NO346351B1 - Isolert hundedyr influensa Avirus, polynukleotid-ekspresjonskonstruksjon, isolert antistoff, isolert celle, reassortant virus og rekombinant virusvektor, samt sammensetning og hundeinfluensavaksine - Google Patents

Isolert hundedyr influensa Avirus, polynukleotid-ekspresjonskonstruksjon, isolert antistoff, isolert celle, reassortant virus og rekombinant virusvektor, samt sammensetning og hundeinfluensavaksine Download PDF

Info

Publication number
NO346351B1
NO346351B1 NO20082257A NO20082257A NO346351B1 NO 346351 B1 NO346351 B1 NO 346351B1 NO 20082257 A NO20082257 A NO 20082257A NO 20082257 A NO20082257 A NO 20082257A NO 346351 B1 NO346351 B1 NO 346351B1
Authority
NO
Norway
Prior art keywords
virus
seq
sequence
amino acid
canine
Prior art date
Application number
NO20082257A
Other languages
English (en)
Other versions
NO20082257L (no
Inventor
Patti C Crawford
Paul J Gibbs
Edward J Dubovi
Ruben O Donis
Jacqueline Katz
Alexander I Klimov
Nancy J Cox
William L Castleman
Nallakannu P Lakshmanan
Melissa Anne Lum
Daniel Ghislena Emiel Goovaerts
Mark William Mellencamp
Original Assignee
Intervet Int Bv
Univ Florida
Cornell Res Foundation Inc
The Government Of The Us Secretary Of The Department Of Health And Human Services Centers For Diseas
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Intervet Int Bv, Univ Florida, Cornell Res Foundation Inc, The Government Of The Us Secretary Of The Department Of Health And Human Services Centers For Diseas filed Critical Intervet Int Bv
Publication of NO20082257L publication Critical patent/NO20082257L/no
Publication of NO346351B1 publication Critical patent/NO346351B1/no

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/145—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C07K14/08—RNA viruses
    • C07K14/11—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5252—Virus inactivated (killed)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5254—Virus avirulent or attenuated
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
    • A61K2039/541—Mucosal route
    • A61K2039/543—Mucosal route intranasal
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
    • A61K2039/552—Veterinary vaccine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55555—Liposomes; Vesicles, e.g. nanoparticles; Spheres, e.g. nanospheres; Polymers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/70—Multivalent vaccine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16121—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2760/16143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/08—RNA viruses
    • G01N2333/11—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/10—Screening for compounds of potential therapeutic value involving cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/12—Pulmonary diseases
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)

