o remueve de la fuente por medios químicos, por ejemplo, por el uso de endonucleasas de restricción, de modo que se puede manipular adicionalmente, por ejemplo, amplificar, para el uso en la invención, por la metodología de ingeniería genética. El virus recombinante se prepara a partir de ácido nucleico recombinante . Como se usa en la presente, un segmento, secuencia o molécula de ácido nucleico "heteróloga" significa que el segmento, secuencia o molécula se deriva de una fuente que es diferente que un segmento, secuencia o molécula de ácido nucleico de referencia. Por ejemplo, un segmento de virus de influenza tipo A o una porción del mismo es heterólogo al correspondiente segmento de virus de influenza tipo B o una porción del mismo, una segmento viral de NA de un serotipo o cepa de influenza es heterólogo a un segmento viral de NA de un serotipo o cepa diferente, y una molécula de ácido nucleico de virus de no influenza, por ejemplo, VIH gp 160, es heteróloga a una molécula de ácido nucleico de virus de influenza. En contraste, un segmento de ácido nucleico homólogo se deriva de la misma fuente como un segmento de ácido nucleico de referencia. Por consiguiente, la molécula de ácido nucleico de la invención es una molécula quimérica la cual incluye una región no codificante 3 ' , al menos una secuencia de incorporación y una secuencia no codificante 5' las cuales son homologas entre si . La frase "replicación eficiente" en el contexto de la presente invención, se define como producir concentraciones de alta infectividad en sistemas de cultivo de tejido in vitro, tales como 104-1010 PFU/ml, y preferiblemente 105-109 PFU/ml. La selección de los virus de influenza para el uso en producción de vacuna o xeplicación, se puede ensayar usando cualquier ensayo conocido y/o adecuado, como se conoce en la técnica. Tales ensayos (solos o en alguna combinación) que son adecuados para la selección incluyen, pero no se limitan a, replicación viral, medición cuantitativa y/o cualitativa de inactivación (por ejemplo, por antisueros) , transcripción, replicación, traducción, incorporación de virión, virulencia, actividad de HA o NA, rendimiento viral, y/o morfogénesis, usando tales métodos como genética inversa, reclasificación, complementación, y/o infección. Por ejemplo, los ensayos de replicación de virus se pueden usar para seleccionar la atenuación o inactivación de los virus. Véase, por ejemplo, rug, R. M. , ed. , The Influenza Viruses, Plenum Press, New York, (1989) . "Ácido siálico" se refiere a una familia de amino azúcares que contienen 9 o más átomos de carbono, por ejemplo, derivados N- y O-sustituidos de ácido neuramínico. Como se usa en la presente, "recombinación de sitio específico" se propone que incluya los siguientes tres casos : 1) supresión de un segmento de ADN objetivo flanqueado por sitios o secuencias de recombinación de sitio específico, por ejemplo, sitios lox; 2) inversión de la secuencia de nucleótido de un segmento de ADN objetivo flanqueado por sitios o secuencias de recombinación de sitio específico, por ejemplo, sitios lox; y 3) intercambio reciproco de segmentos de ADN objetivo próximos a sitios o secuencias de recombinación de sitio específico, por ejemplo, sitios lox localizados en diferentes moléculas de ADN. Los sistemas de recombinasa de sitio específico incluyen, pero no están limitados a, el sistema Cre/lox de bacteriófago Pl (Patente Norteamericana No. 5,658,772), el sistema FLP/FRT de levadura (Golic and Lindquist, 1989) , la recombinasa Gin de Mu (Maeser et al., 1991), la recombinasa Pin de E. coli (Enomoto et al., 1983), y el sistema R/RS del plásmido pSRI (Araki et al., 1992) . Líneas celulares y Virus de Influenza Que Pueden Ser Usados en la Presente Invención De acuerdo con la presente invención, cualquier célula que soporta replicación eficiente de virus de influenza puede ser empleada en la invención, incluyendo células mutantes las cuales expresan niveles reducidos o disminuidos de uno o más ácidos siálicos los cuales son receptores para virus de influenza. Los virus obtenidos por los métodos se pueden hacer en un virus reclasificador. Preferiblemente, las líneas celulares continuas, certificadas o certificables por la WHO (World Health Organization) . Los requerimientos para certificar tales líneas celulares incluyen caracterización con respecto a por lo menos uno de genealogía, características de crecimiento, marcadores inmunológicos , tumorigenicidad de susceptibilidad del virus y condiciones de almacenamiento, así como también por pruebas en animales, huevos, y cultivo celular. Tal caracterización se usa para confirmar que las células estén libres de agentes adventicios detectables. En algunos países, también se requiere cariologia. Además, la tumorigenicidad se prueba preferiblemente en células que están al mismo nivel de paso como aquellas usadas para la producción de vacuna. El virus se purifica preferiblemente por un proceso que se ha mostrado que proporciona resultados consistentes, antes de que se inactiven o atenúen para producción de vacuna (véase, por ejemplo, World Health Organization, 1982) . Es preferible establecer una caracterización completa de las lineas celulares a ser usadas, de modo que se pueden incluir pruebas apropiadas para pureza del producto final. Los datos que se pueden usar para la caracterización de una célula a ser usada en la presente invención incluyen (a) información en su origen, derivación, e historia de paso; (b) información de su crecimiento y características morfológicas; (c) resultados de pruebas de agentes adventicios; (d) distinguir características, tales como bioquímica, inmunología, y configuraciones citogenéticas las cuales permiten que las células sean reconocidas claramente entre otras líneas celulares; y (e) resultados de pruebas para tumorigenicidad. Preferiblemente, el nivel de paso, o desdoblamiento de población, de las células hospederas usadas es tan bajo como sea posible. Se prefiere que el virus producido en las células sea altamente purificado previo a la vacuna o formulación de terapia genética. Generalmente, los procedimientos de purificación resultarán en la remoción extensiva de ADN celular, otros componentes celulares, y agentes adventicios. Los procedimientos que degradan o desnaturalizan ADN también se pueden usar. Véase, por ejemplo, Mizrahi, 1990. Vacuna Una vacuna de la invención puede comprender proteínas inmunogénicas incluyendo glicoproteínas o cualquier patógeno, por ejemplo, una proteína inmunogénica de una o más bacterias, virus, levadura u hongos. Por consiguiente, en una modalidad, los virus de influenza de la invención pueden ser vectores de vacuna para virus de influenza u otros patógenos virales incluyendo pero sin estar limitado a lentivirus tales como VIH, virus de hepatitis B, virus de hepatitis C, virus de herpes tales como CMV o HSV o virus de enfermedades del pie y boca. Una vacuna de virión completa se concentra por ultrafiltración y luego se purifica por centrifugación de zona o por cromatografía. Se inactiva antes o después de la purificación usando formalina o beta-propiolactona, por e emplo . Una vacuna de subunidad comprende glicoproteínas purificadas. Una vacuna se puede preparar como sigue: usando suspensiones virales fragmentadas por tratamiento con detergente, los antígenos superficiales son purificados, por ultracentrifugación por ejemplo. Las vacunas de subunidad por consiguiente contienen principalmente protexna HA, y también NA. El detergente usado puede ser detergente catiónico por ejemplo, tal como bromuro de hexadecil trimetil amonio (Bachmeyer, 1975) , un detergente aniónico tal como desoxicolato de amonio (Laver & Webster, 1976) ; Webster et al., 1977); o un detergente no iónico tal como aquel comercializado bajo la marca TRITON X100. La hemaglutinina también se puede aislar después del tratamiento de los viriones con una proteasa tal como bromelina, luego se purifica por un método tal como se describió por Grand and Skehel (1972) . Una vacuna separada comprende viriones los cuales se han sometido a tratamiento con agentes que disuelven lípidos. Una vacuna separada se puede preparar como sigue: una suspensión acuosa del virus purificado obtenido como anteriormente, inactiva o no, es tratada, bajo agitación, por solventes lípidos tales como éter etílico o cloroformo, asociados con detergentes. La disolución de los lípidos de desarrollo viral resulta en fragmentación de las partículas virales . La fase acuosa se recupera conteniendo la vacuna separada, constituida principalmente de hemaglutinina y neuraminidasa con su ambiente lípido original removido, y el núcleo o sus productos de degradación. Luego las partículas infecciosas residuales se inactivan si esto no se ha dado ya.

Vacunas inactivas . Las vacunas de virus de influenza inactivas de la invención se proporcionan inactivando virus replicados de la invención usando métodos conocidos, tales como, pero sin estar limitados a, tratamiento con formalina o ß-propiolacton . Los tipos de vacunas inactivas que se pueden usar en la invención pueden incluir vacunas de virus completo (VC) o vacunas (separadas) de subvirión (SV) . Las vacunas de VC contienen virus intactos, inactivos, mientras que las vacunas de VC contienen virus purificado deteriorado con detergentes que solubilizan el desarrollo viral que contiene lipidos, seguido por inactivación química de virus residual. Además, las vacunas que se pueden usar incluyen aquellas que contienen las proteínas superficiales de HA y NA aisladas, las cuales se refieren como vacunas de subunidad o antígeno superficiales. En general, las respuestas a vacunas de antígeno superficial y SV (es decir, HA o NA purificada) son similares. Una vacuna de VC inactiva experimental que contiene un antígeno de NA inmunológico se refiere al virus epidérmico y una HA no relacionada parece ser menos efectivo que vacunas convencionales (Ogra et al., 1977). Se prefieren vacunas inactivas que contienen ambos antxgenos superficiales relevantes . Vacunas de Virus Atenuado Vivo. Las vacunas de virus de influenza atenuado vivo, también se pueden usar para prevenir o tratar la infección por virus de influenza, de acuerdo con las etapas del método conocido. La atenuación se logra preferiblemente en una etapa única por transferencia de genes atenuados a partir de un virus donador atenuado a un virus reclasificado o aislado replicado de acuerdo con métodos conocidos (véase, por ejemplo, Murphy, 1993). Puesto que la resistencia al virus de influenza A es mediada por el desarrollo de una respuesta inmune a las glicoproteínas HA y NA, los genes que codifican estos antígenos superficiales deben venir de los virus reclasificados o aislados clínicos de alto crecimiento. Los genes atenuados se derivan de la madre atenuada. En este enfoque, los genes que confieren atenuación preferiblemente no codifican para las glicoproteínas HA y NA. De otra forma, estos genes no se pueden transferir a reclasificadores que llevan los antígenos superficiales del aislado de virus clínico. Muchos virus donadores se han evaluado por su capacidad para atenuar de forma reproducible los virus de influenza. Como un ejemplo no limitante, el virus donador adaptado al frío (af) A/Ann Arbor (AA) /6/SO (H2N2) se puede usar para la producción de vacuna atenuada (véase, por ejemplo, Edwards, 1994; Murphy, 1993). Adicionalmente, las vacunas de virus reclasificados atenuados vivos se pueden generar por la unión del virus donador af con un virus replicado virulento de la invención. La progenie de reclasificadores se selecciona entonces a 25°C, (restrictivo para replicación de virus virulento) , en la presencia de un antisuero H2N2, el cual inhibe replicación de los virus que llevan los antígenos superficiales del virus donador af ?/??./6/60 (H2N2) atenuado. Una gran serie de reclasificadores H1N1 y H3N2 se han evaluado en humanos y se encontró que son satisfactoriamente: (a) infecciosos, (b) atenuados para niños seronegativos y adultos inmunológicamente cebados, (c) inmunogénicos y (d) genéticamente estables. La inmunogenicidad de los reclasificadores af es análoga a su nivel de replicación. Por consiguiente, la adquisición de los seis genes transíeribles del virus donador af por nuevos virus de tipo nativo ha atenuado reproduciblemente estos virus para uso en la vacunación de adultos y niños susceptibles . Otras mutaciones atenuantes se pueden introducir en genes de virus de influenza por mutagenesis de sitio dirigido para rescatar virus infecciosos que llevan estos genes mutantes . Las mutaciones atenuantes se pueden introducir en regiones sin codificación del genoma, así como también en regiones de codificación. Tales mutaciones atenuantes también se pueden introducir en genes diferentes a HA o NA, por ejemplo, el gen de polimerasa de PB2 (Subbarao et al., 1993). Por consiguiente, nuevos virus donadores también se pueden generar llevando mutaciones atenuantes introducidas por mutagénesis de sitio dirigido, y tales nuevos virus donadores se pueden usar en la reducción de candidatos de vacuna de H1N1 y H3N2 reclasificadores atenuados vivos de una manera análoga a aquella descrita anteriormente para el virus donador af ?/??/6/60. De manera similar, otras cepas donadoras atenuadas conocidas y adecuadas se pueden reclasificar con virus de influenza de la invención para obtener vacunas atenuadas adecuadas para uso en la vacunación de mamíferos (Ewami et al., 1990; Muster et al., 1991; Subbarao et al., 1993). Se prefiere que tales virus atenuados mantengan los genes del virus que codifican determinantes antigénicos substancialmente similares a aquellos de los aislados clínicos originales . Esto es debido a que el propósito de la vacuna atenuada es proporcionar sustancialmente la misma antigenicidad como el aislado clínico original del virus, mientras que al mismo tiempo carece de infectividad al grado que la vacuna ocasiona el mínimo cambio para inducir una condición patogénica seria en el mamífero vacunado. Por consiguiente, el virus puede estar atenuado o inactivado, formulado y administrado, de acuerdo con los métodos conocidos, como una vacuna para inducir una respuesta inmune en un animal, por ejemplo, un mamífero. Los métodos son bien conocidos en la técnica para determinar si tales vacunas atenuadas o inactivas han mantenido antigenicidad similar a aquella del aislado clínico o cepa de alto crecimiento derivada de la misma. Tales métodos conocidos incluyen el uso de antisuero o anticuerpos para eliminar virus que expresan determinantes antigénicos del virus donador; selección química (por ejemplo, amantadina o rimantidina) ; actividad e inhibición de HA y NA; y selección de ADN (tal como hibridación por sonda o PCR) para confirmar que genes donadores que codifican los determinantes antigénicos (por ejemplo, genes de HA o NA) no están presentes en los virus atenuados. Véase, por ejemplo, Robertson et al., 1988; Kilbourne, "1969; Aymard-Henry et al., 1985; Robertson et al., 1992. Composiciones Farmacéuticas Las composiciones f rmacéuticas de la presente invención, adecuadas para inoculación o para administración parenteral u oral, comprenden virus de influenza atenuada o inactiva, que comprende opcionalmente soluciones, suspensiones y emulsiones acuosas o no acuosas, estériles. Las composiciones pueden comprender adicionalmente agentes o excipientes auxiliares, como se conoce en la técnica. Véase, por ejemplo, Berko et al., 1987; Goodman et al., 1990; Avery' s Drug Treatment, 1987; Osol, 1980; Katzung, 1992. La composición de la invención generalmente se presenta en la forma de dosis individuales (dosis unitaria) .

