KR20100065405A - 인플루엔자 바이러스 벡터의 패키징을 위한 신호 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 인플루엔자 바이러스 벡터에 대한 패키징 (혼입) 신호, 및 바이러스 및 세포내에서 인플루엔자 바이러스 및 외래 핵산을 전달하고 유지시키기 위해 상기 신호를 사용하는 방법을 제공한다.

Description

인플루엔자 바이러스 벡터의 패키징을 위한 신호 {Signal for Packaging of Influenza Virus Vectors}
<정부 권리에 대한 진술>
본 발명은, 적어도 부분적으로는 미국 정부의 보조금으로 이루어진 것이다 (국립 보건원 (NIH)으로부터의 허가 AI47446호). 미국 정부는 본 발명에 대해 특정 권리를 갖는다.
인플루엔자 A 및 B 바이러스의 게놈은 (-) 극성을 지닌 8개의 단일가닥 RNA 절편으로 구성되어 있고, 이중 2개는 외피 (envelope) 당단백질인 헤마글루티닌 (hemagglutinin; HA) 및 뉴라미니다제 (neuraminidase; NA)를 코딩한다. 인플루엔자 바이러스의 복제는, 비리온 (virion) 표면상의 바이러스성 HA 단백질이 세포성 시알산 함유 수용체와 결합함으로써 개시된다. 비리온은 수용체에 결합한 후, 내포작용 (endocytosis)에 의해 숙주 세포에 유입된다. 후기 엔도좀 (endosome)의 산성 환경으로 인해, HA의 구조 변화가 촉발됨으로써 바이러스 외피와 엔도좀 막이 융합되기 시작하고, M2 이온 채널이 활성화되어 양성자가 비리온 내부로 유입된다. 비리온의 내부가 낮은 pH에 노출되면 M1 단백질과 리보핵단백질 복합체 (RNP) 사이의 산-불안정성 상호작용이 방해받는 것으로 생각되며, 그 결과 세포질로의 RNP 방출이 최고조에 이르게 된다. 그 후 RNP는 핵으로 수송되고, 여기서 바이러스성 mRNA 및 바이러스성 게놈이 합성된다. mRNA가 세포질로 유입되어, 바이러스성 단백질이 합성된다. 핵단백질 (NP)은 핵으로 유입되어 새로이 합성된 vRNA를 3종의 중합효소 서브유닛 단백질 (PA, PB1, PB2)과 함께 캡시드로 둘러싸서 RNP를 형성한다. M1 및 NS2 단백질이 존재하는 경우에는 RNP가 핵 밖으로 유출된다. 3종의 막-결합 단백질 (HA, NA 및 M2)과 RNP는 상호작용하여 버딩 (budding)에 의해 새로운 비리온을 형성한다. NA는 세포성 당접합체 및 바이러스성 당단백질로부터 시알산을 제거함으로써 감염된 세포로부터의 바이러스 방출을 담당한다 (Lamb et al., 2000).
A형 바이러스는 HA (H1 내지 H15) 및 NA (N1 내지 N9) 항원성에 기초하여 아형으로 분류된다. 2가지 상이한 A형 바이러스로 감염된 세포에서는 다양한 유전자 절편의 조합을 지닌 유형내 재배열물질 (reassortant)이 생성된다 (Wright et al., 2000). 그러나, 인간 개체군에서 A형 바이러스와 B형 바이러스 둘 다가 순환하고 있더라도 A형과 B형 바이러스 사이의 유형간 재배열물질은 검출되지 않았다.
연구자들이 A형과 B형 바이러스 사이의 재배열물질을 실험실에서 생성하기 위해 시도했으나 성공하지 못했다 (Kaverin et al., 1983; Mikheera et al., 1982; Tobita et al., 1983). 무스터 등(Muster et al., 1991)은 NA 절편의 비코딩 영역이 B형 바이러스의 비구조 (NS) 유전자 영역으로 치환된 절편을 함유하는 돌연변이체 A형 바이러스를 생성하였다. 이 돌연변이체 바이러스는 야생형 바이러스보다 느리게 복제되고 역가도 더 낮기는 하지만, 이러한 바이러스의 생성은 B형 NS 절편의 비코딩 영역이 RNA 전사 및 복제 수준에서 A형 인플루엔자 바이러스 성분과 상용성임을 시사한다. 이와는 반대로, A형 인플루엔자 바이러스 RNA 절편의 3' 및 5' 비코딩 영역에 플랭킹된 외래 코딩 절편을 지닌 RNA 절편은 계대가 반복된 후에 비리온 내에 안정하게 유지되지 않았다 (Luytjes et al., 1989). 무스터 등 (1991)은 또한, 돌연변이체 바이러스가 마우스에서 감쇄되며, 돌연변이체 바이러스로 감염된 동물은 야생형 바이러스의 접종에 대해 내성이 있음을 개시하고 있다.
인플루엔자 바이러스의 복제 동안에 연결된 서열의 혼입 및(또는) 유지를 위한 인플루엔자 바이러스 서열을 확인하는 방법이 필요한 실정이다.
발명의 요약
본 발명은 인플루엔자 바이러스를 위한 혼입 서열 ("패키징 신호" 또는 vRNA 캡시드화 신호) 및 임의로는 이종 핵산 절편을 포함하는 단리된 재조합 핵산 분자 (폴리뉴클레오티드), 예를 들어 벡터를 제공한다. 일반적으로, 혼입 서열은 약 150 내지 약 250 개 뉴클레오티드로, 각 인플루엔자 vRNA 절편의 한쪽 또는 양쪽 말단에 존재한다. 한 실시양태에서, 인플루엔자 바이러스 혼입 서열은 NA 코딩 서열의 N-말단에 상응하는 서열을 비롯한 NA vRNA의 3' 말단에 상응하는 서열 (예를 들어, 3' 비코딩 서열의 19 개 뉴클레오티드 및 적어도 NA에 대한 처음 19 개 코딩 뉴클레오티드에 상응하는 뉴클레오티드를 비롯한 A형 NA vRNA의 3' 말단의 37 개 뉴클레오티드), 및 임의로는 NA 코딩 영역의 C-말단에 상응하는 서열을 비롯한 NA vRNA의 5' 말단에 상응하는 혼입 서열 (예를 들어, 5' 비코딩 서열의 28 개 뉴클레오티드 및 적어도 NA의 3'의 39 개 코딩 뉴클레오티드에 상응하는 39 개의 뉴클레오티드를 비롯한 A형 NA vRNA의 5' 말단의 67 개 뉴클레오티드)을 포함한다. 다른 실시양태에서, 인플루엔자 바이러스 혼입 서열은 NS 코딩 서열의 N-말단에 상응하는 서열을 비롯한 NS vRNA의 3' 말단에 상응하는 서열을 포함한다. 또다른 실시양태에서, 인플루엔자 바이러스 혼입 서열은 HA 코딩 영역의 C-말단에 상응하는 서열을 비롯한 HA vRNA의 5' 말단에 상응하는 서열 (예를 들어, 5' 비코딩 서열의 45 개 뉴클레오티드 및 적어도 HA의 3'의 80 개 코딩 뉴클레오티드에 상응하는 80 개의 뉴클레오티드를 비롯한 A형 HA vRNA의 5' 말단의 135 개 뉴클레오티드), 및 임의로는 HA 코딩 영역의 N-말단에 상응하는 서열을 비롯한 HA vRNA의 3' 말단에 상응하는 혼입 서열 (예를 들어, 3' 비코딩 서열의 33 개 뉴클레오티드 및 적어도 HA의 처음 3 개 코딩 뉴클레오티드에 상응하는 3 개의 뉴클레오티드를 비롯한 A형 HA vRNA의 3' 말단의 36 개 뉴클레오티드)을 포함한다. 추가의 실시양태에서, 인플루엔자 바이러스 혼입 서열은 PB2 코딩 영역의 C-말단에 상응하는 서열을 비롯한 PB2 vRNA의 5' 말단에 상응하는 서열을 포함한다. 다른 실시양태에서, 인플루엔자 바이러스 혼입 서열은 M 코딩 서열의 N-말단에 상응하는 서열을 비롯한 M vRNA의 3' 말단에 상응하는 서열 (예를 들어, 3' 비코딩 서열의 26 개 뉴클레오티드 및 M 코딩 영역의 N-말단에 상응하는 서열의 221 개 뉴클레오티드를 비롯한 A형 M vRNA의 3' 말단의 247 개 뉴클레오티드), 및 M 코딩 영역의 C-말단에 상응하는 혼입 서열을 비롯한 M vRNA의 5' 말단에 상응하는 서열 (예를 들어, 3' 비코딩 서열의 23 개 뉴클레오티드 및 M 코딩 영역의 C-말단에 대한 마지막 219 개 뉴클레오티드에 상응하는 서열의 219 개 뉴클레오티드를 비롯한 A형 M vRNA의 5' 말단의 242 개 뉴클레오티드)을 포함한다. 다른 실시양태에서, 인플루엔자 바이러스 혼입 서열은 NS 코딩 영역의 N-말단에 상응하는 서열을 비롯한 NS vRNA의 5' 말단에 상응하는 서열 (예를 들어, 3' 비코딩 서열 및 적어도 NS 코딩 영역의 N-말단에 상응하는 처음 30 개의 뉴클레오티드를 비롯한 서열), 및 NS 코딩 영역의 C-말단에 상응하는 혼입 서열을 비롯한 NS vRNA의 5' 말단에 상응하는 서열 (예를 들어, 5' 비코딩 서열 및 적어도 NS 코딩 영역의 C-말단에 상응하는 서열의 마지막 30 개의 뉴클레오티드를 비롯한 서열)을 포함한다. 한 실시양태에서, 인플루엔자 바이러스 혼입 서열은 PB1 코딩 영역의 N-말단에 상응하는 서열을 비롯한 PB1 vRNA의 5' 말단에 상응하는 서열, 및 PB1 코딩 서열의 C-말단에 상응하는 혼입 서열을 비롯한 PB1 vRNA의 5' 말단에 상응하는 서열을 포함한다. 또다른 실시양태에서, 인플루엔자 바이러스 혼입 서열은 PA 코딩 영역의 N-말단에 상응하는 서열을 비롯한 PA vRNA의 5' 말단에 상응하는 서열, 및 PA 코딩 영역의 C-말단에 상응하는 혼입 서열을 비롯한 PA vRNA의 5' 말단에 상응하는 서열을 포함한다. 본원에 사용된 인플루엔자 바이러스 "혼입 서열"은, 상응하는 (동종) 3' 및 5' 비코딩 영역과 함께 vRNA 내에 존재하는 경우에 상기 서열을 포함하는 핵산 분자를 비리온 내로 혼입시켜 계대가 반복되는 동안 비리온 내에 상기 분자를 유지시키는 서열이다.
본원의 하기에 기재된 바와 같이, NA 혼입 서열은 절단된 NA 절편을 갖는 돌연변이 바이러스에서 플라스미드-기재의 역유전학을 이용하여 확인되었다. NA 혼입 서열은 NA vRNA의 3' 말단을 포함하는 영역에 존재하며, 이는 NA 코딩 영역의 일부로 확장된다. 따라서, 이 영역은 관심있는 오픈 리딩 프레임 발현용 재조합 RNA (예를 들어, 관심있는 오픈 리딩 프레임을 포함하는 이종 핵산 절편)를 비롯한 돌연변이 NA RNA (예를 들어, 내부 결실 및(또는) 삽입 영역을 갖는 RNA) 뿐만 아니라 야생형 NA RNA를 패키징하고 유지하는 데 유용하다.
또한 본원에 기재된 바와 같이, A형 인플루엔자 바이러스와 B형 인플루엔자 바이러스 사이의 유형간 불화합성에 대한 통찰을 얻기 위하여, 역유전학을 이용하여 A형 바이러스 배경에 손상되지 않은 B형 HA 절편을 함유하는 재조합체를 생성하였다. 그러나, B형 HA 절편이 A형 폴리머라제 복합체에 의해 전사되었음에도 불구하고 바이러스가 생산되지 않았다. A형 HA의 비코딩 서열에 의해 플래킹된 B형 HA의 전체 코딩 서열을 포함하는 키메라 HA 절편을 가진 A형 바이러스는 생존할 수 있지만 말단에서만 복제된다. 신호 펩티드를 코딩하는 서열 또는 A형 바이러스의 막횡단/세포질 영역, 또는 둘 모두와 함께 A형 비코딩 영역을 프로세싱하는 키메라 HA를 함유하고, 영역의 나머지 절편은 B형 HA로부터 유래된 일련의 A형-기재의 바이러스가 생성된다. 이러한 바이러스 모두는 세포 배양액에서 106의 조직 배양 감염 투여량50/ml를 초과하는 범위까지 증식하지만, A형 HA 서열을 보다 많이 포함하는 바이러스가 보다 양호하게 복제되며, 이는 단백질-단백질 상호작용이 중요한 역할을 한다는 것 또는 바이러스가 효율적으로 증식할 때 비리온으로의 HA 절편의 혼입이 증가한다는 것을 제안한다. 마우스에서는 이러한 A/B 키메라 바이러스 모두가 야생 A형 또는 B형 바이러스에 비해 감소한다. 또한, 키메라 바이러스로 비강내 면역화된 동물은 치사량의 야생형 B형 바이러스로 공격하였을 때 모두 생존하였으며, 이는 신규 생백신 바이러스 고안에 대한 유망한 접근법을 입증한다.
따라서, 특정 인플루엔자 바이러스 절편, 동종 3' 및 5' 비코딩 서열 (영역) 및 이종 핵산 절편에 대한 혼입 서열을 포함하는 본 발명의 단리된 핵산 분자를 PA, PB1, PB2, NP, HA, NA, M 중 하나 이상에 대한 바이러스 단백질 및(또는) 바이러스 단백질 코딩 벡터 (예를 들어, M1 및(또는) M2, 및(또는) NS), 및 PA, PB1, PB2, NP, HA, NA, M 중 하나 이상에 대한 vRNA 또는 vRNA 생산용 벡터 (예를 들어, M1 및(또는) M2, 및(또는) NS)의 존재하에 vRNA 생산용 벡터에서 세포로 도입시킬 때, 재조합 바이러스가 생산된다. 이어서, 이 재조합 바이러스는 세포를 감염시키는 데 사용될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 핵산 분자에 상응하는 vRNA가 10％ 이상 (보다 바람직하게는 30％ 이상, 보다 더 바람직하게는 50％ 이상)의 효율, 또는 상응하는 야생형 vRNA보다 높은 효율로 비리온에 혼입된다. 한 실시양태에서, 핵산 분자는 야생형 vRNA 및 이종 핵산 절편에 상응하는 서열을 포함하고, 상기 이종 핵산 절편은 vRNA에 대한 코딩 영역에 상응하는 vRNA의 서열에 도입되며, 이 때 삽입은 혼입 서열을 실질적으로 파괴하지 않는 것이 바람직하다. 예를 들어, 이종 핵산 절편은 NA 코딩 영역의 처음 300개의 뉴클레오티드에 상응하는 서열 뒤에 도입된다.
다른 실시양태에서, 3' NA 혼입 서열은 N-말단 NA 코딩 영역의 1 내지 183개의 뉴클레오티드, 1 내지 90개의 뉴클레오티드, 1 내지 45개의 뉴클레오티드, 1 내지 21개의 뉴클레오티드, 1 내지 19개의 뉴클레오티드 또는 19 내지 183개 중 임의의 개수의 뉴클레오티드에 상응하며, NA 개시 코돈에서 돌연변이를 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, 5' NA 혼입 서열은 NA의 C-말단 코딩 영역에 포함된 C-말단 NA 코딩 영역의 39, 78 또는 157개, 또는 1 내지 157개 중 임의의 개수의 3' 뉴클레오티드에 상응하는 서열에 상응한다. 다른 실시양태에서, 5' HA 혼입 서열은 NA의 C-말단 코딩 영역에 포함된 C-말단 HA 코딩 영역의 75, 80, 268, 291 또는 518개, 또는 1 내지 518개 중 임의의 개수의 3' 뉴클레오티드에 상응하는 서열에 상응한다. 3' HA 혼입 서열은 N-말단 HA 코딩 영역의 1 내지 3개, 1 내지 6개, 1 내지 9개, 1 내지 15개, 1 내지 216개, 1 내지 468개 또는 1 내지 468개 중 임의의 개수의 뉴클레오티드에 상응한다. 한 실시양태에서, 3' PB1 혼입 서열은 N-말단 PB1 코딩 영역의 1 내지 250개의 뉴클레오티드, 1 내지 200개의 뉴클레오티드, 1 내지 150개의 뉴클레오티드 또는 1 내지 250개 중 임의의 개수의 뉴클레오티드에 상응한다. 한 실시양태에서, 5' PB1 혼입 서열은 C-말단 PB1 코딩 영역의 3' 뉴클레오티드, 예를 들어 3'의 1 내지 250개의 뉴클레오티드, 1 내지 200개의 뉴클레오티드, 1 내지 150개의 뉴클레오티드 또는 1 내지 250개 중 임의의 개수의 뉴클레오티드에 상응한다. 한 실시양태에서, 3' PA 혼입 서열은 N-말단 PA 코딩 영역의 1 내지 250개의 뉴클레오티드, 1 내지 200개의 뉴클레오티드, 1 내지 150개의 뉴클레오티드 또는 1 내지 250개 중 임의의 개수의 뉴클레오티드에 상응한다. 한 실시양태에서, 5' PA 혼입 서열은 C-말단 PA 코딩 영역의 3' 뉴클레오티드, 예를 들어 3'의 1 내지 250개의 뉴클레오티드, 1 내지 200개의 뉴클레오티드, 1 내지 150개의 뉴클레오티드 또는 1 내지 250개 중 임의의 개수의 뉴클레오티드에 상응한다. 다른 실시양태에서, 3' M 혼입 서열은 N-말단 M 코딩 영역의 1 내지 250개의 뉴클레오티드, 1 내지 242개의 뉴클레오티드, 1 내지 240개의 뉴클레오티드 또는 1 내지 250개 중 임의의 개수의 뉴클레오티드에 상응하며, M 개시 코돈에서 돌연변이를 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, 5' M 혼입 서열은 M의 C-말단 코딩 영역에 포함된 C-말단 M 코딩 영역의 50, 100 또는 220개, 또는 1 내지 250개 중 임의의 개수의 3' 뉴클레오티드에 상응한다. 다른 실시양태에서, 3' NS 혼입 서열은 N-말단 NS 코딩 영역의 1 내지 250개의 뉴클레오티드, 1 내지 200개의 뉴클레오티드, 1 내지 150개의 뉴클레오티드, 1 내지 30개의 뉴클레오티드, 1 내지 20개의 뉴클레오티드 또는 1 내지 250개 중 임의의 개수의 뉴클레오티드에 상응하며, NS 개시 코돈에서 돌연변이를 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, 5' NS 혼입 서열은 NS의 C-말단 코딩 영역에 포함된 C-말단 NS 코딩 영역의 10, 30, 150, 200 또는 250개, 또는 1 내지 250개 중 임의의 개수의 3' 뉴클레오티드에 상응하는 서열에 상응한다.
따라서, 본 발명은 특정 vRNA의 3' 및 5' 비코딩 영역에 해당하는 서열, 해당 vRNA의 혼입 서열 및 이종 핵산 절편을 포함하는 인플루엔자 바이러스 벡터를 제공한다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 벡터는 NA vRNA의 3' 비코딩 영역, 3' 또는 5' NA vRNA 혼입 서열 및 임의로 3' 및 5' NA 혼입 서열 모두, 이종 핵산 절편 및 NA vRNA의 5' 비코딩 영역을 포함한다. 다른 실시양태에서, 벡터는 HA vRNA의 3' 비코딩 영역, 5' 또는 3' HA vRNA 혼입 서열 또는 5' 및 3' HA 혼입 서열 모두, 이종 핵산 절편 및 HA vRNA의 5' 비코딩 영역을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 벡터는 NS vRNA의 3' 비코딩 영역, NS 혼입 서열, 이종 핵산 절편 및 NS vRNA의 5' 비코딩 영역을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 벡터는 M vRNA의 3' 비코딩 영역, 5' 또는 3' M 혼입 서열 또는 5' 및 3' M 혼입 서열 모두, 이종 핵산 절편, 및 M vRNA의 5' 비코딩 영역을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 벡터는 PB2 vRNA의 3' 비코딩 영역, 이종 핵산 서열, PB2 혼입 서열 및 PB2 vRNA의 5' 비코딩 영역을 포함한다. 벡터에서 2 개의 혼입 서열을 사용하는 경우에는, 이종 핵산 절편에 의해 이들을 이격시키는 것이 바람직하다. 각 벡터는 세포에 도입하기 위한 vRNA를 제조하거나, 또는 다른 인플루엔자 바이러스 vRNA 및 바이러스 생성에 필수적인 단백질이 존재하는 세포 내에서 vRNA를 발현시키기 위해 사용될 수 있다.
