CN104017775B - 能够感染犬科动物的流感病毒及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及分离的流感病毒，其能够感染犬科动物和在犬科动物中引起呼吸系统疾病。本发明还涉及用于诱导针对本发明的流感病毒的免疫应答的组合物和方法。本发明还涉及用于鉴定本发明的病毒和诊断本发明病毒对动物的感染的组合物和方法。

Description

能够感染犬科动物的流感病毒及其用途
本申请是申请日为2006年10月19日、发明名称为“能够感染犬科动物的流感病毒及其用途”的中国专利申请200680041958.9(国际申请号PCT/US2006/041061)的分案申请。
相关申请的参考
本申请是2006年4月21日提交的申请美国序列号11/409,416的部分继续申请；并且本申请要求2005年10月19日提交的美国序列号60/728,449；2005年12月29日提交的美国序列号60/754,881;2006年1月14日提交的美国序列号60/759,162;2006年1月23日提交的美国序列号60/761,451;和2006年3月3日提交的美国序列号60/779,080的优先权，将它们的公开都完整（包括发明简述、详述、实施例、权利要求、摘要、附图、表、核酸序列、氨基酸序列和图）引入本文作为参考。
发明背景
“狗舍咳嗽”或者感染性气管支气管炎(ITB)是狗中的急性、传染性呼吸系统感染，其特征主要是咳嗽(Ford et al,1998)。犬ITB被认为是世界上狗的最普遍的感染性呼吸系统疾病，并且当狗在高密度群体环境如狗舍中居住时，爆发可以达到流行性比例。多数爆发是由于直接的狗－狗接触或者呼吸系统分泌物的气雾化(Ford et al,1998)。临床病征由细菌和病毒的一种或者组合感染引起，所述细菌和病毒可以在上呼吸道和下呼吸道的上皮组织中建群。犬科动物副流感病毒(CPiV)和支气管博德特氏菌(Bordetellabronchiseptica)细菌是从受侵袭的狗分离的最常见的生物，但是几种其他病毒，如犬科动物瘟热病毒(CDV)和犬科动物腺病毒－1和－2(CAV-1, CAV-2)，以及细菌如链球菌(Streptococcus sp.)、Pasteurella multicoda和大肠杆菌(Escherichia coli)可以影响临床过程和结果(Ford et al,1998)。尽管在高密度群体中爆发最有效和快速发生，具有高的发病率，但是并发的呼吸系统感染和死亡是不常见的。尽管可以发生威胁生命的继发性细菌性肺炎，但是多数ITB病例是自身限制性的并且在没有任何治疗下消退(Ford et al,1998)。
在1992年7月，推测为“狗舍咳嗽”的呼吸系统感染在新英格兰(New England)、佛罗里达(Florida)、西弗吉尼亚(West Virginia)、威斯康辛(Wisconsin)、堪萨斯(Kansas)、科罗拉多(Colorado)、俄克拉荷马(Oklahoma)和亚利桑那州(Arizona)的几个灵
Figure SMS_1
赛场(greyhound track)变得流行。从兽医了解到，多数受侵袭的狗具有后来消退的轻微咳嗽，但是一打以上的灵/>
Figure SMS_2
患上了急性出血性肺炎，接着快速死亡(Greyhound Daily News,1999)。
在1998年下半年到1999年上半年，在美国的竞赛灵
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狗舍中发生了几次“狗舍咳嗽”爆发，导致强制关闭赛场和隔离美国的所有竞赛灵/>
Figure SMS_4
数周(Greyhound Daily News,1999)。在佛罗里达的一个赛场(Palm Beach Kennel Club)，在一天中几乎40％的狗群体中记录到咳嗽(来自William Duggar博士的个人交流)。类似于1992年的爆发，该咳嗽在多数灵/>
Figure SMS_5
中消退，但是佛罗里达的10只狗死于“狗舍咳嗽”非特征性的出血性肺炎综合征(Putnam,1999)。
在2003年3月－4月，在美国东部的灵
Figure SMS_6
赛场发生“狗舍咳嗽”的另一次爆发。认为该爆发在佛罗里达的四个赛场开始，并且因此几乎三周中止比赛和狗的隔离。在West PalmBeach的赛场几乎25％的狗受到侵袭，而St.Petersburg的Derby Lane中1400条狗几乎50％发生咳嗽。再一次，多数狗恢复，但是一些狗死于呼吸系统感染。仅在Derby Lane的呼吸爆发的估计的经济影响为2百万美元。
没有公开的报导记载在1992、1998-1999或2003年在竞赛灵
Figure SMS_7
狗舍中“狗舍咳嗽”流行的病因或者临床病理。假定该感染是由于CPiV和/或支气 管博德特氏菌：狗舍咳嗽的两种最常见的病因。未证实的交流，如网站已经将在一些咳嗽的狗中报导的致命的出血性肺炎规因于β－溶血性马链球菌兽瘟亚种(Streptococcus equi subspecieszooepidemicus)，并且将该综合征称作“犬链球菌中毒性休克”。
病毒从一个宿主物种传染到另一个是流感病毒的生态学和流行病学的关键特征(Webster,1998)。流感病毒的物种间传染的两个基本机制是可能的(Webster et al.,1992;Lipatov et al.,2004)。一种是基本上未变的病毒从一个物种直接转移到另一个物种。该机制的实例包括最近的家禽流感病毒的H5N1亚型对人的感染(Subbarao et al.,1998;Peiris et al.,2004;Guan et al.,2004)和可能地1918年的大流行，称作西班牙流感(Reid et al.,2004)。第二种机制是流感病毒基因组的区段化性质的结果。用来自不同物种的病毒共感染宿主可以导致区段化病毒基因的重排列，和产生能够感染其他物种的重组体。例如，鸟类和人流感病毒之间基因重排列产生的新的病毒在1957和1968年导致人类流感大流行(Webster et al.,1992;Lipatov et al.,2004;Kawaoka et al.,1989)。
未改变的流感病毒从自然宿主物种向不同物种的多数直接传播是最终事件，因为在新物种的个体之间的持续传播不能发生。多种病毒－宿主相互作用是复制和水平传播所必须的并且为流感病毒在新的宿主中的永续性提供了强大的屏障(Webby et al.,2004)。因此，流感病毒的新的宿主特异性谱系的建立是不常见的并且仅仅在驯养的家禽、猪、马和人类中发生(Webster et al.,1992;Lipatov et al.,2004)。
因为流感病毒感染的严重性质，所以仍然需要诊断、预防和治疗流感病毒感染的方法。
发明概述
本发明涉及分离的流感病毒，其能够感染犬科动物和在犬科动物中引起呼吸系统疾病。本发明还涉及用于诱导针对本发明的流感病毒的免疫应答的组合物和方法。本发明还涉及用于鉴定本发明的病毒和诊断本发明的 病毒对动物的感染的组合物和方法。
本发明的一方面涉及保护犬科动物免于犬科动物流感的疫苗和方法、包含此类疫苗的药盒，和使用此类疫苗的方法。该保护包括防止流感和/或其一种或多种（通常两种或多种）症状、减轻其危险、延迟其发作、减少其扩散、将其减轻、抑制和/或消除。认为本发明的疫苗、药盒和方法一般适用于犬科动物。犬科动物包括野生的、动物园的和驯养的犬科动物，包括狼、郊狼和狐狸。犬科动物还包括狗，尤其驯养的狗，如纯种和/或杂种陪伴狗、表演狗、役用狗、放牧狗、猎狗、守卫狗、警犬、赛犬和/或实验用狗。
本发明还部分涉及保护犬科动物免于流感病毒感染（例如，预防、减轻危险、延迟发作、抑制、减轻或消除流感病毒感染）的方法。该方法包括施用治疗有效量的疫苗，其包含至少一种马流感病毒抗原、至少一种H3流感病毒抗原，和/或至少一种H7流感病毒抗原。
本发明还部分涉及保护犬科动物免于犬科动物流感病毒引起的呼吸系统损伤（例如，预防、减轻危险、延迟发作、抑制、减轻或消除呼吸系统损伤）的方法。该方法包括对犬科动物施用治疗有效量的疫苗，其包含至少一种马流感病毒抗原、至少一种H3流感病毒抗原，和/或至少一种H7流感病毒抗原。
本发明还部分涉及保护犬科动物免于犬科动物流感病毒感染引起的在鼻或口分泌物中具有犬科动物流感病毒（例如，预防、减轻危险、延迟发作、抑制、减轻或消除鼻或口分泌物中的犬科动物流感病毒）的方法。该方法包括对犬科动物施用治疗有效量的疫苗，其包含至少一种马流感病毒抗原、至少一种H3流感病毒抗原，和/或至少一种H7流感病毒抗原。
本发明还部分涉及犬科动物流感疫苗。在一些实施方案中，例如，该疫苗包含治疗有效量的至少一种马流感病毒抗原、至少一种H3流感病毒抗原，和/或至少一种H7流感病毒抗原。
本发明还部分涉及用于保护犬科动物免于流感病毒感染的药盒。该药盒包含治疗有效量的疫苗，该疫苗包含至少一种马流感病毒抗原、至少一 种H3流感病毒抗原，和/或至少一种H7流感病毒抗原。此外，所述药盒包含至少一种下面的：
用于对犬科动物施用所述疫苗的装置，
可药用赋形剂，其帮助将疫苗施用于犬科动物，
可药用赋形剂，其增强犬科动物对所述疫苗的免疫应答，
将被犬科动物与疫苗同时消费的食物，和/或
将被犬科动物与疫苗同时消费的饮食（treat）。
申请人的本发明的其他优点将在阅读该说明书后对本领域技术人员是显而易见的。
附图简述
图1A-1B显示了血凝素基因之间的系统发生关系。图1A显示了来自代表性犬、人、鸟类、猪和马分离群，包括作为外类群的A/Budgerigar/Hokkaido/1/77(H4)的HA基因树。图1B显示了使用A/Duck/Ukraine/63(H3)作为外类群，犬流感病毒HA基因与同一时期的和较老的马HA基因的树。通过近邻连接方法从核苷酸序列推论出系统树并且显示了≥90%的自展分析值。条形表示核苷酸改变数目/水平树枝的单位长度。
图2A－2B显示了在肺中流感H3抗原的免疫组织化学检测。用针对HA血凝素的小鼠单克隆抗体检测肺组织切片并通过免疫过氧化物酶反应检测结合(褐色沉淀)。图2A显示了来自具有自发疾病的灵
Figure SMS_8
的支气管上皮。检测支气管上皮细胞细胞质和呼吸道腔和肺泡腔中巨噬细胞中的病毒H3抗原。图2B显示了用A/canine/Florida/43/2004(H3N8)接种后5天，来自狗的支气管上皮。在支气管上皮细胞细胞质中检测到病毒H3抗原。比例尺，66μm。
图3显示了在死于与流感病毒感染有关的出血性肺炎的灵
Figure SMS_9
支气管中特征性组织学改变。对组织用H&E染色。上图：具有纤毛上皮细胞、粘液细胞和基细胞的正常支气管。下图：来自患有自发性流感的灵/>
Figure SMS_10
的支气 管。支气管纤毛上皮细胞有坏死和糜烂。比例尺,100μm。
图4A-4B显示了在H3血凝素基因中的系统发生关系。图4A显示了犬科动物流感病毒HA基因与同一时期的和较老的马HA基因的系统树。图4B显示了犬科动物流感病毒HA蛋白质与同一时期的和较老的马HA基因的系统树。通过近邻连接方法从基因或者氨基酸序列推论出系统树并且显示了≥80%的自展分析值。条形表示氨基酸改变数目/水平树枝的单位长度。
图5显示了在死于与流感病毒感染有关的肺炎的狗的肺中支气管和支气管腺的上皮细胞中流感病毒H3蛋白质。上图：支气管中纤毛上皮细胞的糜烂。组织用H&E染色。下图：在支气管(左)和支气管腺(右)上皮细胞的细胞质中流感病毒H3蛋白质。将组织用针对流感病毒H3的单克隆抗体染色，通过免疫过氧化物酶反应检测(褐色沉淀)并用苏木精复染。
图6A-6D显示了从扩增10倍连续体外稀释的转录的RNA标准得到的H3和基质基因(图6A和图6B)的扩增图。通过起始RNA浓度的对数值对从每次稀释得到的阈值循环数(Ct)作图，构造H3和基质基因(图6C和图6D)的标准曲线。
图7显示用10倍连续稀释的病毒原种(包括A/Wyoming/3/2003和A/canine/FL/242/2003)测试Directigen Flu A的灵敏性。紫色三角形指示阳性结果。
序列简述
SEQ ID NO:1是可以根据本发明使用的编码PB2蛋白质的犬科动物流感病毒(Florida/43/04)的核苷酸序列。
SEQ ID NO:2是SEQ ID NO:1编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO:3是可以根据本发明使用的编码PB1蛋白质的犬科动物流感病毒(Florida/43/04)的核苷酸序列。
SEQ ID NO:4是SEQ ID NO:3编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO:5是可以根据本发明使用的编码PA蛋白质的犬科动物流 感病毒(Florida/43/04)的核苷酸序列。
SEQ ID NO:6是SEQ ID NO:5编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO:7是可以根据本发明使用的编码NS蛋白质的犬科动物流感病毒(Florida/43/04)的核苷酸序列。
SEQ ID NO:8是SEQ ID NO:7编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO:9是可以根据本发明使用的编码NP蛋白质的犬科动物流感病毒(Florida/43/04)的核苷酸序列。
SEQ ID NO:10是SEQ ID NO:9编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO:11是可以根据本发明使用的编码NA蛋白质的犬科动物流感病毒(Florida/43/04)的核苷酸序列。
SEQ ID NO:12是SEQ ID NO:11编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO:13是可以根据本发明使用的编码MA蛋白质的犬科动物流感病毒(Florida/43/04)的核苷酸序列。
SEQ ID NO:14是SEQ ID NO:13编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO:15是可以根据本发明使用的编码HA蛋白质的犬科动物流感病毒(Florida/43/04)的核苷酸序列。
SEQ ID NO:16是SEQ ID NO:15编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO:17是可以根据本发明使用的编码PB2蛋白质的犬科动物流感病毒(FL/242/03)的核苷酸序列。
SEQ ID NO:18是SEQ ID NO:17编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO:19是可以根据本发明使用的编码PB1蛋白质的犬科动物流感病毒(FL/242/03)的核苷酸序列。
SEQ ID NO:20是SEQ ID NO:19编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO:21是可以根据本发明使用的编码PA蛋白质的犬科动物流感病毒(FL/242/03)的核苷酸序列。
SEQ ID NO:22是SEQ ID NO:21编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO:23是可以根据本发明使用的编码NS蛋白质的犬科动物流感病毒(FL/242/03)的核苷酸序列。
SEQ ID NO:24是SEQ ID NO:23编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO:25是可以根据本发明使用的编码NP蛋白质的犬科动物流感病毒(FL/242/03)的核苷酸序列。
SEQ ID NO:26是SEQ ID NO:25编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO:27是可以根据本发明使用的编码NA蛋白质的犬科动物流感病毒(FL/242/03)的核苷酸序列。
SEQ ID NO:28是SEQ ID NO:27编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO:29是可以根据本发明使用的编码MA蛋白质的犬科动物流感病毒(FL/242/03)的核苷酸序列。
SEQ ID NO:30是SEQ ID NO:29编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO:31是可以根据本发明使用的编码HA蛋白质的犬科动物流感病毒(FL/242/03)的核苷酸序列。
SEQ ID NO:32是SEQ ID NO:31编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO:33是SEQ ID NO:16中显示的HA蛋白质的成熟形式，其中已经除去了N-末端16个氨基酸的信号序列。
SEQ ID NO:34是SEQ ID NO:32中显示的HA蛋白质的成熟形式，其中已经除去了N-末端16个氨基酸的信号序列。
SEQ ID NO:35是可以根据本发明使用的寡核苷酸。
SEQ ID NO:36是可以根据本发明使用的寡核苷酸。
SEQ ID NO:37是可以根据本发明使用的寡核苷酸。
SEQ ID NO:38是可以根据本发明使用的寡核苷酸。
SEQ ID NO:39是可以根据本发明使用的寡核苷酸。
SEQ ID NO:40是可以根据本发明使用的寡核苷酸。
SEQ ID NO:41是可以根据本发明使用的寡核苷酸。
SEQ ID NO:42是可以根据本发明使用的寡核苷酸。
SEQ ID NO:43是可以根据本发明使用的寡核苷酸。
SEQ ID NO:44是可以根据本发明使用的寡核苷酸。
SEQ ID NO:45是可以根据本发明使用的寡核苷酸。
SEQ ID NO:46是可以根据本发明使用的寡核苷酸。
SEQ ID NO:47是可以根据本发明使用的编码PB2蛋白质的犬科动物流感病毒(Miami/2005)的核苷酸序列。
SEQ ID NO:48是SEQ ID NO:47编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO:49是可以根据本发明使用的编码PB1蛋白质的犬科动物流感病毒(Miami/2005)的核苷酸序列。
SEQ ID NO:50是SEQ ID NO:49编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO:51是可以根据本发明使用的编码PA蛋白质的犬科动物流感病毒(Miami/2005)的核苷酸序列。
SEQ ID NO:52是SEQ ID NO:51编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO:53是可以根据本发明使用的编码NS蛋白质的犬科动物流感病毒(Miami/2005)的核苷酸序列。
SEQ ID NO:54是SEQ ID NO:53编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO:55是可以根据本发明使用的编码NP蛋白质的犬科动物流感病毒(Miami/2005)的核苷酸序列。
SEQ ID NO:56是SEQ ID NO:55编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO:57是可以根据本发明使用的编码NA蛋白质的犬科动物流感病毒(Miami/2005)的核苷酸序列。
SEQ ID NO:58是SEQ ID NO:57编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO:59是可以根据本发明使用的编码MA蛋白质的犬科动物流感病毒(Miami/2005)的核苷酸序列。
SEQ ID NO:60是SEQ ID NO:59编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO:61是可以根据本发明使用的编码HA蛋白质的犬科动物流感病毒(Miami/2005)的核苷酸序列。
SEQ ID NO:62是SEQ ID NO:61编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO:63是可以根据本发明使用的编码PB2蛋白质的犬科动物流感病毒(Jacksonville/2005)的核苷酸序列。
SEQ ID NO:64是SEQ ID NO:63编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO:65是可以根据本发明使用的编码PB1蛋白质的犬科动物流感病毒(Jacksonville/2005)的核苷酸序列。
SEQ ID NO:66是SEQ ID NO:65编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO:67是可以根据本发明使用的编码PA蛋白质的犬科动物流感病毒(Jacksonville/2005)的核苷酸序列。
SEQ ID NO:68是SEQ ID NO:67编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO:69是可以根据本发明使用的编码NS蛋白质的犬科动物流感病毒(Jacksonville/2005)的核苷酸序列。
SEQ ID NO:70是SEQ ID NO:69编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO:71是可以根据本发明使用的编码NP蛋白质的犬科动物流感病毒(Jacksonville/2005)的核苷酸序列。
SEQ ID NO:72是SEQ ID NO:71编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO:73是可以根据本发明使用的编码NA蛋白质的犬科动物流感病毒(Jacksonville/2005)的核苷酸序列。
SEQ ID NO:74是SEQ ID NO:73编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO:75是可以根据本发明使用的编码MA蛋白质的犬科动物流感病毒(Jacksonville/2005)的核苷酸序列。
SEQ ID NO:76是SEQ ID NO:75编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO:77是可以根据本发明使用的编码HA蛋白质的犬科动物流感病毒(Jacksonville/2005)的核苷酸序列。
SEQ ID NO:78是SEQ ID NO:77编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO:79是可以根据本发明使用的寡核苷酸。
SEQ ID NO:80是可以根据本发明使用的寡核苷酸。
SEQ ID NO:81是可以根据本发明使用的寡核苷酸。
SEQ ID NO:82是可以根据本发明使用的寡核苷酸。
SEQ ID NO:83是可以根据本发明使用的寡核苷酸。
SEQ ID NO:84是可以根据本发明使用的寡核苷酸。
SEQ ID NO:85是可以根据本发明使用的寡核苷酸。
SEQ ID NO:86是可以根据本发明使用的寡核苷酸。
SEQ ID NO:87是可以根据本发明使用的寡核苷酸。
SEQ ID NO:88是可以根据本发明使用的寡核苷酸。
发明详述