Description

Oppfinnelsens bakgrunn
”Kennelhoste” eller infeksiøs trakeobronkitt (ITB) er en akutt, smittsom luftveisinfeksjon hos hunder som hovedsakelig særpreges ved hoste (Ford et al., 1998). Hunde-ITB anses som én av de hyppigst forekommende infeksiøse luftveissykdommene hos hunder verden over, og utbruddene kan nå et epidemisk omfang dersom hunder holdes i områder med høy populasjonstetthet, f.eks. kenneler. De fleste utbrudd skyldes direkte kontakt fra hund til hund eller aerosolisering av luftveissekresjoner (Ford et al., 1998). De kliniske symptomene skyldes infeksjon med ett eller en kombinasjon av bakterielle og virale midler som koloniserer epitelet i de øvre og nedre luftveier. Hundeparainfluensavirus (CPiV) og bakterien Bordetella bronchiseptica er de vanligste organismene som isoleres fra rammede hunder, men flere andre virus, f.eks. valpesykevirus (CDV) og hunde-adenovirus-1 og -2 (CAV-1, CAV-2), kan sammen med bakterier som Streptococcus sp., Pasteurella multicoda og Echerichia coli påvirke det kliniske forløp og utfall (Ford et al., 1998). Selv om utbruddene opptrer mest effektivt og hurtig og med høy morbiditet i populasjoner med høy tetthet, er kompliserte luftveisinfeksjoner og død uvanlig. Selv om en livstruende sekundær bakteriepneumoni kan utvikles begrenser de fleste ITB-tilfeller seg selv og helbredes uten behandling (Ford et al., 1998).
I juli 1992 ble en luftveisinfeksjon som antas å være ”kennelhoste” epidemisk i flere hundeveddeløpsbaner i New England, Florida, West Virginia, Wisconsin, Kansas, Colorado, Oklahoma og Arizona. Ifølge veterinærene hadde de fleste av de syke hundene en mild hoste som gikk over, men mer enn ett dusin mynder utviklet en akutt hemorragisk pneumoni fulgt av hurtig død (Greyhound Daily News, 1999).
Sent i 1998 og tidlig i 1999 forekom flere utbrudd av ”kennelhoste” i kenneler for veddeløpsmynder over hele landet, noe som førte til obligatorisk stenging av veddeløpsbaner og karantene for alle veddeløpsmynder i de Forente Stater i flere uker (Greyhound Daily News, 1999). Ved én bane i Florida (Palm Beach Kennel Club) ble hoste notert hos nesten 40 % av hundepopulasjonen på en enkelt dag (personlig meddelelse fra Dr. William Duggar). I likhet med utbruddet i 1992 gikk hosten over hos de fleste mynder, men ti hunder i Florida døde av et hemorragisk pneomonisyndrom som ikke lignet ”kennelhoste” (Putnam, 1999).
I mars-april 2003 forekom et annet utbrudd av ”kennelhoste” ved veddeløpsbaner i de østlige Forente Stater. Utbruddet antas å ha sitt opphav i kenneler ved fire veddeløpsbaner i Florida og førte til midlertidig stans av veddeløp og karantene for hunder i nesten tre uker. Nesten 25 % av hundene ved veddeløpsbanen i West Palm Beach var rammet, mens nesten 50 % av de 1400 hundene ved Derby Lane i St. Petersburg utviklet hoste. Igjen kom de fleste hundene seg, men flere hunder har dødd grunnet luftveisinfeksjonen. Den beregnede økonomiske virkningen av luftveisutbruddet ved Derby Lane-veddeløpsbanen alene var 2 millioner dollar.
Det foreligger ingen publiserte rapporter som dokumenterer etiologien eller klinikopatologien for ”kennelhoste”-epidemiene i kenneler for veddeløpsmynder i 1992, 1998-1999 eller 2003. Man har antatt at infeksjonene skyldtes CPiV og/eller B. bronchiseptica, de to vanligste årsakene til kennelhoste. Ikke underbygde meddelelser, f.eks. nettseter, har tilskrevet de dødelige hemorragiske pneumoniene som har vært rapportert hos noen av de hostende hundene til infeksjon med �-hemolytisk Streptococcus equi underart zooepidemicus, og betegner syndromet ”streptokokkalt toksisk sjokk hos hunder”.
Overføring av virus fra én vertsart til en annen er en viktig egenskap ved økologien og epidemiologien for influensavirus (Webster, 1998). To grunnleggende mekanismer for overføring av influensavirus mellom arter er mulig (Webster et al., 1992, Lipatov et al., 2004). En av disse er direkte overføring av et i det vesentlige uendret virus fra én art til en annen. Eksempler på denne mekanismen omfatter de nylige infeksjonene av mennesker med H5N1-undertypen av fugleinfluensavirus (Subbarao et al., 1998, Peiris et al., 2004, Guan et al., 2004), og muligens pandemien i 1918, som betegnes spanskesyken (Reid et al., 2004). Den andre mekanismen er en følge av influensagenomets segmenterte egenskaper. Samtidig infeksjon av en vert med virus fra forskjellige arter kan føre til omsortering av de segmenterte virusgenene og dannelse av en erkombinant med evnen til å infisere andre arter. F.eks. førte nye virus dannet ved omsortering av gener mellom fugleinfluensavirus og humant influensavirus til de humane influensapandemiene i 1957 og 1968 (Webster et al., 1992, Lipatov et al., 2004, Kawaoka et al., 1989).
De fleste direkte overføringer av uendrede influensavirus fra den naturlige vertsart til andre arter er terminale begivenheter, siden vedvarende overføring mellom individer av den nye arten ikke oppterer. Flere virus-vertsinteraksjoner er nødvendig for replikasjon og horisontal overføring og utgjør en formidabel barriere mot bevaring av influensavirus i den nye verten (Webby et al., 2004). Etablering av nye vertsspesifikke linjer av influensavirus er følgelig uvanlig og har kun forekommet i tamfugl, griser, hester og mennesker (Webster et al., 1992, Lipatov et al., 2004).
Peek SF et al (J Vet Intern Med. 2004, vol.18, no. 1, side 132-134) omhandler immunhistokjemisk påvisning av influensavirus hos en hund. Influensaviruset ble karakterisert ved RT-PCR som bekreftet at influensaviruset var av subtype H3. Identiteten til viruset som et H3-subtype hesteinfluensavirus ble bekreftet med RT-PCR-amplifisering av hemagglutinin (HA) genet etterfulgt av sekvensering.
Grunnet influensavirusinfeksjonens alvorlige egenskaper foreligger det et behov for fremgangsmåter for diagnostisering, forebyggelse og behandling av influensavirusinfeksjoner.
Kort oppsummering av oppfinnelsen
Foreliggende oppfinnelse gjelder blant annet isolert influensa A-virus som kan infisere et canid dyr og en sammensetning omfattende et immunogen fra influensa A-virus.
I et første aspekt ifølge oppfinnelsen frembringes et isolert hundedyr influensa A-virus, hvor influensaviruset omfatter et hemagglutinin (HA) polypeptid eller et polynukleotid som koder for et HA-polypeptid, hvor HA- polypeptidet omfatter aminosyresekvensen ifølge SEKV. ID nr.62 eller en moden sekvens derav hvor den N-terminale aminosyresignalsekvensen til fullengde sekvensen har blitt fjernet.
I et annet aspekt ifølge oppfinnelsen frembringes en polynukleotid-ekspresjonskonstruksjon omfattende regulatoriske elementer og et polynukleotid som omfatter et hundedyr influensa A-viruspolynukleotid utvalgt fra: (i) et polynukleotid som koder for HA-polypeptidet omfattende aminosyresekvensen ifølge SEKV. ID nr.62; eller (ii) et polynukleotid som koder for en moden sekvens av HA-polypeptidet omfattende aminosyresekvensen ifølge i SEKV. ID nr.62 hvor den N-terminale aminosyresignalsekvensen til fullengde sekvensen har blitt fjernet; og (iii) et polynukleotid som har nukleotidsekvensen ifølge SEKV. ID. nr 61.
I et ytterligere aspekt ifølge oppfinnelsen frembringes et isolert antistoff som binder spesifikt til et hundedyr influensa A-viruspolypeptid utvalgt fra (i) et polynukleotid som koder for et HA-polypeptid omfattende aminosyresekvensen ifølge SEKV. ID nr.62; og (ii) et polynukleotid som koder for en moden sekvens av HA-polypeptidet omfattende aminosyresekvensen ifølge SEKV. ID nr.62 hvor den N-terminale aminosyresignalsekvensen til fullengde sekvensen har blitt fjernet.
I et ytterligere aspekt ifølge oppfinnelsen frembringes en isolert, in vitro celle omfattende et influensavirus ifølge oppfinnelsen eller et polynukleotid som omfatter et hundedyr influensa A-viruspolynukleotid utvalgt fra: (i) et polynukleotid som koder for HA-polypeptidet omfattende aminosyresekvensen ifølge SEKV. ID nr.62; eller (ii) et polynukleotid som koder for en moden sekvens av HA-polypeptidet omfattende aminosyresekvensen ifølge SEKV. ID nr.62 hvor den N-terminale aminosyresignalsekvensen til fullengde sekvensen har blitt fjernet; og (iii) et polynukleotid som har nukleotidsekvensen ifølge SEKV. ID. nr 61.
Oppfinnelsen frembringer også et reassortant virus omfatttende et hundedyr influensa A-viruspolynukleotid utvalgt fra: (i) et polynukleotid som koder for HA-polypeptidet omfattende aminosyresekvensen ifølge SEKV. ID nr.62; (ii) et polynukleotid som koder for en moden sekvens av HA-polypeptidet omfattende aminosyresekvensen ifølge SEKV. ID nr.62 hvor den N-terminale aminosyresignalsekvensen til fullengde sekvensen har blitt fjernet; og (iii) et polynukleotid som har nukleotidsekvensen ifølge SEKV. ID. nr 61.
Oppfinnelsen frembringer videre en rekombinant virusvektor eller rekombinant polynukleotidvektor omfattende et isolert polynukleotid som omfatter et hundedyr influensa A-viruspolynukleotid utvalgt fra: (i) et polynukleotid som koder for HA-polypeptidet omfattende aminosyresekvensen ifølge SEKV. ID nr.62; (ii) et polynukleotid som koder for en moden sekvens av HA-polypeptidet omfattende aminosyresekvensen ifølge SEKV. ID nr.62 hvor den N-terminale aminosyresignalsekvensen til fullengde sekvensen har blitt fjernet; og (iii) et polynukleotid som har nukleotidsekvensen ifølge SEKV. ID. nr 61.
I et annet aspekt ifølge oppfinnelsen frembringes en sammensetning omfattende et immunogen fra et influensavirus ifølge oppfinnelsen, eventuelt ytterligere omfattende en adjuvans, der immunogenet er i stand til å indusere en immunrespons mot et influensavirus som er i stand til å infisere et hundedyr, og hvor immunogenet omfatter hundedyr influensaviruset ifølge oppfinnelsen, eller et hundedyr influensaviruspolynukleotid som omfatter et hundedyr influensa A-viruspolynukleotid utvalgt fra: (i) et polynukleotid som koder for HA-polypeptidet omfattende aminosyresekvensen ifølge SEKV. ID nr.62; (ii) et polynukleotid som koder for en moden sekvens av HA-polypeptidet omfattende aminosyresekvensen ifølge SEKV. ID nr.62 hvor den N-terminale aminosyresignalsekvensen til fullengde sekvensen har blitt fjernet; og (iii) et polynukleotid som har nukleotidsekvensen ifølge SEKV. ID. nr 61. eller en polynukleotidekspresjonskonstruksjon ifølge krav 8, eller et polypeptid omfattende et hundedyr influensa A-viruspolypeptide utvalgt fra: (i) et polynukleotid som koder for HA- polypeptidet omfattende aminosyresekvensen ifølge SEKV. ID nr.62; eller (ii) et polynukleotid som koder for en moden sekvens av HA-polypeptidet omfattende aminosyresekvensen ifølge SEKV. ID nr.62 hvor den N-terminale aminosyresignalsekvensen til fullengde sekvensen har blitt fjernet; eller et reassortant virus ifølge oppfinnelsen, eller en vektor ifølge oppfinnelsen, der sammensetningen foreligger i en farmasøytisk akseptabelt bære eller buffer.
Oppfinnelsen frembringer videre en hundedyr influensavaksine til bruk for å indusere en immunrespons i et hundedyr mot et hundedyrinfluensavirus, hvor vaksinen omfatter et influensavirus ifølge oppfinnelsen, eller en polynukleotid-ekspresjonskonstruksjon ifølge oppfinnelsen, eller et isolert polypeptid omfattende et hundedyr influensa A-viruspolypeptid utvalgt fra: (i) et polynukleotid som koder for HA-polypeptidet omfattende aminosyresekvensen ifølge SEKV. ID nr.62; eller (ii) et polynukleotid som koder for en moden sekvens av HApolypeptidet omfattende aminosyresekvensen ifølge SEKV. ID nr.62 hvor den N-terminale aminosyresignalsekvensen til fullengde sekvensen har blitt fjernet; eller et reassortant virus ifølge oppfinnelsen, eller en vektor ifølge oppfinnelsen, eller en sammensetning ifølge oppfinnelsen.
Ytterligere trekk ved oppfinnelsen er definer i de etterfølgende karv og beskrivelsen nedenfor.
Kort beskrivelse av figurene
Fig. 1A-1B viser fylogenetiske slektskap mellom hemagglutiningenene. Fig. 1A viser et tre med HA-gener fra representative isolater fra hundedyr, menneske, fugl, gris og hest, innbefattet A/Budgerigar/Hokkaido/1/77 (H4) som utgruppe. Fig. 1B viser et tre med hundeinfluensavirus-HA-gener sammen med samtidige og eldre heste-HA-gener ved anvendelse av A/Duck/Ukraine/63 (H3) som utgruppe. Fyllogenetiske trær ble utledet fra nukleotidsekvenser ved ”neighbour joining”-fremgangsmåten, og ”bootstrap”-analyseverdier > 90 % vises. Stolpen angir antall nukleotidendringer pr. enhetslengde av de horisontale tregrenene.
Fig. 2A-2B viser immunhistokjemisk påvisning av influensa H3-antigen i lunger. Lungevevssnitt ble analysert med et monoklonalt museantistoff mot H3-hemagglutinin, og binding ble påvist ved immunperoksidasereaksjon (brun utfelling). Fig. 2A viser bronkialt epitel fra en mynde med spontan sykdom. Virus H3-antigen ble påvist i bronkialt epitelcellecytoplasma og i makrofager i luftveislumen og i alveolære rom. Fig. 2B viser bronkialt epitel fra en hund fem dager etter inokulasjon med A/canine/Florida/43/2004 (H3N8). Virus H3-antigen ble påvist i bronkialt epitelcellecytoplasma. Målestolpe, 66 μm.
Fig. 3 viser de karakteristiske endringene i bronkier hos mynder som har dødd av hemorragisk pneumoni forbundet med influensavirusinfeksjon. Vevene er farget med H&E. Øvre felt: normal bronkie med epitelceller med flimmerhår, slimceller og basalceller. Nedre felt: bronkie fra en mynde med spontan influensa. Det er nekrose og erosjon av de bronkiale epitelcellene med flimmerhår. Målestolpe: 100 μm.
Fig. 4A-4B viser fyllogenetisk slektskap mellom H3-hemagglutiningenene. Fig. 4A viser et fyllogenetisk tre for hundeinfluensavirus-HA-genene med samtidige og eldre heste-HA-gener. Fig. 4B viser et fyllogenetisk tre for HA-protein fra hundeinfluensavirus sammen med samtidige og eldre heste-HA. Fyllogenetiske trær ble utledet fra genetiske sekvenser eller aminosyresekvenser ved ”neighbor joining”-fremgangsmåten, og ”bootstrap”-analyseverdier > 80 % vises. Stolpen angir antall aminosyreendringer pr. enhetslengde av de horisontale tregrenene.
Fig. 5 viser H3-protein fra influensavirus i epitelceller i bronkier og bronkiekjertler i lunger hos hunder som døde av pneumoni forbundet med influensavirusinfeksjon. De øvre feltene: erosjon av bronkiale epitelceller med flimmerhår i bronkier. Vevene ble farget med H&E. De nedre feltene: H3-protein fra influensavirus i cytoplasma i epitelceller fra bronkier (venstre) og bronkialkjertel (høyre). Vevene ble farget med et monoklonalt antistoff mot influensa-H3 påvist ved immunperoksidasereaksjon (brun utfelling) og motfarget med hematoksylin.
Fig. 6A-6D viser amplifiseringskurver for H3-gener og matriksgener (fig. 6A og fig. 6B) erholdt ved amplifisering av 10 ganger seriefortynnede, in vitro-transkriberte RNA-standarder. Standardkurver for H3-genet og matriksgenet (fig. 6C og fig. 6D) ble fremstilt ved å fremstille logaritmen til utgangskonsentrasjonen av RNA mot terskelsyklusen (Ct) erholdt for hver fortynning.
Fig. 7 viser sensitiviteten av Directigen Flu A, analysert med 10 ganger seriefortynnede viruslagerløsninger, innbefattet A/Wyoming/3/2003 og A/canine/FL/242/2003. Det purpurfargede triangel viser positivt resultat.
Kort beskrivelse av sekvensene
SEKV. ID nr. 1 er en nukleotidsekvens fra et hundedyrinfluensavirus (Florida/43/04) som koder for et PB2-protein.
SEKV. ID nr. 2 er aminosyresekvensen som kodes av SEKV. ID nr. 1.
SEKV. ID nr. 3 er en nukleotidsekvens fra et hundeinfluensavirus (Florida/43/04) som koder for et PB1-protein.
SEKV. ID nr. 4 er aminosyresekvensen som kodes av SEKV. ID nr. 3.
SEKV. ID nr. 5 er en nukleotidsekvens fra et hundeinfluensavirus (Florida/43/04) som koder for et PA-protein.
SEKV. ID nr. 6 er aminosyresekvensen som kodes av SEKV. ID nr. 5.
SEKV. ID nr. 7 er en nukleotidsekvens fra et hundeinfluensavirus (Florida/43/04) som koder for et NS-protein.
SEKV. ID nr. 8 er aminosyresekvensen som kodes av SEKV. ID nr. 7.
SEKV. ID nr. 9 er en nukleotidsekvens fra et hundeinfluensavirus (Florida/43/04) som koder for et NP-protein.
SEKV. ID nr. 10 er aminosyresekvensen som kodes av SEKV. ID nr. 9.
SEKV. ID nr. 11 er en nukleotidsekvens fra et hundeinfluensavirus (Florida/43/04) som koder for et NA-protein.
SEKV. ID nr. 12 er aminosyresekvensen som kodes av SEKV. ID nr. 11.
SEKV. ID nr. 13 er en nukleotidsekvens fra et hundeinfluensavirus (Florida/43/04) som koder for et MA-protein.
SEKV. ID nr. 14 er aminosyresekvensen som kodes av SEKV. ID nr. 13.
SEKV. ID nr. 15 er en nukleotidsekvens fra et hundeinfluensavirus (Florida/43/04) som koder for et HA-protein.
SEKV. ID nr. 16 er aminosyresekvensen som kodes av SEKV. ID nr. 15.
SEKV. ID nr. 17 er en nukleotidsekvens fra et hundeinfluensavirus (FL/242/03) som koder for et PB2-protein.
SEKV. ID nr. 18 er aminosyresekvensen som kodes av SEKV. ID nr. 17.
SEKV. ID nr. 19 er en nukleotidsekvens fra et hundeinfluensavirus (FL/242/03) som koder for et PB1-protein.
SEKV. ID nr. 20 er aminosyresekvensen som kodes av SEKV. ID nr. 19.
SEKV. ID nr. 21 er en nukleotidsekvens fra et hundeinfluensavirus FL/242/03) som koder for et PA-protein.
SEKV. ID nr. 22 er aminosyresekvensen som kodes av SEKV. ID nr. 21.
SEKV. ID nr. 23 er en nukleotidsekvens fra et hundeinfluensavirus (FL/242/03) som koder for et NS-protein.
SEKV. ID nr. 24 er aminosyresekvensen som kodes av SEKV. ID nr. 23.
SEKV. ID nr. 25 er en nukleotidsekvens fra et hundeinfluensavirus (FL/242/03) som koder for et NP-protein.
SEKV. ID nr. 26 er aminosyresekvensen som kodes av SEKV. ID nr. 25.
SEKV. ID nr. 27 er en nukleotidsekvens fra et hundeinfluensavirus (FL/242/03) som koder for et NA-protein.
SEKV. ID nr. 28 er aminosyresekvensen som kodes av SEKV. ID nr. 27.
SEKV. ID nr. 29 er en nukleotidsekvens fra et hundeinfluensavirus (FL/242/03) som koder for et MA-protein.
SEKV. ID nr. 30 er aminosyresekvensen som kodes av SEKV. ID nr. 29.
SEKV. ID nr. 31 er en nukleotidsekvens fra et hundeinfluensavirus (FL/242/03) som koder for et HA-protein.
SEKV. ID nr. 32 er aminosyresekvensen som kodes av SEKV. ID nr. 31.
SEKV. ID nr. 33 er den modne form av HA-proteinet som vises i SEKV. ID nr.
16 hvori den N-terminale signalsekvens på 16 aminosyrer har blitt fjernet.
SEKV. ID nr. 34 er den modne form av HA-proteinet som vises i SEKV. ID nr.
32 hvori den N-terminale signalsekvens på 16 aminosyrer har blitt fjernet.
SEKV. ID nr. 35 er et oligonukleotid.
SEKV. ID nr. 36 er et oligonukleotid.
SEKV. ID nr. 37 er et oligonukleotid.
SEKV. ID nr. 38 er et.
SEKV. ID nr. 39 er et oligonukleotid.
SEKV. ID nr. 41 er et oligonukleotid.
SEKV. ID nr. 42 er et oligonukleotid.
SEKV. ID nr. 43 er et oligonukleotid.
SEKV. ID nr. 44 er et oligonukleotid.
SEKV. ID nr. 45 er et oligonukleotid.
SEKV. ID nr. 46 er et oligonukleotid.
SEKV. ID nr. 47 er en nukleotidsekvens fra et hundeinfluensavirus (Miami/2005) som koder for et PB2-protein.
SEKV. ID nr. 48 er aminosyresekvensen som kodes av SEKV. ID nr. 47.
SEKV. ID nr. 49 er en nukleotidsekvens fra et hundeinfluensavirus (Miami/2005) som koder for et PB1-protein.
SEKV. ID nr. 50 er aminosyresekvensen som kodes av SEKV. ID nr. 49.
SEKV. ID nr. 51 er en nukleotidsekvens fra et hundeinfluensavirus (Miami/2005) som koder for et PA-protein.
SEKV. ID nr. 52 er aminosyresekvensen som kodes av SEKV. ID nr. 51.
SEKV. ID nr. 53 er en nukleotidsekvens fra et hundeinfluensavirus (Miami/2005) som koder for et NS-protein.
SEKV. ID nr. 54 er aminosyresekvensen som kodes av SEKV. ID nr. 53.
SEKV. ID nr. 55 er en nukleotidsekvens fra et hundeinfluensavirus (Miami/2005) som koder for et NP-protein.
SEKV. ID nr. 56 er aminosyresekvensen som kodes av SEKV. ID nr. 55.
SEKV. ID nr. 57 er en nukleotidsekvens fra et hundeinfluensavirus (Miami/2005) som koder for et NA-protein.
SEKV. ID nr. 58 er aminosyresekvensen som kodes av SEKV. ID nr. 57.
SEKV. ID nr. 59 er en nukleotidsekvens fra et hundeinfluensavirus (Miami/2005) som koder for et MA-protein.
SEKV. ID nr. 60 er aminosyresekvensen som kodes av SEKV. ID nr. 59.
SEKV. ID nr. 61 er en nukleotidsekvens fra et hundeinfluensavirus (Miami/2005) som koder for et HA-protein.
SEKV. ID nr. 62 er aminosyresekvensen som kodes av SEKV. ID nr. 61.
SEKV. ID nr. 63 er en nukleotidsekvens fra et hundeinfluensavirus (Jacksonville/2005) som koder for et PB2-protein.
SEKV. ID nr. 64 er aminosyresekvensen som kodes av SEKV. ID nr. 63.
SEKV. ID nr. 65 er en nukleotidsekvens fra et hundeinfluensavirus (Jacksonville/2005) som koder for et PB1-protein.
SEKV. ID nr. 66 er aminosyresekvensen som kodes av SEKV. ID nr. 65.
SEKV. ID nr. 67 er en nukleotidsekvens fra et hundeinfluensavirus (Jacksonville/2005) som koder for et PA-protein.
SEKV. ID nr. 68 er aminosyresekvensen som kodes av SEKV. ID nr. 67.
SEKV. ID nr. 69 er en nukleotidsekvens fra et hundeinfluensavirus (Jacksonville/2005) som koder for et NS-protein.
SEKV. ID nr. 70 er aminosyresekvensen som kodes av SEKV. ID nr. 69.
SEKV. ID nr. 71 er en nukleotidsekvens fra et hundeinfluensavirus (Jacksonville/2005) som koder for et NP-protein.
SEKV. ID nr. 72 er aminosyresekvensen som kodes av SEKV. ID nr. 71.
SEKV. ID nr. 73 er en nukleotidsekvens fra et hundeinfluensavirus (Jacksonville/2005) som koder for et NA-protein.
SEKV. ID nr. 74 er aminosyresekvensen som kodes av SEKV. ID nr. 73.
SEKV. ID nr. 75 er en nukleotidsekvens fra et hundeinfluensavirus (Jacksonville/2005) som koder for et MA-protein.
SEKV. ID nr. 76 er aminosyresekvensen som kodes av SEKV. ID nr. 75.
SEKV. ID nr. 77 er en nukleotidsekvens fra et hundeinfluensavirus (Jacksonville/2005) som koder for et HA-protein.
SEKV. ID nr. 78 er aminosyresekvensen som kodes av SEKV. ID nr. 77.
SEKV. ID nr. 79 er et oligonukleotid.
SEKV. ID nr. 80 er et oligonukleotid.
SEKV. ID nr. 81 er et oligonukleotid.
SEKV. ID nr. 82 er et oligonukleotid.
SEKV. ID nr. 83 er et oligonukleotid.
SEKV. ID nr. 84 er et.
SEKV. ID nr. 85 er et oligonukleotid.
SEKV. ID nr. 86 er et oligonukleotid.
SEKV. ID nr. 87 er et oligonukleotid.
SEKV. ID nr. 88 er et oligonukleotid.
Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen
Foreliggende beskrivelse (ikke ifølge oppfinnelsen med mindre det står presisert) gjelder isolert influensavirus som kan infisere hundedyr og føre til luftveissykdom. Et influensavirus kan omfatte et polynukleotid som koder for et protein med en aminosyresekvens som vist i hvilken som helst av SEKV. ID nr. 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28,30, 32, 33, 34, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76 eller 78, eller et funksjonelt og/eller immunogent fragment eller en variant derav.
Polynukleotidet kan omfatte nukleotidsekvensen som er vist i hvilken som helst av SEKV. ID nr. 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 35, 27, 29, 31, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75 eller 77, eller et fragment eller en variant derav. Et influensavirus ifølge foreliggende beskrivelse kan være et influensavirus av undertype H3. Virus kan isoleres fra infiserte hunder og dyrkes i celler eller egg ifølge fremgangsmåtene som beskrives heri. Influensaviruset et influensa A-virus.
Foreliggende beskrivelse gjelder også polynukleotider som omfatter hele eller en del av ett eller flere gener eller et genomisk segment av et influensavirus . Et polynukleotid ifølge beskrivelsen kan omfatter et influensahemagglutinin (HA)-gen, neuraminidase (NA)-gen, nukleoprotein (NP)-gen, matriksprotein (MA eller M)-gen, polymerase basisk (PB)-proteingen, polymerase sur (PA)-proteingen, ikke-strukturelt (NS)-proteingen eller et funksjonelt fragment eller en funksjonell variant av hvilket som helst av disse genene. Et polynukleotidet ifølge beskrivelsen kan omfatte hemagglutiningenet (HA-genet) eller et funksjonelt fragment eller en funksjonell variant derav. HA-genet kan kode for et hemagglutininprotein som har én eller flere av følgende: serin i posisjon 83, leucin i posisjon 222, treonin i posisjon 328 og/eller treonin i posisjon 483, sammenlignet med aminosyresekvensen til heste-H3-konsensussekvensen. HA-genet kan kode for et polypeptid som har en aminosyresekvens som vist i SEKV. ID nr. 16, 32, 62 eller 78 eller et funksjonelt og/eller immunogent fragment eller en variant derav. HA-genet kan omfatte en nukleotidsekvens som vist i SEKV. ID nr. 15, 31, 61 eller 77.
Et polynukleotid ifølge beskrivelsen koder for et polypeptid med aminosyresekvensen som vises i hvilken som helst av SEKV. ID nr. 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28,30, 32, 33, 34, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74 eller 78, eller et funksjonelt og/eller immunogent fragment eller en variant derav.
Polynukleotidet som koder for aminosyresekvensen som vises i SEKV. ID nr. 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28,30, 32, 33, 34, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76 eller 78 omfatter nukleotidsekvensen som vises henholdsvis i SEKV. ID nr. 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 35, 27, 29, 31, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75 eller 77, eller en sekvens som koder for et funksjonelt og/eller immunogent fragment eller en variant av hvilken som helst av SEKV. ID nr. 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28,30, 32, 33, 34, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76 eller 78. Foreliggende beskrivelse gjelder følgelig polynukleotidsekvenser som omfatter nukleotidsekvensen som vises i hvilken som helst av SEKV. ID nr. 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 35, 27, 29, 31, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75 eller 77, eller et fragment eller en variant, innbefattet en degenerert variant, av hvilken som helst av SEKV. ID nr, 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 35, 27, 29, 31, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75 eller 77. Et polynuklotid ifølge beskrivelsen kan omfatte: nukleotid 1-2271 i SEKV. ID nr.3, nukleotid 1-2148 i SEKV. ID nr. 5, nukleotid 1-657 i SEKV. ID nr. 7, nukleotid 1-1494 i SEKV. ID nr. 9, nukleotid 1-1410 i SEKV. ID nr. 11, nukleotid 1-756 i SEKV. ID nr. 13, nukleotid 1-1695 i SEKV. ID nr. 15, nukleotid 1-2271 i SEKV. ID nr.19, nukleotid 1-2148 i SEKV. ID nr. 21, nukleotid 1-657 i SEKV. ID nr. 23, nukleotid 1-1494 i SEKV. ID nr. 25, nukleotid 1-756 i SEKV. ID nr. 29, nukleotid 1-1695 i SEKV. ID nr. 31, nukleotid 1-2277 i SEKV. ID nr.
47, nukleotid 1-2271 i SEKV. ID nr. 49, nukleotid 1-2148 i SEKV. ID nr. 51, nukleotid 1-690 i SEKV. ID nr. 53, nukleotid 1-1494 i SEKV. ID nr. 55, nukleotid 1-1410 i SEKV. ID nr. 57, nukleotid 1-756 i SEKV. ID nr. 59, nukleotid 1-1695 i SEKV. ID nr. 61, nukleotid 1-2277 i SEKV. ID nr. 63, nukleotid 1-2271 i SEKV. ID nr.65, nukleotid 1-2148 i SEKV. ID nr. 67, nukleotid 1-690 i SEKV. ID nr.69, nukleotid 1-1494 i SEKV. ID nr. 71, nukleotid 1-1410 i SEKV. ID nr. 73, nukleotid 1-756 i SEKV. ID nr. 75 og nukleotid 1-1695 i SEKV. ID nr. 77. Nukleotid- og aminosyresekvenser til virale polynukleotid- og polypeptidsekvenser som omfattes av den foreliggende beskrivelse har også blitt deponert hos GenBank med aksesjonsnr. DQ124147 til D124161 og DQ124190.
Foreliggende beskrivelse gjelder også polypeptider som kodes av polynukleotider fra et influensavirus. Foreliggende beskrivelse gjelder også funksjonelle og/eller immunogene fragmenter og varianter av de her beskrevne polypeptider. De omfattede polypeptidene inkluderer HA-protein, NA-protein, NS-protein, nukleoprotein, polymerase basisk protein, polymerase surt protein og matriksprotein fra et influensavirus ifølge beskrivelsen. Et polypeptid ifølge beskrivelsen kan ha en aminosyresekvens som vist i hvilken som helst av SEKV. ID nr. 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28,30, 32, 33, 34, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74 eller 78, eller et funksjonelt og/eller immunogent fragment eller en variant derav.
Foreliggende beskrivelse gjelder også polynukleotid-ekspresjonskonstruksjoner som omfatter en polynukleotidsekvens ifølge foreliggende beskrivelse. En ekspresjonskonstruksjon ifølge beskrivelsen kan omfatte en polynukleotidsekvens som koder for et polypeptid som omfatter en aminosyresekvens som vist i hvilken som helst av SEKV. ID nr. 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28,30, 32, 33, 34, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76 eller 78, eller et funksjonelt og/eller immunogent fragment eller en variant derav. Polynukleotidet som koder for aminosyresekvensen som vises i SEKV. ID nr. 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28,30, 32, 33, 34, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76 eller 78 kan omfatte nukleotidsekvensen som vises henholdsvis i SEKV. ID nr. 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 35, 27, 29, 31, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75 eller 77 eller en sekvens som koder for et funksjonelt og/eller immunogent fragment eller en variant av hvilken som helst av SEKV. ID nr. 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28,30, 32, 33, 34, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76 eller 78.
Foreliggende beskrivelse gjelder følgelig ekspresjonskonstruksjoner som omfatter en polynukleotidsekvens som omfatter nukleotidsekvensen som vises i hvilken som helst av SEKV. ID nr. 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 35, 27, 29, 31, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75 eller 77 eller et fragment eller en variant, innbefattet en degenerert variant, av hvilken som helst av SEKV. ID nr. 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 35, 27, 29, 31, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75 eller 77. En ekspresjonskonstruksjon ifølge foreliggende beskrivelse kan frembringe overekspresjon av et operativt tilkoblet polynukleotid ifølge beskrivelsen.
Generelt kan ekspresjonskonstruksjoner omfatte regulatoriske elementer som er funksjonelle i den påtenkte vertscellen som ekspresjonskonstruksjonen skal uttrykkes i. En gjennomsnittsfagperson kan således utvelge regulatoriske elementer for anvendelse i f.eks. humane vertsceller, pattedyrsvertsceller, insektvertsceller, gjærvertsceller, bakterievertsceller og plantevertsceller. Regulatoriske elementene er de elementer som er funksjonelle i hundedyrceller. Regulatoriske elementer omfatter promotere, transkripsjonstermineringssekvenser, translasjonstermineringssekvenser, enhancere og polyadenyleringselementer. Som anvendt heri viser begrepet ”ekspresjonskonstruksjon” til en kombinasjon av nukleinsyresekvenser som gir transkripsjon av en operativt tilkoblet nukleinsyresekvens. Som anvendt heri viser begrepet ”operativt tilkoblet” til en sammenstilling av de beskrevne bestanddeler, hvori bestanddelene foreligger i en sammenheng som gjør det mulig for dem å fungere på den påtenkte måten. Generelt foreligger operativt sammenkoblede bestanddeler i en kontinuerlig sammenheng.
En ekspresjonskonstruksjon kan omfatte en promotersekvens som er operativt koblet til en polynukleotidsekvens som koder for et polypeptid. Promotere kan innføres i et polynukleotid ved anvendelse av standardfremgangsmåter som er kjente innen faget. Flere kopier av promotere eller flere promotere kan anvendes i en ekspresjonskonstruksjon. En promoter kan plasseres i tilnærmet samme avstand fra transkripsjonsstartsetet i ekspresjonskonstruksjonen som avstanden fra transkripsjonsstartsetet i promoterens naturlige genetiske miljø. En viss variasjon i denne avstanden tillates uten vesentlig reduksjon av promoteraktiviteten. Et transkripsjonsstartsete inngår typisk i ekspresjonskonstruksjonen. Promoteren som er forbundet med en ekspresjonskonstruksjon kan frembringe overekspresjon av et operativt tilkoblet polynukleotid.
Promotere for anvendelse med en ekspresjonskonstruksjon i eukaryote celler kan være av viralt eller cellulært opphav. Virale promotere omfatter, men er ikke begrenset til, cytomegalovirus (CMV)-genpromotere, tidlige eller sene SV40-promotere eller Rous sarkomvirus (RSV)-genpromotere. Promotere av cellulært opphav omfatter, men er ikke begrenset til, desmingenpromoteren og aktingenpromoteren. Promotere som er egnet for anvendelse med en ekspresjonskonstruksjon i gjærceller omfatter, men er ikke begrenset til, 3-fosfoglyseratkinasepromoteren, glyseraldehyd-3-fosfatdehydrogenasepromoteren, metallotioneinpromoteren, alkoholdehydrogenase-2-promoteren og heksokinasepromoteren.