Las vacunas convencionales generalmente contienen aproximadamente 0.1 a 200 µg, preferiblemente 10 a 15 µ , de hemaglutinina de cada una de las cepas que entran en su composición. La vacuna que forma el principal constituyente de la composición de vacuna de la invención puede comprender un virus de tipo A, B o C, o cualquier combinación de los mismos, por ejemplo, al menos dos de los tres tipos, al menos dos de diferentes subtipos, al menos dos del mismo tipo, al menos dos del mismo subtipo, o un aislado (s) o reclasificador (es) diferentes. El virus de influenza humana tipo A incluye subtipos H1N1, H2N2 y H3N2. Las preparaciones para administración parenteral incluyen soluciones, suspensiones, y/o emulsiones acuosas o no acuosas, estériles, las cuales pueden contener agentes o excipientes auxiliares conocidos en la técnica. Los ejemplos de solventes no acuosos son propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales tales como aceite de oliva, y ésteres orgánicos inyectables tales como oleato de etilo. Los vendajes portadores u oclusivos se pueden usar para incrementar la permeabilidad dé la piel y mejorar la absorción de antígeno. Las formas de dosificación liquidas para administración oral pueden comprender generalmente una solución de liposoma que contiene la forma de dosificación líquida. Las formas adecuadas para suspender liposomas incluyen emulsiones, suspensiones, soluciones, jarabes, y elíxires que contienen diluyentes inertes comúnmente usados en la técnica, tales como agua purificada. Además de diluyentes inertes, tales composiciones también pueden incluir adyuvantes, agentes humectantes, agentes emulsionantes o formadores de suspensión, o edulcorantes, saborizantes, o agentes perfumadores. Véase, por ejemplo, Berkow et al., 1992; Goodman et al., 1990; Avery's, 1987; Osol, 1980; y Katzung, 1992. Cuando una composición de la presente invención se usa para administración a un individuo, la misma puede comprender sales, amortiguadores, adyuvantes, u otras sustancias las cuales son deseables para mejorar la eficacia de la composición. Para vacunas, se pueden usar adyuvantes, sustancias las cuales pueden aumentar una respuesta inmune específica. Normalmente, el adyuvante y la composición se mezclan previo a la presentación al sistema inmune, o se presentan separadamente, pero en el mismo sitio del organismo que es inmunizado. Los ejemplos de materiales adecuados para uso en composiciones de vacunas se proporcionan en Osol (1980) . La heterogenicidad en una vacuna se puede proporcionar mezclando virus de influenza replicados para al menos dos cepas de virus de influenza, tal como 2-50 cepas o cualquier rango o valor en la presente . Son preferidas cepas de virus de influenza A o B que tienen una composición antigénica moderna. De acuerdo con la presente invención, se pueden proporcionar vacunas para variaciones en una cepa única de un virus de influenza, usando técnicas conocidas en la técnica. Una composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención puede comprender además o adicionalmente al menos un compuesto quimioterapéutico, por ejemplo, para terapia genética, inmunosupresores , agentes anti-inflamatorios o mej oradores inmunes, y para vacunas, quimioterapéuticos incluyendo, pero sin estar limitado a, gamma globulina, amantadina, guanidina, hidroxibencimidazol , interferon-a, interferon-ß , interferon-?, factor alfa de necrosis de tumor, tiosemicarbarzonas, metisazona, rifampina, ribavirina, un análogo de pirimidina, un análogo de purina, foscarnet, ácido fosfonoacético, aciclovir, didesoxinucleósidos , un inhibidor de proteasa, o ganciclovir. Véase, por ejemplo, Katzung (1992), y las referencias citadas aqui en páginas 798-800 y 680-681, respectivamente. La composición también puede contener cantidades variables pero pequeñas de formaldehído libre de endotoxina, y preservativos, los cuales se han encontrado seguros y que no contribuyen a efectos indeseables en el organismo al cual la composición es administrada. Propósito Farmacéutico La administración de la composición (o el antisuero que la misma obtiene) puede ser para ya sea un propósito "profiláctico" o "terapéutico" , Cuando se proporcionan profilácticamente, las composiciones de las invenciones las cuales son vacunas, se proporcionan antes de que cualquier síntoma de una infección patógena llegue a manifestarse. La administración profiláctica de la composición sirve para prevenir o atenuar cualquier infección subsiguiente . Cuando se proporcionan terapéuticamente, la vacuna viral atenuada o inactiva se proporciona en la detección de un síntoma de infección real. La administración terapéutica del (de los) compuesto (s) sirve para atenuar cualquier infección real. Véase, por ejemplo, Berkow et al., 1992; Goodman et al., 1990; Avery, 1987; y Katzung, 1992. Una composición de vacuna atenuada o inactivada de la presente invención se puede proporcionar por consiguiente, cualquiera antes del inicio de la infección (de modo que se previene o atenúa una infección anticipada) o después de la iniciación de una infección real . De manera similar, para terapia genética, la composición se puede proporcionar antes de que algún síntoma de un trastorno o enfermedad se manifieste o después de que uno o más síntomas sean detectados . Una composición se dice que es "aceptable farmacológicamente" si su administración puede ser tolerada por un paciente receptor. Un agente se . dice que se administra en una "cantidad terapéuticamente efectiva" si la cantidad administrada es fisiológicamente significante. Una composición de la presente invención es fisiológicamente significante si su presencia resulta en un cambio detectable en la fisiología de un paciente receptor, por ejemplo, mejora al menos una respuesta inmune secundaria humoral o celular contra al menos una cepa de un virus de influenza infeccioso. La "protección" provista no necesita ser absoluta, es decir, la infección de influenza no necesita prevenirse o erradicarse totalmente, si existe un mejoramiento estadísticamente significante comparado con una población de control o conjunto de pacientes. La protección se puede limitar a mitigar la severidad o rapidez de aparición de síntomas de la infección del virus de influenza. Administración Farmacéutica Una composición de la presente invención puede conferir resistencia a uno o más patógenos, por ejemplo, una o más cepas de virus de influenza, por ya sea inmunización pasiva o inmunización activa. En inmunización activa, una composición de vacuna viva inactiva o atenuada se administra profilácticamente a un hospedero (por ejemplo, un mamífero) , y la respuesta inmune del hospedero a la administración protege contra infección y/o enfermedad. Para inmunización pasiva, los antisueros obtenidos se pueden recubrir y administrar a un receptor sospechoso de tener una infección causada por al menos una cepa de virus de influenza. En una segunda modalidad, se proporciona la vacuna a un mamífero hembra (en o previo a embarazo o parto) , bajo condiciones de tiempo y cantidad suficiente que causa la producción de una respuesta inmune la cual sirve para proteger tanto a la hembra como el feto o recién nacido (vía incorporación pasiva de los anticuerpos a través de la placenta o en la leche de la madre) . Por consiguiente, la presente invención incluye métodos para prevenir o atenuar un trastorno o enfermedad, por ejemplo, una infección por al menos una cepa de patógeno. Como se usa en la presente, una vacuna se dice que previene o atenúa una enfermedad si su administración resulta ya sea en la atenuación total o parcial (es decir, supresión) de un síntoma o condición de la enfermedad, o en la inmunidad total o parcial del individuo a la enfermedad. Al menos un virus de influenza inactivado o atenuado, o composición de los mismos, de la presente invención, se puede administrar por cualquier medio que logre la propuesta pretendida, usando una composición farmacéutica como se describe previamente. Por ejemplo, la administración de una composición puede ser por varias rutas parenterales tales como rutas subcutánea, intravenosa, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal , intranasal, oral o transdérmica . La administración parenteral puede ser por inyección de bolos o por perfusión gradual en el tiempo. Un modo preferido de usar una composición farmacéutica de la presente invención es por aplicación intramuscular o subcutánea. Véase, por ejemplo, Berkow et al., 1992; Goodman et al., 1990; Avery, 1987; y Katzung, 1992. Un régimen típico para prevenir, sorprender, o tratar una patología relacionada con el virus de influenza, comprende la administración de una cantidad efectiva de una composición de vacuna como se describe en la presente, se administra como un tratamiento único, o repetido como dosificaciones mejoradoras o reforzadoras, sobre un periodo de hasta y que incluye entre una semana y aproximadamente 24 meses, o cualquier intervalo o valor en éste. De acuerdo con la presente invención, una "cantidad efectiva" de una composición de vacuna es una que es suficiente para lograr un efecto biológico deseado. Se entiende que la dosificación efectiva dependerá de la edad, sexo, salud y peso del ' receptor, clase de tratamiento concurrente, si lo hay, frecuencia de tratamiento, y la naturaleza del efecto buscado. Los intervalos de dosis efectivas provistos posteriormente no se proponen para limitar la invención y representan intervalos de dosis preferidas. Sin embargo, la mayor dosis preferida se adaptará al sujeto individual, como se entienda y determine por un experto en la técnica. Véase, por ejemplo, Berkow et al., 1992; Goodman et al., 1990; Avery's, 1987; Ebadi, 1985; y Katsung, 1992. La dosificación de una vacuna de virus atenuada para un organismo adulto de mamífero (por ejemplo, humano) o ave puede ser de aproximadamente 103-107 unidades formadoras de plaquetas (PFU)/kg, o cualquier intervalo o valor en ésta. La dosificación de vacuna inactiva puede variar desde aproximadamente 0.1 a 200, por ejemplo, 50 µg de proteína de hemaglutinina. Sin embargo, la dosificación deberá ser una cantidad segura y efectiva como se determine por métodos convencionales, usando vacunas existentes como un punto de partida . La dosificación, de HA inmunorreactiva en cada dosis de vacuna de virus replicada se puede estandarizar para contener una cantidad adecuada, por ejemplo, 1-50 µg o cualquier intervalo o valor en éste, o la cantidad recomendada por el Servicio de Salud Pública de E.U. (por sus siglas en inglés, PHS) , la cual usualmente es de 15 µg, por componente para niños mayores j> 3 años de edad, y 7.5 µg por componente para niños mayores <3 años de edad. La cantidad de NA también se puede estandarizar, sin embargo, esta glicoproteína puede ser lábil durante la purificación y almacenamiento del procesador (Kendal et al., 1980; Kerr et al., 1975) . Cada dosis de 0.5 mi de vacuna preferiblemente contiene aproximadamente 1-50 billones de partículas de virus, y preferiblemente 10 billones de partículas. La invención se describirá adicionalmente por los siguientes ejemplos no limitativos. Ejemplo 1 Materiales y Métodos Virus y células . El virus H3N2 humano aislado de un solo paciente, ya sea en huevos de pollo embrionado (A/Tottori/ATl/AM2AL3/94; AM1AL3) de células de riñon de canino Madin-Darby (RCMD) , se obtuvieron de T.Jto (Tottori University, Tottori, Japón). Las soluciones base de virus se hicieron crecer ya sea en huevos de pollo embrionado de 10 días de vida (virus A ZAL3) o en células de RCMD (virus K4) en medio esencial mínimo (MEM) complementado con 0.3% de albúmina de suero bovino y 0.5 mg de tripsina/ml . Las células de RCMD se mantuvieron en MEM suplementado con 5% de suero de becerro recién nacido (Sigma, St . Louis, MO.) . Generación de líneas celulares resistentes a lectina. Las células de RCMD crecidas a 75% de confluencia se lavaron tres veces con solución salina amortiguada con fosfato y se incubaron con lectina Maakia amurensis (???) (100 mg/ml; Boehringer Mannheim, Mannheim, Alemania) o lectina Sambucus nigra (SNA) (100 mg/ml; Boehringer Mannheim) en MEM que contiene 0.3% de albúmina de suero bovino. Después de una incubación de 48 horas, el medio se remplazó con medio de crecimiento (MEM-5% de suero fetal de becerro) . La selección de lectina se repitió como anteriormente dos veces adicionales. Las colonias de células sobrevivientes se clonaron entonces, y las lineas celulares seleccionadas de SNA y MAA se designaron .RCMD-SnlO y RCMD-Ma, respectivamente. Método de CLAR Fluorométrica para determinación de contenido de ácido siálico. El contenido de ácido siálico (ácido N-acetilneuramínico [NeuAc] y ácido N-glicolilneuramínico [NeuGc] ) de ambas líneas celulares y el virus purificado se determinó fluorornétricamente por cromatografía líquida de alto rendimiento como se describe en Suzuki et al. (1997) . Cada muestra se colocó en un vial de vidrio descoronado de 5 mi de tierra y se mezcló con 100 µ? (25 mM) de ácido sulfúrico. Luego los viales se calentaron a 60°C por 12 horas para hidrolizar cadenas de sialo-azúcar . Después del enfriamiento, 50 µ? de 1, 2-diamino-4, 5-metilen dioxibenceno se adicionó a 50 µ? del hidrolito, y la mezcla se calentó a 60°C por 2.5 horas en la oscuridad para desarrollar la fluorescencia del ácido siálico. Una alícuota de 10 µ? de la solución resultante se inyectó entonces en una cromatografía líquida de alto rendimiento 880-PU (JASCO, Tokyo Japón) equipada con una válvula inyectora de muestra (modelo 7125;. eodyne) y un espectrofotómetro fluorescente (650-105; Hirachi , Tokyo, Japón) con una células de flujo de 20-µ1 y un registrador (Chromatopac C-RSA; Shionadzu, Kyoto, Japón) . El espectrofotómetro fluorescente se colocó en una longitud de onda de excitación de 373 nm y una longitud de onda de emisión de 448 nm. Las mezclas estándares (200 pmol/µ?) de NeuAc (Sigma) y NeuGc (Sigma) se usaron para establecer curvas de calibración. Ensayo fluorométrico de actividad de sialidasa. La actividad de sialidasa de virus (5 x 105 PFU se midió con ácido 2 ' - (4-metilumbeliferil) -a-D-N-acetilneuramínico (Sigma) como un sustrato como se describe en Hará et al. (1987). En resumen, el sustrato fluorogénico, diluido 1:2 con acetato de sodio 0.5 M (pH 4.6), se adicionó a un volumen igual de muestras de virus y se incubó por 30 minutos a 37°C. Las reacciones se detuvieron con 200 mi de Na2C02 0.5 M (pH 10.7), y fluorescencia luego se incubó a una longitud de onda de excitación de 360 nm y una longitud de onda de emisión de 460 nm. Todas las reacciones se realizaron por duplicado. Análisis de secuencia del gen NA y HA. Se obtuvo ARN viral total ¦ (ARNv) a partir de muestras de virus con uso del kit de purificación de ARNv Qiappin como se instruyó por el fabricante (Qiagen, Inc., Valencia, Calif.). Para producción de ADNc, el oligonucleótido Uni-12, complementario a los 12 nucleótidos terminales de ARNv conservados de segmentos de gen de virus de influenza A se usaron como un cebador para la reacción de transcriptasa inversa de Virus de Leucemina de Murina Moloney (Promega, adison, WI) . El ADNc del gen de NA se amplificó durante 30 series de PCR con los cebadores de gen específico NA JN2-43 (secuencia de sentido de ARNc 5': 5 ' -TGGCTCGTTTCTCTCACTATTGCC-3 ' ; SEC ID NO:l) y JN2-1410r (secuencia antisentido de 3' -ARNc : 5'-TTATATAGGCATGAGATTGATGTCCG-3 ' ; SEC ID NO: 2) y 10 U de polimerasa de ADN Pwo (Boehringer Mannheim) . Los productos de PCR resultantes se subclonaron en el vector pCR21 (Invitrogen, Carlsbad, Calif.) y se usaron para el secuenciado fluorescente automático. El gen de HA se clonó en un modo similar con los cebadores de gen específico HA JH3-Up (secuencia de cebador de sentido 5' ARNc, 5'-AGCAAAAGCAGGGGATAATTCTATTAACCATGAAGAC-3 ' ; SEC ID NO : 3 ) y JH3-Down (secuencia antisentido de cebador 3' ARNc 5'-AGTAGAAACAAGGGTGTTTTTAATTAATGCACTC-3 ' ; SEC ID NO: 4). Para cada aislado, se examinaron tres clones para obtener una secuencia de consenso de NA y HA. Resultados Generación de líneas celulares resistentes a lectina. Para producir líneas celulares con un nivel disminuido de expresión de ácido siálico en la superficie celular, se usaron dos lectinas, SNA y AA, que difieren en especificidad de enlace de ácido siálico. La lectina de MAA se une al ácido siálico enlazado a galactosa por enlaces a(2,3) ( ang et al., 1988), mientras que la lectina SNA es específica para ácidos siálicos enlazados a galactosa o N-acetilgalactosamina por enlaces a(2-6) (Shibuya et al., 1987) . La línea celular de RCMD, la cual soporta el crecimiento de virus de influenza, se usó como una célula madre para selección de lectina. Cuando se incubó en la presencia de ya sea lectina, la mayoría de las células murieron dentro de una semana. Los clones de células resistentes se hicieron crecer entonces para cultivos de soluciones base . Las líneas celulares que resultan de selección de lectina de ??? y SNA se designaron RCMD-Ma y RCMD-SnlO, respectivamente. La clasificación de células fluorescentes activas (CCFA) con lectinas de MAA y SNA etiquetadas con digoxigenxna (Figura 1A) demuestra altos niveles de unión de células de RCMD para ambas lectinas, como se reportó previamente (Ito et al., 1997). Las células de RCMD-SnlO, seleccionadas con lectina de enlace específico OÍ (2,5), retienen fuertes uniones para la lectina de MAA específica OÍ (2, 3) pero muestran lectina de SNA que se une más débilmente que aquella de la madre RCMD. En contraste, las células de RCMD-Ma, seleccionadas con la lectina de enlace específico OÍ (2-3), unen ambas lectinas mucho más débilmente que las células de RCMD.