本发明涉及分离的流感病毒，其能够感染犬科动物和引起呼吸系统疾病。在一个实施方案中，本发明的流感病毒包含编码具有SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、33、34、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76或78任一个所示的氨基酸序列的蛋白质或者其功能和/或免疫原性片段或者变体的多核苷酸。在一个特定实施方案中，所述多核苷酸包含SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75或77中任一个所示的核苷酸序列，或者其片段或者变体。本发明的流感病毒可以具有H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8和H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15或H16的HA亚型或N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8或N9的NA亚型。在特定实施方案中，本发明的流感病毒是亚型H3。根据本文描述的方法，可以从受感染的狗分离病毒并在细胞或者蛋中培养。在示例的实施方案中，流感病毒是甲型流感病毒。
本发明还涉及包含本发明的流感病毒的一种或多种基因或者基因组区段的全部或者部分的多核苷酸。在一个实施方案中，本发明的多核苷酸包含流感血凝素(HA)基因、神经氨酸酶(NA)基因、核蛋白(NP)基因、基质蛋白(MA或者M)基因、聚合酶碱性(PB)蛋白基因、聚合酶酸性(PA)蛋白基因、非结构(NS)蛋白基因，或者这些基因任一种的功能片段或者变体。在特定实施方案中，本发明的多核苷酸包含血凝素(HA)基因或者其功能片段或者变体。在另一实施方案中，HA基因编码血凝素蛋白质，其与马H3共有序列的氨基酸序列相比，具有如下一个或多个：83位的丝氨酸；222位的亮氨酸；328位的苏氨酸；和/或483位的苏氨酸。在一个实施方案中， HA基因编码具有SEQ ID NO:16、32、62或78中所示的氨基酸序列的多肽，或者其功能和/或免疫原性片段或者变体。在一个特定实施方案中，HA基因包含SEQ ID NO:15、31、61或77中所示的核苷酸序列。
在一个实施方案中，本发明的多核苷酸编码具有SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、33、34、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76或78的任一个中所示的氨基酸序列的多肽，或者其功能和/或免疫原性片段或者变体。在特定实施方案中，编码SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、33、34、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76或78中所示的氨基酸序列的多核苷酸分别包含SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75或77中所示的核苷酸序列，或者编码SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、33、34、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76或78的任一项的功能和/或免疫原性片段或者变体的序列。从而，本发明涉及多核苷酸序列，其包含SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75或77的任一项中所示的核苷酸序列，或者SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75或77的任一项的片段或者变体，包括简并变体。在一个特定实施方案中，本发明的多核苷酸可以包含：SEQ ID NO:3的核苷酸1-2271；SEQ ID NO:5的核苷酸1-2148；SEQ ID NO:7的核苷酸1-657；SEQ ID NO:9的核苷酸1-1494；SEQ ID NO:11的核苷酸1-1410；SEQ ID NO:13的核苷酸1-756；SEQ ID NO:15的核苷酸1-1695；SEQ ID NO:19的核苷酸1-2271；SEQ ID NO:21的核苷酸1-2148；SEQ ID NO:23的核苷酸1-657；SEQ ID NO:25的核苷酸1-1494；SEQ ID NO:29的核苷酸1-756；SEQ ID NO:31的核苷酸1-1695； SEQ IDNO:47的核苷酸1-2277；SEQ ID NO:49的核苷酸1-2271；SEQ ID NO:51的核苷酸1-2148；SEQID NO:53的核苷酸1-690；SEQ ID NO:55的核苷酸1-1494；SEQ ID NO:57的核苷酸1-1410；SEQ ID NO:59的核苷酸1-756；SEQ ID NO:61的核苷酸1-1695；SEQ ID NO:63的核苷酸1-2277；SEQ ID NO:65的核苷酸1-2271；SEQ ID NO:67的核苷酸1-2148；SEQ ID NO:69的核苷酸1-690；SEQ ID NO:71的核苷酸1-1494；SEQ ID NO:73的核苷酸1-1410；SEQ ID NO:75的核苷酸1-756；和SEQ ID NO:77的核苷酸1-1695。在本发明的范围内预期的病毒多核苷酸和多肽序列的核苷酸和氨基酸序列已经保存在GenBank，检索号为DQ124147到DQ124161和DQ124190，将其公开引入本文作为参考。
本发明还涉及本发明的流感病毒的多核苷酸编码的多肽。本发明还涉及主题多肽的功能和/或免疫原性片段和变体。预期的多肽包括本发明的流感病毒的HA蛋白、NA蛋白、NS蛋白、核蛋白、聚合酶碱性蛋白、聚合酶酸性蛋白，和基质蛋白。在一个示例的实施方案中，本发明的多肽具有SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、33、34、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76或78任一项所示的氨基酸序列，或者其功能和/或免疫原性片段或变体。
本发明还涉及包含本发明的多核苷酸序列的多核苷酸表达构建体。在一个实施方案中，本发明的表达构建体包含多核苷酸序列，该多核苷酸序列编码包含SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、33、34、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76或78任一项所示的氨基酸序列的多肽，或者其功能和/或免疫原性片段或变体。在特定实施方案中，编码SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、33、34、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76或78中所示的氨基酸序列的多核苷酸分别包含SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、47、49、51、53、55、57、59、 61、63、65、67、69、71、73、75或77的任一个中所示的核苷酸序列，或者编码SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、33、34、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76或78任一个的功能和/或免疫原性片段或变体的序列。从而，本发明涉及包含多核苷酸序列的表达构建体，所述多核苷酸序列包含SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75或77的任一个中所示的核苷酸序列，或者SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75或77任一个的片段或者变体，包括简并变体。在优选实施方案中，本发明的表达构建体提供了本发明的有效连接的多核苷酸的过表达。
本发明的表达构建体一般包括在预计的宿主细胞中有功能的调节元件，在所述宿主细胞中将表达该表达构建体。从而，本领域技术人员可以选择用于例如人类宿主细胞、哺乳动物宿主细胞、昆虫宿主细胞、酵母宿主细胞、细菌宿主细胞、和植物宿主细胞的调节元件。在一个实施方案中，调节元件是在犬科动物细胞中有功能的调节元件。调节元件包括启动子、转录终止序列、翻译终止序列、增强子、和多聚腺苷酸化元件。如本文所用的，术语“表达构建体”指核酸序列的组合，其提供了有效连接的核酸序列的转录。如本文所用的，术语“有效连接”指所述的元件的并列，其中所述元件处于允许它们以它们预期的方式发挥功能的关系中。通常，有效连接的元件为邻接的关系。
本发明的表达构建体可以包含有效连接到编码本发明多肽的多核苷酸序列的启动子序列。使用本领域中已知的标准技术，可以将启动子掺入多核苷酸中。在本发明的表达构建体中可以使用启动子的多个拷贝或者多个启动子。在优选实施方案中，启动子与表达构建体中转录起始位点的距离可以与它与天然遗传环境中转录起始位点的距离相同。在该距离中允许一定的变化而不实质性降低启动子活性。在表达构建体中通常包括转录起始位点。优选地，与本发明的表达构建体结合的启动子提供了本发明的有效连接的多核苷酸的过表达。
与本发明的表达构建体用于真核细胞中的启动子可以是病毒或者细菌来源的。病毒启动子包括，但不限于，巨细胞病毒(CMV)基因启动子、SV40早期或者晚期启动子，或者劳斯肉瘤病毒(RSV)基因启动子。细胞来源的启动子包括，但不限于，结蛋白基因启动子和肌动蛋白基因启动子。适于与本发明的表达构建体用于酵母细胞的启动子包括，但不限于，3-磷酸甘油酸酯激酶启动子、甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子、金属硫蛋白启动子、醇脱氢酶－2启动子，和己糖激酶启动子。
如果在植物细胞中提供或者向植物细胞中导入表达构建体，那么可以使用植物病毒启动子，如花椰菜花叶病毒(CaMV)35S(包括增强的CaMV35S启动子(见，例如，美国专利号5,106,739和An,1997))或者CaMV 19S启动子。可以用于植物中表达构建体的其他启动子包括，例如，prolifera启动子、Ap3启动子、热休克启动子、根癌农杆菌(A.tumefaciens)的T-DNA1'-或2'-启动子、多聚半乳糖醛酸酶启动子、来自牵牛花的查耳酮合酶A(CHS-A)启动子、烟草PR-1a启动子、泛蛋白启动子、肌动蛋白启动子、alcA基因启动子、pin2启动子(Xuet al.,1993)、玉米WipI启动子、玉米trpA基因启动子(美国专利号5,625,136)、玉米CDPK基因启动子、和RUBISCO SSU启动子(美国专利号5,034,322)。根特异的启动子，如美国专利号6,455,760或美国专利号6,696,623或公布的美国专利申请号20040078841;20040067506;20040019934;20030177536;20030084486;或20040123349中描述的任一种启动子序列可以用于本发明的表达构建体。组成性启动子(如CaMV、泛蛋白、肌动蛋白或者NOS启动子)、发育调节的启动子和诱导型启动子(如可以通过热、光、激素或者化学品诱导的那些启动子)也预期用于本发明的多核苷酸表达构建体。也可以使用组织特异性启动子，例如，果实特异性启动子，如番茄的E8启动子(检索号:AF515784;Good et al.(1994))。也可以使用种子特异性启动子，如来自β-菜豆蛋白基因(例如，菜豆的)或者大豆球蛋白基因(例如，大豆的)的启动子，和其他启 动子。
对于在原核系统中表达，本发明的表达构建体可以包含启动子，如碱性磷酸酶启动子、色氨酸(trp)启动子、λPL启动子、β－内酰胺酶启动子、乳糖启动子、phoA启动子、T3启动子、T7启动子、或者tac启动子(de Boer et al.,1983)。
本发明的表达构建体可以任选含有转录终止序列、翻译终止序列、编码信号肽的序列，和/或增强子元件。转录终止区可以通常从真核生物或者病毒基因序列的3’非翻译区得到。转录终止序列可以位于编码区的下游以提供有效终止。信号肽序列是通常存在于蛋白质的氨基末端的短氨基酸序列，其负责有效连接的成熟多肽重定位到多种不同的翻译后细胞目的地，从特定细胞器隔室到蛋白质作用部位和细胞外环境。通过使用有效连接的信号肽序列将基因产物靶向预期的细胞和/或细胞外目的地预期用于本发明的多肽。典型的增强子是顺式作用元件，其增加基因转录并且可以包括在表达构建体中。典型的增强子元件是本领域中已知的，并且包括，但不限于，CaMV35S增强子元件、巨细胞病毒(CMV)早期启动子增强子元件，和SV40增强子元件。增强基因表达的内含子介导的增强子元件也是本领域中已知的。这些元件必须存在于转录区内并且是方向依赖性的。
指导从表达构建体转录的mRNA的多聚腺苷酸化的DNA序列也可以包括在表达构建体中，并且包括，但不限于，章鱼碱合酶或者胭脂氨酸合酶信号。
表达构建体还可以包括一种或多种显性选择标记基因，包括，例如，编码抗生素抗性和/或除草剂抗性用于选择转化细胞的基因。抗生素抗性基因可以提供对一种或多种下面的抗生素的抗性：潮霉素、卡那霉素、博来霉素、G418、链霉素、巴龙霉素、新霉素和大观霉素。通过新霉素磷酸转移酶(NPT II)可以提供卡那霉素抗性。除草剂抗性基因可以提供对膦丝菌素乙酰转移酶或者草甘膦的抗性。用于细胞转化筛选的其他标记包括，但不限于，编码β－葡糖醛酸糖苷酶(GUS)、β－半乳糖苷酶、萤光素酶、胭脂氨酸合成酶、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、绿色荧光蛋白(GFP)或者增强的 GFP的基因(Yang et al.,1996)。
本发明还涉及包含编码本发明多肽的本发明的多核苷酸序列的多核苷酸载体。可以在本发明的表达构建体或者多核苷酸的5’和3’末端包括独特的限制酶位点以允许插入到多核苷酸载体中。如本文所用的，术语“载体”指任一遗传元件，包括例如，质粒、粘粒、染色体、噬菌体、病毒等等，其当与适当的控制元件结合时能够复制并且可以在细胞之间转移多核苷酸序列。载体含有允许载体在所选的宿主细胞中复制的核苷酸序列。许多载体可以用于表达和/或克隆，并且包括，但不限于，pBR322、pUC系列、M13系列、pGEM系列、和pBLUESCRIPT载体(Stratagene,La Jolla,CA and Promega,Madison,WI)。
本发明还涉及寡核苷酸探针和引物，如聚合酶链式反应(PCR)引物，其可以与本发明多核苷酸的编码或非编码序列杂交。本发明的寡核苷酸探针可以用于检测流感病毒核酸序列的方法中。本发明的寡核苷酸引物可以用于PCR方法和涉及核酸扩增的其他方法中。在优选实施方案中，本发明的探针或引物可以与本发明的多核苷酸在严格条件下杂交。本发明的探针和引物可以任选包含检测标记或者报道分子，如荧光分子、酶、放射性部分，等等。本发明的探针和引物对于使用它们的方法或测定法可以是任何合适的长度。通常，本发明的探针和引物将长为10到500个或者更多核苷酸。在本发明的范围内预期长为10到20、21到30、31到40、41到50、51到60、61到70、71到80、81到90、91到100或101个或更多核苷酸的探针和引物。在一个实施方案中，探针和引物长为9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸的任一个。本发明的探针和引物可以与所述多核苷酸序列具有完全(100％)的核苷酸序列同一性，或者序列同一性可以小于100%。例如，探针或引物和序列之间的序列同一性可以为99%、98%、97%、96%、95%、90%、85%、80%、75%、70%或者任一其他百分数序列同一性，只要该探针或引物可以在严格条件下与本发明的多核苷酸的核苷酸序列杂交。本发明的示例的探针和引物包括具有SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:46的任一个中所示的核苷酸序列，或者SEQ ID NO:35-46的任一个的功能片段或者变体的那些探针和引物。
如本文所用的，术语“核酸”、“多核苷酸”和“寡核苷酸”指单链或者双链形式的脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸或者混合的脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸聚合物，并且除非另外限制，将包括天然核苷酸的已知的类似物，其可以以类似于天然存在的核苷酸的方式发挥功能。多核苷酸序列包括可以转录成RNA的DNA链序列和可以翻译成蛋白质的RNA链。本发明的任一核酸、多核苷酸或者寡核苷酸的互补序列也预期在本发明的范围内。多核苷酸序列还包括全长序列以及衍生自全长序列的较短的序列。本发明还包括序列与本文公开的多核苷酸互补的那些多核苷酸。本发明的多核苷酸和多肽可以以纯化或者分离的形式提供。
因为遗传密码的简并性，多种不同的多核苷酸序列可以编码本发明的多肽。在Lewin(1985)中描述了显示所有可能的三联体密码子(并且其中U也代表T)和每个密码子编码的氨基酸的表格。此外，本领域技术人员完全能够产生编码与本发明的多肽相同或者基本相同的多肽的备选的多核苷酸序列。这些简并变体和备选多核苷酸序列在本发明的范围内。如本文使用的，对“基本上相同”的序列的引用指编码氨基酸替代、缺失、添加或者插入的序列，其不实质上改变本发明的多核苷酸编码的多肽的功能和/或免疫原性活性。
本发明还涉及编码本发明多肽的本发明的多核苷酸的变体。变体序列包括那些序列，其中该序列的一个或多个核苷酸已经被替代、缺失和/或插入。可以替代DNA的天然核苷酸的核苷酸具有碱基部分，其可以包括，但不限于，次黄苷、5-氟尿嘧啶、5－溴尿嘧啶、次黄嘌呤、1－甲基鸟嘌呤、5－甲基胞嘧啶，和三苯甲基化碱基。序列中核苷酸的糖部分还可以是经修饰的并且包括，但不限于，阿拉伯糖、木酮糖和己糖。此外，可以用乙酰基、甲基和/或硫代基团修饰核苷酸的腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺 嘧啶和尿嘧啶碱基。使用本领域中已知的标准技术可以制备和测试含有核苷酸替代、缺失、和/或插入的序列。
本发明的范围内还预期与本发明的多肽中那些特别示例或者天然存在的氨基酸不同的氨基酸替代。例如，非天然氨基酸可以替代多肽的氨基酸，只要具有替代氨基酸的多肽基本上保留与没有替代的氨基酸的多肽相同的功能活性。非天然氨基酸的实例包括，但不限于，鸟氨酸、瓜氨酸、羟脯氨酸、高丝氨酸、苯基甘氨酸、牛磺酸、碘代酪氨酸、2,4-二氨基丁酸、α-氨基异丁酸、4－氨基丁酸、2-氨基丁酸、γ-氨基丁酸、ε-氨基己酸、6－氨基己酸、2－氨基异丁酸、3－氨基丙酸、正亮氨酸、正缬氨酸、肌氨酸、高瓜氨酸、半胱磺酸、τ-丁基甘氨酸、τ-丁基丙氨酸、苯基甘氨酸、环己基丙氨酸、β－丙氨酸、氟－氨基酸、设计者氨基酸，如β－甲基氨基酸、C-甲基氨基酸、N-甲基氨基酸、和一般的氨基酸类似物。非天然氨基酸还包括具有衍生的侧基的氨基酸。此外，蛋白质中的任一氨基酸可以为D(右旋)型或者L(左旋)型。本发明的范围内还包括本发明多肽的蛋白质序列的等位基因变体。
氨基酸可以一般以下面的类别分类：非极性的、不带电的极性的、碱性的和酸性的。保守替代(其中具有一个类别氨基酸的本发明的多肽用相同类别的另一氨基酸替代)落入本发明的范围内，只要具有替代的多肽仍然保留与不具有该替代的多肽基本上相同的功能活性。编码序列中具有一个或多个氨基酸替代的多肽的多核苷酸包括在本发明的范围内。下面的表11提供了属于每个类别的氨基酸的实例列表。在表12中定义了单字母氨基酸缩写。
使用本领域中已知的标准方法可以产生本发明的流感病毒多肽的片段和变体并且使用本领域中已知的标准技术测试功能或者免疫原性的存在。例如，为了测试本发明的神经氨酸酶多肽的片段和/或变体，可以测定酶促活性。从而，普通技术人员可以容易制备和测试本发明多肽的片段和变体，并确定该片段或变体是否相对于全长或者非变异多肽保持活性。
本发明范围内预期的多核苷酸和多肽也可以按照与本文特别示例的本 发明的那些序列的更具体的同一性和/或相似性范围定义。序列同一性将通常大于60％，优选大于75％，更优选大于80％，甚至更优选大于90％，并且可以大于95％。与本文示例的序列相比，序列的同一性和/或相似性可以为49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%。除非另外指出，如本文使用的，两个序列的百分比序列同一性和/或相似性可以使用Karlin和Altschul(1990)的，如在Karlin和Altschul(1993)中改进的算法确定。这种算法整合到Altschul et al.(1990)的NBLAST和XBLAST程序中。可以用NBLAST程序,得分=100,字长=12进行BLAST搜索，以得到具有所希望的百分比序列同一性的序列。为了得到用于比较目的的缺口比对，可以使用如Altschul et al.(1997)的Gapped BLAST。当利用BLAST和Gapped BLAST程序时，可以使用各自程序(NBLAST和XBLAST)的默认参数。见NCBI/NIH网站。
本发明还预期这样的多核苷酸分子，其具有与本文示例的多核苷酸序列足够同源的序列，从而允许与该序列在标准的严格条件和标准方法(Maniatis et al.,1982)下杂交。如本文使用的，杂交的“严格”条件指这样的条件，其中通常在6x SSPE,5x Denhardt溶液,0.1%SDS,0.1mg/ml变性DNA中低于DNA杂交分子的解链温度(Tm)20-25℃下过夜进行。通过下面的公式描述解链温度Tm(Beltz et al.,1983):
Tm=81.5C+16.6Log[Na+]+0.41(%G+C)-0.61(%甲酰胺)-600/双链体长度(以碱基对计)。
通常如下进行洗涤：
(1)在1x SSPE,0.1%SDS中室温下洗涤两次，每次15分钟(低严格洗涤)。
(2)在0.2x SSPE,0.1%SDS中Tm-20℃下洗涤一次15分钟(中等严格洗涤)。
本发明还涉及本发明的流感病毒的基因编码的病毒蛋白质和肽。在一 个实施方案中，病毒蛋白是成熟HA蛋白。在特定实施方案中，成熟的HA蛋白包含下面的一个或多个：82位的丝氨酸；221位的亮氨酸；327位的苏氨酸；和/或482位的苏氨酸。在示例的实施方案中，成熟的HA蛋白质具有SEQ ID NO:33或SEQ ID NO:34中所示的氨基酸序列，或者SEQ IDNO:33或SEQ ID NO:34的功能和/或免疫原性片段或变体。在另一实施方案中，病毒蛋白是NA蛋白、NS蛋白、PB蛋白、PA蛋白、或者MA蛋白。本发明的病毒蛋白质和肽可以用于产生特异结合所述蛋白质或肽的抗体。本发明的病毒蛋白质和肽还可以用作疫苗组合物中的免疫原。
本发明还涉及用于诱导针对流感病毒的免疫应答的组合物和方法，所述流感病毒能够感染易感的宿主动物和引起呼吸系统疾病。本发明可以用于在易感的宿主动物中诱导针对任一亚型的流感病毒的免疫应答。例如，流感病毒可以是H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15或H16的HA亚型，和N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8或N9的NA亚型。在一个实施方案中，HA亚型是H3或者H5。在另一实施方案中，NA亚型是N7或者N8。在特定实施方案中，诱导针对亚型H3N8的流感病毒的免疫应答。在一个实施方案中，宿主动物是犬科动物。犬科动物包括野生的、动物园的和驯养的犬科动物，如狼、郊狼和狐狸。犬科动物还包括狗，尤其驯养的狗，如纯种和/或杂种陪伴狗、表演狗、役用狗、放牧狗、猎狗、守卫狗、警犬、赛犬和/或实验用狗。在特定实施方案中，宿主动物是驯养的狗，如灵
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在一个实施方案中，对动物施用有效量的本发明的免疫原性组合物，其足以诱导针对本发明的流感病毒的免疫应答。免疫应答可以是体液和/或细胞免疫应答。在特定实施方案中，免疫应答是保护性免疫应答，其能够在免疫后在一定的时间段内预防或者减小受免疫的宿主动物中的病毒感染。从而，本发明还涉及疫苗组合物和方法，其为接种的动物提供了针对本发明病毒的保护性免疫应答。