Dersom ekspresjonskonstruksjonen skal foreligge i eller innføres i en plantecelle kan planteviruspromotere, f.eks. en 35S (innbefattet den forsterkede CaMV 35S-promoter (se f.eks. US patentskrift nr. 5 106 739 og An, 1997))- eller 19S-promoter fra blomkålmosaikkvirus (CaMV) anvendes. Andre promotere som kan anvendes for ekspresjonskonstruksjoner i planter omfatter f.eks. prolifera-promoteren, Ap3-promoteren, varmesjokkpromotere, T-DNA 1’- eller 2’-promoteren fra A. tumefaciens, polygalakturonasepromoteren, chalkon syntase A (CHS-A)-promoteren fra petunia, PR-1a-promoteren fra tobakk, ubiquitinpromoteren, aktinpromoteren, alcA-genpromoteren, pin2-promoteren (Xu et al., 1993), WipI-promoteren fra mais, trpA-genpromoteren fra mais (US patentskrift nr. 5 625 136), CDPK-genpromoteren fra mais og RUBISCO SSU-promoteren (US patentskrift nr. 5034 322). Rotspesifikke promotere, f.eks. hvilken som helst av promoterselvensene som beskrives i US patentskrift nr. 6 455 760 eller US patentskrift nr. 6 696 623 eller i de offentliggjorte US patentsøknader nr. 20040078841, 20040067506, 20040019934, 20030177536, 20030084486 eller 20040123349, kan anvendes med en ekspresjonskonstruksjon ifølge beskrivelsen. Konstitutive promotere (f.eks. CaMV-, ubiquitin-, aktin- eller NOS-promoteren), utviklingsregulerte promotere og induserbare promotere (f.eks. promotere som kan induseres med varme, lys, hormoner eller kjemikalier)kan også anvendes. Vevsspesifikke promotere, f.eks. fruktspesifikke promotere, f.eks. E8-promoteren fra tomat (aksesjonsnr. AF515784, Good et al. (1994)) kan også anvendes. Frøspesifikke promotere som promoteren fra et β-faseolingen (f.eks. fra snittebønne) eller et glysiningen (f.eks. fra soyabønne) og andre kan også anvendes.
For ekspresjon i prokaryote systemer kan en ekspresjonskonstruksjon omfatte promotere som f.eks. promoteren for alkalisk fosfatase, tryptofan (trp)-promoteren, lambda PL-promoteren, β-laktamasepromoteren, laktosepromoteren, phoA-promoteren, T3-promoteren, T7-promoteren eller tac-promoteren (de Boer et al., 1983).
Ekspresjonskonstruksjoner kan om ønskelig inneholde en transkripsjonstermineringssekvens, en translasjonstermineringssekvens, en sekvens som koder for et signalpeptid og/eller enhancerelementer. Transkripsjonstermineringsområder kan typisk erholdes fra det 3’ ikke-translaterte området i en eukaryot eller viral gensekvens. Transkripsjonstermineringssekvenser kan plasseres nedstrøms for en kodende sekvens for å oppnå effektiv terminering. En siganlpeptidsekvens er en kort aminosyresekvens som typisk foreligger i aminoenden av et protein og som er ansvarlig for relokalisering av et operativt tilkoblet, modent polypeptid til et bredt utvalg av posttranslasjonelle cellulære destinasjoner som varierer fra en spesifikk organelleavdeling til seter for proteinvirkning og det ekstracellulære miljøet. Styring av genprodukter til en påtenkt cellulær og/eller ekstracellulær destinasjon kan oppnås ved anvendelse av en operativt tilkoblet signalpeptidsekvens. Klassiske enhancere er cis-virkende elementer som forhøyer gentranskripsjonen, og slike kan også inngå i ekspresjonskonstruksjonen. Klassiske enhancerelementer er kjent innen faget og omfatter, men er ikke begrenset til, CaMV 35S-enhancerelementet, enhancerelementet for den tidlige promoter fra cytomegalovirus (CMV) og SV40-enhancerelementet. Intronformidlede enhancerelementer som forsterker genekspresjonen er også kjent innen faget. Disse elementene må foreligge inne i det transkriberte området og er orienteringsavhengige.
DNA-sekvenser som styrer polyadenylering av mRNA som transkriberes fra ekspresjonskonstruksjonen kan også inngå i ekspresjonskonstruksjonen og omfatter, men er ikke begrenset til, et oktopinsyntase- eller nopalinsyntase-signal.
Ekspresjonskonstruksjoner kan også omfatte ett eller flere dominante seleksjonsmarkørgener, innbefattet f.eks. gener som koder for antibiotikaresistens og/eller herbicidresistens for seleksjon av transformerte celler. Antibiotikaresistensgener kan gi resistens overfor ett eller flere av følgende antibiotika: hygromycin, kanamycin, bleomycin, G418, streptomycin, paromomycin, neomycin og spektinomycin.
Kanamycinresistens kan gis av neomycinfosfotransferase (NPT II).
Herbicidresistensgener kan gi resistens overfor fosfinotricinacetyltransferase eller flyfosat. Andre markører som anvendes for analyse av celletransformasjon omfatter, men er ikke begrenset til, gener som koder for β-glukoronidase (GUS), β-galaktosidase, luciferase, nopalinsyntase, kloramfenikolacetyltransferase (CAT), grønt fluorescerende protein (GFP) eller forsterket GFP (Yang et al., 1996).
Foreliggende beskrivelse gjelder også polynukleotidvektorer som omfatter en polynukleotidsekvens som koder for et polypeptid. Unike restriksjonsenzymseter kan foreligge i den 5’ og 3’ ende av en ekspresjonskonstruksjon eller et polynukleotid for å muliggjøre innsetting i en polynukleotidvektor. Som anvendt heri viser begrepet ”vektor” til hvilket som helst genetisk element, innbefattet f.eks. plasmider, kosmider, kromosomer, bakteriofag, virus og lignende, som kan replikere når det er assosiert med egnede kontrollelementer og som kan overføre polynukleotidsekvenser mellom celler. Vektorer inneholder en nukleotidsekvens som gjør det mulig for vektoren å replikere i en valgt vertscelle. En rekke forskjellige vektorer er tilgjengelige for ekspresjon og/eller kloning og omfatter, men er ikke begrenset til, pBT322, pUC-serien, M13-serien, pGEM-serien og pBLUESCRIPT-vektorene (Stratagene, La Jolla, CA og Promega, Madison, WI).
Foreliggende beskrivelse gjelder også oligonukleotidprober og –primere, f.eks. polymerasekjedereaksjon (PCR)-primere, som kan hybridisere til en kodende eller ikkekodende sekvens i et polynukleotid. Oligonukleotidprober kan anvendes i fremgangsmåter for påvisning av nukleinsyresekvenser fra influensavirus.
Oligonukleotidprimere kan anvendes i PCR-fremgangsmåter og andre fremgangsmåter som omfatter nukleinsyreamplifisering. En probe eller primer kan hybridisere til et polynukleotid ifølge beskrivelsen under stringente betingelser. Prober og primere kan om ønskelig omfatte en påvisbar merking eller et rapportørmolekyl, f.eks. fluorescerende molekyler, enzymer, radioaktive grupper og lignende. Prober og primere kan ha hvilken som helst lengde som er egnet for fremgangsmåten eller analysen som de skal benyttes i. Prober og primere vil typisk ha en lengde på fra 10-500 eller flere nukleotider. Prober og primere som er fra 10-20, fra 21-30, fra 31-40, fra 41-50, fra 51-60, fra 61-70, fra 71-80, fra 81-90, fra 91-100 nukleotider lange eller 101 eller flere nukleotider lange. Prober og primere kan være 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 eller 30 nukleotider lange. Prober og primere kan ha fullstendig (100 %) nukleotidsekvensidentitet med polynukleotidsekvensen, eller sekvensidentiteten kan være lavere enn 100 %. F.eks. kan sekvensidentiteten mellom en probe eller primer og en sekvens være 99 %, 98 %, 97 %, 96 %, 95 %, 90 %, 85 %, 80 %, 75 %, 70 % eller hvilken som helst annen prosent sekvensidentiet, så lenge som proben eller primeren kan hybridisere under stringente betingelser til en nukleotidsekvens i et polynukleotid.
Eksempler på prober og primere omfatter prober og primere med nukleotidsekvensen som vises i hvilken som helst av SEKV. ID nr. 35, SEKV. ID nr. 36, SEKV. ID nr. 37, SEKV. ID nr. 38, SEKV. ID nr. 39, SEKV. ID nr. 40, SEKV. ID nr. 41, SEKV. ID nr. 42, SEKV.
ID nr. 43, SEKV. ID nr. 44, SEKV. ID nr. 45 og SEKV. ID nr. 46, eller et funksjonelt fragment eller en variant av hvilken som helst av SEKV. ID nr. 35-46.
Som anvendt heri viser begrepene ”nukleinsyre”, ”polynukleotid” og ”oligonukleotid” til en deoksyribonukleotid-, ribonukleotid- eller blandet deoksyribonukleotid- og ribonukleotid-polymer i enten enkelttrådet eller dobbelttrådet form, og vil med mindre annet er angitt omfatte kjente analoger av naturlige nukleotider som kan fungere på lignende måte som naturlig forekommende nukleotider.
Polynukleotidsekvenser omfatter DNA-trådsekvensen som kan transkriberes til RNA og RNA-tråden som kan translateres til protein. Den komplementære sekvensen til hvilken som helst nukleinsyre, hvilket som helst polynukleotid eller hvilket som helst oligonukleotid ifølge foreliggende beskrivelse omfattes også av beskrivelsen.
Polynukleotidsekvenser omfatter også både fullengdesekvenser og kortere sekvenser avledet fra fullengdesekvensene. Foreliggende beskrivelse omfatter også polynukleotider som er komplementære i sekvens til polynukleotidene som beskrives heri.
Polynukleotider og polypeptider ifølge beskrivelsen kan foreligge i renset eller isolert form.
Grunnet den genetiske kodes degenererthet kan en rekke forskjellige polynukleotidsekvenser kode for et polypeptid. En tabell som viser alle mulige triplettkodoner (og hvor U også står for T) og aminosyren som kodes av hvert kodon beskrives i Lewin (1985). I tillegg ligger det godt innenfor kunnskapsnivået til en fagperson å danne alternative polynukleotidsekvenser som koder for de samme eller i det vesentlige de samme polypeptidene. Disse degenererte polynukleotidsekvensvariantene og alternative polynukleotidsekvensene omfattes av den foreliggende beskrivelse. Som anvendt heri viser henvisninger til ”i det vesentlige den samme” sekvens til sekvenser som koder for aminosyresubstitusjoner, -delesjoner, -addisjoner eller –insersjoner som ikke i vesentlig grad endrer den funksjonelle og/eller immunogene aktivitet av polypeptidet som kodes av polynukleotidene ifølge foreliggende beskrivelse.
Foreliggende beskrivelse gjelder også varianter av polynukleotidene ifølge foreliggende beskrivelse som koder for polypeptider ifølge beskrivelsen. Sekvensvarianter omfatter sekvenser hvori ett eller flere nukleotider i sekvensen har blitt substituert, deletert og/eller innsatt. Nukleotidene som kan erstatte naturlige nukleotider i DNA har en basegruppe som kan omfatte, men som ikke er begrenset til, inosin, 5-fluorurasil, 5-bromurasil, hypoksantin, 1-metylguanin, 5-metylcytosin og tritylerte baser.
Sukkergruppen i nukleotidet i en sekvens kan også modifiseres og omfatter, men er ikke begrenset til, arabinose, xylulose og heksose. I tillegg kan adenin-, cytosin-, guanin-, tymin- og urasilbasen i nukleotidene modifiseres med acetyl-, metyl- og/eller tiogrupper. Sekvenser som inneholder nukleotidsubstitusjoner, -delesjoner og/eller insersjoner kan fremstilles og analyseres ved anvendelse av standardteknikker som er kjente innen faget.
Innføring av aminosyrer som er forskjellige fra dem som spesifikt eksemplifiseres eller som naturlig foreligger i et polypeptid omfattes også av den foreliggende beskrivelse. F.eks. kan ikke-naturlige aminosyrer erstatte aminosyrene i et polypeptid så lenge som polypeptidet med de substituerte aminosyrene bevarer i det vesentlige den samme funksjonelle aktivitet som polypeptidet hvor aminosyrene ikke har blitt substituert. Eksempler på ikke-naturlige aminosyrer omfatter, men er ikke begrenset til, ornitin, sitrullin, hydroksyprolin, homoserin, fenylglysin, taurin, jodtyrosin, 2,4-diaminosmørsyre, α-aminoisosmørsyre, 4-aminosmørsyre, 2-aminosmørsyre, γ-aminosmørsyre, εaminoheksansyre, 6-aminoheksansyre, 2-aminoisosmørsyre, 3-aminopropionsyre, norleucin, norvalin, sarkosin, homositrullin, cysteinsyre, τ-butylglysin, τ-butylalanin, fenylglysin, sykloheksylalanin, β-alanin, fluoraminosyrer, ”designer” aminosyrer som βmetylaminosyrer, C-metylaminosyrer, N-metylaminosyrer og aminosyreanaloger generelt. Ikke-naturlige aminosyrer omfatter også aminosyrer med derivatiserte sidegrupper. Videre kan hvilke som helst av aminosyrene i proteinet foreligge i D-form (desktroroterende) eller L-form (levoroterende). Alleliske varianter av en proteinsekvens i et polypeptid omfattes også av beskrivelsen.
Aminosyrer kan generelt kategoriseres i følgende klasser: upolare, uladde polare, basiske og sure. Konservative substitusjoner med hvilke et polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse har en aminosyre fra én klasse som erstattes med en annen aminosyre fra samme klasse omfattes av den foreliggende beskrivelse, så lenge som polypeptidet med substitusjonen fortsatt bevare i det vesentlige den samme funksjonelle aktivitet som polypeptidet som ikke har substitusjonen. Polynukleotider som koder for et polypeptid med én eller flere aminosyresubstitusjoner i sekvensen omfattes av den foreliggende beskrivelse. Tabell 11 nedenfor gir en liste over eksempler på aminosyrer som tilhører hver av klassene. Enbokstavaminosyreforkortelser er definert i tabell 12.
Fragmenter og varianter av polypeptider fra influensavirus ifølge foreliggende beskrivelse kan fremstilles ved anvendelse av standardfremgangsmåter som er kjente innen faget og analyseres for nærvær av funksjon eller immunogenisitet ved anvendelse av standardteknikker som er kjent innen faget. For analyse av fragmenter og/eller varianter av et nevraminidasepolypeptid ifølge beskrivelsen kan f.eks. enzymatisk aktivitet analyseres. En gjennomsnittsfagperson kan således lett fremstille og analysere fragmenter og varianter av et polypeptid ifølge oppfinnelsen og avgjøre hvorvidt fragmentet eller varianten bevarer aktivitet sammenlignet med et fullengde polypeptid eller et uendret polypeptid.
Polynukleotider og polypeptider som omfattes av den foreliggende beskrivelse kan også defineres ut fra mer spesielle identitets- og/eller likhetsområder relativt til de sekvenser ifølge beskrivelsen som spesifikt er eksemplifisert heri. Sekvensidentiteten vil typisk være høyere enn 60 %, fortrinnsvis høyere enn 75 %, mer foretrukket høyere enn 80 %, enda mer foretrukket høyere enn 90 % og kan være høyere enn 95 %. Identitet og/eller likhet av en sekvens kan være 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 eller 99 %, sammenlignet med en sekvens som er eksemplifisert heri. Med mindre annet er angitt kan prosent sekvensidentitet og/eller –likhet som anvendt heri bestemmes ved anvendelse av algoritmen til Karlin og Altschul (1990), modifisert som i Karlin og Altschul (1993). En slik algoritme er innført i programmene NBLAST og XBLAST i Altschul et al. (1990). BLAST-søk kan utføres med programmet NBLAST, poeng = 100, ordlengde = 12, for erholdelse av sekvenser med den ønskede prosent sekvensidentitet. For erholdelse av sammenstillinger med gap for sammenligningsformål kan Gapped BLAST anvendes som beskrevet i Altschul et al. (1997). Ved benyttelse av programmene BLAST og Gapped BLAST kan standardparameterne i de angjeldende programmer (NBLAST og XBLAST) anvendes. Se nettsiden til NCBI/NIH.
Foreliggende beskrivelse omfatter også polynukleotidmolekyler med sekvenser som er tilstrekkelig homologe til polynukleotidsekvensene som vises heri til å tillate hybridisering til denne sekvensen under standard stringente betingelser og ved standardfremgangsmåter (Maniatis et al., 1982). Som anvendt heri viser ”stringente” hybridiseringsbetingelser til betingelser hvor hybridiseringen typisk utføres over natten med en temperatur som ligger 20-25<o>C under smeltetemperaturen (Tm) for DNA-hybridet i 6x SSPE, 5x Denhardts løsning, 0,1 % SDS, 0,1 mg/ml denaturert DNA.
Smeltetemperaturen Tm beskrives ved følgende formel (Beltz et al., 1983):
Tm=81,5 C 16,6 Log[Na+]+0,41(%G+C)-0,61(% formamid)-600/dupleksens lengde i basepar.
Vask utføres typisk som følger:
(1) To ganger ved romtemperatur i 15 min. i 1x SSPE, 0,1 % SDS (vask ved lav stringens).
(2) En gang ved Tm-20<o>C i 15 min. i 0,2x SSPE, 0,1 % SDS (vask ved moderat stringens).
Foreliggende beskrivelse gjelder også virusproteiner og –peptider som kodes av genene fra et influensavirus ifølge foreliggende beskrivelse. Virusproteinet kan være et modent HA-protein. Det modne HA-protein kan omfatte én eller flere av følgende: serin i posisjon 82, leucin i posisjon 221, treonin i posisjon 327 og/eller treonin i posisjon 482. Det modne HA-protein kan ha en aminosyresekvens som vist i SEKV. ID nr. 33 eller SEKV. ID nr. 34 eller et funksjonelt og/eller immunogent fragment eller en variant av SEKV. ID nr. 33 eller SEKV. ID nr. 34. Virusproteinet kan være et NA-protein, NS-protein, PB-protein, PA-protein eller MA-protein. Virusproteiner og –peptider ifølge beskrivelsen kan anvendes for frembringelse av antistoffer som bindes spesifikt til proteinet eller peptidet. Virusproteiner og –peptider ifølge foreliggende beskrivelse kan også anvendes som immunogener og i vaksinepreparater.
Foreliggende beskrivelse gjelder også preparater og fremgangsmåter for induksjon av en immunrespons mot et influensavirus som kan infisere et mottakelig vertsdyr og føre til luftveissykdom. Beskrivelsen kan anvendes for induksjon av en immunrespons mot et influensavirus av hvilken som helst undertype i et mottakelig vertsdyr. F.eks. kan influensavirus ha HA-undertypen H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15 eller H16 og NA-undertypen N1, N2, N3, N4, N5, N6, N7, N8 eller N9. HA-undertypen kan være H3 eller H5. NA-undertypen kan være N7 eller N8. En immunrespons kan induseres mot et influensavirus av undertype H3N8. Vertsdyret kan være en canid. Hundedyr omfatter ville hundedyr, hundedyr i zoologiske hager og tamme hundedyr, f.eks. ulver, prærieulver og rever. Hundedyr omfatter også hunder, nærmere bestemt tamhunder, f.eks. ledsagerhunder, oppvisningshunder, arbeidshunder, gjeterhunder, jakthunder, vakthunder, politihunder, veddeløpshunder og/eller laboratoriehunder av ren rase eller blandingsrase. Vertsdyret kan være en domestisert hund, f.eks. en mynde. Et dyr kan få administrert en effektiv mengde av et immunogent preparat beskrivelse som er tilstrekkelig for induksjon av en immunrespons mot et influensavirus ifølge beskrivelsen. Immunresponsen kan være en humoral og/eller cellulær immunrespons. Immunresponsen kan være en beskyttende immunrespons som kan forebygge eller minimalisere virusinfeksjon i det immuniserte vertsdyr over et visst tidsrom etter immuniseringen. Foreliggende beskrivelse gjelder følgelig også vaksinepreparater og fremgangsmåter som kan gi et vaksinert dyr en beskyttende immunrespons mot et virus ifølge foreliggende beskrivelse.
Som beskrevet heri kan vaksinepreparatene eller de immunogene preparatene ifølge foreliggende beskrivelse omfatte cellefritt, intakt virus, innbefattet svekket eller inaktivert virus, eller deler av viruset, innbefattet subvirionpartikler (innbefattet ”splittvaksine” hvori et virion er behandlet for fjerning av noen av eller alle viruslipider), virusproteiner (innbefattet enkeltvise proteiner og makromolekylære komplekser av flere proteiner), polypeptider og peptider, så vel som virusinfiserte cellelinjer, eller en kombinasjon av hvilke som helst av disse. Vaksinepreparater eller immunogene preparater som omfatter virusinfiserte cellelinjer hvor hver cellelinje er infisert med en forskjellig virusstamme.
Vaksinepreparatene eller de immunogene preparatene ifølge foreliggende beskrivelse omfatter også rekombinante, virusvektorbaserte konstruksjoner som f.eks. kan omfatte gener som koder for HA-protein, NA-protein, nukleoprotein, polymerase basisk protein, polymerase surt protein og/eller matriksprotein fra et influensavirus ifølge foreliggende beskrivelse. Enhver egnet virusvektor som kan anvendes for fremstilling av en rekombinant vektor/virus-konstruksjon omfattes for anvendelse i den foreliggende beskrivelse. F.eks. kan virusvektorer avledet fra adenovirus, avipoksvirus, herpesvirus, vaksiniavirus, kanaripoksvirus, entomopoksvirus, svinepoksvirus, vestnilvirus og andre som er kjent innen faget anvendes med preparatene og fremgangsmåtene ifølge foreliggende beskrivelse. Rekombinante polynukleotidvektorer som koder for og uttrykker komponenter kan konstrueres ved anvendelse av standardteknikker for genetisk modifisering som er kjente innen faget. I tillegg kan de forskjellige vaksinepreparatene som beskrives heri anvendes alene og i kombinasjon med hverandre. F.eks. kan primærimmunisering av et dyr anvende rekombinantvektorbaserte konstruksjoner med komponenter fra én eller flere stammer, fulgt av sekundære forsterkende tilførsler av vaksinepreparater som omfatter inaktivert virus eller cellelinjer infisert med inaktivert virus. Andre immuniseringsfremgangsmåter med vaksinepreparatene ifølge beskrivelsen vil være åpenbare for fagpersoner og omfattes av den foreliggende beskrivelse.
Foreliggende beskrivelse gjelder også reassortant virus som omfatter minst ett gen eller genomisk segment fra et influensavirus ifølge foreliggende beskrivelse og de gjenværende virusgener eller genomiske segmenter fra et annet influensavirus ifølge beskrivelsen eller fra et influensavirus som ikke er et virus ifølge foreliggende beskrivelse. Reassortant virus kan fremstilles ved genetisk omsortering av nukleinsyre fra et donor-influensavirus ifølge foreliggende beskrivelse og nukleinsyre fra et mottakerinfluensavirus, og så seleksjon for reassortant virus som omfatter nukleinsyren fra donorviruset. Fremgangsmåter for fremstilling og isolering av reassortant virus er velkjente innen faget (Fields et al., 1996). Et reassortant virus ifølge beskrivelsen kan omfatte gener eller genomiske segmenter fra et humant influensavirus, fugleinfluensavirus, griseinfluensavirus eller hesteinfluensavirus. Et reassortant virus ifølge foreliggende beskrivelse kan omfatte hvilken som helst kombinasjon av nukleinsyre fra donor- og mottaker-influensavirus, så lenge som det reassortante virus omfatter minst ett gen eller genomisk segment fra et donor-influensavirus ifølge foreliggende beskrivelse. Et mottaker-influensavirus kan være et hesteinfluensavirus.
Naturlige, rekombinante eller syntetiske polypeptider fra virusproteiner og peptidfragenter derav kan også anvendes som vaksinepreparater ifølge de her beskrevne fremgangsmåter. Viruspolypeptider avledet fra flere stammer kan kombineres i et vaksinepreparat og anvendes for vaksinasjon av et vertsdyr. F.eks. kan polypeptider basert på det virale HA-protein fra minst to forskjellige stammer av influensavirus ifølge beskrivelsen kombineres i vaksinen. Polypeptidene kan være homologe til én stamme eller omfatte hybride eller kimære polypeptider hvis aminosyresekvens er erholdt ved å sammenbinde eller sammenkoble polypeptider fra minst to forskjellige stammer.
Fremgangsmåter for fremstilling av virale polypeptider er velkjente innen faget. F.eks. kan virale polypeptider og peptider syntetiseres ved anvendelse av syntesefremgangsmåter i fast fase (Merrifield, 1963). Virale polypeptider og peptider kan også fremstilles ved anvendelse av rekombinant DNA-teknikker, hvori et polynukleotidmolekyl som koder for et viralt protein eller peptid uttrykkes i en vertscelle, f.eks. bakterier, gjær eller pattedyrscellelinjer, og det uttrykte protein renses ved anvendelse av standardteknikker innen teknikken.
Vaksinepreparater ifølge foreliggende beskrivelse kan også omfatte preparater med naken nukleinsyre. En nukleinsyre kan omfatte en nukleotidsekvens som koder for et HA- og/eller et NA-protein fra et influensavirus ifølge foreliggende beskrivelse.
Fremgangsmåter for nukleinsyrevaksinasjon er kjente innen faget og beskrives f.eks. i US patentskrifter nr. 6 063 385 og 6472 375. Nukleinsyren kan foreligge i form av et plasmid eller en genekspresjonskassett. Nukleinsyren kan være innkapslet i et liposom, som tilføres til et dyr.
Vaksinepreparater og immunogener, f.eks. polypeptider og nukleinsyrer, som kan anvendes i samsvar med den foreliggende beskrivelse kan foreligge i et farmasøytisk aksepterbart bærestoff eller fortynningsmiddel. Forbindelser og preparater som er anvendbare i den foreliggende beskrivelse kan utformes ifølge kjente fremgangsmåter for fremstilling av farmasøytisk anvendbare preparater. Utforminger beskrives i detalj i en rekke forskjellige kilder som er velkjente og lett tilgjengelige for fagpersonen. F.eks. beskriver Remington’s Pharmaceutical Science av E.W. Martin, Easton Pennsylvania, Mack Publishing Company, 19. utgave, 1995 utforminger som kan anvendes i forbindelse med den foreliggende beskrivelse. Generelt vil preparatene ifølge foreliggende beskrivelse utformes slik at en effektiv mengde av immunogen kombineres med et egnet bærestoff for å oppnå effektiv tilførsel av preparatet. Preparatene som anvendes i de her beskrevne fremgangsmåtene kan også foreligge i en rekke forskjellige former. Disse omfatter f.eks. faste, halvfaste og flytende doseringsformer, f.eks. tabletter, piller, pulvere, flytende løsninger eller suspensjoner, stikkpiller, injiserbare og infunderbare løsninger og sprayer. Den foretrukne form avhenger av den påtenkte tilførselsmåte og den terapeutiske anvendelse. Preparatene kan også fortrinnsvis omfatte konvensjonelle, farmasøytisk aksepterbare bærestoffer og fortynningsmidler som er kjente blant fagfolk. Eksempler på bærestoffer eller fortynningsmidler for anvendelse med de her beskrevne peptidetterlignende forbindelser omfatter, men er ikke begrenset til, vann, saltvann, oljer, innbefattet mineralolje, etanol, dimetylsulfoksid, gelatin, syklodekstraner, magnesiumstearat, dekstrose, cellulose, sukre, kalsiumkarbonat, glyserol, aluminiumoksid, stivelse og ekvivalente bærestoffer og fortynningsmidler, eller blandinger av hvilke som helst av disse. Utforminger av et immunogen ifølge beskrivelsen kan også omfatte suspensjonsmidler, beskyttende midler, smøremidler, buffere, konserveringsmidler og stabilisatorer. For å oppnå tilførsel av slike doser for den ønskede terapeutiske behandling vil farmasøytiske preparater ifølge beskrivelsen med fordel omfatte mellom tilnærmet 0,1 % og 45 %, mer foretrukket mellom 1 og 15 % (vekt/vekt) av immuogenet eller immunogenene, basert på vekten av det totale preparat, innbefattet bærestoff eller fortynningsmiddel.
Vaksinepreparatene og de immunogene preparatene kan fremstilles ved fremgangsmåter som er velkjente innen faget. F.eks. fremstilles vaksinen eller immunogenene typisk som injiserbare midler, f.eks. flytende løsninger eller suspensjoner.
Vaksinen eller immunogenene tilføres på en måte som er forenlig med doseutformingen og i en mengde som vil være terapeutisk effektiv og immunogen i mottakeren. De optimale dosene og tilførselsmønstrene for en gitt vaksineutforming eller immunogen utforming kan lett fastslås av en fagperson innen teknikken.
Peptider og/eller polypeptider kan også foreligge i form av en multippelt antigent peptid (MAP)-konstruksjon. Fremstilling av MAP-konstruksjoner beskrives i Tam (1988). MAP-konstruksjoner benytter en kjerne av lysinrester på hvilke flere kopier av et immunogen syntetiseres (Posnett et al., 1988). Flere MAP-konstruksjoner, hver inneholdende det samme immunogen eller forskjellige immunogener, kan fremstilles og tilføres i et vaksinepreparat. En MAP-konstruksjon kan frembringes med og/eller tilføres med én eller flere adjuvanser. Influensapolypeptider ifølge beskrivelsen kan også fremstilles og tilføres som makromolekylære proteinstrukturer som omfatter ett eller flere polypeptider. Den offentliggjorte US patentsøknad US 2005/0009008 beskriver fremgangsmåter for fremstilling av viruslignende partikler som en vaksine for influensavirus.
Ifølge fremgangsmåtene ifølge foreliggende beskrivelse tilføres vaksinepreparatene og de immunogene preparatene som beskrives heri til mottakelige verter, typisk hundedyr og mer typisk tamhunder, i en effektiv mengde og på en måte som induserer beskyttende immunitet mot påfølgende smitte eller infeksjon av verten med virus. Vertsdyret kan være en canid. Hundedyr omfatter ville hundedyr, hundedyr i zoologiske hager og tamme hundedyr, f.eks. ulver, prærieulver og rever. Hundedyr omfatter også hunder, nærmere bestemt tamhunder, f.eks. ledsagerhunder, oppvisningshunder, arbeidshunder, gjeterhunder, jakthunder, vakthunder, politihunder, veddeløpshunder og/eller laboratoriehunder av ren rase og/eller blandingsrase. Vertsdyret kan være en domestisert hund, f.eks. en mynde. Vaksinene eller immunogenene tilføres typisk parenteralt ved injeksjon, f.eks. enten subkutant, intraperitonealt eller intramuskulært. Andre egnede tilførselsmåter omfatter oral og nasal tilførsel. Vanligvis tilføres vaksinene eller immunogenene til et dyr minst to ganger med et mellomrom på 1 eller flere uker mellom hver tilførsel. Andre skjemaer for innledende tilførsel og forsterkende tilførsel av vaksinen eller immunogenene omfattes imidlertid også og kan avhenge av utøverens vurdering og vertsdyret som skal behandles.
Virus og virusinfiserte celler i en vaksineutforming kan være inaktivert eller svekket ved anvendelse av fremgangsmåter som er kjente innen faget. Hele virus og infiserte celler kan f.eks. inaktiveres eller svekkes ved behandling med paraformaldehyd, formalin, β-propiolakton (BPL), brometylamin (BEA), binært etylenimin (BEI), fenol, UV-lys, forhøyet temperatur, frysing/tining, tilførsel av lydenergi (innbefattet ultralydbehandling) og lignende. Mengden av cellefritt, helt virus i en vaksinedose kan være i området fra tilnærmet 0,1 mg til tilnærmet 5 mg og mer vanligvis fra tilnærmet 0,2 mg til tilnærmet 2 mg. Dosen for vaksineutforminger som omfatter virusinfiserte cellelinjer vil vanligvis inneholde fra tilnærmet 10<6 >til tilnærmet 10<8 >celler pr. dose og mer vanlig fra tilnærmet 5 x 10<6 >til tilnærmet 7,5 x 10<7 >celler pr. dose. Mengden av proteineller peptidimmunogen i en dose for et dyr kan variere fra tilnærmet 0,1 μg til 10000 μg, fra tilnærmet 1 μg til 5000 μg, fra tilnærmet 10 μg til 1000 μg, fra tilnærmet 25 μg til 750 μg, fra tilnærmet 50 μg til 500 μg eller fra 100 μg til 250 μg, avhengig av størrelsen alderen, osv. av dyret som skal motta dosen.
Et immunogent preparat eller vaksinepreparat , f.eks. virus eller virusinfiserte celler eller virale proteiner eller peptider, kan kombineres med en adjuvans, typisk like før tilførselen. Adjuvanser som omfattes for anvendelse i vaksineutformingene omfatter treonylmuramyldipeptid (MDP) (Byars et al., 1987), saponin, Cornebacterium parvum, Freunds komplette og Freunds ukomplette adjuvans, aluminium eller en blanding av hvilke som helst av disse. En rekke andre adjuvanser som er egnet for anvendelse med fremgangsmåtene og vaksinene , f.eks. alun, er velkjente innen faget og omfattes for anvendelse med den foreliggende beskrivelse.
Foreliggende beskrivelse gjelder også antistoffer som spesifikt bindes til et protein eller peptid ifølge foreliggende beskrivelse. Antistoffer kan omfatte monoklonale og polyklonale antistoffpreparater. Antistoffene kan være monoklonale antistoffer. Hele antistoffer og antigenbindende fragmenter derav omfattes av foreliggende beskrivelse. Således omfatter f.eks. egnede antigenbindende fragmenter Fab2-, Fab- og Fvantistoffragmenter. Antistoffer kan merkes med en påvisbar gruppe, f.eks. et fluorescerende molekyl (f.eks. fluorescein eller et enzym).
Foreliggende beskrivelse gjelder også fremgangsmåter og preparater for påvisning og identifisering av et influensavirus ifølge beskrivelsen og for diagnose av infeksjon av et dyr med et influensavirus ifølge foreliggende beskrivelse.
Fremgangsmåtene ifølge beskrivelsen omfatter påvisning av nærvær av hundeinfluensa i en biologisk prøve fra et dyr. Påvisning av hundeinfluensa i en prøve er nyttig for diagnose av hundeinfluensa i et dyr. Denne informasjonen kan i sin tur gjøre det mulig å bestemme prognosen for et dyr, basert på å skille mellom nivået av hundeinfluensa som foreligger over tid, og kan bidra til valg av terapeutiske midler og behandlingsformer for dyret og bidra til å følge virkningen av behandlingen. Fremgangsmåen tilveiebringer også evnen til å etablere fravær av hundeinfluensa i et analysert dyr.
Evnen til å påvise hundeinfluensa i et dyr gjør det mulig å vurdere utbrudd av hundeinfluensa i forskjellige geografiske lokaliteter. Denne informasjonen muliggjør også tidlig påvisning, slik at infiserte dyr kan isoleres og spredningen av sykdommen begrenses, og tillater tidlig intervensjon for behandling. I tillegg kan det å ha denne informasjonen tilgjengelig gi retningslinjer for medisinsk personell som forberedelse for behandling av et stort antall syke dyr, innbefattet innsamling av medisinsk materiell og vaksiner, dersom slike er tilgjengelige.
En fremgangsmåte ifølge foreliggende beskrivelse omfatter innsamling av en biologisk prøve fra et forsøksdyr, f.eks. et hundedyr. Den biologiske prøven kan være hvilket som helst biologisk materiale, innbefattet celler, vev, hår, helblod, serum, plasma, brystvorteaspirat, lungelavage, cerebrospinalvæske, spytt, svette og tårer.
Analyseprøven fra dyret kan komme fra det dyr som mistenkes for å ha hundeinfluensavirus, uavhengig av hvorvidt dyret viser symptomer på sykdommen.
Kontrollprøver kan også tilveiebringes eller innsamles fra dyr som vites å være frie for hundeinfluensa. Ytterligere kontroller kan tilveiebringes, f.eks. for å redusere falske positive og falske negative resultater og bekrefte at reagensene i analysen aktivt påviser hundeinfluensa A-virus.
I tillegg til å påvise nærvær eller fravær av hundeinfluensa i en biologisk prøve kan påvisningsfremgangsmåtene som anvendes ifølge beskrivelsen påvise mutasjoner i hundeinfluensavirus, f.eks. endringer i nukleinsyresekvens, som kan være en følge av miljøet, medikamentbehandling, genetisk manipulering eller genetiske mutasjoner, skade, endret kost, aldring eller hvilke som helst andre egenskaper forbundet med et dyr.