Crecimiento viral en líneas celulares RC D-SnlO y RCMD-Ma. Para comprender cómo los virus de influenza se adaptan a células con expresión de receptor reducido, dos variantes de virus de influenza (AM2AL3 y K4) se eligieron con especificidad de enlace del receptor de ácido siálico conocido (Ito et al., 1997). El virus K4 reconoce específicamente a NeuAc enlazado a galactosa por enlaces o¡(2-S) [NeuAca (2-6) Gal] , mientras que el virus A 2AL3 es específico para NeuAca (2-3) Gal . Ambos virus se replican también en células de RCMD-SnlO como en células de RCMD (Tabla 1) . Sin embargo, las concentraciones de ambos virus en células de RCMD-Ma fueron 1 log más bajo que en células de RCMD. También, después de la infección con cualquier virus, incluso a una multiplicidad de infección de 10, un pequeño porcentaje de células RCMC-Ma continuó creciendo a confluencia sin cualesquiera efectos citopáticos. La producción de virus no se detectó en estas células sobrevivientes por ensayo de hemaglutinación durante el remplazo del medio con aquel que contiene tripsina, lo cual promueve el crecimiento de virus. Las células también fueron negativas por manchado inmunoquímico para tanto proteínas de HA como NP de virus de influenza (datos no mostrados) , por consiguiente, se demuestra que las células no fueron infectadas persistentemente . Las células sobrevivientes fueron designadas MaKS.

Tabla 1: Replicación de virus de influenza en lineas celulares resistentes a lectina* Concentración (TCIDso/ml) Linea celular AM2AL3 K4 RCMD 1.8 x 10y 5.6 x 104 RCMD-SnlO 5.6 x 108 3.2 x 104 RCMD-Ma 1.8 x 108 5.6 x 103 * La susceptibilidad de cada una de las lineas celulares se determinó infectando células con AM2AL3 o K4 con virus y determinando la dosis requerida para infectar 50% de células de cultivo de tejido (TCID50) - El análisis de CCFA con tanto lectinas de SNA como ??? demuestra que las células aKS, similares a las células RCMD-Ma de las cuales las mismas se derivaron, se unen a la lectina de SNA a (2, 6) -especifica mucho más débilmente que con células de RCMD (Figura IB) . Además, el pico de unión de lectina de MAA fue mucho más estrecho que aquel de la linea celular de RCMD-Ma, con pérdida de un pequeño pico de saliente que representa una población de unión de MAA superior (Figura 1) . Para determinar si las cantidades reducidas de ácido siálico fueron responsables para la unión de lectina reducida de células MaKS, los niveles de ácido siálico presentes en las células MaKS se cuantificaron por análisis cromatográfico líquido. La línea celular MaKS mostró niveles mucho menores de tanto NeuAc como NeuCc (8.2 y 0.4 pmol/^g de proteína, respectivamente) que células de RCMD (216.0 y 2.5 ?t??1/µ9 de proteína) , aunque el contenido de NeuGc fue mucho menor. Estos datos demuestran una reducción extensiva de receptor de ácido siálico determinante en células MaKS. Adaptación de virus en células MaKS . Para determinar cómo virus AM2AL3 y K4 se propagan y adaptan para crecer en células que expresan niveles muy bajos de receptor de virus, ambos virus se pasaron seriadamente en células MaKS en cultivo líquido. Puesto que ambos virus se replicaron muy pobremente en células MaKS que en células RCMD (Tabla 2) , se realizaron los pasos 1 a 3 sin dilución, y se realizaron los pasos 4 a 13 en dilución 1:1, 000. Después del paso 8, el diámetro de plaquetas producidas por cualquier variante cambió del grande (mayor que 3 mm) al más pequeño (aproximadamente 1 nm) . Por el paso 10 y mayor, solamente plaquetas más pequeñas estuvieron presentes cuando los virus se sometieron a ensayo con células RCMD (datos no mostrados) . Después de 13 pasos seriales, ambos virus fueron capaces decrecer en células MaKS así como también o mejor que en las células RCMD (tabla 2) . Soluciones base de virus producidas de cualquier variante después del paso 13 se amplificaron y designaron AL3(MaKS)-13 y K4 (MaKS) -13, respectivamente.

Tabla 2. Replicación de virus adaptados a crecimiento en células de lectina seleccionada* Concentración (TCID50/ml) Linea celular AM2AL3 AL3( a S)-13 K4 K4 (MaKS) - 13 RCMD 1.8X109 5.6X104 5.6X10" 5.6X104 MaKS 5.6X106 5.6X104 1.8X103 1.8X103 Resina, concentración 321 1 31 0.3 de RCMD/concentración de MaKS * La susceptibilidad de cada linea celular se determinó infectando células con solución base de virus AM2AL3 (crecimiento en huevos) , K4 (crecimiento en células RCMD) , AL3(MaKS)-13 (crecimiento en células MaK3) , o K4 (MaKS) -13 (crecimiento en células MaKs) y determinando de la dosis requerida para infectar 50% de células de cultivo de tejido (TCID50) . Nótese que ambos virus adaptados en células MaKS crecieron en estas células asi como [AL3 (MaKS) -13] o mejor que [K4 (MaKS) -13] en células RCMD, mientras que los virus originales crecieron mejor en células RCMD.

Análisis mutacional de los genes de HA y NA de virus AL3 (MaKS) -13 y K4 (MaKS) -13. Para determinar la base molecular de la adaptación de virus a un ambiente celular caracterizado por una concentración de receptor reducida, los genes de HA de los virus AL3(MaKS)-13 y K4 (MaKS) -13 fueron transcritos inversos, los ADNc se amplificaron por PCR, los productos resultantes se secuenciaron. .Ninguno de los genes contuvo mutaciones por comparación con los genes de HA correspondientes de los dos virus parentales . Puesto que los cambios en la actividad de sialidasa de NA probablemente influencian la actividad de enlace de enlace de receptor de HA, se determinó la secuencia de NA de los virus AL3 (MaKS) -13 y K4(MaKS)-13. El análisis de secuencia de los genes de NA de ambas variantes reveló supresiones internas grandes (figura 2). En el AL3 (MaKS) -13 , la supresión se extendió desde los nucléotidos 220 a 1253, desplazando una estructura de lectura y por consiguiente generando un codón de terminación inmediatamente después de la supresión. La capacidad de codificación de esta NA es 66 aminoácido, correspondiente a la cola citoplásmica, el dominio de transmembrana, la región de tronco, y una porción corta de la región de cabeza de NA. De manera similar, el aislado de K4 (MaKS) -13 contuvo una supresión en el gen de NA de bases 130 a 1193, produciendo un codón de terminación en la estructura a codón 39. Similar al virus AL3 (MaKS) -13 , el gen no más largo codificó una región de cabeza catalítica completa. Por consiguiente, los virus pasados en una línea celular con muy baja expresión de receptor perdieron su actividad catalítica de NA. Para confirmar este resultado, las variantes de AL3 (MaKS) -13 y K4 (MaKS) -13 se analizaron para actividad de sialidasa,' usando un sustrato de sialidasa fluorescente [ácido 2' (4-metilumbeliferil) -a-D-N-acetilneuramínico] .

Distinto de los virus parentales, ninguno de los mutantes de supresión de NA tuvo actividad de sialidasa detectable (figura 3) . Extensión de sialilacion de glicoproteínas virales. Durante la infección normal, los virus con actividad de sialidasa reducida fallaron para crecer eficientemente y agregarse a la superficie celular (Palese et al., 1974; Shibata et al., 1993). Porqué, cuando, los virus AL3 (MaKS) -13 y K (MaKS) -13 lo hacen, los cuales carecen de actividad de sialidasa, crecen en células MaKS? Una explicación posible podría ser que puesto que el contenido de ácido siálico de estas células es bajo, la extensión de sialilacion de los oligosacáridos de HA y NA también puede ser baja, previniendo la agregación de virus en la superficie celular infectada, aún cuando la actividad de sialidasa está ausente. Para probar esta hipótesis, el contenido de ácido siálico en preparaciones de virus purificadas se comparó entre crecimiento de virus AM2AL3 y K4 en células RCMD y crecimiento de virus AL3 (MaKS) -13 en células MaKS. El contenido de NeuAc fue similar entre las muestras de virus, aunque el virus AM2AL3 tubo contenido de ácido siálico inferior (0.9 pmol de NeuAc/g de proteína) que las otras muestras (A/Tottori/872/K4/94 , 3.8 pmol de NeuAc/g de proteína; AL3 (MaKS) -13 , 2.6 pmol de NeuAc/g de proteína) . Por consiguiente, los virus que carecen de actividad de sialidasa pueden crecer eficientemente en células que expresan un nivel reducido de ácido siálico debido a que las glicoproteínas virales no son sialiladas extensivamente comparado con aquellas en líneas celulares normales y no son enlazadas por la HA, previniendo así la agregación viral . Discusión En estudios previos, el paso del virus de la influenza A en la presencia de una actividad de sialidasa bacteriana exógena y anticuerpos al NA viral, conducen a la supresión del gen viral NA (Liu et al., 1993; Liu et al., 1995; Yang et al., 1997). Sin embargo, mutantes NA obtenidos por tales pasos fueron capaces de crecer en cultivos celulares carentes de actividad de sialidasa exógena, así como también en huevos y ratones, como un resultado de las mutaciones compensatorias en la proteína HA, que reduce la afinidad de las moléculas para los residuos de ácido siálico (Hughes et al., 2000). Como se describe aquí, los virus de la influenza A pueden adaptar el crecimiento en las células con expresión del receptor mayormente reducida por las grandes mutaciones de supresión del gen AN que suprime la actividad de sialidasa. Aunque la reducción de receptores virales podría afectar teóricamente la proteína HA de enlace al receptor, solamente se altera el gen NA. ¿Cuál es la base molecular de este hallazgo? En ambientes celulares normales en donde son abundantes los receptores de ácido siálico, la pérdida de actividad NA puede ser compensada por la reducción de la afinidad HA viral por el ácido siálico, permitiendo liberación eficiente de la progenie a partir de la superficie de las células hospedadoras y previniendo la agregación del virión (Hughes et al., 2000) . En la ausencia de altos niveles de receptores virales, como en las células MaKS, no es necesaria una reducción de afinidad de HA para liberar la progenie viral y permitir el crecimiento de mutantes de supresión NA. En efecto, la alta afinidad de enlace de la proteína HA debe ser mantenida para la replicación viral en células que expresan bajos niveles del receptor viral. La actividad de sialidasa sin embargo, no es requerida para la liberación del virión y prevención de la agregación del virión en tales ambientes, puesto que cantidades de ácido siálico en las moléculas de la superficie celular son casi bajas y los contenidos de ácido siálico de los viriones de supresión de NA son similares a aquellos de los viriones de tipo nativos. En efecto, la actividad sialidasa es probablemente nociva para el crecimiento viral, debido a que además remueve el ácido siálico determinante del receptor a partir de la superficie celular. Recientemente, se ha mostrado que el virus de la influenza A carece de un tallo de NA, y de este modo no permite el crecimiento en huevos, adquiriendo un tallo de inserción de hasta 22 aminoácidos a través de la recombinación de ARN-ARN no homologa ( itnau et al., 2000). Tomados en conjunto, estos hallazgos indican que el virus de la influenza puede adaptar nuevos ambientes de hospedadores, sometiéndose a cambios genéticos radicales, que incluyen grandes inserciones y supresiones. En estos y en estudios previos (Hughes et al., 2000; Liu et al., 1993), los virus pierden actividad de sialidasa por supresiones internas en el segmento del gen de NA que repone segmentos terminales que codifican el extremo citoplásmico y la región de la transmembrana. De este modo, pueden ser necesarias regiones preservadas del gen de NA en estos mutantes, para funciones tales como morfogénesis y estabilidad de virión. Las células MaKS tienen un contenido de ácido siálico inferior que sus células originales (RCMD) . Aunque se han producido líneas celulares similares a partir de células CHO (Ray et al., 1991), no han probado ser útiles para los estudios del virus de la influenza debido a su inhabilidad para soportar el virus de la influencia eficiente. Por el contrario, células MaKS se derivaron de células RCMD, una línea celular estándar en estudios de virus de la influenza, y deben ser empleadas en análisis basados en el receptor viral. Por ejemplo, puesto que se conocen los gangliosidos agregados exógenaraente por estar incorporados en las membranas de las células hospedadoras (Carroll et al., 1985), se podrían por lo tanto, incubar gangliosidos conocidos con células MaKS y probar su habilidad para servir como receptores virales . Durante el siglo pasado, tres pandemias del virus de la influenza A se originaron cuando los genes de HA o tanto de HA como de NA de virus emergentes, se introdujeron en una población humana. Estudios comparativos de virus de diferentes animales hospedadores, sugieren que en estas cepas pandémicas, las mutaciones se introdujeron en el gen HA (Bean et al., 1992). Permanece desconocido, si se requieren mutaciones similares en el NA para permitir al virus cruzar las barreras de especies hospedadoras; sin embargo,' la especificidad del substrato del virus humano de NA N2 , el cual se deriva de un virus de ave, gradualmente cambió durante su replicación en humanos (Baum et al., 1991) . Resultados descritos aquí anteriormente, indican que las mutaciones de NA pueden sin embargo, contribuir a la habilidad de los virus de la influenza A, para adaptarse a nuevos ambientes. Por ejemplo, un virus reafirmado con el virus humano de NA y los genes restantes de un virus de pato, fallan al replicarse en patos (Hinshaw et al., 1983), aún aunque el NA del virus humano se origine de un virus de ave (Scholtissek et al., 1978). Esto sugiere que las mutaciones probablemente ocurren en el gen de NA durante la adaptación en humanos. Estudios comparativos de NA virales de diferentes hospedadores animales, en conjunto con genética inversa basada en el plásmido recientemente desarrollado (Fodor et al., 1999; Neumann et al., 1999), pueden proporcionar una visión útil en como estas glicoproteínas de la superficie contribuyen a los cambios adaptivos entre los virus de la influenza en la naturaleza.

Ejemplo 2 Materiales y Métodos Células . Se mantuvieron células embriónicas de riñon humano 293T en medio Dulbecco, suplementado con suero bovino fetal al 10% (FCS) y se mantuvieron células caninas de riñon Madin-Darby (RCMD) en medio de Águila, suplementado con suero bovino recién nacido al 5%.