한 실시양태에서, 이종 핵산 절편은 마커 유전자에 대한 오픈 리딩 프레임에 해당하는 서열을 포함한다. 다른 실시양태에서, 이종 핵산 절편은 치료용 유전자에 대한 오픈 리딩 프레임에 해당하는 서열을 포함한다. 추가의 실시양태에서, 이종 핵산 절편은 병원체 또는 종양 세포의 면역원성 펩티드 또는 단백질, 예컨대 보호용 면역 반응을 일으키기에 유용한 것들에 대한 오픈 리딩 프레임에 해당하는 서열을 포함한다. 예를 들어 이종 핵산 절편은 암 치료 또는 백신에 유용한 면역원성 에피토프를 코딩할 수 있다. 이종 핵산 절편을 포함하는 벡터는 벡터 vRNA의 전사로 NA와 같은 인플루엔자 단백질과의 융합 단백질을 코딩하는 mRNA를 얻는 것으로 제조할 수 있다. 따라서 융합 단백질, 예를 들어 NA의 N-말단 21 개 잔기와의 융합 단백질을 코딩하기 위해 이종 핵산 절편을 바이러스 혼입 서열과 융합할 수 있다는 것이 제안되었다. 융합 단백질은 2 개의 상이한 NA 또는 HA 단백질로부터의 서열을 비롯한 2 개의 상이한 인플루엔자 바이러스 단백질로부터의 서열을 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, 이종 핵산 절편은 오픈 리딩 프레임의 5'에 결합된 IRES에 해당하는 서열을 포함할 수 있다.
다수의 인플루엔자 바이러스 벡터를 갖는 플라스미드-기초 역사 유전학을 이용하여 재조합 바이러스를 제조하기 위해서 벡터 내 인플루엔자 바이러스 DNA는 프로모터에 대해 센스 또는 안티센스 방향으로 존재할 수 있다. 따라서, 벡터는 인플루엔자 바이러스 단백질 (센스) 또는 인플루엔자 바이러스 A, B 또는 C의 vRNA (안티센스), 균주 또는 단리형, 또는 재조합 인플루엔자 바이러스를 코딩할 수 있다 (본원에서 구체적으로 참조 인용한 문헌 [Chapters 45 and 46 of Fields Virology (Fields et al. (eds.), Lippincott-Raven Publ., Philadelphia, PA (1996)] 참조). 바이러스 단백질을 발현하는 데 임의의 프로모터를 사용할 수 있으며, 얻어진 벡터는 특정 인플루엔자 바이러스 단백질에 대한 DNA에 작동가능하게 결합된 프로모터를 포함한다. vRNA를 코딩하는 벡터에 있어 바람직한 프로모터로는 RNA 중합효소 Ⅰ 프로모터, RNA 중합효소 Ⅱ 프로모터, RNA 중합효소 Ⅲ 프로모터, T7 프로모터 및 T3 프로모터가 있으며, 여기에만 제한되지는 않는다. 한 실시양태에서, RNA 중합효소 Ⅰ 프로모터는 인간 RNA 중합효소 Ⅰ 프로모터이다. vRNA를 코딩하는 벡터에 대한 바람직한 전사 종결 서열로는 RNA 중합효소 Ⅰ 전사 종결 서열, RNA 중합효소 Ⅱ 전사 종결 서열 또는 RNA 중합효소 Ⅲ 전사 종결 서열 또는 리보자임이 있으며, 여기에만 제한되지는 않는다. 따라서, vRNA에 대한 백터는 전사 종결 서열에 작동가능하게 결합된 프로모터의 안티센스 방향으로 인플루엔자 바이러스 단백질에 대한 cDNA에 작동가능하게 결합된 프로모터를 포함한다. 본 발명의 벡터를 갖는 재조합 바이러스를 생성하기 위해, 특정 야생형 vRNA 벡터를 제거할 수 있으며, 특정 야생형 바이러스 단백질 코딩 벡터를 대체할 수 있다. 예를 들어, HA 3' 및 5' 비코딩 서열, 5' HA 혼입 서열 및 비인플루엔자 바이러스 단백질 코딩 서열, 예컨대 VSV G 단백질 코딩 서열에 해당하는 이종 핵산 절편을 포함하는 vRNA 벡터의 경우 HA 야생형 vRNA 벡터를 제거할 수 있다. 본 발명의 벡터를 세포에 순차적으로 또는 동시에 도입할 수 있다. 상기 언급한 다수의 벡터, 이 벡터 하나 이상과 접촉하는 숙주 세포, 본 방법으로 제조된 바이러스 및 이 바이러스로 감염된 세포를 포함하는 조성물이 또한 제공된다.
본 발명의 다수의 벡터가 물리적으로 결합될 수 있거나, 또는 각각의 벡터가 개별적인 플라스미드 또는 기타, 예컨대 선형의 핵산 전달 비히클에 존재할 수 있다.
상기 기재한 바와 같이 재조합 DNA 분자로 증대된 숙주 세포는 감염성 복제 결손 인플루엔자 바이러스를 제조하는 데 유용하다. 예를 들어, HA, NA, M1, M2 및 NS2를 코딩하는 재조합 DNA 분자로 안정하게 형질전환된 숙주 세포는 다수의 벡터, 예컨대 PA를 포함하는 vRNA, NP를 포함하는 vRNA, PB1을 포함하는 vRNA, PB2를 포함하는 vRNA 및 임의로 해당 유전자를 포함하는 vRNA를 발현하는 벡터; 및 PA, PB1, PB2 및 NP를 코딩하는 벡터와 접촉할 수 있다.
헬퍼 바이러스 감염이 필요 없는, 본원에서 기재한 바이러스 생성 방법은 바이러스 돌연변이 연구 및 백신 생산 (예를 들어, AIDS, 인플루엔자, B형 간염, C형 간염, 리노바이러스, 필로바이러스, 말라리아, 헤르페스 및 구저병에 대한 백신) 및 유전자 치료 벡터 (예를 들어, 암, AIDS, 탈아미노효소증, 근육퇴행위축증, 오르니틴 트랜스카르바밀라제 결핍증 및 중추 신경계 종양에 대한 치료)에 유용하다.
따라서, 의약 치료 (예를 들어, 백신 또는 유전자 치료)에 사용하기 위한 재조합 바이러스가 제공된다. 예를 들어, 본 발명은 병원체, 예를 들어 세균, 바이러스 또는 기생충, 또는 악성 종양에 대해 개체를 면역시키는 방법을 제공한다. 이 방법은 본 발명의 단리된 바이러스 1 종 이상을 개인을 면역시키기에 유효량으로 임의로 보조제와 함께 개인에게 투여하는 것을 포함한다. 이 바이러스는 병원체에 의해 코딩되는 폴리펩티드 또는 종양 특이적 폴리펩티드를 포함하는 vRNA를 포함한다.
또한 내인성 단백질의 양이 감소하거나 결핍되는 특징을 갖는 증상 또는 질병을 가진 포유류에게서 내인성 단백질의 발현을 증대 또는 증가시키는 방법을 제공한다. 이 방법은 본 발명의 재조합 바이러스를 포유류에게 내인성 단백질의 양을 증대 또는 증가시키는 데 유효한 양으로 포유류에게 투여하는 것을 포함한다. 포유류는 바람직하게는 사람이다.
또한 인플루엔자 바이러스 감염 및(또는) 복제를 억제하는 방법이 제공된다. 이 방법은 NA, M, HA, NS, NP, PB1, PB2, PA 또는 이 분자들의 임의의 조합에 대한 인플루엔자 바이러스 혼입 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자를 포함하는 조성물을 인플루엔자 바이러스 감염 및(또는) 복제를 억제하는 유효량으로 세포와 접촉시키는 것을 포함한다. 세포는 감염되지 않은 세포 또는 인플루엔자 바이러스로 감염된 세포일 수 있다. 혼입 서열은 NA 또는 HA형 중 한 가지 이상에 대해 특이적이다. 한 실시양태에서는, 세포를 M2 채널 억제제 또는 뉴라미니다제 억제제와 더 접촉시킨다.
또한 비리온으로 인플루엔자 바이러스 RNA가 혼입하는 것을 특이적으로 억제하거나 예방하는 제제를 확인하는 방법이 제공된다. 이 방법은 인플루엔자 바이러스에 감염된 세포를 제제와 접촉시키고, 이 제제가 비리온으로 NA vRNA 또는 재조합 NA vRNA와 같은 인플루엔자 바이러스 RNA의 혼입을 특이적으로 억제하거나 예방하는지 검출 또는 측정하는 것을 포함한다. 이 방법에 의해 확인된 제제 및 이들의 용도, 예를 들어 인플루엔자 바이러스 복제를 억제 또는 예방하기 위한 용도 또한 제공된다.
도 1: 내렉틴 세포주의 결합. 각각의 세포주에 있어서, 세포를 디곡시제닌이 표지된 마키아 아무렌시스 (Maakia amurensis; MAA) 또는 삼부쿠스 니그라 (Sambucus nigra; SNA) 렉틴으로 배양하고, 플루오레세인 이소티오시아네이트로 표지된 항디곡시제닌 항체로 배양한 후, FACS로 분석하였다. 굵은 선, MAA 렉틴의 결합; 좁은 선, SNA 렉틴의 결합; 음영 프로파일, (-) 제어 (렉틴 무첨가).
도 2: AL3(MaKS)-13 및 K4(MaKS)-13 돌연변이체의 NA 유전자의 구조. (A) AL3(MaKS)-13은 NA 유전자 코딩 서열의 많은 부분을 제거하는 936 개 뉴클레오티드 결실 (220 내지 1253 개 염기)을 함유한다. 이러한 돌연변이는 또한 TAG 정지 코돈을 결실 밖의 이염기 프레임으로 가져와, 유전자가 NA의 세포질 꼬리, 막횡단 영역, 자루 및 머리부에 상응하는 66-아미노-산 펩티드만을 암호화하도록 한다. (B) K4(MaKS)-13 NA 유전자는 NA 유전자 코딩 서열의 많은 부분을 제거하는 1,066 개 뉴클레오티드 결실 (130 내지 1193 개 염기)을 함유한다. 이러한 돌연변이는 또한 TAG 정지 코돈을 결실 밖의 사염기 프레임으로 가져와, 유전자가 NA 유전자의 세포질 꼬리 및 막횡단 영역에 상응하는 38-아미노-산 펩티드만을 암호화하도록 한다.
도 3: 부모 AM2AL3 바이러스, 부모 K4 바이러스, AL3(MaKS)-13 돌연변이체 및 K4(MaKS)-13 돌연변이체의 시알리다제 활성. 각각의 샘플에 있어서, 바이러스 (5 × 102 PFU)를 형광 시알리다제 기질 (4-메틸엄벨리페릴-α-N-아세틸뉴라민산)의 존재하에 37 ℃에서 1 시간 동안 2배로 배양시켰다. 방출된 4-메틸엄벨리페론의 형광을 360 nm에서 여기되고 460 nm에서 방출되는 형광측정기 (랩시스템즈 (Labsystems) 플로오로스캔 (Fluoroskan) II)로 측정하였다.
도 4a: 야생형 및 NAFLAG 벡터의 개략도.
도 4b: NAFLAG 바이러스 제조 방법의 개략도.
도 4c: NAFLAGWT 바이러스 또는 NA(-) 바이러스에 감염된 MDCK 세포의 면역염색. 상기 세포들을 항-FLAG 모노클로날 항체 (MAb) M2 또는 항-WSN 폴리클로날 항체로 염색하였다.
도 5: 재조합 7 개 절편 인플루엔자 바이러스 및 NAFLAG 바이러스를 위한 경쟁 분석의 개략도.
도 6a: NAFLAG 및 NAFLAGM(-) ("-ATG") 벡터의 개략도.
도 6b: NAFLAGM(-) 바이러스로 감염된 MDCK 세포의 면역염색. 상기 세포들을 항-FLAG 모노클로날 항체 M2 또는 항-WSN 폴리클로날 항체로 염색하였다.
도 7a: FLAG 서열용 NAFLAG 및 NAFLAGM(-)로 감염된 세포의 동일계내 혼성화 분석.
도 7b: NAFLAGWT 바이러스 또는 NAFLAGM(-) 바이러스의 복제 효율.
도 8a: NA 결실 바이러스의 개략도.
도 8b: NA 결실 바이러스의 패키징율.
도 9: 6, 7 또는 8개 절편의 인플루엔자 바이러스의 시간에 따른 바이러스 역가.
도 10: 인플루엔자 바이러스 절편용 혼입 시그널 (점각)을 나타내는 개략도.
도 11a: 인플루엔자 비리온의 전자 현미경 단층촬영도.
도 11b 내지 11f: 인플루엔자 비리온의 전자 현미경 단층촬영도로 발견한 막대균의 컬러 이미지.
도 12: a) A형 인플루엔자 바이러스 및 HA 코딩 서열을 B HA형으로 대체한 A형 바이러스용 바이러스 절편. b) A형 인플루엔자 바이러스 및 HA 코딩 서열을 B HA형으로 대체한 A형 바이러스용 비리온.
도 13: A/B 키메라 HA 구조물의 도면. 뉴만 (Neumann) 등 (1999)이 기재한 바와 같이 pPolI 기재 플라스미드 (pHH21) 중 야생형 A/WSN 바이러스 HA (pPolI-WSN-HA) 및 야생형 B/Lee 바이러스 HA (pPolI-B-HA) 사이에서 키메라 HA 구조물을 제조하였다.
도 14: A/B HA 키메라 바이러스에 의한 B HA형의 표현. 각각의 바이러스로 감염된 MDCK 세포를 감염후 제24시간 고정시키고, 항-A/HA, 항-B/HA 또는 항-A/NP 항체로 면역염색하였다.
도 15: A/B HA 키메라 바이러스의 성장 특성. MDCK 세포를 0.01 TCID50의 MOI에서 각각의 바이러스로 감염시키고, 바이러스의 성장을 모니터링하였다. 유사한 결과를 갖는 두 개의 독립된 실험 중 하나를 나타내었다.
도 16: A/B HA 키메라 바이러스를 접종한 마우스의 B형 바이러스에 대한 항체 반응. a) 마우스 (마우스 3 마리/군)를 각각의 바이러스 (103 TCID50)로 비강 접종시켰다. 접종후 제3주, 코/기관을 세척하고, 혈청 샘플을 마우스로부터 뽑아서 ELISA 측정 중 항-B 바이러스 특이 IgA (코/기관 세척) 또는 IgG (혈청) 항체를 시험하였다. b) 혈청 샘플내 HI 역가도 시험하였다. 각각의 바아는 키메라 바이러스로 감염된 개별적인 마우스를 나타낸다.
도 17: HA vRNA 돌연변이체 및 그의 비리온 혼입 효율의 개략도. 모든 HA RNA 돌연변이체는 (-) 센스 방향을 나타낸다. 각각의 돌연변이체는 HA vRNA (검정 바아)의 정지 코돈, 3' 비코딩 영역의 33 개 뉴클레오티드 및 5' 비코딩 영역의 45 개 뉴클레오티드로 플랭킹된 GFP 오픈 리딩 프레임 (HA 오픈 리딩 프레임을 갖는 프레임내 삽입)을 함유한다. 돌연변이체는 HA 코딩 영역으로부터 유도된 뉴클레오티드의 개수에 따라 명명하였다. HA 코딩 영역은 회색 바아로 나타내었다. 수평 점선은 결실을 나타낸다. 영역의 길이는 비례하지 않는다. HA vRNA 돌연변이체의 VLP로의 혼입 효율은 접종후 제16시간 고정되고 VLP로 감염된 세포 중 GFP로 표현되는 세포의 개수를 NP로 표현되는 세포의 개수로 나누어 측정하였다.
도 18: 플라스미드 발현 돌연변이체 HA vRNA로 형질감염된 293T 세포 중 vRNA 농도. 293T 세포를 pPolIHA(0)GFP(0) 또는 pPolIHA(9)GFP(80) 및 플라스미드 발현 PA, PB1, PB2 및 NP로 형질감염시켰다.
도 19: VSVG(HA)GFP(NA) 바이러스 감염된 세포의 VSV G 및 GFP 발현. MDCK 세포를 VSVG(HA)GFP(NA) 바이러스 또는 WSN 바이러스로 감염시키고 1.0 ％ 아가로오즈로 오버레이시켰다. 감염된 세포를 37 ℃에서 48 시간 동안 배양하고 플라크를 정상광 하에서 (A, B), 그리고 플라크를 식별하기 위한 한정된 정상광 및 형광 하에서 (C, D) 사진촬영하였다. 세포를 고정시키고 3 ％ 포름알데히드 중 0.1 ％ 트리톤-X100 (Triton-X100) 용액이 스며들게 하였다. 벡타스테인 ABC 키트 (Vectastain ABC kit; 미국 캘리포니아주 벌링게임에 소재하는 벡터 (Vector) 제품)를 사용하여 1차 항체 및 바이오티닐화 2차 항체로서 항-VSV G 모노클로날 항체 (E, F), 항-HA 모노클로날 항체 (G, H) 또는 항-NP 모노클로날 항체 (I, J)로 면역 염색하여 바이러스 단백질을 검출하였다.
도 20: VSVG(HA)GFP(NA) 바이러스로의 VSV G 단백질의 혼입. 샘플 완충액 중에서 농축 WNS, VSVG(HA)GFP(NA) 및 VSV 바이러스를 용균하였다. 바이러스 단백질을 2-메르캅토에탄올로 처리하고, 10 ％ SDS-PAGE로 분리한 후 PVDF 멤브레인으로 이송하여 항-VSV G 모노클로날 항체 또는 항-WSN-HA 모노클로날 항체와 배양하였다. 마커 단백질의 분자량을 좌측에 나타내었다.
도 21: BHK, CHO 및 MDCK 세포 중 VSVG(HA)GFP(NA) 바이러스의 성장 곡선. BHK(a), CHO (b) 및 MDCK (c) 세포를 0.001의 MOI에서 바이러스로 감염시켰다. 감염 후 소정 시점에서 MDCK세포를 사용하여 상등액 중 바이러스 역가를 측정하였다. 이 값은 2회 실험의 평균값이다.
도 22: 돌연변이체 NS vRNA 및 이들의 혼입 효율의 개략도.
도 23: 돌연변이체 M vRNA 및 이들의 혼입 효율의 개략도.
도 24: 두 이종 단백질을 발현하는 A) 바이러스 절편 및 B) 비리온의 개략도.
도 25: 두 이종 단백질 HIV gp160 및 gag의 바이러스 절편과 인플루엔자 바이러스의 개략도.
도 26: Cre/lox를 사용한 불능 바이러스 복제 생산 개략도.
본원에서 사용된 "단리 및(또는) 정제된"의 용어는 본 발명의 숙주 세포 또는 바이러스의 시험관내 제조, 단리 및(또는) 정제를 지칭하므로, 생체내 물질과는 관련이 없고, 또는 시험관내 물질로부터 실질적으로 정제된 것을 의미한다. 본원에서 사용된 "실질적으로 순수한"은 대상종이 존재하는 종 가운데 우세하고 (즉, 몰 기준으로 조성물 중 임의의 다른 개별 종보다 더 풍부함), 바람직하게는 실질적으로 정제된 분획은 대상종이 존재하는 모든 거대 분자종의 약 50 ％ 이상 (몰 기준)을 차지하는 조성물이다. 일반적으로, 실질적으로 순수한 조성물은 조성물에 존재하는 모든 거대분자종 가운데 약 50 ％ 초과, 더욱 바람직하게는 약 80 ％ 초과, 더 더욱 바람직하게는 약 85 ％ 초과, 약 90 ％ 초과, 약 95 ％ 초과, 및 약 99 ％ 초과를 차지한다. 가장 바람직하게는 대상종은 본질적으로 균질하게 정제된다 (통상적인 검출 방법으로는 조성물 중에서 오염종을 검출할 수 없음).
본원에서 사용된 "재조합 핵산" 또는 "재조합 DNA 서열 또는 절편"의 용어는 시험관 내에서 후속적으로 화학적으로 변형될 수 있는 공급원으로부터 유도 또는 단리된 핵산, 예를 들어 DNA를 지칭하며, 그의 서열은 자연 발생적이지 않거나 선천적 게놈 중 위치와는 다른 곳에 위치하는 천연 발생 서열에 상응한다. 공급원으로부터 "유도된" DNA의 예로는 유용한 단편으로 확인되거나 RNA로부터 역전사된 후 실질적으로 순수한 형태로 합성된 DNA 서열을 들 수 있다. 공급원으로부터 "단리된" 상기 DNA의 예로는 화학적 수단, 예를 들어 제한 핵산 내부 가수분해 효소를 이용하여 상기 공급원으로부터 절제 또는 제거되어 유전 공학 방법으로 본 발명에 사용하기 위해 추가로 조정, 예를 들어 확장될 수 있는 유용한 DNA 서열을 들 수 있다. 재조합 바이러스는 재조합 핵산으로부터 제조된다.
본원에 사용된 바와 같이, "이종" 핵산 절편, 서열 또는 분자는, 상기 절편, 서열 또는 분자가 참고 핵산 절편, 서열 또는 분자와는 상이한 근원으로부터 유래된 것을 의미한다. 예를 들어, A형 인플루엔자 바이러스 절편 또는 그의 일부분은 상응하는 B형 인플루엔자 바이러스 절편 또는 그의 일부분에 대해 이종이고, 한 인플루엔자 균주 또는 혈청형의 NA 바이러스 절편은 다른 균주 또는 혈청형의 NA 바이러스 절편에 대해 이종이고, 비-인플루엔자 바이러스 핵산 분자, 예를 들어 HIV gp160은 인플루엔자 바이러스 핵산 분자에 대해 이종이다. 반대로, 동종 핵산 절편은 참고 핵산 절편와 동일한 근원으로부터 유래된 것이다. 따라서, 본 발명의 핵산 분자는 서로 동종인 3' 비코딩 영역, 하나 이상의 혼입 서열 및 5' 비코딩 서열을 포함하는 키메라 (chimeric) 분자이다.