Mutasjoner kan også gjøre at hundeinfluensa A blir resistent overfor et medikament som tidligere var effektivt og gjøre det mulig for viruset å infisere og oppformeres i en annen dyreart eller i et menneske. F.eks. har fugleinfluensa A-virus blitt vist å infisere andre dyr og mennesker.
For påvisning av et influensavirus i et dyr, kan diagnostisering forenkles ved innsamling av prøver av høy kvalitet, hurtig transport av disse til en analyseenhet og egnet lagring før laboratorieanalysen. Virus påvises best i prøver som inneholder infiserte celler og sekreter. Prøver for direkte påvisning av virale antigener og/eller for isolering av nukleinsyrer og/eller virus i cellekulturer kan tas i løpet av de første tre dagene etter at de kliniske symptomene viser seg. En rekke forskjellige type av prøver er egnet for diagnose av virusinfeksjoner i de øvre luftveier, innbefattet, men ikke begrenset til, nesesekretprøve tatt med vattpensel, nese-svelg-sekretprøve tatt med vattpensel, nese-svelg-aspirat, nesevask og halssekretprøver tatt med vattpensel. I tillegg til vattpenselprøver kan det tas prøver av vev eller serum, og invasive fremgangsmåter kan også utføres.
Luftveisprøver oppsamles og transporteres i 1-5 ml virustransportmedium. En rekke forskjellige medier som er tilfredsstillende for gjenvinning av et bredt utvalg av virus er kommersielt tilgjengelige. Kliniske prøver tilsettes til transportmedium. Neseeller nese-svelg-sekretprøver tatt med vattpensel kan også transporteres i virustransportmediet. Et eksempel på et transportmedium er 10 g kalveinfusjonsbrygg og 2 g bovint albumin fraksjon V tilsatt til sterilt destillert vann til 400 m. Antibiotika som 0,8 ml gentamicinsulfatløsning (50 mg/ml) og 3,2 ml amfotericin B (250 μg/ml) kan også tilsettes. Mediet steriliseres fortrinnsvis ved filtrering. Nesevask, f.eks. sterilt saltvann (0,85 % NaCl), kan også anvendes for oppsamling av prøver av luftveisvirus.
Serum kan oppsamles i en mengde på 1-5 ml fra helblod fra et dyr i akutt fase, kort tid etter utløsning av kliniske symptomer og fortrinnsvis ikke senere enn 7 dager. En serumprøve fra konvalesent fase kan også oppsamles, f.eks. tilnærmet 14 dager etter påbegynte symptomer. Serumprøver kan være anvendbare for påvisning av antistoffer mot luftveisvirus i en nøytraliseringsanalyse.
I noen tilfeller kan prøver oppsamles fra enkeltdyr over et tidsrom (f.eks. én gang om dagen, én gang i uken, én gang i måneden, to ganger i året eller hvert år). Erholdelse av en rekke prøver fra et enkeltdyr over et tidsrom kan anvendes for å bekrefte resultater fra tidligere påvisninger og/eller for påvisning av respons på eller resistens mot en spesifikk behandling, f.eks. et valgt terapeutisk medikament.
Fremgangsmåtene ifølge foreliggende beskrivelse kan anvendes for å påvise nærvær av ett eller flere patologiske midler i en analyseprøve fra et dyr og nivået av hvert av de patologiske midlene. Hvilken som helst fremgangsmåte for påvisning av det patologiske middel kan anvendes, innbefattet, men ikke begrenset til, antistofanalyser, innbefattet enzymkoblet immunabsorpsjonsanalyse (ELISA), indirekte fluorescerende antistoff (IFA)-analyser, hemagglutinasjon og inhibering av hemagglutinasjons (HI)-analyser og Western-blotting. Kjente celledyrkningsfremgangsmåter kan også anvendes. Positive kulturer kan videre identifiseres ved anvendelse av immunfluorescens av cellekulturer eller HI-analyse av celledyrkningsmedium (supernatant).
I tillegg kan det anvendes fremgangsmåter for påvisning av nukleinsyre (DNA eller RNA) eller protein. Slike fremgangsmåter omfatter, men er ikke begrenset til, polymerasekjedereaksjonen (PCR) og revers transkriptase (RT)-PCR-analyser og sanntidsanalyser, samt kvantitative nukleasebeskyttelsesanalyser. Kommersielt tilgjengelige analysesett er tilgjengelige for utførelse av disse analysene. F.eks. selger QIAGEN (Valencia, CA) et entrinns RT-PCR-sett og et virus-RNA-ekstraksjonssett.
Fremgangsmåten kan benytte et antistoff som er spesifikt for et virus eller virusprotein ifølge beskrivelsen. Et antistoff som er spesifikt for et HA-protein fra et virus ifølge beskrivelsen kan benyttes. Et antistoff som er spesifikt for et NP-protein fra et virus ifølge beskrivelsen kan benyttes. En egnet prøve, f.eks. fra neseområdet eller nese-svelgområdet erholdes fra et dyr, og virus eller virusprotein isoleres fra denne.
Virusbestanddelene analyseres så for binding av et antistoff som er spesifikt for et protein, f.eks. HA eller NP, fra et virus ifølge beskrivelsen. En serumprøve (eller en annen antistoffholdig prøve) fra et dyr kan fremskaffes, og serumet analyseres for nærvær av antistoff som bindes til et protein fra et virus ifølge beskrivelsen. Det kan f.eks. utføres en ELISA-analyse hvor plateveggene har HA- og/eller NP-protein eller et peptidfragment derav bundet til veggen. Plateveggen settes så i forbindelse med serum eller antistoff fra et forsøksdyr. Nærvær av antistoff i dyret som bindes spesifikt til HA- og/eller NP-proteinet viser at forsøksdyret er infisert eller har vært infisert med et influensavirus ifølge foreliggende beskrivelse.
Nærvær av et patologisk middel kan påvises ved å bestemme nærvær eller fravær av antistoffer mot midlet i en biologisk prøve. Det kan ta noe tid (f.eks. måneder) etter infeksjon av et dyr før antistoffer kan påvises i en blodanalyse. Når antistoffene først er dannet vedvarer de vanligvis i flere år, selv etter vellykket behandling av sykdommen. Påvisning av antistoffer mot hundeinfluensa A vil ikke nødvendigvis fortelle hvorvidt infeksjonen var nylig eller én gang i fortiden.
Antistoffanalyse kan også utføres på væsker. Antistoffanalyser omfatter enzymkoblede immunabsorpsjonsanalyser (ELISA), indirekte fluorescerende antistoff (IFA)-analyser og Western-blotting. Fortrinnsvis utføres antistoffanalyse ved anvendelse av flere analyser, f.eks. ELISA eller IFA fulgt av Western-blotting. Antistoffanalyser kan gjøres i en totrinns prosess ved anvendelse av enten en ELISA- eller IFA-analyse, fulgt av en Western-blot analyse. ELISA anses som en mer pålitelig og nøyaktig analyse enn IFA, men IFA kan anvendes dersom ELISA ikke er tilgjengelig. Western-blot analysen (som er en mer spesifikk analyse) kan også utføres i alle dyr, særlig dyr som ar blitt analysert som positive eller på grensen til positive (tvetydige) i en ELISA- eller IFA-analyse.
Andre antistoffbaserte analyser som kan anvendes for påvisning av influensavirus omfatter hemagglutinasjonsinhiberingsanalyser. Hemagglutinasjonsaktivitet kan påvises i en biologisk prøve fra et dyr med anvendelse av røde blodceller fra høns eller kalkun som beskrevet (Burleson et al., 1992) og Kendal et al., 1982). Et influensavirus eller et HA-protein eller –peptid ifølge beskrivelsen kan bringes i kontakt med en analyseprøve som inneholder serum eller antistoff. Røde blodceller (RBC) fra et dyr, f.eks. en fugl, tilsettes så. Dersom antistoff mot HA foreligger vil RBC ikke agglutinere. Dersom antistoff mot HA ikke foreligger vil RBC agglutinere i nærvær av HA. Varianter og modifikasjoner av standard hemagglutinasjonsinhiberingsanalyser er kjente innen faget og omfattes av den foreliggende beskrivelse.
Infeksjon av et dyr kan også bestemmes ved å isolere viruset fra en prøve, f.eks. en nese- eller nese-svelg-sekretprøve tatt med vattpensel. Isolering av virus kan utføres ved anvendelse av standardfremgangsmåter, innbefattet cellekultur og inokulering av egg.
En nukleinsyrebasert analyse kan anvendes for påvisning av et virus ifølge foreliggende beskrivelse. En nukleinsyreprøve fra et dyr frembringes, og nukleinsyren behandles ved PCR ved anvendelse av primere som vil gi et amplifiseringsprodukt dersom nukleinsyren inneholder en sekvens som er spesifikk for et influensavirus ifølge foreliggende beskrivelse. RT-PCR kan anvendes i en analyse for det angjeldende virus. Sanntids RT-PCR kan anvendes for analyse for et influensavirus ifølge beskrivelsen.
PCR-, RT-PCR- og sanntids-PCR-fremgangsmåter er kjente innen faget og beskrives i US patentskrifter nr. 4 683 202, 4 683 195, 4 800 159, 4 965 188, 5 994 056 og 6814 934 og i Saiki et al. (1985), Sambrook et al. (1989), Lee et al. (1993), og Livak et al. (1995). PCR-analysen kan anvende oligonukleotider som er spesifikke for et infliensamatriks (MA)-gen og/eller HA-gen. Amplifiseringsproduktet kan også sekvenseres for å fastslå hvorvidt produktet har en sekvens fra et influensavirus ifølge foreliggende beskrivelse. Andre nukleinsyrebaserte analyser kan anvendes for påvisning og diagnose av virusinfeksjon med et virus ifølge beskrivelsen, og slike analyser omfattes av den foreliggende beskrivelse. En prøve som inneholder en nukleinsyre kan behandles ved PCR-basert amplifisering ved anvendelse av en ”forward” og en ”revers” primer, hvor primerne er spesifikke for et viralt polynukleotid eller en viral gensekvens. Dersom nukleinsyren i prøven er RNA kan RT-PCR utføres. For sanntids PCR benyttes en påvisbar probe sammen med primerne.
Primersett som er spesifikke for hemagglutinin (HA)-genet i mange av de sirkulerende influensavirus er kjente og utvikles kontinuerlig. Influensavirusgenomet er enkelttrådet RNA, og en DNA-kopi (cDNA) må dannes ved anvendelse av en revers transkrptase (RT)-polymerase. Amplifisering av RNA-genomet, f.eks. ved anvendelse av RT-PCR, krever et par av oligonukleotidprimere som typisk er utformet basert på den kjente HA-sekvens fra influensa A-undertyper og på nevraminidase (NM)-1. Primerne kan utvikles slik at de spesifikt vil amplifisere RNA fra kun én undertype av virus. DNA fremstilt ved anvendelse av undertypespesifikke primere kan analyseres videre ved molekylærgenetiske teknikker, f.eks. sekvensering. Analysen utføres fortrinnsvis med en positiv kontroll, eller produktene bekreftes ved sekvensering og sammenligning med kjente sekvenser. Fravær av mål-PCR-produktene (dvs. et ”negativt” resultat) utelukker ikke nødvendigvis nærvær av viruset. Resultater kan da gjøres tilgjengelige i løpet av noen få timer, enten fra kliniske vattpenselprøver eller fra infiserte cellekulturer. PCR- og RT-PCR-analyser for influensa A-virus beskrives av Fouchier et al., 2000 og Maertzdorf et al., 2004.
Foreliggende beskrivelse gjelder også fremgangsmåter for søk etter forbindelser eller medikamenter med antiviral aktivitet mot et virus ifølge foreliggende beskrivelse. Celler som er infisert med et virus ifølge beskrivelsen kan bringes i kontakt med en analyseforbindelse eller et medikament. Virusmengden eller den virale aktivitet etter kontakten bestemmes så. De forbindelser eller medikamenter som viser antiviral aktivitet kan så utvelges for videre evaluering.
Foreliggende beskrivelse gjelder også isolerte celler infisert med et influensavirus ifølge foreliggende beskrivelse. Cellen kan være en hundecelle, f.eks. en hundenyreepitelcelle.
Foreliggende beskrivelse gjelder også celler som er transformert med et polynukleotid ifølge foreliggende beskrivelse som koder for et polypeptid ifølge beskrivelsen. Polynukleotidsekvensen foreligger fortrinnsvis i en ekspresjonskonstruksjon ifølge beskrivelsen. Mer foretrukket gir ekspresjonskonstruksjonen overekspresjon i cellen av et operativt tilkoblet polynukleotid ifølge beskrivelsen. Cellen kan være transformert med en polynukleotidsekvens som omfatter en sekvens som koder for aminosyresekvensen som vises i hvilken som helst av SEKV. ID nr. 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28,30, 32, 33, 34, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76 eller 78 eller et funksjonelt fragment eller en variant derav. Cellen kan være transformert med et polynukleotid som koder for aminosyresekvensen som vises i SEKV. ID nr. 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28,30, 32, 33, 34, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76 eller 78 og som omfatter nukleotidsekvensen som vises i SEKV. ID nr. 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 35, 27, 29, 31, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75 henholdsvis 77, eller en sekvens som koder for et funksjonelt fragment eller en variant av hvilken som helst av SEKV. ID nr. 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28,30, 32, 33, 34, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76 eller 78. Foreliggende beskrivelse gjelder følgelig celler som er transformert med en polynukleotidsekvens som omfatter nukleotidsekvensens om vises i hvilken som helst av SEKV. ID nr. 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 35, 27, 29, 31, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75 eller 77, eller et fragment eller en variant, innbefattet en degenerert variant, av hvilken som helst av SEKV. ID nr.1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 35, 27, 29, 31, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75 eller 77.
Den transformerte cellen kan være en eukaryot celle, f.eks. en plantecelle, innbefattet protoplaster, eller den transformerte cellen kan være en prokaryot celle, f.eks. en bakteriecelle som E. coli eller B. subtilis. Dyreceller omfatter menneskeceller, pattedyrsceller, fortrinnsvis hundeceller, fugleceller og insektceller. Planteceller omfatter, men er ikke begrenset til, tofrøbladede planteceller, enfrøbladede planteceller og nåletreceller.
Foreliggende beskrivelse gjelder også planter, innbefattet transgene planter, som uttrykker og danner et viralt protein eller polypeptid ifølge foreliggende beskrivelse.
Planter, plantevev og planteceller som er transformert med eller avlet til å inneholde et polynukleotid ifølge beskrivelsen omfattes av den foreliggende beskrivelse.
Polynukleotidet ifølge beskrivelsen overuttrykkes fortrinnsvis i planten, plantevevet eller plantecellen. Planter kan anvendes for fremstilling av influensavaksinepreparater ifølge foreliggende beskrivelse, og vaksinene kan tilføres ved inntak av plante (se f.eks. US patentskrifter nr. 5 484 719 og 6136 320).
Foreliggende beskrivelse gjelder også et sett for påvisning av et virus eller diagnose av en infeksjon med et virus ifølge foreliggende beskrivelse. Et sett kan omfatte et antistoff ifølge beskrivelsen som spesifikt bindes til et influensavirus ifølge foreliggende beskrivelse eller en antigen del derav. Et sett kan omfatte ett eller flere polypeptider eller peptider ifølge foreliggende beskrivelse. Polypeptidene kan ha en aminosyresekvens som vist i hvilken som helst av SEKV. ID nr. 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28,30, 32, 33, 34, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76 eller 78, eller funksjonelt og/eller immunogent fragment eller en variant derav. Et sett kan omfatte ett eller flere polynukleotider eller oligonukleotider ifølge foreliggende beskrivelse. Polynukleotidene kan ha en nukleotidsekvens som vist i hvilken som helst av SEKV. ID nr. 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 35, 27, 29, 31, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75 eller 77, eller et fragment eller en variant derav. Et sett kan om ønskelig omfatte ett eller flere kontrollantistoffer, kontrollpolypeptider eller kontrollpeptider, og/eller kontrollpolynukleotider eller –oligonukleotider. Antistoffet, polypeptidene, peptidene, polynukleotidene og/eller oligonukleotidene i settet kan foreligge i en egnet beholder eller pakke.
Foreliggende patentsøknad gjelder også anvendelse av hunder av blandingsrase som en modell for infeksjon og patogenese av influensavirus. En hund av blandingsrase kan inokuleres med et influensavirus, f.eks. et hundeinfluensavirus ifølge foreliggende beskrivelse. Om ønskelig kan hunden tilføres terapeutiske midler etter inokulasjonen. Hunden kan også ha blitt tilført et preparat for frembringelse av en immunrespons mot et influensavirus før inokulering med viruset. Vev, blod, serum og andre biologiske prøver kan erholdes før og/eller etter inokulasjonen og undersøkes for nærvær av virus og patogenese av vev ved anvendelse av fremgangsmåter som er kjent innen faget, innbefattet, men ikke begrenset til, PCR, RT-PCR, nukleinsyresekvensering og immunhistokjemisk analyse.
Materialer og fremgangsmåter for eksemplene 1-6 (Referanseeksempler)
Innsamling av blod og nesesekretprøver tatt med vattpensel fra mynder
Akutte og konvalescente blodprøver ble oppsamlet ved halsvenepunksjon fra klinisk syke eller normale mynder i veddeløpskenneler som hadde utbrudd av luftveissykdom. Konvalescente prøver ble oppsamlet 4-12 uker etter den akutte prøven. Serum ble høstet og lagret ved -80<o>C. Vattpenselprøver av nesesekret ble oppsamlet og plassert i Amies transportmedium med trekull (Beckton Dickinson Biosciences) i påvente av innlevering for bakterieisolasjon.
Postmortenundersøkelse av mynder
Fullstendige obduksjonsundersøkelser ble utført av Anatomic Pathology Service ved University of Florida College of Veterinary Medicine (UF CVM) på 5 av de 8 myndene som døde i utbruddet i januar 2004 i en veddeløpsbane i Florida. Obduksjon av en annen hund ble utført ved en privat veterinærklinikk med levering av vev til UF CVM for histopatologisk diagnose. Vevene ble fiksert i 10 % nøytralbufret formalin og innstøpt i parafin, og 5 μm snitt ble enten farget med hematoksilin og eosin for histopatologisk diagnose eller prosessert for immunhistokjemisk analyse som beskrevet nedenfor. Ikkefikserte vev ble innlevert for bakteriedyrkning, og også lagret ved -80<o>C.
Serologiske analyser for patogene hundeluftveisvirus
Par av prøver av akutt og konvalescent serum ble levert til Animal Health Diagnostic Laboratory (AHDL) ved Cornell University College of Veterinary Medicine for serumnøytraliseringsanalyser mot valpesykevirus, adenovirus type 2 og parainfluensavirus. Antistofftiteret ble uttrykt som den siste fortynning av serum som viste viral infeksjon av cellekulturer. Serokonversjon, definert som > 4 gangers økning av antistofftiteret mellom den aktutte prøven og den konvalescente prøven, indikerte virusinfeksjon. Ingen serokonversjon ble påvist for disse patogene virusene.
Mikrobielle analyser for patogene luftveisbakterier i hund
Par av nesesekretprøver og obduksjonsvev ble levert til Diagnostic Clinical Microbiology/Parasitology/Serology Service ved UF CVM for isolering og identifisering av bakterier. Prøvene ble dyrket på ikke-selektivt medium, så vel som medium selektivt for Bordetella-arter (Regan-Lowe, Remel) og Mycoplasma-arter (Remel). Alle kulturer ble fortsatt i 21 dager før ingen vekst ble rapportert. Neseprøver fra én av myndene ble også levert til Department of Diagnostic Medicine/Pathobiology ved Kansas State University College of Veterinary Medicine for bakteriedyrking. Av 70 analyserte klinisk syke hunder ble Bordetelle bronchiseptica isolert fra nesehulen til én hund, mens Mycoplasma spp. ble gjenvunnet fra nesehulen til 33 hunder. Pasteurella muultocida ble hyppig gjenvunnet fra nesehulen til hunder med purulent neseutflod. To av de hundene som døde i utbruddet i januar 2004 hadde en sparsom fremvekst av Escherichia coli i lungene postmortem, én hund hadde sparsom fremvekst av E. coli og Streptococcus canis, og en annen hadde svak fremvekst av Pseudomonas aeruginosa og en gjær. Verken Bordetella bronchiseptica eller Mycoplasma ble isolert fra luftveier eller lunger fra hundene som døde.
Isolasjon av virus fra postmortemvev
Nedfrosne vev ble opptint og homogenisert i 10 volumer minimalt essensielt medium (MEM) tilsatt 0,5 % bovint serumalbumin (BSA) og antibiotika. Faste rester ble fjernet ved sentrifugering, og supernatantene ble inokulert på dyrkede celler eller i 10 dager gamle hønseegg med embryoer. Vevshomogenater fra mynder som døde ble inokulert i flere cellekulturer som understøttet replikasjon av et bredt utvalg av patogene virus. Cellekulturene omfattet Vero (dyreepitelceller fra afrikansk grønnape, ATCC nr. CCL-81), A-72 (hundetumorfibroblaster, CRL-1542), HRT-18 (humane rektale epitelceller, CRL-11663), MDCK (hundenyreepitelceller, CCL-34), primære hundenyreepitelceller (AHDL, Cornell University), primære hundelungeepitelceller (AHDL) og primære oksetestikkelceller (AHDL). MDCK- og HRT-cellene ble dyrket i MEM tilsatt 2,5 μg/ml TPCK-behandlet trypsin (Sigma), mens de gjenværende cellelinjene ble dyrket i MEM tilsatt 10 % føtalt kalveserum og antibiotika. Celle ble dyrket i 25 cm<2 >flasker ved 37<o>C i en fuktiggjort atmosfære inneholdende 5 % CO2. En kontrollkultur ble inokulert med det tilsatte MEM. Kulturene ble observert daglig for morfologiske endringer og høstet fem dager etter inokulasjonen. De høstede væskene og cellene ble klarnet ved sentrifugering og inokulert på nye celler som beskrevet for den innledende inokuleringen, to blinde passasjer ble utført. Hemagglutinasjonsaktiviteten i de klarnede supernatantene ble bestemt ved anvendelse av røde blodceller fra høns eller kalkun som beskrevet (Burleson et al., 1992, Kendal et al., 1982). For isolering av virus i hønseembryoer ble 0,1 ml vevshomogenat inokulert i allantoinsekken og inkubert i 48 timer ved 35<o>C. Etter to blinde passasjer ble hemagglutinasjonsaktiviteten i allantoinvæskene bestemt som beskrevet (Burleson et al., 1992, Kendal et al., 1982).
RT-PCR, nukleotidsekvensering og fylogenetisk analyse
Total-RNA ble ekstrahert fra vevsdyrkningssupernatant eller allantoinvøske ved anvendelse av settet RNeasy (Qiagen, Valencia, CA) ifølge produsentens instruksjoner. Total-RNA (10 ng) ble reverstranskribert til cDNA ved anvendelse av et ettrinns RT-PCR-sett (Qiagen, Valencia, CA) ifølge produsentens instruksjoner. PCR-amplifisering av det kodende området i de åtte influensavirusgenene i cDNA ble utført som beskrevet tidligere (Klimov et al., 1992a) ved anvendelse av universelle, genspesifikke primersett. De resulterende DNA-amplikonene ble anvendt som templater for automatisert sekvensering i et Applied Biosystems 3100 automatisert DNA-sekvenseringsinstrument ved anvendelse av syklussekvensering og farget terminatorkjemi (ABI).
Nukleotidsekvensene ble analysert ved anvendelse av GCG Package <© >versjon 10.0 (Accelyrs) (Womble, 2000). Phylogeny Inference Package <©>, versjon 3.5 ble anvendt for estimering av fylogenier og beregning av ”bootstrap”-verdier fra nukleotidsekvensene (Felsenstein, 1989). Fylogenetiske trær ble sammenlignet med trær fremstilt ved ”neighbor-joining”-analyse med Tamura-Nei-gamma-modellen som er implementert i programmet MEGA <© >(Kumar et al., 2004) og bekreftet med programmet PAUP <© >4.0 Beta (Sinauer Assoicates).
Eksperimentell inokulering av hunder
Fire 6 måneder gamle, spesifikt patogenfrie beagler [(2 hanner og 2 hunner (Liberty Research)] ble anvendt. Den fysiske undersøkelse og de innledende blodanalysene, innbefattet fullstendig blodcelletall/differensielt celletall, kjemisk analyse av serum og urinanalyse, viste at dyrene var friske. Dyrene ble oppstallet sammen i en BSL 2-forsterket fasilitet godkjent av Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care. Den basale ektumtemperatur ble målt to ganger daglig i 7 dager. Dyrene ble bedøvet ved intravenøs injeksjon av propofol (Diprivan <®>, Zeneca Pharmaceuticals, 0,4 mg/kg kroppsvekt for virkning) for intubering med endotrakeale slanger. Hver hund ble inokulert med en totaldose på 10<6,6 >mediane vevskulturinfeksiøse doser (TCID50) av A/Canine/Florida/43/2004 (Canine/FL/04) (H3N8)-virus, hvor halvparten av dosen ble tilført til de distale luftrør gjennom den endotrakeale slangen, mens den andre halvparten ble tilført til den dype nesepassasjen ved hjelp av et kateter. Fysisk undersøkelse og måling av rektumtemperatur ble utført to ganger daglig i 14 dager etter inokulasjonen (p.i.). Blodprøver (4 ml) ble oppsamlet ved halsvenepunksjon på dag 0, 3, 5, 7, 10 og 14 p.i. Prøver fra nese og nese-svelg ble oppsamlet med vattpensler av polyester (Fischer Scientific) fra hver hund på dag 0-5, 7, 10 og 14 p.i. Vattpenslene ble plassert i virustransportmedium (Remel) og lagret ved -80<o>C. To hunder (1 hann og 1 hunn) ble avlivet ved intravenøs inokulasjon av Beuthanasia-D <®>-løsning (1 ml/5 kg kroppsvekt, Schering-Plough Animal Health Corp) på dag 5 p.i. og de gjenværende 2 hundene på dag 14 for obduksjon. Vev for histologisk analyse ble prosessert som beskrevet. Vev for virusdyrking ble lagret ved -80<o>C. Denne undersøkelsen var godkjent av University of Florida Institutional Animal Care and Use Committee.
Virusutskillelse fra eksperimentelt inokulerte hunder
Seriefortynninger av lungehomogenat og vattpenselekstrakter fremstilt ved klarning av penseltransportmediet ved sentrifugering ble oppsatt i MEM tilsatt 0,5 % BSA og antibiotika. Plakkanalyse ble utført som beskrevet (Burleson et al., 1992) ved anvendelse av encellelag av MDCK-celler i 6-brønners vevsdyrkningsplater. Inokulerte encellelag ble overlagt med MEM med tilsetninger inneholdende 0,8 % agarose og 1,5 μg/ml TPCK-trypsin. Cellene ble dyrket i 72 timer ved 37<o>C i en fuktiggjort atmosfære inneholdende 5 % CO2 før fiksering og farging med krystallfiolett. Viruskonsentrasjonen ble uttrykt som plakkdannende enheter (PFU) pr. gram vev eller pr. vattpensel.
Immunhistokjemisk analyse
Avparafiniserte og rehydrerte 5 μm lungevevssnitt fra myndene og beaglene ble montert på Bond-Rite<TM >objektglass (Richard-Allan Scientific, Kalamazoo, MI) og så behandlet med proteinase K (DakoCytomation, Carpenteria, CA) fulgt av peroksidaseblokkerende reagens (Dako <® >®n Vision<TM >Peroksidasesett, Dako Corp.). Snittene ble inkubert med 1:500 fortynninger av monoklonale antistoffer mot valpesykevirus (VMRD, Inc.), hundeadenovirus type 2 (VMRD, Inc.), hundeparainfluensavirus (VMRD, Inc.), eller influensa A H3 (Chemicon International, Inc.) i 2 timer ved romtemperatur. Kontrollene omfattet inkubering av de samme snittene med muse-IgG (1 mg/ml, Serotec, Inc.), og inkubering av de monoklonale antistoffene med normale hundelungesnitt. Etter behandling med primærantistoffene ble snittene inkubert med sekundær immunperoksidase og peroksidasesubstratreagenser (Dako <® >EnVision<TM >peroksidasesett, Dako Corp.) ifølge produsentens instruksjoner. Snittene ble motfarget med hematoksylin, behandlet med Cliarifier #2 og Bluing Reagent (RichardAllan Scientific, Kalamazoo, MI), dehydrert, og dekkglass ble påført med Permount (ProSciTech).
Hemagglutinasjonsinhiberingsanalyse (HI)-analyse
Serumprøver ble inkubert med reseptorødeleggende enzym (RDE, Denka) (1 del serum: 3 deler RDE) i 16 timer ved 37<o>C før varmeinaktivering i 60 min. ved 56<o>C.
Influensa A/Canine/FL/04 (H3N8)-virus ble dyrket i MDCK-celler i 36-48 timer ved 37<o>C. Virusdyrkningssupernatanter ble høstet, klarnet ved sentrifugering og lagret ved -80<o>C. HI-analysen ble utført som beskrevet tidligere (Kendal et al., 1982). Kort beskrevet ble 4 hemagglutinasjonsenheter av virus i 25 μl tilsatt til et likt volum seriefortynnet serum i mikrotiterbrønner og inkubert ved romtemperatur i 30 min. Et likt volum av 0,5 % (vol/vol) kalkunerytrocytter ble tilsatt, og hemagglutinasjonstiteret ble estimert visuelt etter 30 min. Sluttpunkts-HI-titeret ble definert som den siste fortynning av serum som fullstendig inhiberte hemagglutinasjon. Serokonversjon ble definert som > 4 gangers økning av HI-titeret mellom parede akutte og konvalescente prøver. En enkelt prøves seropositivitet ble definert som et HI-antistofftiter > 1:32.
Mikronøytraliseringsanalyse (MN)-analyse
Antistoffresponser i nøytraliserende serum mot A/Canine/Fl/04 (H3N8) ble påvist ved en MN-analyse som beskrevet tidligere (Rowe et al., 1999), bortsett fra at hundeserumprøvene ble RDE-behandlet som beskrevet ovenfor før analysen.
Sluttpunktstiteret ble definert som den høyeste serumfortynning som ga 50 % nøytralisering av 100 TCID50 av virus. Serokonversjon ble definert som > 4 gangers økning av MN-titeret mellom parede akutte og konvalescente prøver. En enkelt prøves seropositivitet ble definert som et MN-titer > 1:80.
I det påfølgende gis eksempler og referanseeksempler som illustrerer fremgangsmåter ifølge oppfinnelsen og beskrivelsen. Disse eksemplene skal ikke oppfattes som begrensende. Alle prosentandeler er vekt/vekt og alle andeler i løsemiddelblandinger vol/vol med mindre annet er angitt.
EKSEMPEL 1 (REFERANSE)
I januar 2004 skjedde et utbrudd av luftveissykdom i 22 veddeløpsmynder oppstallet i to kenneler ved en veddeløpsbane i Florida og i den lokale gården som leverte hunder til disse kennelene. Det var tilnærmet 60 hunder i hver kennelbygning og 300 hunder i gården. Utbruddet skjedde over et tidsrom på 6 dager, hvoretter ingen nye tilfeller ble påvist. 14 av de 22 hundene hadde feber med fra 39,4-41,5<o>C, en myk, kvelende hoste i 10-14 dager og så tilfriskning. Av de gjenværende åtte hundene døde seks tilsynelatende friske hunder uventet med blødning fra munn og nese. To andre hunder ble avlivet i løpet av 24 timer etter påbegynt blødning fra munn og nese, grunnet hurtig svekkelse. Begge disse hundene hadde feber på 41<o>C. Fire av de åtte dødsfallene skjedde i kennelbygningene og fire på gården. 50 % av dødsfallene skjedde på utbruddets dag 3. De 22 hundene varierte i alder fra 17 måneder til 4 år, men 73 % var 17-33 måneder gamle.
To kliniske syndromer var åpenbare: en mildere sykdom særpreget ved innledende feber, og så hoste i 10-14 dager (14 hunder) med påfølgende tilfriskning, eller en perakutt død forbundet med blødning i luftveiene (8 hunder for en dødelighetsfrekvens på 36 %). Obduksjoner ble utført på seks av de åtte dødelige tilfellene. Alle hundene hadde omfattende blødning i lungene, mediastinum og brusthule. Histologisk undersøkelse av luftveiene viste at alle hundene i tillegg til lungeblødning hadde trakeitt, bronkitt, bronkiolitt og supurativ bronkopneumoni (fig. 3). Epitelbelegget og luftveisrommene i disse vevene var infiltrert av nøytrofile celler og makrofager.
Lungehomogenater fremstilt fra disse hundene ble inokulert i en rekke forskjellige cellelinjer fra ape, menneske, storfe og hund for virusdyrkning. Lungehomogenat fra 1 hund førte til cytopatiske virkninger på Madin-Darby hundenyreepitelceller (MDCK) dyrket i nærvær av trypsin, og celledyrkningssupernatanten agglutinerte røde blodceller fra høns. Foreløpig bevis for et influensavirus type A ble tilveiebrakt ved en kommersiell ELISA for påvisning av nukleoproteinet fra influensa A- og B-virus og ved PCR-analyse ved anvendelse av primere som var spesifikke for matriksgenet fra influensa A-virus. I tillegg ble hemagglutinasjonsaktiviteten inhibert av referanseantiserum mot hesteinfluensa A undertype H3, men ikke av antiserum spesifikt for humant influensa A undertype H1-H11 og H13 (tabell 3). For karakterisering av virusets molekylære egenskaper bestemte vi nukleotidsekvensen til de åtte RNA-segmentene i virusgenomet.
Sammenligning med sekvensen til kjente influensavirusgener og fyogenetisk analyse viste at de åtte genene i hundeisolatet lignet mest på genene fra samtidige hesteinfluensa A (H3N8)-virus som de hadde > 96-97 % sekvensidentitet med (fig. 1A, tabell 4). I motsetning til dette hadde representative gener fra fugleinfluensa-, griseinfluensa- og human influensa A-isolater < 94 % identitet med hundeisolatet (tabell 4). Disse resultatene identifiserte hundeisolatet A/Canine/Florida/43/2004 (Canine/FL/04) som et influensa A H3N8-virus som er nært beslektet med samtidige linjer av hesteinfluensavirus. Siden alle gener i hundeisolatet hadde sitt opphav i hesteinfluensavirus konkluderte vi at hele genomet til et hesteinfluensavirus hadde blitt overført til hunden.
EKSEMPEL 2 (REFERANSE)
For å undersøke rollen til Canine/FL/04-viruset i de kliniske og patologiske observasjonene i myndene utførte vi immunhistokjemisk farging (IHC) av lungevev ved anvendelse av et monoklonalt antistoff mot influensa A H3. Viralt H3-antigen ble konsistent påvist i cytoplasma i bronkeale og bronkiolære epitelceller, epitelceller fra bronkiekjertel og makrofager i luftveislumen og alveolære rom (fig. 2A). Disse resultatene understøtter en diagnose av lungeinfeksjon med influensavirus av H3-undertype i flere hunder.
EKSEMPEL 3 (REFERANSE)
For å fastslå deltagelsen av et Canine/FL/04-lignende virus i etiologien for utbruddet av luftveissykdommen analyserte vi par av akutt og konvalesent serum fra 11 syke hunder og 16 ikke-symptomatiske kontakter ved hemagglutinasjonsinhibering (I) og mikronøytraliserng (MN). Serokonversjon, definert som > 4 gangers økning av antistofftiteret mot Canine/FL/04 fra akutt til konvalescent fase, forekom hos åtte av elleve (73 %) syke hunder i begge analyser (tabell 1). Serokonversjon forekom hos seks av seksten (38 %) symptomfrie kontakter i HI-analysen, mens åtte av seksten (50 %) serukonverterte i MN-analysen (tabell 1). Serokonversjonsresultatene viste infeksjon av hundene med et Canine/FL/04-lignende virus som tidsmessig falt sammen med utløsningen av luftveissykdom i de fleste dyrene.