如本文所用的，本发明的疫苗或者免疫原性组合物可以包含无细胞的完整病毒，包括减毒的或者失活的病毒，或者病毒的部分，包括亚病毒颗粒(包括“分离疫苗”，其中处理病毒体以除去一些或者全部病毒脂类)、病 毒蛋白质(包括个体蛋白质和多种蛋白质的大分子复合体)、多肽、和肽，以及病毒感染的细胞系，或者这些任一种的组合。包含病毒感染的细胞系的疫苗或者免疫原性组合物可以包含多种细胞系，每种用不同的病毒毒株感染。
在本发明的一个实施方案中，可以用用一种或多种灭活的（例如，杀死的）和/或活的减毒流感病毒疫苗或者包含来自一种或多种病毒隔离群的一种或多种流感病毒抗原的疫苗免疫犬科动物。在一个实施方案中，流感病毒是马流感病毒。在另一实施方案中，流感病毒是马流感病毒，其编码或表达与犬科动物流感病毒多肽具有至少约90％，或者至少约95％，或至少约96%、或97%、或98%、或99%或更高氨基酸序列同一性的多肽。在一个实施方案中，用于本发明疫苗中的流感抗原与犬科动物流感病毒的HA抗原和/或NA抗原具有至少约96％序列同一性。
灭活疫苗的一个实例是EQUICINE IITM，其已经由Intervet Inc.(Millsboro,DE,USA)作为液体疫苗上市。EQUICINE IITM含有灭活的A/Pennsylvania/63流感病毒("A/Pa/63")和A/equine/Kentucky/93流感病毒("A/KY/93")与卡波姆(carbopol)(即
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(Intervet Inc.))。更具体地，一剂EQUICINE IITM含有：106.0EID50灭活的A/Pa/63、106.7EID50灭活的A/KY/93、0.25%体积的卡波姆，和足够产生总体积1ml的PBS。
灭活疫苗的另一实例是马流感病毒A/equine/Ohio/03("Ohio 03")。在一些实施方案中，这种疫苗含有CARBIGENTM，其是可以通过商业途径从MVP Laboratories,Inc.(Ralston,NE)得到的乳化的基于聚合物的佐剂。在这种疫苗中，剂量单位通常包含至少约250HA单位病毒、约250到约12,500HA单位病毒，或约1000到约6200HA单位病毒。CARBIGENTM的推荐浓度为约5到约30%(按质量计)。
活的减毒疫苗的一个实例是冻干疫苗形式的改性的活的equine/Kentucky/91("A/KY/91")流感，其可以用水重构。在一些实施方案中，用足够将疫苗剂量达到1ml总体积的疫苗级水进行重构。此类疫苗的方面在例如美国专利号6,436,408;6,398,774;和6,177,082中讨论，将它们 完整引入本专利作为参考。当重构时，这种疫苗的一个剂量可以例如含有每毫升107.2TCID50的A/KY/91、每毫升0.015克N-Z AMINE ASTM、每毫升0.0025克明胶，和每毫升0.04克D乳糖。N-Z AMINE ASTM是通过酪蛋白的酶促水解产生的氨基酸和肽的精制来源。N-Z AMINE ASTM由Kerry Bio-Science(Norwich,NY,USA)上市。
在优选实施方案中，疫苗包含在HA编码序列中与Florida/43/2004具有至少约93％同源性的H3流感抗原，例如equine/New Market/79毒株。优选的同源性为至少约96％，例如，equine/Alaska/1/91和equine/Santiago/85毒株。在下面的实施例中，将equine/Kentucky/91、equine-2/Kentucky/93、equine-1/Pennsylvania/63和equine Ohio/03流感抗原掺入疫苗中。优选的疫苗还包括包含equine/Wisconsin/03、equine/Kentucky/02、equine/Kentucky/93和equine/New Market2/93的疫苗。在下面的实施例中，使用H3N8病毒。然而，认为根据本发明也可以使用其他H3流感病毒。
可以通过常规手段制备活的减毒疫苗。此类手段一般包括例如，通过体外传代改变致病毒株、冷适应、通过遗传操作改变生物的致病性、制备嵌合体、在病毒载体中插入抗原、选择无毒性野生型毒株，等等。
在一些实施方案中，通过细胞培养、实验室动物、非宿主动物或者卵进行野生型病毒的连续传代得到活的减毒病毒毒株。在此类传代中基因突变的积累通常导致生物对最初宿主的毒性的不断丧失。
在一些实施方案中，通过用减毒的突变病毒和致病病毒共同感染允许细胞制备活的减毒病毒毒株。期望的所得重组病毒具有减毒病毒的安全性和编码来自致病病毒的保护性抗原的基因。
在一些实施方案中，通过冷适应制备活的减毒病毒毒株。冷适应的病毒具有仅在上呼吸道中发现的温度下复制的优点。产生冷适应马流感病毒的方法已经在美国专利号6,177,082中描述。期望的所得冷适应病毒赋予一种或多种下面的表型：冷适应、温度敏感性、显性干涉，和/或减毒。
在一些实施方案中，通过分子手段制备活的减毒病毒毒株，如点突变、 缺失、或插入以将致病病毒转化为与最初病毒相比不致病或者致病性降低的病毒，而保留最初病毒的保护性质。
在一些实施方案中，通过将保护性抗原的候选基因克隆到非致病性或致病性降低的病毒或其他生物的基因组中制备活的减毒病毒。
使用常规方法失活病毒可以制备失活的（如，“杀死的”）病毒疫苗。通常，此类病毒包括可以增强免疫应答的赋形剂，以及疫苗中常规使用的其他赋形剂。例如，在下面的实施例中，EQUICINE IITM包含
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通过用灭活化学品（例如，福尔马林、β丙内酯("BPL")、溴乙胺("BEA")、和二元氮丙啶("BEI"))处理病毒或者通过非化学方法（例如，热、冻/融或声处理）使得病毒不能复制来完成病毒的灭活。
在下面的实施例中，用equine/Ohio/03用作攻击病毒。已知其与Florida/43/04隔离群具有约99％同源性，并且表明在狗中诱导感染症状和血清转变。实施例18阐明了马流感疫苗在狗中的功效，显示了在用包含CARBIGENTM佐剂的疫苗组合物中灭活的Ohio 03抗原接种的狗中血凝抑制(或"HI"或"HAI")效价。表29显示了接种前、接种后和二次接种后，以及攻击后的效价。结果显示了接种的狗的接种后每个阶段的HI效价，对于对照有很小的或者没有增加。表30阐明了来自相同研究的临床病征、病毒分离和组织病理学结果。尽管被攻击的动物不显示出临床病征、病毒脱落，或者阳性组织病理学，但是阳性HI效价（表29）表明在经免疫的动物中显著的抗体效价。
应该指出本发明也包括其他H3流感病毒抗原疫苗。提供本说明书中描述的实施例和下面的实施例来阐明本发明的和它的优选实施方案，并且它们不限制要求保护的发明的范围。
还应该指出根据本发明可以使用不同于H3流感病毒抗原的流感抗原。此类抗原包括例如，来自equine/PA/63的那些抗原，其是马A1亚型(H7N7)。预期一种或多种此类此类抗原可以与或不与一种或多种H3流感抗原使用。
通常，以治疗有效量施用疫苗。“治疗有效量”是足够在犬科动物患 者中诱导针对靶抗原的保护应答的量。通常，如果剂量防止流感或其一种或多种（通常两种或多种）症状、延迟其发作、减少其扩散、使其减轻、抑制或消除，那么所述剂量是“治疗有效的”。典型的流感症状包括例如，发热（对于狗，通常≥103.0°F;≥39.4℃)、咳嗽、打喷嚏、组织病理学病变、眼分泌物、鼻分泌物、呕吐、腹泻、抑郁、体重减轻、作呕、咯血、和/或听得见的啰音。其他通常更严重的症状可以包括例如，肺、纵隔、或胸膜腔中出血；气管炎；支气管炎；毛细支气管炎；支持性支气管肺炎；和/或肺的上皮层和气管腔中嗜中性粒细胞和/或巨噬细胞渗入。
疫苗可以作为组合疗法的部分施用，组合疗法即包括疫苗自身外，还包括施用一种或多种额外的活性剂、佐剂、疗法等等的疗法。在该情况中，应该认识到如果将仅仅施用疫苗，那么构成“治疗有效”量的疫苗的量可以小于将构成“治疗有效”量的疫苗的量。其他疗法可以包括本领域中已知的那些，如抗病毒药疗法、镇痛剂、退热药疗法、祛痰药、抗炎药物、抗组胺药、治疗流感病毒感染引起的细菌感染的抗生素、休息，和/或施用液体。在一些实施方案中，本发明的疫苗与博德特氏菌疫苗、腺病毒疫苗和/或副流感病毒疫苗组合施用。
在一些实施方案中，例如，活的减毒疫苗的典型剂量为至少约103pfu/犬科动物，更典型地约103到约109pfu/犬科动物。在本专利中，“pfu”指“噬斑形成单位”。在一些实施方案中，活的减毒疫苗的典型剂量为至少约103TCID50/犬科动物，更典型地约103到约109TCID50/犬科动物。在一些实施方案中，活的减毒疫苗的典型剂量为至少约103EID50/犬科动物，更典型的约103到约109EID50/犬科动物。在一些实施方案中，被杀死的疫苗的典型剂量为至少约40HA单位，通常约40到约10,000HA单位，更通常为约500到约6200HA单位。在一些实施方案中，剂量为约6100到约6200HA单位。
在一些优选实施方案中，疫苗包含活的减毒疫苗，其浓度比免疫原性水平高至少约100.5pfu/犬科动物。在一些优选实施方案中，疫苗包含活的减毒疫苗，其浓度比免疫原性水平高至少约100.5TCID50/犬科动物。在一 些优选实施方案中，疫苗包含活的减毒疫苗，其浓度比免疫原性水平高至少约100.5EID50/犬科动物。
通过本领域公知的攻击剂量滴定研究技术可以通过实验确定免疫原性水平。此类技术通常包括用不同剂量的疫苗接种许多犬科动物，然后用毒性病毒攻击所述犬科动物以确定最小保护剂量。
影响优选剂量方案的因素可以包括例如，受试者的类型（例如，物种和品种）、年龄、体重、性别、饮食、活动、肺大小和状况；施用途径；使用的具体疫苗的功效、安全性，和免疫力持续时间分布；是否使用递送系统；和疫苗是否作为药物和/或疫苗组合的部分施用。从而，使用的实际剂量可以对于特定动物不同，并且因此，可以偏离上面给出的典型剂量。使用常规手段，确定此类剂量调整在本领域技术人员能力之内。还应该指出活的减毒病毒通常能够自身增殖；从而，施用的此类病毒的特定量不一定是关键的。
设想疫苗可以一次施用于犬科动物患者；或者备选地，在几天、几周、几个月或几年内两次或多次施用。在一些实施方案中，施用疫苗至少两次。在一些此类实施方案中，例如，施用疫苗两次，第二次剂量（例如，加强剂量）在第一次剂量后至少约2周施用。在一些实施方案中，施用疫苗两次，第二次剂量在第一次剂量后不大于约2周施用。在一些实施方案中，第二次剂量在第一次剂量后约2周到约4年施用、第一次剂量后约2到约8周、或第一次剂量后约3到约4周施用。在一些实施方案中，第二次剂量在第一次剂量后约4周施用。在上面的实施方案中，第一次和随后的剂量例如可以改变量和/或形式。然而，通常，剂量是相同的量和形式。当仅仅施用一次剂量时，该单次剂量中疫苗的量通常包含治疗有效量的疫苗。然而，当施用一次以上的剂量时，那些剂量中疫苗的量可以一起构成治疗有效量。
在一些实施方案中，在流感感染犬科动物受者之前施用疫苗。在此类实施方案中，例如，可以施用疫苗以预防、降低危险或延迟流感发作或其一种或多种（通常两种或多种）流感症状。
在一些实施方案中，在流感感染犬科动物受者后施用疫苗。在此类实施方案中，例如，疫苗可以减轻、抑制或消除流感或一种或多种（通常两种或多种）流感症状。
疫苗的优选组成取决于例如，疫苗是否是灭活的疫苗、活的减毒疫苗还是两者。它还取决于施用疫苗的方法。设想疫苗将包含一种或多种常规的可药用载体、佐剂、其他免疫应答增强剂、和/或载体（总称为“赋形剂”）。通常选择此类赋形剂以与疫苗中的活性成分相容。赋形剂的用途是本领域技术人员公知的。
术语“可药用的”以形容词用于指修饰的名词适于用于药品中。当它用于例如描述药物疫苗中的赋形剂时，它表征该赋形剂与组合物中的其他成分是相容的并且不会不利地损害预期的受者犬科动物。
可以通过常规方法施用疫苗，所述方法包括例如，粘膜途径（如鼻内、经口、气管内和眼），和肠胃外施用。粘膜施用对于活的减毒疫苗是尤其有利的。肠胃外施用对于灭活疫苗尤其有利。
粘膜疫苗可以是例如液体剂型，如可药用的乳剂、溶液剂、混悬剂、糖浆剂和酏剂。适于此类疫苗的赋形剂包括例如，常用于本领域中的惰性稀释剂，如水、盐水、葡萄糖、甘油、乳糖、蔗糖、淀粉粉末、链烷酸的纤维素酯、纤维素烷基酯、滑石、硬脂酸、硬脂酸镁、氧化镁、磷酸和硫酸的钠和钙盐、明胶、阿拉伯胶、藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮，和/或聚乙烯醇。赋形剂还可以包含多种湿润剂、乳化剂、悬浮剂、调味剂（例如，增甜）和/或芳香剂。
经口粘膜疫苗可以例如被压片或包胶以方便施用。此类胶囊剂或片剂可以含有控释制剂。对于胶囊剂、片剂和丸剂的情况，剂型还可以含有缓冲剂，如柠檬酸钠，或碳酸镁或钙或碳酸氢镁或钙。还可以用肠包衣制备片剂和丸剂。
设想可以通过犬科动物患者的饮用水和/或食物施用疫苗。还设想可以以膳食（treat）或玩具的形式施用疫苗。
“肠胃外施用”包括皮下注射、粘膜下层注射、静脉内注射、肌内注 射、胸骨内注射、经皮注射、和灌注。可注射的制剂（例如，无菌可注射的水性或油性混悬剂）可以根据本领域已知的用合适的赋形剂配制，所述赋形剂为如载体、溶剂、分散剂、湿润剂、乳化剂和/或悬浮剂。这些通常包括例如，水、盐水、葡萄糖、甘油、乙醇、玉米油、棉籽油、花生油、芝麻油、苯甲醇、1,3-丁二醇、林格液、等渗氯化钠溶液、温和的不挥发油（例如，合成的甘油一酯或二酯）、脂肪酸（例如，油酸）、二甲基乙酰胺、表面活性剂（例如，离子和非离子去污剂）、丙二醇，和/或聚乙二醇。赋形剂还可以包括少量的其他辅助物质，如pH缓冲剂。
疫苗可以包括增强犬科动物患者免疫应答（其可以包括抗体应答、细胞应答或两者），从而增强疫苗有效性的一种或多种赋形剂。此类赋形剂（或“佐剂”）的使用在使用灭活疫苗时可以尤其有益。佐剂可以是对犬科动物患者免疫系统的细胞具有直接影响的物质（例如，细胞因子或卡介苗（“BCG”））或间接影响的物质（脂质体）。通常合适的佐剂的实例包括油（例如，矿物油）、金属盐（例如，氢氧化铝或磷酸铝）、细菌组分（例如，细菌脂多糖、弗氏佐剂，和/或MDP）、植物组分（例如，Quil A)，和/或一种或多种具有载体作用的物质（例如，皂土、乳胶颗粒、脂质体，和/或Quil A、ISCOM)。如上面提到的，佐剂还包括例如CARBIGENTM和卡波姆。应该认识到本发明包括包含佐剂的疫苗以及不包含任何佐剂的疫苗。
设想为了保存可以将疫苗冻干（或者减少液体体积），然后在施用之前或施用时用液体重构。此类重构可以用如疫苗级水实现。
本发明还包括适于用于进行上述方法的药盒。药盒包含含有上述疫苗的剂型。药盒还包含至少一种额外的组分，和通常，关于使用该疫苗和额外组分的说明书。所述额外组分可以是例如，一种或多种额外成份（如一种或多种上面讨论的赋形剂、食品，和/或膳食（treat）），其可以在施用前或施用期间与疫苗混合。额外组分可以备选（或额外）包含用于对犬科动物患者施用疫苗的一种或多种装置。此类装置可以是例如，注射器、吸入器雾化器、吸管、镊子，或任何医学上可接受的递送载体。在一些实施 方案中，所述装置适于皮下施用疫苗。在一些实施方案中，所述装置适于鼻内施用疫苗。
也可以使用药学或生物领域中已知的其他赋形剂和施用方式。
本发明的疫苗或者免疫原性组合物还包含重组的基于病毒载体的构建体，其可以包含例如编码本发明的流感病毒的HA蛋白、NA蛋白、核蛋白、聚合酶碱性蛋白、聚合酶酸性蛋白，和/或基质蛋白的基因。可以用于制备重组载体/病毒构建体的任何合适的病毒载体预期用于本发明。例如，来自腺病毒、禽痘、疱疹病毒、牛痘、金丝雀痘、昆虫痘、猪痘、西尼罗病毒和本领域已知的其他病毒的病毒载体可以用于本发明的组合物和方法中。可以使用本领域中已知的标准遗传工程技术构建编码和表达组分的重组多核苷酸载体。此外，本文描述的多种疫苗组合物可以单独使用和相互组合使用。例如，动物的初次免疫可以使用重组的基于载体的构建体，其具有单个或者多个毒株组分，然后用包含失活病毒或者失活的病毒感染的细胞系的疫苗组合物二次加强。使用本发明的疫苗组合物的其他免疫方案是本领域技术人员显而易见的并且预计在本发明的范围内。
本发明还涉及重排列病毒，其包含本发明的流感病毒的至少一种基因或者基因组区段和来自本发明的不同的流感病毒或者来自不同于本发明病毒的流感病毒的病毒基因或者基因组区段的剩余部分。通过本发明的供体流感病毒的核酸与受体流感病毒的核酸的遗传重排列，然后选择包含供体病毒的核酸的重排列病毒，可以产生重排列病毒。产生和分离重排列病毒的方法是本领域中公知的(Fields et al.,1996)。在一个实施方案中，本发明的重排列病毒包含人类、鸟类、猪或者马流感病毒的基因或者基因组区段。本发明的重排列病毒可以包括来自供体和受体流感病毒的核酸的任一组合，只要重排列病毒包含来自本发明的供体流感病毒的至少一个基因或者基因组区段。在一个实施方案中，受体流感病毒可以是马流感病毒。
病毒蛋白质的天然的、重组的或者合成的多肽，和其肽片段也可以用作根据本发明方法的疫苗组合物。在一个实施方案中，疫苗组合物包含犬科动物流感病毒的多核苷酸或多肽。在一个实施方案中，疫苗组合物包含 编码具有SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、33、34、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76或78任一个中所示氨基酸序列的多肽，或者其功能和/或免疫原性片段或变体的多核苷酸。在特定实施方案中，编码SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、33、34、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76或78中所示氨基酸序列的多核苷酸分别包含SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75或77中所示核苷酸序列，或者编码SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、33、34、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76或78任一个的功能和/或免疫原性片段或变体的序列。在另一特定实施方案中，本发明的多核苷酸可以包含：SEQ ID NO:3的核苷酸1-2271；SEQ ID NO:5的核苷酸1-2148；SEQ ID NO:7的核苷酸1-657；SEQ ID NO:9的核苷酸1-1494；SEQ ID NO:11的核苷酸1-1410；SEQ ID NO:13的核苷酸1-756；SEQ ID NO:15的核苷酸1-1695；SEQ ID NO:19的核苷酸1-2271；SEQ ID NO:21的核苷酸1-2148；SEQ ID NO:23的核苷酸1-657；SEQ ID NO:25的核苷酸1-1494；SEQ ID NO:29的核苷酸1-756；SEQ ID NO:31的核苷酸1-1695；SEQ IDNO:47的核苷酸1-2277；SEQ ID NO:49的核苷酸1-2271；SEQ ID NO:51的核苷酸1-2148；SEQID NO:53的核苷酸1-690；SEQ ID NO:55的核苷酸1-1494；SEQ ID NO:57的核苷酸1-1410；SEQ ID NO:59的核苷酸1-756；SEQ ID NO:61的核苷酸1-1695；SEQ ID NO:63的核苷酸1-2277；SEQ ID NO:65的核苷酸1-2271；SEQ ID NO:67的核苷酸1-2148；SEQ ID NO:69的核苷酸1-690；SEQ ID NO:71的核苷酸1-1494；SEQ ID NO:73的核苷酸1-1410；SEQ ID NO:75的核苷酸1-756；SEQ ID NO:77的核苷酸1-1695。在另一实施方案中，疫苗组合物包含具有SEQID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、33、34、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76或78任一个所示氨基酸序列的多肽或其功能和/或免疫原性片段或变体。在另一实施方案中，疫苗组合物包含马流感病毒的多核苷酸或多肽，其中所述多核苷酸或多肽与犬科动物流感多核苷酸或多肽具有至少约90％、或者至少约95％、或至少约96%、或97%、或98%、或99%或更高序列同一性。在一个实施方案中，来自多种毒株的病毒多肽可以组合在疫苗组合物中并且用于接种宿主动物。例如，基于来自至少两种不同毒株的本发明的流感病毒的病毒HA蛋白质的多肽可以组合在疫苗中。该多肽可以与一种毒株同源或者可以包含“杂合”或“嵌合”多肽，其氨基酸序列来自结合或者连接来自至少两种不同毒株的多肽。制备病毒多肽的步骤是本领域公知的。例如，使用固相合成方法(Merrifield,1963)可以合成病毒多肽和肽。使用重组DNA技术也可以产生病毒多肽和肽，其中编码病毒蛋白质或者肽的多核苷酸分子在宿主细胞，如细菌、酵母或者哺乳动物细胞系中表达，并且使用本领域的标准技术纯化表达的蛋白质。
本发明的疫苗组合物还包括裸核酸组合物。在一个实施方案中，核酸可以包含编码本发明的流感病毒的HA和/或NA蛋白质的核苷酸序列。核酸接种的方法是本领域中已知的并且描述于例如美国专利号6,063,385和6,472,375。核酸可以为质粒或者基因表达盒的形式。在一个实施方案中，将核酸包裹在脂质体中提供，将所述脂质体施用于动物。
可以为根据本发明使用的疫苗组合物和免疫原，如多肽和核酸提供可药用载体或者稀释剂。可以根据制备药学上有用的组合物的已知方法配制用于本发明的化合物和组合物。在本领域技术人员公知和容易得到的许多来源中详细描述了制剂。例如，E.W.Martin,Easton Pennsylvania,Mack Publishing Company,19th ed.,1995的Remington’sPharmaceutical Science描述了可以用于本发明的制剂。通常，将配制本发明的组合物使得有效量的免疫原与合适的载体组合以便促进组合物的有效施用。用于本发明方法中的组合物还可以为多种形式。这些包括例如，固体、半固体和液体剂型，如片剂、丸剂、粉剂、液体溶液剂或混悬剂、栓剂、注射液和灌 注液，和喷雾剂。优选的形式取决于预期的施用方式和治疗应用。组合物还优选包括本领域技术人员已知的常规的可药用载体和稀释剂。用于本发明肽模拟物的载体或稀释剂的实例包括，但不限于，水、盐水、油，包括矿物油、乙醇、二甲基亚砜、明胶、环糊精、硬脂酸镁、葡萄糖、纤维素、糖、碳酸钙、甘油、氧化铝、淀粉和等同的载体和稀释剂，或者这些任一种的混合物。本发明免疫原的制剂还可以包含悬浮剂、保护剂、润滑剂、缓冲剂、防腐剂和稳定剂。为了提供施用此类剂量用于所希望的治疗性治疗，本发明的药物组合物将有利地包含基于包括载体或稀释剂的总组合物的重量按重量计约0.1%到45％，特别1到15％的一种或多种免疫原。
通过本领域公知的方法可以制备本发明的疫苗和免疫原性组合物。例如，通常将疫苗或者免疫原制备为注射剂，例如，液体溶液剂或者混悬剂。以与剂量制剂相容的方式和在受体中治疗有效和免疫原性的量施用疫苗或者免疫原。本领域技术人员可以容易地确定具体疫苗或者免疫原制剂的最佳剂量和施用模式。
还可以以多抗原肽(MAP)构建体的形式提供本发明的肽和/或多肽。已经在Tam(1988)描述了MAP构建体的制备。MAP构建体利用赖氨酸残基的核心基质，其上合成多个拷贝的免疫原(Posnett et al.,1988)。可以根据本发明的方法制备并在疫苗组合物中施用多种MAP构建体，每种含有相同或者不同的免疫原。在一个实施方案中，为MAP构建体提供一种或多种佐剂和/或与一种或多种佐剂一起施用。还产生了本发明的流感多肽并且作为包含一种或多种多肽的大分子蛋白质结构施用。公布的美国专利申请US2005/0009008描述了产生作为流感病毒疫苗的病毒样颗粒的方法。