본 발명의 문맥상 "효율적인 복제"라는 문구는 시험관내 조직 배양계에서 높은 감염 역가, 예컨대 104 내지 1010 PFU/ml, 바람직하게는 106 내지 109 PFU/ml을 제공하는 것으로 정의된다. 복제 또는 백신 제조에 사용하기 위한 인플루엔자 바이러스의 스크리닝은 당업계에 공지된 바와 같이 임의의 공지된 및(또는) 적합한 분석법을 이용하여 분석할 수 있다. 스크리닝에 적합한 이러한 분석법 (단독으로 또는 임의의 조합으로)으로는 역유전학, 재배열 (reassortment), 상보화 (complementation) 및(또는) 감염과 같은 방법을 이용하는, 바이러스 복제, 불활성화 (예를 들어, 항혈청에 의한 불활성화)에 대한 정량적인 및(또는) 정성적인 측정, 전사, 복제, 번역, 비리온 혼입, 병독성, HA 또는 NA 활성, 바이러스 수율 및(또는) 형태형성이 포함되나, 이로 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 바이러스 복제 분석법을 이용하여 바이러스의 약독화 또는 불활성화에 대해 스크리닝할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Krug, R. M., ed., The Influenza Viruses, Plenum Press, New York, (1989)]를 참조한다.
"시알산"은 9개 이상의 탄소 원자를 포함하는 아미노 당의 일족, 예를 들어 뉴라민산의 N- 및 0-치환된 유도체를 나타낸다.
본원에 사용된 바와 같이, "부위-특이적 재조합"은 1) 부위-특이적 재조합 부위 또는 서열, 예를 들어 lox 부위에 의해 플랭킹된 표적 DNA 절편의 결실; 2) 부위-특이적 재조합 부위 또는 서열, 예를 들어 lox 부위에 의해 플랭킹된 표적 DNA 절편의 뉴클레오티드 서열의 역위; 및 3) 상이한 DNA 분자 상에 위치하는 부위-특이적 재조합 부위 또는 서열, 예를 들어 lox 부위에 인접한 표적 DNA 절편의 상호 교환의 3가지 사건을 포함하는 것으로 의도된다. 부위-특이적 재조합효소계로는 박테리오파지 P1의 Cre/lox 계 (미국 특허 제5,658,772호), 효모의 FLP/FRT 계 (골릭 (Golic) 및 린드퀴스트 (Lindquist)의 1989년도 문헌), Mu의 Gin 재조합효소 (매저 (Maeser) 등의 1991년도 문헌), 이. 콜라이 (E. coli)의 Pin 재조합효소 (에노모토 (Enomoto) 등의 1983년도 문헌), 및 pSR1 플라스미드의 R/RS 계 (아라키 (Araki) 등의 1992년도 문헌)이 포함되나, 이로 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 사용될 수 있는 세포주 및 인플루엔자 바이러스
본 발명에 따라, 인플루엔자 바이러스의 효율적인 복제를 지지하는 임의의 세포, 예를 들어 인플루엔자 바이러스에 대한 수용체인 1종 이상의 시알산을 감소된 또는 저하된 수준으로 발현하는 돌연변이 세포는 본 발명에 이용될 수 있다. 이 방법에 의해 수득되는 바이러스는 재배열 바이러스일 수 있다.
바람직하게는, 세포는 WHO 인증된 또는 인증가능한 연속 세포주이다. 이러한 세포주를 인증하기 위해 필요한 요건으로는 계통, 성장 특성, 면역학적 마커, 바이러스 감수성 종양형성 및 저장 조건 중 하나 이상에 대한 특성 뿐만 아니라, 동물, 난(亂), 및 세포 배양에서의 시험이 포함된다. 이러한 특성을 이용하여 세포에 검출가능한 부정 제제 (adventitious agent)가 없음을 확인할 수 있다. 일부 국가에서는, 핵학 또한 필요할 수 있다. 또한, 종양형성은 백신 제조에 사용된 것과 동일한 계대 수준을 갖는 세포에서 시험하는 것이 바람직하다. 바람직하게는, 바이러스는 백신 제조를 위해 불활성화시키거나 약독화시키기 전에 일관된 결과를 제공하는 것으로 밝혀진 방법에 의해 정제한다 (예를 들어, 문헌 [World Health Organization, 1982] 참조).
사용하고자 하는 세포의 완벽한 특성을 정립하는 것이 바람직하여서, 최종 생성물의 순도에 대한 적절한 시험을 포함시킬 수 있다. 본 발명에 사용하고자 하는 세포의 특성 분석을 위해 이용될 수 있는 데이타로는 (a) 그의 기원, 유래, 및 계대사에 대한 정보; (b) 그의 성장 및 형태학적 특성에 대한 정보; (c) 부정 제제의 시험 결과; (d) 다른 세포주 중에서 사용하고자 하는 세포를 명확히 인식할 수 있게 하는, 생화학적, 면역학적 및 세포유전학적 패턴과 같은 구별되는 특성; 및 (e) 종양형성에 대한 시험 결과가 포함된다. 사용되는 숙주 세포의 계대 수준 또는 개체군 배가가 가능한 한 낮은 것이 바람직하다.
세포에서 제조된 바이러스는 백신 또는 유전자 요법 제제 이전에 고도로 정제되는 것이 바람직하다. 일반적으로, 정제 과정으로 인해 세포성 DNA, 다른 세포성 성분, 및 부정 제제가 광범위하게 제거될 것이다. DNA를 광범위하게 분해하거나 변성시키는 과정이 또한 사용될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Mizrahi, 1990]을 참조한다.
백신
본 발명의 백신은 임의의 병원균의 당단백질을 비롯한 면역원성 단백질, 예를 들어 하나 이상의 박테리아, 바이러스, 효모 또는 진균으로부터의 면역원성 단백질을 포함할 수 있다. 따라서, 일 실시양태에서, 본 발명의 인플루엔자 바이러스는 인플루엔자 바이러스, 또는 HIV, 헤파티티스 B 바이러스, 헤파티티스 C 바이러스, CMV 또는 HSV와 같은 헤르페스 바이러스, 또는 발 및 입 질환 바이러스와 같은 렌티바이러스를 비롯한, 그러나 이에 제한되지 않는 다른 바이러스성 병원균에 대한 백신 벡터일 수 있다.
완전 비리온 백신을 한외여과에 의해 농축한 후, 띠 원심분리에 의해 또는 크로마토그래피에 의해 정제한다. 이를 정제 전 또는 후에, 예를 들어 포르말린 또는 베타-프로피오락톤을 이용하여 불활성화시킨다.
서브유닛 백신은 정제된 당단백질을 포함한다. 이러한 백신은 하기와 같이 제조될 수 있다: 세정제로 처리함으로써 단편화된 바이러스성 현탁액을 이용하여, 예를 들어 초원심분리에 의해 표면 항원을 정제한다. 따라서, 서브유닛 백신은 주로 HA 단백질, 및 또한 NA를 함유한다. 사용되는 세정제는 예를 들어, 헥사데실 트리메틸 암모늄 브로마이드 (문헌 [Bachmeyer, 1975])와 같은 양이온성 세정제, 암모늄 데옥시콜레이트 (문헌 [Laver & Webster, 1976]; [Webster et al., 1977])와 같은 음이온성 세정제; 또는 트리톤 (TRITON) X100이라는 명칭으로 시판되는 것과 같은 비이온성 세정제일 수 있다. 적혈구응집소는 또한 브로멜린과 같은 프로테아제로 비리온을 처리한 후 단리한 다음, 그랜드 (Grand) 및 스켈 (Skehel) (1972)에 의해 기재된 것과 같은 방법에 의해 정제할 수 있다.
분할 백신은 지질을 용해하는 제제로 처리된 비리온을 포함한다. 분할 백신은 하기와 같이 제조할 수 있다: 불활성화되거나 되지 않은, 상기와 같이 수득된 정제된 바이러스의 수성 현탁액을 에틸 에테르 또는 클로로포름과 같은 지질 용매에 의해 세정제와 함께 교반하면서 처리한다. 바이러스 외피 지질이 용해되면 바이러스 입자가 단편화된다. 주로 적혈구응집소 및 뉴라민 분해효소로 구성된 분할 백신을 함유하는 수성상을, 제거된 그 원래의 지질 환경, 및 코어 또는 그 분해 생성물과 함게 회수한다. 그런 다음, 잔류 감염성 입자를 불활성화가 이미 수행되지 않았을 경우 불활성화시킨다.
불활성화된 백신. 본 발명의 불활성화된 인플루엔자 바이러스 백신은 포르말린 또는 β-프로피오락톤 처리와 같은, 그러나 이에 제한되지 않는 공지의 방법을 이용하여 본 발명의 복제된 바이러스를 불활성화시킴으로써 제공된다. 본 발명에 사용될 수 있는 불활성화된 백신 유형의 예로는 전 바이러스 (WV) 백신 또는 서브비리온 (SV) (분할) 백신을 들 수 있다. WV 백신은 그대로의 불활성화된 바이러스를 함유하는 반면, SV 백신은 지질 함유 바이러스 외피를 용해시키는 세정제로 분쇄한 후 잔류 바이러스를 화학적으로 불활성화시킨, 정제된 바이러스를 함유한다.
그리고, 사용될 수 있는 백신은 표면 항원 또는 서브유닛 백신으로 지칭되는, 단리된 HA 및 NA 표면 단백질을 함유하는 것들을 포함한다. 일반적으로, SV 및 표면 항원 (즉, 정제된 HA 또는 NA) 백신에 대한 반응은 유사하다. NA 항원을 함유하는 실험적인 불활성화된 WV 백신은 면역학적으로 유행성 바이러스에 관련되며, 관련되지 않는 HA는 통상의 백신보다 덜 효과적인 것으로 나타난다 (문헌 [Ogra et al., 1977]). 적절한 표면 항원을 함유하는 불활성화된 백신이 바람직하다.
살아 있는 약독화된 바이러스 백신. 살아 있는 약독화된 인플루엔자 바이러스 백신은 또한 공지된 방법 단계에 따라 인플루엔자 바이러스 감염의 예방 또는 치료용으로 사용될 수 있다. 약독화는 바람직하게는 공지된 방법에 따라 약독화된 유전자를 약독화된 공여체 바이러스로부터 복제된 단리물 또는 재배열된 바이러스에 전이시킴으로써 단일 단계로 달성된다 (예를 들어, 문헌 [Murphy, 1993] 참조). 인플루엔자 A 바이러스에 대한 내성이 HA 및 NA 당단백질에 대한 면역 반응의 발달에 의해 중개되기 때문에, 상기 표면 항원을 코딩하는 유전자는 재배열된 바이러스 또는 고성장 임상 단리물로부터 유래되어야 한다. 약독화된 유전자는 약독화된 모체로부터 유래된다. 이러한 접근법에서, 약독화를 제공하는 유전자는 바람직하게는 HA 및 NA 당단백질을 코딩하지 않는다. 그렇지 않으면, 상기 유전자는 임상 바이러스 단리물의 표면 항원을 갖는 재배열물질로 전이될 수 없다.
많은 공여체 바이러스가 재생적으로 인플루엔자 바이러스를 약독화하는 능력에 대해 평가되었다. 비제한적인 예로서, A/Ann 아버 (Arbor) (AA)/6/60 (H2N2) 저온 적응된 (ca) 공여체 바이러스는 약독화된 백신 제조용으로 사용될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Edwards, 1994]; [Murphy, 1993] 참조). 그리고, 살아 있는 약독화된 재배열 바이러스 백신은 ca 공여체 바이러스를 본 발명의 유독성 복제된 바이러스와 결합시킴으로써 생성할 수 있다. 그런 다음, 약독화된 A/AA/6/60 (H2N2) ca 공여체 바이러스의 표면 항원을 갖는 바이러스의 복제를 억제하는 H2N2 항혈청의 존재 하에서, 재결합 후대를 (유독성 바이러스의 복제를 위해 제한적인) 25℃에서 선별한다.
H1N1 및 H3N2 재배열물질의 많은 계열은 인간에서 평가되었고, 만족스럽게 (a) 감염성이고, (b) 음성혈청반응 어린이 및 면역학적으로 초회감작된 성인에 대해 약독화되고, (c) 면역원성이고 (d) 유전학적으로 안정한 것으로 밝혀졌다. ca 재배열체의 면역원성은 그 복제 수준에 상응한다. 즉, 신규한 야생형 바이러스에 의한 ca 공여체 바이러스의 6 개의 전이가능한 유전자의 획득은 감수성 성인 및 어린이를 백신화하는데 사용하기 위한 상기 바이러스를 재생적으로 약독화시켰다.
다른 약독화 돌연변이는 부위 지정 돌연변이유발에 의해 인플루엔자 바이러스 유전자 내로 도입되어 상기 돌연변이 유전자를 갖는 감염성 바이러스를 보호할 수 있다. 약독화 돌연변이는 게놈의 비코딩 영역 내로 뿐만 아니라 코딩 영역 내로 도입될 수 있다. 이러한 약독화 돌연변이는 또한 HA 또는 NA 이외의 유전자, 예를 들어, PB2 폴리머라제 유전자 내로 도입될 수 있다 (문헌 [Subbarao et al., 1993]). 따라서, 부위 지정 돌연변이유발에 의해 도입된 약독화 돌연변이를 갖는 신규한 공여체 바이러스가 또한 생성될 수 있으며, 이러한 신규한 공여체 바이러스는 A/AA/6/60 ca 공여체 바이러스에 대해 상기 기재된 것과 유사한 방식으로 살아 있는 약독화된 재배열체 H1N1 및 H3N2 백신 후보체를 감소시키는데 사용될 수 있다. 유사하게, 다른 공지된 그리고 적합한 약독화된 공여체 균주를 본 발명의 인플루엔자 바이러스로 재배열시켜 포유동물의 백신화에 사용하기에 적합한 약독화된 백신을 수득할 수 있다 (문헌 [Ewami et al., 1990]; [Muster et al., 1991]; [Subbarao et al., 1993]).
이러한 약독화된 바이러스는 원래의 임상 단리물과 실질적으로 유사한 항원 결정기를 코딩하는 바이러스로부터의 유전자를 유지하는 것이 바람직하다. 이는 약독화된 백신의 목적이 백신화된 포유동물에서 백신이 심각한 병원성 증상을 비롯한 최소의 변화를 유발하는 정도로 감염성이 없는 동시에 바이러스의 원래의 임상 단리물과 실질적으로 동일한 항원성을 제공하는 것이기 때문이다.
따라서 바이러스를 공지된 방법에 따라, 백신으로서 감독하거나, 불활성화시키고, 제제화하고, 투여하여 동물, 예를 들어 포유 동물에서 면역 반응을 유도할 수 있다. 이러한 감독된 또는 불활성화된 백신이 그로부터 유도된 임상적인 분리체 또는 고도로 성장한 균주의 항원성과 유사한 항원성을 유지하고 있는지를 측정하는 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다. 이러한 공지된 방법은 공여체 바이러스의 항원성 결정소를 발현하는 바이러스를 제거하기 위한 항혈청 또는 항체의 용도; 화학적 선택 (예를 들어, 아만타딘 또는 리만티딘); HA 및 NA 활성 및 억제; 및 항원성 결정소 코딩 공여체 유전자 (예를 들어, HA 및 NA 유전자)가 감독된 바이러스에 존재하지 않는다는 것을 확인하기 위한 DNA 스크리닝 (예를 들어, 탐침 혼성화 (probe hybridization) 또는 PCR)을 포함한다. 예를 들어, 문헌 [Robertson et al., 1988; Kilbourne, 1969; Aymard-Henry et al., 1985; Robertson et al., 1992]을 참조한다.
제약 조성물
접종에 또는 비경구 또는 경구 투여에 적합한 본 발명의 제약 조성물은 감독된 또는 불활성화된 인플루엔자 바이러스를 포함하고, 임의로 살균 수성 또는 비수성 용액, 현탁액 및 유제를 더 포함한다. 조성물은 당업계에 공지된 보조제 또는 부형제를 더 포함할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Berkow et al., 1987; Goodman et al., 1990; Avery's Drug Treatment, 1987; Osol, 1980; Katzung, 1992]을 참조한다. 본 발명의 조성물은 일반적으로 개별 투여 (단위 투여) 형태로 존재한다.
통상적인 백신은 일반적으로 그들의 조성물에 도입된 각각의 균주로부터의 적혈구 응집소를 약 0.1 내지 200 μg, 바람직하게는 10 내지 15 μg 함유한다. 본 발명의 백신 조성물의 주요 구성 성분을 형성하는 백신은 A, B 또는 C형 바이러스, 또는 이들의 임의의 조합, 예를 들어, 3개의 유형 중 2개 이상, 상이한 아형 중 2개 이상, 동일한 유형 중 2개 이상, 동일한 아형 중 2개 이상 또는 여러가지 분리체(들) 또는 재조합체(들)을 포함할 수 있다. 인간 인플루엔자 바이러스 A형은 H1N1, H2N2 및 H3N2 아형을 포함한다.
비경구 투여용 제제는 살균 수성 또는 비수성 용액, 현탁액 및(또는) 유제를 포함하며, 당업계에 공지된 보조제 또는 부형제를 포함할 수 있다. 비수성 용매의 예로는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브유와 같은 식물유, 및 올레산에틸과 같은 주사가능한 유기 에스테르가 있다. 담체 또는 차단용 붕대를 사용하여 피부 투과성을 증가시키고, 항원 흡수를 개선시킬 수 있다. 경구 투여용 액체 투여 형태는 일반적으로 액체 투여 형태를 함유하는 리포솜 용액을 포함할 수 있다. 리포솜을 현탁화시키기에 적합한 형태로는, 정제수와 같은 당업계에서 일반적으로 사용되는 불활성 희석제를 함유하는 유제, 현탁액, 용액, 시럽 및 엘릭시르제를 들 수 있다. 불활성 희석제 이외에, 이러한 조성물은 또한 보조약, 습윤제, 유화제 및 현탁제 또는 감미료, 향미제 또는 방향제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Berkow et al., 1992; Goodman et al., 1990; Avery's, 1987; Osol, 1980; 및 Katzung, 1992]을 참조한다.
본 발명의 조성물이 개체에 투여되기 위해 사용될 때, 조성물의 효능을 개선시키는데 바람직한 염, 버터, 보조약, 또는 그밖의 물질을 더 포함할 수 있다. 백신에 대해, 특이적 면역 반응을 증가시킬 수 있는 보조약, 물질을 사용할 수 있다. 일반적으로, 보조약 및 조성물은 혼합된 후, 면역계에 제시되거나, 별도로 면역될 유기체의 동일한 부위로 제시된다. 백신 조성물에 사용하기에 적합한 물질의 예는 오솔 (Osol, 1980)에서 제공된다.
백신에서 이종성은, 2 내지 50개의 균주 또는 임의의 범위 또는 수치의 균주와 같은 2개 이상의 인플루엔자 바이러스 균주에 대해 복제된 인플루엔자 바이러스를 혼합함으로써 제공될 수 있다. 현대의 항원 조성물을 갖는 인플루엔자 A 또는 B 바이러스 균주가 바람직하다. 본 발명에 따라, 백신은 당업계에 공지된 기술을 이용하여 인플루엔자 바이러스의 하나의 균주에서의 변이에 대해 제공될 수 있다.
본 발명에 따른 제약 조성물은, 예를 들어 유전자 치료, 면역 억제제, 항염증제 또는 면역 개선제 및 백신에 대한 하나 이상의 화학치료 화합물, 감마 글로불린, 아만타딘, 구아니딘, 히드록시벤즈이미다졸, 인터페론-α, 인터페론-β, 인터페론-γ, 종양 괴사 인자-알파, 티오세미카르바존, 메티사존, 리팜핀, 리바비린, 피리딘 유사체, 푸린 유사체, 포스카르넷, 포스포노아세트산, 아실로비르, 디데옥시뉴클레오시드, 프로테아제 억제제 또는 간시클로비르를 비롯한 (그러나 이에 한정되지는 않음) 화학치료제를 더 또는 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Katzung (1992)] 및 이 문헌에서 각각 798 내지 800 및 680 내지 681 페이지에서 인용된 참고 문헌을 참조한다.
조성물은 또한 다양한 그러나 소량의 엔도톡신-무함유 포름알데히드 및 방부제를 함유할 수 있으며, 이들은 안전하고, 조성물이 투여되는 유기체에서 원하지 않는 효과를 제공하지 않는 것으로 밝혀져 있다.
제약학적 목적
조성물 (또는 그것이 유도한 항혈청)의 투여는 "예방적" 또는 "치료적" 목적을 위한 것일 수 있다. 예방적으로 제공될 경우, 백신인 본 발명의 조성물은 병원체 감염의 임의의 증상이 발현되기 전에 제공된다. 조성물의 예방적 투여는 임의의 이후의 감염을 예방 또는 약화시키기 위해 제공된다. 치료적으로 제공될 경우, 감독된 또는 불활성화된 바이러스성 백신은 실제 감염의 증상을 검출시 제공된다. 화합물(들)의 치료적 투여는 임의의 실제 감염을 약화시키기 위해 제공된다. 예를 들어, 문헌 [Berkow et al., 1992; Goodman et al., 1990; Avery, 1987; 및 Katzung, 1992]을 참조한다.