Genética inversa basada en plásmidos . Se generaron virus de la influenza A, usando plásmidos que poseen el ADNc de genes virales A/WSN/33 (H1N1) , bajo el control del promotor y terminador de la polimerasa I de ARN (referido como plásmidos Poli) , y los plásmidos pCAGGS/MCS que expresan las proteínas virales de la influenza como se describe en Neuman et al. (1999) (Figura 4B) . Brevemente, los plásmidos Poli y los plásmidos de expresión de la proteína se mezclaron con un reactivo de transfección, Trans IT LT-1 (Panvera, Madison, WI) , incubados a temperatura ambiente por 10 minutos, y agregados a 1 x 10s- células 293T cultivadas en Opti-MEM (GIBCO-BRL) . Cuarenta y ocho horas posteriores a la transfección, se agregaron ' 0.5 µg por mi de tripsina al medio para activar la protelna HA, seguido por incubación por 1 hora a 37°C. El sobrenadante fue entonces colectado. Plásmidos . El gen NAFLAG contiene la región codificante del 5' del A c de NA; 51 codones de NA que corresponden al extremo citoplásmico (6 aminoácidos) , transmembrana (29 aminoácidos) y la región del tallo (16 aminoácidos) (Figura 4A) ; el epítope FLAG (Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys ; SEC ID NO: 5) ; dos codones de detención secuenciales (TAA TAG; SEC ID NO: 6); y 185 bases de la secuencia del extremo del 3' de ARNc de NA. Esta longitud de la secuencia del extremo 3' es la más corta encontrada en un segmento NA truncado (Yang et al., 1997) . El pPoll-NAFLAGWT, el cual produce el ARN de NAFLAG de sentido negativo, se elaboró suprimiendo los nucleotidos 173 a 1070 (en el sentido positivo) del gen NA de SN en pT7Azul-NA (el cual contiene el gen de longitud completa A/WSN/33 NA, flanqueado por los sitios Bsrrí I) e insertando las secuencias FLAG, dos codones de detención y el sitio Stul por RCP. Este fragmento se digirió por Stul y se auto-ligó. El gen NAFLAG se escindió con BsrriBI en el sitio BsmBI de pHH21. El pPoll-NAFLAGM(-) , para la producción del ARNv de NAFLAGM(-) , carece el codón iniciador de la proteína de NA. Esto se logró cambiando el codón de iniciación ATG por la proteina truncada NAFLAG a GCG por el sistema de mutagénesis dirigida al sitio in vitro (GeneEditor, Promega) . El pPollNA- (183) GFP (157) , el cual genera el ARN que contiene el extremo no codificante del 3 ' del ARNv de NA y la secuencia complementaria que codifica una proteína de fusión con 61 codones Na N-terminales , proteína fluorescente verde me orada (eGFP, Clontech) , y 185 bases del extremo 5' del ARNv de NA, se produjo por reemplazo de los nucleótidos 203 a 1109 (en sentido positivo) del gen NA de WSN en el pT7Azul-Na con un sitio BglII por RCP inversa. El gen eGFP se clonó en este sitio Bglll y el sitio Stul en la posición 1226 (en el gen NA de tipo nativo) en estructura, con la proteína NA. El gen NA- (183) GFP (157) , entonces se insertó en el sitio BsmBI de pHH21. Se produje el gen NA(0)GFP(0), el cual contiene la región no codificante del 3' del ARNv de NA, la secuencia codificante complementaria de eGFP y la región no codificante del 5' del ARNv de NA, por RCP con cebadores oligonucleótidos que poseen un sitio Bbsl . Este fragmento de RCP se digirió con BJsI y se insertó en el sitio BsmBI de pHH21, de manera que después de la introducción del plásmido en las células, se sintetizó el ARN que contiene la secuencia codificante de eGFP en la orientación sentido negativo, flanqueada por las regiones de ARNv de NA no codificantes del 5' y 3' . Se produjeron una serie de imitantes de supresión por mutagénesis en RCP . Los imitantes de supresión de la proteína de fusión NA-eGFP, se elaboraron del gen ??-(183)GPP(157) en el vector pT7azul. Se produjo el gen NA-(183)GFP(0), el cual carece del extremo 3' completo (sentido positivo) de la región codificante NA de NA- (183 ) GFP (157) , por mutagénesis de RCP. Este mutante contiene la región no codificante del 5' (sentido positivo), 61 aminoácidos de la secuencia de NA, el gen eGFP, dos codones de detención y la región no codificante del 3'. Los mutantes de RCP, NA (90) GFP (0) , NA- (45) GFP (0) , NA- (21) GFP (0) y NA- (18) GFP (0) , contienen 30, 14, 7 o 6 supresiones de aminoácido N-terminal de la región codificante NA de NA- (183 ) GFP (0) , respectivamente . El gen NA0G185, el cual contiene la región no codificante del 5', gen eGFP, dos codones de detención y 185 nucleótidos del extremo del 3' del NA (sentido positivo, se elaboró en la misma manera a partir del gen NA(61)GFP. Este mutante tiene la región no codificante del 5' de ARNv de NA (28 nucleótidos) y 157 nucleótidos de la región codificante del 5' NA de ARNv. Los mutantes NA- (183) GFP (78) y NA-(183) GFP (39) , son mutantes de supresión de NA0G185, los cuales tienen una mitad o un cuarto de la región codificante del 5' de NA como NA0G185, respectivamente.

Inmunomanc ado . Para detectar el epítope FLAG unido al C-término de la proteina NA truncada, se infectaron células RCMD con el virus que posee este epítope y se sobrepuso con agarosa al 0.6% que contiene 0.5 µg por mi de tripsina y 100 µ? por mi de sialidasa de Vibrio Cholerae (GIBCO/BRL) . Las células infectadas se fijaron con solución de formaldehído al 3%, se permearon por Triton-X100 al 0.1% en solución de formaldehído al 3%. Se detectó entonces el epítope FLAG usando un kit de Vectasain ABC (Vector, Burlingame, CA) y anticuerpo M2 monoclonal anti-FLAG (Sigma) , como el anticuerpo primario e IgG anti-ratón biotinilado como el anticuerpo secundario. Para identificar las células infectadas con el virus WSN, se empleó suero anti-WSN de conejo como el anticuerpo primario.

Hibridación in situ. Se sometieron a hibridación células infectadas con sonda etiquetada con digoxigenina (DIG) , y se tiñeron usando un Kit de Detección de ácido Nucleico DIG (Roche) , de conformidad con el protocolo del fabricante. Se etiquetó un oligonucleótido (100 pmol) complementario a la secuencia de nucleótido que codifica el epítope FLAG (GACTACAAGGACGACGATGACAAG ; SEC ID NO: 7), por el Kit de Terminación de ADN de Oligonucleótido DIG (Roche) a 37°C por 6 horas. Las células infectadas con virus se fijaron con solución de formaldehído al 3%, se permearon por Triton-XlOO al 0. i% en solución de formaldehído y se prehibridizaron a 65 °C por 30 minutos en amortiguador de prehibridación (5x SSC, Reactivo de Bloqueo . al 1% del Kit de Detección, N-lauroilsarcosina al 0.1%, sulfato dodecil de sodio al 0.02% [SDS] ) , que contiene 0.1 mg/ml de Poly(A)~ADN del Kit de Detección). Las sondas de oligonucleótido (10 pmol) se agregaron al amortiguador de prehibridación y se sometieron a hibridación a 55 °C por 1. Las células sometidas a hibridación se lavaron por 5 minutos con amortiguador de lavado (0.1 M de ácido maléico, 0.15 M de NaCl , Tween 20 al 0.3%, pH 7.5), bloqueado con Reactivo de Bloqueo al 1% por 30 minutos a temperatura ambiente, y se incubaron con anticuerpo anti-DIG (1:500) conjugado con fosfatasa alcalina por 30 minutos a temperatura ambiente. Las células entonces se lavaron con el amortiguador de lavado y se incubaron con cloruro de tetrazolio - nitroazul/5-bromo-4-cloro-3-indolil-fosfato (NBT/BCIP) en el amortiguador de detección (0.1 M de Tris-HC1, 0.1 M de NaCl, pH 9.5) a temperatura ambiente por 3 horas en la oscuridad.

Pasos competitivos. El virus NAFLAGWT o NAFLAGM(-) (300 unidades que forman placas [PFU] ) , se mezcló con 3 x 10"4 PFU del virus NA(-) y se usó para infectar células RCMD subconfluentes (multiplicidad de infección de 0.01) y se incubaron por 72 horas en medio que contiene 0.5 µ9 por mi de tripsina y 100 µ?" por mi de sialidasa de Vibrio cholerae. Los virus cosechados se usaron para infectar células RCMD. Este proceso se repitió 5 veces.

Resultados Es viable un virus de la influenza A que carece del segmento del gen de NA. El mantenimiento del gen de NA truncado después del paso repetido, sugiere su importancia para la replicación viral . Para generar un virus mutante de la influenza A sin el segmento de ARN de NA, se transfectaron células 293T con plásmidos para la producción de ARNv, con la excepción de ARNv de NA, y aquellos para la expresión de las nueve proteínas estructurales . Después de la incubación del sobrenadante del cultivo de células 293T con células RCMD en la presencia de sialidasa ViJrio cholerae, se observaron placas (diámetros de 189 + 15.6 µt?) . En cultivo líquido, este virus (designado NA(-) ) , creció hasta 105 PFU/tnl. De este modo, fue viable el virus de la influenza A con solamente 7 segmentos de ARNv.

Se requiere un segmento truncado de NA para crecimiento viral eficiente. Para entender las bases moleculares para el mantenimiento estable del gen de NA truncado después del paso repetido, se comparó el crecimiento del virus que contiene el gen NA truncado con el virus carente del codón inicial para el gen NA, que codifica el virus NA(-) . Se generó un virus mutante NAFLAGWT por genética inversa. El NAFLAGWT tiene un gen NA con una supresión interna y se fusionó una secuencia de epítope FLAG al gen NA truncado. El NAFLAGWT creció hasta 105 PFU/ml y produce placas en la -presencia de una sialidasa bacteriana. Las placas fueron inmunomanchadas con anticuerpo monoclonal anti-FLAG o anticuerpo policlonal anti-WSN (Figura 4C) . Las placas producidas por el virus NA(-) o NAFLAGWT, fueron teñidas con anticuerpo anti-WSN, pero solamente aquellas de los últimos virus fueron teñidas con el anticuerpo anti-FLAG. Para determinar la diferencia en la habilidad replicativa, se mezclaron virus NA(-) y NAFLAGWT a una relación de 100:1 y esta mezcla se incubó con células RCMD (Figura 5) . A 48 horas posteriores a la infección, el sobrenadante se removió y se usó para la producción de placas, las cuales fueron inmunomanchadas con anticuerpo monoclonal anti-FLAG. La pre'valencia del virus con el segmento NA truncado se determinó calculando el porcentaje de placas FLAG-positivas entre las placas totales. Este procedimiento . se repitió 4 veces más . Como se muestra en la Figura 7B, las placas FlAG-positivas en la población, se incrementaron gradualmente durante el paso, alcanzando cerca del 90% para el quinto paso. Este resultado muestra que un virus con 8 segmentos (aún aunque el gen NA truncado no codifica una sialidasa funcional) , crece mejor que un virus con 7 segmentos.

El ARN viral es importante para el crecimiento viral eficiente. Para determinar si una proteína NA truncada o ARN viral es importante para la replicación viral eficiente, se construyó un gen NAFLAGM (-), el cual carece tanto del codón iniciador de NA como de otro codón ATG en estructura (el codón decimoquinto) (Figura 6A) . Las placas producidas por el virus NAFLAGM (-) no fueron detectadas por el anticuerpo anti-FLAG, indicando que la proteína no fue traducida. Para asegurar que el virus NAFLAGM (-) posee el gen NAFLAGM (- ) , la hibridación in sítu se realizó en placas producidas por este virus usando una sonda específica de la secuencia FLAG. Estas placas se hacen reaccionar con la sonda, confirmando la presencia del gen NAFLAGM (-) en este virus . La habilidad replicativa de este virus entonces se comparó con el virus de 7 segmentos descritos anteriormente . El porcentaje de placas etiquetadas con la sonda específica de la secuencia FLAG se incrementó gradualmente (Figura 7B) , y casi 80% de las placas llegaron a ser positivas a la secuencia FLAG por el quinto paso (Figura 7A) . No hay-reversión en aquellos que expresan la proteína NA truncada durante el paso, como se demuestra por la carencia de teñido con el anticuerpo anti-FLAG. De este modo, el ARN viral mismo, parece jugar un papel importante en la replicación viral eficiente, aunque la proteína NA truncada puede también jugar un papel- en la replicación viral eficiente, puesto que la relación en la cual el NAFLAGM(-) llega a ser dominante en la infección combinada, es más lenta que aquella del virus NAFLAGWT .

Una señal de empaquetado del ARN viral NA se extiende en la secuencia codificante. Aún después del paso extensivo del virus CK2-29 y E17E (Hughes et al., 2000), el gen NA truncado se mantuvo, sugiriendo que la señal para la incorporación del ARNv en viriones (es decir, señal de empaquetado) , está presente en la región codificante del segmento de ARN de NA. Para probar esta hipótesis, se insertó una secuencia codificante eGFP en el gen NA truncado en estructura, en donde la secuencia de NA se suprimió. De este modo, este gen recombinante, designado NA- (183) GFP (157) , posee el extremo no codificante del 3' del ARNv de NA y 61 codones de la región codificante NA N-terminal, una región codificante eGFP, y 185 nucleótidos del extremo del 5' de ARNv de NA. Se preparó un virus que posee el gen ??- (183) GFP (157) , en lugar del gen NA de tipo nativo correspondiente, y se realizaron ensayos de placas (Figura 8A) . Arriba del 90% de las placas que expresan eGFP, indica que el gen NA- (183) GFP (157) se incorporó en los viriones y se mantiene durante la replicación viral (Figura 8B) . Este hallazgo fue interesante, considerando que la secuencia CAT flanqueada por las secuencias no codificantes NS, no se mantuvo por más de 5 pasos (Luytjes et al., 1989) . Debido a la diferencia entre NA- (183) GFP (157) y los constructos CAT en la presencia de la secuencia codificante viral, se generó un gen similar al constructo CAT, NA(0)GFP(0), que contiene la secuencia codificante eGFP flanqueada por las regiones no codificantes NA 3' y 5'. Este constructo carece de la secuencia codificante NA. Aunque el virus generado con este gen produce placas, solamente una población menor de placas (0.1%) tiene una o dos células que expresan eGFP, indicando que el gen NA(0)GFP(0) no se mantiene en el virus durante la replicación viral . En las células 293T transfectadas con plásmidos, que incluyen una que expresa el gen NA(0)GFP(0) para producción viral, el eGFP se expresa a una extensión menor, comparada con aquellas transfectadas con el plásmido que expresa NA(61) GFP. La cantidad de plásmido Poli para NA(0)GFP(0), se incrementó por 10 veces, resultando en un número similar de eGFP que expresa células 293T, como células transfectadas con el plásmído Poli para NA(61)GFP. Aún con la cantidad superior de 10 veces del plásmido Poli para este gen, solamente 1% de las placas producidas por el virus NA(0)GFP(0) contienen células positivas eGFP, y solamente unas cuantas células en estas placas expresan eGFP. Estos resultados indican que la señal de empaquetado del ARN de NA viral, se extiende en la secuencia codificante NA. La función de los segmentos de ARN en la producción eficiente del virión. Para entender porqué un virus con 8 segmentos de ARN crece menor que uno con 7 segmentos, se comparó la producción de virión infeccioso entre los virus que poseen 6, 7 u 8 segmentos virales de ARN (Figura 9) . Para producir un virus de 8 segmentos, se transíectaron células 293T con plásmidos de expresión de proteína para todas las 9 proteínas estructurales y 8 plásmidos Poli para la producción normal de virus. También, se usó un plásmido Poli de NS, el cual tiene dos mutaciones que eliminan la producción de NS2 ,-de este modo, el virus producido de células 293T no se somete a múltiples ciclos de replicación. Además, se usaron los plásmidos HA y NA de Poli que tienen mutaciones que eliminan la producción de proteínas HA y NA, respectivamente, de manera que el efecto de la eliminación de los segmentos del gen está restringido solamente al segmento de ARN, no al producto del gen. Para la producción de un virus de 7 segmentos, se eliminó el plásmido Poli para el gen NA, sin embargo, se incluyó un plásmido para la expresión de la proteína NA. Para preparar un virus con 6 segmentos, se omitieron los plásmidos para los ARN de HA y Na, sin embargo, se incluyeron los plásmidos para la expresión de las proteínas HA y NA. Para comparar la producción de virión entre estos virus, se tituló el número de viriones infecciosos producidos a partir de células transíectada's con plásmidos, infectando células RCMD · con estos virus y células infectadas inmunomanchados con anticuerpo anti-WSN, 48 horas posteriores a la infección. Como se muestra en la Figura 9, la eficiencia de la producción de viriones infecciosos se correlacionó con el número de segmentos de ARN virales ; superior el número de segmentos ARN virales, mejor la producción de virión. Estos resultados indican el papel de los segmentos de . ARN virales en las producciones de viriones eficientes.

El extremo 3 ' del ARNv de NA es importante para su empaquetado en viriones. Para restringir la señal de empaquetado en ARNv de NA, se prepararon virus que tienen genes NA truncados con supresiones adicionales en la región codificante al 3' o 5' (sentido ARNv) (Figura 8A) . Aproximadamente 40% de las plaquetas producidas por el virus NA- (183) GFP (0) , el cual carece del término 5' de la región codificante NA, expresaron eGFP, mientras solamente 1.8% de las placas producidas por el virus NA0G185, las cuales carecen del término 3' de la región codificante NA, expresan eGFP. Estos datos indican que el término 3' de la región codificante ARNv de NA, es importante para el empaquetado del virión (Figura 8) .

Discusión Haciendo constructos de supresión, se determinó la región codificante de NA, la cual resulta en la incorporación del segmento de MA en viriones . Ambos términos de las regiones codificantes se encontraron ser importantes, pero el término 3' del ARNv que corresponde al término 5' de la región codificante NA, fue más secuencial que el otro término. Para el segmento de NS, el término 3' de ARNv que corresponde al término 5' de la región codificante de NS, parece más importante que el otro término para la incorporación (Figura 22) . Por el contrario, para los segmentos HA, M, y NP, ambos términos son importantes, y para PB2 , el término 5' del ARNv correspondiente al extremo 3' de la región codificante PB2 es importante. Estos resultados muestran que las secuencias importantes para la incorporación del segmento de ARNv, están ubicadas en las regiones codificantes, y son por lo tanto, únicas a cada segmento.