根据本发明的方法，将本文描述的疫苗和免疫原性组合物施用于易感宿主，通常犬科动物，并且更通常为驯养的狗，以诱导保护性免疫以抵抗病毒对宿主随后的攻击或者感染的有效量和方式施用。在一个实施方案中，宿主动物是犬科动物。犬科动物包括野生的、动物园的和驯养的犬科动物，如狼、郊狼和狐狸。犬科动物还包括狗，尤其驯养的狗，如纯种和/或杂种陪伴狗、表演狗、役用狗、放牧狗、猎狗、守卫狗、警犬、赛犬和/或实验 用狗。在特定实施方案中，宿主动物是驯养的狗，如灵
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通常肠胃外、通过注射，例如皮下、腹膜内或者肌内注射施用疫苗或者免疫原。其他合适的施用方式包括经口或者经鼻施用。通常，将疫苗或者免疫原施用于动物至少两次，每次施用之间为一周或多周的间隔。然而，设想用于初次和加强施用疫苗或者免疫原的其他方案，并且该方案可以取决于从业医生的判断和被治疗的具体宿主动物。
使用本领域中已知的方法，可以将疫苗制剂中的病毒和病毒感染的细胞失活或者减毒。例如，通过暴露于低聚甲醛、福尔马林、β-丙内酯（BPL）、溴乙胺（BEA）、二元氮丙啶(BEI)、苯酚、紫外线、高温、冻融、声处理（包括超声处理）等可以失活或者减毒完整病毒和受感染的细胞。疫苗剂量中无细胞的完整病毒的量将通常为约0.1mg到约5mg，更通常约0.2mg到约2mg。包含病毒感染的细胞系的疫苗制剂的剂量将通常含有每剂约106到约108个细胞，更通常每剂约5x106到约7.5x107个细胞。用于动物的剂量中蛋白质或肽免疫原的量可以从约0.1μg到10000μg,或约1μg到5000μg,或约10μg到1000μg,或约25μg到750μg,或约50μg到500μg,或100μg到250μg，取决于接受剂量的动物的大小、年龄等等。
本发明的免疫原性或者疫苗组合物，如病毒或者病毒感染的细胞或者病毒蛋白质或肽可以与佐剂组合，通常刚好在施用前组合。设想用于疫苗制剂的佐剂包括苏氨酰基胞壁酰二肽(MDP)(Byars et al.,1987)、皂苷、Cornebacterium parvum、弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂、铝，或者这些任一种的混合物。适于用于本发明的方法和疫苗的多种其他佐剂，如明矾，是本领域中公知的，并且设想用于本发明。
本发明还涉及特异结合本发明的蛋白质或者肽的抗体。本发明的抗体包括单克隆和多克隆抗体组合物。优选地，本发明的抗体是单克隆抗体。在本发明中设想完整抗体和其抗原结合片段。从而，例如，合适的抗原结合片段包括Fab2、Fab和Fv抗体片段。本发明的抗体可以用可检测部分，如荧光分子标记(例如，萤光素或者酶)。
本发明还涉及用于检测和鉴定本发明的流感病毒和诊断本发明的流感 病毒对动物的感染的方法和组合物。本发明的方法包括检测来自动物的生物样品中犬科动物流感的存在。样品中犬科动物流感的检测可用于诊断动物中的犬科动物流感。该信息又可以提供基于区分随时间存在的犬科动物流感的水平来预后动物的能力，并且可以帮助选择动物的治疗剂和治疗，和帮助监测疗法。该方法还提供了确立在测试的动物中不存在犬科动物流感的能力。
检测动物中犬科动物流感的能力允许评估不同的地理位置中犬科动物流感的爆发。该信息还允许早期检测从而可以隔离受感染的动物，以限制疾病的传播，和允许早期干预治疗选择。此外，得到该信息可以为准备治疗许多患病动物的医学人员提供指导，包括装备药材供应，和如果可以得到，疫苗。
在一个实施方案中，本发明的方法涉及从受试动物，如犬科动物收集生物样品。生物样品可以是任一种生物样品，包括细胞、组织、毛发、全血、血清、血浆、乳头抽吸物、肺灌洗液、脑脊液、唾液、汗液和泪液。
动物受试样品可以来自怀疑具有犬科动物流感病毒的动物，无论该动物是否显示出疾病症状。还可以提供对照样品或者从已知没有犬科动物流感的动物收集。可以提供额外的对照例如，以减少假阳性和假阴性结果，和证实测定中的试剂主动检测犬科动物甲型流感病毒。
除了检测生物样品中犬科动物流感的存在或不存在，本发明中使用的检测方法可以检测犬科动物流感病毒中的突变，如核酸序列的改变，其可以由环境、药物治疗、遗传操作或者突变、损伤、食物的改变、衰老或者动物的任何其他的特征引起。突变还可以导致犬科动物甲型流感变得抵抗以前有效的药物，或者使得病毒感染和在不同物种的动物或者人类中繁殖。例如，已经表明鸟类甲型流感病毒感染其他动物和人。
在用于检测动物中流感病毒的一个实施方案中，通过收集高质量的样品、它们快速运输到检测设施、和在实验室检验前合适的保存方便了诊断。在含有受感染的细胞和分泌物的样品中最佳地检测到病毒。在一个实施方案中，在临床症状发作后前3天内采集用于直接检测病毒抗原和/或核酸和 /或病毒分离的样品。多种类型的样本适于诊断上呼吸道的病毒感染，包括，但不限于，鼻拭子、鼻咽拭子、鼻咽抽吸物、鼻洗液和喉咙拭子。除了拭子外，还可以采集组织或者血清的样品，并且还可以进行侵入性步骤。
在一个实施方案中，收集呼吸系统样品并以1-5ml病毒运送培养基运输。满足多种病毒的回收的多种培养基可通过商业途径获得。向运送培养基中加入临床样品。还可以用病毒运送培养基运送鼻或者鼻咽拭子。运送培养基的一个实例是10克小牛肉浸汁和2克牛白蛋白级分V，加入到无菌蒸馏水至400m。也可以加入抗生素，如0.8ml硫酸庆大霉素溶液(50mg/ml)和3.2ml两性霉素B(250μg/ml)。优选通过过滤消毒培养基。鼻洗液，如无菌盐水(0.85%NaCl)也可以用于收集呼吸系统病毒的样品。
在一个实施方案中，在临床症状发生后不久，优选不迟于7天内，从急性期动物的1－5ml量的全血收集血清。还例如在症状发生后约14天收集恢复期血清样品。在中和试验中，血清样品可以用于检测抗呼吸系统病毒的抗体。
在一个实例中，可以在一定期限内(例如，每天一次，每周一次，每月一次，每半年一次或者每年一次)从个体动物收集样品。在一定时期内从个体动物得到多个样品可以用于验证来自更早检测的结果，和/或鉴定对特定治疗，例如，对所选的治疗药物的应答或者抗性。
本发明的方法可以用于检测来自动物的受试样品中一种或多种病理物质的存在，和每种病理物质的水平。可以使用用于检测病理物质的任何方法，包括但不限于，抗体测定法，包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、间接荧光抗体(IFA)检测、血细胞凝集，和血细胞凝集抑制(HI)测定法，和蛋白质印迹。也可以使用已知的细胞培养方法。使用细胞培养物的免疫荧光或者细胞培养基(上清液)的HI测定法，可以进一步鉴定阳性培养物。
此外，可以使用检测核酸(DNA或者RNA)或者蛋白质的方法。此类方法包括，但不限于，聚合酶链式反应(PCR)和逆转录酶(RT)PCR测试和实时测试，和定量核酸酶保护测定法。可利用通过商业途径可获得的测试试剂盒用于进行这些测定法。例如，QIAGEN(Valencia,CA)出售一步 RT-PCR试剂盒，和病毒RNA提取试剂盒。
在一个实施方案中，该方法利用对本发明的病毒或病毒蛋白质特异的抗体。在特定实施方案中，利用对本发明病毒的HA蛋白质特异的抗体。在一个实施方案中，使用对本发明病毒的NP蛋白质特异的抗体。从动物得到合适的样品，如来自鼻或者鼻咽区域的样品，并从中分离病毒或者病毒蛋白质。然后对病毒组分筛选对蛋白质，如本发明病毒的HA或者NP特异的抗体的结合。在另一实施方案中，从动物得到血清样品(或者其他含有抗体的样品)并对血清筛选结合本发明病毒的蛋白质的抗体的存在。例如，可以进行ELISA测定，其中平板壁具有结合到壁的HA和/或NP蛋白质，或者其肽片段。然后将平板壁与来自受试动物的血清或者抗体接触。动物中特异结合HA和/或NP蛋白质的抗体的存在表明该受试动物受到或者已经受到本发明的流感病毒的感染。
在一个实施方案中，通过测定生物样品中抗病理物质的抗体的存在或不存在，检测病理物质的存在。在动物受感染后可以在血液检验中检测到抗体之前，需要一定的时间(例如，数月)。抗体一旦形成，通常持续许多年，甚至在成功地治疗该疾病之后。发现针对犬科动物甲型流感病毒的抗体不能指出感染是最近的还是在过去的某个时间。
还可以用液体进行抗体测试。抗体测定法包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、间接荧光抗体(IFA)测定法，和蛋白质印迹。优选地，使用多种测定法，如ELISA或者IFA，接着通过蛋白质印迹进行抗体测试。在两步方法中，使用ELISA或者IFA测定法，接着通过蛋白质印迹进行抗体测定法。认为ELISA是比IFA更可靠和更准确的测定法，但是如果不能利用EILSA，那么可以使用IFA。蛋白质印迹测试(其是更特异的测试)也可以在所有动物中进行，尤其在那些在ELISA或者IFA测定中检测为阳性或者临界阳性(含糊的)的动物中进行。
可以用于检测流感病毒的其他基于抗体的测试包括血细胞凝集抑制测定法。如所述的使用鸡或者火鸡红细胞(Burleson et al.,1992)和Kendal et al.,1982)，可以检测来自动物的生物样品中的血细胞凝集活性。在一个实 施方案中，将本发明的流感或者HA蛋白或者肽与含有血清或者抗体的测试样品接触。然后加入来自动物如鸟的红细胞(RBC)。如果存在抗HA的抗体，那么RBC将不凝集。如果不存在抗HA的抗体，那么在HA存在下，RBC将凝集。对标准血细胞凝集抑制测定法的变更和修改是本领域中已知的并且设想在本发明的范围内。
通过从样品如鼻或者鼻咽拭子分离病毒，可以确定动物的感染。使用标准方法，包括细胞培养和鸡胚接种，可以进行病毒分离。
在进一步的实施方案中，可以用基于核酸的测定法检测本发明的病毒。在一个实施方案中，从动物得到核酸样品并将该核酸进行PCR，如果该核酸含有对本发明的流感病毒特异的序列，那么使用的引物将产生扩增产物。在特定实施方案中，在测定中将RT-PCR用于本发明病毒。在示例的实施方案中，用实时RT-PCR测定本发明的流感病毒。PCR、RT-PCR和实时PCR方法是本领域中已知的并且已经在美国专利号4,683,202;4,683,195;4,800,159;4,965,188;5,994,056;6,814,934;和Saiki et al.(1985);Sambrook et al.(1989);Lee etal.(1993);和Livak et al.(1995)中。在一个实施方案中，PCR测定法使用对流感基质(MA)基因和/或HA基因特异的寡核苷酸。还可以对扩增产物测序以确定该产物是否具有本发明的流感病毒的序列。其他基于核酸的测定法可以用于检测和诊断本发明病毒的病毒感染并且设想此类测定法在本发明的范围内。在一个实施方案中，将含有核酸的样品进行基于PCR的扩增，使用正向和反向引物，其中所述引物对病毒多核苷酸或者基因序列特异。如果样品中的核酸是RNA，那么可以进行RT-PCR。对于实时PCR，将可检测的探针与引物一起使用。
对许多循环流感病毒的血凝素(HA)基因特异的引物组是已知的，并且正在被不断开发出来。流感病毒基因组是单链RNA，并且必须使用逆转录酶(RT)聚合酶进行DNA拷贝(cDNA)。例如，使用RT-PCR对RNA基因组的扩增需要一对寡核苷酸引物，其通常基于甲型流感病毒亚型的已知的HA序列和神经氨酸酶(NM)-1设计。可以选择引物使得它们将特异扩增仅一种病毒亚型的RNA。使用亚型特异的引物产生的DNA可以通过分子遗 传学技术如测序进一步分析。试验优选用阳性对照进行，或者产物通过测序并与已知序列比较来验证。不存在目标PCR产物(即，“阴性”结果)不能排除病毒的存在。然后可以在几小时内从临床拭子或者感染的细胞培养物得到结果。甲型流感病毒的PCR和RT-PCR试验由Fouchier et al.,2000和Maertzdorf et al.,2004描述。
本发明还涉及筛选对本发明的病毒具有抗病毒活性的化合物或药物的方法。在一个实施方案中，将本发明的病毒感染的细胞与受试化合物或者药物接触。然后测定接触后病毒的量或者病毒活性。可以选择显示出抗病毒活性的那些化合物或者药物用于进一步评估。
本发明还涉及用本发明的流感病毒感染的分离的细胞。在一个实施方案中，所述细胞是犬科动物细胞，如犬科动物肾上皮细胞。
本发明还涉及用编码本发明多肽的本发明多核苷酸转化的细胞。优选地，在本发明的表达构建体中提供所述多核苷酸序列。更优选地，所述表达构建体提供了在细胞中过表达有效连接的本发明的多核苷酸。在一个实施方案中，用多核苷酸序列转化细胞，所述多核苷酸序列包含编码SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、33、34、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76或78的任一个中显示的氨基酸序列，或者其功能片段或者变体的序列。在特定实施方案中，用编码SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、33、34、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76或78中所示的氨基酸序列的多核苷酸转化的细胞分别包含SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75或77中所示的核苷酸序列，或者编码SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、33、34、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76或78的任一个的功能片段或者变体的序列。从而，本发明涉及用包含SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、47、 49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75或77的任一个中所示的核苷酸序列或者SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75或77的任一个的片段或者变体，包括简并变体的多核苷酸序列转化的细胞。
所转化的细胞可以是真核细胞，例如，植物细胞，包括原生质体，或者转化的细胞可以是原核细胞，例如，细菌细胞，如大肠杆菌或者枯草芽孢杆菌。动物细胞包括人细胞，哺乳动物细胞，部分犬科动物细胞、鸟类细胞和昆虫细胞。植物细胞包括，但不限于，双子叶植物细胞、单子叶植物细胞和针叶树细胞。
本发明还涉及表达和产生本发明的病毒蛋白或者多肽的转基因植物。本发明设想用本发明的多核苷酸转化或者经育种而含有本发明的多核苷酸的植物、植物组织和植物细胞。优选地，在植物、植物组织或者植物细胞中过表达本发明的多核苷酸。植物可以用于产生本发明的流感疫苗组合物并且可以通过植物的消费施用疫苗(见，例如，美国专利号5,484,719和6,136,320)。
本发明还涉及用于检测病毒或者诊断本发明的病毒感染的试剂盒。在一个实施方案中，试剂盒包含本发明的抗体，其特异结合本发明的流感病毒，或者其抗原性部分。在另一实施方案中，试剂盒包含本发明的一种或多种多肽或者肽。在特定实施方案中，所述多肽具有SEQ ID NO.2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、33、34、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76或78任一个中所示的氨基酸序列，或者其功能和/或免疫原性片段或变体。在另一实施方案中，试剂盒包含一种或多种本发明的多核苷酸或者寡核苷酸。在特定实施方案中，所述多核苷酸具有SEQ ID NO.1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75或77任一个中所示的核苷酸序列，或者其片段或者变体。试剂盒可以任选包含一种或多种对照抗体、对照多肽或者 肽，和/或对照多核苷酸或者寡核苷酸。试剂盒的抗体、多肽、肽、多核苷酸和/或寡核苷酸可以在合适的容器或者包装中提供。
本申请还涉及杂种狗作为流感病毒感染和发病机理模型的用途。在一个实施方案中，对杂种狗接种本发明的流感病毒，如犬科动物流感病毒。任选地，接种后可以对狗施用治疗剂。在用病毒接种之前，还可以对狗施用组合物用于产生针对流感病毒的免疫应答。可以在接种之前和/或之后得到组织、血液、血清和其他生物样品并使用本领域中已知的方法检查病毒的存在和组织的发病机理，所述方法包括，但不限于，PCR、RT-PCR、核酸测序，和免疫组织化学。
将犬科动物流感病毒毒株(称作“A/canine/Florida/43/2004”和“A/canine/Florida/242/2003”)于2006年10月9日保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，P.O.Box1549,Manassas,VA20108，其中犬科动物流感病毒毒株“A/canine/Florida/43/2004”的保藏号为PTA-7914，犬科动物流感病毒毒株“A/canine/Florida/242/2003”的保藏号为PTA-7915。将犬科动物病毒毒株(称作“canine/Jax/05”和“canine/Miami/05”)于2006年10月17日保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，P.O.Box1549,Manassas,VA20108，其中犬科动物流感病毒毒株“canine/Jax/05”(也称作“A/Canine/Jacksonville/05”)的保藏号为PTA-7941，犬科动物流感病毒毒株“canine/Miami/05”(也称作“A/Canine/Miami/05”)的保藏号为PTA-7940。已经将主题病毒毒株保藏在这样的条件下，其确保在本专利申请待决期间，根据37CFR1.14和35U.S.C.122授权的专利和商标委员(Commissioner of Patentsand Trademarks)决定的人可以得到所述培养物。在提交主题申请的副本或其后续申请的国家，如需要可以按照所述国家的外国专利法获得所述保藏物。然而，应该理解保藏物的可得性不构成实施本发明而损害政府行为授予的专利权的许可。
此外，将根据微生物保藏布达佩斯条约的规定保藏主题病毒保藏物并且可以被公众获得，即将进行所有必要的管理以保存它而确保在供应保藏物样品的最近请求后至少5年的期间内和在任何情况下，保藏日后的至少30年期间内或者可以出版公开该培养物的任何专利的可实施期间内是存活的和未受污染的。保藏人承认当请求时，由于保藏物的条件保藏机构不能提供样品时而更换保藏物的的义务。当公开该保藏物的专利被授权时，主题培养保藏物对公众可得性的所有限制都将被不能改变地废除。
表57阐明了在鉴定为A/canine/Florida/43/2004(Ca/Fla/43/04)的犬 科动物流感病毒以及H3N8马隔离群以及canine/Florida/242/2003隔离群的血凝素(或“HA”)、神经氨酸酶（或“NA”）和核蛋白（NP）基因编码的氨基酸之间的相似性。
本文公开的任一实施方案的任一元素可以与本文的任何其他元素或者实施方案组合，并且特别设想此类组合在本发明的范围内。
本文提及或者引用的所有专利、专利申请、临时申请和出版物都完整(包括所有图和表)引入本文作为参考，直到它们与本说明书的明确教导不一致的程度。
实施例1－6的材料和方法
从灵
Figure SMS_15
收集血液和鼻拭子
从在赛跑狗舍中经历呼吸系统疾病爆发的临床上患病的或者正常的灵
Figure SMS_16
通过颈静脉穿刺收集急性和恢复期血液样品。在急性样品后4到12周收集恢复期样品。收获血清并在－80℃保存。收集鼻拭子并在递交用于细菌分离之前置于具有炭的Amies运送培养基(Becton Dickinson Biosciences)中。
灵
Figure SMS_17
的尸体剖检
由佛罗里达大学兽医学院(University of Florida College of VeterinaryMedicine(UF CVM))的解剖病理学处(Anatomic Pathology Service)对2004年1月在佛罗里达赛场的爆发中死亡的8只灵
Figure SMS_18
的5只进行完全的尸体剖检。另一只狗的尸体剖检在私立的兽医诊所进行，将组织递交到UF CVM用于组织病理学诊断。将组织用10％中性缓冲福尔马林固定，包埋在石蜡中，并对5-μm切片用苏木精和伊红染色用于组织病理学诊断或者处理用于如下述的免疫组织化学。递交未固定的组织用于细菌培养并且也保存在－80℃。
犬科动物呼吸系统病原体的血清学试验
将配对的急性和恢复期血清样品递交给康耐尔大学兽医学院(CornellUniversity College of Veterinary Medicine)的动物健康诊断实验室(Animal HealthDiagnostic Laboratory(AHDL))，对犬瘟热病毒、2型腺病毒和副流感病毒进行血清中和测定。抗体效价表达为抑制细胞培养物的病毒感染的血清的最终稀释度。血清转变表明病毒感染，将血清转变定义为急性和恢复期样品之间抗体效价升高≥4倍。没有检测到对这些病毒病原体的血清转变。
犬科动物细菌呼吸系统病原体的微生物试验
将配对的鼻拭子和死后组织递交给UF CVM的诊断临床微生物学/寄生虫学/血清学处(Diagnostic Clinical Microbiology/Parasitology/Serology Service)用于细菌分离和鉴定。在非选择培养基以及选择博德特氏菌(Bordetella)种(Regan-Lowe;Remel)和支原体(Mycoplasma)种(Remel)的培养基上培养样品。在没有报告生长前，保持所有培养物21天。还将一些灵
Figure SMS_19
的鼻拭子递交给堪萨斯州立大学兽医学院(Kansas StateUniversity College of Veterinary Medicine)的诊断医学/病理生物学系(Departmentof Diagnostic Medicine/Pathobiology)用于细菌培养。在所检验的70只临床上患病的狗中，从1只狗的鼻腔分离支气管博德特氏菌(Bordetella bronchiseptica)，而从33只狗的鼻腔回收支原体。通常用化脓性鼻涕从狗的鼻腔回收出血败血性巴斯德氏菌(Pasteurellamultocida)。在2004年1月的爆发中死亡的两只狗在死亡后肺中具有大肠杆菌的不足的生长，一只狗具有大肠杆菌和犬链球菌(Streptococcus canis)的不足的生长，另一只具有铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)和酵母的不足的生长。从死亡狗的气管或者肺中没有分离到支气管博德特氏菌或者支原体。
从死后组织分离病毒
将冷冻的组织解冻并在10倍体积的补充0.5%牛血清白蛋白(BSA)和抗生素的极限必需培养基(MEM)中匀浆。通过离心除去固体碎片并将上清 液接种到培养的细胞或者10天龄的含胚的鸡蛋中。将来自死亡灵
Figure SMS_20
的组织匀浆物接种到不同的细胞培养物中，该培养物支持多种病毒病原体的复制。细胞培养物包括Vero(非洲绿猴肾上皮细胞,ATCC No.CCL-81)、A-72(犬肿瘤成纤维细胞,CRL-1542)、HRT-18(人直肠上皮细胞,CRL-11663)、MDCK(犬肾上皮细胞,CCL-34)、原代犬肾上皮细胞(AHDL,Cornell University)、原代犬肺上皮细胞(AHDL)和原代牛睾丸细胞(AHDL)。在补充2.5ug/mL TPCK-处理的胰蛋白酶(Sigma)的MEM中培养MDCK和HRT细胞；在补充10％胎牛血清和抗生素的MEM中培养剩余的细胞系。在25cm2瓶中37℃下在含有5%CO2的增湿空气中培养细胞。用经补充的MEM接种对照培养物。每天观察培养物的形态改变并在接种后5天收获。将收获的液体和细胞通过离心澄清并如对最初接种所描述的接种在新鲜细胞上；进行两次盲法传代。使用鸡或者火鸡血红细胞如所述的(Burleson et al.,1992;Kendal et al.,1982)测定澄清的上清液中的血细胞凝集活性。对于鸡胚中的病毒分离，将0.1mL组织匀浆物接种在尿膜囊中并在35℃下培养48小时。两次盲法传代后，如所述的测定尿囊液中的血细胞凝集活性(Burleson et al.,1992;Kendalet al.,1982)。