본 발명의 감독된 또는 불활성화된 백신 조성물은 따라서 (예상되는 감염을 예방 또는 약화시키기 위해) 감염의 개시 전 또는 실제 감염의 개시 후에 제공될 수 있다.
유사하게, 유전자 치료를 위해, 조성물은 장애 또는 질환의 임의의 증상이 발현되기 전 또는 하나 이상의 증상이 검출된 후에 제공될 수 있다.
조성물은 그의 투여가 수용하는 환자에게 내성이 있을 수 있는 경우, "약리학적으로 허용가능한" 것으로 말할 수 있다. 이러한 제제는 투여량이 생리학적으로 상당할 경우, "치료적 유효량"으로 투여되는 것으로 말할 수 있다. 본 발명의 조성물은, 그의 존재가 수용하는 환자의 생리 기능에 검출가능한 변화를 초래할 경우, 예를 들어 감염성 인플루엔자 바이러스의 하나 이상의 균주에 대한 하나 이상의 제1 또는 제2 체액성 또는 세포성 면역 반응을 개선시킬 경우, 생리학적으로 중요하다.
대조군 집단 또는 조절된 환자에 비해 통계학적으로 현저한 개선이 있을 경우, 제공된 "보호"가 절대적일 필요는 없다, 즉 인플루엔자 감염을 전적으로 예방하거나 근절시킬 필요는 없다. 보호는 인플루엔자 바이러스 감염의 증상의 중증도 또는 개시의 신속함을 완화시키는 것으로 제한될 수 있다.
제약학적 투여
본 발명의 조성물은 수동 면역 또는 능동 면역에 의해 하나 이상의 병원체, 예를 들어 하나 이상의 인플루엔자 바이러스 균주에 대한 저항성을 부여할 수 있다. 능동 면역에서, 불활성화된 또는 감독된 간 백신 조성물을 예방적으로 숙주 (예를 들어, 포유 동물)에게 투여하고, 투여에 대한 숙주의 면역 반응은 감염 및(또는) 질환에 대해 보호한다. 수동 면역에 대해, 근절된 항혈청을 회복시키고, 하나 이상의 인플루엔자 바이러스 균주에 의해 유발되는 감염에 걸렸을 것으로 짐작되는 수용체에게 투여할 수 있다.
제2 실시양태에서, 백신을 포유 동물 암컷에게 (임신 또는 산후에, 또는 그 전에) 암컷 및 (태반을 통해 또는 모유에 의한 항체의 수동적 도입을 통해) 태아 또는 신생아 모두를 보호하기 위해 제공되는 면역 반응의 생성을 유발시키기에 충분한 시간 및 양의 조건하에 제공한다.
따라서 본 발명은 장애 또는 질환, 예를 들어 하나 이상의 병원체의 균주에 의한 감염을 예방 또는 약화시키는 방법을 포함한다. 본 명세서에 사용된 백신은 그의 투여가 질환의 증상 또는 상태를 완전히 또는 부분적으로 약화시키거나 (즉, 억제시킴), 또는 질환에 대한 개체의 완전한 또는 부분적인 면역을 생성할 경우, 질환을 예방 또는 약화시킨다고 말할 수 있다.
본 발명의 하나 이상의 불활성화된 또는 감독된 인플루엔자 바이러스 또는 그의 조성물은 상기 기재된 바와 같은 제약 조성물을 이용하여, 의도된 목적을 이루기 위한 임의의 수단에 의해 투여될 수 있다.
예를 들어, 이러한 조성물은 피하, 정맥내, 피내, 근육내, 복막내, 비내와 같은 다양한 비경구 경로, 경구 또는 경피 경로에 의해 투여될 수 있다. 비경구 투여는 순간 주사 (bolus injection)에 의한 또는 시간에 따른 점진적인 살포에 의한 것일 수 있다. 본 발명의 조성물을 이용하는 바람직한 방법은 근육내 또는 피하내 도포에 의한 것이다. 예를 들어, 문헌 [Berkow et al., 1992; Goodman et al., 1990; Avery, 1987; 및 Katzung, 1992]을 참조한다.
인플루엔자 바이러스 관련 병리를 예방, 억제 또는 치료하는 통상의 요법은 단일 치료로 투여하거나, 1주일 내지 약 24개월 이하의 기간 또는 상기 기간에서 임의의 범위 또는 값에 걸쳐 강화 또는 추가 투여량으로 반복하여, 본원에 기재된 백신 조성물을 유효량으로 투여하는 것을 포함한다.
본 발명에 따라서, 백신 조성물의 "유효량"은 목적하는 생물학적 효과를 달성하기에 충분한 양이다. 활성 투여량이 수용자의 나이, 성별, 건강상태 및 체중, 현재 진행중인 치료의 종류, 존재하는 경우에 치료 빈도, 및 원하는 효과의 성격에 따라 달라질 것으로 이해된다. 하기 유효 투여량의 범위는 본 발명을 제한하려는 것이 아니며, 바람직한 투여량 범위를 나타낸다. 그러나, 가장 바람직한 투여량은 당업자에 의해 이해되고 결정될 수 있는 것과 같이 개별 대상체에 따라서 조절될 것이다. 예를 들어, 문헌[Berkow et al., 1992; Goodman et al., 1990; Avery's, 1987; Ebadi, 1985; 및 Katsung, 1992] 참조.
포유동물 (예를 들어, 인간) 또는 조류 성체 유기체에 있어서 약화된 바이러스 백신의 투여량은 약 103 내지 107개 플라크 (단위: (PFU)/kg)이거나, 상기 투여량의 임의의 범위 또는 값일 수 있다. 비활성화 백신의 투여량은 적혈구응집소 단백질 약 0.1 내지 200 ㎍ 범위, 예를 들어 50 ㎍일 수 있다. 그러나, 투여량은 존재하는 백신을 출발점으로서 사용하는 통상의 방법으로 측정하였을 때 안전하고 유효한 양이어야 한다.
복제된 바이러스 백신의 각 투여량에서 면역반응 HA의 투여량을 표준화하여 적합한 양, 예를 들어 1 내지 50 mg 또는 상기 양의 임의의 범위 또는 값, 또는 미국 보건원(U.S. Public Heath Service; PHS)에서 권장하는 양 (통상적으로 3세 이상의 유아에 대해서는 성분당 15 ㎍이고, 3세 미만의 유아에 대해서는 성분당 7.5 ㎍임)을 함유할 수 있다. NA의 양 또한 표준화될 수 있으나, 이러한 당단백질은 프로세서 정제 및 저장동안 불안정할 수 있다[Kendal et al., 1980; Kerr et al., 1975]. 백신 투여량 0.5 ㎖ 당 약 10억 내지 500억개의 바이러스 입자를 함유하는 것이 바람직하며, 100억개의 입자를 함유하는 것이 바람직하다.
본 발명은 하기 비제한적인 실시예에 의해 더욱 기재될 것이다.
실시예 1
재료 및 방법
바이러스 및 세포. 닭의 발육란 (A/Tottori/ATl/AM2AL3/94; AM1AL3) 또는 마딘-다비 개 신장(Madin-Darby canine kidney; MDCK) 세포 (A/Tottori/872/K4/94; K4)중에, 단일 환자로부터 단리한 인간 H3N2 바이러스를 T. 이또(T. Ito; 일본 도또리에 소재하는 도또리 유니버시티(Tottori University) 제품)로부터 구입하였다. 바이러스 원액을 0.3% 소혈청알부민 및 트립신 0.5 mg/ml로 보충된 최소 필수 배지(MEM) 중 10일된 닭의 발육란 (AMZAL3 바이러스) 또는 MDCK 세포 (K4 바이러스)에서 생장시켰다. MDCK 세포를 5% 송아지혈청 (미국 미주리주 세인트 루이스에 소재하는 시그마(Sigma) 제품)으로 보충된 MEM 중에서 유지시켰다.
렉틴-내성 세포주의 생성. 컨플루언시 75%로 성장한 MDCK 세포를 인산염-완충 염수로 3회 세척하고, 0.3% 소혈청알부민 함유 MEM 중 다릅나무(Maakia amurensis; MAA) 렉틴 (100 mg/ml; 독일 만하임에 소재하는 뵈링거 만하임(Boehringer Manngeim) 제품) 또는 엘더베리(Sambucus nigra; SNA) 렉틴 (100 mg/ml; 뵈링거 만하임)으로 인큐베이션하였다. 48 시간 동안 인큐베이션한 후, 배지를 성장 배지 (MEM-5% 소태아혈청)로 교체하였다. 상기한 바와 같이 렉틴 선택을 2회 더 반복하였다. 이어서, 생존 세포 집락을 클로닝하고, SNA- 및 MAA-선택된 세포주를 각각 MDCK-Sn1O 및 MDCK-Ma로 명명하였다.
시알산 함량 측정을 위한 형광분석 HPLC 법. 세포주와 정제 바이러스 모두의 시알산 (N-아세틸뉴라민산[NeuAc] 및 N-글리콜릴뉴라민산[NeuGc]) 함량을 문헌[Suzuki et al. (1997)]에 기재된 바와 같이 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 형광분석법으로 측정하였다. 각 샘플을 5 ㎖ 둥근 유리-상부 바이알에 두고, 황산 100 ㎕ (25 mM)와 혼합하였다. 이어서, 바이알을 60 ℃에서 12 시간 동안 가열하여 시알로-당 사슬을 가수분해하였다. 냉각 후, 1,2-디아미노-4,5-메틸렌 디옥시벤젠 50 ㎕를 가수분해물 50 ㎕에 첨가하고, 혼합물을 암흑속에서 60 ℃로 2.5 시간 동안 가열하여 시알산의 형광을 현상하였다. 이어서, 생성된 용액의 10 ㎕ 분취액을 샘플 주입 밸브 (모델 7125; 레오딘(Reodyne)), 20 ㎕ 유동 셀이 포함된 형광 분광광도계 (650-105; 일본 도꾜에 소재하는 히라치(Hirachi) 제품) 및 기록기 (크로마토팩(Chromatopac) C-RSA; 일본 교또에 소재하는 시오나쯔(Shionadzu) 제품)가 장착된 880-PU 고성능 액체 크로마토그래피 (일본 도꾜에 소재하는 JASCO 제품)로 주입하였다. 형광 분광광도계를 373 nm의 여기 파장 및 448 nm의 방출 파장에 위치시켰다. NeuAc (시그마)와 NeuGc (시그마)의 표준 혼합물 (200 pmol/㎕)을 사용하여 검정 곡선을 정하였다.
시알리다제 활성의 형광분석. 바이러스 시알리다제 활성 (5 x 105 PFU)을 문헌[Hara et al. (1987)]에 기재된 바와 같이 기질로서 2'-(4-메틸움벨리페릴)-α-D-N-아세틸뉴라민산 (시그마)를 사용하여 측정하였다. 요약하면, 0.5 M 아세트산나트륨 (pH 4.6)으로 1:2로 희석한 형광성 기질을 동일한 부피의 바이러스 샘플에 첨가하고, 37 ℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 0.5 M Na2C02 (pH 10.7) 200 ml로 반응을 중지시킨 다음 360 nm의 여기 파장 및 460 nm의 방출 파장에서 형광물질을 인큐베이션하였다. 모든 반응을 2회 반복하였다.
NA 및 HA 유전자의 서열 분석. 전체 바이러스 RNA(vRNA)를 제조사 (미국 캘리포니아주 발렌시아에 소재하는 퀴아겐, 인크.(Qiagen Inc.))에서 지시한 바와 같이 퀴아핀(Qiappin) vRNA 정제 키트를 사용하여 바이러스 샘플로부터 수득하였다. cDNA 제조에 대해서는, 인플루엔자 A 바이러스 유전자 절편의 보존 12 vRNA 3' 말단 뉴클레오티드에 대해 상보적인 올리고뉴클레오티드 Uni-12를 몰로니 뮤린 류케미아 바이러스(Moloney Murine Leukemia Virus)) 역전사효소 (미국 위스콘신주 매디슨에 소재하는 프로메가(Promega) 제품) 반응에 대한 프라이머로 사용하였다. NA 유전자 cDNA를 NA 유전자-특이적 프라이머 JN2-43 (5'cRNA 센스 서열: 5'-TGGCTCGTTTCTCTCACTATTGCC-3'; 서열 1) 및 JN2-1410r (3'-cRNA 안티센스 서열: 5'-TTATATAGGCATGAGATTGATGTCCG-3'; 서열 2) 및 Pwo DNA 폴리머라제 (뵈링거 만하임) 10 U로 30회의 PCR 동안 증폭시켰다. 생성된 PCR 생성물을 벡터 pCR21 (미국 캘리포니아주 칼스바드에 소재하는 인비트로겐(Invitrogen) 제품)로 서브클로닝하고, 자동화 형광 서열분석에 사용하였다. HA 유전자를 유사한 방식으로 HA 유전자-특이적 프라이머 JH3-업 (5' cRNA 센스 프라이머 서열, 5'-AGCAAAAGCAGGGGATAATTCTATTAACCATGAAGAC-3'; 서열 3) 및 JH3-다운 (3' cRNA 안티센스 프라이머 서열 5'-AGTAGAAACAAGGGTGTTTTTAATTAATGCACTC-3'; 서열 4)로 클로닝하였다. 각 단리물에 대해서 3개의 클론을 시험하여 NA 및 HA 컨센서스 서열을 수득하였다.
결과
렉틴-내성 세포주의 발생. 세포 표면에서 시알산 발현의 수준이 감소된 세포주를 생산하기 위하여, 시알산-결합 특이성 면에서 상이한 2가지의 렉틴 SNA 및 MAA을 사용하였다. MAA 렉틴은 α(2,3) 연결에 의해 갈락토스에 연결된 시알산에 결합하는 반면 (Wang et al., 1988), SNA 렉틴은 α(2-6) 연결에 의해 갈락토스 또는 N-아세틸갈락토사민에 연결된 시알산에 특이적이다 (Shibuya et al., 1987). 인플루엔자 바이러스의 성장을 지지하는 MDCK 세포주를 렉틴 선택을 위한 모세포로서 사용하였다. 둘 중 한 렉틴의 존재하에 인큐베이션하는 경우, 대부분의 세포는 1주일 이내에 사멸하였다. 이어서, 내성 세포 클론을 원액 배양을 위해 성장시켰다. MAA 및 SNA 렉틴 선택으로부터 생성된 세포주를 각각 MDCK-Ma 및 MDCK-Sn10으로 명명하였다.
이전에 보고된 바와 같이 (Ito et al., 1997), 디곡시게닌-표지된 MAA 및 SNA 렉틴 (도 1A)을 이용하는 형광-활성 세포 분류 (FACS)로, 두 렉틴 모두에 대한 MDCK 세포의 고수준 결합이 증명되었다. α(2,6) 연결-특이적 렉틴으로 선택된 MDCK-Sn10 세포는 α(2,3) 특이적 MAA 렉틴에의 강한 결합을 유지하나, MDCK 모체보다 약한 SNA 렉틴 결합을 나타내었다. 반대로, α(2-3) 연결-특이적 렉틴으로 선택된 MDCK-Ma 세포는 MDCK 세포보다 훨씬 더 약하게 두 렉틴 모두에 결합하였다.
MDCK - Sn10 및 MDCK - Ma 세포주에서의 바이러스 성장. 인플루엔자 바이러스가 수용체 발현이 감소된 세포에 어떻게 적응하는지를 알아보기 위하여, 공지된 시알산 수용체 연결 특이성 (Ito et al., 1997)을 갖는 2개의 인플루엔자 바이러스 변형체 (AM2AL3 및 K4)를 선택하였다. K4 바이러스는 α(2-6) 연결에 의해 갈락토스에 연결된 NeuAc [NeuAcα(2-6)Gal]를 특이적으로 인식하는 반면, AM2AL3 바이러스는 NeuAcα(2-3)Gal에 대해 특이적이다. 두 바이러스 모두 MDCK 세포에서 뿐 아니라 MDCK-Sn10 세포에서도 대부분 복제되었다 (표 1). 그러나, MDCK-Ma 세포에서 두 바이러스 모두의 역가는 MDCK 세포에서의 역가보다 1 log 낮았다. 또한, 둘 중 하나의 바이러스로 감염된 후, 10회의 다수의 감염에서조차, 적은 퍼센트의 MDCK-Ma 세포가 어떠한 세포변성 효과도 없이 컨플루언스로 계속 성장하였다. 배지를 바이러스 성장을 촉진하는 트립신을 함유하는 배지로 치환할 때, 이러한 생존 세포에서는 바이러스 생산을 적혈구응집반응 분석으로 검출할 수 없었다. 세포는 또한 인플루엔자 바이러스 HA 및 NP 단백질 (데이타는 나타내지 않음) 모두에 대한 면역화학 염색에 의해 음성이었으므로, 세포가 지속적으로 감염되지 않았음이 증명되었다. 생존 세포는 MaKS로 명명하였다.
렉틴-내성 세포주에서 인플루엔자 바이러스의 복제*
세포주 역가 (TCID50/ml)
AM2AL3 K4
MDCK 1.8 x 109 5.6 x 104
MDCK-Sn10 5.6 x 108 3.2 x 104
MDCK-Ma 1.8 x 108 5.6 x 103
* AM2AL3 또는 K4 바이러스로 세포를 감염시키고 조직 배양 세포의 50%를 감염시키기 위해 요구되는 투여량 (TCID50)을 결정함으로써 각 세포주의 감수성을 결정하였다.
SNA 및 MAA 렉틴 모두에 대한 FACS 분석으로, 이들이 유도된 MDCK-Ma 세포와 같은 MaKS 세포가 MDCK 세포보다 훨씬 더 약하게 α(2,6)-특이적 SNA 렉틴과 결합한다는 것이 증명되었다 (도 1B). 또한, MaKS 세포의 MAA 렉틴-결합 피크는 MDCK-Ma 세포주의 피크보다 훨씬 더 좁았고, 작은 어깨 피크의 손실은 더욱 큰 MAA-결합 개체수를 나타내었다 (도 1).
시알산의 양 감소가 MaKS 세포의 렉틴 결합 감소에 책임이 있는지의 여부를 결정하기 위하여, MaKS 세포 내에 존재하는 시알산 수준을 액체 크로마토그래피 분석으로 정량하였다. NeuGc 함량이 훨씬 낮음에도 불구하고, MaKS 세포주는 MDCK 세포 (216.0 및 2.5 pmol/㎍ 단백질)보다 NeuAc 및 NeuGc (각각 8.2 및 0.4 pmol/㎍ 단백질) 둘다 훨씬 더 낮은 수준을 나타내었다. 이러한 데이타는 MaKS 세포에서 시알산 수용체 결정자의 거대한 감소를 증명한다.
MaKS 세포에서 바이러스의 적응. AM2AL3 및 K4 바이러스가 매우 낮은 수준의 바이러스 수용체를 발현하는 세포에서 어떻게 증식하고 성장에 적응하는지를 결정하기 위하여, 두 바이러스 모두 액체 배양 중의 MaKS 세포에 연속적으로 계대하였다. 두 바이러스 모두 MDCK 세포에서보다 MaKS 세포에서 복제가 더욱 불량하였기 때문에 (표 2), 계대 1 내지 3은 희석하지 않고 수행하고, 계대 4 내지 13은 1:1,000 희석으로 수행하였다. 계대 8 이후에, 둘 중 하나의 변형체에 의해 생산된 플라크의 직경은 큰 것에서 (3 mm 초과) 작은 것으로 (대략 1 nm) 변화하였다. 계대 10 이상까지는, 바이러스를 MDCK 세포에 의해 분석했을 때 (데이타는 나타내지 않음) 오직 더욱 작은 플라크만이 존재하였다. 13 연속 계대 후, 두 바이러스 모두 MaKS 세포에서는 MDCK 세포에서 만큼 또는 그보다 더욱 양호하게 성장할 수 있었다 (표 2). 계대 13 이후, 둘 중 하나의 변형체로부터 생산된 바이러스 원액을 증폭시키고, 각각 AL3(MaKS)-13 및 K4(MaKS)-13으로 명명하였다.
렉틴-선택된 세포에서 성장에 적응된 바이러스의 복제*
세포주 역가 (TCID50/ml)
AM2AL3 AL3(MaKS)-13 K4 K4(MaKS)-13
MDCK 1.8 x 109 5.6 x 104 5.6 x 104 5.6 x 104
MaKS 5.6 x 106 5.6 x 104 1.8 x 103 1.8 x 103
수지, MDCK 역가/MaKS 역가 321 1 31 0.3
* AM2AL3 (나에서 성장됨), K4 (MDCK 세포에서 성장됨), AL3(MaKS)-13 (MaK3 세포에서 성장됨), 또는 K4(MaKS)-13 (MaKs 세포에서 성장됨) 원액 바이러스로 세포를 감염시키고 조직 배양 세포의 50%를 감염시키기 위해 요구되는 투여량 (TCID50)을 결정함으로써 각 세포주의 민감성을 결정하였다. MaKS 세포에서 적응된 두 바이러스 모두 상기 세포에서는 MDCK 세포에서 만큼 [AL3(MaKS)-13] 또는 그보다 더욱 양호하게 [K4(MaKS)-13] 성장하나, 원래의 바이러스는 MDCK 세포에서 더욱 양호하게 성장함을 주지한다.