Enkeltvise serumprøver ble oppsamlet tre måneder etter utbruddet av ytterligere 46 symptomfrie hunder som var oppstallet sammen med de syke hundene. Av disse var 43 (93 %) seropositive i begge analyser. For totalpopulasjonen på 73 analyserte hunder var 93 % seropositive i begge analyser, innbefattet 82 % (9/11) av de syke hundene og 95 % (59/62) av de friske kontaktene. Den høye forekomsten av antiserum i hunder uten historie med luftveissykdom indikerer at de fleste infeksjoner med hundeinfluensavirus er subkliniske og tyder på en effektiv spredning av viruset blant hunder. Det er ikke kjent hvorvidt subkliniske infeksjoner bidrar til spredning av viruset.
EKSEMPEL 4 (REFERANSE)
For bedre å forstå evnen til Canine/FL/04-viruset til å infisere hunder ble fire 6 måneder gamle beagler avlet for dette formål inokulert med 10<6,6 >mediane vevskulturinfeksiøse doser (TCID50) ved intratrakeal og intranasal tilførsel. Alle hundene utviklet feber (rektumtemperatur > 39<o>C) i de første to dagene etter inokulasjonen (p.i.), men ingen viste luftveissymptomer som hoste eller neseutflod over en observasjonstid på 14 dager. Virusutskillelse ble undersøkt ved kvantifisering av virus i prøver av nesesekret og nesesvelgsekret. Kun to av de fire hundene utskilte påvisbare mengder av virus. En hund utskilte virus på dag 1 og 2 p.i. (1,0-2,5 log10 PFU pr. vattpensel), mens den andre hunden utskilte virus i fire på hverandre følgende dager etter inokulasjonen (1,4-4,5 log10 PFU pr. vattpensel). Postmortemundersøkelse av to hunder på dag 5 p.i. viste nekrotiserende og hyperplastisk trakeitt, bronkitt og bronkiolitt som lignet på hva som ble observert i den spontane sykdommen i mynder, men det var ingen lungeblødning eller bronkopneumoni. Viralt H3-antigen ble påvist i cytoplasma i epitelceller i bronkier, bronkioler og bronkiekjertler ved IHC (fig. 2B). Infeksiøst virus ble gjenvunnet fra lungevevet fra én av hundene. Postmortemundersøkelse av de gjenværende to hundene på dag 14 p.i. viste minimale histologiske endringer i luftveisvev, intet viralt H3-antigen ved IHC og ingen gjenvinning av virus fra lungehomogenater. Serokonversjon i disse to siste hundene ble påvist i MN-analyser på dag 7 p.i., med ytterligere 2-3 gangers økning av antistofftiteret på dag 14. Disse resultatene etablerte hundenes mottakelighet for infeksjon med Canine/FL/04, vist ved feberresponsen, nærvær av viralt antigen og infeksiøst virus i lungeparenkym, histopatologiske funn typiske for influensa og serokonversjon.
Manglende evne til å reprodusere alvorlig sykdom og død i de eksperimentelt inokulerte beaglene er ikke overraskende, siden en stor andel av de naturlig infiserte myndene var symptomfrie.
EKSEMPEL 5 (REFERANSE)
For å undersøke hvorvidt et Canine/FL/04-lignende influensavirus hadde sirkulert blant myndepopulasjoner i Florida før utbruddet i januar 2004 ble arkivert serum fra 65 veddeløpsmynder analysert for nærvær av antistoffer mot Canine/FL/04 ved anvendelse av HI- og MN-analysen. Det var ingen påvisbare antistoffer i 33 hunder med prøver fra 1996-1999. Av 32 hunder hvor prøver var tatt mellom 2000 og 2003 var ni seropositive i begge analyser – én i 2000, to i 2002 og seks i 2003 (tabell 5). De seropositive hundene var lokalisert til veddeløpsbaner i Florida som hadde inngått i utbrudd av luftveissykdom av ukjent etiologi fra 1999-2003, mye som tyder på at et Canine/FL/04-lignende virus kan ha vært årsaken til disse utbruddene. For å undersøke denne muligheten videre undersøkte vi arkivert vev fra mynder som døde av hemorragisk bronkopneumoni i mars 2003.
Lungehomogenater inokulert i MDCK-celler og kyllingembryoer fra én hund ga H3N8-influensavirus, betegnet A/Canine/Florida/242/2003 (Canine/FL/03). Sekvensanalyse av det komplette genom til Canine/FL/03 viste > 99 % identitet med Canine/FL/04 (tabell 4), noe som viser at Canine/FL/04-lignende virus hadde infisert mynder før 2004.
EKSEMPEL 6 (REFERANSE)
Fra juni til august 2004 forekom utbrudd av luftveissykdom i tusenvis av veddeløpsmynder ved 14 veddeløpsbaner i Florida, Texas, Alabama, Arkansas, West Virginia og Kansas.
Funksjonærer ved noen av disse veddemålsbanene anslo at minst 80 % av hundepopulasjonen ved banen hadde klinisk sykdom. De fleste av hundene hadde kliniske tegn på feger (> 39<o>C) og hoste, i likhet med hundene i utbruddet i januar 2004, men mange hunder hadde også en mukopurulent neseutflod. Flere dødsfall ble rapportert, men en nøyaktig dødelighetsfrekvens kunne ikke bestemmes.
Vi innsamlet par av akutt og konvalesent serum fra 94 hunder lokalisert til fire veddeløpsbaner i Florida: 56 % av disse hundene hadde > 4 gangers økning av antistofftiteret mot Canine/FL/04, og 100 % var seropositive (tabell 6). Konvalesent serum fra 29 hunder i West Virginia og Kansas hadde også antistoffer mot Canine/FL/04. Vi isolerte influensa A (H3N8)-virus fra lungene til en mynde som døde av hemorragisk bronkopneumoni ved en veddeløpsbane i Texas. Sekvensanalyse av hele genomet til dette isolat, betegnet A/Canine/Texas/1/2004 (Canine/TX/04), viste > 99 % identitet med Canine/FL/04 (tabell 4). Isolering av tre nært beslektede influensavirus fra dødelige tilfeller i hund over et tidsrom på 13 måneder og fra forskjellige geografiske lokaliteter tydet sammen med omfattende serologisk bevis for en omfattende infeksjon blant veddeløpsmynder på vedvarende sirkulasjon av et Canine/FL/04-lignende virus i hundepopulasjonen.
Fyllogenetisk analyse av HA-genene fra Canine/FL/03, Canine/FL/04 og Canine/TX/04 viste at de utgjorde en monofyletisk gruppe med robust ”bootstrap”-støtte som klart skilte seg fra samtidige H3-gener fra hestevirus isolert i 2002 og 2003 (fig. 1B). Fylogenetisk analyse og parvis nukleotidsekvenssammenligning av de andre 7 genomiske segmentene understøttet segregasjonen av hundegenene som en distinkt underlinje som mest lignet på hesteviruslinjen (resultater ikke vist og tabell 4). Klustringen av hundeinfluensagenene som en monofyletisk gruppe separat fra hesteinfluensa understøttes også av nærvær av fire karakteristiske aminosyreendringer i HA (tabell 2). Sammen med de serologiske resultatene fra 2003 og 2004 er disse resultatene i samsvar med en enkelt overføringsbegivenhet av virus fra hester til hunder, med påfølgende horisontal spredning av viruset i myndepopulasjonen. Gjentatte gangers innføring av denne unike linjen av influensavirus fra en ikke-identifisert reservoarart kan imidlertid ikke formelt sett utelukkes, selv om det er usannsynlig.
Viralt HA er en kritisk determinant for vertsartspesifisiteten til influensavirus (Suzuki et al., 2000). For identifisering av aminosyrerester i HA som kan være forbundet med tilpasning til hundeverten sammenlignet i den utledede aminosyresekvens for hunde-HA med sekvensen til samtidige hestevirus. Fire aminosyreendringer skiller de modne HA-konsensusaminosyresekvensene fra hest og hund fra hverandre: N83S, W222L, I328T og N483T (se tabell 2). Hundevirusene har en aminosyredelesjon sammenlignet med heste-konsensussekvensen. Følgelig er aminosyreposisjon i HA-hestesekvensen posisjon 6 i HA-hundesekvensen, aminosyreposisjon 29 i HA-hestesekvensen er posisjon 28 i HA-hundesekvensen, aminosyreposisjon 83 i HA-hestesekvensen er posisjon 82 i HA-hundesekvensen og så videre. De fire substituerte aminosyrene foreligger følgelig i posisjon 82, 221, 327 og 482 i aminosyresekvensen som vises i SEKV. ID nr. 33 og SEKV. ID nr. 34. Innføring av serin i stedet for asparagin i konsensussekvensposisjon 83 er en endring av ukjent funksjonell betydning, siden forskjellige polare aminosyrerester forefinnes i H3-molekyler fra andre arter. Den strengt konserverte isoleucin i konsensussekvensposisjon 328 nær kløyvingssetet i H3 HA har blitt erstattet med treonin. Den avgjørende rolle for HA-kløyving ved vertsproteaser i patogenesen tyder på at denne endringen fortjener videre undersøkelser. Innføring av leucin i stedet for tryptofan i konsensussekvensposisjon 22 er bemerkelsesverdig, siden dette representerer en ikkekonservativ endring i nabostilling den sialinsyrebindende lomme som kan tenkes å modulere reseptorfunksjonen (Weis et al., 1988). Det er av interesse at leucin i posisjon 222 ikke er spesiell for hunde-H3 HA, siden leucin typisk finnes i undertypene H4, H8, H9 og H12 HA (Nobusawa et al., 1991, Kovacova et al., 2002). Leucinsubstitusjonen kan være mer forenlig med virusspesifisitet for pattedyrsverter, siden infeksjon av gris med undertype H4 (Karasin et al., 2000) og mennesker og gris med undertype H9 (Peiris et al., 1999) har blitt rapportert. Erstatning av asparagin med treonin i konsensussekvensposisjon 483 fører til tap av et glykosyleringssete i HA2-subenheten som er konservert i alle HA-undertyper (Wagner et al., 2002). Selv om betydningen av disse aminosyreendringene i HA for adapsjon av et hestevirus til hunder fortsatt ikke er bestemt har lignende aminosyreendringer tidligere blitt observert i forbindelse med overføring mellom arter (Vines et al., 1998, Matrosovich et al., 2000).
Aminosyreforskjeller mellom andre influensavirusproteiner ifølge beskrivelsen og hestekonsensussekvensen vises i tabellene 19-25.
Kilden for hesteinfluensaviruset som i utgangspunktet infiserte veddeløpsmynder er fortsatt spekulativ. Kenneler ved veddeløpsbaner er ikke plassert nær hester eller hesteveddeløpsbaner, noe som tyder på at kontakt mellom mynder og hester som utskiller virus ikke er en tilstrekkelig forklaring på de flere utbruddene i forskjellige stater i 2004. En mulig kilde for eksponering overfor hesteviruset er fôring av mynder med hestekjøtt, siden myndenes kost suplementeres med rått kjøtt levert av hermetikkfabrikker som behandler kadavre, innbefattet hester, som kan bære influensa. Tidligere eksempler på denne infeksjonsmåten omfatter rapporter om overføring mellom arter av H5N1-fugleinfluensavirus til griser og kattedyr i zoologiske hager fôret med infiserte hønsekadavere (Webster, 1998, Keawcharoen et al., 2004, Kuiken et al., 2004). Selv om dette er en plausibel vei for innledende innføring av hesteinfluensavirus til hunder forklarer den ikke de nylige, flere influensautbruddene i tusenvis av hunder i forskjellige stater. Vår eksperimentelle inokulasjonsundersøkelse viste nærvær av virus i neseveier og munnsvelg hos hunder, om enn i moderat titer. Disse resultatene indikerer ikke desto mindre at utskillelse er mulig og at overføring av virus fra hund til hund via aerosoler med store dråper, uorganiske gjenstander eller direkte slimhinnekontakt kan spille en rolle i sykdommens episotiologi.
Overføring mellom arter av et helt pattedyrsinfluensavirus til en ubeslektet pattedyrsart er en sjelden begivenhet. Tidligere undersøkelser har tilveiebrakt begrenset serologisk eller virologisk materiale, men ikke begge deler, som tyder på forbigående infeksjon av hunder med humant influensa A (H3N2)-virus (Nikitin et al., 1972, Kilbourne et al., 1975, Chang et al., 1976, Hauser et al., 1980). Det var imidlertid ingen tegn på vedvarende sirkulasjon i hundeverten. Selv om direkte overføring av griseinfluensavirus fra gris til mennesker er godt dokumentert (Dacso et al., 1984, Kimura et al., 1998, Patriarca et al., 1984, Top et al., 1977) foreligger det ingen bevis på adapsjon av grisevirusene i menneskeverter. I denne rapporten gir vi virologisk, serologisk og molekylært bevismateriale for overføring mellom arter av et helt hesteinfluensa A (H3N8)-virus til en annen pattedyrsart, hunden. Unike aminosyresubstitusjoner i hundevirus-HA koblet med serologisk bekreftelse av infeksjon av hunder i flere stater i de Forente Stater tyder på adapsjon av viruset til hundeverten. Siden hunder er et primært ledsagerdyr for mennesker har disse funnene implikasjoner for folkehelsen, siden hunder kan utgjøre en ny kilde for overføring av nye influensa A-virus til mennesker.
<a>Antall hunder med kliniske sykdomstegn.
<b>Antall symptomfrie hunder som var oppstallet i kontakt med klinisk syke hunder. <c>Hemagglutinasjonsinhiberingsanalyse (HI)-analyse ved anvendelse av A/Canine/Florida/43/2004-virus. <d>Mikronøytraliseringsanalyse (MN)-analyse ved anvendelse av A/Canine/Florida/43/2004-virus. <e>Prosentandel av hunder med minst fire gangers økning av antistofftiteret i par av akutt og konvalesent serum. <f>Prosentandel av hunder med positivt antistofftiter (HI-titer > 23, MN-titer > 80) i konvalesent serum. <g>Geometrisk gjennomsnitt av antistofftiteret for konvalesente sera.
*Aminosyrerest (enbokstavkode) og posisjon i modent H3 HA. Aminosyrekoden er: A = alanin, D = asparaginsyre, G = glysin, I = isoleucin, K = lysin, L = leucin, M = metionin, N = asparagin, R = arginin, S = serin, T = treonin, V = valin, W = tryptofan. ;†Angir ingen endring fra heste-H3 HA-konsensus. ;;;346351 ;;;<a>Hemagglutinasjonsinhiberingstiter mot virusisolat fra hund # 43. ;<b>Polyklonale antisera ble fremstilt i fritter, mens alle andre antisera ble fremstilt i sauer eller geiter. ;346351 ;;;;<a>Prosent nukleotid- og aminosyre (i parentes)-sekvensidentitet mellom A/Canine/Florida/43/2004 (H3N8)-gener og det mest homologe gen eller influensavirusisolat fra arten, fulgt av sekvensens aksesjonsbetenelse i databasen Genbank. ;<b>Ikke anvendbart: N8 nevraminidase har aldri blitt rapportert i menneskevirus eller grisevirus. ;Tabell 5. Antistofftiter mot A/canine/Florida/43/2004 (H3N8) i myndeserum oppsamlet fra 1996-2003 ;;;<a>Året for innsamling av serumprøve fra veddeløpsmynder i Florida. ;<b>Antistofftiter bestemt ved mikronøytraliseringsanalyse for seropositive hunder, innbefattet området for de seks seropositive hundene i 2003. ;;;;<a>Antall klinisk syke hunder analysert ved HI og anvendelse av A/canine/Florida/43/2004 (H3N8). <b>Prosentandel av hunder med > 4 gangers økning av antistofftiteret mellom akutt og konvalesent serum. <c>Prosentandel hnnder med positivt antistofftiter (HI-titer > 16) i konvalesent serum. ;<d>Geometrisk middelverdi av antistofftiteret for konvalesente sera. ;;MATERIALER OG FREMGANGSMÅTER FOR EKSEMPLENE 7-11 ;;Hundevev ;Obduksjoner ble utført ved Anatomic Pathology Service ved University of Florida College of Veterinary Medicine på 6 hunder av blandingsrase som døde i april/mai 2005 under et influensautbrudd i et hundemottak i nordøstlige Florida og på en Yorkshire-terreir som døde i mai 2005 under et influensautbrudd i en veterinærklinikk i sørøstlige Florida. Vevene ble fiksert med 10 % nøytralbufret formalin og innstøpt i parafin, og 5 μm snitt ble farget med hematoksylin og eosin for histopatologisk diagnose. Ikke-fikserte vev ble lagret ved -80<o>C i påvente av virologisk analyse. ;;RNA-ekstraksjon fra hundevevsprøver ;Nedfrosset lungevev fra hver av de 7 hundene ble opptint og homogenisert i minimalt essensialt medium (MEM) tilsatt 0,5 % bovint serumalbumin (BSA) og antibiotika (gentamycin og ciprofloksacin) ved anvendelse av en engangs vevsmaler (Kendall, Lifeline Medical Inc., Danbury, CT). Total-RNA ble ekstrahert ved anvendelse av et kommersielt sett (RNeasy <® >Mini Kit, QIAGEN Inc., Valencia, CA) ifølge produsentens retningslinjer og eluert i et endelig volum på 60 μl buffer. Total-RNA ble også ekstrahert fra lungevev oppsamlet fra hunder uten luftveissykdom. ;;Sanntids-RT-PCR ;En entrinns kvantitativ sanntids-RT-PCR ble utført på total-RNA ekstrahert fra hundevevsprøvene ved anvendelse av QuantiTect <® >Probe RT-PCR Kit inneholdende ROX som passivt referansefargestoff (QIAGEN Inc., Valencia, CA). Kort beskrevet ble 2 primer-probesett anvendt for påvisning av influensa A-sekvenser i hver prøve (tabell 7). Ett primer-probe-sett var selektivt for hunde-hemagglutinin (H3)-gensekvenser. Det andre primer-probesettet var rettet mot et svært konservert område i matriks (M)-genet fra type A influensavirus. For hver sanntids RT-PCR-reaksjon ble 5 μl ekstrahert total-RNA tilsatt til en reaksjonsblanding som inneholdt 12,5 μl 2X QuantiTech <® >Probe RT-PCR Master Mix, 0,25 μl QuantiTech <® >RT Mix, ”forward” og revers primer (0,4 μM sluttkonsentrasjon for begge9, probe (0,1 μM sluttkonsentrasjon) og RNase-fritt vann i et sluttvolum på 25 μl. TaqMan <® >Ribosomal RNA Control Reagents (Applied Biosystems, Foster City, CA) ble anvendt ifølge produsentens retningslinjer for påvisning av 18S-rRNA som en endogen, intern kontroll for nærvær av RNA ekstrahert fra hundevevsprøvene. ;Kvantitativ entrinns sanntids-RT-PCR ble utført på reaksjonsblandingene i et Mx3000P <® >QPCR-system (Stratagene, La Jolla, CA). Varmesyklusbetingelsene omfattet et reverstranskripsjonstrinn ved 50<o>C i 30 min., et innledende denatureringstrinn ved 95<o>C i 15 min. for aktivering av HotStarTaq <® >DNA-polymerase og amplifisering over 40 sykluser. Hver amplifiseringssyklus omfattet denaturering ved 94<o>C i 15 sek., fulgt av hybridisering/forlengelse ved 60<o>C i 1 min. Fluorescenssignalene fra FAM (emisjonsbølgelengde 518 nm) og VIC (emisjonsbølgelengde 554 nm) ble målt ved slutten av hver syklus. Terskelsyklusen (Ct) ble bestemt ved å sette fluorescensterskelen (dR) til 1000 i hvert enkelt eksperiment. Programmet Mx3000P <® >versjon 2.0 (Stratagene, La Jolla, CA) ble anvendt for dataoppsamling og analyse. Prøvene ble ansett som positive for influensa A-virus dersom terskelsyklusen (Ct) for H3- eller M-genet var 3 enheter lavere enn Ct for lungevev fra hunder uten luftveissykdom. Den positive kontrollen bestod av amplifisering av RNA ekstrahert fra A/canine/FL/242/03 (H3N8)-virus. ;;Isolering av virus i MDCK-celler ;Nedfrosset lungevev fra hver av de 7 hundene ble opptint og homogenisert i 10 volumer Dulbeccos modifiserte Eagles Medium (DMEM) tilsatt 0,5 % (BSA) og antibiotika (gentamycin og ciprofloksacin). Fast materiale ble fjernet ved sentrifugering og supernatantene inokulert på Madin-Darby hundenyreceller (MDCK)-celler dyrket i DMEM tilsatt 1 μg/ml TPCK-behandlet trypsin (Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO) og antibiotika (gentamycin og ciprofloksacin). Cellene ble dyrket i 25 cm<2 >flasker ved 37<o>C i en fuktiggjort atmosfære inneholdende 5 % CO2. Kulturene ble observert daglig for morfologiske endringer og høstet 5 dager etter inokulasjonen. De høstede kulturene ble klarnet ved sentrifugering og supernatantene inokulert på friske DMCK-celler som beskrevet for den innledende inokuleringen, ytterligere to passasjer ble utført for prøver som ikke viste teten på influensavirus ved hemagglutinasjon eller RT-PCR. ;Hemagglutinasjonsaktivitet i de klarnede supernatantene ble bestemt ved anvendelse av 0,5 % røde blodceller fra kalkun som beskrevet tidligere (Burleson, F. et al., 1992, Kendal, P. et al., 1982). RT-PCR ble utført som beskrevet nedenfor. ;;Isolering av virus i hønseegg med embryoer ;Homogenater ble fremstilt fra nedfrosset lungevev som beskrevet ovenfor for inokulering av MDCK-celler. Homogenatene (0,2 ml) ble inokulert i allantoinsekken hos 10 dager gamle kyllingegg med embryoer. Etter 48 timers inkubering ved 35<o>C ble eggene avkjølt ved 4<o>C over natten før allantoinvæsken ble høstet. ;Hemagglutinasjonsaktiviteten i de klarnede supernatantene ble bestemt ved anvendelse av 0,5 % røde blodceller fra kalkun som beskrevet tidligere (Burleson, F. et al., 1992, Kendal, P. et al., 1982). RT-PCR ble utført som beskrevet nedenfor. Ytterligere to passasjer i egg med embryoer ble utført for prøver som ikke viste tegn på influensavirus etter den opprinnelige inokulasjonen. ;;RT-PCR, nukleotidsekvensering og fylogenetiske analyser ;Virus-RNA ble ekstrahert fra MDCK-supernatant eller allantoinvæske ved anvendelse av QIAamp <® >Viral RNA Mini Kit (QIAGEN Inc., Valencia, CA) ifølge produsentens retningslinjer. Virus-RNA ble reverstranskribert til cDNA ved anvendelse av QIAGEN <® >OneStep RT-PCR Kit (QIAGEN Inc., Valencia, CA) ifølge produsentens retningslinjer. PCR-amplifisering av det kodende området i de 8 influensavirusgenene i dette cDNA ble utført som beskrevet tidligere (Klimov, A. et al., 1992b), ved anvendelse av universelle, genspesifikke primersett (primersekvensene er tilgjengelige etter henvendelse). De resulterende DNA-amplikonene ble anvendt som templater for automatisert sekvensering i et ABI PRISM <® >3100 automatisert DNA-sekvenseringsinstrument ved anvendelse av syklussekvensering og terminatorer med tilkoblede fargestoffer (Applied Biosystems, Foster City, CA). Nukleotidsekvensene ble analysert ved anvendelse av Lasergene 6 Package <® >(DNASTAR, Inc., Madison, WI). Programvaren PHYLIP versjon 3.5 ©blenvendt for estimering av fylogenier og beregning av ”bootstrap”-verdier fra nukleotidsekvensene (Felsensein, J., 1989). De fylogenetiske trærne ble sammenlignet med trær fremstilt ved ”neighbor-joining”-analyse med Tamura-Nei-modellen implementert i programmet MEGA <© >(Kumar, S. et al., 2004) og bekreftet med programmet PAUP <© >4.0 Beta (Sinauer Associates, inc., Sunderland, MA). ;;Hemagglutinasjonsinhiberings- (HI)-analyse ;Serumprøver ble inkubert med reseptorødeleggende enzym (RDE, DENKA SEIKEN Co., Ltd., Tokyo, Japan) (1 del serum: 3 deler RDE) i 16 timer ved 37<o>C før varmeinaktivering i 30 min. ved 56<o>C. Influensa A/Canine/Jacksonville/05 (H3N8)-virus ble dyrket i MDCK-celler i 72 timer ved 37<o>C i 5 % CO2. Virusdyrkningssupernatantene ble høstet, klarnet ved sentrifugering og lagret ved -80<o>C. Alle andre virus som ble anvendt i HI-analysen ble dyrket i 10 dager gamle hønseegg med embryoer, fra hvilke allantoinvæske ble oppsamlet og lagret ved -80<o>C. HI-analysen ble utført som beskrevet tidligere (Kendal, P. et al., 1982). Kort beskrevet ble 4 hemagglutinasjonsenheter av virus i 25 μl tilsatt til et likt volum seriefortynnet serum i 96-brønners plastplater og inkubert ved romtemperatur i 30 min. Et visst volum 0,5 % kalkunerytrocytter ble tilsatt, og hemagglutinasjonstitere ble bestemt visuelt etter 30 min. HI-sluttpunkttiteret ble definert som den siste fortynning av serum som fullstendig inhibere hemagglutinasjon. ;;EKSEMPEL 7 – KLINISKE TILFELLER ;I april og mai 2005 oppstod et tidligere beskrevet (Crawford, P.C. et al., 2005) utbrudd av luftveissykdom hos hunder som bodde i et hundemottak i nordøst Florida. Utbruddet omfattet minst 58 hunder med alder i området fra 3 måneder til 9 år og omfattet renrasede hunder så vel som hunder av blandingsrase. De vanligste kliniske symptomene var purulent neseutflod og hoste i 7-21 dager. Av de 43 hundene som hadde klinisk sykdom i > 7 dager hadde 41 HI-antistofftitere mot Canine/FL/04 (H3N8) som varierte fra 32 til > 1024. Hos minst 10 av hundene utviklet sykdommen seg til pneumoni, og seks av disse hundene ble avlivet. disse seks hundene av blandingsrase omfattet tre hanner og tre hunner med alder i området fra 4 måneder til 3 år. Varigheten av de kliniske symptomene varierte fra 2-10 dager ved avlivningstidspunktet. Obduksjonen viste at hundene hadde lungekongestion og ødem. En histologisk undersøkelse av luftveiene viste rinitt, trakeititt, bronkitt, bronkiolitt og suppurativ bronkopneumoni. Det forelå epitelcellenekrose og erosjon i luftrør, bronkier, bronkioler og bronkiekjertler. Luftveisvevene var infiltrert av nøytrofile celler og makrofager. ;I mai 2005 forekom et utbrudd av luftveissykdom hos 40 kjælehunder i en veterinærklinikk i sørøst Florida. De vanligste kliniske symptomene var purulent neseutflod og hoste i 10-30 dager. Av de 40 hundene var seropositive for canine/FL/04 (H3N8) med et HI-antistofftiter i området fra 32 til > 1024. Serokonversjon opptrådte i 10 hunder for hvilke par av akutt og konvalesent serum var tilgjengelig. Hos tre hunder utviklet sykdommen seg til pneumoni. En av disse hundene, en ni år gammel Yorkshireterrier-hann, døde tre dager etter at de kliniske symptomene viste seg. Denne hunden hadde trakeobronkitt, lungeødem og kongestion og alvorlig bronkopneumoni. I likhet med de 6 hundene fra hundemottaket forelå det epitelcellenekrose og erosjon av luftveiene og infiltrering av nøytrofile celler i vevene. ;;EKSEMPEL 8 – SANNTIDS RT-PCR OG VIRUSISOLERING ;Lungevev fra de 7 hundene ble analysert ved kvantitative sanntids RT-PCR-analyser for påvisning av M-genet fra influensa type A og H3-genet fra hundeinfluensa A H3N8-virus. Lungene fra alle de 7 hundene var positive for både M-genet fra influensa A og H3-genet fra hundeinfluensa (tabell 8). Etter tre passasjer i MDCK-celler ble influensa A-vikrus av undertype H3N8 isolert fra lungene til en hund fra hundemottaket som døde etter tre dagers pneumoni. Dette viruset ble betegnet A/canine/Jacksonville/05 (H3N8) (canine/Jax/05). Etter to passasjer i hønseegg med embryoer ble influensa A-virus av undertype H3N8 gjenvunnet fra lungene til kjælehunden som også døde etter 3 dager med pneumoni. Dette viruset ble betegnet A/canine/Miami/05 (H3N8) (canine/Miami/05). ;;EKSEMPEL 9 – GENETISKE ANALYSER AV ISOLATET AV HUNDEINFLUENSA A H3N8 ;Sekvensanalyse av canine/Jax/05 og canine/Miami/05 viste at hemagglutiningenene (HA-genene) var 98 % identiske med genene fra isolatene canine/FL/04, canine/TX/04 og canine/Iowa/05, som ble gjenvunnet fra lungene til veddeløpsmynder som døde av pneumoni under influensautbruddene ved veddeløpsbaner i 2004 og 2005 (Crawford, P.C. et al., 2005, Yoon K-Y. et al., 2005). I tillegg var HA-genene fra canine/Jax/05 og canine/Miami/05 98 % identiske med samtidige hesteinfluensavirus isolert etter år 2000- Fylogenetisk sammenligning av HA-genene viste at virusene canine/Jax/05 og canine/Miami/05 dannet et kluster med canine/FL/04, canine/TX/04 og canine/Iowa/05, isolert fra mynder, og samtidige hesteisolater og dannet en separat gruppe fra de eldre hestevirusene som ble isolert tidlig på 1990-tallet (fig. 4). Videre var isolatene canine/Jax/05, canine/Miami/05 og canine/Iowa/05 nærmere beslektet med canine/TX/04 enn med canine/FL/04 og canine/FL/03. Isolatene fra 2005 dannet en undergruppe som ser ut til å forgrenes fra de tidligere hundevirusene fra 2003 og 2004, med forskjeller i tilnærmet 10 parsimoniinformative seter. Disse forskjellene understøtter hypotesen om at hundeinfluensavirus overføres horisontalt fra hund til hund, i motsetning til regelmessig gjeninnføring fra en ytre kilde. Akkumuleringen av mutasjoner fra 2003-2005 illustrerer den pågående adapsjonsprosessen som viruset må gjennomgå etter overføring til en ny vert, noe som forventes å ha skjedd for ;hundeinfluensavirusene. ;EKSEMPEL 10 – AMINOSYREANALYSE AV HUNDEINFLUENSA A H3N8-ISOLATENE ;Det var konserverte aminosyresubstitusjoner i alle de seks hundeisolatene som gjorde dem forskjellige fra samtidige hesteinfluensavirus (tabell 9). Disse konserverte substitusjonene var I15M, N83S, W222L, I328T og N483T. Fylogenetisk sammenligning av de modne HA-proteinene viste at virusene canine/Jax/05, canine/Miami/05 og canine/Iowa/05 dannet en undergruppe sammen med canine/TX/04-isolatet (fig. 4). Det var fire aminosyreendringer (L118V, K261N og G479E), gjorde denne undergruppen forskjellig fra de andre hundevirusene (tabell 9). det var 2 aminosyreendringer (F79L og G218E) som skilte isolatene fra 2005 fra roten canine/TX/04. Videre var 2005-isolatene fra ikke-mynder, canine/Jax/05 og canine/Miami/05, forskjellige fra myndeisolatet canine/Iowa/05 med én aminosyreendring, R492K. Endelig var canine/Jax/05 forskjellig fra canine/Miami/05 i en enkelt aminosyre, S107P. I alle andre H3N8-hestevirus og -hundevirus er S konservert i posisjon 107, bortsett fra A/Equine/Jilin/1/89, som har en T (Guo Y. et al., 1992). ;;EKSEMPEL 11 – ANTIGENANALYSE AV HUNDEINFLUENSA A H4N8-ISOLATENE ;Hemagglutinasjonsinhiberingsanalyser (HI-analyser) ble utført ved anvendelse av et sett av antigener fra eldre og samtidige hesteinfluensavirus og hundeinfluensavirusene og serum oppsamlet i 2005 fra hunder og hester som hadde blitt infisert med influensavirus (tabell 10). Serum fra fritter immunisert mot canine/FL/04 inngikk også i analysene. HI-antistofftiteret i hesteserum var 8-16 ganger høyere ved analyse med samtidige hestevirus sammenlignet med eldre isolater, men var minst fire ganger lavere ved analyse med hundevirusene. Hundeserum reagerte ikke med de eldre hestevirusene, men antistofftiteret økte fire ganger ved analyse med samtidige hesteisolater og hundeisolater. Dette ble også observert for serum fra fritter immunisert mot hundeinfluensavirus. Disse seroreaktivitetsmønstrene viste antigenlikheten mellom hundeinfluensavirusene og samtidige hesteinfluensavirus og var i samsvar med de fylogenetiske analysene. Antistofftiteret i hesteserum, hundeserum og fritteserum mot canine/Miami/05-isolatet tilsvarte titrene for hundeisolatene fra 2003 og 2004. Titeret var imidlertid 2-4 ganger lavere for canine/Jax/05-isolatet. Dette tyder på at canine/Jax/05 skiller seg antigenisk fra de andre hundeisolatene, noe som delvis kan skyldes den ene aminosyreendringen i posisjon 107 i modent HA. ;;;<a>Understreket bokstav r står for nukleotid a eller g og understreket bokstav k står for nukleotid g eller t. <b>Store bokstaver står for ”låste” nukleinsyrerester. ;;( ) ;;;;;<a>Antistofftiteret ble bestemt i en hemagglutinasjonsinhiberingsanalyse utført med seriefortynninger av hesteserum, hundeserum eller fritteserum og virusene som er opplistet i antigenkolonnen. ;<b>Serum fra fritter immunisert med canine/FL/04-virus. ;;MATERIALER OG FREMGANGSMÅTER FOR EKSEMPLENE 12-15 (REFERANSEEKSEMPLER) ;;Hundeinfluensavirus-inokulat ;Virusinokulatet ble fremstilt ved inokulering av Madin-Darbyhundenyreepitelceller (MDCK)-celler med en lagerløsning av A/canine/FL/43/04 (H3N8) som representerte passasje 3 av det opprinnelige, tidligere beskrevne isolat (Crawford et al., 2005). De inokulerte MDCK-cellene ble dyrket i Dulbeccos minimale essensielle medium (DMEM) tilsatt 1 μg/ml TPCK-behandlet trypsin (Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO) og antibiotika (gentamycin og ciproflosacin) i 250 cm<2 >flasker ved 37<o>C i en fuktiggjort atmosfære inneholdende 5 % CO2. Kulturene ble observert daglig for morfologiske endringer og høstet 5 dager etter inokulasjonen. De høstede kulturene ble fjernet ved sentrifugering, og supernatantene ble lagret ved -80<o>C før hundene ble inokulert. Et uttak av supernatanten ble anvendt for bestemmelse av virustiteret ved fremgangsmåten til Reed og Muench. Titeret var 10<7 >mediane vevskulturinfeksiøse doser (TCID50) pr. ml for A/canine/Florida/43/2004 (canine/FL/04). ;;Eksperimentell inokulasjon ;Åtte 4 måneder gamle koloniavlede hunder av blandingsrase (Marshall BioResources, North Rose, NY) (4 hanner og 4 hunner) ble anvendt for den eksperimentelle inokulasjonsundersøkelsen, som var godkjent av university of Florida Institutional Animal Care and Use Committee. Hundenes kroppsvekt varierte fra 13-17 kg. Hundene var friske basert på fysisk undersøkelse, blodanalyser i basalnivået og måling av kroppstemperaturen i 2 uker før inokulasjonen. Ingen av hundene hadde tidligere vært eksponert overfor hundeinfluensavirus, basert på serologiske analyser utført på parede serumprøver oppsamlet på tidspunktet for ankomst til enheten og 2 uker senere. Hundene ble bedøvet ved intravenøs injeksjon av propofol (Diprivan <®>, Zeneca Pharmaceuticals, 0,4 mg/kg kroppsvekt til virkning) for endotrakeal inkubasjon. Seks hunder 3 hanner og 3 hunner) ble alle inokulert med 10<7 >TCID50 av canine/FL/04-virus i 5 ml sterilt saltvann, tilsatt til de distale luftrør ved hjelp av et gummikateter med liten diameter innført i endotrakealslangen. To hunder (1 hann og 1 hunn) ble narreinokulert med et likt volum sterilt saltvann. De narreokulerte kontrollhundene ble oppstallet i et annet rom enn de dyrisk inokulerte hundene og behandlet av annet personell. Fysiske undersøkelser og måling av rektaltemperaturen ble utført to ganger daglig i 6 dager etter inokulasjonen (p.i.). ;;Oppsamling av prøver fra svelg og rektum ;For måling av virusutskillelse ble munnsvelgprøver oppsamlet to ganger daglig fra hver hund på dagene 0-6 p.i. ved anvendelse av vattpensler av polyester (Fischer Scientific International Inc., Pittsburg, PA). Penslene ble plassert i 1 ml sterilt fosfatbufret saltvann (PBS) tilsatt 0,5 % bovint serumalbumin (BSA). Rektumprøver ble oppsamlet daglig fra hver hund fra dag 0-6. Ekstrakter av vattpenslene ble fremstilt ved klarning av penseltransportmediet ved sentrifugering. Et uttak av penselekstraktet ble umiddelbart analysert for influensa A-virusnukleoprotein ved anvendelse av det kommersielle immunanalysesettet Directigen<TM >(BD, Franklin Lakes, NJ) ifølge produsentens retningslinjer. Resten av ekstraktet ble lagret ved -80<o>C i påvente av andre virologiske analyser. ;;Postmortemundersøkelser ;På dag 1 p.i. ble én narreinokulert hund og én virusinokulert hund avlivet ved intravenøs inokulasjon av Beuthanasia-D <®>-løsning (1 ml/5 kg kroppsvekt, ScheringPlough Animal Health