RT-PCR、核苷酸测序和系统进化分析
使用RNeasy试剂盒(Qiagen,Valencia,CA)根据生产商的使用说明，从组织培养物上清液或者尿囊液提取总RNA。使用一步RT-PCR试剂盒(Qiagen,Valencia,CA)根据生产商的使用说明将总RNA(10ng)逆转录成cDNA。如以前描述的(Klimov et al.,1992a)，使用通用的基因特异性引物组进行cDNA中8种流感病毒基因的编码区的PCR扩增。所得DNA扩增子用作Applied Biosystems3100自动化DNA测序仪上的自动化测序的模板，使用循环测序染料终止化学(ABI)。用
Figure SMS_21
版本10.0(Accelyrs)(Womble,2000)分析核苷酸序列。用Phylogeny Inference/>
Figure SMS_22
版本3.5估计系统发生和从核苷酸序列计算自展值(Felsenstein,1989)。使用/>
Figure SMS_23
程序(Kumar et al.,2004)中实现的Tamura-Nei gamma模型，将系统树与近邻连接分析产生的那些系统树比较，并通过/>
Figure SMS_24
4.0Beta程序(Sinauer Associates)证实。
狗的实验接种
使用四只6个月龄的特定无病原体的小猎兔犬[2只雄性和2只雌性(LibertyResearch)]。体检和基线血试验，包括全血细胞计数/微分、血清化学小组和尿分析确定动物是健康的。将它们养在试验动物照料评估和认证协会(Association for Assessmentand Accreditation of Laboratory Animal Care)认证的BSL2-增强型设施中。每天两次持续7天记录基线直肠温度。通过异丙酚(
Figure SMS_25
Zeneca Pharmaceuticals,0.4mg/kg体重以生效)的静脉内注射麻醉狗用于用气管内插管进行插管法。每只狗接种总剂量为106.6半数组织培养感染量(TCID50)的A/Canine/Florida/43/2004(Canine/FL/04)(H3N8)病毒，将一半的剂量通过气管内插管施用于远端气管并将另一半剂量通过导管施用于鼻道深处。接种后(p.i.)14天，每天两次进行体检和直肠温度记录。通过颈静脉穿刺在接种后0、3、5、7、10和14天收集血样(4mL)。在接种后0到5、7、10和14天用聚酯拭子(FisherScientific)从每只狗收集鼻和鼻咽样品。将拭子置于病毒运送培养基(Remel)中并保存在－80℃。通过在接种后5天静脉内接种/>
Figure SMS_26
溶液(1mL/5kg体重;Schering-Plough Animal Health Corp)对两只狗实施安乐死(1只雄性和1只雌性)并在第14天对剩下的2只狗进行尸体剖检。如所述的处理用于组织学分析的组织。用于病毒培养的组织在－80℃保存。该研究得到佛罗里达大学机构动物管理和使用委员会(University ofFlorida Institutional Animal Care and Use Committee)的批准。
病毒从实验接种的狗的脱落
通过离心澄清拭子运送培养基制备的肺匀浆物和拭子提取物的连续稀释液用补充0.5%BSA和抗生素的MEM建立。如所述的(Burleson et al.,1992)使用单层MDCK细胞在6孔组织培养板中进行噬菌斑测定。用含有 0.8%琼脂糖和1.5ug/mL TPCK-胰蛋白酶的补充的MEM覆盖接种的细胞单层。在固定和用结晶紫染色前，在含有5%CO2的增湿的空气中37℃下培养细胞72小时。病毒浓度表达为每克组织或者每个拭子的噬斑形成单位(PFU)。
免疫组织化学
在Bond-RiteTM载玻片(Richard-Allan Scientific,Kalamazoo,MI)上封固来自灵
Figure SMS_27
和小猎兔犬的脱蜡和再水化的5-μm肺组织切片并随后用蛋白酶K(DakoCytomation,Carpenteria,CA)接着用过氧化物酶封闭试剂(/>
Figure SMS_28
EnVisionTMPeroxidase Kit,DakoCorp.)处理。将切片与抗犬瘟热病毒(VMRD,Inc.)、犬2型腺病毒(VMRD,Inc.)、犬副流感病毒(VMRD,Inc.)或者甲型流感H3(Chemicon International,Inc.)的单克隆抗体的1:500稀释液在室温下温育2小时。对照包括用小鼠IgG(1mg/mL,Serotec,Inc.)温育相同的切片，并温育单克隆抗体与正常的犬肺切片。用一级抗体处理后，用二级免疫过氧化物酶和过氧化物酶底物试剂(/>
Figure SMS_29
EnVisionTM Peroxidase Kit,Dako Corp.)根据生产商的使用说明温育切片。将切片用苏木精复染，用Clarifier#2和Bluing Reagent(Richard-AllanScientific,Kalamazoo,MI)处理，脱水，并用Permount(ProSciTech)盖片。
血细胞凝集抑制(HI)测定法
在37℃下用受体破坏酶(RDE,Denka)(1份血清:3份RDE)温育血清样品16小时，然后在56℃热失活60分钟。在37℃下在MDCK细胞中培养Influenza A/Canine/FL/04(H3N8)病毒36-48小时。收获病毒培养上清液，通过离心澄清，并在－80℃保存。如以前描述的进行HI测定法(Kendal et al.,1982)。简言之，将25μl中的4血凝单位病毒加入微量滴定孔中等体积的连续稀释的血清，并在室温温育30分钟。加入等体积的0.5%v/v火鸡红细胞并在30分钟后通过视觉评估血细胞凝集效价。将终点HI效价定义为完全抑制血细胞凝集的血清的最后稀释度。将血清转变定义为配对的 急性和恢复期样品之间的HI效价≥4倍增加。将单个样品的血清阳性定义为≥1:32的HI抗体效价。
微量中和(MN)测定
通过如以前描述的MN测定法(Rowe et al.,1999)检测对A/Canine/FL/04(H3N8)的中和血清抗体应答，只是在测定前对犬血清进行如上述的RDE处理。将终点效价定义为得到病毒的100TCID5050%中和的血清的最高稀释度。将血清转变定义为配对的急性和恢复期样品之间MN效价≥4-倍增加。将单个样品的血清阳性定义为MN效价≥1:80。
下面是阐明实施本发明方法的实例。不应该将这些实施例理解为限制。除非另外指出，所有百分数都是按重量计并且所有溶剂混合物比例都是按体积计。
实施例1
在2004年1月，在Florida赛场的2个狗舍中喂养的22只竞赛灵
Figure SMS_30
和为这些狗舍提供狗的当地农场中发生了呼吸系统疾病的爆发。在每个狗舍建筑中有约60只狗，农场中约300只狗。在6天内发生了爆发，之后没有鉴定到新的病例。22只狗的14只具有39.5到41.5℃的发热，发咝的作呕性咳嗽10到14天，并且最终恢复。在剩余的8只狗中，6只明显健康的狗出乎意料地死亡，具有口和鼻出血。两只其他狗由于快速恶化，在发生口鼻出血的24小时内实施安乐死。这些狗都具有41℃发热。8例死亡中4例在狗舍建筑物中发生，4例在农场发生。50％的死亡发生在爆发的第3天。22只狗的年龄为17个月到4岁，但是73％的为17到33个月龄。
两种临床综合征是明显的：较轻微的病，其特征是最初的发热和然后咳嗽10－14天(14只狗)，随后恢复，或者过急性死亡，伴随着呼吸道中的出血(8只狗，死亡率为36％)。对8个死亡病例的6例进行了尸体剖检。所有狗都在肺、纵隔和胸膜腔中具有广泛的出血。对呼吸道的组织学检查揭示除了肺部出血外，所有狗都具有气管炎、支气管炎、细支气管炎和化 脓性支气管肺炎(图3)。这些组织中上皮层和气道腔中浸润嗜中性粒细胞和巨噬细胞。将从这些狗制备的肺匀浆物接种到多种猴、人、牛和犬细胞系用于病毒培养。来自一条狗的肺匀浆物在胰蛋白酶存在下在培养的Madin-Darby犬肾上皮细胞(MDCK)中引起细胞病变效应，并且细胞培养上清液凝集了鸡红细胞。通过商业ELISA检测甲型和乙型流感病毒的核蛋白，和通过使用对甲型流感病毒的基质基因特异的引物进行PCR分析，提供甲型流感病毒的初步证据。此外，通过针对马甲型流感H3亚型的参照抗血清抑制了血细胞凝集活性，但是通过对人甲型流感亚型H1-H11和H13特异的抗血清没有抑制血细胞凝集活性(表3)。为了表征病毒的分子性质，我们测定了病毒基因组的8个RNA区段的核苷酸序列。与已知的流感病毒基因的序列比较和系统进化分析表明犬分离群的8种基因与来自同时代的马甲型流感(H3N8)病毒最相似，它们与所述病毒的基因共有≥96-97%的序列同一性(图1A，表4)。相比，来自鸟类、猪和人甲型流感分离株的代表性基因与犬分离群具有≤94%同一性(表4)。这些数据将犬分离群A/Canine/Florida/43/04(Canine/FL/04)鉴定为与马流感病毒的同时代谱系密切相关的甲型流感H3N8病毒。因为犬分离群的所有基因都是马流感病毒来源的，所以我们推断马流感病毒的整个基因组已经转移到狗。
实施例2
为了研究Canine/FL/04在灵
Figure SMS_31
中的临床和病理学观察中的作用，我们使用抗甲型流感H3的单克隆抗体对肺组织进行了免疫组织化学染色(IHC)。在支气管和细支气管上皮细胞的细胞质、支气管腺上皮细胞和气道腔和肺泡腔的巨噬细胞中总是检测到病毒H3抗原(图2A)。这些数据支持在多只狗中H3亚型流感病毒的肺部感染的诊断。
实施例3
为了确定Canine/FL/04-样病毒参与呼吸系统疾病爆发的病因，我们通过血细胞凝集抑制(HI)和微量中和法(MN)分析了来自11只病狗和16只无 症状接触狗的急性和恢复期血清。在两种测定法中，在11只中的8只(73％)病狗中发生了血清转变，其定义为对Canine/FL/04的抗体效价从急性到恢复期升高≥4-倍(表1)。在HI测定中，16只中的6只(38％)无症状接触狗中发生血清转变，而在MN测定法中，16只中的8只(50％)血清转变(表1)。血清转变数据表明Canine/FL/04-样病毒对狗的感染，其与多数动物中呼吸系统疾病的发作在时间上吻合。
在与病狗一起喂养的额外的46只无症状狗的爆发后3个月，收集单个血清样品。其中，在两种测定法中43只(93％)为血清阳性。对于所测试的73只狗的总群体中，93％的在两种测定中为血清阳性，包括82%(9/11)只病狗和95%(59/62)健康接触狗。没有呼吸系统疾病史的狗中的高血清阳性率表明犬科动物流感病毒的多数感染是亚临床的并且提示病毒在狗中的有效传播。亚临床感染是否促进病毒的传播还是未知的。
实施例4
为了更好地理解Canine/FL/04病毒感染狗的能力，用106.6半数组织培养感染量(TCID50)通过气管内和鼻内途径接种四只6月龄purpose-品种的小猎兔犬的每一只。所有狗在接种后前2天(p.i.)都发生发热(直肠温度≥39℃)，但是在14天的观察期内没有一只显示出呼吸症状，如咳嗽或者鼻涕。通过用鼻或者口咽拭子定量病毒检查病毒脱落。4只狗的仅仅两只脱落可检测量的病毒。一只狗在接种后1和2天脱落病毒(每个拭子1.0-2.5log10PFU)，而另一只狗在接种后连续四天脱落病毒(每个拭子1.4-4.5log10PFU)。在5p.i.对两只狗的尸体剖检揭示了类似于在灵
Figure SMS_32
中的自发疾病中发现的坏死和增生性气管炎、支气管炎和细支气管炎，但是没有肺出血或者支气管肺炎。通过IHC在支气管、细支气管和支气管腺的上皮细胞的细胞质中检测到病毒H3抗原(图2B)。从一只狗的肺组织回收感染性病毒。在接种后14天对剩下两只狗的尸体剖检显示了呼吸系统组织中最小的组织学改变，通过IHC没有检测到病毒H3抗原，从肺匀浆物没有回收病毒。到接种后第7天用MN测定法检测到后两只狗中的血清转变，到第14天 抗体效价进一步增加2到3倍。这些结果确定狗对Canine/FL/04感染的易感性，如通过发热反应、在肺实质中存在病毒抗原和感染性病毒、流感的典型组织学发现，和血清转变所证实。在实验接种的小猎兔犬中不能再现严重疾病和死亡并不令人惊奇，因为大部分的天然感染的灵/>
Figure SMS_33
是无症状的。
实施例5
为了研究在2004年1月爆发前，Canine/FL/04-样流感病毒是否已经在佛罗里达的灵
Figure SMS_34
群体中传播，使用HI和MN测定法对来自65只竞赛灵/>
Figure SMS_35
的存档血清测试抗Canine/FL/04的抗体。在来自1996到1999年的33个狗样品中没有检测到抗体。在2000到2003年间的32个狗样品中，9个样品在两种测定法中都是血清阳性的－1个在2000年，2个在2002年，6个在2003年(表5)。血清阳性狗位于佛罗里达赛场，这些赛场与从1999到2003年未知病因的呼吸系统疾病爆发有关，提示Canine/FL/04-样病毒可能是那些爆发的致病因子。为了进一步研究该可能性，我们检查了来自2003年3月死于出血性支气管肺炎的灵/>
Figure SMS_36
的存档组织。接种到MDCK细胞和鸡胚的来自一只狗的肺匀浆物产生了H3N8流感病毒，称作A/Canine/Florida/242/2003(Canine/FL/03)。对Canine/FL/03的完整基因组的序列分析揭示与Canine/FL/04的>99%同一性(表4)，表明Canine/FL/04-样病毒在2004年前已经感染了灵
Figure SMS_37
实施例6
从2004年6月到8月，在佛罗里达、德克萨斯、阿拉巴马、阿肯色、西佛吉尼亚和堪萨斯州的14个赛场的几千只竞赛灵
Figure SMS_38
中发生了呼吸系统疾病爆发。
一些赛场的官员估计他们至少80％的狗群体患有临床疾病。多数狗具有与2004年1月爆发中的狗类似的发热(≥39℃)和咳嗽的临床病征，但是许多狗也具有粘液脓性鼻涕。报导了多例死亡，但是不能确定准确的死亡率。
我们收集了位于4佛罗里达赛场的94只狗的配对的急性和恢复期血清：56％的这些狗对Canine/FL/04的抗体效价升高≥4倍，100％为血清阳性的(表6)。来自西佛吉尼亚和堪萨斯州的29只狗的恢复期血清也具有抗Canine/FL/04的抗体。我们从德克萨斯赛场的死于出血性支气管肺炎的灵
Figure SMS_39
的肺分离了甲型流感(H3N8)病毒。该分离群(称作A/Canine/Texas/1/2004(Canine/TX/04))的完整基因组的序列分析揭示与Canine/FL/04≥99%的同一性(表4)。在13个月期间内和从不同的地理位置从致死的犬病例分离出三种密切相关的流感病毒，以及在竞赛灵/>
Figure SMS_40
中普遍感染的实质性血清学证据，提示Canine/FL/04-样病毒在狗群体中的持续传播。
Canine/FL/03、Canine/FL/04和Canine/TX/04的HA基因的系统进化分析表明它们组成单源群，具有有力的自引支持度，其与2002和2003年分离的马病毒的同时代H3基因明显不同(图1B)。其他7种基因组区段的系统发生分析和逐对核苷酸序列比较提示犬基因隔离为与马病毒谱系最密切相关的不同的亚谱系(数据未显示，和表4)。在HA中存在4个标记氨基酸改变也支持犬流感基因聚类为与马流感分离的单源群(表2)。与来自2003和2004年的血清学结果一起，这些数据与如下相一致：从马到狗的单个病毒传播事件和随后该病毒在灵
Figure SMS_41
群体中的水平扩散。然而，不能正式排除来自未鉴定的储存物种的流感病毒的该独特谱系的重复导入，虽然这无论如何不太可能。
病毒HA是流感病毒的宿主物种特异性的关键决定子(Suzuki et al.,2000)。为了鉴定HA内可能与对犬科动物宿主的适应有关的残基，我们比较了犬HA的推导的氨基酸序列与同时代马病毒的那些氨基酸序列。在马和犬成熟HA共有氨基酸序列中有四个氨基酸不同：N83S、W222L、I328T和N483T(见表2)。犬病毒当与共有的马序列比较时具有氨基酸缺失。因此，HA马序列中的氨基酸位置7是HA犬序列中的位置6，HA马序列中的氨基酸位置29是HA犬序列中的位置28，HA马序列中的氨基酸位置82是HA犬序列中的位置82，等等。从而，四个替代的氨基酸在SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:34中所示氨基酸序列的位置82、221、327和482。在共有 序列位置83上丝氨酸对天冬酰胺的替代是未知功能重要性的改变，因为在来自其他物种的H3分子中发现多种极性残基。在接近H3HA的切割位点的共有序列位置328上的严格保守的异亮氨酸已经被苏氨酸替代。发病机理中宿主蛋白酶对HA切割的重要作用提示该改变值得进一步研究。在共有序列位置222上亮氨酸对色氨酸的替代是相当值得注意的，因为它代表与唾液酸结合口袋相邻的非保守改变，其可以调节受体功能(Weis et al.,1988)。有趣的是，在222位的亮氨酸不是犬H3HA特有的，因为它通常被发现于H4、H8、H9和H12HA亚型中(Nobusawa et al.,1991;Kovacova et al.,2002)。亮氨酸替代与对哺乳动物宿主的病毒特异性可能更相容，因为已经报导了亚型H4病毒对猪的感染(Karasin et al.,2000)和亚型H9病毒对人和猪的感染(Peiris et al.,1999)。在共有序列483位上天冬酰胺对苏氨酸的替代导致在HA2亚基中糖基化位点的丧失，该位点在所有HA亚型中保守(Wagneret al.,2002)。尽管HA中这些氨基酸改变对于马病毒对狗的适应性的重要性还有待确定，但是以前已经观察到与物种间转移有关的类似的氨基酸改变(Vines et al.,1998;Matrosovich et al.,2000)。在表19到25中显示了本发明的其他流感病毒蛋白质和马共有序列之间的氨基酸差异。
最初感染竞赛灵
Figure SMS_42
的马流感病毒的来源仍然是推测性的。在灵/>
Figure SMS_43
竞赛场的狗舍不位于附近的马或者马赛场，提示该灵/>
Figure SMS_44
和脱落病毒的马之间的接触不能充分解释2004年在不同州的多处爆发。接触马病毒的潜在来源是对灵/>
Figure SMS_45
喂饲马肉，所述灵/>
Figure SMS_46
的食物被补充食品加工厂的生肉，食品加工厂提供可能携带流感的尸体，包括马。该感染方式的先例包括H5N1鸟流感病毒向进食受感染的鸡尸体的猪和动物园猫科动物的种间传播(Webster,1998;Keawcharoen et al.,2004;Kuiken et al.,2004)。尽管这是马流感向狗的最初引入的似乎合理的途径，但是它不能解释最近在不同州的几千只狗中的多次流感爆发。我们的实验接种研究表明在狗的鼻道和口咽中存在病毒，尽管处于适度的滴度。然而，这些结果表明脱落是可能的，并且通过大滴气溶胶、污染物进行的病毒的狗－狗传播或者间接粘膜接触可以在该疾病的动物流行病学中起作用。
全部哺乳动物流感病毒向不相关的哺乳动物物种的种间转移是罕见的事件。以前的研究已经提供了狗与人甲型流感(H3N2)病毒的暂时感染的有限的血清学或者病毒学证据，但不是血清学和病毒学证据两者(Nikitin et al.,1972,Kilbourne,et al.,1975;Chang et al.,1976;Houser et al.,1980)。然而，没有犬科动物宿主中持续传播的证据。尽管充分记载了猪流感病毒从猪向人的直接转移(Dacso et al.,1984;Kimura et al.,1998;Patriarca et al.,1984;Top et al.,1977)，但是没有猪病毒在人宿主中适应的证据。在该报导中，我们提供了完整马甲型流感(H3N8)病毒向另一种哺乳动物物种狗的种间传播。犬病毒HA中独特的氨基酸替代，以及美国多个州中狗感染的血清学证据，提示该病毒适应了犬科动物宿主。因为狗是人类的主要陪伴动物，所以这些发现具有公共健康的牵连；狗可能提供新的甲型流感病毒向人类传播的新的来源。
Figure SMS_47
a具有疾病的临床病征的狗的数目。
b与临床上患病狗接触喂养的无症状狗的数目。
c使用A/Canine/Florida/43/2004病毒的血细胞凝集抑制(HI)测定法。
d使用A/Canine/Florida/43/2004病毒的微量中和(MN)测定法。
e具有配对的急性和恢复期血清中抗体效价增加至少4倍的狗的百分比。
f在恢复期血清中具有阳性抗体效价(HI效价≥32:MN效价≥80)的狗的百分比。
g恢复期血清的几何平均抗体效价。
Figure SMS_48
＊成熟H3HA中的氨基酸残基(单字母代码)和位置。氨基酸代码是：A=丙氨酸,D=天冬氨酸,G=甘氨酸,I=异亮氨酸,K=赖氨酸,L=亮氨酸,M= 甲硫氨酸,N=天冬酰胺,R=精氨酸,S=丝氨酸,T=苏氨酸,V=缬氨酸,W=色氨酸。
Figure SMS_49
表示没有从共有马H3HA的改变。/>
Figure SMS_50
a对来自#43狗的病毒分离群的血细胞凝集抑制效价。
b在白鼬中产生多克隆抗血清，而在绵羊或山羊中产生所有其他抗血 清。
Figure SMS_51
/>
Figure SMS_52
a A/Canine/Florida/43/04(H3N8)基因与来自所述物种的流感病毒分离 群的多数同源基因的百分比核苷酸和氨基酸(括号内)序列同一性，接着是它们的Genbank序列数据库检索号。
b不可应用:在人或者猪病毒中从没有报道N8神经氨酸酶。
Figure SMS_53
a从佛罗里达竞赛灵
Figure SMS_54
收集血清样品年份。
b血清阳性狗的微量中和测定抗体效价，包括6只2003年血清阳性狗。
Figure SMS_55
a使用A/canine/Florida/43/2004(H3N8)通过HI测试的临床上患病狗的数目。
b在急性和恢复期血清之间抗体效价升高≥4倍的狗的百分比。
c在恢复期血清中具有阳性抗体效价(HI效价>16)的狗的百分比。
d恢复期血清的几何平均抗体效价。
实施例7–11的材料和方法
犬组织
由佛罗里达大学兽医学院的解剖病理学处对6只杂种狗和一只宠物YorkshireTerrier狗进行尸体剖检，所述杂种狗在2005年4月/5月流感爆发期间在佛罗里达东北部的收容所死亡，所述Yorkshire Terrier狗在2005年5月流感病毒爆发期间在佛罗里达东南部的兽医诊所中死亡。将组织用10％中性缓冲福尔马林固定，包埋在石蜡中，并用苏木精和伊红染色5-μm的切片用于组织病理学诊断。在病毒学分析之前，未固定的组织在-80℃保存。
从犬组织样品提取RNA
将来自7只狗的每一只的冷冻的肺组织解冻并在补充0.5%牛血清白蛋白(BSA)(Kendall,Lifeline Medical Inc.,Danbury,CT)和抗生素(庆大霉素和环丙沙星)的极限必需培养基(MEM)中用一次性组织研磨机匀浆。使用商业试剂盒(
Figure SMS_56
Mini Kit,QIAGEN Inc.,Valencia,CA)根据生产商的使用说明提取总的RNA并用60μL最终体积的缓冲液洗脱。还从自没有呼吸系统疾病的狗收集的肺组织提取总RNA。
实时RT-PCR
使用含有ROX作为被动参考染料的
Figure SMS_57
Probe RT-PCR试剂盒(QIAGENInc.,Valencia,CA)，对从犬组织样品提取的总RNA进行一步定量实时RT-PCR。简言之，两个引物－探针组用于检测每种样品中的甲型流感序列(表7)。一个引物－探针组对于犬血凝素(H3)基因序列是选择性 的。另一个引物－探针组靶定甲型流感病毒的基质(M)基因的高度保守区。对于每个实时RT-PCR反应，向含有12.5μL2X/>
Figure SMS_58
Probe RT-PCRMaster Mix,0.25μL/>