AL3 ( MaKS )-13 및 K4 ( MaKS )-3 바이러스의 HA 및 NA 유전자의 돌연변이 분석. 감소된 수용체 농도로 특징지어지는 세포적 환경에 대한 바이러스 적응의 분자적 근거를 결정하기 위하여, AL3(MaKS)-13 및 K4(MaKS)-13 바이러스의 HA 유전자를 역전사시키고, cDNA를 PCR로 증폭시키고, 생성된 생성물을 서열화하였다. 2개의 모체 바이러스로부터의 상응하는 HA 유전자와 비교했을 때 유전자 중 어떤 것도 돌연변이를 함유하지 않았다.
아마도 NA 시알리다제 활성에서의 변화가 HA 수용체-결합 활성에 영향을 주기 때문에, AL3(MaKS)-13 및 K4(MaKS)-13 바이러스의 NA 서열을 결정하였다. 두 변형체의 NA 유전자의 서열 분석으로 큰 내부 결실이 밝혀졌다 (도 2). AL3(MaKS)-13에서, 리딩 프레임을 이동시킴으로써 결실 즉후에 정지 코돈을 발생시키면서, 결실이 뉴클레오티드 220에서 1253으로 연장된다. 상기 NA의 코딩 능력은 NA의 세포질 꼬리, 막횡단 도메인, 자루 영역, 및 헤드 영역의 짧은 부분에 상응하는 66개의 아미노산이다. 유사하게, K4(MaKS)-13 단리체는 염기 130 내지 1193의 NA 유전자에 결실을 함유하고, 정지 코돈을 코돈 39에서의 프레임으로 이끈다. AL3(MaKS)-13 바이러스처럼, 유전자는 더이상 전체의 촉매 헤드 영역을 코딩하지 않는다. 따라서, 수용체 발현이 매우 낮은 세포주를 계대시킨 바이러스는 그의 NA 촉매 활성을 잃는다.
상기 결과를 확증하기 위해, AL3(MaKS)-13 및 K4(MaKS)-13 변이체를 시알리다아제 활성에 대해 형광 시알리다아제 기질 [2'(4-메틸엄벨리페릴)-α-D-N-아세틸뉴라민산]을 사용하여 분석하였다. 모 바이러스와는 다르게, NA 결실 돌연변이체 모두에서 시알리다아제 활성이 검출되지 않았다 (도 3).
바이러스 당단백질의 시알화의 범위. 정상적인 감염 동안, 시알리다아제 활성이 감소된 바이러스는 효과적으로 성장하지 못하며, 세포 표면에서 응집된다 (Palese et al., 1974; Shibata et al., 1993). 그렇다면, 왜 시알리다아제 활성이 결핍된 AL3(MaKS)-13 및 K4(MaKS)-13 바이러스가 MaKS 세포에서 성장하였는가? 한가지 가능한 설명은 이러한 세포의 시알산 함량이 낮아서, HA 및 NA 올리고당의 시알화의 범위가 또한 낮아질 수 있기 때문에, 바이러스 시알리다아제 활성이 없었을 때에도 감염된 세포 표면에서 바이러스의 응집을 막았다는 것이다. 이러한 가설을 시험하기 위해, 정제된 바이러스 표본 중 시알산 함량을 MDCK 세포에서 성장한 AM2AL3 및 K4 바이러스와 MaKS 세포에서 성장된 AL3(MaKS)-13 바이러스 사이에서 비교하였다. AM2AL3 바이러스는 다른 시료 (A/Tottori/872/K4/94, 3.8 pmol NeuAc/g 단백질; AL3(MaKS)-13, 2.6 pmol NeuAc/g 단백질)보다 시알산 함량이 더 적었지만 (0.9 pmol NeuAc/g 단백질), NeuAc 함량은 상기 바이러스 시료에서 유사하였다.
따라서, 바이러스 당단백질이 정상 세포주와 비교하여 광범위하게 시알화되지 않고, HA에 의해 결합되지 않기 때문에 시알리다아제 활성이 결핍된 바이러스는 감소된 시알산 수준을 나타내는 세포에서 효과적으로 성장할 수 있으며, 따라서 바이러스성 응집을 막을 수 있다.
논의
사전 연구에서, 외인성 세균 시알리다아제 활성의 존재하에 인플루엔자 A 바이러스의 계대 및 바이러스 NA에 대한 항체는 바이러스 NA 유전자의 결실을 유도하였다 (Liu et al., 1993; Liu et al., 1995; Yang et al., 1997). 또한, 이러한 계대배양에 의해 얻어진 NA 돌연변이체는 시알산 잔기에 대한 분자 친화도를 감소시키는 HA 단백질 중 보상 돌연변이의 결과로 외인성 시알리다아제 활성이 결핍된 세포 배양액 뿐 아니라 난 및 마우스 중에서 성장할 수 있었다 (Hughes et al., 2000). 본원에서 기술한 바와 같이, 인플루엔자 A 바이러스는 시알리다아제 활성을 파기시키는 큰 NA 유전자 결실 돌연변이에 의해 수용체 발현이 크게 감소된 세포에서 성장하도록 적응시킬 수 있다. 바이러스 수용체의 감소가 이론적으로 수용체-결합성 HA 단백질에 영향을 미칠 수 있으나, 단지 NA 유전자만 변경시켰다.
이러한 발견의 분자적 기초는 무엇인가? 시알산 수용체가 풍부한 정상 세포성 환경에서, NA 활성의 손실은 시알산에 대한 바이러스성 HA 친화도의 감소에 의해 보상되어, 숙주 세포 표면으로부터 후대를 효과적으로 유출시키고, 비리온 응집을 막을 수 있다 (Hughes et al., 2000). 높은 수준의 바이러스 수용체가 없을 때, MaKS 세포에서와 같이, HA 친화도의 감소가 바이러스 후대를 유출하고 NA 결실 돌연변이의 성장을 일으키는데 필수적이지는 않다. 사실, HA 단백질의 고 친화성 결합은 낮은 수준의 바이러스 수용체를 발현하는 세포에서 바이러스 복제를 위해 유지되어야 한다. 그러나, 시알리다아제 활성은 세포 표면 분자 상의 시알산의 양이 매우 적고, NA 결실 비리온의 시알산 함량이 야생형 비리온의 시알산 함량과 유사하기 때문에, 이러한 환경에서 비리온 유출 및 비리온 응집을 위해 필요하지 않다. 사실, 시알리다아제 활성은 세포 표면으로부터 수용체 결정자 시알산을 추가로 제거하기 때문에, 바이러스성 성장을 위해서 해로울 수 있다. 최근, 인플루엔자 A 바이러스는 NA 자루가 결핍되고, 따라서 난에서 성장할 수 없으며, 비동종 RNA-RNA 재조합을 통해 최대 22개 아미노산의 자루 삽입을 요구한다는 것이 밝혀졌다 (Mitnau et al., 2000). 함께 고려해보면, 이러한 발견은 인플루엔자 바이러스는 대량 삽입 및 결실을 비롯한 과격한 유전자적 변화를 겪어 새로운 숙주 환경에 적응할 수 있다는 것을 나타낸다.
상기 및 이전의 연구(Hughes et al., 2000; Liu et al., 1993) 모두에서, 바이러스는 세포질 꼬리 및 막횡단 영역을 코딩하는 절편 말단을 공유한 NA 유전자 절편 중 내부 결실에 의해 시알리다아제 활성을 상실하였다. 따라서, 이러한 돌연변이체에서 NA 유전자의 보존된 영역이 기능, 예컨대 비리온 형태형성 및 안정성을 위해 필수적일 수 있다.
MaKS 세포는 그들의 모 (MDCK) 세포보다 더 낮은 시알산 함량을 갖는다. 유사한 세포주가 CHO 세포로부터 생성되었음에도 불구하고 (Ray et al., 1991), 효율적인 인플루엔자 바이러스를 지지할 수 없기 때문에 인플루엔자 바이러스 연구에 유용한 것으로 증명되지 않았다. 반면에, MaKS 세포는 인플루엔자 바이러스의 연구에 있어서 표준 세포주인 MDCK 세포로부터 유도되며, 바이러스 수용체-기재 분석에 유용할 것이다. 예를 들어, 외인성으로 첨가된 갱글리오사이드가 숙주 세포 막으로 혼입되는 것으로 공지되어 있기 때문에 (Carroll et al., 1985), 따라서, 공지된 갱글리오사이드를 MaKS 세포와 인큐베이션할 수 있고, 바이러스 수용체로서 제공되는 이들의 능력을 시험할 수 있다.
지난 세기 동안, 급생한 바이러스의 HA 또는, HA 및 NA 유전자 모두가 인간 집단으로 도입되었을 때, 3 차례의 인플루엔자 A 바이러스 유행이 발생하였다. 상이한 숙주 동물로부터의 바이러스의 비교 연구에 의해 이러한 유행적 균주에서, 돌연변이가 HA 유전자에 도입되었음이 제안되었다 (Bean et al., 1992). 그러나 바이러스가 알려지지 않은 숙주 종 벽을 가로지를 수 있도록 유사한 돌연변이가 NA에 필수적이든지간에; 조류 바이러스로부터 유도된 인간 바이러스 N2 NA의 기질 특이성이 인간에서 복제하는 동안 점차적으로 변화되었다 (Baum et al., 1991). 본원에서 상기 기술한 결과는 NA 돌연변이가 결국 새로운 환경에 적응하기 위한 인플루엔자 A 바이러스의 능력에 공헌할 수 있다는 것을 나타낸다. 예를 들어, 조류 바이러스부터 인간 바이러스의 NA가 유래되었음에도 불구하고 (scholtissek et al., 1978), 인간 바이러스 NA가 있는 재분류 바이러스 및 오리 바이러스로부터 남은 유전자는 오리에서 복제되지 못하였다 (Hinshaw et al., 1983). 이것은 돌연변이가 인간에서 적응하는 동안 NA 유전자에서 일어났다는 것을 제안한다. 최근 개발된 플라스미드-기재 역전유전학으로 접합되어, 상이한 동물 숙주로부터의 바이러스성 NA의 비교 연구 (Fodor et al., 1999; Neumann et al., 1999)에 의해 이러한 표면 당단백질이 본래의 인플루엔자 바이러스 중에서 적응적인 변화에 기여하는 방법에 대한 유용한 관점을 제공할 수 있다.
실시예 2
재료 및 방법
세포. 293T 인간 배아기의 신장 세포를 10% 소태아혈청이 보충된 둘베코 (Dulbecco) 배지 중에 유지시키고, 매딘-다비 개 신장 (MDCK) 세포를 5% 신생 소혈청이 보충된 이글 배지에 유지시켰다.
플라스미드 기재의 역유전학
인플루엔자 A 바이러스를, 노이만 등의 문헌(1999)에 기재된 바와 같이 RNA 폴리머라제 I 프로모터 및 종결자(Poll 플라스미드로서 언급됨)의 조절하에 A/WSN/33(H1N1) 바이러스 유전자의 cDNA를 갖는 플라스미드 및 인플루엔자 바이러스 단백질을 발현하는 pCAGGS/MCS 플라스미드를 사용하여 발생시켰다 (도 4b). 요약하면, Poll 플라스미드 및 단백질 발현 플라스미드를 형질감염 시약 Trans IT LT-1(미국 위스콘신주 매디슨에 소재하는 팬베라(Panvera) 제품)와 혼합하고, 실온에서 10분 동안 인큐베이션하고, Opti-MEM (GIBCO/BRL)에서 배양된 1×106 개 293T 세포에 가하였다. 형질감염후 제48시간에서, 트립신 0.5 ㎍/ml을 매질에 가하여 HA 단백질을 활성화시킨 후, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 그 후, 상등액을 수집하였다.
플라스미드. NAFLAG 유전자는 NA cRNA의 5' 비코딩 영역; 세포질 꼬리(6 개 아미노산), 막횡단(29 개 아미노산) 및 자루 영역(16 개 아미노산)에 상응하는 NA의 51개 코돈 (도 4a); FLAG 에피토프(Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys; 서열 5), 2개의 순차적 정지 코돈(TAA TAG; 서열 6); 및 NA cRNA의 3' 말단 서열의 185개 염기를 함유한다. 3' 말단 서열의 상기 길이는 말단절단형 NA 절편에서 발견된 가장 짧은 것이다(문헌[Yang et al., 1997]). (-) 센스 NAFLAG RNA를 생성하는 pPoll-NAFLAGWT는 pT7Blue-NA(BsmB1 부위에 의해 플랭킹된 전장 A/WSN/33 NA 유전자를 함유함)에서 WSN NA 유전자의 뉴클레오티드 173 내지 1070((+) 센스에서)을 결실시키고, PCR에 의해 FLAG 서열, 2개의 정지 코돈 및 StuI 부위를 삽입함으로써 제조하였다. 이 단편을 StuI에 의해 소화시키고, 자가 결찰시켰다. NAFLAG 유전자를 BsmBI로 절제하고, pHH21의 BsmBI 부위중으로 삽입하였다.
NAFLAGM(-) vRNA의 제조를 위한 pPoll-NAFLAGM(-)은 NA 단백질을 위한 출발 코돈이 결핍되었다. 이는 말단절단형 NAFLAG 단백질을 위한 ATG 개시 코돈을 시험관내 부위 지정 돌연변이유발 시스템(진에디터, 프로메가 제품(GeneEditor, Promega))에 의해 GCG로 변화시킴으로써 달성하였다.
NA vRNA의 3' 비코딩 말단 및 융합 단백질을 61 N-말단 NA 코돈으로 코딩하는 상보적 서열을 함유하는 RNA를 발생시키는 pPollNA-(183)GFP(157)은 녹색 형광 단백질(eGFP, 클론테크 제품)을 개선시켰고, NA vRNA의 5' 말단의 185개 염기는 pT7Blue-NA중 WSN NA 유전자의 뉴클레오티드 203 내지 1109((+) 센스에서)를 역 PCR에 의해 BglII 부위로 치환시킴으로써 제조하였다. eGFP 유전자를 NA 단백질을 사용하여 프레임중 위치 1226(야생형 NA 유전자에서)에서 상기 BglII 부위 및 StuI 부위중으로 클로닝하였다. 그 후, NA-(183)GFP(157) 유전자를 pHH21의 BsmBI 부위중으로 삽입하였다.
NA vRNA의 3' 비코딩 영역, eGFP의 상보적 코딩 서열 및 NA vRNA의 5' 비코딩 영역을 함유하는 NA(0)GFP(0) 유전자를 BbsI 부위를 갖는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 제조하였다. 이 PCR 단편을 BbsI에 의해 소화시키고, pHH21의 BsmBI 부위중으로 삽입하여 세포중으로의 플라스미드 도입시 5' 및 3' 비코딩 NA vRNA 영역에 의해 플랭킹된 (-) 센스 방향으로 eGFP 코딩 서열을 함유하는 RNA를 합성하였다.
일련의 결실 돌연변이체를 PCR 돌연변이유발에 의해 생성하였다. NA-eGFP 융합 단백질이 결실 돌연변이체를 pT7blue 벡터중 NA-(183)GFP(157)유전자로부터 제조하였다. NA-(183)GFP(157)의 NA 코딩 영역의 전체 3' 말단((+) 센스)이 결핍된 NA-(183)GFP(0) 유전자를 PCR 돌연변이유발에 의해 생성하였다. 이 돌연변이체는 5' 비코딩 영역((+) 센스), NA 서열의 61개 아미노산, eGFP 유전자, 2개의 정지 코돈 및 3' 비코딩 영역을 함유하였다. PCR 돌연변이체, NA-(90)GFP(0), NA-(45)GFP(0), NA-(21)GFP(0) 및 NA-(18)GFP(0)는 각각 NA-(183)GFP(0)의 NA 코딩 영역의 30, 15, 7 또는 6 개 N-말단 아미노산 결실을 함유하였다.
5' 비코딩 영역, eGFP 유전자, 2 개 정지 코돈 및 NA의 3' 말단의 185 개 뉴클레오티드((+) 센스)를 함유하는 NAOG185 유전자를 NA(61)GFP 유전자로부터 동일한 방식으로 제조하였다. 이 돌연변이체는 NA vRNA의 5' 비코딩 영역(28 개 뉴클레오티드) 및 vRNA의 NA 5' 코딩 영역의 157개 뉴클레오티드를 함유하였다. NA-(183)GFP(78) 및 NA-(183)GFP(39) 돌연변이체는 각각 NA0G185로서 NA 5' 코딩 영역의 1/2 또는 1/4을 갖는 NA0G185의 결실 돌연변이체이다.
면역염색 말단절단형 NA 단백질의 C-말단에 부착된 FLAG 에피토프를 검출하기 위해, MDCK 세포를 상기 에피토프를 갖는 바이러스로 감염시키고, 트립신 0.5 ㎍/ml 및 비브리오 콜레라 시알리다제 100 μU/ml를 함유하는 0.6% 아가로스 (GIBCO/BRL)로 덮어 씌웠다. 감염된 세포를 3% 포름알데히드 용액으로 고정시키고, 3% 포름알데히드 용액중 0.1% 트리톤-X100에 의해 투과시켰다. 그 후, FLAG 에피토프를 벡타스테인 ABC 키트(Vectastain ABC kit)(미국 캘리포니아주 버를링암 벡터) 및 1차 항체로서의 항-FLAG 모노클로날 항체 M2(시그마) 및 2차 항체로서의 바이오티닐화 항-마우스 IgG를 사용하여 검출하였다. WSN 바이러스 감염된 세포를 확인하기 위해, 래빗 항-WSN 혈청을 1차 항체로서 사용하였다.
동일계내 혼성화 감염된 세포를 디곡시게닌(DIG)-표지된 프로브로 혼성화시키고, 제조업자의 프로토콜에 따라 DIG 핵산 검출 키트(DIG Nucleic Acid Detection Kit)(로쉐 제품)를 사용하여 염색시켰다. FLAG 에피토프(GACTACAAGGACGACGATGACAAG; 서열 7)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 상보적인 올리고뉴클레오티드(100 pmol)를 37℃에서 6시간 동안 DIG 올리고뉴클레오티드 테일링 키트(DIG Oligonucleotide Tailing Kit)(로쉐 제품)에 의해 표지화하였다. 바이러스 감염된 세포를 3% 포름알데히드 용액으로 고정시키고, 3% 포름알데히드 용액중 0.1% 트리톤-X100에 의해 투과시키고, 예비 혼성화 완충액 (5×SSC, 검출 키드의 0.1 mg/ml Poly(A)-DNA를 함유하는 1% 검출 키트 블로킹 시약(Blocking Reagent of the Detection Kit), 0.1% N-라우로일사르코신, 0.02% 소듐 도데실 술페이트[SDS])에서 65℃에서 30분 동안 예비 혼성화시켰다. 올리고뉴클레오티드 프로브(10 pmol)를 예비 혼성화 완충액에 가하고, 55℃에서 1시간 동안 혼성화시켰다. 혼성화된 세포를 세척 완충액(0.1 M 말레산, 0.15 M NaCl, 0.3% Tween 20, pH 7.5)로 5분 동안 세척하고, 실온에서 30분 동안 1% 블로킹 시약으로 블로킹하고, 실온에서 30분 동안 알칼리성 인산분해효소와 접합된 항-DIG 항체(1:500)로 인큐베이션하였다. 그 후, 세포를 세척 완충액으로 세척하고, 실온에서 3시간 동안 암실에서 검출 완충액 (0.1 M Tris-HCl, 0.1 M NaCl, pH 9.5) 중 니트로블루 테트라졸륨 클로라이드/5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-포스페이트 (NBT/BCIP)로 인큐베이션시켰다.
경쟁적 계대 NAFLAGWT 또는 NAFLAGM(-) 바이러스(300 개 플라크 형성 단위[PFU])를 3×104 PFU의 NA(-) 바이러스와 혼합하고, 하부 융합성 MDCK 세포(감염 다중도 0.01)를 감염시키는데 사용하고, 트립신 0.5 ㎍/ml 및 비브리오 콜레라 시알리다제 100 μU/ml를 함유하는 매질에서 72시간 동안 인큐베이션시켰다. 수거된 바이러스를 MDCK 세포를 감염시키는데 사용하였다. 이 과정을 5회 반복하였다.
결과
NA 유전자 절편이 결핍된 인플루엔자 A 바이러스는 생존가능하다. 반복된 계대후 말단절단형 NA 유전자의 유지는 바이러스 복제에 대한 그의 중요성을 암시하였다. NA RNA 절편없이 돌연변이체 인플루엔자 A 바이러스를 발생시키기 위해, 293T 세포를 NA vRNA를 제외한 vRNA의 제조 및 9개 구조 단백질의 발현을 위한 플라스미드로 형질감염시켰다. 비브리오 콜레라 시알리다제의 존재하에 MDCK 세포를 사용한 293T 세포 배양의 상등액의 인큐베이션시, 플라크(189±15.6 ㎛ 직경)가 관찰되었다. 액체 배양에서, 이 바이러스(NA(-)로서 명명됨)는 105 PFU/ml까지 성장하였다. 따라서, 단지 7 개 vRNA 절편만을 갖는 인플루엔자 A 바이러스가 생존가능하였다.