Posiblemente, aquellas regiones interactúan con otros ARN virales por apareamiento de bases, conduciendo al reclutamiento de una serie de 8 segmentos de ARNv en un vírión. Puesto que la interacción entre el ARNv y los componentes virales es específica del virus, tal interacción puede 'ser un objetivo para el desarrollo de compuestos virales . Ejemplo 3 Para obtener una imagen verdadera de los contenidos virales, se realizó tomografía por microscopio del electrón (Figura HA) . Se colectó una imagen de viriones con un espesor de 50 nm. Después, se condujo un análisis de uno de' los viriones y se reconstituyeron las imágenes en 3D del contenido de virión. Las estructuras (barras) dentro de la partícula, están coloreadas para distinguirlas entre cada estructura (Figuras 11B-F, mostrando vistas desde la parte superior, lateral e inferior) . La mayoría de las vistas para las barras están cortadas, sin embargo, para una vista, en la cual las barras están cortadas a través de la mitad, se muestra la molécula completa. Sin embargo, todas las vistas muestran interacciones inter-barras . Basados en los resultados resumidos anteriormente, que incluyen datos los cuales soportan cada uno de tales segmentos virales, contienen una secuencia única que es importante para la incorporación en viriones, lo cual probablemente . contribuye a la formación de las características morfológicas únicas de los contenidos virales, los segmentos de ARNv son probablemente incorporados de manera selectiva en los viriones de la influenza. De este modo, la información es empleada no solamente para identificar objetivos para el desarrollo de compuestos antivirales, sino también para la preparación de vacunas vivas atenuadas como ruptura molecular de interacciones específicas del virus que pueden inhibir la replicación viral y conducir a la atenuación. Ejemplo 4 Materiales y Métodos Células. Se mantuvieron células embriónicas de riñon humano 293 y células COS-7 en medio esencial mínimo Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) , con suero bovino fetal al 10% y antibióticos. Se hicieron crecer células caninas de riñon Madin-Darby (RCMD) , en MEM con suero bovino recién nacido al 5% y antibióticos. Las células se mantuvieron a 37 °C en C02 al 5%. Construcción de plásmidos. La generación de constructos de plásmidos para la producción de ARN viral (referido como pPolI) , que contiene los genes HA de virus A/ SN/33 (H1N1) de tipo nativo (nombrado como pPolI-WSN-HA) y B/Lee/40 (pPolI-B-HA) de tipo nativo, flanqueados por el promotor de polimerasa I de ARN humano y ARN de ratón, el terminador de . polimerasa I, se describen en Neumann et al. (1999) . Se produjo una serie de constructos pPolI de HA quimérico A/B, por amplificación de RCP con cebadores y polimerasa ProofStart (QiAGEN) y subsecuente ligación usando constructos de HA de tipo nativo (Figura 13) . Todos los constructos fueron secuenciados para asegurar que no fueran incluidas las mutaciones no deseadas. Ensayos biológicos de HA expresados en cultivos celulares . Se transfirió cada constructo pPolI de HA quimérico A/B (1 µg) , en células COS-7 usando reactivo Trans IT (Mirus) , junto con los otros cuatro plásmidos a base de pCAGGS (1 µg de cada uno), que expresan tres subunidades de polimerasa (PA, PBl y PB2) y la nucleoproteína (NP) del virus A/WSN (Neumann et al., 1991). 48 horas después de la transfección, se . trataron células con sialidasa de Vibrio choleras (10 U/ml) y TPCK-tripsina (2.5 µg/ml) a 37°C por 30 minutos. Entonces se fijaron células con paraformaldehído al 4% e inmunomanchado usando anticuerpo anti-B/HA y un kit de detección ABC comercial (Laboratorio Vector) .' También, se realizaron ensayos de hemadsorpción para valorar las propiedades de enlace del receptor de cada HA. Brevemente, se incubaron células transfectadas en una suspensión de células rojas de la sangre de pollo al 1% en salina amortiguada de fosfato (PBS) a temperatura ambiente por 30 minutos, y después se lavó 5 veces antes de la observación.

Adicionalmente, se llevaron a cabo ensayos de fusión. Brevemente, se incubaron células transfectadas en amortiguador HEPES (pH 5.0) a 37 °C por 5 minutos, seguido por incubación en medio de cultivo por 7 horas. Después de la fijación con metanol frío, las células fusionadas fueron inmunomanchadas como se describe anteriormente. Genética inversa. Se generaron virus por sistemas genéticos inversos basados en plásmidos A/WSN o B/Lee, como se describe en Neumann et al. (1999) . Se designaron virus con genotipos de tipo nativo producidos a partir de plásmidos como A/WSN-R o B/Lee-R, respectivamente, y se usaron como controles para comparación. Para producir virus quiméricos A/B, se usaron constructos Poli HA quiméricos, en lugar de pPolI- SN-HA. Virus producidos a partir de células 293T fueron biológicamente clonados, limitando la dilución una vez y se produjeron soluciones bases de virus en células RCMD. Infección experimental . Para probar la patogenicidad de los virus, ratonas de cuatro semanas de edad BALB/c, anestesiadas con sevoflurano, fueron infectadas intranasalmente con virus quiméricos A/B o de tipo nativo (105 TCIDSo/50 µ?) . Se monitorearon la mortalidad y pesos corporales por 14 días después de la infección. Tres días después de la infección, algunas de los ratonas infectadas fueron eutanizadas para la determinación de tituladores de virus en órganos .

Para, evaluar la eficacia de la vacuna de cada uno de los virus quiméricos contra el tipo nativo estimulado, fueron infectados intranasalmente ratones con virus quiméricos o de tipo nativo (105 TCID50/50 µ?) . Tres semanas después, se eutanizó un grupo de ratones para obtener suero y la traquea nasal se lavó para detectar anticuerpos IgA o IgG específicos del virus . Cuatro semanas después de la infección, los ratones restantes fueron estimulados intranasalmente bajo anestesia con 50 LD50 del virus de tipo nativo (B/Lee-R) y se monitorearon para determinar la mortalidad y peso corporal por 14 días. Detección de anticuerpos específicos de virus. Se examinaron muestras de suero y lavados de traquea nasal para el anticuerpo IgA o IgG por un ensayo inmunosorbente ligado a la enzima (ELISA) como se describe en ida et al. (1982). También se examinaron anticuerpos HI usando muestras de suero siguiendo el tratamiento con la enzima que destruye al receptor (RDEII: Denka Sieken) . Resultados Construcción de genes HA quiméricos A/B. Para determinar la compatibilidad de HA tipo B con los componentes virales tipo A, se construyeron una serie de genes quiméricos entre los genes A/WSN y B/Lee (Figura 14) . Puesto que las secuencias no codificantes en ambos de los términos de los segmentos de ARN son probablemente intercambiables entre los virus de tipo. A y B para la transcripción y replicación del AR (Crescenzo-Chaigne et al., 1999; Desselberg et al., 1980; Muster et al., 1981), se preparó un gen HA quimérico que contiene las secuencias no codificantes del virus de tipo A y la secuencia codificante completa del virus de tipo B (Figura 14A, A BH) . Este constructo podría producir la proteína HA de tipo B intacta. Después, se preparó un gen quimérico en el cual la región de secuencia de señal de la secuencia codificante HA de tipo B y las secuencias no codificantes se cambiaron a aquellas del virus tipo A (A SBH) . Este constructo podría también producir el HA de tipo B intacto, después de la remoción del péptido señal de tipo A por la peptidasa de señal celular. De manera similar, se preparó un gen quimérico en el cual la transmembrana que codifica la secuencia y las regiones citoplásmicas del HA se cambiaron del tipo B al tipo A (ANTBH) , de este modo, codificando una proteína HA quimérica A/B. Se preparó otro gen quimérico en el cual las secuencia que codifican tanto la señal como las regiones de la transmembrana/citoplásmicas, se cambiaron del tipo B al tipo A (A STHB) . Este constructo podría producir la misma proteína HA quimérica como ANTBH después de la remoción del péptido señal. Además, se preparó una quimera que contiene todas las secuencias corriente arriba de la región que corresponde al sitio de desdoblamiento del tipo B y la región corriente abajo del virus del tipo A en la secuencia que codifica HA (A BW) . Este constructo podría producir una proteína HA quimérica que comprende la región HA1 del virus de tipo B y la región HA2 del virus de tipo A. Finalmente, se prepara un gen quimérico en el cual se cambia la secuencia señal del tipo B al tipo A dentro del constructo ANBW, el cual podría resultar en la misma protexna HA quimérica como ANBW. Propiedades biológicas de los HA quiméricos A/B expresados en cultivos celulares . Para evaluar la funcionalidad de los HA quiméricos, se transfirió cada constructo de HA pPolI en células COS-7, con el virus tipo A PA-, PB1-, PB2-, y plásmidos que expresan NP. Todos los constructos HA quiméricos se expresaron en la superficie celular. Para probar las actividades de enlace al receptor de estos HA, se realizó el ensayo de hemadsorpción. Previo al ensayo, se trataron células transfectadas con sialidasa bacteriana para remover el ácido siálico terminal en cadenas laterales de oligosacáridos de HA, lo cual podría interferir con su actividad de enlace al receptor (Luo et al., 1999) . ANBH-, ANSBH-, ANTBH, y ANSTBH- expresan células hemadsorbidas , mientras aquellas que expresan las otras dos (ANBW y ANSBW) no (Tabla 3) . De manera similar, el HA formador induce fusión celular, mientras la última no. Estos resultados indican que las quimeras HA formadoras fueron biológicamente funcionales, mientras las dos últimas no, presumiblemente debido a alteraciones estructurales . Como se anticipa de reportes previos, el HA de tipo B se produjo del segmento HA de tipo B nativo intacto por el complejo de polimerasá tipo A y NP (Tabla 3), confirmando la compatibilidad entre las estructuras promotoras tipo B y el complejo de polxmerasa de tipo A.

Tabla 3. Propiedades de HA quiméricos A/B expresados en células y virus que los poseen. 5 a) Cada constructo HA se transfectó en células COS-7 junto con polimerasa tipo A y plásmidos que expresan NP. A 48 horas después de la transfección, se ensayaron propiedades biológicas en cada HA. b> Se realizó la generación de virus que posee el gen HA quimérico o tipo nativo junto con otros genes de virus de influenza A por sistemas genéticos inversos basados en plásmidos. A 48 horas después de la transfección, se cosechó el sobrenadante de las célullas 294T transfectadas y se titularon para determinar la infectividad c) Se preparó solución base de virus con células RCMD . El virus se cosechó cuando los efectos citopáticos se advirtieron. * NA: no disponible. 20 Producción de virus con HA quiméricos . Para determinar si los genes HA quiméricos funcionan durante la infección del virus de la influenza A, se preparó un virus mutante WSN, en el cual, se reemplazó el gen HA con un gen quimérico HA A/B . La genética inversa a base de plásmidos, permitió la generación de virus de tipo nativo con un titulador de aproximadamente 107TCID50/ml (Tabla 3) . Cuando el pPolI-B-HA se empleó en lugar de pPolI-WSN-HA, no se generó virus infeccioso. Los cuatro constructos HA quiméricos que fueron biológicamente funcionales (Tabla 3) , fueron exitosamente rescatados en el virus infeccioso tipo A, aunque a eficiencias diferentes, juzgado por tituladores de virus en los sobrenadantes de las células transfectadas con plásmidos . Los virus que poseen el HA de ANBH, replican solamente de manera marginal, mientras el virus con el A STHB de HA se produjo a eficiencia más alta y creció a más de 106TCID50/ml . Los otros dos genes HA quiméricos que no expresan proteínas biológicamente funcionales, no soportan el crecimiento viral. Los virus quiméricos A/B son designados como virus ANBH, ANSBH, ANTBH, y ANSTBH. Para confirmar que los virus los cuales se produjeron verdaderamente contienen el ectodominio HA de tipo B, se infectaron células RCMD con estos virus y se probaron para determinar su reactividad con anticuerpos al HA del virus de tipo A o B (Figura 14) . Células infectadas con virus que contienen constructos HA quiméricos, se hicieron reaccionar con anti-B/HA, así como también anticuerpos anti-A/NP, pero no con anticuerpo anti-A/HA, confirmando que estos virus contienen ectodominios HA de tipo B.

Características de crecimiento de virus quiméricos A/B en cultivos celulares. Para determinar las propiedades replicativas de los virus quiméricos HA A/B, se infectaron células con los virus a una MOI de 0.01 y los virus resultantes se examinaron para determinar su cinética de crecimiento (Figura 15) . Aunque ninguno de los virus con los HA quiméricos crece mejor que los virus A de tipo nativo, los virus quiméricos ANSTBH y A TBH crecen cercanamente a 10sTCIDSo/ml . Distinto de los virus tanto tipo A como B, todos estos virus quiméricos formaron plaquetas de posición observada, las cuales podrían ser detectadas solamente con inmunomanchado (datos no mostrados) .

Replicación de los virus quiméricos A/B en ratones. La replicación restringida de los virus quiméricos A/B en cultivo celular, sugiere que estos virus pueden ser atenuados in vivo. Por lo tanto, se inocularon ratones intranasalmente con virus quiméricos de HA A/B (105TCID5Q/50 µ?) . No se probó el virus ANBH puesto que el titulador de la materia fue bajo también (aproximadamente 103TCID5o/ml) . Ninguno de los otros virus quiméricos probados fueron letales a los ratones, mientras la misma dosis del virus de tipo A nativo mató a todos los ratones infectados, mientras la misma dosis del virus tipo B nativo, mató a siete de ocho ratones infectados (Tabla 4) . Se recuperaron virus quiméricos de pulmones y turbinatos nasales al día 3 posterior a la inoculación, indicando que estos virus se replicaron en ratones. De manera interesante, la replicación de los virus quiméricos fue más restringida en pulmones y menos restringida en turbinatos nasales, cuando se comparan con aquellos virus de tipo nativo. Esto sugiere un posible enlace entre el nivel de replicación del virus en pulmón y letalidad. Ratones infectados con virus quiméricos ANTBH y ANSTBH perdieron peso aunque a una extensión menor comparados con aquellos con los virus de tipo A nativos. En conjunto, estos datos indican que los virus quiméricos de HA A/B, son atenuados en ratones. 5 Tabla 4. Patogenicidad de virus quiméricos A/B en ratones. 10 15 a) Se inocularon ratones intranasalmente con virus (106 TCIDso ) v se monitorearon por 14 días. El cambio de peso corporal se expresó como valor medio + desviación estándar (SD (n=3). b> Se determinaron tituiadores de virus en órganos a 3 días después de la inoculación y se expresaron como valor medio + SD (n=3) de logioTCIDso lg. c) NA: no disponible. ?) Se inocularon falsamente los ratones de control con salina amortiguada de fosfato (PBS).

Protección de ratones inmunizados con los virus quiméricos HA A/B después de la infección del virus de tipo nativo . Puesto que los virus quiméricos HA A/B expresan un ectodominio de HA, esto es derivado del virus de tipo B, se anticipa que estos virus proporcionan una respuesta inmune protectiva a la infección del virus de tipo B nativo. Previo a los experimentos de estimulación, se determinó si los anticuerpos anti-B son estimulados en ratones después de la infección con los virus quiméricos. A tres semanas posteriores a la incubación, se detectó IgA específico del virus tipo B en muestras de lavados nasales/traqueales y anticuerpos IgG en muestras de suero, a partir de ratones infectados con virus quiméricos por una prueba ELISA (Figura 16) . Se detectaron también anticuerpos HI en muestras de suero de ratones infectados con el virus quimérico HA A/B (Figura 16B) . De este modo, se demostraron las respuestas anticuerpo especificas en todos los ratones infectados con los virus quiméricos, aunque el virus ANSBH estimuló una respuesta inmune menos eficiente. Ratones inmunizados del virus quimérico fueron estimulados con 50LD50 del virus tipo B nativo, 4 semanas posteriores a la inmunización (Tabla 5) . Todos los ratones sobrevivieron después de la estimulación, mientras todos los ratones inmunizados falsos de control, murieron y solamente 3 de 8 ratones inmunizados con el virus WSN a una dosis subletal (103TCID50) sobrevivieron después de la estimulación con el virus de tipo B nativo, indicando un efecto protector especifico de la inmunización del virus quimérico contra la infección del virus tipo B nativo. Además, el virus tipo B no se recuperó de los turbinatos nasales o pulmones de ratones preinmunizados con virus quiméricos, con la excepción de un ratón que recibió el virus ANSBH 3 días después de la estimulación (datos no mostrados) .