Figure SMS_59
RT Mix,正向和反向引物(每种0.4μM终浓度),探针(0.1μM终浓度)和无RNA酶的水的反应混合物中加入5μL提取的总RNA，最终体积为25μL。根据生产商的使用说明，用/>
Figure SMS_60
Ribosomal RNA Control Reagents(AppliedBiosystems,Foster City,CA)检测18S rRNA，其作为从犬组织样品提取的RNA的存在的内源性内部对照。
在
Figure SMS_61
QPCR系统(Stratagene,La Jolla,CA)中对反应混合物进行定量一步实时RT-PCR。循环条件包括50℃30分钟的逆转录步骤，95℃15分钟以激活/>
Figure SMS_62
DNA聚合酶的最初变性步骤，和40个循环的扩增。每个扩增循环包括94℃变性15秒，接着60℃下退火/延伸1分钟。在每个循环结束时记录FAM(发射波长518nm)和VIC(发射波长554nm)荧光信号。通过在每个单独的实验中设置阈值荧光(dR)为1000，确定阈值循环数(Ct)。用
Figure SMS_63
版本2.0软件程序(Stratagene,La Jolla,CA)进行数据采集和分析。当H3或者M基因的阈值循环(Ct)比来自没有呼吸系统疾病的狗的肺组织的Ct小3个单位时，认为样品是甲型流感病毒阳性的。阳性对照由从A/canine/FL/242/03(H3N8)病毒提取的RNA的扩增组成。
MDCK细胞中的病毒分离
解冻来自7只狗的每一只的冷冻的肺组织并在10倍体积的补充0.5%(BSA)和抗生素(庆大霉素和环丙沙星)的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)中匀浆。离心除去固体残渣并将上清液接种到在补充1μg/mL TPCK-处理的胰蛋白酶(Sigma-Aldrich Corp.,St.Louis,MO)和抗生素(庆大霉素和环丙沙星)的DMEM中培养的Madin-Darby犬肾(MDCK)细胞上。细胞在含有5%CO2的湿润空气中37℃下在25cm2瓶中生长。每天观察培养物的形态学改变并在接种后5天收获。通过离心澄清收获的培养物并如对于最初接种所述的将上清液接种到新鲜的MDCM细胞上；对通过 血细胞凝集或者RT-PCR没有显示流感病毒证据的样品进行两次额外的传代。使用0.5%火鸡细胞如以前描述(Burleson,F.et al.,1992;Kendal,P.et al.,1982)的测定澄清的上清液中的血细胞凝集活性。如下述进行RT-PCR。
含胚的鸡蛋中的病毒分离
如上文关于MDCK细胞的接种所述的从冷冻的肺组织制备匀浆。将匀浆(0.2mL)接种到10天龄含胚的鸡蛋的尿膜囊中。在35℃培育48小时后，在4℃过夜冷冻鸡蛋，然后收获尿囊液。使用0.5%火鸡血红细胞如以前描述的(Burleson,F.et al.,1992;Kendal,P.etal.,1982)测定澄清的上清液中的血细胞凝集活性。如下文描述的进行RT-PCR。对最初接种后没有显示出流感病毒证据的样品用含胚的蛋进行两次额外传代。
RT-PCR、核苷酸测序和系统进化分析
使用
Figure SMS_64
Viral RNA Mini试剂盒(QIAGEN Inc.,Valencia,CA)根据生产商的使用说明从MDCK上清液或者尿囊液提取病毒RNA。使用/>
Figure SMS_65
OneStep RT-PCR试剂盒(QIAGEN Inc.,Valencia,CA)根据生产商的使用说明将病毒RNA反转录成cDNA。如以前描述的(Klimov,A.et al.,1992b)，使用通用的基因特异性引物组(根据请求可以得到引物序列)进行cDNA中8种流感病毒基因的编码区的PCR扩增。所得的DNA扩增子用作
Figure SMS_66
3100自动化DNA测序仪中自动化测序的模板，使用循环测序染料终止化学(Applied Biosystems,Foster City,CA)。使用Lasergene6/>
Figure SMS_67
(DNASTAR,Inc.,Madison,WI)分析核苷酸序列。用PHYLIP版本/>
Figure SMS_68
软件程序从核苷酸序列估计系统发生和计算自展值(Felsenstein,J.,1989)。将系统树与用/>
Figure SMS_69
程序(Kumar,S.et al.,2004)中实现的Tamura-Nei模型进行的近邻连接分析产生的系统树相比较，并通过
Figure SMS_70
4.0Beta程序(Sinauer Associates,Inc.,Sunderland,MA)证实。
血细胞凝集抑制(HI)测定
将血清样品与受体破坏酶(RDE,DENKA SEIKEN Co.,Ltd.,Tokyo,Japan)(1份血清:3份RDE)在37℃温育16小时，然后在56℃热失活30分钟。流感A/Canine/Jacksonville/05(H3N8)病毒在37℃下5%CO2中在MDCK细胞中生长72小时。收获病毒培养上清液，通过离心澄清，并在－80℃保存。HI测定中使用的所有其他病毒都生长在10天龄的含胚的鸡蛋中，从其收集尿囊液并在－80℃保存。如以前描述的(Kendal,P.et al.,1982)进行HI测定。简言之，向96孔塑料板中等体积的连续稀释的血清中加入25μl4凝血单位的病毒并在室温下温育30分钟。加入等体积的0.5%火鸡红细胞并在30分钟后通过视觉估计血细胞凝集效价。将终点HI效价定义为完全抑制血细胞凝集的血清的最后稀释度。
实施例7─临床病例
在2005年4月和5月，在佛罗里达东北部的收容所中喂养的狗中发生了以前描述的呼吸系统疾病爆发(Crawford,P.C.et al.,2005)。该爆发涉及3个月至9岁年龄的至少58条狗，并且包括纯种狗以及杂种狗。最常见的临床病征是脓性鼻分泌物和咳嗽7到21天。在具有临床疾病≥7天的43条狗中，41条对canine/FL/04(H3N8)的HI抗体效价为32到>1024。至少10条狗发展成肺炎，其中6条被实施安乐死。这6条杂种狗包括3条雄性和3条雌性，年龄为4个月到3岁。在安乐死时临床病征的持续时间为2到10天。在尸体剖检时，这些狗具有肺充血和水肿。对呼吸道的组织学检查揭示了鼻炎、气管炎、支气管炎、细支气管炎和化脓性支气管肺炎。在气管、支气管、细支气管和支气管腺中存在上皮细胞坏死和糜烂。呼吸系统组织被嗜中性粒细胞和巨噬细胞浸润。
在2005年5月，在佛罗里达东南部的一个兽医诊所中40条宠物狗中发生呼吸系统疾病爆发。最常见的临床病征是脓性鼻分泌物和咳嗽10到30天。在40条狗中，17条对于canine/FL/04(H3N8)是血清阳性的，HI抗体效价范围为32到>1024。在可以得到配对的急性和恢复期血清的10 条狗中发生了血清转变。三条狗发展为肺炎。一条狗为9岁的雄性Yorkshire Terrier，在临床病征发作后3天死亡。该狗具有气管支气管炎、肺水肿和充血，和严重的支气管肺炎。类似于6条收容所的狗，在组织中有上皮细胞坏死和气道糜烂和嗜中性粒细胞浸润。
实施例8─实时RT-PCR和病毒分离
通过定量实时RT-PCR测定法分析来自7条狗的肺组织，所述测定法检测甲型流感的M基因和犬H3N8甲型流感病毒的H3基因。来自所有7条狗的肺对于甲型流感M基因和犬流感H3基因都是阳性的(表8)。在MDCK细胞中传代3次后，从在肺炎3天后死亡的收容所狗的肺分离亚型H3N8病毒。该病毒称作A/canine/Jacksonville/05(H3N8)(canine/Jax/05)。在含胚的鸡蛋中传代2次后，从肺炎3天后也死亡的宠物狗的肺回收甲型流感亚型H3N8病毒。将该病毒称作A/canine/Miami//05(H3N8)(canine/Miami/05)。
实施例9─犬甲型流感H3N8分离群的遗传学分析
canine/Jax/05和canine/Miami/05的序列分析揭示它们的血凝素(HA)基因与从2004和2005年赛场的流感爆发期间死于肺炎的竞赛灵
Figure SMS_71
的肺回收的canine/FL/04、canine/TX/04和canine/Iowa/05分离群具有98％同一性(Crawford,P.C.et al.,2005;Yoon K-Y.et al.,2005)。此外，canine/Jax/05和canine/Miami/05的HA基因与2000年后分离的同时代马流感病毒有98％同一性。HA基因的系统发生比较表明canine/Jax/05和canine/Miami/05病毒与canine/FL/04、canine/TX/04和canine/Iowa/05灵/>
Figure SMS_72
分离群和同时代的马分离群聚类，形成与20世纪90年代早期分离的较早的马病毒不同的组(图4)。此外，canine/Jax/05、canine/Miami/05和canine/Iowa/05分离群与canine/Tx/04比对canine/FL/04或canine/FL/03更接近。2005年分离群形成了一个亚组，其似乎与较早的2003和2004犬病毒分叉，在约10个简约信息位点具有差异。这些差异支持如下假说，即犬流感病毒在狗与 狗之间水平传播，而不是从外部来源定期地再次输入。从2003到2005年的突变积累表明病毒被传播到新的宿主后必须经历的正在进行的适应过程，如对犬流感病毒预期已经发生。
实施例10─犬甲型流感病毒H3N8分离群的氨基酸分析
在所有6种犬分离群中都有保守氨基酸替代，其使得它们与同时代的马流感病毒不同(表9)。这些保守替代是I15M、N83S、W222L、I328T和N483T。成熟HA蛋白质的系统发生比较表明canine/Jax/05、canine/Miami/05和canine/Iowa/05病毒与canine/TX/04分离群形成一个亚组(图4)。有3个氨基酸改变(L118V、K261N和G479E)使得该亚组与其他犬病毒不同(表9)。有两个氨基酸改变(F79L和G218E)，其使得2005分离群与它们的canine/TX/04根不同。此外，来自非灵
Figure SMS_73
狗的2005分离群canine/Jax/05和canine/Miami/05与canine/Iowa/05灵/>
Figure SMS_74
分离群有一个氨基酸改变R492K而不同。最后，canine/Jax/05与canine/Miami/05的差别是一个氨基酸S107P。在所有其他H3N8马和犬病毒中，S在107位保守，但是A/Equine/Jilin/1/89除外，其具有T(Guo Y.et al.,1992)。
实施例11─犬甲型流感H3N8分离群的抗原分析
使用较早的和同时代的马流感病毒和犬流感病毒的血清组，和在2005年从感染流感病毒的马和狗收集的血清进行血细胞凝集抑制(HI)试验(表10)。在该分析中还包括来自对canine/FL/04免疫的白鼬的血清。当用同时代的马病毒测试时，马血清中HI抗体效价比以前的分离群高8到16倍，但是当用犬病毒测试时降低至少4倍。犬血清不与较早的马病毒反应，但是当用同时代的马分离群和犬分离群测试时，抗体效价增加4倍。该结果也在来自对犬流感病毒免疫的白鼬的血清中观察到。这些血清反应性模式表明犬流感病毒和同时代的马流感病毒之间的抗原相似性，并且与系统发生分析相一致。抗canine/Miami/05分离群的马、犬和白鼬血清中的抗体效价与2003和2004白鼬分离群的那些相似。然而，canine/Jax/05分离群
Figure SMS_75
的效价低2到4倍。这提示canine/Jax/05在抗原上与其他犬分离群不同，这可能与成熟HA中107位的单个氨基酸改变部分有关。
a加下划线的字母r代表核苷酸a或者g，加下划线的字母k代表核苷酸g或者t。
b大写字母代表锁定核酸残基。
Figure SMS_76
/>
Figure SMS_77
/>
Figure SMS_78
a在用抗原栏中所列出的马、犬或者白鼬血清和病毒进行的血细胞凝集抑制测定中测定的抗体效价。
b来自用canine/FL/04病毒免疫的血清。
实施例12-15的材料和方法
犬流感病毒接种物
通过用代表以前描述的(Crawford et al.,2005)最初分离群的第3代的A/canine/FL/43/04(H3N8)原种接种Madin-Darby犬肾(MDCK)上皮细胞，制备病毒接种物。在补充1μg/mL TPCK-处理的胰蛋白酶(Sigma-Aldrich Corp.,St.Louis,MO)和抗生素(庆大霉素和环丙沙星)的Dulbecco极限必 需培养基(DMEM)中接种的MDCK细胞在含有5%CO2的湿润空气中37℃下生长在250cm2培养瓶中。每天观察培养物的形态改变并在接种后5天收获。通过离心澄清收获的培养物并在接种狗之前将上清液在－80℃保存。用上清液的等分试样通过Reed和Muench方法测定病毒效价。效价为107半数组织培养感染量(TCID50)的A/canine/Florida/43/2004(canine/FL/04)/mL。
实验接种
8条4个月龄的colony品种的杂种狗(Marshall BioResources,North Rose,NY)(4条雄性和4条雌性)用于佛罗里达大学机构动物管理和使用委员会批准的实验接种研究。狗的体重为13到17kg。在接种前，根据体检、基线血试验和记录体温两周，发现狗是健康的。根据对在到达实验室之时和2周后收集的配对血清样品进行的血清学试验，所有狗以前都没有接触犬流感病毒。通过静脉内注射异丙酚(
Figure SMS_79
Zeneca Pharmaceuticals,0.4mg/kg体重以生效)麻醉狗以用气管内管插管。6条狗(3条雄性和3条雌性)每条接种5mL无菌盐水中的107TCID50canine/FL/04病毒，通过插入到气管内插管的小直径橡胶导管将所述病毒施用于气管远端。两条狗(1条雄性和1条雌性)用等体积的无菌盐水假接种。假接种的对照狗与接种病毒的狗关在不同的房间内并且由不同的工作人员照料。每天进行两次体检和直肠温度记录，直到接种后6天(p.i.)。
咽和直肠拭子采集
为了监视病毒脱落，在接种后0到6天，使用聚酯拭子(Fisher ScientificInternational Inc.,Pittsburgh,PA)从每条狗每天两次收集口咽样品。将拭子置于含有0.5%牛血清白蛋白(BSA)的1mL无菌磷酸缓冲盐水(PBS)中。从第0到6天每天从每条狗收集直肠拭子。通过离心澄清拭子运送培养液，制备拭子提取物。使用DirectigenTM商业免疫测定试剂盒(BD,Franklin Lakes,NJ)根据生产商的使用说明，对拭子提取物的等分试样立即测试甲 型流感病毒核蛋白。剩余的提取物在－80℃保存备用于其他的病毒学测定。
尸体剖检
在接种后第1天，通过静脉内接种
Figure SMS_80
溶液(1mL/5kg体重;Schering-Plough Animal Health Corp)，对一条假接种的狗和一条病毒接种的狗实施安乐死。从接种后第2到第5天，每天对一条病毒接种的狗类似地实施安乐死。在接种后第6天，对剩下的假接种的和病毒接种的狗实施安乐死。由研究人员(WLC)之一进行完全的尸体剖检。将组织用10％中性缓冲的福尔马林固定，石蜡包埋，并对5-μm切片用苏木精和伊红染色用于组织病理学诊断或者处理用于如下文所述的免疫组织化学。将未固定的肺组织送到佛罗里达大学兽医学院的诊断临床微生物学/寄生虫学/血清学处(Diagnostic ClinicalMicrobiology/Parasitology/Serology Service)用于细菌分离和鉴定。在非选择性培养基以及选择博德特氏菌(Bordetella)种(Regan-Lowe;Remel,Lenexa,KS)和支原体(Mycoplasma)种(Remel)的培养基上培养样品。在报告无生长前，所有培养物都保持了21天。在病毒学分析之前，未固定的组织也在－80℃保存。
免疫组织化学
将脱石蜡并再水化的5-μm气管和肺组织切片封固在Bond-RiteTM载玻片(Richard-Allan Scientific,Kalamazoo,MI)上并随后用蛋白酶K(DAKOCytomation Inc.,Carpenteria,CA)处理，接着用过氧化物酶封闭试剂(
Figure SMS_81
EnVisionTMPeroxidaseKit,DAKO Corp.,Carpenteria,CA)处理。将切片用抗甲型流感H3的单克隆抗体(ChemiconInternational,Inc.,Ternecula,CA)的1:500稀释液在室温下温育2小时。对照包括用小鼠IgG(1mg/mL,Serotec,Inc.Raleigh,NC)温育相同的切片，和使用正常的犬肺切片与单克隆抗体温育。用一级抗体处理后，将切片与二级免疫过氧化物酶和过氧化物酶底物试剂
Figure SMS_82
EnVisionTMPeroxidase Kit,Dako Corp.)根据生产商的使用说明处理。将切片用苏木精复染，用Clarifier#2和Bluing 试剂(Richard-Allan Scientific,Kalamazoo,MI)处理，脱水，并用Permount(ProSciTech,Queensland,Australia)盖片。
来自拭子和组织的RNA提取物
将来自每条狗的肺和气管组织解冻并在补充0.5%牛血清白蛋白(BSA)和抗生素(庆大霉素和环丙沙星)的极限必需培养基(MEM)中，使用一次性组织研磨机(Kendall,Lifeline Medical Inc.,Danbury,CT)匀浆。使用商业试剂盒(
Figure SMS_83
Mini Kit,QIAGEN Inc.,Valencia,CA)，根据生产商的使用说明从组织匀浆以及咽和直肠拭子提取物提取总RNA并用最终体积60μL的缓冲液洗脱。
实时RT-PCR
使用
Figure SMS_84
Probe RT-PCR试剂盒(QIAGEN Inc.,Valencia,CA)和引物－探针组对总的RNA进行一步定量实时RT-PCR，该试剂盒含有作为被动参照染料的ROX，所述引物－探针组靶定甲型流感病毒的基质(M)基因的高度保守区(Payungporn S.et al.,2006a;Payungporn S.et al.,2006b)。对于每次实时RT-PCR反应，向含有12.5μL2X
Figure SMS_85
Probe RT-PCR Master Mix,0.25μL/>
Figure SMS_86
RT Mix,正向和反向引物(每种终浓度0.4μM),探针(0.1μM终浓度)和无RNA酶的水的反应混合物中加入5μL提取的总RNA，终体积为25μL。使用/>
Figure SMS_87
GAPDH Control Reagents(AppliedBiosystems,Foster City,CA)根据生产商的使用说明检测GAPDH，其作为从拭子和组织样品提取的RNA存在的内源性内部对照和作为归一化对照。
对
Figure SMS_88
QPCR系统(Stratagene,La Jolla,CA)中的反应混合物进行定量一步实时RT-PCR。循环条件包括50℃30分钟的反转录步骤，95℃15分钟以活化
Figure SMS_89
DNA聚合酶的最初变性步骤，和40个循环的扩增。每个扩增循环包括94℃变性15秒，接着60℃下退火/延伸1分钟。在每个循环结束时记录FAM(发射波长518nm)和VIC(发射波长554nm) 荧光信号。通过在每个单独的实验中设置阈值荧光(dR)为1000，确定阈值循环数(Ct)。用/>
Figure SMS_90
版本2.0软件程序(Stratagene,La Jolla,CA)进行数据采集和分析。阳性对照由从A/canine/FL/242/03(H3N8)病毒提取的RNA的扩增组成。对于每个样品，通过将M Ct值除以对应的GAPDH Ct值对结果归一化。
从组织再次分离病毒
解冻来自接种病毒的狗的冷冻的肺和气管组织并在10倍体积的补充0.5%(BSA)和抗生素的DMEM中匀浆。离心除去固体残渣并将上清液接种到在补充1μg/mL TPCK-处理的胰蛋白酶(Sigma-Aldrich Corp.,St.Louis,MO)和如上述抗生素的DMEM中培养的MDCK细胞上。细胞在含有5%CO2的湿润空气中37℃下在25cm2瓶中生长。每天观察培养物的形态学改变并在接种后5天收获。通过离心澄清收获的培养物并如对于最初接种所述的将上清液接种到新鲜的MDCM细胞上；对通过血细胞凝集或者RT-PCR没有显示流感病毒证据的样品进行两次额外的传代。使用0.5%火鸡细胞如以前描述(Crawford et al.,2005)的测定经澄清的上清液中的血细胞凝集活性。如下述进行RT-PCR。
RT-PCR、核苷酸测序和系统进化分析
使用
Figure SMS_91
Viral RNA Mini试剂盒(QIAGEN Inc.,Valencia,CA)根据生产商的使用说明从MDCK上清液提取病毒RNA。使用/>
Figure SMS_92
OneStep RT-PCR试剂盒(QIAGEN Inc.,Valencia,CA)根据生产商的使用说明将病毒RNA反转录成cDNA。如以前描述的(Crawford et al.,2005)，使用通用的基因特异性引物组(根据请求可以得到引物序列)进行cDNA中8种流感病毒基因的编码区的PCR扩增。所得的DNA扩增子用作ABI/>
Figure SMS_93
3100自动化DNA测序仪中自动化测序的模板，使用循环测序染料终止化学(AppliedBiosystems,Foster City,CA)。使用Lasergene 6/>
Figure SMS_94
(DNASTAR,Inc.,Madison,WI)分析核苷酸序列。将从受感染的狗回收的 病毒的核苷酸序列与接种物中病毒的序列比较以确定在呼吸道中复制期间是否已经发生了改变。
实施例12─临床疾病
所有6条接种病毒的狗在接种后前2天都产生了暂时发热(直肠温度≥39℃)，但是没有一只在6天的观察期内显示出呼吸系统病征如咳嗽或者鼻涕。假接种的狗保持临床上健康。
实施例13─病毒脱落
对接种后24小时从一条接种病毒的狗收集的口咽拭子检测甲型流感核蛋白。通过定量实时RT-PCR，在接种后72、84和120小时从一条狗和接种后108、120和132小时从另一条狗收集的口咽拭子是病毒阳性的(表11)。每μL拭子提取物中流感M基因拷贝的绝对数目从接种后第3天到第6天随时间增加。在直肠拭子中没有检测到病毒。
实施例14─尸体剖检
与以前使用特定无病原体的小猎兔犬的实验感染(Crawford et al.,2005)相比，接种病毒的杂种狗患有肺炎，如通过来自接种后1到6天的肺的总体的和组织学分析所证明。除了肺炎外，狗还患有类似于自然感染的狗中所描述的鼻炎、气管炎、支气管炎和细支气管炎(Crawford et al.,2005)。在呼吸道和支气管腺层中存在上皮坏死和糜烂，在粘膜下层组织中有嗜酸性粒细胞和巨噬细胞浸润(图5，上图)。免疫组织化学在支气管、细支气管和支气管腺的上皮细胞中检测到病毒H3抗原(图5，下图)。不存在细菌超感染。来自2条假接种的狗的呼吸系统组织是正常的。
实施例15－气管和肺中的病毒复制
通过定量实时RT-PCR，从接种后第1天到第6天，所有狗中的气管和肺都是病毒阳性的(表12)。每μL气管匀浆的流感M基因拷贝的绝对数 目从接种后第1天到第5天增加，然后在第6天下降。每μL肺匀浆的M基因拷贝的绝对数目从接种后第1天到第6天下降。通常，在接种后6天的每天，气管含有比肺多≥1log10的病毒。
Figure SMS_95
a用A/canine/FL/43/04(H3N8)病毒接种后从狗收集口咽拭子的时间。
b通过将M(Ct)除以每个拭子提取物的GAPDH(Ct)计算归一化比。
c每μL拭子提取物的基质基因拷贝的绝对数目。
Figure SMS_96
Figure SMS_97
a用A/canine/FL/43/04(H3N8)病毒接种后从狗收集组织的时间。
b通过将M(Ct)除以每个组织匀浆的GAPDH(Ct)计算归一化比。
c每μL组织匀浆的基质基因拷贝的绝对数目。
实施例16的材料和实施例方法
病毒毒株