말단절단형 NA 절편은 효율적인 바이러스 성장에 필요하다. 반복 계대후 말단절단형 NA 유전자의 안정한 유지를 위한 분자 기준을 이해하기 위해, 말단절단형 NA 유전자를 함유하는 바이러스의 성장을 NA(-) 바이러스를 코딩하는 NA 유전자용 출발 코돈이 결핍된 바이러스와 비교하였다. 돌연변이 바이러스 NAFLAGWT를 역유전학에 의해 발생시켰다. NAFLAGWT는 내부 결실을 갖는 NA 유전자 및 말단절단형 NA 유전자에 융합된 FLAG 에피토프 서열을 갖는다. NAFLAGWT는 105 PFU/ml까지 성장하였고, 박테리아 시알리다제의 존재하에 플라크를 생성하였다. 플라크를 항-FLAG 모노클로날 항체 또는 항-WSN 폴리클로날 항체로 면역염색시켰다(도 4c). NA(-) 또는 NAFLAGWT 바이러스에 의해 생성된 플라크를 항-WSN 항체로 염색시켰으나, 단지 후자의 바이러스의 플라크는 항-FLAG 항체로 염색시켰다.
복제능의 차이를 결정하기 위해, NA(-) 및 NAFLAGWT 바이러스를 100:1의 비로 혼합하고, 이 혼합물을 MDCK 세포와 함께 인큐베이션하였다 (도 5). 감염후 제48시간에서, 상등액을 제거하고, 항-FLAG 모노클로날 항체로 면역염색되는 플라크의 제조에 사용하였다. 말단절단형 NA 절편을 갖는 바이러스의 유병율은 총 플라크중에 FLAG-양성 플라크의 백분율을 계산함으로써 결정하였다. 이 과정을 4회 이상 반복하였다. 도 7b에 나타낸 바와 같이, 집단에서 FLAG-양성 플라크는 계대시 점차로 증가하여 5회 계대에 의해 거의 90%에 도달하였다. 이 결과는 8개 절편을 갖는 바이러스(말단절단형 NA 유전자가 관능성 시알리다제를 코딩하지 않을지라도)가 7개 절편을 갖는 바이러스보다 잘 성장한다는 것을 나타낸다.
바이러스 RNA 는 효율적인 바이러스 성장에 중요하다. 말단절단형 NA 단백질 또는 바이러스 RNA가 효율적인 바이러스 복제에 중요한지를 결정하기 위해, NA 출발 코돈 및 또다른 프레임내 ATG 코돈(제15 코돈) 둘다가 결핍된 NAFLAGM(-) 유전자를 구축하였다 (도 6a). NAFLAGM(-) 바이러스에 의해 생성된 플라크는 항-FLAG 항체에 의해 검출되지 않았고 (도 6b), 이는 단백질이 번역되지 않았다는 것을 나타낸다. NAFLAGM(-) 바이러스가 NAFLAGM(-) 유전자를 갖는다는 것을 보장하기 위해, FLAG 서열-특이적 프로브를 사용하여 상기 바이러스에 의해 생성된 플라크상에 동일계내 혼성화를 수행하였다. 이들 플라크는 프로브와 반응하여 상기 바이러스중 NAFLAGM(-) 유전자의 존재를 확인시켰다. 그 후, 상기 바이러스의 복제능을 상기 기재된 7 개 절편 바이러스와 비교하였다. FLAG 서열-특이적 프로브로 표지된 플라크의 백분율은 점차로 증가하였고(도 7b), 플라크의 거의 80%가 제5 계대에 의해 FLAG 서열-양성이 되었다 (도 7a). 항-FLAG 항체를 사용한 염색의 결핍에 의해 입증되는 바와 같이 계대 동안 말단절단형 NA 단백질을 발현시키는 것들에 대한 복귀돌연변이주가 존재하지 않았다. 따라서, NAFLAGM(-)이 혼합 감염에서 지배적이 되는 속도가 NAFLAGWT 바이러스의 속도보다 느리기 때문에 말단절단형 NA 단백질은 또한 효율적인 바이러스 복제에서 역할을 할 수 있지만, 바이러스 RNA 자체는 효율적인 바이러스 복제에 중요한 역할을 하는 것처럼 보인다.
바이러스 NA RNA 의 패키징 신호는 코딩 서열로 확장됨. CK2-29 및 E17E 바이러스 (Hughes 외., 2000)의 계대 확장 후에도, 말단절단형 NA 유전자는 유지되었고, 이것은 비리온으로 vRNA 혼입에 대한 신호 (즉, 패키징 신호)는 NA RNA 절편의 코딩 영역에 존재함을 제시하였다. 이러한 가설을 시험하기 위해, eGFP 코딩 서열을 NA 서열이 결실된 프레임내 말단절단형 NA 유전자 중으로 삽입하였다. 따라서, NA-(183)GFP(157)로 지정된 이러한 재조합 유전자는 NA vRNA의 3'비코딩 말단 및 N-말단 NA 코딩 영역의 61 코돈, eGFP 코딩 영역 및 NA vRNA의 5'말단의 185 뉴클레오티드를 보유하였다. 상응하는 야생형 NA 유전자 대신 NA-(183)GFP(157) 유전자를 지닌 바이러스를 제조하고, 플라크 분석을 수행하였다 (도 8A). 플라크의 90 % 이상은 eGFP을 발현하고, 이것은 NA-(183)GFP(157) 유전자가 비리온으로 혼입되어 바이러스 복제 동안 유지됨을 나타낸다 (도 8B). 이러한 발견은 비코딩 서열에 의해 플랭킹된 CAT 서열이 5 계대 초과 동안 유지되지 않는다는 것을 고려하면 흥미롭다 (Luytjes 외., 1989).
NA-(183)GFP(157) 및 CAT 구조물의 차이점은 바이러스 코딩 서열의 존재이기 때문에, CAT 구조물과 유사한 유전자는 3' 및 5'NA 비코딩 영역에 의해 플랭킹된 eGFP 코딩 서열을 함유하는, 생성된 NA(O)GFP(O)이었다. 이러한 구조물은 NA 코딩 서열이 없다. 이러한 유전자로 생성된 바이러스가 플라크를 생산할지라도, 단지 플라크의 소수 (0.1 %)만이 하나 또는 두개의 eGFP-발현 세포를 가지며, 이것은NA(O)GFP(O) 유전자가 바이러스 복제 동안 바이러스 내에서 유지되지 않음을 나타낸다. 바이러스 생산을 위한 NA(O)GFP(O) 유전자를 발현하는 것을 비롯한, 플라스미드로 형질감염된 293T 세포에서, eGFP는 플라스미드 발현 NA(61)GFP로 형질감염된 것과 비교하여 보다 작은 범위로 발현되었다. NA(O)GFP(O)를 위한 PolI 플라스미드의 양은 10 배 증가하여, NA(61)GFP를 위한 PolI 플라스미드로 형질감염된 세포와 유사한 수의 eGFP-발현 293T 세포를 생성하였다. 상기 유전자를 위한 10 배 많은 양의 PolI 플라스미드를 사용하여도, NA(O)GFP(O) 바이러스에 의해 생산된 단지 1 % 플라크만이 eGFP 양성 세포를 함유하고, 이러한 플라크의 약간의 세포만이 eGFP를 발현하였다. 상기 결과는 바이러스 NA RNA의 패키징 신호가 NA 코딩 서열로 확장함을 나타낸다.
효율적인 비리온 생산에서의 RNA 절편의 역할. 8개의 RNA 절편을 갖는 바이러스가 7개의 절편을 갖는 바이러스보다 잘 자라는 이유를 이해하기 위해, 감염성 비리온 생산을 6,7 또는 8개의 바이러스 RNA 절편을 지닌 바이러스 사이에서 비교하였다 (도 9). 8개의 절편 바이러스를 생산한기 위해, 293T 세포를 모든 9 구조 단백질을 위한 단백질 발현 플라스미드 및 일반적인 바이러스 생산을 위한 8 PolI 플라스미드로 감염시켰다. 또한, NS2 생산을 제거하는 2종의 돌연변이를 갖는 NS PolI 플라스미드를 사용하였고, 따라서 293T 세포로부터 생산된 바이러스는 다중 주기 복제를 수행하지 않았다. 또한, 각각 HA 단백질 및 NA 단백질의 생산을 제거하는 돌연변이를 갖는 HA 및 NA PolI 플라스미드를 사용하여, 유전자 절편의 제거 효과가 유전자 생성물이 아닌 RNA 절편에만 제한되도록 하였다. 7개의 절편 바이러스의 생산을 위해, NA 유전자를 위한 PolI 플라스미드를 제거하였지만, NA 단백질의 발현을 위한 플라스미드는 포함되었다. 6개의 절편을 갖는 바이러스를 제조하기 위해, HA 및 NA RNA를 위한 플라스미드를 제거하지만, HA 단백질 및 NA 단백질의 발현을 위한 플라스미드는 포함되었다.
이러한 바이러스 사이에서의 비리온 생산과 비교하여, 플라스미드 형질감염된 세포로부터 생산된 감염성 비리온의 수는 이러한 바이러스를 갖는 감염 MDCK 세포 및 감염 48 시간 후 안티-WSN 항체를 갖는 면역염색된 감염 세포에 의해 적정하였다. 도 9에 나타낸 바와 같이, 감염성 비리온 생산의 효율은 바이러스 RNA 절편의 수와 상호관련이 있었는데, 바이러스 RNA 절편의 수가 높을수록, 비리온 생산도 양호하였다. 이러한 결과는 효율적인 비리온 생산에서의 바이러스 RNA 절편의 역할을 나타낸다.
NA vRNA 의 3'말단은 비리온의 패키징에 중요함. NA vRNA 중에서의 패키징 신호를 감소시키기 위해, 3' 또는 5'(vRNA 센스) 코딩 영역에서 추가 결실된, 말단절단형 NA 유전자를 갖는 바이러스를 제조하였다 (도 8A). NA 코딩 영역의 5'말단이 없는 NA-(183)GFP(0) 바이러스에 의해 생산된 플라크의 대략 40 %는 eGFP를 발현하는 반면, NA 코딩 영역의 3'말단이 없는 NA0G185 바이러스에 의해 생산된 플라크의 1.8 %만이 eGFP를 발현하였다. 상기 데이타는 NA vRNA 코딩 영역의 3'말단이 비리온 패키징에 중요하다는 것을 나타낸다 (도 8).
논의
결실 구조물을 제조함으로써, 비리온으로 NA 절편을 혼입하는 NA 코딩 영역을 결정하였다. 코딩 영역의 양 말단은 중요한 것으로 밝혀졌지만, NA 코딩 영역의 5'말단에 상응하는 vRNA의 3'말단은 다른 말단보다 더욱 중요하였다. NS 절편의 경우에, NS 코딩 영역의 5'말단에 상응하는 vRNA의 3'말단은 혼입을 위한 다른 말단보다 더욱 중요한 듯하였다 (도 22). 대조적으로, HA, M 및 NP 절편의 경우 양 말단은 중요하고, PB2의 경우 PB2 코딩 영역의 3'말단에 상응하는 vRNA의 5'말단이 중요하다. 상기 결과는, vRNA 절편 혼입을 위해 중요한 서열이 코딩 영역에 위치하고, 따라서 각각의 절편에 대해 독특함을 나타낸다. 가능하게는, 이러한 영역은 염기 짝짓기에 의해 다른 바이러스 RNA와 상호작용하여, 8개의 vRNA 절편 한 세트를 비리온으로 보충시켰다. vRNA 및 바이러스 성분 사이의 상호작용은 바이러스-특이적이기 때문에, 항바이러스 화합물 개발의 타켓이 될 수 있다.
실시예 3
바이러스 내용물의 진정한 화상을 수득하기 위해, 전자 현미경 단층 촬영을 수행하였다 (도 11a). 두께가 50 nm인 비리온의 화상을 수집하였다. 이어서, 비리온 중 하나의 화상을 분석하고, 비리온 내용물의 3D 화상을 재구성하였다. 입자 내부의 구조물 (막대)을 염색하여 각각의 구조물을 구별하였다 (도 11b-f, 상부도, 측면도, 하부도를 나타냄). 대부분의 막대 도면은 절단되어 있지만, 막대의 중간을 절단한 도면의 경우에 전체 분자가 보였다. 그럼에도 불구하고, 모든 도면은 막대 간 상호관계를 보여주었다.
바이러스 내용물의 독특한 형태학적 특징의 형성에 기여하는, 각각의 바이러스 절편이 비리온으로의 혼입에 중요한 독특한 서열을 함유한다는 것을 지지하는 데이타를 비롯한, 상기 요약된 결과를 기준으로, vRNA 절편은 선택적으로 인플루엔자 비리온으로 혼입하는 것으로 보인다. 바이러스 특이적 상호작용의 방해는 바이러스 복제를 억제하고 감소시킬 수 있기 때문에, 이러한 정보는 항바이러스 화합물의 개발 뿐만 아니라, 감소된 생 백신의 제조를 위한 타켓을 확인하는데 유용하였다.
실시예 4
재료 및 방법
세포. 293T 인간 배아 신장 세포 및 COS-7 세포를, 10 % 소태아 혈청 및 항생제를 함유한 둘베코 변형 이글 최소 필수 배지 (Dulbecco's modified Eagle's minimal essential medium (DMEM)) 내에서 유지시켰다. 매딘-다비 (Madin-Derby)개 신장 (MDCK) 세포를, 5 % 신생 송아지 혈청 및 항생제를 함유한 MEM 중에서 배양하였다. 세포를 37 ℃에서 5 % CO2 중에 유지시켰다.
플라스미드의 구조물. 인간 RNA 폴리머라제 I 프로모터 및 마우스 RNA 폴리머라제 I 종결자에 의해 플랭킹된, 야생형 A/WSN/33(H1N1) (pPolI-WSN-HA로 불림) 및 야생형 B/Lee/40 (pPolI-B-HA) 바이러스의 HA 유전자를 함유하는 바이러스 RNA 생산 (pPolI과 관련)을 위한 플라스미의 구조물의 제조는 뉴만 (Neumann 외)(1999)에 기재되어 있다. 일련의 A/B 키메라 HApPolI 구조물은 프라이머를 갖는 PCR 증폭기 및 프루프스타트 (ProofStart) 폴리머라제 (QiAGEN) 및 야생형 HA 구조물을 사용한 후속 결찰로 제조하였다 (도 13). 모든 구조물은 불필요한 돌연변이가 포함되지 않도록 배열되었다.
세포 배양 내 발현된 HA 의 생물학적 분석
A/WSN 바이러스의 핵산단백 (NP) 및 3개의 중합효소 서브유닛 (PA, PB1 및 PB2)을 발현하는 다른 4개의 pCAGGS 기재의 플라스미드 (각각 1 ㎍)과 함께 트란스 IT 시약 (미루스 (Mirus))을 사용하여 각 A/B 키메라 HA pPo1I 구조물 (1 ㎍)을 COS-7 세포로 형질감염시켰다 (문헌 [Neumann et al., 1991] 참조). 형질감염 48시간 후, 세포를 37 ℃에서 30분 동안 비브리오 콜레라 시알리다제 (Vibrio cholerae sialidase, 10 U/ml) 및 TPCK-트립신 (2.5 ㎍/ml)로 처리하였다. 그 후, 세포를 4 ％ 파라포름알데히드로 고정시키고 항-B/HA 항체 및 시판되는 ABC 검출 키트 (벡터 실험실 (Vector laboratory))를 사용하여 면역염색하였다. 또한, 혈구흡착 분석을 수행하여 각 HA의 수용체 결합 특성을 조사하였다. 요약하면, 형질감염된 세포를 실온에서 30분 동안 인산염 완충 염수 (PBS) 중 1 ％ 치킨 적혈구 현탁액 중에서 인큐베이션시키고, 그 후 5회 세척한 후 관찰하였다. 추가로, 융합 분석을 수행하였다. 요약하면, 형질감염된 세포를 37 ℃에서 5분 동안 HEPES 완충액 (pH 5.0) 중에서 인큐베이션한 후, 배양 매질 중에서 7시간 동안 인큐베이션하였다. 저온 메탄올로 고정시킨 후, 융합된 세포를 상기와 같이 면역염색하였다.
역유전학
바이러스를 문헌 [Neumann et al. (1999)]에 기재된 바와 같이 플라스미드 기재의 A/WSN 또는 B/Lee 역유전학 시스템에 의해 생성시켰다. 플라스미드로부터 생성된 야생형 유전형을 갖는 바이러스를 각각 A/WSN-R 또는 B/Lee-R로 명명하고, 비교용 대조군으로서 사용하였다. A/B 키메라 바이러스를 생성시키기 위해, pPo1I-WSN-HA 대신에 키메라 HA Po1I-구조물을 사용하였다. 293T 세포로부터 생성된 바이러스를 희석을 1회로 제한하여 생물학적으로 클로닝하여 원료 바이러스를 MDCK 세포 내에 생성시켰다.
실험적 감염
바이러스 병원성 테스트를 위해, 세보플루란으로 마취시킨 4주된 암컷 BALB/c 마우스를 A/B 키메라 또는 야생형 바이러스 (105 TCID50/50 ㎕)로 비강내 감염시켰다. 감염 후 14일 동안 사망률 및 체중을 모니터링하였다. 감염 3일 후, 감염된 마우스 일부를 기관내 바이러스 역가 측정을 위해 안락사시켰다.
야생형 감염에 대한 각 키메라 바이러스의 백신 효능을 평가하기 위해, 마우스를 키메라 또는 야생형 바이러스 (103 TCID50/50 ㎕)로 비강내 감염시켰다. 3주 후, 한 그룹의 마우스를 안락사시켜 바이러스-특이적 IgA 또는 IgG 항체 검출을 위해 기관-코 세척물 및 혈청을 얻었다. 감염 4주 후, 나머지 마우스를 마취 하에 야생형 바이러스 (B/Lee-R)의 50 LD50으로 비강내 감염시키고, 14일 동안 사망률 및 체중을 모니터링하였다.
바이러스-특이적 항체의 검출
혈청 및 기관-코 세척물 샘플을 문헌 [Kida et al. (1982)]에 기재된 바와 같이 효소 결합된 면역흡수 분석법 (ELISA)에 의해 IgA 또는 IgG 항체에 대해 검사하였다. 또한, HI 항체를 수용체 파괴 효소 (RDEII: 덴카 세이켄 (Denka Seiken))로 처리한 후 혈청 샘플을 사용하여 검사하였다.
결과
A/B 키메라 HA 유전자의 구축
B형 HA와 A형 바이러스 성분과의 상용성을 결정하기 위해, 일련의 키메라 유전자를 A/WSN과 B/Lee HA 유전자 사이에 구축하였다 (도 14). RNA 절편의 양 말단 내의 비코닝 서열은 RNA 전사 및 복제를 위해 A형과 B형 바이러스간 상호교환이 가능하기 때문에 (문헌 [Crescenzo-Chaigne et al., 1999], [Desselberger et al., 1980] 및 [Muster et al., 1981] 참조), A형 바이러스의 비코딩 서열 및 B형 바이러스로부터의 완전 코딩 서열을 함유하는 키메라 HA 유전자가 제조되었다 (도 14A, ANBH). 이 구조물은 무손상 B형 HA 단백질을 생성하였다. 이어서, B형 HA 코딩 서열 및 비코딩 서열의 신호 서열 영역이 A형 바이러스의 상기 영역으로 바뀐 키메라 유전자 (ANSBH)를 제조하였다. 또한, 이 구조물은 세포 신호 펩티다제에 의해 A형 신호 펩티드 제거 후 무손상 B형 HA를 생성하였다. 유사하게, HA의 서열 코딩 막횡단 및 세포질 영역이 B형에서 A형으로 바뀐 키메라 유전자 (ANTBH)를 제조함으로써, A/B 키메라 HA 단백질을 코딩하였다. 신호 및 막횡단/세포질 영역 양쪽 모두 코딩하는 서열이 B형에서 A형으로 바뀐 또다른 키메라 유전자 (ANSTBH)를 제조하였다. 이 구조물은 신호 펩티드 제거 후 ANTBH와 동일한 키메라 HA 단백질을 생성하였다. 또한, HA 코딩 서열 내의 A형 바이러스로부터의 하류 영역 및 B형으로부터의 절단 부위에 상응하는 상류 영역 서열을 모두 함유하는 키메라 (ANBW)를 제조하였다. 이 구조물은 B형 바이러스의 HA1 영역 및 A형 바이러스의 HA2 영역을 포함하는 키메라 HA 단백질을 생성하였다. 마지막으로, ANBW 구조물 내의 신호 서열이 B형에서 A형으로 바뀐 키메라 유전자를 제조하였고, 이로 인해 ANBW의 경우와 동일한 키메라 HA 단백질이 생성되었다.