Corp.). En virusinokulert hund ble avlivet på samme måte hver dag fra dagene 2-5 p.i. På dag 6 p.i. ble den gjenværende narreinokulerte hund og virusinokulerte hund avlivet. Fullstendige postmortemundersøkelser ble utført av én av forskerne (WLC). Vevene ble fiksert med 10 % nøytralbufret formalin og innstøpt i parafin, og 5 μm snitt ble enten farget med hematoksilin og eosin for histopatologisk diagnose eller viderebehandlet for immunhistokjemisk analyse som beskrevet nedenfor. Ikke-fikserte lungevev ble levert til Diagnostic Clinical Microbiology/Parasitology/Serology Service ved University of Florida College of Veterinary Medicine for isolering og identifisering av bakterier. Prøvene ble dyrket i ikkeselektivt medium, så vel som i medium som var selektivt for Bordetella-arter (Regan-Lowe, Remel, Lenexa, KS) og Mycoplasma-arter (Remel). Alle kulturer ble dyrket i 21 dager før manglende vekst ble rapportert. Ikke-fikserte vev ble også lagret ved -80<o>C i påvente av virologiske analyser. ;;Immunhistokjemisk analyse ;Avparafiniserte og rehydrerte 5 μm snitt av luftrør og lungevev ble montert på Bond-Rite<TM >objektglass (Richard-Allan Scientific, Kalamazoo, MI) og så behandlet med proteinase K (DACOCytomation Inc., Carpenteria, CA), fulgt av peroksidaseblokkerende reagens (DAKO <® >EnVision<TM >Peroksidase Kit, DAKO Corp., Carpenteria, CA). Snittene ble inkubert med en 1:500 fortynning av monoklonalt antistoff mot influensa A H3 (Chemicon International, Inc., Ternecula, CA) i 2 timer ved romtemperatur. Kontrollene omfattet inkubering av de samme snittene med muse-IgG (1 mg/ml, Serotec, Inc. Raleigh, NC), og inkubering av det monoklonale antistoff med normale hundelungesnitt. Etter behandling med primærantistoffet ble snittene inkubert med sekundær immunoperoksidase og peroksidasesubstratreagenser (Dako <® >EnVision<TM >Peroxidase Kit, Dako Corp.) ifølge produsentens retningslinjer. Snittene ble motfarget med hematoksylin, behandlet med Clarifier #2 og Bluing Reagent (Richard-Allan Scientific, Kalamazoo, MI) og dehydrert, og dekkglass ble påført med Permount (ProSciTech, Queensland, Australia). ;;RNA-ekstraksjon fra vattpensler og vev ;Lungevev og luftrørsvev fra hver hund ble opptint og homogenisert i minimalt essensielt medium (MEM) tilsatt 0,5 % bovint serumalbumin (BSA) og antibiotika (gentamycin og ciprofloksacin) ved anvendelse av en engangs vevsmaler (Kendall, Lifeline Medical Inc., Danbury, CT). Total-RNA ble ekstrahert fra vevshomogenatene så vel som fra munnsvelgprøver og rektumprøver på vattpensler ved anvendelse av et kommersielt sett (RNeasy <® >Mini Kit, QIAGEN Inc., Valencia, CA) ifølge produsentens retningslinjer og eluert i et sluttvolum på 60 μl buffer. ;Sanntids RT-PCR ;En entrinns kvantitativ sanntids RT-PCR ble utført på total-RNA ved anvendelse av QuantiTect <® >Probe RT-PCR Kit med ROX som passivt referansefargestoff (QIAGEN Inc., Valencia, CA) og et primer-probesett rettet mot et svært konservert område i matriksgenet (M-genet) i influensavirus type A (Payungporn S. et al., 2006a, Payungporn S. et al., 2006b). For hver av sanntids RT-PCR-reaksjonene ble 5 μl ekstrahert total-RNA tilsatt til en reaksjonsblanding som inneholdt 12,5 μ 2X QuantiTech <® >Probe RT-PCR Master Mix, 0,25 μ QuantiTech <® >RT Mix, ”forward” og revers primer (0,4 μM sluttkonsentrasjon for begge), probe (0,1 μM sluttkonsentrasjon) og RNasefritt vann i et sluttvolum på 25 μ. TaqMan <® >GAPDH-kontrollreagenser (Applied Biosystems, Foster City, CA) ble anvendt ifølge produsentens retningslinjer for påvisning av GAPDH som endogen intern kontroll for nærvær av RNA ekstrahert fra vattpensel- og vevsprøvene og som normaliseringskontroll. ;Kvantitativ entrinns sanntids RT-PCR ble utført på reaksjonsblandingene i et Mx3000P <® >QPCR-system (Stratagene, La Jolla, CA). Syklusbetingelsene omfattet et reverstranskripsjonstrinn ved 50<o>C i 30 min., et innledende denatureringstrinn ved 95<o>C i 15 min. for aktivering av HotStarTaq <® >DNA-polymerase og amplifisering over 40 sykluser. Hver amplifiseringssyklus omfattet denaturering ved 94<o>C i 15 sek., fulgt av hybridisering/forlengelse ved 60<o>C i 1 min. Fluorescenssignalene fra FAM (emisjonsbølgelengde 518 nm) og VIC (emisjonsbølgelengde 554 nm) ble målt ved avsluttelsen av hver syklus. Terskelsyklusen (Ct) ble bestemt ved å sette fluorescensterskelen (dR) til 1000 i hvert enkelt eksperiment. Programvaren Mx3000P <® >vsersjon 2.0 (Stratagene, La Jolla, CA) ble anvendt for dataoppsamling og –analyse. Den positive kontrollen bestod av amplifisering av RNA ekstrahert fra A/canine/FL/242/03 (H3N8)-virus. Resultatene ble normalisert ved å dividere Ct-verdien for M-genet med den tilsvarende Ct-verdi for GAPDH for hver prøve. ;;Gjenisolering av virus fra vev ;Nedfrosset lungevev og luftrørsvev fra virusinokulerte hunder ble opptint og homogenisert i 10 volumer DMEM tilsatt 0,5 % BSA og antibiotika. Faste rester ble fjernet ved sentrifugering, og supernatantene ble inokulert på MDCK-celler dyrket i DMEM tilsatt 1 μg/ml TPCK-behandlet trypsin (Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO) og antibiotika som beskrevet ovenfor. Cellene ble dyrket i 25 cm<2 >flasker ved 37<o>C i en fuktiggjort atmosfære inneholdende 5 % CO2. Kulturene ble observert daglig for morfologiske endringer og høstet 5 dager etter inokulasjonen. De høstede kulturene ble klarnet ved sentrifugering, og supernatantene ble inokulert på friske MDCK-celler som beskrevet for den innledende inokulasjonen, ytterligere to passasjer ble utført for prøver som ikke viste tegn på influensavirus ved hemagglutinasjon eller RT-PCR. ;Hemagglutinasjonsaktiviteten i de klarnede supernatantene ble bestemt ved anvendelse av 0,5 % røde blodceller fra kalkun som beskrevet tidligere (Crawford et al., 2005). RT-PCR ble utført som beskrevet nedenfor. ;;RT-PCR, nukleotidsekvensering og fylogenetiske analyser ;Virus-RNA ble ekstrahert fra MDCK-supernatant ved anvendelse av QIAamp <® >Viral RNA Mini Kit (QIAGEN Inc., Valencia, CA) ifølge produsentens retningslinjer. Virus-RNA ble reverstranskribert til cDNA ved anvendelse av QIAGEN <® >OneStep RT-PCR Kit (QIAGEN Inc., Valencia, CA) ifølge produsentens retningslinjer. PCR-amplifisering av det kodende området i de åtte influensavirusgenene i dette cDNA ble utført som beskrevet tidligere (Crawford et al., 2005) ved anvendelse av universelle, genspesifikke primersett (primersekvensene er tilgjengelige ved forespørsel). De resulterende DNA-amplikonene ble anvendt som templater for automatisert sekvensering i et ABI PRISM <® >3100 automatisert DNA-sekvenseringsinstrument ved anvendelse av syklussekvensering og fargestoffmerkede terminatorer (Applied Biosystems, Foster City, CA). Nukleotidsekvensene ble analysert ved anvendelse av Lasergene 6 Package <® >(DNASTAR, Inc., Madison, WI). Nukleotidsekvensen for virus gjenvunnet fra infiserte hunder ble sammenlignet med sekvensene til viruset i inokulatet for å avgjøre hvorvidt det hadde skjedd endringer under replikasjonen i luftveiene. ;;EKSEMPEL 12 – KLINISK SYKDOM (REFERANSE) ;Alle de seks virusinokulerte hundene utviklet en forbigående feber (rektumtemperatur > 39<o>C) i de første to dagene p.i., men ingen viste luftveissymptomer som hoste eller neseutflod i løpet av observasjonstiden på seks dager. De narreinokulerte hundene forble klinisk friske. ;;EKSEMPEL 13 – VIRUSUTSKILLELSE (REFERANSE) ;Influensa A-nukleoprotein ble påvist i munnsvelgprøven oppsamlet fra én av de virusinokulerte hundene 24 timer p.i. Munnsvelgprøvene oppsamlet fra én hund 72, 84 og 120 timer p.i., og en annen hund 108, 120 og 132 timer p.i. var positive for virus, vurdert ved kvantitativ sanntids RT-PCR (tabell 11). Det absolutte antall influensa M-genkopier pr. μ vattpenselekstrakt økte med tiden fra 3-6 dager p.i. Intet virus ble påvist i rektumprøvene. ;;EKSEMPEL 14 – POSTMORTEMUNDERSØKELSER (REFERANSE) ;I mosetning til den tidligere eksperimentelle infeksjonen ved anvendelse av spesifikt patogenfrie beagler (Crawford et al., 2005) hadde de virusinokulerte hundene av blandingsrase pneumoni, vist ved totalanalyse og histologisk analyse av lungene fra dag 1-6 p.i. I tillegg til pneumoni hadde hundene rinitt, trakeitt, bronkitt og bronkiolitt, på tilsvarende måte som beskrevet i naturlig infiserte hunder (Crawford et al., 2005). Det forelå epitelnekrose og erosjon av belegget i luftveier og bronkiekjertler, med infiltrasjon av nøytrofile celler og makrofager i de submukosale vev (fig. 5, øvre felter). ;Immunhistokjemisk analyse påviste viralt H3-antigen i epitelcellene i bronkier, bronkioler og bronkiekjertler (f.eks. 5, nedre felter). Ingen superinfeksjon med bakterier forelå. ;Luftveisvevene fra de to narreinokulerte hundene var normale. ;;EKSEMPEL 15 – VIRUSREPLIKASJON I LUFTRØR OG LUNGER (REFERANSE) Luftveiene og lungene var positive for virus, vurdert ved kvantitativ sanntids RT-PCR, i alle hundene fra 1-6 dager p.i. (tabell 12). Det absolutte antall influensa M-genkopier pr. μ luftrørshomogenat økte fra 1-5 dager p.i. og avtok så på dag 6. Det absolutte antall M-genkopier pr. μ lungehomogenat avtok fra 1-6 dager p.i. Generelt inneholdt luftrørene > 1 log10 mer virus enn lungen på hver av de seks dagene p.i. ;;;;<a>Tidspunkt for oppsamling av munnsvelgprøver fra hundene etter inokulering med A/canine/FL/43/04 (H3N8)-virus ;<b>Normaliseringsforhold ble beregnet ved å dividere M (Ct) med GAPDH (Ct) for hvert vattpenselekstrakt. ;<c>Det absolutte antall matriksgenkopier pr. μ vattpenselekstrakt. ;;;;;<a>Tidspunkt for oppsamling av vev fra hundene etter inokulering med A/canine/FL/43/04 (H3N8)-virus. <b>Normaliseringsforhold ble beregnet ved å dividere M (Ct) med GAPDH (Ct) for hvert vevshomogenat. ;<c>Det absolutte antall matriksgenkopier pr. μl vevshomogenat. ;;MATERIALER OG FREMGANGSMÅTER FOR EKSEMPEL 16 (REFERANSE) ;;Virusstammer ;Hundeinfluensavirusstammer samt stammer med opphav i fugl, hest og menneske (opplistet i tabell 15) ble oppformert i egg med embryoer eller MDCK-celler, og infektiviteten ble titrert ved sluttpunktsfortynning i hønseembryoer eller ved plakkanalyse. Hurtig viruskvantifisering ble utført ved hemagglutinasjonsanalyse med røde blodceller (erytrocytter) fra kalkun. ;;Diagnostiske prøver ;Lungevev fra i alt 60 hunder, oppsamlet fra tilfeller med mistanke om viral luftveissykdom i løpet av året 2005, ble analysert for nærvær av hundeinfluensavirus. ;;RNA-ekstraksjon fra hundevevsprøver ;Blokker av lungevev med en vekt på mellom 20 og 30 mg ble homogenisert med en engangs vevsmaler (Kendal). Total-RNA ble ekstrahert ved anvendelse av et kommersielt sett (RNeasy Mini Kit, Qiagen, Valencia, CA) og eluert i et sluttvolum på 60 μl ifølge produsentens retningslinjer. ;;Utforming av primere og prober ;Flersekvenssammenstillinger av H3- og M-genet fra forskjellige undertyper og fra forskjellige arter ble utført ved anvendelse av programmet CLUSTAL X (versjon 1.8). Matriks (M)-primere og –probe ble utvalgt fra de konserverte områdene i de kjente sekvensene, som tilsvarer forskjellige undertyper av influensa A-virus, mens det H3-hemagglutiningenspesifikke primer-probesett ble utvalgt for spesifikt å stemme med influensa A-virusgener fra hest og hund, og ikke med de homologe genene fra fugl og menneske (tabell 13). Programvare for primerutforming (OLIGOS versjon 9.1) og de nettbaserte analyseverktøyene som leveres av EXIQON (http://Inatools.com) ble anvendt for beregning av Tm og prediksjon av sekundærstruktur, så vel som av selvhybridisering. Et konservert område i et 18S rRNA-gen ble anvendt som endogen intern kontroll for nærvær av RNA ekstrahert fra hundevevsprøvene. De ferdigfremkalte TaqMan <®>-analysereageksene for eukaryot 18S rRNA (VIC/TAMRA) (Applied Biosystems) ble anvendt for sanntidspåvisning av 18S rRNA i vevsprøver. ;Betingelser for sanntids RT-PCR ;En entrinns sanntids RT-PCR ble utført ved anvendelse av Quantitect Probe RT-PCR Kit med ROX som passivt referansefargestoff (Qiagen, Valencia, CA). I hver santids RT-PCR-reaksjon ble 5 μl RNA-prøve anvendt som templat og blandet med en reaksjonsblanding som inneholdt 10 μl 2X QuantiTech Probe RT-PCR Master Mix, 0,2 μl QuantiTech RT Mix, primere (0,4 μM sluttkonsentrasjon for H3-genet og 0,6 μM sluttkonsentrasjon for M-genet), prope (0,1 μM sluttkonsentrasjon for H3-genet og 0,2 μM sluttkonsentrasjon for M-genet) og RNasefritt vann i et sluttvolum på 20 μl. Entrinns sanntids RT-PCR ble utført i et Mx3005P Real-Time QPCR-system (Stratagene). ;Syklusbetingelsene omfattet et reverstranskripsjonstrinn ved 50<o>C i 30 min. Etter et innledende denatureringstrinn ved 95<o>C i 15 min. for aktivering av HotStarTaq DNA-polymerase ble amplifisering utført over 40 sykluser som omfattet denaturering (94<o>C i 15 sek.) og hybridisering/forlengelse (60<o>C i 30 sek.). Fluorescenssignalene fra FAM (emisjonsbølgelengde 516 nm for påvisning av H3 og M) og VIC (emisjonsbølgelengde 555 nm for påvisning av 18S rRNA) ble erholdt én gang pr. syklus ved avsluttelsen av forlengelsestrinnet. Oppsamling og analyse av data fra sanntids PCR-analysen ble utført ved anvendelse av programvaren Mx3005P versjon 2.02 (Stratagene). ;;Spesifisiteten av H3-primer/probesett for hundeinfluensa (H3N8) og universaliteten av M-primer/probesett for type A influensavirus ;For å analysere spesifisiteten av primer/probesettene ble RNA ekstrahert fra fleree kjente undertyper av influensa A-virus anvendt som templat i sanntids RT-PCR-analysen (tabell 15). ;;RNA-standard for bestemmelse av yteevnen til sanntids RT-PCR ;Genene fra hundeinfluensa A-virus (A/canine/Florida/242/2003(H3N8)) ble anvendt for fremstilling av PCR-amplikonene for H3 (nt 1-487) og M (nt 1-276) ved anvendelse av primere koblet til T7-promoter (tabell 13). De rensede PCR-amplikonene fra H3-genet og M-genet ble så anvendt som templat for in vitro-transkripsjon ved anvendelse av Riboprobe in vitro Transcription System-T7 (Promega) ifølge produsentens retningslinjer. Konsentrasjonen av de transkriberte RNA ble beregnet ved å måle absorbansen ved 260 nm. Disse RNA ble så seriefortynnet 10 ganger for oppnåelse av et konsentrasjonsområde fra 10<8 >til 10 kopier/ μl for utførelse av sensitivitetsanalyser. Videre ble det fremstilt en standardkurve ved å fremstille logaritmen til konsentrasjonen av det opprinnelige RNA-templat (kopier/ μl) mot terskelsyklusen (Ct) erholdt for hver fortynning, for å bestemme den totale yteevne til sanntids RT-PCR. ;;Sammenlignende sensitivitetsanalyser mellom sanntids RT-PCR og direktegen Flu A-analysesettet ;Lagersuspensjoner av virus fra to virusstammer, innbefattet A/Wyoming/3/2003 (H3N2) med 10<6,67 >EID50/ml (HA=64) og A/canine/Florida/242/2003 (H3N8) ved 10<7,17 >EID50/ml (HA=16) ble anvendt for deteksjonsterskelanalysen. Logaritmisk fortynning av prøver i fosfatbufret saltvann (PBS) (125 μl) ble anvendt i et sett for hurtig påvisning av influensa A-antigen, Directigen Flu A (Beckton, Dickinson og Company) ifølge produsentens retningslinjer. Hver Directigen Flu A-analyseinnretning har en H1N1-influensaantigenflekk i membranens sentrum, som utvikles som en purpurfarget flekk og viser integriteten av analysen, som bygger på et monoklonalt antistoff mot nukleoprotein (NP). Utvikling av et purpurfarget triangel som omgir flekken viser nærvær av influensa-NP i den analyserte prøven. Intensiteten av det purpurfargede siganlet fra triangelet ble vurdert som (omriss av triangelet), + (svakt farget triangel), ++ (mørkt purpurfarget triangel) og +++ (svært mørkt purpurfarget triangel). Virus-RNA ble ekstrahert fra 125 μl porsjoner av hver virusfortynning ved anvendelse av QIAamp Viral RNA Mini Kit (Qiagen, valencia, CA) og eluert i et sluttvolum på 50 μl. 5 μl ekstrahert virus-RNA ble analysert ved sanntids RT-PCR for å sammenligne sensitiviteten med sensitiviteten til Directigen Flu A-settet. ;;EKSEMPEL 16 (REFERANSE) ;Sanntids RT-PCR-analysen for hundeinfluensa bygger på informasjon fra tre molekylære prober som er rettet mot 18S rRNA fra vertscellen, så vel som M og H3 fra influensa A-virusgenomet (tabell 14). Amplifisering av vertsgenet viser prøvens kvalitet og integritet. Kliniske prøver, obduksjonsprøver og laboratorieprøver som inneholder hundeinfluensavirus (H3N8) forventes å gi amplifiseringssignal med alle de tre probene. Prøver som gir amplifiseringssignal med M- og 18S rRNA-probene, men ikke med H3-proben, vil indikere et influensavirus undertype H3 med opphav i menneske, gris eller fugl eller fra en ikke-H3-undertype. Disse sjeldne tilfellene kan løses ved RT-PCR og anvendelse av universelle HA-primere for dannelse av amplikon cDNA som kan analyseres ved sekvensering. Korrekt oppsamlede og håndterte prøver uten influensa A-virus gir kun 18S rRNA-amplifiseringssignal. Situasjoner i hvilke kun 18S rRNA-proben og H3-proben gir amplifiseringssignal viser, med mindre annet kan bevises, man må enten vise en falsk negativ med M-prober eller en falsk positiv for H3. Endelig viser prøver som ikke gir amplifiseringssignaler med de tre probene feilaktig prøveoppsamling, degradering, feilaktig RNA-ekstraksjon eller nærvær av inhibitorer mot polymerasene som anvendes i PCR. ;For å analysere spesifisiteten av H3-primer/probesettet for hundeinfluensa A-virus (H3N8) og universaliteten av M-primer/probesettet for type A influensa ble flere undertyper av influensa A-virus analysert ved sanntids RT-PCR. Resultatene viser at H3-primer/probesettet kun ga positivt amplifiseringssignal med hundeinfluensa (H3N8). ;Ingen signifikante falske positive eller uspesifikke amplifiseringssignaler ble observert for andre undertyper eller for humane H3-stammer. M-primer/probesettet ga positivt amplifiseringssignal med alle de analyserte stammene (tabell 15). Disse resultatene viste at H3-primer/probesettet spesifikt påviser hundeinfluensa A-virus (H3N8), mens M-primer/probesettet påviser flere undertyper av influensavirus type A. ;Yteevnen til sanntids RT-PCR-analyser ble evaluert ved sluttpunktsfortynning av in vitro-transkribert M- og H3-RNA. Som forventet økte terskelsyklusen (Ct) i direkte korrelasjon med fortynningen av RNA-standardene. Fluorescenssignalene kan påvises ved RNA-standardfortynninger for M og H3 ned til 10<3 >henholdsvis 10<2 >kopier/ μl (fig. 6A og 6B). Standardkurvene for M-genet og H3-genet ble fremstilt ved å fremstille logaritmen til utgangs-RNA-konsentrasjonen som funksjon av terskelsyklusen (Ct) som ble erholdt for hver fortyning (fig. 6C og 6D). Vinkelkoeffisienten til standardkurven anvendes for bestemmelse av PCR-reaksjonens effektivitet, som teoretisk sett er eksponensiell, 100 % amplifiseringseffektivitet impliserer en dobling av amplikonkonsentrasjonen for hver syklus. Standardkurver med en vinkelkoeffisient på mellom tilnærmet -3,1 og -3,6 er typisk akseptable for de fleste anvendelser som krever nøyaktig kvantifisering (90-110 % reaksjonseffektivitet). En Rsq-verdi er tilpasningen av alle data til standardkurvefremstillingen. Dersom alle data ligger perfekt på linjen vil Rsq være 1,00. Etter hvert som måleverdiene fjerner seg fra linjen avtar Rsq. En Rsq-verdi > 0,985 er akseptabel for de fleste analyser. M-standardkurven viste en vinkelkoeffisient på -3,576 (effektivitet = 90,4 %) og Rsq = 1,00, mens H3-standardkurven ga en vinkelkoeffisient på -3,423 (effektivitet = 95,9 %) og Rsq = 0,999. Disse verdiene viser tilfredsstillende amplifiseringseffektivitet og total yteevne for sanntids RT-PCR-analysene. Vi tilskriver den lavere effektiviteten og sensitiviteten for M-primer/probesettet sammenlignet med H3-primer/probesettet den N gangers degenererthet av M-primersekvensene som er nødvendig for å sikre en bred dekning av variabiliteten i M-gensekvensene i virus fra flere undertyper, verter og linjer. ;Sensitiviteten av sanntids RT-PCR-analysen ble også sammenlignet med den kommersielle analysen for hurtig påvisning av antigen (Directigen Flu A). Logaritmiske fortynnigner av A/Wyoming/3/2003 (H3N2) og A/canine/Florida/242/2003 (H3N8) ble analysert med Directigen Flu A og ved sanntids RT-PCR. Resultatene fra Directigen Flu A viste at sensitiviteten mot begge de to virusstammene er tilnærmet 100 gangers fortynning av lagervirussuspensjonene som ble anvendt i disse eksperimentene (fig. 7). Signalene (purpur farge) dannet med hundevirusprøvene (A/canine/Florida/242/2003: 10<6.x >PFU/ml) var mye svakere enn signalene fra humant virus (A/Wyoming/3/2003: 10<7.x >PFU/ml), i samsvar med den lavere viruskonsentrasjonen i disse prøvene. Alternativt kan et lavere signal for hundeinfluensa tilskrives den molekylære spesifisiteten av monoklonale antistoffer mot NP, dvs. dårlig konservering av aminosyrene i NP-epitopen i hundeinfluensa A-virus. ;Sanntids RT-PCR av M-genet ga Ct-verdier over terskelen med 10 og 30 PFU-ekvivalenter av virus pr. reaksjon for A/canine/Florida/242/2003 og A/Wyoming/3/2003 (tabell 16). Forskjellen mellom sensitivitetsverdiene for to virusstammer skyldes forskjeller i det opprinnelige virustiter. En sammenligning av H3-gendeteksjonen mellom hundeinfluensavirus og humant influensavirus ble ikke utført, siden H3-primer/probesettet i vår sanntids RT-PCR-analyse kun amplifiserer hundeinfluensa A-virus. RT-PCR var 10<5 >ganger mer sensitivt enn settet for hurtig antigenpåvisning. ;For evaluering av yteevnen til RT-PCR-analysen for obduksjonsprøver fra hunder med akutt luftveissykdom ble 60 prøver av hundelungevev innlevert i året 2005 analysert for nærvær av hundeinfluensa A-virus ved sanntids RT-PCR. I alt 12 av 60 prøver (20 %) var positive for både M-genet og H3-genet, mens de gjenværende 48 prøvene ga negativt resultat for både M-genet og H3-genet. Forsøk på isolering av virus ble utført ved inokulasjon av egg og MDCK-celler for evaluering av sanntidsanalysens spesifisitet, to av tolv prøver som var positive for hundeinfluensa ved RT-PCR ga hundeinfluensavirus (resultater ikke vist, manuskript under forberedelse). Selv om alle vev var oppsamlet fra hunder med en historie med alvorlig luftveissykdom ga de fleste av prøvene intet hundeinfluensavirus, verken ved sanntids PCR eller ved konvensjonell isolering, noe som tyder på høy forekomst av andre patogene luftveisorganismer som Bordetella bronchiseptica, valpesykevirus eller parainfluensavirus. Den entrinns sanntids RT-PCR-analyse som beskrives heri utgjør en hurtig, følsom og kostnadseffektiv tilnærming for påvisning av hundeinfluensa A-virus (H3N8). Hurtig laboratoriediagnose av infeksjoner med hundeinfluensa A-virus (H3N8) i sykdommens tidlige stadier kan gi informasjon som er relevant for den kliniske behandling av pasienten og for den kliniske enheten. ;;;p obe ;;;*Bemerk: Store bokstaver = LNA (låst nukleinsyre)-rester, r = a eller g, k = g eller t, understreket = T7-promotersekvens
REFERANSER
US patentskrift nr. 5 106 739
US patentskrift nr. 5 034 322
US patentskrift nr. 6 455 760
US patentskrift nr. 6 696 623
US patentskrift nr. 4 683 202
US patentskrift nr. 4683 195
US patentskrift nr. 4 800 159
US patentskrift nr. 4 965 188
US patentskrift nr. 5 994 056
US patentskrift nr. 6 814 934
US patentskrift nr. 6 436 408
US patentskrift nr. 6 398 774
US patentskrift nr. 6 177 082
Offentliggjort US patentsøknad nr. 20040078841
Offentliggjort US patentsøknad nr. 20040067506
Offentliggjort US patentsøknad nr. 20040019934
Offentliggjort US patentsøknad nr. 20030177536
Offentliggjort US patentsøknad nr. 20030084486
Offentliggjort US patentsøknad nr. 20040123349
Greyhound Daily News, 1/28/99. National Greyhound Association (NGA), Abilene, Kansas http://www.NGAgreyhounds.com.
Personlig meddelelse, Dr. William Duggar, veterinær ved Palm Beach Kennel Club, West Palm Beach, Florida.
Altschul, S.F. et al. (1990) ”Basic Local Alignment Search Tool” J. Mol. Biol.
215:402-410.
Altschul, S. F. et al (1997) “Gapped BLAST and PSl-BLAST: A New Generation of Protein Database Search Programs” Nucl Acids Res , 25:3389-3402.
An, G. (1987) “Binary Ti vectors for plant transformation and promoter analysis” Methods Bnzymol. 153:292-305.
Beltz, G. A., Jacobs, K, A.. Eickbush, T. EL Cherbas, P. T., Kafatos, F, C. (1983) “Isolation of fiiiltigene families and determination of homologies by filter hybridization methods” Methods of Enzymology , R. Wu, L. Grossman and K, Moldave [eds.] Academic Press, New York 100:266-285.
Burleson, F. et al (1992) Virology: A Laboratory Manual (Academic Press).
Byars. N.E., A.C. Allison (198?) “Adjuvant formulation for use in vaccines to elicit both cellmediated and humoral immunity” Vaccine 5:223-228.
Crawford, P.C. et al. (2005) ‘Transmission of equine influenza torus to dogs” Science 310:482-485.
Chang, C.P. et al (1976) “Influenza virus isolations from dogs during a human epidemic in Taiwan” Ini J Zoonoses 3:61-64.
Daeso, C.C. et al (1984) “Sporadic occurrence of zoonotic swine influenza virus infections” J Clin Microbiol 20:833-835.
de Boer, H. A., Comstock, L. J., Yasser. M. (1983) “The tac promoter: a functional hybrid derived from the trp and lac promoters” Proc. Nail Acad , Sci. USA 80(1 ):21-25. Felsenstein, J. (1989) Cladisiics 5:164.
Fields et al. (1946( Fields Virology , 3. utgave, Lippincott-Raven publishers.
Ford, R.B., Vaden, S.L. (1998) “Canine infectious tracheobronchitis” I Infectious Diseases of the Dog and Cat, 2. utgave, C.E. Greene, utgiver, W.B. Saunders Co., Philadelphia, PA, s. 33-38.
Fouchier et al, (2000) 10urnal of Clinical Microbiology 38 (11):4096-410L
Good, X. et al (1994) “Reduced ethylene synthesis by transgenic tomatoes expressing S~ adeuosylmethi onine hydrolase” Plant Molec. Biol 26:781-790.
Guan, Y. et al (2004) “H5N1 influenza: a protean pandemic threat” Proc Natl Acad Sci U S A 101:8156-8161.
Guo, Y. et al (1992) “Characterization of a new avian-like influenza A virus from horses in China” Virology 188:245-255.
Houser, R.B. et al (1980) “Evidence of prior infection with influenza ATexas/77 (H3N2) virus in dogs with clinical parainfluenza” Can J Comp Med 44:396-402.
Karasin, A.I. ei al (2000) ‘'Isolation and characterization of H4N6 avian influenza viruses from pigs with pneumonia in Canada” J Virol 74:9322-9327.
Karlin S. and Altschul, S. F. (1990) “Methods for Assessing the Statistical Significance of Molecular Sequence Features by Using General Scoring Schemes.” Proc. Natl. Acad. Set. USA 87:2264-2268.
Karlin S. and Aitschul. S. F. (1993) “Applications and Statistics for Multiple High-Scoring Segments in Molecular Sequences” Proc. Nail Acad Scl USA 90:5873-5877.
Kawaoka, Y. ei al, (1989) “Avian-to-human transmission of the FBI gene of influenza A viruses in the 1957 and 1968 pandemics” J Virol 63:4603-4608.
Keawcharoen, J. et al (2004) “Avian influenza H5N1 in tigers and leopards” Em erg Infect Dis 10:2189-2191.
Kendal, A.P. et al. (1982) i Concent and Procedures for Laboratory-based Incluenza Surveillance. A.P. Kendal, M.S. Pereira, J.J. Skehel, red. (U.S. Department of Health and Human Services, Centers for Disease Control and Prevention and Pan-American Health Organization, Atlanta, GA, United States) s. B17-B35.
Kilboume. E.D. et al. (1975) “Demonstration of antibodies to both hemagglutinin and neuraminidase antigens of H3N2 influenza A vims in domestic dogs" Intervirology 6:315-318.
Kimura. K. et al (1998) “Fatal case of swine influenza virus in an immunocompetent host" Mayo Clin Proc 73:243-245.
Klimov, A. I. et al. (1992a) “Sequence changes in the live attenuated, cold-adapted variants of influenza A/Leningrad/134/57 (H2N2) virus” Virology 186:795-797.
Klimov A. et al. (1992b) “Subtype H7 influenza viruses: comparative antigenic and molecular analysis of the HA-, M-, and NS-genes” Arch Virol 122:143-161. Kovacova, A. et al (2002) “Sequence similarities and evolutionary relationships
virus A hemagglutinins" Virus Genes 24:57-63.
Ruiken, T. et al. (2004) “Avian H5N1 influenza in cats” Science 306:241,
Kumar, S. et al. (2004) "MEGA3: Integrated software for Molecular Evolutionary" Genetics Analysis and sequence alignment” Brief Bioinform 5:150-163.
Lee, L.G. et al. (1993) “Allelic discrimination by nick-translation PCS. with florogenic probes” Nucleic Acids Res. 21(16):3761 -3766.
Lewin, B. (1985) Genes II. John Wiley & Sons, Inc., p. 96.
Lipatov, A.S. et al (2004) “Influenza: emergence and control” J Virol 78:8951-8959.
Livak, K. J. et al (1995) “Oligonucleotides with fluorescent dyes at opposite ends provide a quenched probe system useful for detecting PCR product and nucleic acid hybridization” PCR Methods Appl 4(6): 357-362,
Maniatis, T., E.F. Fritsch L Sambrook (1982) “Nuclease Bal3<1 >Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor, NY.
Matrosovich, M. et al. (2000) “Early alterations of the receptor-binding properties of Hl, H2, and H3 avian influenza virus hemagglutinins after their introduction into mammals” J Virol 74:8502-8512.
Maertzdorf et al , (2004) Clin Microbiol. 42(3);98l-986.
Merrifield, R.B. (1963) “Solid Phase Peptide Synthesis. L The Synthesis of a Tetrapeptide” J. Amer. Chem. Soc. 85:2149-2154.
Nikitin, A. ef al (1972) ‘Epidemiological studies of A-Hong Kong~68 virus infection in dogs” Bull World Health Organ 47:471-479.
Nobusawa, E. et al (1991) “Comparison of complete amino acid sequences and receptorbinding properties among 13 serotypes of hemagglutinins of influenza A viruses” Virology 182:475-485.
Patriarca, P.A. et al (1984) “Lack of significant person-to person spread of swine influenzalik eirus following fetal infection in an immunocompromised child” Am J Epidemiol 119:152-158.
Payungpom S. et al. (2006a) “Detection of canine influenza A virus (H3N8) RNA by real-time RT-PCR” (under utarbeidelse for Journal of Clinical Microbiology).
Payungpom S. et al. (2006b) “Isolation and characterization of influenza A subtype H3N8 viruses from dogs with respiratory disease in a shelter and veterinary clinic in Florida” (under utarbeidelse for Emerging infectious Diseases).
Peiris. M. et al (1999) “Human infection with influenza H9N2” Lancet 354:916-917.
Peiris, J.S. ei al. (2004) “Re-emergence of fatal human influenza A subtype H5N1 disease” Lancet 363:617-61 9.
Posnett, D. N. et al. (1988) “A Novel Method for Producing Anti-peptide Antibodies” J. Biol.
Chem. 263(4):1719-1725.
Putnam, Bob (February 10, 1999) “TWO illnesses seen in death of dogs” St Petersburg Times .
Reid, AHL et al (2004) “Evidence of an absence: the genetic origins of the 1918 pandemic influenza virus” Nat Rev Microbiol 2:909-914.
Rowe, T, et al. (1999) "Detection of antibody to avian influenza Å (H5N1) virus in human serum by using a combination of serologic assays” J Clin Microbiol 37: 937-943.
Saiki. R. (1985) “Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia” Science 230:1350-1354.
Sambrook, J. et al. (1989) “Plasmid Vectors” i: Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 2. utgave, s- 1.82-1.104. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York.
Subbarao, K. et al. (199S) “Characterization of an avian influenza A (H5N1) virus isolated from a child with a fatal respirator}' illness” Science 279:393-396.
Suzuki, Y. et al. (2000) “Sialic acid species as a determinant of the host range of influenza A viruses” J Virol 74:11825-11831.
Tam, J. P. (1988) “Synthetic Peptide Vaccine Design: Synthesis and Properties of a High-Density Multiple Antigenic Peptide System” PNAS USA 85(15);5409-5413.
Top, Jr., F.H. et al. (1977) “Swine influenza A at Fort Dix, New Jersey (January-February 1976). IV. Summary and speculation” J Infect Dis 136 Suppl:S376-S380.
Vines, A. et al (1998) “The role of influenza A virus hemagglutinin residues 226 and 228 in receptor specificity and host range restriction” J Virol 72:7626-7631.
Wagner, R. ei al. (2002) “N-Glycans attached to the stem domain of haemagglutmia efficiently regulate influenza A virus replication”, I Gen Virol 83:601-609.
Webby, R. et al. (2004) “Molecular constraints to interspecies transmission of viral pathogens” Nat Med 10:S77-S81.
Webster, R.G. (1998) “Influenza: an emerging disease” Emerg Infect Bis. 4:436-441.
Webster, R.G. ei al (1992) “Evolution and. ecology of influenza A viruses” Microbiol Rev.
56 :152-179.
Weis. W. et al (1988) “Structure of the influenza virus haemagglutinin complexed with its receptor, sialic acid” Nature 333:426-431.
Womble, D.D. (2000) “GCG: The Wisconsin Package of sequence analysis programs” Methods Mol Biol 132:3-22.
Xu, D., McElroy, D., Thornburg. R. W., Wu. R. ei al (1993) “Systemic induction of a potato ρί<η>2 promoter by wounding, methyl jasmonate, and abscisic acid in transgenic rice plants” Plant Molecular Biology 22:573-588.
Yang, T. T. et al (1996) “Optimized Codon Usage and Chromophore Mutations Provide Enhanced Sensitivity with the Green Fluorescent Protein” Nucleic Acid Research 24(22};4592-4593.
Yoon K-Y. et al. (2005) ’’Influenza virus infection in racing greyhounds” Emerg Infect Dis. 11:1974-1975.