在含胚的卵或者MDCK细胞中增殖犬流感病毒毒株以及鸟、马和人来源的那些流感病毒毒株(表15中所列)，并通过鸡胚中的终点稀释或者噬斑测定法滴定它们的感染力。使用火鸡血红细胞通过血细胞凝集测定法进行快速病毒定量。
诊断样品
对2005年期间病毒呼吸系统疾病的疑似病例收集的共60条犬的肺组织测试犬流感病毒的存在。
从犬组织样品提取RNA
将重量为20到30mg的肺组织块在一次性组织研磨机(Kendal)中匀浆。按照生产商的推荐，使用商业试剂盒(RNeasy Mini Kit,Qiagen,Valencia,CA)提取总RNA并用终体积60μL稀释。
引物和探针设计
使用CLUSTAL X程序(版本1.8)进行来自多种亚型和来自多种物种的H3和M基因的多序列比对。从对应于甲型流感病毒的不同亚型的已知 序列的保守区选择基质(M)引物和探针，而选择H3血凝素基因特异引物和探针组以特别匹配马和犬甲型流感病毒基因和错配同源的鸟和人基因(表13)。用引物设计软件(OLIGOS版本9.1)和EXIQON(http:// lnatools.com)提供的基于网络的分析工具进行Tm计算和预测二级结构以及自身杂交。18SrRNA基因的保守区用作从犬组织样品的提取的RNA的存在的内源性内部对照。Pre-Developed
Figure SMS_98
Assay Reagents for Eukaryotic 18S rRNA(VIC/TAMRA)(Applied Biosystems)用于实时检测组织样品中的18S rRNA。
实时RT-PCR条件
通过使用含有作为被动参照染料的ROX的Quantitect Probe RT-PCR试剂盒(Qiagen,Valencia,CA)进行一步实时RT-PCR。在每次实时RT-PCR反应中，5μL RNA样品用作模板与反应混合物组合，所述反应混合物含有10μL2X QuantiTech Probe RT-PCR MasterMix,0.2μL QuantiTech RT Mix,引物(0.4μM终浓度的H3基因或者0.6μM终浓度的M基因),探针(0.1μM终浓度的H3基因或者0.2μM终浓度的M基因)和无RNA酶的水，最终体积为20μL。在Mx3005P Real-Time QPCR系统(Stratagene)中进行一步实时RT-PCR。循环条件包括50℃30分钟的反转录步骤。95℃15分钟以便活化HotStarTaq DNA聚合酶的初步变性步骤后，在40个循环中进行扩增，每个循环包括变性(94℃15秒)和退火/延伸(60℃30秒)。在每个循环延伸步骤结束时得到FAM(发射波长516nm，用于H3和M检测)和VIC(发射波长555nm，用于18SrRNA检测)荧光信号一次。使用Mx3005P软件版本2.02(Stratagene)进行实时PCR测定的数据采集和分析。
H3引物/探针组对于犬流感(H3N8)的特异性和M引物/探针组对于甲型流感病毒的 通用性
为了测试每种引物/探针组的特异性，从甲型流感病毒的几种已知的亚 型提取的RNA用作实时RT-PCR测定中的模板(表15)。
用于确定实时RT-PCR性能的RNA标准
通过使用与T7启动子连接的引物，用犬甲型流感病毒(A/canine/Florida/242/2003(H3N8))的基因产生H3(nt1-487)和M(nt1-276)的PCR扩增子(表13)。然后通过使用Riboprobe体外转录系统-T7(Promega)，按照生产商的推荐，将H3和M基因的纯化的PCR扩增子用作体外转录的模板。通过测量260nm的吸光度计算所转录的RNA的浓度。然后将RNA连续稀释10倍，从108到10个拷贝/μL以进行灵敏度测试。此外，通过将最初的RNA模板浓度(拷贝/μL)的对数对为每次稀释得到的阈值循环数(Ct)作图产生标准曲线，以便确定实时RT-PCR的总体性能。
实时RT-PCR和Directigen Flu A测试试剂盒之间的比较灵敏度测试
将包括106.67EID50/mL(HA=64)的A/Wyoming/3/2003(H3N2)和107.17EID50/mL(HA=16)的A/canine/Florida/242/2003(H3N8)的两种病毒毒株的原种病毒用于检测阈值测定法。按照生产商的使用说明，在快速甲型流感病毒抗原检测试剂盒Directigen Flu A,(Becton,Dickinson and Company)中使用磷酸缓冲盐水(PBS)(125μL)中样品的对数稀释度。每个Directigen Flu A测试装置在膜中央具有一个H1N1流感抗原点，其显影为紫色点并且指出该测试的完整性，该测试是基于抗核蛋白(NP)的单克隆抗体。在所述点周围紫色三角形的显影表明在测试的样品中存在流感NP。将来自三角形的紫色信号的强度打分为+(三角形轮廓),++(浅色三角形),+++(深紫色三角形)和++++(极深紫色三角形)。使用QIAamp Viral RNA Mini试剂盒(Qiagen,Valencia,CA)从每种病毒稀释液的125μL等分试样提取病毒RNA并以最终体积50μL稀释。通过实时RT-PCR测试5uL体积提取的病毒RNA用于与Directigen Flu A试剂盒的比较灵敏度测试。
实施例16
犬流感病毒的实时RT-PCR测定依赖于来自三种分子探针的信息，所述探针靶定来自宿主细胞的18S rRNA以及来自甲型流感病毒基因组的M和H3(表14)。宿主基因的扩增报告样品质量和完整性。预期含有犬流感(H3N8)病毒的临床的、尸体剖检或实验室样品用三种探针产生扩增信号。用M和18S rRNA探针产生扩增信号但是对于H3阴性的样品将表明来自人、猪或者鸟来源的流感病毒亚型H3或者来自非H3亚型的流感病毒。这些罕见的情况可以通过RT-PCR解决，其使用HA通用引物以产生扩增子cDNA，可以通过测序分析所述cDNA。适当收集和处理的缺少甲型流感病毒的样品仅仅产生18S rRNA扩增信号。仅仅18S rRNA探针和H3探针产生扩增信号的情况表明有缺点的技术，除非证明相反；需要阐明使用M探针的假阴性或者对于H3的假阳性。最后，用这三种探针不能产生扩增信号的样品表明有缺陷的样品收集、降解、错误的RNA提取或者存在PCR中使用的聚合酶的抑制剂。
为了测试犬甲型流感病毒(H3N8)的H3引物/探针组的特异性和甲型流感的M引物/探针组的通用性，通过实时RT-PCR测试甲型流感病毒的几种亚型。结果表明H3引物/探针组仅仅用犬流感(H3N8)产生阳性扩增信号。在其他亚型或者人H3毒株中没有观察到显著的假阳性或者非特异性扩增信号。M引物/探针组对测试的所有毒株产生了阳性扩增信号(表15)。这些结果表明H3引物/探针特异检测犬甲型流感病毒(H3N8)，而M引物/探针检测甲型流感病毒的多种亚型。
通过M和H3体外转录的RNA的终点稀释评估实时RT-PCR测定法的性能。如所预期的，阈值循环数(Ct)与RNA标准品的稀释度以正相关增加。可以在M和H3的分别低至103和102个拷贝/μL的RNA标准品稀释度下检测到荧光信号(图6A和6B)。通过将起始RNA浓度的对数对从每个稀释度得到的阈值循环数(Ct)作图，构建M和H3基因的标准曲线(图6C和6D)。用标准曲线的斜率确定PCR反应效率，其在理论上是指数的；100％扩增效率将意味着每个循环的扩增子浓度的加倍。具有约-3.1到-3.6之 间斜率的标准曲线通常适于多数需要准确定量的应用(90-110%反应效率)。Rsq值是所有数据对标准曲线图的拟合。如果所有数据都精确地位于曲线上，那么Rsq将为1.00。随着数据从该曲线进一步下降，Rsq降低。Rsq≥0.985是多数测定法可接受的。M标准曲线揭示了-3.576的斜率(效率=90.4%)和Rsq=1.00，而H3标准曲线产生了-3.423的斜率(效率=95.9%)和Rsq=0.999。这些值表明实时RT-PCR测定法的满意的扩增效率和总体性能。我们将M引物/探针组与H3引物/探针组相比较低的效率和灵敏度规因于M引物序列的N倍简并性，需要该简并性来确保M基因序列变异性在多种亚型、宿主和谱系的病毒之间的宽覆盖度。
还将实时RT-PCR测定法的灵敏度与商业的快速抗原检测测定法(Directigen FluA)相比较。用Directigen Flu A和通过实时RT-PCR分析了A/Wyoming/3/2003(H3N2)和A/canine/Florida/242/2003(H3N8)的对数稀释度。Directigen Flu A的结果表明对两种病毒毒株的灵敏度为用于这些实验的原种病毒的约100倍稀释度(图7)。犬病毒(A/canine/Florida/242/2003:106.x PFU/ml)样品产生的信号(紫色)比在人病毒(A/Wyoming/3/2003:107.x PFU/ml)中发现的弱得多，与这些样品中较低的病毒浓度相一致。备选地，犬流感的较低信号可以规因于单克隆抗体对NP的分子特异性；即在犬甲型流感病毒的NP表位中氨基酸的保守性很差。
A/canine/Florida/242/2003和A/Wyoming/3/2003的每次反应分别使用病毒10和30PFU当量，M基因的实时RT-PCR产生了高于阈值的Ct值(表16)。两种病毒毒株的灵敏度值的差异是因为最初的病毒效价的不同。没有进行犬和人流感病毒之间的H3基因检测比较，是因为我们的实时RT-PCR测定中的H3引物/探针唯一地扩增犬甲型流感病毒。RT-PCR比快速抗原检测试剂盒灵敏105倍。
为了评估RT-PCR测试在来自患有急性呼吸系统疾病的狗的尸体剖检样品中的性能，通过实时RT-PCR测试了在2005年送交的60个犬肺组织样品中犬甲型流感病毒的存在。60个样品中总共12个(20％)对于M和H3基因是阳性的，而剩下的48个样品对于M和H3基因都产生了阴性结果。 通过蛋和MDCK细胞接种进行病毒分离尝试，以评估实时测定法的特异性；根据RT-PCR，12个样品中对犬流感阳性的两个样品产生了犬流感病毒(数据未显示，手稿准备中)。尽管所有组织都从具有严重呼吸系统疾病史的狗中收集，但是通过实时PCR或者常规分离，多数样品都没有产生犬流感病毒，提示其他呼吸系统病原体如支气管博德特氏菌(Bordetella bronchiseptica)、犬瘟热或者副流感病毒的高发生率。本文的一步实时RT-PCR测定法提供了犬甲型流感病毒(H3N8)检测的快速、灵敏和划算的方法。该疾病的早期中，犬甲型流感病毒(H3N8)感染的快速实验室诊断可以得到与临床患者和设施管理相关的信息。
Figure SMS_99
/>
Figure SMS_100
Figure SMS_101
/>
Figure SMS_102
＊注意通过核苷酸测序证实临床样品的亚型。
Figure SMS_103
/>
Figure SMS_104
Figure SMS_105
/>
Figure SMS_106
Figure SMS_107
/>
Figure SMS_108
＊基于1963和1998年间分离的病毒的可利用的基因。
Figure SMS_109
/>
Figure SMS_110
Figure SMS_111
＊基于1963和1998年间分离的病毒的可利用的基因。
Figure SMS_112
＊基于1963和1998年间分离的病毒的可利用的基因。
实施例17–犬科动物流感攻击模型开发
观察到从Florida的流感爆发分离的犬科动物流感（犬科动物流感）病毒是H3N8型流感病毒，并且与马流感病毒毒株A/equine/Ohio/03非常接近(Crawford et al.,SCIENCEVol.309,2005年9月,将其完整引入本专利作为参考)。在本研究中研究了使用马流感病毒毒株A/equine/Ohio/03在狗中诱导流感样疾病的潜力。
步骤:
从供应商得到13周龄的混合性别的小猎犬，并圈在BSL-2设施中的各个笼子中。将狗随机分配成两组，每组5只狗。如表26所示，将一组进行气管内攻击，另一组进行口鼻攻击。在14周龄时对狗进行攻击。
Figure SMS_113
将细胞培养生长的马流感病毒A/equine/Ohio/03用作攻击病毒。对于 气管内攻击，通过递送试管施用攻击病毒，该试管由具有胶管管头的气管导管(大小4.0/4.5,Sheridan,USA)和饲管(大小5Fr,1.7mm,/16英寸长,Kendall,USA)组成，体积为0.5到1.0ml。对于口鼻攻击，使用雾化器(DeVilbiss
Figure SMS_114
超声雾化器,SunriseMedical,USA)以2到3ml的体积以喷雾施用攻击病毒（每只狗10x7.0到10x8.0TCID50）。
攻击后观察狗的流感相关临床病征14天。在第0天（攻击前）、和攻击后第7天和14天从每只狗收集血清样品用于用H3N8马流感病毒以标准方案(SAM124,CVB,USDA,Ames,IA)测定HI效价。将所有狗实施人道的安乐死并用10％缓冲的福尔马林收集肺组织用于组织病理学评估。
结果:
该实验的结果在表27中总结。攻击后在几只狗中观察到流感相关的临床病征。这些病征包括发热(>103°F;>39.4℃)和咳嗽。在组1中5只狗中的2只（即40％）发热(>103°F;>39.4℃)，相比组2中为5只狗中的1只（即，20％）。来自口鼻攻击组的一只狗打喷嚏，另一种在攻击后咳嗽。为组1观察到HI效价为10到80，几何平均效价（GMT）为20。为组2观察到效价范围为40到160，GMT为86。每组的一只狗具有与流感相容或其特有的组织病理损伤。
Figure SMS_115
Figure SMS_116
＊用马流感隔离群Ohio03攻击动物。
＊＊直肠温度≥103°F;≥39.4℃
实施例18–马流感病毒疫苗对狗的功效
观察到从Florida的流感爆发分离的犬科动物流感是H3N8型流感病毒，并且基于序列相似性与马流感病毒A/equine/Ohio/03非常接近。进行下面的研究以确定实验灭活的马流感病毒疫苗的功效。
步骤:
从供应商得到9只7周龄的混合性别的小猎犬，并圈在BSL-2设施的各个笼子中。将这些狗随机分成两组，如表28概述：
Figure SMS_117
第一组由5只狗组成，在8和12周龄时用皮下（SQ）途径对它们用灭活的CARBIGENTM佐剂化的马流感病毒A/equine/Ohio/03疫苗接种。 使用标准方法通过二元氮丙啶("BEI")灭活A/equine/Ohio/03。每剂疫苗含有按重量计5％的CARBIGENTM、4096HA单位灭活病毒、足够的PBS以使得剂量的总体积为1ml，并用足够的NaOH调节pH到7.2和7.4之间。在第一次和第二次接种当天和第一次和第二次接种后7和14天和在攻击前从所有狗收集血清样品，用于测定HI效价，该测定使用H3N8马流感病毒和标准方案(SAM124,CVB,USDA,Ames,IA)。在第二次接种后3周时，用细胞培养生长的马流感病毒A/equine/Ohio/03(每只狗107.0到108.0TCID50)以每剂1－2ml体积经口鼻攻击5只接种的狗和由4只年龄匹配的狗组成的第二组（即，对照组）。将攻击病毒用雾化器(DeVilbiss
Figure SMS_118
超声雾化器,SunriseMedical,USA)以喷雾施用于狗。在攻击后14天观察狗的流感相关的临床病征。将攻击后7天的5只狗（3只接种，2只对照）和攻击后14天的4只狗（2只对照和2只接种）实施人道的安乐死用于用10％缓冲的福尔马林收集肺组织用于组织病理学评估。
结果:
该实验的结果在表29和30中概述。所有接种的狗在接种后发生血清转变。在用马流感病毒A/equine/Ohio/03进行的接种后期间内观察到HI效价范围为40到640，GMT为129。使用犬科动物流感隔离群A/canine/Florida/242/03观察到HI效价为160到320，几何平均效价为211。6只接种狗的两只在1天内具有>103°F(>39.4℃)的发热，在攻击后的任何狗中没有观察到其他临床病征。
结论:
所有接种的狗都应答灭活的CARBIGENTM佐剂化的马流感疫苗。使用犬科动物流感病毒隔离群的HI效价提示灭活的马流感疫苗诱导了对犬科动物流感病毒的可检测水平的交叉反应抗体。尽管基于犬科动物流感病毒隔离群的HI效价，用于该实验的攻击病毒在小猎犬狗中没有诱导任何可注意到的临床疾病，但是断定灭活的马疫苗可以用于在狗中诱导交叉反应抗体，其可以潜在保护狗抵抗H3N8型犬科动物流感病毒引起的“犬科 动物流感”病。
Figure SMS_119
/>
Figure SMS_120
＊用马流感隔离群Ohio 03攻击动物
＊＊CARBIGENTM佐剂化的马流感病毒Ohio 03疫苗用于接种
实施例19–马流感病毒疫苗对狗的功效
从Florida流感爆发分离的犬科动物流感病毒经表征与许多H3N8型马流感病毒隔离群密切相关。通过DNA和氨基酸相似性分析，表明该犬科动物流感病毒与马流感病毒A/equine/Ohio/03非常相似。在狗中进行下面的研究以确定通过商业途径可获得的马流感疫苗在狗中的功效。
步骤:
在该研究中使用约16月龄的混合性别的20只杂种狗和20只小猎犬。 将狗随机分成6组（表31），每组6－7只狗。组1和4中的狗在16和17月龄时通过皮下（SQ）途径用可商购的灭活的佐剂化马流感疫苗(EQUICINE IITM,Intervet Inc.,Millsboro,DE)接种。组2和5中的狗通过鼻内途径（单鼻孔）用1ml体积的修饰的活的equine/Kentucky/91流感疫苗接种。在接种当天、第一次接种后（组1、2、4和5）和第二次接种后（组1和4）7和14天收集血样，用于用H3N8马流感病毒和犬科动物流感病毒，按照标准方案(SAM124,CVB,USDA,Ames,IA)测定HI效价。
用细胞培养生长的马流感病毒毒株A/equine/Ohio/03(每只狗10x7.0到10x8.0TCID50)以1－2ml体积经口鼻攻击接种的狗（最后接种后72天）和对照。将攻击病毒用雾化器(DeVilbiss
Figure SMS_121
超声波雾化器,Sunrise Medical,USA)作为喷雾施用于狗。攻击后观察狗的流感相关的临床病征12天。从攻击后－1到12天每天用含有抗生素（新霉素和多粘菌素B）的Earl’s MEM培养基收集鼻和口咽拭子用于病毒分离。拭子中病毒的存在表明动物在鼻/口分泌物中分泌病毒。在攻击后12天对所有狗实施人道安乐死并用10％缓冲的福尔马林收集肺组织用于组织病理学评估。
Figure SMS_122
＊不适用
＊＊EQUICINE IITM由Intervet Inc.作为液体疫苗上市。EQUICINE IITM含 有灭活的A/Pennsylvania/63流感(或"A/Pa/63")病毒和A/equine/Kentucky/93流感(或"A/KY/93")病毒与卡波姆(即，
Figure SMS_123
(Intervet Inc.))。更具体地，一剂EQUICINEIITM含有：106.0EID50的灭活的A/Pa/63，106.7EID50灭活的A/KY/93，0.25%体积的卡波姆，和足够的PBS以产生总体积1ml。
＊＊＊A/KY/91是冻干的疫苗，其用水重构。这种重构用足够使疫苗剂量达到1ml总体积的疫苗级水进行。该疫苗含有equine/Kentucky/91流感(或"A/KY/91")病毒，并且在例如美国专利号6,436,408;6,398,774;和6,177,082中讨论，将其完整引入本专利作为参考。当重构时，一剂疫苗含有每ml107.2TCID50的A/KY/91，每ml0.015克N-Z AMINE ASTM，每ml0.0025克明胶，和每ml0.04克D乳糖。N-Z AMINE ASTM是通过酪蛋白的酶促水解产生的氨基酸和肽的精炼来源。N-Z AMINE ASTM由Kerry Bio-Science(Norwich,NY,USA)上市。
结果:
所有接种的狗在接种后都发生血清转变，并且使用马流感病毒(H3N8型)，HI效价对于EQUICINE IITM疫苗组的狗为10到80，对于A/KY/91疫苗组，为10到40。
将接种后（对于EQUICINE IITM疫苗，在第二次接种后）2周收集的样品用犬科动物流感和马流感病毒（H3N8型）测定HI效价。HI结果在表32中显示。临床病征包括攻击后观察到的发热(>103°F;>39.4℃),偶尔咳嗽，和轻微的鼻涕。
Figure SMS_124
＊不适用
在小猎犬中，EQUICINE IITM疫苗组（组1）中6只狗的2只、A/KY/91疫苗组（组2）中7只狗的1只和对照组（组3）中6只狗的2只具有发热。组3（对照组）中6只狗的一只在使用0.25%鸡红细胞（CRBC）进行的血凝测定中对鼻拭子材料的细胞培养上清液中的病毒是阳性的。对照组（组3）中6只狗的1只和A/KY/91疫苗组（组2）中7只狗的1只在攻击后观察期具有轻微的流涕。对于小猎犬狗，在对照和疫苗组之间没有统计学显著差异(P>0.05)。
在杂种狗中，EQUICINE IITM疫苗组（组4）中7只狗的5只，A/KY/91疫苗组（组5）中7只狗的1只，和对照组（组6）中6只狗的5只具有发热。来自组4和6各有1只狗具有轻微流涕，并且来自组5的一只狗具有偶尔的咳嗽。EQUICINE IITM疫苗组（组4）中7只狗的两只和对照组（组6）中6只狗的3只在HA测定法中对于鼻拭子中流感病毒是阳性的。A/KY/91组（组5）中没有狗对于鼻拭子材料中的流感病毒是阳性的。
结论:
通过血清学，阐明用通过商业途径可获得的马流感疫苗接种狗刺激中等水平的流感抗体应答。在用H3N8型流感病毒攻击后，在狗中流感相关的临床病征的发展中可以存在一定的品种差异。活的减毒马流感疫苗(A/KY/91)提供了杂种狗中对临床疾病发展（直肠温度）的显著(P<0.05)保护。而且，活的减毒的病毒疫苗防止鼻分泌物中流感病毒脱落。
实施例20–犬科动物流感攻击模型开发
考虑到为了研究目的在犬科动物中诱导疾病还没有被证明是成功的，在下面的研究中使用犬科动物流感病毒H3N8开发狗中的犬科动物流感攻击模型的潜力。
步骤:
从供应商得到10只混合性别的杂种狗，并圈在BSL-2设施的笼子中。将狗随机分成两组，每组5只狗。如表33所示，一组进行气管内/鼻内攻击，另一组进行口鼻攻击。
Figure SMS_125
在约12周龄时攻击狗。含胚的鸡蛋生长的犬科动物流感病毒(A/canine/Florida/242/03)用作攻击病毒。每只狗接受2ml（用于口鼻途径）或4ml（气管内/鼻内途径）体积的总共约107.2TCID50病毒。
对于气管内/鼻内攻击，首先将3ml攻击病毒施用于气管，然后使用递送试管施用5ml PBS，该试管由具有胶管管头的气管导管(大小4.0/4.5,Sheridan,USA)和饲管(大小5Fr,1.7mm；16英寸(41cm)长,Kendall,USA) 组成，并施用1ml攻击病毒，接着用注射器将3ml空气施用到鼻孔中。
对于口鼻攻击，使用雾化器(NebulairTM,DVM Pharmaceuticals,Inc.,Miami,FL)以大约2ml的体积以喷雾施用攻击病毒。在攻击后14天观察狗的流感相关的临床病征。在攻击后14天对狗实施安乐死，并用10％缓冲的福尔马林收集组织（肺和气管）样品用于组织病理学检查。
结果:
组1和2中的所有狗在24到48小时内都发生了犬科动物流感临床病征。每只狗具有两种或多种下面的临床病征：发热(>103.0°F;>39.4℃)、咳嗽、严重的或者粘液脓性的眼分泌物、浆液性或粘液脓性的鼻分泌物、呕吐、腹泻、抑郁、体重减轻、作呕、咯血，和听得见的啰音。来自组1的5只狗的5只和来自组2的5只狗中的4只的肺组织具有组织病理学损害，其包括下面的一种或多种：弥散化脓性支气管肺炎、支气管炎/毛细支气管炎，在腔中具有嗜中性粒细胞渗出物栓，和粘膜和细支气管周组织中显著的单核细胞聚集、肺泡内混合的渗出物，具有大量泡沫状巨噬细胞、淋巴细胞和浆细胞以及粒细胞渗入，和肺泡隔的增厚，具有II型肺细胞增殖，其与流感病毒感染相容或是流感病毒感染特有的。气管组织样品是正常的。
结论:
H3N8犬科动物流感隔离群如在该研究中使用的隔离群可以用于使用本研究中描述的方法之一或者类似方法在狗中诱导犬科动物流感疾病。
实施例21–犬科动物流感攻击模型开发
在下面的研究中进一步研究使用犬科动物流感病毒H3N8开发狗中的犬科动物流感攻击模型的可能性。
步骤:
从供应商得到15只17到18周龄杂种狗和15只15周龄小猎犬，并圈在BSL-2设施的笼子中。将杂种狗随机分成3组（组1到3），每组5只狗。将所有小猎犬分成一组（组4），如表34所示：
Figure SMS_126
将狗用毒性犬科动物流感病毒A/Canine/Florida/242/2003（从患有犬科动物流感疾病的灵
Figure SMS_127
的肺分离（University of Florida的Cynda Crawford博士提供））经口鼻攻击。使用雾化器(NebulairTM)以约2ml体积作为喷雾施用攻击病毒。在攻击后观察狗的流感相关的临床病征14天。
结果:
组1和4中80％（5只中的4只）狗、组2和3中的100％的狗在48小时内产生犬科动物流感临床病征。每只狗具有一种或多种下面的临床病征：发热(>103.0°F;>39.4℃)、咳嗽、浆液性或粘液脓性眼分泌物、浆液性或粘液脓性鼻分泌物、呕吐、腹泻、抑郁、体重减轻、作呕、和啰音。在小猎犬中观察到的临床病征与杂种狗相比通常更轻并且是短程的。
结论:
H3N8犬科动物流感隔离群，如该研究中使用的隔离群可以用于使用该研究中描述的方法或者类似的方法以104.8到106.8 TCID50的攻击剂量范围在狗中诱导犬科动物流感样或者狗窝咳嗽样疾病。在杂种狗和小猎犬中观察到的临床病征有一定的不同。通常，小猎犬与杂种狗相比具有更 轻微的流感相关的临床病征。
实施例22–犬科动物流感疫苗功效研究
进行下面的研究以评估H3N8马流感疫苗在狗中抗犬科动物流感病毒的功效。
步骤:
从供应商得到17只14周龄杂种狗和10只8周龄小猎犬。将狗随机分成5组，如表35所示，并圈在研究设施中。
Figure SMS_128
该研究中使用的疫苗是
Figure SMS_129
-佐剂化的、失活的马流感病毒(A/equine/KY/02)疫苗。为了制备该疫苗，使用标准方法通过二元氮丙啶（BEI）灭活病毒。每个疫苗剂量含有/>
Figure SMS_130
(10%v/v)、6144HA单位的灭活病毒、0.1%(v/v)的10％硫柳汞、0.1%(v/v)酚红，足够的NaOH以调节pH为6.8至7.2，和足够的PBS用于使总剂量体积达到1ml。
将组1和4中的狗用2剂疫苗接种。在第一次剂量后4周施用第二次剂量（即，加强剂量）。在18周龄时用1剂接种组2中的狗。收集血样以用标准方案评估HI效价，使用在第0天（接种前）、第一次和第二次接种后7和14天的H3N8犬科动物流感隔离群。攻击前约5天，将狗转移到BSL-2设施并圈在单独的笼子中。
在组1和4的第二次接种后和组2第一次接种后2周用毒性犬科动物流感病毒(每只狗107.7TCID50A/Canine/Florida/242/2003)经口鼻攻击所有接种的和年龄匹配的对照狗。使用雾化器(NebulairTM)以每只狗2ml作为喷雾施用攻击病毒。攻击后观察狗的流感相关的病征17天。从－1天（即攻击前一天）到攻击后17天用含有2ml病毒转移培养基的试管收集鼻和口咽拭子用于病毒分离。在攻击后17天对所有狗实施安乐死并用10％缓冲的福尔马林收集肺和气管样品用于组织病理学分析。在攻击后7和14天收集血样用于HI效价测定。用于攻击后观察的临床病征得分评估在表36中显示。
结果:
2剂量接种组（组1和4）中的所有狗都发生了对犬科动物流感病毒分离物的HI抗体效价应答（表37）。攻击后，在所有组中攻击后14天时效价增加约4倍间接表明所有狗都暴露于攻击病毒。所有狗显示出一种或多种下面的犬科动物流感病征：发热(>103.0°F;>39.4℃)、咳嗽、浆液性或粘液脓性眼分泌物、浆液性或粘液脓性的鼻分泌物、呕吐、腹泻、抑郁、体重减轻和呼吸困难。与年龄匹配的对照相比，接种具有较不严重的临床病征（表38）。由于8周龄(P=0.040)和14周龄(P=0.003)狗中的2－剂量接种，临床病征存在显著减轻（分别为组4和组1）。在该实验中，一次剂量接种没有提供临床病征（组2）的显著减轻(P=0.294)。
病毒分离结果在表39中显示。在14周龄狗中，从收集自2次剂量疫苗组（组1）的7只狗中的2只（29％）、1次剂量疫苗组（组2）的5只狗的3只（60％），和对照组（组3）的5只狗的5只（100％）的拭子样品分离到犬科动物流感病毒。在8周龄狗中，从2次剂量疫苗组（组4）的5只狗的1只（20％）、对照组（组5）的5只狗的4只（80％）分离到病毒。与未接种的对照（组3和5）相比，由于2次剂量接种（组1和4），在拭子样品中对于犬科动物流感病毒阳性的狗的数目显著减少(P=0.003)。尽管在1次剂量疫苗组（组2）和对照组（组3）之间拭子样品中对犬科动物流感病毒阳性的狗的数目减少(60%对100%)，但是该差异不是统计学显著的(P=0.222)。
进行肺和气管组织样品的损伤的组织病理学评估以鉴定与犬科动物流感疾病相容或其特有的损伤。这包括例如，测定是否存在下面的一种或多种：具有化脓性支气管肺炎的区域；具有单核细胞聚集（淋巴细胞、浆细胞）的支气管周围炎/细支气管周围炎；在腔中存在粒细胞细胞碎片栓；呼吸上皮增生；肺泡中混合的渗出物，具有大量粒细胞和细胞碎片；（泡沫状）巨噬细胞、浆细胞和淋巴细胞聚集；和肺泡隔增厚，具有II型肺细胞增生。
表40提供了该实验中狗的损伤程度概述。在14周龄狗中，在2次剂量接种组（组2）中7只狗的5只和1次剂量接种组（组1）中5只狗的4只中肺损伤的范围和严重性较低。所有对照狗（组3）都具有严重和广泛的损伤，提示没有受到保护。在14周龄狗中，1或2次剂量接种引起的气管损伤没有差异。在8周龄狗中，在2次剂量接种和对照狗之间肺损伤没有差异。没有狗具有气管损伤。
结论:
该研究的结果表明：（1）灭活的H3N8马流感病毒可以在接种的狗中诱导犬科动物流感病毒交叉反应性HI抗体应答，（2）使用H3N8马流感病毒疫苗可以减轻狗中犬科动物流感病毒疾病的严重性，和（3）使用H3N8犬科动物流感病毒疫苗可以减少鼻和/或口分泌物中的病毒排泄。
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Figure SMS_140
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Figure SMS_141
“+”与流感感染一致或其特有的严重损伤
“+/-“轻微损伤(不确定)
“-“正常的
实施例23–犬科动物流感疫苗功效研究
进行下面的研究以确定在狗中多价H3N8马流感疫苗对犬科动物流感病毒的功效。
步骤:
从供应商得到17只15周龄的小猎犬。将狗随机分成3组，如表41中所示，并圈在研究设施中。
Figure SMS_142
Figure SMS_143
在该研究中使用的疫苗是
Figure SMS_144
佐剂化的灭活的马流感(A/equine/KY/02、A/equine/KY/93,和A/equine/NM/2/93)疫苗。为了制备该疫苗，使用标准方法通过二元氮丙啶(BEI)灭活病毒。每个疫苗剂量含有/>
Figure SMS_145
(10%v/v)，2048HA单位每种灭活的病毒，0.1%(v/v)10%硫柳汞，0.1%(v/v)酚红，足够的NaOH以调节pH到6.8至7.2，和足够的PBS用于使总剂量体积达到1ml。
将组1中的狗用2剂疫苗接种。在第一次剂量后4周施用第二次剂量（即，加强剂量）。在19周龄时用1剂疫苗接种组2中的狗。收集血样以用标准方案评估HI效价，使用在第0天（接种前）、第一次和第二次接种后7和14天的H3N8犬科动物流感分离物。攻击前7天，将狗转移到BSL-2设施并圈在单独的笼子中。
在组1第二次接种后和组2第一次接种后2周用毒性犬科动物流感病毒(每只狗107.7TCID50A/Canine/Florida/242/2003)经口鼻攻击所有接种的狗和年龄匹配的对照狗。使用雾化器(NebulairTM)以每只狗2ml作为喷雾施用攻击病毒。攻击后观察狗的流感相关的临床病征14天。在攻击后14天对所有狗实施安乐死并用10％缓冲的福尔马林收集肺和气管样品用于组织病理学分析。在攻击后7和14天收集血样用于HI效价测定。用于攻击后观察的临床病征得分分配在表42中显示。
结果:
所有接种的狗都发生了对犬科动物流感病毒分离物的HI抗体效价应答（表43）。攻击后，在所有组中攻击后14天时HI效价与攻击前HI效价相比增加约4倍间接表明所有狗都暴露于攻击病毒。所有狗显示出犬科 动物流感疾病病征，每只狗显示出一种或多种下面的临床病征：发热(>103.0°F;>39.4℃)、咳嗽、浆液性或粘液脓性眼分泌物、浆液性或粘液脓性的鼻分泌物、呕吐、腹泻、抑郁、体重减轻和呼吸困难。与年龄匹配的对照相比，接种具有较不严重的临床病征（表44）。由于狗（组1）中的2－剂量接种，临床病征存在显著减轻(P=0.028)。一剂量接种没有提供临床病征(组2)的显著减轻(P=0.068)。
如在实施例22中，进行肺和气管组织样品损伤的病理组织学评估以鉴定与犬科动物流感疾病相容或者其特有的损伤。表45提供了该实验中狗的损伤程度概述。在15周龄的狗中，使用1剂或2剂接种狗在所有狗中预防了肺损伤。5只对照狗中的4只（80％）具有与流感疾病一致的严重的化脓性支气管肺炎。来自2剂疫苗组（组1）的7只狗的1只和来自对照组（组3）的5只狗的1只具有轻微的气管损伤，提示为气管炎，其可以规因于流感疾病。
结论:
来自该研究的结果表明1）灭活的H3N8马流感病毒可以在接种的狗中诱导犬科动物流感病毒交叉反应性HI抗体应答，和2）使用H3N8马流感病毒疫苗可以降低狗中犬科动物流感病毒疾病的严重性。
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＊第一次接种-组1
＊＊第二次接种–组1;第一次接种–组2
＊＊＊攻击日
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Figure SMS_152
“+”与流感感染一致或其特有的严重损害
“+/-“轻微损伤(不确定)
“-“正常的
实施例24–犬科动物流感疫苗功效研究
进行下面的研究以确定：（1）在狗中单价对多价H3N8马流感疫苗对犬科动物流感病毒的功效，和（2）施用途径对疫苗功效的影响。
步骤:
从供应商得到30只10周龄杂种狗。将狗随机分成6组，如表46所 示，并圈在研究设施中。
Figure SMS_153
使用三种类型的疫苗(VAX-1、VAX-2,和VAX-3)。VAX-1为
Figure SMS_154
-佐剂化的灭活马流感病毒(A/equine/KY/02)单价疫苗，每剂含有/>
Figure SMS_155
(10%v/v)、6144HA单位的灭活病毒、0.1%(v/v)的10％硫柳汞、0.1%(v/v)酚红，足够的NaOH以调节pH到6.8至7.2，和足够的PBS用于使总剂量体积达到1ml。VAX-2是/>
Figure SMS_156
-佐剂化的灭活马流感病毒(A/equine/KY/02)单价疫苗，每剂疫苗含有/>
Figure SMS_157
(10%v/v)、4096HA单位的灭活病毒、0.1%(v/v)的10％硫柳汞、0.1%(v/v)酚红，足够的NaOH以调节pH到6.8至7.2，和足够的PBS用于使总剂量体积达到1ml。VAX-3是/>
Figure SMS_158
-佐剂化的灭活马流感(A/equine/KY/02、A/equine/KY/93和A/equine/NM/2/93)多剂疫苗，并且含有
Figure SMS_159
(10%v/v),每种毒株2048HA单位灭活的病毒，0.1%(v/v)的10％硫柳汞、0.1%(v/v)酚红，足够的NaOH以调节pH到6.8至7.2，和足够的PBS用于使总剂量体积达到1ml。通过二元氮丙啶（BEI）使用标准方法灭活用于疫苗制剂的所有流感病毒。
每组的疫苗和施用途径在表46描述。通过鼻内（IN）或皮下（SQ）途径接种接种组中的所有狗，并且每只狗接受2剂。第二剂（即，加强剂 量）在第一剂后4周施用。收集血样以用标准方案用H3N8犬科动物流感分离物在第0天（接种前）、第一次和第二次接种后7和14天评估HI效价。攻击前7天，将狗转移到BSL-2设施中并圈在单独的笼子中。
在第二次接种后2周用毒性犬科动物流感病毒(每只狗107.4TCID50A/Canine/Florida/242/2003)经口鼻攻击所有接种的狗和年龄匹配的对照狗。使用雾化器(NebulairTM)以每天2ml体积作为喷雾施用攻击病毒。攻击后观察狗的流感相关的临床病征14天。攻击后7和14天收集血样用于HI效价测定。在攻击后14天对所有狗实施安乐死并用10％缓冲的福尔马林收集肺和气管样品用于组织病理学分析。用于攻击后观察的临床病征得分评估在表47中显示。
结果:
不管疫苗的类型如何，所有通过SQ途径接种的狗都应答犬科动物流感病毒隔离群产生HI抗体效价（表48）。在接种后期间，无论疫苗类型，来自IN接种组（即组1、3和5）的狗都没有应答犬科动物流感病毒隔离群而产生HI抗体效价。然而，在所有狗中攻击后14天，效价升高4倍，间接表明所有狗都暴露于攻击病毒（表47）。
所有狗显示出一种或多种下面的犬科动物流感临床病征：发热(>103.0°F;>39.4℃)、咳嗽、浆液性或粘液脓性眼分泌物、浆液性或粘液脓性的鼻分泌物、呕吐、腹泻、抑郁、体重减轻和呼吸困难。与年龄匹配的对照相比，接种具有较不严重的临床病征（表49）。在通过SQ途径用VAX-3接种的狗中临床病征显著减轻（组4）。在该实验中，IN施用VAX-1、VAX-2或VAX-3没有提供犬科动物流感病毒临床病征的显著减轻。
如实施例22和23中，进行肺和气管组织样品的损伤的组织病理学评估以鉴定与犬科动物流感疾病相容或其特有的损伤。表50提供了该实验中对于狗的损伤程度概述。5只对照狗（组6）中的5只具有与流感感染一致的肺损伤。通过SC途径用VAX-2接种（组2）的5只狗的2只和通过SC途径用VAX-3接种(组4)的5只狗的3只没有任何流感相关的肺损伤。不 管疫苗类型如何，通过鼻内途径接受疫苗的所有狗都具有与流感感染相一致的严重肺损伤。在该研究中观察到的气管损伤非常轻微。
结论:
来自该研究的结果表明：（1）灭活的H3N8马流感病毒可以在通过SQ途径接种的狗中诱导犬科动物流感病毒交叉反应性HI抗体应答，（2）鼻内施用单价(VAX-1和VAX-2)或多价疫苗(VAX-3)在狗中不是有效的，和（3）皮下施用多价疫苗(VAX-3)提供了狗中犬科动物流感病毒疾病严重性的显著(P=0.016)减轻。
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“+”与流感感染一致或其特有的严重损伤
“+/-“轻微损伤(不确定)
“-“正常的
实施例25–犬科动物流感疫苗功效研究
犬科动物流感疾病由H3N8流感病毒（CIV）引起。CIV非常接近马H3N8病毒(Crawford et al.,2005)并且感染所有接触的狗。约80％的被接触的狗发生临床病征。在下面的研究中，确定灭活的H3N8马流感病毒疫苗和犬科动物流感病毒疫苗的功效。
步骤:
在该研究中使用35只小猎犬和5只杂种狗。将小猎犬随机分成3组（表51）。将所有杂种狗都分配到对照组（组3）。对所有狗都饲以标准 生长饮食并且无限制地获取水。
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对组1和2中的狗用VAX-1或VAX-2接种（表51）。VAX-1是
Figure SMS_169
佐剂化的灭活的马流感病毒(A/equine/KY/02)疫苗。为了疫苗制备，使用标准方法通过二元氮丙啶(BEI)灭活疫苗病毒。每剂疫苗含有/>
Figure SMS_170
(10%v/v)、6144HA单位的灭活病毒、0.1%(v/v)10%的硫柳汞、0.1%(v/v)的酚红和足够使总剂量体积达到1ml的PBS和用于调节pH到6.8到7.2的NaOH。
VAX-2是灭活的CARBIGENTM佐剂化的犬科动物流感抗原疫苗(A/canine/Fl/43/2004)。使用标准方法通过二元氮丙啶("BEI")灭活A/canine/Fl/43/2004。每剂量疫苗含有按质量计5％的CARBIGENTM，约1280HA单位灭活病毒，足够使剂量总体积达到1ml的PBS，和足够调节pH到7.2至7.4的NaOH。在第一次和第二次接种当天、第一次和第二次接种后7和14天，和攻击前从所有狗收集血清样品以使用H3N8马流感病毒标准方案(SAM124,CVB,USDA,Ames,IA)测定HI效价。攻击前7天，将狗转移到ABSL-2设施并圈在单独的笼子中。
将所有接种的狗和年龄匹配的对照狗在第二次接种后2周用毒性犬科动物流感病毒(每只狗107.2TCID50A/Canine/Florida/242/2003)经口鼻攻击。使用雾化器(NebulairTM)以喷雾(2ml/狗)施用攻击病毒。攻击后观察狗的流感相关的临床病征14天。从－1天(即攻击前1天)到攻击后14天每天用含有2ml用于病毒分离的病毒转移培养基的试管收集鼻和口咽拭子。 在攻击后第7和14天收集血样用于HI效价测定。在表52中显示了用于攻击后观察的临床病征分数赋值。
结果:
所有接种的狗（组1和2）都应答犬科动物流感病毒隔离群而产生了HI抗体效价（表53）。所有的狗显示出一种或多种下面的犬科动物流感病征：发热(>103.0°F;>39.4℃)、咳嗽、浆液性或粘液脓性眼分泌物、浆液性或粘液脓性的鼻分泌物、呕吐、腹泻、抑郁、和厌食。与年龄匹配的对照相比，接种具有较不严重的临床病征（表54）。用VAX-1（组1）或VAX-2（组2）接种的狗中临床病征有显著(P<0.001)减轻。
病毒分离结果在表55和56中显示。毒性犬科动物流感病毒攻击后，从组1（VAX-1）的15只狗的5只（33％）、组2(VAX-2)的5只狗的0只（0％）和对照（组3）的20只的17只（85％）中分离到犬科动物流感病毒。灭活的马流感疫苗(VAX-1)和犬科动物流感病毒(VAX-2)接种都证明引起鼻或口分泌物或两者中的病毒脱落与对照相比显著(P=0.004)减少（表55）。
结论:
来自该研究的结果表明：（1）灭活的H3N8马流感病毒和犬科动物流感病毒疫苗可以在接种的狗中诱导犬科动物流感病毒反应性HI抗体应答，（2）使用H3N8马流感病毒或犬科动物流感病毒疫苗可以降低狗中犬科动物流感病毒疾病的严重性，和（3）使用H3N8马流感病毒或犬科动物流感病毒疫苗可以在鼻和/或口分泌物中减少病毒分泌。
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＊使用
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版本9.1的NPARIWAY程序分析(使用GLM程序比较疫苗组)
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＊使用
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(版本9.1)的FREQ程序分析和与Fisher精确检验相关的P值/>
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在本专利（包括权利要求）中的单词“包含”、“含有”和“包括”将被解释为包括在内而不是排他性的。该解释意在与这些单词在美国专利法中给出的解释相同。
上面对优选实施方案的详细描述仅仅意在使本领域技术人员熟悉本发明、它的原理和它的实际应用，从而本领域技术人员可以改编和以多种形式应用本发明，使得它们可以最适于具体应用的需要。因此，本发明不限于上面的实施方案并且可以以多种形式修饰。
应该理解本文描述的实施例和实施方案仅用于阐明目的，并且参照其的多种修饰或更改将是本领域技术人员可以想到的，并且包括在本申请的精神和范围内。
参考文献
美国专利号5,106,739
美国专利号5,034,322
美国专利号6,455,760
美国专利号6,696,623
美国专利号4,683,202
美国专利号4,683,195
美国专利号4,800,159
美国专利号4,965,188
美国专利号5,994,056
美国专利号6,814,934
美国专利号6,436,408
美国专利号6,398,774
美国专利号6,177,082
公布的美国专利申请号20040078841
公布的美国专利申请号20040067506
公布的美国专利申请号20040019934
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Claims (27)

1.分离的流感病毒，其能够感染犬科动物，其中所述流感病毒的基因组由分别编码SEQID NO:64、66、68、70、72、74、76和78的多肽的多核苷酸序列组成；或者其中所述流感病毒由如SEQ ID NO:64、66、68、70、72、74、76和78所示的多肽组成。
2.根据权利要求1的流感病毒，其中所述流感病毒具有H3的HA血清型。
3.根据权利要求1的流感病毒，其中所述流感病毒的基因组由SEQ ID NO:63、65、67、69、71、73、75和77所示的多核苷酸序列组成。
4.根据权利要求1的流感病毒，其中所述流感病毒是称作canine/Jacksonville/05的病毒隔离群。
5.根据权利要求1的流感病毒，其中所述流感病毒被灭活或减毒。
6.根据权利要求1的流感病毒，其中所述流感病毒在可药用载体或稀释剂中提供。
7.分离的多核苷酸，其由权利要求1的流感病毒的基因组组成。
8.多核苷酸表达构建体，其包含权利要求7的多核苷酸。
9.权利要求7的多核苷酸编码的经分离的多肽。
10.包含权利要求1的流感病毒的免疫原的组合物，其中所述免疫原能够诱导针对流感病毒的免疫应答，所述流感病毒能够感染犬科动物，其中所述免疫原包含无细胞的完整病毒或病毒感染的细胞。
11.根据权利要求10的组合物，其中在可药用载体或稀释剂中配制所述组合物。
12.权利要求10的组合物在制造试剂盒中的用途，所述试剂盒用于在动物中诱导针对能够感染犬科动物的流感病毒的免疫应答。
13.根据权利要求12的用途，其中所述动物是犬科动物。
14.根据权利要求12的用途，其中肠胃外、皮下、腹膜内、肌内、经鼻或者经口施用所述组合物。
15.细胞，其包含权利要求1的流感病毒。
16.重组病毒载体，其包含编码由SEQ ID NO:78中所示的氨基酸序列组成的血凝素(HA)的多核苷酸。
17.权利要求16的重组病毒载体，其中所述多核苷酸由SEQ ID NO:77的核苷酸序列组成。
18.权利要求16的重组病毒载体，其中所述重组病毒载体包含编码由成熟形式的氨基酸序列SEQ ID NO:78组成的血凝素(HA)的多核苷酸，其中所述HA蛋白包含在成熟形式氨基酸序列的第82位的丝氨酸、221位的亮氨酸、327位的苏氨酸，和482位的苏氨酸。
19.权利要求16到18任一项的重组病毒载体，其中所述病毒载体来自腺病毒、禽痘、疱疹病毒、牛痘病毒、金丝雀痘、昆虫痘、猪痘、或西尼罗病毒。
20.权利要求16到18任一项的重组病毒载体，其中所述病毒载体是金丝雀痘病毒载体。
21.多核苷酸载体，其包含编码血凝素(HA)的多核苷酸，所述血凝素(HA)由成熟形式所示的氨基酸序列SEQ ID NO:78组成。
22.权利要求21的多核苷酸载体，其中所述多核苷酸由SEQ ID NO:77的核苷酸序列组成。
23.权利要求21的多核苷酸载体，其中所述多核苷酸载体包含编码由成熟形式的氨基酸序列SEQ ID NO:78组成的血凝素(HA)的多核苷酸，其中所述HA蛋白包含在所述成熟形式氨基酸序列的第82位的丝氨酸、221位的亮氨酸、327位的苏氨酸，和482位的苏氨酸。
24.权利要求21到23任一项的多核苷酸载体，其中所述多核苷酸载体是病毒载体。
25.权利要求24的多核苷酸载体，其中所述病毒载体来自腺病毒、禽痘、疱疹病毒、牛痘病毒、金丝雀痘、昆虫痘、猪痘、或西尼罗病毒。
26.权利要求24的多核苷酸载体，其中所述病毒载体是金丝雀痘病毒载体。
27.权利要求16到26任一项的重组病毒载体或多核苷酸载体，其中所述HA蛋白还包含成熟形式的氨基酸序列的第491位的赖氨酸。
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