세포 배양 내 발현된 A/B 키메라의 생물학적 특성. 키메라 HA의 기능을 검사하기 위해, 각 pPo1I HA 구조물을 A형 바이러스 PA-, PB1-, PB2- 및 NP-발현 플라스미드와 함께 COS-7 세포로 형질감염시켰다. 모든 키메라 HA 구조물이 세포 표면 상에 발현되었다. 이들 HA의 수용체-결합 활성을 테스트하기 위해, 혈구흡착 분석을 수행하였다. 분석에 앞서, 형질감염된 세포를 그의 수용체 결합 활성을 저해하는 HA 올리고당 측쇄 내의 말단 시알산 제거를 위해 박테리아 시알리다제로 처리하였다 (문헌 [Luo et al., 1999] 참조). ANBH-, ANSBH-, ANTBH- 및 ANSTBH-발현 세포를 혈구흡착시키고, 다른 둘 (ANBW 및 ANSBW)을 발현하는 세포는 혈구흡착시키지 않았다 (표 3). 유사하게, 전자 HA의 경우 세포 융합을 유도하였고, 후자의 경우에는 세포 융합을 유도하지 않았다. 이들 결과는 전자 HA 키메라는 생물학적 기능을 갖는 반면 후자의 둘은 생물학적 기능이 없음을 나타내며, 이는 구조적 변화 때문일 것이다. 상기 결과로부터 예상되는 바와 같이, 관능성 B형 HA는 A형 중합효소 복합체 및 NP에 의해 무손상 야생형 B HA 절편으로부터 생성되며 (표 3), 이로부터 B형 프로모터 구조와 A형 중합효소 복합체 사이의 상용성이 확인된다.
세포내에서 발현된 A/B 키메라 HA 및 그들을 보유하는 바이러스의 특성
HA 구조물 세포 배양물에서의 특성a) 상기 유전자를 보유하는 바이러스의 생성b) 감염된 세포의 상청액 중의 바이러스 역가b) (TCID50/ml) 원액의 바이러스 역가c)(TCID50/ml)
세포 표면 발현 혈구흡착 융합
야생형 HA
WSN-HA + + + + 3.2x107 6.3 x 107
B-HA + + + - NAd )
A/B 키메라 HA
ANBH + + + + 2.0 x 10 6.3 x 102
ANSBH + + + + 1.1 x 102 2.0 x 106
ANTBH + + + + 2.0 x 104 6.3 x 106
ANSTBH + + + + 1.1 x 106 3.6 x 106
ANBW + - - - NA
ANSBW + - - - NA
a) 각각의 HA 구조물을 A형 폴리머라제- 및 NP-발현 플라스미드와 함께 COS-7 세포 내에서 형질감염시켰다. 형질감염후 48시간째에, 각각의 HA의 생물학적 특성을 분석하였다.
b) 야생형 또는 키메라 HA 유전자를 다른 인플루엔자 A 바이러스 유전자와 함께 보유하는 바이러스의 생성을 플라스미드계 역 유전학 시스템에 의해 수행하였다. 형질감염후 48시간째에, 형질감염된 294T 세포의 상청액을 수거하고 감염도에 대해 적정하였다.
c) 바이러스 원액을 MDCK 세포로 제조하였다. 세포병변 효과가 개선될 때 바이러스를 수거하였다.
d) NA: 이용불가능
키메라 HA 를 이용한 바이러스 생성. 키메라 HA 유전자가 인플루엔자 A 바이러스 감염 동안에 기능하는지 측정하기 위해, HA 유전자가 A/B HA 키메라 유전자로 치환된 돌연변이 WSN 바이러스를 제조하였다. 플라스미드-기초 역유전학은 약 107 TCID50/㎖의 역가를 갖는 야생형 바이러스의 발생을 가능케 하였다 (표 3). pPolI-B-HA가 pPolI-WSN-HA 대신 사용된 경우, 감염성 바이러스가 발생되지 않았다. 생물학적으로 기능성인 4 종의 키메라 HA 구조물 (표 3)은 비록 효율이 상이하기는 하나 플라스미드-형질감염된 세포의 상등액의 바이러스 역가로 판단할 때에 감염성 A형 바이러스에서 성공적으로 보호되었다. ANBH HA를 보유하는 바이러스는 단지 최소한으로만 복제된 반면, ANSTBH HA를 갖는 바이러스는 가장 높은 효율로 생성되었고 106 TCID50/㎖ 초과로 성장하였다. 생물학적으로 기능성인 단백질을 발현하지 않은 다른 2 종의 키메라 HA 유전자는 바이러스 성장을 지원하지 않았다. A/B 키메라 바이러스를 ANBH, ANSBH, ANTBH 및 ANSTBH 바이러스로 명명하였다.
생성된 바이러스가 실제로 B형 HA 엑토도메인을 함유하는지 확인하기 위해, MDCK 세포를 이들 바이러스로 감염시키고, A형 또는 B형 바이러스의 항체에 대한 그의 반응성을 시험하였다 (도 14). 키메라 HA 구조물을 함유하는 바이러스로 감염된 세포는 항-B/HA 뿐만 아니라 항-A/NP 항체와도 반응하였으나 항-A/HA 항체와는 반응하지 않아 이들 바이러스가 B형 HA 엑토도메인을 함유함을 확인시켜 주었다.
세포 배양액 중 A/B 키메라 바이러스의 성장 특성. A/H HA 키메라 바이러스의 복제 특성을 측정하기 위하여 세포를 바이러스에 의해 0.01의 MOI로 감염시키고 감염된 바이러스의 성장 동역학을 검사하였다 (도 15). 키메라 HA를 갖는 바이러스 중 그 어느 것도 야생 A형 바이러스보다 많이 성장하지는 않았으나, ANSTBH 및 ANTBH 키메라 바이러스는 거의 106 TCID50/㎖까지 성장하였다. A형 및 B형 바이러스 둘다와는 달리, 이들 모든 키메라 바이러스는 면역염색법에 의해서만 검출될 수 있는 소량의 플라크를 형성하였다 (데이타는 나타내지 않음).
마우스에서의 A/B 키메라 바이러스 복제. 세포 배양액 중 A/B 키메라의 한정된 복제는 이들 바이러스가 생체내에서 약독화될 수도 있음을 시사한다. 따라서, 마우스를 A/B HA 키메라 바이러스 (105 TCID50/50㎕)로 비내 접종시켰다. ANBH 바이러스는 원액의 역가가 너무 낮았으므로 (약 103 TCID50/㎖) 측정하지 않았다. 다른 3 종의 시험된 키메라 바이러스 중 그 어느 것도 마우스에 치명적이지 않았던 반면, 동일 투여량의 야생 A형 바이러스는 감염된 모든 마우스를 사망시켰으며, 동일 투여량의 야생 B형 바이러스는 8 마리의 감염된 마우스 중 7 마리를 사망시켰다 (표 4). 키메라 바이러스를 접종후 제3일에 폐 및 비골개에서 회수하였으며, 이는 이들 바이러스가 마우스에서 복제되었음을 나타낸다. 흥미롭게도, 키메라 바이러스의 복제는 야생형 바이러스의 복제에 비해 폐에서는 보다 많이 한정되었고 비골개에서는 보다 적게 한정되었다. 이것은 폐에서의 복제 수준과 치사율이 관련될 수 있음을 제시한다. ANTBH 및 ANSTBH 키메라 바이러스로 감염된 마우스는 야생 A형 바이러스로 감염된 마우스에 비해 그 정도가 더 낮기는 하나 체중이 감소되었다. 이들 데이타는 종합적으로 A/B HA 키메라 바이러스가 마우스에서 약독화됨을 나타낸다.
마우스에서의 A/B 키메라 바이러스의 병원성
야생형 바이러스 기관내 복제b) 체중 변화율 (%)C) 치사율 (%)(사멸수/시험된 수)
비개골 폐 제5일 제14일
A/WSN-R 5.0±0.3 8.2±0.1 -27.4±1.1 NAc ) 100 (8/8)
B/Lee-R 4.7±0.1 5.6±0.1 -19.3±7.9 NA 87.5 (7/8)
A/B 키메라 바이러스
ANSBH 4.0±0.3 2.8±0.3 2.6±1.0 4.6±1.2 0 (0/8)
ANTBH 5.3±0.3 4.9±0.1 -17.3±0.7 -8.3±0.4 0 (0/8)
ANTSTBH 5.3±0.4 4.6±0.1 -20.9±0.3 -6.2±8.8 0 (0/8)
대조군 (PBS)d) NA NA 2.9±1.3 7.1±0.2 0 (0/8)
a) 마우스에게 바이러스 (106 TCID50)로 비내 접종하여 14일 동안 모니터링하였다. 체중 변화를 평균치±표준 오차 (SD (n=3))로서 나타내었다.
b) 바이러스 역가를 기관내에서 접종후 3일째에 측정하여 log10TCID50/g의 평균치±SD (n=3)로서 나타내었다.
c) NA: 이용불가능
d) 대조군 마우스를 인산염-완충 염수로 모의 접종하였다.
야생형 바이러스 감염에 대해 A/B HA 키메라 바이러스로 면역화시킨 마우스의 보호. A/BHA 키메라 바이러스는 B형 바이러스에서 유도된 HA 엑토도메인을 발현하기 때문에, 이 바이러스가 야생-B형 바이러스 감염에 대한 보호 면역 반응을 제공할 것으로 예상되었다. 챌린지 실험 전에, 키메라 바이러스로 감염된 마우스에서 항-B 항체가 유도되는지 측정하였다. 접종후 제3주에, 키메라 바이러스로 감염된 마우스에서 얻은 코/기관 세척 샘플에서는 B형 바이러스-특이적 IgA를, 혈청 샘플에서는 IgG 항체를 ELISA 시험으로 검출하였다 (도 16A). 또한, A/B HA 키메라 바이러스-감염된 마우스에서 얻은 혈청 샘플에서 HI 항체를 검출하였다 (도 16B). 따라서, 비록 ANSBH 바이러스는 덜 효율적인 면역 반응을 유도했지만, 키메라 바이러스로 감염된 모든 마우스에서 특이적 항체 반응을 입증하였다.
키메라 바이러스-면역화 마우스는 면역화후 제4주에 야생-B형 바이러스 50LD50으로 챌린지시켰다 (표 5). 챌린지 후 모든 마우스가 생존했지만, 야생-B형 바이러스 챌린지에 의해 대조군의 모의-면역화 마우스가 모두 사망하고 준치사량 (103TCID50)의 WSN 바이러스로 면역화시킨 마우스 8 마리 중 2 마리만 생존한 것은, 야생-B형 바이러스 감염에 대한 키메라 바이러스 면역화의 특이적 보호 효과를 나타내는 것이다. 추가로, 키메라 바이러스로 미리 면역화시킨 마우스의 코선반 또는 폐에서는 B형 바이러스가 회수되지 않았으나, 챌린지후 제3일에 ANSBH 바이러스를 수용한 마우스 1마리는 예외였다 (데이타는 나타내지 않음).
야생-B형 바이러스 챌린지에 대해 A/B 키메라 바이러스로 면역화시킨 마우스의 보호
면역화에 사용된 바이러스a) 챌린지 후b)
체중 변화 (％) 생존율 (％)
제5일 제14일 (생존자수/시험체수)
야생형 바이러스
A/WSN-R -17.5±3.6 NAc ) 25(2/8)
B/Lee-R 1.8±0.9 1.4±0.6 100 (8/8)
A/B 키메라 바이러스
ANSBH -5.6±0.8 -0.7±0.7 100 (8/8)
ANSBH 0.9±0.9 1.9±0.9 100 (8/8)
ANSBH 1.5±0.2 2.9±0.7 100 (8/8)
대조군 (PBS)d) -20.8±0.5 NA 0 (0/8)
a) 마우스들을 나열된 각각의 바이러스로 비강내 감염시켰다.
b) 면역화후 제4주에, 마우스를 야생형B/Lee-R 바이러스(50LD50)로 비강내 챌린지시키고, 챌린지후 14일 동안 모니터링하였다. 체중 변화를 평균값 SD (n=3)로 나타냈다.
c) NA : 데이타 없음
d) 대조군 마우스를 PBS로 모의-면역화시키고 챌린지시켰다.
논의
본원에 기재한 바와 같이, 최초로 A형 바이러스의 배경에서 A, HA 대신 B형을 가짐으로써, A형 및 B형 바이러스 단백질을 둘다 보유하는 인플루엔자 바이러스를 생성하였다. A/B HA 키메라 바이러스의 생성에 필수적인 것은 무엇인가? 키메라 유전자가 비리온 내에 유지되기 위해서는 전사 및 복제되어야 한다. RNA 전사 및 복제에 필요한 프로모터 서열을 함유하는 비코딩 영역 양쪽 말단의 말단 서열 [Luytjes et al., 1989]은, 비록 동일한 바이러스형에서 보존되어 있지만, A형 및 B RNA 절편에서 상이하다 [Crescenzo-Chaigne et al., 1999; Desselberger et al., 1980]. 그러나, 종래의 연구는 B형 바이러스 NS 절편의 비코딩 서열에 플랭킹된 리포터 유전자에 의해, 이것이 A형 중합효소에 의해 전사 및 복제됨을 밝혔다 [Muster et al., 1991]. 또한, A형 바이러스 NA의 코딩 서열 및 B형 바이러스 NS의 비코딩 서열을 포함하는 키메라 유전자를 함유하는 키메라 A/B 인플루엔자 바이러스 (NA/B-NS)가 제조되었다 [Muster et al., 1991]. 이러한 데이타는 A형 중합효소 복합체가, A형 바이러스 유전자의 동종 프로모터 보다는 덜하지만, B형 NS 유전자의 프로모터 서열을 인식함을 나타냈다.
각 RNA 절편의 비코딩 서열은 8개의 RNA 절편 모두에서 보존된 말단 서열 및 내부 절편-특이적 서열의 2가지 구조 영역을 포함한다. 프로모터의 활성은 주로 전자의 영역에서 결정되기 때문에 [Portela et al., 1999], 모든 B형 유전자 절편은 A형 중합효소 복합체에 의해 전사 및 복제될 것이다. 실제로, 이러한 개념은 B형 비코딩 영역 및 A형 중합효소 복합체를 함유하는 pPolI-B-HA 및 NP-발현 플라스미드와 함께 공형질감염된 세포에서 B형 HA가 발현되었다는 데이타에 의해 지지된다 (표 3). 따라서, 무손상 B형 HA 절편, 즉, HA 유형간 재배열제를 함유하는 바이러스의 생성의 실패는 RNA 전사 및 복제의 결핍으로 설명될 수 없다.
키메라 바이러스 생성의 제한은 비리온 내에 혼입될 수 있는 RNA 절편의 수준으로 인한 것일 수 있다; 바이러스의 생성을 위해서는, 키메라 절편이 비리온 내에 패키징되어야 한다. 비록 A형 NS 절편의 비코딩 영역이 RNA 패키징 신호를 함유하는 것으로 보고되었지만 [Luytjes et al., 1989], 인플루엔자 바이러스 RNA 절편의 패키징 기전은 완전히 밝혀지지 않았다. 비리온 혼입에 필요한 RNA 절편의 서열 또는 구조적 특징은 거의 공지되어 있지 않다; 그러나, 최근 A형 NA RNA 절편이 코딩 영역의 양쪽 말단에 비리온 혼입 신호를 보유함이 밝혀졌다 ([Fujii et al., 2002] 및 실시예 2). 이 연구에서는, ANSBH 바이러스가 ANBH 바이러스 보다 더 효율적으로 복제되었다 (도 14 및 표 3). 이 2종의 바이러스에서 발현되는 HA 단백질은 동일해야 하기 때문에, 복제 효율의 차이는 RNA 패키징 효율에 의한 것일 수 있다. 즉, 효율적인 RNA 패키징에 필요한 구조적 특징이 HA의 신호 서열을 코딩하는 영역내에 존재할 수 있다. 유사하게, 이것은 또한 동일한 HA 단백질을 발현하는 ANTBH 및 ANSTBH 바이러스 사이의 복제 효율의 차이도 또한 설명할 수 있다. 실제로, A형 HA 절편에 대한 패키징 신호는 코딩 영역의 양쪽 말단에 위치한다 (비공개 데이타). 흥미롭게도, A형 바이러스 NA의 비코딩 서열 및 B형 NA의 코딩 서열을 함유하는 키메라 NA 유전자는 A형 바이러스로 보호되지 않았다 [Ghate et al., 1999]. 이것은 RNA 패키징 신호를 함유하는 A형 NA 코딩 영역의 결핍에 의해 설명될 수 있으며, 상기 언급된 최근의 발견과 일치한다 [Fujii et al., 2002].
또한, A/B HA 키메라 바이러스의 생성을 위해서는 단백질 수준에서의 결정적인 상호작용이 존재할 수 있다; 키메라 단백질은 비리온 내에 패키징되어야 하고, 바이러스 복제에 기능해야 한다. 대체된 B형 NA 단백질은 A형 NA의 기능을 대신하고, A형 비리온 내에 혼입되어 세포 배양에서 NA-결손된 A형 바이러스의 다수의 복제 사이클을 지지할 수 있다 [Ghate et al., 1999]. 그러나, 상기 고찰된 바와 같이, B형 NA를 함유하는 A형 바이러스는 생성되지 않았다. 비록 키메라 A/B HA 바이러스가 생성되었지만, 이들은 야생형 바이러스에 비해 약독화되었다. 이러한 약독화는 B형 HA의 수용체-결합 활성과 A형 NA의 시알리다제 활성 사이의 차선적인 균형으로 인한 것일 수 있다. 추가로, HA내에서 신호 펩티드 및/또는 막횡단/세포질성 도메인의 대체에 의해 이들의 구조가 변경되었을 수 있다. 예를 들어, HA 내의 막횡단/세포질성 도메인은 다른 바이러스 성분, 예컨대 M1와 상호작용하여 효율적인 비리온 어셈블리를 인도할 수 있다 [Ali et al., 2000; Cenami et al., 1996; Jin et al., 1997; Zhang et al., 2000]. 따라서, 무손상 B형 RNA 절편을 보유하는 A형 바이러스의 생성불능 또는 그 역은 RNA 절편 혼입의 수준 또는 단백질의 기능적 상호작용의 수준에서의 제한 또는 둘다에 의해 설명될 수 있다.
A/B HA 키메라 바이러스는 폐에서 복제가 제한된 마우스에서 약독화되어 마우스에게 야생-B형 바이러스 감염에 대한 보호 면역을 수여하였으며, 이것은 인플루엔자 백신의 개발에 있어서 신규 접근법을 제시한다. 현재, 3가 불활성 인플루엔자 백신의 피하 투여가 국제 표준이지만, 이들의 효능은 차선적인 것이다. 이것은 주로 인플루엔자 바이러스가 초기에 침입하는 상부 호흡기의 점막 면역의 불만족스런 유도에 기인한 것이다 [Wavening et al., 2001]. 따라서, 이 백신들은 비록 병의 심각도를 감소시키지만, 바이러스 감염을 예방하지는 않는다. 불활성화 백신과 달리, 생 백신은 점막 및 세포독성 T-세포의 면역 반응을 둘다 유도한다. 본원에 기재된 연구는 HA 유전자의 키메라 조작에 의해 다양한 정도로 바이러스의 약독화를 제어할 수 있음을 제시한다. 따라서, 이러한 접근법은 약독화와 면역원성 사이에 적절한 균형을 가진 생 백신 균주의 제조를 허용할 것이다. 별법으로, A/B 키메라 HA는 약독화 돌연변이가 잘 규명된 저온-적응된 인플루엔자 A 바이러스에 혼입될 수 있다 [Maassab et al., 1999]. 현재의 저온-적응된 백신은 A형 및 B형 바이러스의 혼합물이다. 잠재적으로는, 2종의 바이러스 사이의 간섭이 백신의 효능에 영향을 주지만, 이 문제는 바이러스 투여량의 비를 조정함으로써 처리되어 왔다. A/B 키메라 HA를 갖는 A형 바이러스는 2종의 약독화된 바이러스 보다는 1종의 약독화된 바이러스를 기재로 하여, A형 및 B형 바이러스 사이의 잠재적인 간섭을 제거한 생 인플루엔자 백신의 제조를 허용할 것이다.
따라서, B형 백신 균주의 약독화 돌연변이에 대한 정보가 제한된, A형 및 B형 바이러스의 혼합물을 갖는 약독화된 생 백신과는 현저하게 다른, A형 바이러스 배경에 B형 HA 및 NA를 함유하는 바이러스를 제조할 수 있다. 이러한 접근법은 A형 뿐만 아니라 B형 HA 및 NA의 발현에서 약독화 돌연변이가 잘 정의된 마스터 백신 균주 기재 백신의 제조를 허용한다. 또한, 바이러스 절편에 대한 패키징 신호에 대한 지식도 또한 약독화된 생 인플루엔자 백신의 개선을 촉진한다.
실시예 5
재료 및 방법
세포 및 바이러스: 293T 인간 배아 신장 세포 (시미안 바이러스 40 (simian 바이러스 40) T 항원의 유전자가 삽입된, 293 세포주의 유도체)를 10％ 소 태아 혈청 (FCS)으로 보충한 둘베코 변형 이글 배지 중에 유지시켰다. 베이비 햄스터 신장 (BHK; Baby Hamster Kidney) 세포의 경우에는 5％ FCS를 함유하는 DMEM을 사용하고, 차이니스 햄스터 난소 (CHO; Chinese Hamster Ovary) 세포의 경우에는 10％ 신생 태아 혈청을 함유하는 MEM을 사용하였으며, 매딘-다비 개 신장 (MDCK) 세포의 경우에는 5％ 신생 태아 혈청을 함유하는 MEM을 사용하였다. 모든 세포를 37℃에서 5％ C02 중에 유지시켰다. 문헌 [Neumann et al. (1999)]에 기재된 바와 같은 역유전학을 이용하여 A/WSN/33 (H1N1) (WSN) 바이러스를 생성하고 MDCK 세포에서 증식시켰다. 역유전학을 이용하여 생성한 VSV 인디애나 (Indiana) 균주는 BHK 세포에서 증식시켰다.