Tabla 5. Protección de ratones inmunizados con virus quiméricos A/B contra virus tipo B nativo estimulados Virus usado Post-estimulados para Cambio de peso corporal Relación de supervivencia inmunización'a) (%) Dia 5 Día 14 (No. de sobrevivientes/no . de muertes) Virus tipo nativo A/WSN-R -17.5+3.6 Nac) 25 (2/8) B/Lee-R 1.8±0.9 1. , 4±0. 6 100 (8/8) Virus quimérico A/B ANSBH -5.6±0.8 -0 .7±0 .7 100 (8/8) ANTBH 0.9+0.9 1. ,9±0. 9 100 (8/8) ANSTBH 1.5±0.2 2. 9±0. 7 100 (8/8) Control (PBS)d! -20.810.5 NA 0(0/8= a> Se infectaron intranasalmente ratones con cada virus listado b) Cuatro semanas después de la inmunización, los ratones se estimularon intranasalmente con virus tipo B/Lee-R nativo (5OLD50) y se monitorearon por 14 días después de la estimulación. El cambio de peso corporal se expresó como valor medio ± SD(n=3) . c) NA: no disponible d) Se inmunizaron falsamente ratones de control con PBS y se estimularon.

Discusión Cómo se describe aquí, para -la primera vez, se generó un virus de la influenza el cual posee el tipo B, en lugar de A, HA en el antecedente del virus de tipo A, de este modo, posee proteínas virales tanto A como B. ¿Que es esencial para la generación de los virus quiméricos de HA BA/B? Los genes quiméricos deben ser transcritos y replicados para ser mantenidos en los viriones . Aunque conservados entre el mismo tipo de virus, secuencias terminales en ambos extremos de las regiones no codificantes, las cuales contienen secuencias promotoras necesarias para la transcripción y replicación den ARN (Luytjes et al., 1989), difieren entre los segmentos de ARN de tipo A y B (Crescenzo-Chaigne et al., 1999) Desselberg et al., 1989). Sin embargo, un estudio previo ha mostrado que un gen reportero flanqueado por la secuencia no codificante del segmento SN de virus tipo B, fue transcrito y replicado por una polimerasa tipo A (Muster et al., 1991). Además, se produjo un virus quimérico de la influenza A/B (NA/B-NS) , que contiene un gen quimérico que comprende la secuencia codificante del NA de virus tipo A y la secuencia no codificante del NS de virus tipo B (Muster et al., 1991) . Estos datos indican que el complejo de polimerasa tipo A, reconoce la secuencia promotora del gen NS tipo B, aunque a una extensión menor que el promotor homólogo de los genes del virus tipo A. La secuencia no codificante de cada segmento de ARN incluye dos regiones estructurales : secuencias terminales que son conservadas entre todos los ocho segmentos de ARN y las secuencias específicas del segmento interno. Puesto que la actividad promotora está determinada principalmente por la región formadora (Pórtela et al., 1999), todos los segmentos del gen tipo B son probablemente transcritos y replicados por el complejo de polimerasa de tipo A. En efecto, este concepto está soportado por datos que muestran que el HA de tipo B se expresó en células transíectadas con pPolI-B-HA que contiene regiones no codificantes de tipo B y complejos de polimerasa de tipo A y plásmidos que expresan NP (Tabla 3) . De este modo, el fracaso para generar un virus que contiene un segmento HA tipo B intacto, es decir, un reafirmador intertipico HA, no puede ser explicado por la carencia de transcripción y replicación de ARN. La restricción de la generación del virus quimérico puede originar al nivel del segmento de ARN, incorporación en viriones; para la generación de virus, el segmento quimérico debe ser empaquetado en viriones . Aunque la región no codificante del segmento. NS de tipo A se reportó por contener una señal de empaquetado de ARN (Luytjes et al., 1989), el mecanismo de empaquetado de los segmentos del ARN del virus de la influenza no ha sido completamente elucidado. Las secuencias o características estructurales de los segmentos de ARN requeridos para la incorporación del virión, fueron ampliamente desconocidas; sin embargo, se ha mostrado recientemente, que el segmento ARN de NA de tipo A, posee sus señales de incorporación al virión a ambos extremos de las regiones codificantes (Fugii et al., 2002 y Ejemplo 2). En este estudio, el virus ANSBH se replicó más eficientemente que el virus ANBH (Figura 14 y Tabla 13) . Puesto que las proteínas HA expresadas en estos dos virus deben ser idénticas, la diferencia en la eficiencia de replicación puede resultar de la eficiencia de empaquetado de ARN. Esto es, una característica estructural requerida para que el empaquetado eficiente de ARN pueda existir en la región que codifica la secuencia señal del HA. De manera similar, esto puede también explicar la diferencia en la eficiencia replicativa entre los virus ANTBH y ANSTBH, los cuales también expresan proteínas HA idénticas. En efecto, las señales de empaquetado para el segmento HA de tipo A, residen en ambos extremos de las regiones codificantes (datos no publicados) . De manera interesante, un gen NA quimérico que contiene las secuencias no codificantes del NA de virus de tipo nativo y la secuencia codificante del NA de tipo B, no se rescató en el virus tipo A (G ate et al., 1999) . Esta característica puede, ser explicada por la carencia de una región codificante NA de tipo A que contiene una señal de empaquetado de ARN, consistente con , el hallazgo reciente mencionado anteriormente (Fujii et al., 2002). También pueden ser críticas interacciones al nivel de la protexna por la generación de virus quiméricos HA A/B; las proteínas quiméricas pueden ser empaquetadas en viriones y deben ser funcionales para la replicación del virus. La proteína NA de tipo B suministrada en trans, puede reemplazar la función de un NA tipo A y ser incorporada en los viriones tipo A, soportando ciclos múltiples de replicación de un virus tipo A defectivo de NA en cultivos celulares (Ghate et al., 1999). Sin embargo, como se discute anteriormente, no se generó un virus tipo A que contiene NA de tipo B. Aunque se generaron virus HA A/B quiméricos, fueron atenuados comparados con el virus de tipo nativo. Esta atenuación puede originarse de un balance subóptimo entre la actividad de enlace al receptor del HA de tipo B y la actividad de sialidasa de NA de tipo A. Además, el reemplazo del péptido señal y/o dominios de la transmembrana/citoplásmicos en el HA, puede haber alterado su estructura. Por ejemplo, los dominios de la transmembrana/citoplásmicos en HA, pueden interactuar con otros componentes virales tales como MI, conduciendo al montaje de virión eficiente (Ali et al., 2000; Cenami et al., 1996; Jin et al., 1997; Zhang et al., 2000). De este modo, la inhabilidad para generar el virus de tipo A que posee segmentos ARN de tipo B intactos o viceversa, puede ser explicada por restricción al nivel de incorporación del segmento de ARN o al nivel de interacción funcional de las proteínas o ambos. Los virus quiméricos HA A/B, fueron atenuados en ratones con replicación restringida en pulmón y confirieron inmunidad protectiva a ratones contra la infección del virus de tipo B nativo, sugiriendo un nuevo procedimiento para el desarrollo de vacunas de la influenza. Actualmente, la administración subcutánea de vacunas de la influenza inactivadas trivalentes es el estándar de la red mundial y sus eficiencias son subóptimas . Esto es principalmente debido a la inducción insatisfactoria de inmunidad mucosal en el tracto respiratorio superior, en donde el virus de la influenza invade inicialmente (Wavening et al., 2001). De este modo, estas vacunas no previenen la infección viral, aunque disminuyen la severidad del padecimiento. Distintas de las vacunas inactivadas, las vacunas vivas inducen respuestas inmunes a las células T mucosales y citotóxicas . El estudio descrito aquí, sugiere que la manipulación quimérica del gen HA podría controlar la atenuación del virus a varios grados.

De este modo, este procedimiento podría permitir la producción de cepas de vacunas vivas con un balance apropiado entre la atenuación e inmunogenicidad. Alternativamente, los HA quiméricos A/B pueden ser incorporados en el virus de. la influenza A adaptado al frío, cuyas mutaciones atenuantes están bien caracterizadas (Maassab et al., 1999). Las vacunas adaptadas al frío actuales, son mezclas de virus de tipo A y tipo B. Potencialmente, la interferencia entre los dos virus afecta la eficacia de la vacuna, aunque este problema ha sido dirigido por el ajuste de la relación de dosis virales. Un virus de tipo A con el HA quimérico A/B, podría permitir la producción de vacunas vivas de la influenza basadas en un virus único atenuado, preferentemente dos virus atenuados, eliminando la interferencia potencial entre los virus tipo A y tipo B. De este modo, contrario a una vacuna atenuada viva que tiene una mezcla de virus tipo A y B, con información limitada en la atenuación de mutaciones para la cepa de vacuna tipo B, se puede producir un virus que contiene HA y NA de tipo B en el antecedente del virus tipo A. Este procedimiento permite la producción de vacunas basadas en una cepa de vacuna principal, con atenuación de mutaciones bien definidas para la expresión del HA y NA de tipo A también como de Tipo B. Sin embargo, el conocimiento de las señales de empaquetado para segmentos virales, también promueve el desarrollo de vacunas de la influenza atenuadas vivas, mej oradas .

Ej emplo 5 Materiales y Métodos Células y virus . Células embriónicas de riñon humano 293T (un derivado de la línea 293 en el cual se insertó el gen para el antígeno del virus 40 T de simio) , fueron mantenidas en medio de Águila modificado de Dulbecco, suplementado con suero bovino fetal al 10% (FCS) . Para células de riñon de hámster bebé (BH ) , de ovario de hámster Chino (CHO) , y caninas de riñon Madin-Darby (RCMD) , se usaron, respectivamente, DMEM que contiene FCS al 5% y MEM que contiene suero de bovino recién nacido al 10% y 15%. Todas las células se mantuvieron a 37 °C en C02 al 5%. Se 'generó el virus A/WSN/33 (H1N1) (WSN) por genética inversa como se describe en Neumann et al. (1999) y se propagó en células RCMD. La cepa indiana VSV generada por genética inversa, se propagó en células BHK.

Genética inversa. Para la generación de partículas similares al virus de la influenza (VLP) y virus mutantes de la influenza A, se usaron plásmidos que poseen el ADMc de genes virales WSN bajo el control del promotor de polimerasa I de ARN humano y terminador de polimerasa I de ARN de ratón (referido como plásmidos Poli) , y el vector de expresión de proteína eucariótica pCAGGS/MCS (controlado por el promotor ß-actina de pollo) . Brevemente, los plásmidos Poli y los plásmidos de expresión de la proteína, se mezclaron con un reactivo de transfección, Trans IT LT-1 (Panvera, Madison, WI) , se incubaron a temperatura ambiente por 15 minutos, y se cargaron 1 x 10s a células 293T cultivadas en Opti-MEM I (GIBCO/BRL) . Seis horas después, la mezcla de reactivo de transfección de ADN se reemplazó con Opti-MEM I que contiene BSA al 0.3% y 0.01% de FCS . Cuarenta y ocho horas después, se cosecharon VLP o virus mutantes de la influenza A en el sobrenadante. Los transfectantes generados en este estudio, todos contienen un segmento de ARNv de HA mutante, junto con otros segmentos de ARNv del virus WSN y son designados por el nombre del segmento de ARNv de HA mutante (por ejemplo, un VLP que contiene el segmento HA (0) GF (0) RN, es designado el HA(0)GFP(0) VLP) .

Construcción de plásmidos. Se usó pPolIH ( 0 ) GFP ( 0 ) , para producir el ARN sentido negativo que contiene la región no codificante del 3' de ARNv de HA, la secuencia codificante complementaria de la proteína fluorescente verde mejorada (GFP, Clontech) , y la región no codificante del 5' de ARNv de HA. Brevemente, el gen GFP se amplificó por RCP con cebadores que contienen los sitios BsniBI y la secuencia no codificante al 3' y 5' de HA, digerida con BsrriBI , y clonada en el. sitio BsmBl del plásmido Poli . La introducción de este plásmido en las células, resulta en un ARN que contiene la secuencia codificante GFP en la orientación sentido negativo, flanqueada por el ARv de HA de las regiones no codificantes al 5' y 3' . Se elaboró pPolIH (458) GFP (513) como sigue: pPolIHA para la producción de ARNv de WSN, fue amplificado primero por RCP inversa, usando cebadores adosados Bam500R (5'-GCGGATCCTCCCCTATGGGAGCATGATAC-3' ; SEC ID NO: 6) y Xbal218F (5' -GCTCTAGAAACTCTGTTATCGAGAAAATG-3' ; SE ID NO: 7). El producto de RCP se digirió con BamHI y Xbal , y después se clonó el gen GFP en el sitio BamHI y Xbal . El plásmido resultante, pPolIHA (468) GFP (513) , se usó para la producción de ARN de sentido negativo, que contiene la región no codificante 3' y 468 bases de la región codificante al 3' de ARNv de HA, la secuencia codificante GFP, 513 bases de la región codificante al 5' y la región no codificante al 5' de ARNv de HA. También se produjeron imitantes de supresión HA por RCP inversa en la misma manera. Los mutantes se designaron de conformidad con el número de nucleótidos derivados de la región codificante HA, por ejemplo, el segmento HA (9) GFP (80) RN contiene la región no codificante HA al 3 ' , 9 nucleótidos a partir de la secuencia codificante HA que corresponde a la región N-terminal, la estructura lectora abierta GFP, . 80 nucleótidos a partir de la secuencia codificante HA que corresponde a la región C-terminal y la secuencia no codificante HA al 5' . Todos los constructos de plásmidos fueron secuenciados para asegurar que no se introdujeron mutaciones indeseadas por RCP. Se produjo por RCP, pPolIHA (0) VSVG ( 0) , el cual se usó para producir ARN sentido negativo, que contiene la región no codificante al 3 ' de ARNv de HA, la secuencia codificante complementaria de V SVG, y la región no codificante al 5' de ARNv de HA. Brevemente, se amplificó el gen VSV G por RCP usando pCAGGS-VSVG como una plantilla y cebadores que contienen los sitios Bs Bl y la secuencia no codificante al 3' o 5' de HA. El producto de RCP entonces se digirió con BsmBI, y se clonó en el sitio BSÍMBI del vector pHH2l. Se elaboró pPolIHA (9) SVG (80 ) , clonando las secuencias de codificación de VSV G en el sitio BamHI y el sitio Xba.1 de pPolIHA(9)GFP (80) . El pPolINA (183 ) GFP (157) , el cual contiene los extremos no codificantes al 3' del ARNv de NA y una secuencia complementaria que codifica una proteína de fusión que posee 61 codones NA N-terminales y GFP, dos codones de detención consecutivos (TAA-TAG) y 185 bases del extremo 5' de ANRv de NA, se produjo como sigue. La región que corresponde a los nucleótidos 203 a 1109 (sentido positivo) del gen WSN NA en pT7Azul-NA, fue primero reemplazada con un sitio Bglll por RCP inversa. El gen GFP fue entonces clonado en este sitio. BglU y el sitio Stul en la posición 1226 (en el gen NA de tipo nativo) en estructura con la proteina NA. El gen NA (183) GFP (157) , entonces se insertó en el sitio BsmBI de un plásmido Poli, pHH21. El pPolINA(183)GFP (157) Met (-) , usado para la producción de NA(183) GFP (157)Met (-) ARN, sentido negativo, el cual carece del codón iniciador para la proteína NA, se generó como sigue. El codón de iniciación ATG y otro ATG en el decimoquinto codón del gen N (183) GFP (157) en pPolINA(183) GF (157) , se cambió a GCG por mutagénesis dirigida al sitio in vitro (GeneEditor, Promega) . El constructo resultante, pPolINA (183 ) GFP (157) Met ( -) , contiene la región no codificante NA al 3' (19 nucleótidos) , 183 nucleótidos correspondientes a la región codificante NA N-terminal, la estructura lectora abierta GFP, dos codones de detención consecutivos (TAA-TAGA) , 157 nucleótidos que corresponden a la región codificante NA C-terminal, y la región no codificante de NA al 5' (28 nucleótidos), bajo el control del promotor de polimerasa I de ARN humano y el terminador de polimerasa I de ARN de ratón.