Claims (23)

Kravsett
1. Et isolert hundeinfluensa A virus, hvor influensaviruset omfatter et hemagglutinin (HA) polypeptid eller et polynukleotid som koder for et HA polypeptid, hvor HA polypeptidet omfatter aminosyresekvensen som vist i SEQ ID NO: 62, eller en modne sekvens derav, hvor den N-terminale aminosyresignalsekvensen av en full-lengde sekvens er fjernet.
2. Influensaviruset ifølge krav 1, hvor influensaviruset har en HA serotype av H3.
3. Influensaviruset ifølge krav 1, hvor influensaviruset har serotypen H3N8.
4. Influensaviruset ifølge krav 1, hvor influensaviruset omfatter et polynukleotid som har nukleotidsekvensen som vist i SEQ ID NO: 61.
5. Influensaviruset ifølge krav 1, som videre omfatter et polypeptid eller et polynukleotid som koder for et polypeptid, hvor polypeptidet omfatter aminosyresekvensen som vist i en hvilken som helst av SEQ ID NO: 48, 50, 52, 54, 56, 58 eller 60.
6. Influensaviruset ifølge krav 1, hvor influensaviruset tilveiebringes i en fysiologisk akseptabel bærer eller buffer.
7. Influensaviruset ifølge et hvilket som helst av de foregående kravene, hvor influensaviruset er svekket eller inaktivert.
8. En polynukleotiduttrykkskonstruksjon som omfatter regulatoriske elementer og et polynukleotid som omfatter et hundeinfluensa A viruspolynukleotid som er valgt fra: (i) et polynukleotid som koder for HA polypeptidet som omfatter aminosyresekvensen som vist i SEQ ID NO: 62; (ii) et polynukleotid som koder for en modne sekvens av HA-polypeptidet som omfatter aminosyresekvensen som vist i SEQ ID NO: 62, hvor den N-terminale aminosyresignalsekvensen av en full-lengde sekvens er fjernet; og (iii) et polynukleotid som har nukleotidsekvensen som vist i SEQ ID NO: 61.
9. Et isolert antistoff som binder seg spesifikt til et hundeinfluensa A viruspolypeptid som er valgt fra: (i) et HA polypeptid som omfatter aminosyresekvensen som vist i SEQ ID NO: 62 og (ii) en modne sekvens av HA polypeptidet som omfatter aminosyresekvensen som vist i SEQ ID NO: 62, hvor den N-terminale aminosyresignalsekvensen av en fulllengde sekvens er fjernet.
10. Et isolert in vitro celle som omfatter et influensavirus ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 7 eller et polynukleotid som omfatter et hundeinfluensa A viruspolynukleotid som er valgt fra: (i) et polynukleotid som koder for HA polypeptidet som omfatter aminosyresekvensen som vist i SEQ ID NO: 62; (ii) et polynukleotid som koder for en modne sekvens av HA polypeptidet som omfatter aminosyresekvensen som vist i SEQ ID NO: 62, hvor den N-terminale aminosyresignalsekvensen av en full-lengde sekvens er fjernet; og (iii) et polynukleotid som har nukleotidsekvensen som vist i SEQ ID NO: 61.
11. Et reassortant virus som omfatter et hundeinfluensa A viruspolynukleotid som er valgt fra: (i) et polynukleotid som koder for HA polypeptidet som omfatter aminosyresekvensen som vist i SEQ ID NO: 62; (ii) et polynukleotid som koder for en modne sekvens av HA polypeptidet som omfatter aminosyresekvensen som vist i SEQ ID NO: 62, hvor den N-terminale aminosyresignalsekvensen av en full lengde sekvens er fjernet; og (iii) et polynukleotid som har nukleotidsekvensen som vist i SEQ ID NO: 61.
12. En rekombinant virusvektor eller rekombinant polynukleotidvektor som omfatter et isolert polynukleotid som omfatter et hundeinfluensa A viruspolynukleotid som er valgt fra: (i) et polynukleotid som koder for HA polypeptidet som omfatter aminosyresekvensen som vist i SEQ ID NO: 62; (ii) et polynukleotid som koder for en modne sekvens av HA polypeptidet som omfatter aminosyresekvensen som vist i SEQ ID NO: 62, hvor den N-terminale aminosyresignalsekvensen av en full-lengde sekvens er fjernet; og (iii) et polynukleotid som har nukleotidsekvensen som vist i SEQ ID NO: 61.
13. Vektoren ifølge krav 12, hvor den virale vektoren er fra adenovirus, avipoks, herpesvirus, vaksiniavirus, kanaripoks, entomopoks, svinepoks, eller Vest-Nil-Virus.
14. Den rekombinante virusvektoren ifølge krav 12, hvor den virale vektoren er en kanaripoksvirusvektor.
15. Polynukleotidvektoren ifølge krav 12, hvor polynukleotidvektoren er en virusvektor.
16. En sammensetning som omfatter et immunogen av et influensavirus ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 7, som eventuelt ytterligere omfatter et adjuvans, hvor immunogenet er i stand til å indusere en immunrespons mot et influensavirus som er i stand til å infisere et hundedyr og hvor immunogenet omfatter en hundeinfluensavirus som definert i et hvilket som helst av kravene 1 til 7, eller et hundeinfluensaviruspolynukleotid som omfatter et hundeinfluensa A viruspolynukleotid som er valgt fra: (i) et polynukleotid som koder for HA polypeptidet som omfatter aminosyresekvensen som vist i SEQ ID NO: 62; (ii) et polynukleotid som koder for en modne sekvens av HA polypeptidet som omfatter aminosyresekvensen som vist i SEQ ID NO: 62, hvor den N-terminale aminosyresignalsekvensen av en full-lengde sekvens er fjernet; og (iii) et polynukleotid som har nukleotidsekvensen som vist i SEQ ID NO: 61, eller en polynukleotiduttrykkskonstruksjon som definert i krav 8, eller et polypeptid som omfatter et hundeinfluensa A viruspolypeptid som er valgt fra: (i) et HA polypeptid som omfatter aminosyresekvens som vist i SEQ ID NO: 62; og (ii) en moden sekvens av HA-polypeptidet som omfatter aminosyresekvensen som vist i SEQ ID NO: 62, hvor den N-terminale aminosyresignalsekvensen av en full-lengde sekvens er fjernet, eller et reassortant virus som definert i krav 11, eller en vektor som definert i et hvilket som helst av kravene 12 til 15, hvor sammensetningen er tilveiebrakt i en fysiologisk akseptabel bærer eller buffer.
17. En hundeinfluensavaksine for bruk i å indusere en immunrespons i et hundedyr mot et hundeinfluensavirus, hvor vaksinen omfatter et influensavirus ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 7, eller en polynukleotiduttrykkskonstruksjon ifølge krav 8, eller et isolert polypeptid som omfatter et hundeinfluensa A viruspolypeptid som er valgt fra: (i) et HA polypeptid som omfatter aminosyresekvensen som vist i SEQ ID NO: 62; og (ii) en modne sekvens av HA polypeptidet som omfatter aminosyresekvensen som vist i SEQ ID NO: 62, hvor den N-terminale aminosyresignalsekvensen av en full-lengde sekvens er fjernet, eller et reassortant virus ifølge krav 11, eller en vektor ifølge et hvilket som helst av kravene 12 til 15, eller en sammensetning ifølge krav 16.
18. Vaksinen for bruk ifølge krav 17, hvor vaksinen omfatter en farmasøytisk akseptabel bærer eller fortynningsmiddel.
19. Vaksinen for bruk ifølge krav 17, hvor hundedyret er en tamhund.
20. Vaksinen for bruk ifølge krav 17, hvor vaksinen videre omfatter et adjuvans.
21. Vaksinen for bruk ifølge krav 17, hvor vaksinen er formulert for å være administrerbart parenteralt.
22. Vaksine for bruk ifølge krav 21, hvor vaksinen er formulert for å være administrerbart subkutant, intraperitonealt eller intramuskulært.
23. Vaksine for bruk ifølge krav 17, hvor vaksinen er formulert til å være administrerbart nasalt eller oralt.
NO20082257A 2005-10-19 2006-10-19 Isolert hundedyr influensa Avirus, polynukleotid-ekspresjonskonstruksjon, isolert antistoff, isolert celle, reassortant virus og rekombinant virusvektor, samt sammensetning og hundeinfluensavaksine NO346351B1 (no)