Ensayo de inmunomanchado . Dieciséis horas después de la infección con VLP de la influenza, se lavaron dos veces células con salina amortiguada de fosfato (PBS) y se fijaron con formaldehído al 3.7% (en PBS) por 20 minutos a temperatura ambiente, seguido por tratamiento con TritonX-100 al 0.1% y se procesaron. Para examinar la eficiencia de la generación de VLP, se incubaron células 10s con 0.1 mi de sobrenadante de cultivo de células 293T transfectadas con plásmidos, y se registró el número de células NP-positivas , como se detectó por el ensayo de inmunomanchado, a las 16 horas posteriores a la infección.

Manchado Western. Se rotaron virus mutantes o VLP descendentemente por 1.5 horas a 50,000 x g a 4°C. El VLP concentrado o virus, fue resuspendido en amortiguador de lisis (0.6 M KC1, 50 mM de Tris-HCl, pH 7.5, Tritón X-100 al 0.5%). Los Usados fueron colocados en geles de poliacrilamida-SDS al 15%, electrotransferidos a una membrana de difluoruro de polivinilideno (PVDF) , se bloquearon durante la noche a 4°C con leche descremada al 5% en PBS, y se incubaron con anticuerpo policlonal de virus anti- SN; anticuerpo monoclonal o anticuerpo monoclonal anti-VSVG por 1 hora a temperatura ambiente . La membrana se lavó tres veces con PBS que contiene Tween-20 al 0.05%. Los anticuerpos enlazados se detectaron con un kit VECTASTAIN ABC (Vector) y kit de inmunomanchado Konica (Konica) .

Hibridación Northern. El APJSTv presente en células 293T transfectadas con plásmidos Poli, se extrajo con el kit de extracción, de AR Isogen (Nippo Gene, Tokio, Japón) a 24 horas posteriores a la transfección. El ARN fue glioxilado en amortiguador de glioxal/DMSO/amortiguador de fosfato a 50 °C por 1 hora y separado por electrofóresis en gel de agarosa al 1.0% en amortiguador de fosfato 10 mM (pH 7.0). El ARN se trazó en membrana de nylon y se sometió a hibridación con la sonda de oligonucleótido complementaria a la secuencia de GFP, (ATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGG; SEC ID NO: 8) (10 pmol) , la cual se etiquetó usando un Kit de Terminación de ADN de Oligonucleótido DIG (Roche) a 37 °C por 30 minutos. La hibridación se hizo usando una sonda GFP en Easy Hyb (Roche) , durante la noche a 42 °C. Las bandas de ARN se detectaron usando el Kit de Detección de Ácido nucleico DIG (Roche) . Brevemente, la membrana hibridizada se lavó con un amortiguador de lavado (0.1M de ácido maléico, 0.15M de NaCl, T een 20 al 0.3% pH 7.5), se bloqueó con Reactivo de Bloqueo al 1% por 30' minutos a temperatura ambiente y se incubó con anticuerpo anti-DIG (1:5000) conjugado con fosfatasa alcalina por 30 minutos a temperatura ambiente. La membrana entonces se lavó con el amortiguador de lavado y se incubó con cloruro de tetrazolio nitroazul/5-bromo-4-cloro-3 -indolil-fosfato (NBT/BCIP) en el amortiguador de detección (0.1 M de Tris-HC1 , 0.1 m de NaCl, pH 9.5), a temperatura ambiente en la oscuridad. Las bandas de ARN fueron detectadas usando el Kit de Detección de Ácido Nucleico DIG (ROCHE) . El ARN de control se extrajo de células 293T transfectadas , falsas.

Propiedades replicativas de virus transfectantes . Se infectaron células BHK, CHO o RCMD en cavidades duplicadas de placas de 24 cavidades, con un virus, sobrepuesto con medio MEM que contiene FCS al 0.01%, e incubadas a 37°C. A diferentes tiempos, se ensayaron los sobrenadantes para virus infecciosos en placas de ensayo en células RCMD.

Resultados Se requirió la región codificante de ARNv de HA para la incorporación del segmento HA en viriones . Para determinar si las regiones codificantes de ARNv de HA son necesarias para su incorporación del virión para ARNv de NA, se construyeron dos plásmido's : pPolI (0) GFP (0) que contiene solamente las regiones no codificantes 3' y 5' de ARNv de HA de la secuencia codificante GFP, y pPolIHA (468 ) GFP (513) , en el cual se insertó la .secuencia codificante en el gen HA en estructura, después de suprimir la secuencia HA en las posiciones de nucleótidos 500-1218 (en orientación de sentido positivo) (Figura 17) . El último constructo posee la región no codificante HA de 3 ' (33 nucleótidos), 468 nucleótidos que corresponden a la región codificante N-terminal, la estructura lectora abierta con un codón de detención, 513 nucleótidos que corresponden a la región codificante HA C-terminal, - y la región no codificante HA al 5' (45 nucíeótidos) . La proteína de fusión resultante contiene 156 aminoácidos N-terminal de HA y la secuencia GFP completa. Para generar VLP que poseen estos mutantes de ARNv HA, se transfectaron células 293T con pPollHA (0) GFP (0) o pPolIHA(4S8) GFP (513) , y 7 plásmidos Poli de ARN para la producción de los segmentos de ARN viral de la influenza restantes y plásmidos de expresión de proteína para nueve proteínas virales (es decir, PA, PB1, PB2 , NP, HA, NA, MI, M2 , y NS2) . Cuarenta y ocho horas posteriores a la transfección, los VLP en los sobrenadantes de cultivos de células 293T, se cosecharon y usaron para infectar células RCMD. Puesto que el VLP resultante posee el mutante HA, expresan GFP y todas las proteínas virales, excepto HA. Consecuentemente, no se generó virus de progenie infecciosa (datos no mostrados) . La eficiencia de la incorporación del virión del ARNv de HA mutante, se determinó dividiendo el número de células que expresan GFP (es decir, el número de VLP que poseen el gen GFP que codifica el segmento) , con aquel de las células que expresan NP (es decir, el número de todos los VLP infecciosos) a 16 horas posteriores a la infección. El titulador de todos los VLP infecciosos en el sobrenadante de cultivo de células 293T transfectadas con pPolIHA(468) GFP (513) (es decir, el número de células positivas NP) fue de 7.4 x 105 VLP infecciosas/ml y el titulador del . VLP que contiene HA (468 ) GFP (513 ) ARN (es decir, el número de células GFP positivas) fue 3.2 x 10s VLP/ml . Estos resultados indican que 42.8% de todos los VLP infecciosos generados albergan ARNv de HA mutante (Figura 18) . Por el contrario, solamente 3.9% de VLP poseen el segmento de ARN HA (0) GFP (0)ARN (Figura 18). Estos resultados sugieren que las regiones codificantes de ARNv de HA son requeridas para la incorporación del segmento HA en los viriones de influenza .

Ambos extremos al 3 ' y 5' de la región codificante de ARNv de HA son importantes para la incorporación del segmento HA en viriones . Previamente, se muestra que el extremo 3' de la región codificante de ARNv de NA juega un papel más crucial en la incorporación del virión que el extremo 5' . De este modo, se determinó si el 3', 5' o ambos extremos fueron importantes para la incorporación del virión del segmento de ARNv de HA. Para dirigir esta publicación, se preparó el gen HA (0) GFP (1011) , el cual carece del término 3' de la región, codificante de ARNv de HA, y el gen HA (966) GFP (0) , el cual carece del término 5' de la región codificante del ARNv de HA (Figura 17) y la incorporación del virión de estos ARNv de HA examinados como se describe anteriormente. Aunque las cantidades de ambos ARNv en células transfectadas con plásmidos fueron comparables con aquellas de HA (468) GFP (513) ARNv (datos no mostrados), la eficiencia de la incorporación del segmento de tanto HA(0) GFP (1011) como HA (966) GFP (0) , fue solamente del 6.8% y 8.4%, respectivamente (Figura 17), indicando que tanto los términos 3' como 50 de la región codificante ARNv de HA, juegan un papel importante en la incorporación del virión del segmento HA. Para definir además la región critica en ARNv de HA por su incorporación en viriones, se generó una serie de VLP, los cuales poseen ARNv de HA truncados con supresiones adicionales en la región codificante al 3' y/o 5' (Figura 17) . Se determinó entonces, la eficiencia de incorporación del ARNv de HA mutante en VLP. Puesto que la supresión adicional en el extremo 3' deja solamente 15 oligonucleótidos y el extremo 5' deja 268 oligonucleótidos, no afecta la eficiencia de la incorporación de ARNv de HA (compare H (468) GFP (513 ) con HA(15) GFP (268) ) , los constructos de supresión adicional fueron preparados usando pPolIH (15) GF (268) , el cual posee 15 nucleótidos del extremo 3' y 268 nucleótidos del extremo 5' de la región codificante HA. Aunque la extensión de la incorporación de ARNv se redujo gradualmente como la extensión de las supresión incrementó, 80 nucleótidos en la región codificante HA de 5' parecen mínimamente requeridos para la incorporación eficiente del virión de ARNv de HA (compare H (15) GFP (80) con HA(15) GFP (75) ) . Análisis de supresión adicional demuestra que el HA(9)GFP(80) que deja 9 residuos de nucleótido de la región codificante HA al extremo 3', resulta en incorporación eficiente al virión de ARNv de HA (más de 65%) , aunque el nivel de HA (9) GFP (80) ARNv presente en células transfectadas , no difiere apreciablemente de aquel de HA (0) GFP (0) ARNv (Figuras 17 y 18) . Estos resultados indican que 9 nucleótidos en el extremo 3' y 80 nucleótidos en el extremo' 5' de la región codificante HA, son requeridos para la incorporación eficiente de ARNv de HA en viriones .

Generación de un nuevo virus tipo A de influenza cuyos genes de HA y NA contienen las secuencias codificantes para genes extraños . Puesto que las secuencias requeridas para la incorporación del segmento HA en virones se ha determinado, se examinó si un gen extraño flanqueado por aquellas secuencias se podría incorporar en los virus de la influenza A y mantener durante el paso repetido. Como un modelo de gen extraño, la secuencia codificante VSV G, se insertó en los sitios Ban I y Xbal de pPolIHA (9) GFP (80) , en lugar de la secuencia GFP. El constructo resultante se designó pPolIHA(9) SVG (80) , que posee la región no codificante HA al 3' (33 nucleótidos), 9 nucleótidos que corresponden a la región codificante HA N-terminal, la estructura lectora abierta- VSV G con un codón de detención (1552 nucleótidos) , 80 nucleótidos que corresponden a la región codificante HA C-terminal, y la región no codificante de HA al 5' (45 nucleótidos) . Como un control, se construyó el vector pPolIHA (0) VSVG (0) , el cual posee solamente las regiones no codificantes 3' y 5', pero no la región codificante del ARNv HA. Dado que la proteina VSV G debe ser substituida por las proteínas HA y NA, la región codificante NA puede ser substituida con un gen extraño. Por lo ' tanto, se construyó · El pPolINA (183) GFP ( 157 ) Met ( - ) para la producción de un segmento de ARN NA recombinante que contiene las secuencias codificantes GFP y las secuencias codificantes NA requeridas para la incorporación eficiente del virión del segmento de NA. En este constructo, el codón de iniciación para la estructura lectora abierta NA se destruyó substituyendo ATG a CGG. De este modo, la estructura lectora abierta GFP podría ser traducida de su propio codón de iniciación. Se transfectaron células 293T con plásmidos para la producción de ambos segmentos recombinantes HA (9) VSVG (80) y NA(183)GFP(157)Met (-) , y los 6 segmentos de ARN viral restantes, así como también los plásmidos para la expresión de las proteínas de polimerasa del virus de la influenza, NP, MI, M2, NS2, y VSV G. A las 72 horas después de la transfección, se cosecharon los sobrenadantes de las células 293T y se realizaron análisis de placas usando células RCMD.

Un virus transfectante que alberga el segmento HA (0) VSVG (80) ARN y el segmento N (183 ) GPP (157) et (-) ARN (designado virus VSVG (HA) GFP (NA) , fue viable y produjo placas que expresan GFP en la ausencia de tripsina (Figura 19) . El inmunomanchado confirmó la expresión de VSV G, pero no HA, que contiene placas (Figura 19) . Células infectadas con el virus VSVG (HA) GFP (NA) , pero no con el virus de control WSN, también expresan GFP. Por el contrario, no se observaron placas cuando se usó el plásmido pPolIH (0) VSVG (0) en lugar de pPolIHA (9) VSVG (80) , aunque células únicas que expresan proteínas GFP y/o NP, se detectaron en células RCMD (datos no mostrados) . Sin embargo, se observa que tanto VSVG como GFP continúan expresados en células RCMD infectadas con el virus VSVG (HA) GFP (NA) , después de cinco pasos consecutivos (datos no mostrados) . No se detectó mutación en la región HA restante del segmento H (9) VSVG (80) ARN del virus VSVG (HA) GFP (NA) , después de cinco pasos. Sin embargo, se encontraron tres mutaciones, lie a Leu en la posición 57, Gln a His en la posición 95, y Gln a detención en la posición 499 en las secuencias de aminoácido de VSVG. Aunque la protexna VSVG de tipo nativa tiene 29 residuos de dominio citoplásmico, los últimos 13 residuos de este dominio fueron suprimidos debido a la mutación Gln para detención en la posición 499.

Propiedades biológicas del virus VSVG (HA) GFP (NA) . Para determinar si la proteína VSVG es verdaderamente incorporada en los viriones compuestos de otras proteínas virales de la influenza, se condujo análisis de manchado Western en virus concentrados VSVG (HA) GFP (NA) y WSN (control) . Como se muestra en la Figura 20, la proteína VSV G, pero no la HA, se' detectó en los viriones VSVG (HA) GFP (NA) , confirmando la incorporación del virión de la proteína VSVG. Después, las propiedades del virus de VSVG (HA) GFP (NA) se examinaron en células BHK, CHO o RCMD. Las células se infectaron a un MOI de 0.001, y se determinaron rendimientos de virus en el sobrenadante de cultivo a diferentes tiempos posteriores a la infección a 37 "C por ensayo de placas en células RCMD. Aunque inferior que aquel del virus WSN, el'titulador máximo del virus VSVG (HA) GFP (NA) en ambas células BHK y RCMD, alcanzó al menos 10s PFU por mi (Figura 21) . Contrario al escaso crecimiento del virus WSN en células CHO, el virus VSVG (HA) GFP (NA) crece también en estas células como en las otras dos líneas probadas (Figura 21) . Sin embargo, durante la replicacion en cada una de las líneas celulares, células infectadas con el virus VSVG (HA) GF (NA) , expresan GF . Estos resultados indican que ambos segmentos HA (9) VSVG (80) y NA(183) GFP (157j Met ( -) , fueron eficientemente incorporados en los viriones de influenza y qué dos genes extraños deben ser establemente mantenidos en el virus de la influenza A durante la etapa repetida. Discusión La determinación de los mecanismos de empaquetado del genoma es crítica por el entendimiento del ciclo de vida del virus de la influenza, así como también para el desarrollo de los vectores a base del virus de la influenza para la expresión de proteínas extrañas. En este estudio, se demostró que las secuencias en ambos extremos 3 ' y 5 ' de las regiones codificantes en ARNv HA, fueron requeridas para la incorporación eficiente de este segmento en viriones. Sin embargo, durante este conocimiento, se generó un virus nuevo a base de influenza que posee dos segmentos de ARN recombinante que contienen las secuencias codificantes de VSVG y GFP flanqueadas por secuencias necesarias para la incorporación del virión de ARNv de HA y ARNv NA respectivamente, demostrando la expresión estable de dos genes extraños . Se han reportado varios procedimientos para el desarrollo de vectores de vacunas basados en el virus de la influenza A para la expresión de genes o porciones de genes a partir de agentes infecciosos no relacionados . Se han insertado polipéptidos cortos en los sitios antigénicos de HA, resultando en respuestas inmunes positivas contra los péptidos insertados. Para la expresión de péptidos y proteínas más .grandes, los genes extraños se han insertado en uno de los genes del virus de la influenza, en el cual, las proteínas extrañas fueron expresadas utilizando sitios de entrada ribosomal interna (IRES) o la proteasa del virus 2A de la enfermedad de pie y boca. Aquí, se estableció un nuevo sistema para la expresión de una proteína extraña, explotando las señales de incorporación del virión cis-actuante en el ARNv de NA y HA. Este sistema permite a los virus a base de influenza, incorporar más de 1.5 kb de un gen extraño (por ejemplo, VSVG) , demostrando el potencial de este sistema vector. Como se ha mostrado la eficacia de la vacuna de VLP de la influenza incompetente de replicacion en ratones, el VLP basado en la influenza incompetente de replicacion con un segmento recombinante ARN que contiene un gen a partir de un patógeno no relacionado, puede servir como una vacuna prometedora. Este potencial es especialmente atrayente para la vacunación contra el VIH, enfermedades del pie y boca y otras infecciones, en donde cualquier inversión de los virus de vacuna vivos al tipo nativo, es absolutamente inaceptable o donde la eficacia de las vacunas inactivadas puede ser limitada debido a la inducción limitada de las respuestas del linfocito T citotóxicos e inmunidad mucosal . De este modo, usando este procedimiento, se puede emplear el virus de la influenza como un vector de vacuna. Por ejemplo, se puede hacer un virus que contiene una región codificante gpl60 de VIH en lugar de HA y una región codificante gag en lugar de NA (Figuras 24 y 25) . Sin embargo, si VSV G reemplaza HA, M2 no se requiere más y asi se pueden reemplazar tres genes virales con genes heterólogos. Por ejemplo, HA puede ser reemplazado con gp!60 de VIH, NA con gag y M2 con nef . Puede ser empleado el virus de la influenza recombinante resultante como una vacuna, o como un refuerzo para otra vacuna del VIH, por ejemplo, una vacuna de ADN del VIH, para mejorar o inducir inmunidad incluyendo la inmunidad mucosal . Alternativamente, una vacuna puede ser una vacuna multivalente basada en un virus de la influenza recombinante en el cual el segmento codificante NA es reemplazado con aquel de otro patógeno, por ejemplo, glicoproteína D del virus del herpes, en el cual la vacuna puede resultar en una respuesta inmune protectiva a infecciones del virus de la influenza y virus del herpes . Los vectores virales derivados de adenovirus, retrovirus y poxvirus, eficientemente introducen genes extraños en las células objetivo. Puesto que estos virus contienen ADN o tienen intermediarios de replicación de ADN que podrían ser integrados en el cromosoma hospedador, el riesgo de desventajas adversas no se puede eliminar. Por el contrario, tal integración es improbable en los virus de la influenza, debido a la carencia de una fase de ADN en las células infectadas. Sin embargo, puesto que el virus VSVG (HA) GF (NA) , no requiere tripsina para desdoblar el H, distinto de los virus de la influenza típicos, puede presentar un uso más amplio. Además, el virus recombinante con el tropismo celular deseado, puede ser generado alterando una glicoproteína en la superficie del virión. De este modo, el sistema que utiliza señales cis-actuantes en los segmentos ANv para la incorporación del virión, permite la designación de vectores de virus basados en la influenza recombinante, que pueden suministrar múltiples genes extraños en las células objetivo. El montaje y liberación de virus a partir de genes extraños múltiples, es polarizado en algunos virus, ocurriendo selectivamente a ya sea la superficie apical o basolateral. Los virus polarizados que brotan se piensa, juegan un papel en la determinación de la patogénesis de las infecciones virales . El virus de la influenza A que brota apicalmente de células epiteliales infectadas y proteínas HA, NA, y M2 individualmente expresadas, es también objetivo a la superficie apical de las células. Por otro lado, el VSV es liberado de la superficie basolateral de células infectas y la proteína VSV G es transportada a la superficie basolateral. En el presente estudio, un virus recombinante VSVG (HA) GFP (NA) , que posee VSV G en lugar de las proteínas HA y NA, fue exitosamente generado. Sin embargo, la proteína VSV G de este virus recombinante, carece de los últimos 13 lie residuos del dominio citoplásmico debido a una mutación de punto. La supresión de estos 13 residuos en el dominio citoplásmico se conoce por proporcionar una proteína que es más eficientemente transportada a la superficie apical que a la superficie basolateral. Por lo tanto, la mutación introducida en la proteína VSV G en el virus VSVG (??) GFP (NA) , probablemente promueve su transporte eficiente a la superficie apical, conduciendo a brotes eficientes del virus VSVG (HA) GFP (NA) . Las pandemias de influenza, usualmente ocurren cuando un virus cuyo HA y/o NA es inmunológicamente distinto de aquellos de las cepas de circulación que aparecen después de la reafirmación de los segmentos de ARN virales de la influenza. Las secuencias en los extremos 3' y 5' de las regiones codificantes con HA, NA, M y ARNv de NS, son requeridas para su eficiente incorporación en viriones. El empaquetado de segmentos de ARNv (más probablemente como un complejo de ribonucleoproteína) , es mediado por las interacciones de ARN-ARN que ocurren en trans, entre los segmentos de ARN virales. En ese caso, las señales de incorporación específica dentro de cada segmento, pueden restringir la reafirmación de los segmentos de ARN. Empíricamente, se sabe que los segmentos de ARN virales de la influenza, no se reafirman aleatoriamente. Las interacciones funcionales entre las proteínas (por ejemplo, formación del complejo de pplimerasa, HA-NA y asociaciones funcionales ??-M2 escindibles) , se piensa, restringen la reafirmación aleatoria. Además de estas restricciones en la reafirmación al nivel de proteína, puede existir una restricción similar al nivel de AR . En este contexto, es interesante que en tanto las pandemias de 1957 como 1968, el gen PB1 además de los genes HA y/o NA, introducidas en virus humanos a partir dé virus de aves, sugieren un posible enlace entre los segmentos ARN de HA y PB1. La caracterización adicional para regiones críticas para la incorporación del virión de otros segmentos de ARN, puede proporcionar una pista para el entendimiento de la reafirmación de los segmentos de ARN, conduciendo a la predicción de la emergencia de nuevas cepas pandémicas del virus de la influenza A. En resumen, con la información en las señales de empaquetado de ARNv, se pueden desarrollar nuevas vacunas de la influenza y vectores de vacuna a base de influenza.

E emplo 6 Como se ilustra en la Figura 26, use puede elaborar una línea celular que expresa constitutivamente un ARN como el virus de la influenza, que codifica una proteína por ejemplo, NS2, aunque este ARN carece de una señal de incorporación. Se puede preparar también un virus el cual carece de la secuencia de codificación NS2 (NS2 KO) (Neumann et al., 2000; Watanabe et al., 2000). Cuando el virus NS2 KO infecta células normales, el virus -de la progenie no se producirá, puesto que carece del virus NS2. Por el contrario, cuando el virus NS2 KO infecta células que expresan un ARN como el virus de la influenza que codifica a NS2 pero que carece de una señal de incorporación, el NS2 se expresa después de la infección viral y se produce el virus de la progenie NS2 KO. Sin embargo, el ARN como el virus de la influenza que codifica a NS2 , no se incorporará en el virus NS2 KO, debido a que carece de una señal de incorporación de virión. De este modo, el NS2 KO permanece de replicación incompetente en células normales. Este sistema puede ser usado para la producción de células productoras para la replicación incompetente de virus. Usando este sistema, se pueden elaborar células productoras que expresan proteínas virales, cuya toxicidad a las células podría típicamente prohibir la generación de líneas celulares constitutivamente expresadas. De este modo, en esta solicitud, el conocimiento de las señales de incorporación al virión se pueden emplear para designar un sistema que no permita un segmento específico ser incorporado en viriones .

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Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patente se incorporan aquí por referencia. En la especificación anterior, esta invención ha sido descrita en relación a ciertas modalidades preferidas de la misma, y muchos detalles han sido mostrados para el propósito de ilustración, será aparente para aquellos expertos en la técnica, que la invención es susceptible a modalidades adicionales y que ciertos detalles que se describen aquí puede ser considerablemente variados sin salirse de los principios básicos de la invención.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Vector viral de influenza, que comprende secuencias de incorporación del virus de influenza, caracterizado porgue dicho vector comprende : a) secuencias que corresponden a la región no codificante del 3' de ARNv de NA del virus de influenza, secuencias de incorporación del 3 ' de NA, un segmento de ácido nucleico heterologo y la región no codificante del 5' de ARNv de NA; b) secuencias que corresponden a la región no codificante del 3' de ARNv de HA del virus de influenza, un segmento de ácido nucleico heterologo, secuencias de incorporación de HA al 5' y la región no codificante del 5' de ARNv de HA; c) secuencias que corresponden a la región no codificante del 3' de ARNv de M del virus de influenza, secuencias de incorporación de M al 3 ' , un segmento de ácido nucleico heterologo, secuencias de incorporación de M al 5' y la región no codificante del 5' de ARNv de M; d) secuencias que corresponden a la región no codificante del 3' de ARNv de NS del virps de influenza, secuencias de incorporación de NS al 3 ' , un segmento de ácido nucleico heterologo y la región no codificante del 5' de ARNv de NS; e) secuencias que corresponden a la región no codificante del 3' de ARNv de PB2 del virus de influenza, un segmento de ácido nucleico heterologo, secuencias de incorporación de PB2 al 5' y la región no codificante del 5' de ARNv de PB2 ; f) secuencias que corresponden a la región no codificante del 3' de ARNv de PBl del virus de influenza, un segmento de ácido nucleico heterologo, secuencias de incorporación de PBl al 5' y la región no codificante del 5' de ARNv de PBl; o g) secuencias que corresponden a la región no codificante del 3' de ARNv de PA del virus de influenza, un segmento de ácido nucleico heterologo, secuencias de incorporación de PA al 5' y la región no codificante del 5' de ARNv de PA; en donde el ARNv que corresponde la vector, cuando está presente en una célula que expresa proteínas del virus de influenza y comprende ARNv distinto del ARNv que corresponde al vector, está empaquetado en viriones . 2. "Vector de conformidad con la reivindicación la) , caracterizado porque las secuencias de incorporación de NA al 3' incluyen al menos, 19 nucleótidos que corresponden a los primeros 19 nucleótidos codificantes para NA. 3. Vector de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque además comprende secuencias de incorporación de NA al 5' . . Vector de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque las secuencias de incorporación de NA al 5' , incluyen al menos, 39 nucleótidos que corresponden a los 39 nucleótidos codificantes del 3' para NA. 5. Vector de conformidad con la reivindicación la) , caracterizado porque las secuencias de incorporación de NA al 3 ' , incluyen al menos, 90 nucleótidos que corresponden a los primeros 90 nucleótidos codificantes para NA. 6. Vector de conformidad con la reivindicación Ib) , caracterizado porque las secuencias de incorporación de HA al 5' , incluyen al menos, 80 nucleótidos que corresponde a los 80 nucleótidos codificantes del 3' de HA. 7. Vector de conformidad con la reivindicación Ib) , caracterizado porque las secuencias de incorporación de HA al 5', incluyen al menos, 291 nucleótidos que corresponden a los 291 nucleótidos codificantes del 3' de HA. 8. Vector de conformidad con la reivindicación Ib) , caracterizado porque además comprende secuencias de incorporación de HA al 3' . 9. Vector de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque las secuencias de incorporación de HA al 3', incluyen al menos, 3 nucleótidos que corresponden a los primeros 3 nucleótidos codificantes para HA. 10. Vector de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque las secuencias de incorporación de HA al 3', incluyen al menos, 9 nucleótidos que corresponden a los primeros 9 nucleótidos codificantes para HA. 11. Vector de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el segmento de ácido nucleico heterólogo comprende secuencias que corresponden a una secuencia de entrada de ribosoma interno . 12. Vector de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el segmento de ácido nucleico heterólogo comprende secuencias que corresponden a una estructura lectora abierta para un gen marcador. 13. Vector de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el segmento de ácido nucleico heterólogo comprende secuencias que corresponden a una estructura lectora abierta para una proteína o un péptido inmunogénico de un patógeno, o una proteina terapéutica. 14. Vector de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque las secuencias de incorporación son de un virus de influenza de tipo A . 15. Vector de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque las secuencias de incorporación son de un virus de influenza de tipo B . 16. Vector de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el segmento de ácido nucleico heterólogo está fusionado a otro segmento de ácido nucleico, para así codificar una proteína de fusión.' 17. Virus de influenza recombinante , caracterizado porque comprende un ARNv que corresponde al vector de la reivindicación 1. 18. Virus recorabinante de conformidad con la reivindicación 17, caracte izado porque el segmento de ácido nucleico eterólogo comprende secuencias que corresponden a una estructura lectora abierta para un gen marcador. 19. Virus recombinante de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque el segmento de ácido nucleico comprende secuencias que corresponden a una estructura lectora abierta para una proteína o péptido inmunogénico de un patógeno. 20. Virus recombinante de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque la estructura lectora abierta codifica una proteína HA. 21. Virus recombinante de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque la estructura lectora abierta codifica una proteína NA. 22. Virus recombinante de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque el segmento de ácido nucleico heterólogo comprende secuencias que corresponden a una estructura lectora abierta para una proteína de transmembrana. 23. Virus recombinante de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque el segmento de ácido nucleico heterólogo comprende secuencias que corresponden a una estructura lectora abierta para una proteína con actividad de fusión de la membrana. 24. Virus recombinante de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque el segmento de ácido nucleico heterólogo comprende secuencias que corresponden a una estructura lectora abierta para una proteína cápsida viral . 25. Virus recombinante de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque el segmento de ácido nucleico heterólogo comprende secuencias que corresponden a una estructura lectora abierta para una proteína G del virus de estomatitis vesicular. 26. Virus recombinante de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque el segmento de ácido nucleico heterólogo comprende secuencias que corresponden a una estructura lectora abierta para una proteína terapéutica. 27. Virus recombinante de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque la proteína HA es una proteína HA de tipo B. 28. Método para expresar un segmento de ácido nucleico heterólogo en una célula, caracterizado porque comprende: poner en contacto una célula con el virus recombinante de la reivindicación 17 y detectar o determinar sí un producto codificado por el segmento de ácido nucleico heterólogo se expresa en la célula. 29. Molécula de ácido nucleico aislada, caracterizada porque comprende secuencias de incorporación de NA del virus de influenza, que corresponden a la región codificante del 5' de NA y un segmento de ácido nucleico heterologo. 30. Molécula de ácido nucleico aislada, caracterizada porque comprende secuencias de incorporación de NS del virus de influenza, que corresponden a la región codificante del 5' de NS y un segmento de ácido nucleico heterologo. 31. Molécula de ácido nucleico aislada, caracterizada porque comprende secuencias de incorporación de HA del virus de influenza, que corresponden a la región codificante del 3' de HA y un segmento de ácido nucleico heterologo . 32. Molécula de ácido nucleico aislada, caracterizada porque comprende secuencias de incorporación de PB2 del virus de influenza, que corresponden a la región codificante del 3 ' de PB2 de un segmento de ácido nucleico heterologo. 33. Molécula de ácido nucleico aislada, caracterizada porque comprende secuencias de incorporación M del virus de influenza, que . corresponden a la región codificante del 3' de M y la región codificante al 5' de M, y un segmento de ácido nucleico heterologo. 34. Vector de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el ARNv que corresponde al vector, cuando está presente en la célula, se empaqueta en viriones a una eficiencia de al menos 10%, de aquella de un correspondiente ARNv de tipo nativo. 35. Vector de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el ARNv que corresponde al vector, cuando está presente en la célula, se empaqueta en viriones a una eficiencia de al menos 30%, de aquella de un correspondiente ARNv de tipo nativo. 36. Vector de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el ARNv que corresponde al vector, cuando está presente en la célula, se empaqueta en viriones a una eficiencia de al menos 60%, de aquella de un correspondiente ARNv de tipo nativo. 37 Método para preparar la replicación del virus incompetente similar a la influenza, caracterizado porque comprende : a) poner en contacto una célula hospedadora recombinante con un virus de influenza recombinante, el cual carece de un ARNv con una secuencia codificante NS de tipo nativa y la cual comprende secuencias para una recombinasa, en donde la célula hospedadora recombinante comprende una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende, una estructura lectora abierta pero -no una secuencia de incorporación . operablemente ligada a dos secuencias de recombinación de sitio específico, reconocidas por la recombinasa 5' en la estructura lectora abierta NS2 y en donde en la ausencia de la recombinasa, no se expresa NS2; y b) aislar el virus de replicación incompetente similar a la influenza, a partir de la célula hospedadora recombinante . 38. Método de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado porque la recombinasa es Cre y las secuencias de recombinación de sitio específico son secuencias loxP. 39. Método de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado porgue la recombinasa es FLPnd y las secuencias de recombinación de sitio específico son secuencias frt.