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US72844905P 2005-10-19 2005-10-19
US75488105P 2005-12-29 2005-12-29
US75916206P 2006-01-14 2006-01-14
US76145106P 2006-01-23 2006-01-23
US77908006P 2006-03-03 2006-03-03
US40941606A 2006-04-21 2006-04-21
PCT/US2006/041061 WO2007047938A2 (en) 2005-10-19 2006-10-19 Influenza viruses able to infect canids, uses thereof

Publications (2)

Publication Number Publication Date
NO20082257L NO20082257L (no) 2008-07-18
NO346351B1 true NO346351B1 (no) 2022-06-20

Family

ID=37885846

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO20082257A NO346351B1 (no) 2005-10-19 2006-10-19 Isolert hundedyr influensa Avirus, polynukleotid-ekspresjonskonstruksjon, isolert antistoff, isolert celle, reassortant virus og rekombinant virusvektor, samt sammensetning og hundeinfluensavaksine
NO2022022C NO2022022I1 (no) 2005-10-19 2022-06-09 Fedratinib, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, or a pharmaceutically acceptable hydrate thereof, in particular fedratinib dihydrochloride monohydrate

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO2022022C NO2022022I1 (no) 2005-10-19 2022-06-09 Fedratinib, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, or a pharmaceutically acceptable hydrate thereof, in particular fedratinib dihydrochloride monohydrate

Country Status (15)

Country Link
EP (2) EP2407480B1 (no)
JP (3) JP2009512449A (no)
KR (2) KR101548436B1 (no)
CN (3) CN117587038A (no)
AU (1) AU2006304747B2 (no)
BR (1) BRPI0617735B1 (no)
CA (2) CA2626489C (no)
ES (2) ES2496315T3 (no)
HK (2) HK1118563A1 (no)
IL (2) IL190906A (no)
MX (2) MX2008005234A (no)
NO (2) NO346351B1 (no)
NZ (4) NZ567809A (no)
RU (2) RU2520081C2 (no)
WO (1) WO2007047938A2 (no)

Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2570758T3 (es) * 2005-04-21 2016-05-20 Univ Florida Materiales y métodos para el control de enfermedades respiratorias en cánidos
US20080241184A1 (en) * 2005-08-25 2008-10-02 Jules Maarten Minke Canine influenza vaccines
US7682619B2 (en) 2006-04-06 2010-03-23 Cornell Research Foundation, Inc. Canine influenza virus
ES2744126T3 (es) 2006-10-25 2020-02-21 Intervet Int Bv Vacuna contra la gripe felina y método de uso
CA2791396C (en) * 2010-03-10 2019-08-27 Intervet International B.V. Method for protecting against disease caused by secondary pathogens
CN101838708B (zh) * 2010-03-30 2012-07-18 华南农业大学 一种检测犬流感的方法
CN102220293B (zh) * 2011-05-26 2012-12-19 中国农业科学院上海兽医研究所 犬流感重组病毒及其制备方法和应用
CN103242433B (zh) * 2012-02-14 2016-12-14 中国医学科学院病原生物学研究所 一种腺病毒非结构蛋白免疫原、其抗体及应用
US10080792B2 (en) 2013-09-23 2018-09-25 Engen Bio, Inc. Influenza vaccine and therapy
CN104436157A (zh) 2013-09-23 2015-03-25 恩金生物有限公司 流感疫苗和治疗
CA2967532A1 (en) * 2014-11-24 2016-06-02 Intervet International B.V. Inactivated equine influenza virus vaccines
JP2015120709A (ja) * 2015-01-09 2015-07-02 ラボラトリオ アヴィメキシコ エスエー ディーイー シーヴィーＬａｂｏｒａｔｏｒｉｏ Ａｖｉ−Ｍｅｘ，Ｓ．Ａ． Ｄｅ Ｃ．Ｖ． 遺伝子組み換え不活性化ウィルスベクターワクチン
CN104911150B (zh) * 2015-05-27 2018-05-01 华南农业大学 一种h3n2犬流感病毒的单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立及其单克隆抗体的制备与应用
CN106636475B (zh) * 2017-03-01 2020-05-22 中国农业大学 一种检测北美h3n8亚型犬流感病毒的引物组及其应用
US20230190242A1 (en) * 2020-05-18 2023-06-22 Thomas Jefferson University Viral sample collection
CN112410467A (zh) * 2020-11-23 2021-02-26 深圳市赛格诺生物科技有限公司 一种检测甲型和乙型流感病毒的冻干型荧光rt-pcr试剂及方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004057021A2 (en) * 2002-12-19 2004-07-08 UNIVERSITé LAVAL Molecular methods and compositions for detecting and quantifying respiratory viruses
WO2006073436A2 (en) * 2004-04-29 2006-07-13 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Mass tag pcr for multiplex diagnostics

Family Cites Families (33)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5034322A (en) 1983-01-17 1991-07-23 Monsanto Company Chimeric genes suitable for expression in plant cells
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4965188A (en) 1986-08-22 1990-10-23 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences using a thermostable enzyme
US4800159A (en) 1986-02-07 1989-01-24 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences
US5106739A (en) 1989-04-18 1992-04-21 Calgene, Inc. CaMv 355 enhanced mannopine synthase promoter and method for using same
US5994056A (en) 1991-05-02 1999-11-30 Roche Molecular Systems, Inc. Homogeneous methods for nucleic acid amplification and detection
US5484719A (en) 1991-08-26 1996-01-16 Edible Vaccines, Inc. Vaccines produced and administered through edible plants
US5612487A (en) 1991-08-26 1997-03-18 Edible Vaccines, Inc. Anti-viral vaccines expressed in plants
UA48104C2 (uk) 1991-10-04 2002-08-15 Новартіс Аг Фрагмент днк, який містить послідовність,що кодує інсектицидний протеїн, оптимізовану для кукурудзи,фрагмент днк, який забезпечує направлену бажану для серцевини стебла експресію зв'язаного з нею структурного гена в рослині, фрагмент днк, який забезпечує специфічну для пилку експресію зв`язаного з нею структурного гена в рослині, рекомбінантна молекула днк, спосіб одержання оптимізованої для кукурудзи кодуючої послідовності інсектицидного протеїну, спосіб захисту рослин кукурудзи щонайменше від однієї комахи-шкідника
RU2193065C2 (ru) * 1994-03-14 2002-11-20 Мерк энд Ко. Инк. Конструкция днк (варианты), днк-вектор, иммуногенная композиция против вируса гриппа, способ индукции иммунного ответа, вакцина и способ вакцинации
GB9524395D0 (en) 1995-11-29 1996-01-31 Nickerson Biocem Ltd Promoters
US6252139B1 (en) 1996-07-18 2001-06-26 The Salk Institute For Biological Studies Method of increasing growth and yield in plants
US6063385A (en) 1997-11-07 2000-05-16 Wisconsin Alumni Research Foundation DNA vaccine for parvovirus
US6472375B1 (en) 1998-04-16 2002-10-29 John Wayne Cancer Institute DNA vaccine and methods for its use
GB9809666D0 (en) * 1998-05-06 1998-07-01 Isis Innovation Modified viruses
US6177082B1 (en) 1998-08-13 2001-01-23 The University Of Pittsburgh-Of The Commonwealth System Of Higher Education Cold-adapted equine influenza viruses
DE69929825T2 (de) 1998-11-24 2006-11-02 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Wurzelspezifische promotoren und ihre anwendung
EP1035209A1 (en) * 1999-03-06 2000-09-13 ARTEMIS Pharmaceuticals GmbH Stable recombinant influenza viruses free of helper viruses
GB9916794D0 (en) * 1999-07-16 1999-09-22 Isis Innovation In vitro virus reconstitution
MXPA02001009A (es) * 1999-07-30 2002-10-31 Isis Innovation Virus de la influenza atenuado util como vacuna.
US6398774B1 (en) 1999-09-29 2002-06-04 Heska Corporation Intranasal delivery system
DE19960843A1 (de) 1999-12-16 2001-06-28 Florian Grundler Wurzelspezifischer Promotor
US6455760B1 (en) 2000-11-16 2002-09-24 The Salk Institute Of Biological Studies Expression of flavin-containing monoxygenases in plants
US20040067506A1 (en) 2000-12-04 2004-04-08 Ben Scheres Novel root specific promoter driving the expression of a novel lrr receptor-like kinase
DK1427444T3 (da) * 2001-07-27 2013-11-04 Zoetis W Llc West-nil-vaccine
ES2806412T3 (es) * 2002-02-13 2021-02-17 Wisconsin Alumni Res Found Señal para el empaquetamiento de vectores del virus de la gripe
US7285656B2 (en) 2002-04-26 2007-10-23 Her Majesty The Queen In Right Of Canada, As Represented By The Minister Of Natural Resources Canada, Canadian Forest Service Root-specific conifer gene promoter and its use
US20040123349A1 (en) 2002-12-20 2004-06-24 Qi Xie SINAT5, an Arabidopsis thaliana gene promotes ubiquitin related degradation
JP2004285019A (ja) * 2003-03-25 2004-10-14 Kyoto Prefecture 生体外異物の不活化方法
US8592197B2 (en) 2003-07-11 2013-11-26 Novavax, Inc. Functional influenza virus-like particles (VLPs)
ATE469972T1 (de) * 2003-12-23 2010-06-15 Medimmune Llc Multiplasmid-system zur erzeugung des grippevirus
ES2570758T3 (es) * 2005-04-21 2016-05-20 Univ Florida Materiales y métodos para el control de enfermedades respiratorias en cánidos

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004057021A2 (en) * 2002-12-19 2004-07-08 UNIVERSITé LAVAL Molecular methods and compositions for detecting and quantifying respiratory viruses
WO2006073436A2 (en) * 2004-04-29 2006-07-13 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Mass tag pcr for multiplex diagnostics

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BIOLOGICAL ABSTRACTS, 1 January 1900, Philadelphia, PA, US; abstract no. PREV200300495526, CATTOLI G ET AL: "Plaque morphology of Italian H7N1 LPAI isolates in MDCK cells and in primary cells of different avian species." XP002461905 *
BIOLOGICAL ABSTRACTS, 1 January 1900, Philadelphia, PA, US; abstract no. PREV200600343510, CASTLEMAN WILLIAM L ET AL: "Pathologic findings in dogs infected with newly emerged canine H3N8 influenza virus" XP002442668 *
CRAWFORD PC. ET AL. Transmission of equine influenza virus to dogs. Science. 2005, vol. 310, no. 5747, side 482-485., Dated: 01.01.0001 *
DATABASE MEDLINE 1 January 1900 (1900-01-01), FONI EMANUELA ET AL: "Detection of influenza A virus by RT-PCR and standard methods in experimental infection of Ducks.", XP002461906, Database accession no. NLM15782624 *
PEEK SF. ET AL. Acute respiratory distress syndrome and fatal interstitial pneumonia associated with equine influenza in a neonatal foal. J Vet Intern Med. 2004, vol. 18, no. 1, side 132-134. , Dated: 01.01.0001 *
WOOD JM. ET AL. The standardization of inactivated equine influenza vaccines by single-radial immunodiffusion. J Biol Stand. 1983, vol. 11, no. 2, side 133-136., Dated: 01.01.0001 *

Also Published As

Publication number Publication date
WO2007047938A3 (en) 2008-03-20
KR20080093018A (ko) 2008-10-17
NZ627888A (en) 2016-03-31
HK1118563A1 (en) 2009-02-13
JP6220361B2 (ja) 2017-10-25
RU2020100036A (ru) 2021-07-09
ES2496315T3 (es) 2014-09-18
IL190906A0 (en) 2008-11-03
CN117587038A (zh) 2024-02-23
BRPI0617735A2 (pt) 2011-08-02
WO2007047938A2 (en) 2007-04-26
CN104017775B (zh) 2023-05-30
CA2626489C (en) 2020-10-27
JP2009512449A (ja) 2009-03-26
CA3090231A1 (en) 2007-04-26
EP1945659A2 (en) 2008-07-23
NZ735684A (en) 2020-04-24
MX341842B (es) 2016-09-02
EP1945659B1 (en) 2012-08-15
AU2006304747B2 (en) 2013-10-03
JP2012254080A (ja) 2012-12-27
NO2022022I1 (no) 2022-06-09
RU2711807C2 (ru) 2020-01-22
NZ567809A (en) 2012-06-29
EP2407480B1 (en) 2014-07-16
ES2393406T3 (es) 2012-12-21
NZ717751A (en) 2019-09-27
KR20130048800A (ko) 2013-05-10
MX2008005234A (es) 2008-09-23
AU2006304747A1 (en) 2007-04-26
JP2015186478A (ja) 2015-10-29
NO20082257L (no) 2008-07-18
CN101563361B (zh) 2014-01-29
HK1167660A1 (zh) 2013-01-11
IL226253A0 (en) 2013-06-27
IL190906A (en) 2017-03-30
RU2008119461A (ru) 2009-12-27
KR101548436B1 (ko) 2015-08-28
EP2407480A1 (en) 2012-01-18
CN104017775A (zh) 2014-09-03
CA2626489A1 (en) 2007-04-26
RU2014101481A (ru) 2015-07-27
EP1945659B9 (en) 2013-05-29
RU2520081C2 (ru) 2014-06-20
CN101563361A (zh) 2009-10-21
JP5974397B2 (ja) 2016-08-23
BRPI0617735B1 (pt) 2022-05-17
KR101597534B1 (ko) 2016-02-26
IL226253A (en) 2017-08-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10258686B2 (en) Materials and methods for respiratory disease control in canines
NO20180601A1 (no) Isolert hunde-influensavirus A som er i stand til å infisere et hundedyr, isolert polynukleotid som omfatter en nukleotidsekvens og polynukleotidekspresjonskonstruksjon.
NO346351B1 (no) Isolert hundedyr influensa Avirus, polynukleotid-ekspresjonskonstruksjon, isolert antistoff, isolert celle, reassortant virus og rekombinant virusvektor, samt sammensetning og hundeinfluensavaksine
RU2811752C2 (ru) Материалы и методы, используемые для лечения респираторных заболеваний у собак
US11865172B2 (en) Materials and methods for respiratory disease control in canines
RU2802222C2 (ru) Вирус гриппа, способный инфицировать собачьих, и его применение
AU2018201367B2 (en) Materials and methods for respiratory disease control in canines