역유전학: 인플루엔자 바이러스-유사 입자 (VLP; Virus-Like Particle) 및 돌연변이체 인플루엔자 A 바이러스를 생성하기 위해서, 인간 RNA 폴리머라제 I 프로모터 및 마우스 RNA 폴리머라제 I 종결자의 제어를 받는 WSN 바이러스 유전자의 cDNA를 보유하는 플라스미드 (PolI 플라스미드라고 지칭함) 및 진핵세포의 단백질 발현 벡터 pCAGGS/MCS (닭 β-액틴 프로모터의 제어를 받음)를 사용하였다. 요약하면, PolI 플라스미드 및 단백질 발현 플라스미드를 형질감염 시약인 Trans IT LT-1 (미국 위스콘신주 매디슨에 소재하는 판베라 제품)과 혼합하여 실온에서 15분 동안 인큐베이션하고, Opti-MEM I (GIBCO/BRL 제품) 중에서 배양한 1 ×106개 293T 세포에 첨가하였다. 6시간 후에는 DNA-형질감염 시약 혼합물을 0.3％ BSA 및 0.01％ FCS를 함유하는 Opti-MEM I로 교체하였다. 48시간 후에는 상등액 중의 VLP 또는 돌연변이체 인플루엔자 A 바이러스를 수거하였다. 이 연구에서 생성된 형질감염체 모두가 돌연변이체 HA vRNA 절편 및 WSN 바이러스의 다른 vRNA 절편을 함유하였고, 돌연변이체 HA vRNA 절편의 명칭에 따라 명명하였다 (예를 들어 HA(O)GFP(O) RNA 절편을 함유하는 VLP는 HA(O)GFP(O) VLP라고 명명함).
플라스미드의 구축: pPolIHA(O)GFP(O)을 사용하여 HA vRNA의 3' 비코딩 영역, 개선된 녹색 형광 단백질 (GFP, 클론테크 제품)의 상보적 코딩 서열 및 HA vRNA의 5' 비코딩 영역을 함유하는 (-) 센스 RNA를 제조하였다. 요약하면, GFP 유전자를 BsmBI 부위 및 HA의 3' 또는 5' 비코딩 서열을 함유하는 프라이머로 PCR 증폭시키고, BsmBI로 소화시켜 PolI 플라스미드의 BsmBI 부위에 클로닝했다. 상기 플라스미드를 세포에 도입하여, HA vRNA의 5' 및 3' 비코딩 영역이 플랭킹하는, (-) 센스 방향의 GFP-코딩 서열을 함유하는 RNA를 수득하였다.
pPolIHA(468)GFP(513)을 다음과 같이 제조하였다: 우선, WSN vRNA 제조용 pPolIHA를 후방 대 후방 (back-to-back) 프라이머 Bam500R (5'-GCGGATCCTCCCCTATGGGAGCATGATAC-3'; 서열 9) 및 Xbal218F (5'-GCTCTAGAAACTCTGTTATCGAGAAAATG-3'; 서열 10)을 사용한 역 PCR로 증폭시켰다. PCR 생성물을 BamHI 및 XhaI로 소화시킨 후에 GFP 유전자를 BamHI 부위 및 XbaI 부위에 클로닝하였다. 생성된 플라스미드 pPolIHA(468)GFP(513)을 사용하여 HA vRNA의 3' 비코딩 영역 및 3' 코딩 영역 468개 염기, GFP 코딩 서열, HA vRNA의 5' 코딩 영역 513개 염기 및 5' 비코딩 영역을 함유하는 (-) 센스 RNA를 제조하였다. 또한, 일련의 HA 결실 돌연변이체를 유사한 방식의 역 PCR로 제조하였다. 상기 돌연변이체를 HA 코딩 영역에서 유래한 뉴클레오티드 수에 따라 명명하였고, 예를 들어 HA(9)GFP(80) RNA 절편은 3' HA 비코딩 영역, N-말단 영역에 상응하는 HA 코딩 서열에서 유래한 9개 뉴클레오티드, GFP 오픈 리딩 프레임, C-말단 영역에 상응하는 HA 코딩 서열에서 유래한 80개 뉴클레오티드 및 5' HA 비코딩 서열을 함유한다. 모든 플라스미드 구조물을 서열분석하여 PCR에 의해 원치않는 돌연변이가 도입되지 않았음을 확인하였다.
pPolIHA(O)VSVG(O)을 PCR로 제조하여, HA vRNA의 3' 비코딩 영역, V SVG의 상보적 코딩 서열 및 HA vRNA의 5' 비코딩 영역을 함유하는 (-) 센스 RNA의 제조에 사용하였다. 요약하면, VSV G 유전자를 BsmBI 부위 및 HA의 3' 또는 5' 비코딩 서열을 함유하는 pCAGGS-VSVG를 주형 및 프라이머로 사용한 PCR로 증폭시켰다. 이어서, PCR 생성물을 BsmBI로 소화시키고 pHH21 벡터의 BsmBI 부위에 클로닝했다. VSV G의 코딩 서열을 pPolIHA(9)GFP(80)의 BamHI 부위 및 XbaI 부위에 클로닝하여 pPolIHA(9)VSVG(80)을 제조하였다. NA vRNA의 3' 비코딩 말단 및 61개 N-말단 NA 코돈과 GFP를 보유하는 융합 단백질을 코딩하는 상보적 서열, 2개의 연속적인 정지 코돈 (TAA-TAG) 및 NA vRNA 5' 말단의 185개 염기를 함유하는 pPolINA(183)GFP(157)을 다음과 같이 제조하였다: 우선, pT7Blue-NA 중 WSN NA 유전자의 뉴클레오티드 203 내지 1109 ((+) 센스)에 상응하는 영역을 역 PCR을 통해 BglII 부위로 대체하였다. 이어서, GFP 유전자를 이러한 BglII 부위 및 위치 1226 (야생형 NA 유전자에서의 위치)의 StuI 부위에서 NA 단백질에 프레임내 클로닝했다. 이어서, NA(183)GFP(157) 유전자를 PolI 플라스미드인 pHH21의 BsmBI 부위에 삽입하였다.
pPolINA(183)GFP(157)Met(-)를 다음과 같이 생성하여, NA 단백질의 출발 코돈이 없는 (-) 센스 NA(183)GFP(157)Met(-) RNA의 제조에 사용하였다: ATG 개시 코돈 및 pPolINA(183)GFP(157) 중 NA(183)GFP(157) 유전자의 15번째 코돈에 존재하는 또다른 ATG를 시험관내 부위 지정 돌연변이유발법으로 GCG로 변화시켰다 (진에디터, 프로메가 제품). 생성된 구조물인 pPolINA(183)GFP(157)Met(-)는 인간 RNA 폴리머라제 I 프로모터 및 마우스 RNA 폴리머라제 I 종결자의 제어를 받는, 3' NA 비코딩 영역 (19개 뉴클레오티드), N-말단 NA 코딩 영역에 상응하는 183개 뉴클레오티드, GFP 오픈 리딩 프레임, 2개의 연속적인 정지 코돈 (TAA-TAG), C-말단 NA 코딩 영역에 상응하는 157개 뉴클레오티드 및 5' NA 비코딩 영역 (28개 뉴클레오티드)을 함유하였다.
면역염색 분석: 세포를 인플루엔자 VLP로 감염시키고, 16시간이 지난 후에 상기 세포를 인산염 완충 염수 (PBS)로 2회 세척하고 3.7％ 포름알데히드 (PBS 중)를 사용하여 20분 동안 실온에서 고정시킨 후에 0.1％ Triton X-100으로 처리하여 프로세싱했다. VLP 생성 효율을 시험하기 위해서, 106개 세포를 플라스미드로 형질감염된 293T 세포의 배양 상등액 0.1 ㎖와 함께 인큐베이션하고, 감염후 제16시간에는 면역염색 분석으로 검출된 NP-양성 세포의 수를 기록하였다.
웨스턴 블럿팅: VLP 또는 돌연변이체 바이러스를 1.5시간 동안 50,000 ×g로 4℃에서 회전시켜 가라앉혔다. 밀집된 VLP 또는 바이러스를 용균 완충액 (0.6 M KCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.5％ Triton X-100) 중에 재현탁시켰다. 용균물을 15％ SDS-폴리아크릴아미드 겔 상에서 위치시켜 폴리비닐리덴 디플루오라이드 (PVDF) 막으로 전기이동시키고, PBS 중 5％ 탈지유를 사용하여 4℃에서 밤새 블로킹하고, 항-WSN 바이러스 폴리클로날 항체, 항-HA 모노클로날 항체 또는 항-VSVG 모노클로날 항체와 함께 1시간 동안 실온에서 인큐베이션했다. 0.05％ Tween-20을 함유하는 PBS를 사용하여 막을 3회 세척했다. 결합된 항체를 VECTASTAIN ABC 키트 (벡터 제품) 및 코니카 (Konica) 면역염색 키트 (코니카 (Konica) 제품)로 검출하였다.
노던 혼성화: PolI 플라스미드로 형질감염시킨 293T 세포 중의 vRNA를 형질감염후 제24시간에 이소젠 (Isogen) RNA 추출 키트 (일본 도쿄에 소재하는 니폰 진 (Nippon Gene) 제품)으로 추출하였다. RNA를 글리옥살/DMSO/인산염 완충액 중에서 50℃에서 1시간 동안 글리옥살화시키고, 10 mM 인산염 완충액 (pH 7.0) 중의 1.0％ 아가로스 겔에서 전기영동시켜 분리하였다. RNA를 나일론 막으로 블럿팅하고, GFP 서열에 상보적이며 DIG 올리고뉴클레오티드 테일링 키트 (로쉐 제품)로 표지시킨 올리고뉴클레오티드 프로브 (ATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGG; 서열 8) (10 pmol)와 37℃에서 30분 동안 혼성화시켰다. Easy Hyb (로쉐 제품) 중에서 GFP 프로브를 사용하여 42℃에서 밤새 혼성화를 수행하였다. DIG 핵산 검출 키트 (로쉐 제품)를 사용하여 RNA 밴드를 검출하였다. 요약하면, 혼성화된 막을 세척 완충액 (0.1 M 말레산, 0.15 M NaCl, 0.3％ Tween 20, pH 7.5)으로 세척하여 1％ 블로킹 시약으로 30분 동안 실온에서 블로킹하고, 알칼리성 포스파타제와 접합된 항-DIG 항체와 함께 (1 : 5000) 30분 동안 실온에서 인큐베이션했다. 이어서, 막을 세척 완충액으로 세척한 후에 검출 완충액 (0.1 M Tris-HCl, 0.1 M NaCl, pH 9.5) 중에서 니트로블루 테트라졸륨 클로라이드/5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-포스페이트 (NBT/BCIP)와 함께 실온의 암실에서 인큐베이션했다. DIG 핵산 검출 키트 (로쉐 제품)를 사용하여 RNA 밴드를 검출했다. 모의-형질감염된 293T 세포에서 대조군 RNA를 추출했다.
형질감염체 바이러스의 복제 특성: 24-웰 플레이트에서 각 2벌 웰의 BHK, CHO 또는 MDCK 세포를 바이러스로 감염시켜 0.01％ FCS를 함유하는 MEM 배지를 약간 넣어 37℃에서 인큐베이션했다. 상이한 시간마다 MDCK 세포에 대해 플라크 분석을 수행하여, 상등액을 감염성 바이러스에 대해 분석하였다.
결과
비리온으로의 HA 절편 혼입에는 HA vRNA 의 코딩 영역이 필요함: NA vRNA의 경우에서와 같이, 비리온으로의 HA vRNA 혼입에 HA vRNA의 코딩 영역이 필요한지 여부를 결정하기 위해서, 하기하는 2가지 플라스미드를 구축하였다: HA vRNA에서는 그의 3' 및 5' 비코딩 영역만을 함유하고 GFP 코딩 서열을 함유하는 pPolIHA(O)GFP(O) 및 HA 서열 중 뉴클레오티드 위치 500 내지 1218의 서열 ((+) 센스 방향)을 결실시킨 HA 유전자에 GFP 코딩 서열을 프레임내 삽입한 pPolIHA(468)GFP(513) (도 17). pPolIHA(468)GFP(513) 구조물은 3' HA 비코딩 영역 (33개 뉴클레오티드), N-말단 코딩 영역에 상응하는 468개 뉴클레오티드, 정지 코돈이 있는 GFP 오픈 리딩 프레임, C-말단 HA 코딩 영역에 상응하는 513개 뉴클레오티드 및 5' HA 비코딩 영역 (45개 뉴클레오티드)을 보유하였다. 생성된 융합 단백질은 HA의 N-말단 156개 아미노산 및 전체 GFP 서열을 함유하였다.
이들 돌연변이체 HA vRNA를 보유하는 VLP를 생성하기 위해서, 293T 세포를 pPolIHA(O)GFP(O) 또는 pPolIHA(468)GFP(513) 및 나머지 인플루엔자 바이러스 RNA 절편을 제조하기 위한 7개의 RNA PolI 플라스미드 및 9종의 바이러스 단백질 (즉, PA, PB1, PB2, NP, HA, NA, M1, M2 및 NS2)에 대한 단백질 발현 플라스미드로 형질감염시켰다. 형질감염후 제48시간에, 293T 세포 배양물 상등액 중의 VLP를 수거하고, 이를 사용하여 MDCK 세포를 감염시켰다. 생성된 VLP은 돌연변이체 HA를 보유하기 때문에, 이들은 GFP 및 HA를 제외한 모든 바이러스 단백질을 발현하였다. 따라서, 감염성 후대 바이러스는 전혀 생성되지 않았다 (데이타는 나타내지 않음). 비리온으로의 돌연변이체 HA vRNA 혼입 효율은 GFP를 발현하는 세포 수 (즉, GFP 유전자를 코딩하는 절편을 보유하는 VLP의 수)를 감염후 제16시간에 NP를 발현하는 세포 수 (즉, 모든 감염성 VLP의 수)로 나눈 값으로 정하였다. pPolIHA(468)GFP(513)으로 형질감염시킨 293T 세포의 배양 상등액 중에 존재하는 모든 감염성 VLP의 역가 (즉, NP-양성 세포의 수)는 7.4 ×105개 감염성 VLP/㎖였으며, HA(468)GFP(513) RNA를 함유하는 VLP의 역가 (즉, GFP-양성 세포의 수)는 3.2 ×105개 VLP/㎖였다. 이러한 결과는 생성된 모든 감염성 VLP의 42.8％가 돌연변이체 HA vRNA를 보유함을 지시한다 (도 18). 반대로, VLP의 단지 3.9％만이 HA(O)GFP(O) RNA 절편을 보유하였다 (도 18). 이러한 결과는 인플루엔자 비리온으로의 HA 절편 혼입에 HA vRNA의 코딩 영역이 필요함을 시사하는 것이다.
비리온으로의 HA 절편 혼입에는 HA vRNA 코딩 영역의 3' 및 5' 말단 모두가 중요함: 앞서, 비리온으로의 혼입에 있어서 NA vRNA 코딩 영역의 3' 말단이 5' 말단보다 더 중요한 역할을 수행하는 것으로 나타난 바 있다. 따라서, 3' 말단, 5' 말단 또는 이들 말단 둘다가 비리온으로의 HA vRNA 절편 혼입에 중요한지 여부를 결정하였다. 이러한 사안을 검토해보기 위해서, HA vRNA 코딩 영역의 3' 말단이 없는 HA(O)GFP(1011) 유전자 및 HA vRNA 코딩 영역의 5' 말단이 없는 HA(966)GFP(O) 유전자를 제조하였고 (도 17), 비리온으로의 이들 HA vRNA 혼입을 상기한 바와 같이 시험하였다. 플라스미드로 형질감염된 세포에서 이들 두가지 모두의 vRNA 양은 HA(468)GFP(513) vRNA의 양에 필적할만 했으나 (데이타는 나타내지 않음), HA(O)GFP (1011) 및 HA(966)GFP(O)의 두 경우 모두에서 절편 혼입 효율은 각각 6.8％ 및 8.4％에 불과하였는데 (도 17), 이는 비리온으로의 HA 절편 혼입에 있어서 HA vRNA 코딩 영역의 3' 및 5' 말단 둘다가 중요한 역할을 수행함을 지시한다.
HA vRNA에서 비리온으로의 HA vRNA 혼입에 중요한 영역을 추가로 한정하기 위해서, 3' 및(또는) 5' 코딩 영역이 추가로 결실된 말단절단형 HA vRNA를 보유하는 일련의 VLP를 생성하였다 (도 17). 이어서, VLP로의 돌연변이체 HA vRNA의 혼입 효율을 측정하였다. 3' 말단에서는 단지 15개 뉴클레오티드만을 남기고 5' 말단에서는 268개 뉴클레오티드를 남긴 추가 결실은 HA vRNA 혼입 효율에 영향을 미치지 않았고 (HA(468)GFP(513)을 HA(15)GFP(268)과 비교함), HA 코딩 영역 3' 말단의 15개 뉴클레오티드 및 5' 말단의 268개 뉴클레오티드를 보유하는 pPolIHA(15)GFP(268)을 사용하여 추가의 결실 구조물을 제조하였다. 결실 정도가 커짐에 따라 vRNA 혼입 정도가 점차 감소하였지만, 비리온으로의 효율적인 HA vRNA 혼입에는 5' HA 코딩 영역의 80개 뉴클레오티드가 최소 요구치라고 여겨진다 (HA(15)GFP(80)을 HA(15)GFP(75)와 비교함). 추가의 결실 분석에서는, 3' 말단에 HA 코딩 영역의 9개 뉴클레오티드 잔기를 남긴 HA(9)GFP(80)은 형질감염된 세포 내에 존재하는 수준이 HA(O)GFP(O) vRNA의 경우와 명백하게 다르지 않지만 (도 17 및 도 18), HA(9)GFP(80)의 경우에 HA vRNA가 비리온에 효율적으로 혼입 (65％ 초과)된다는 것이 입증되었다. 이러한 결과는, 비리온으로의 효율적인 HA vRNA 혼입에 HA 코딩 영역 3' 말단의 9개 뉴클레오티드 및 5' 말단의 80개 뉴클레오티드가 요구됨을 지시한다.
HA 및 NA 유전자가 외래 유전자의 코딩 서열을 함유하는 신규 인플루엔자 A 바이러스의 발생. HA 절편의 비리온으로의 혼입에 필요한 서열이 결정되었기 때문에, 그러한 서열에 의해 플랭킹된 외래 유전자가 인플루엔자 A 바이러스로 혼입되어 반복된 계대배양 동안 유지될 수 있는지를 조사하였다. 외래 유전자 모델로서, VSV G 코딩 서열을 GFP 서열 대신에 pPolIHA(9)GFP(80)의 BamHI 및 Xbal 부위에 삽입하였다. 생성된 구조물은 pPolIHA(9)VSVG(80)으로 명명되었으며, 3' HA 비코딩 영역 (33 개 뉴클레오티드), N-말단 HA 코딩 영역에 상응하는 9 개 뉴클레오티드, 정지 코돈을 갖는 VSV G 오픈 리딩 프레임 (1552 개 뉴클레오티드), C-말단 HA 코딩 영역에 상응하는 80 개 뉴클레오티드, 및 5' HA 비코딩 영역 (45 개 뉴클레오티드)을 보유하였다. 대조군으로서, HA vRNA의 3' 및 5' 비코딩 영역만을 보유하지만 코딩 영역은 보유하지 않는 벡터 pPolIHA(O)VSVG(O)을 구성하였다. VSV G 단백질이 HA 및 NA 단백질 둘 다를 치환할 것이기 때문에, NA 코딩 영역은 외래 유전자로 치환할 수 있다. 따라서, pPolINA(183)GFP(157)Met(-)는 NA 절편의 효율적인 비리온 혼입에 필요한 GFP 코딩 서열 및 NA 코딩 서열을 함유하는 재조합 NA RNA 절편의 제조를 위해 구성되었다. 이러한 구조물에서, ATG를 GCG로 치환하여 NA 오픈 리딩 프레임에 대한 개시 코돈을 파괴하였다. 따라서, GFP 오픈 리딩은 그 자신의 개시 코돈으로부터 번역된다.
재조합 HA(9)VSVG(80) 및 NA(183)GFP(157)Met(-) 절편 및 나머지 6 개의 바이러스 RNA 절편의 제조를 위한 플라스미드, 및 인플루엔자 바이러스 폴리머라제 단백질, NP, M1, M2, NS2 및 VSV G의 발현을 위한 플라스미드를 사용해서 293T 세포를 형질감염시켰다. 형질감염 후 72 시간의 시점에서, 293T 세포의 상등액을 수거하였으며, MDCK 세포를 사용해서 플라크 분석을 수행하였다. HA(9)VSVG(80) RNA 절편 및 NA(183)GFP(157)Met(-) RNA 절편을 보유하는 형질감염체 바이러스 (VSVG(HA)GFP(NA) 바이러스라 명명함)는 생존가능했으며, 트립신의 부재하에 GFP를 발현하는 플라크를 생성했다 (도 19). 면역염색법에 의해 VSV G의 발현을 확인했으나, 플라크를 함유하는 HA의 발현은 확인하지 못했다 (도 19). 또한, VSVG(HA)GFP(NA) 바이러스로 감염된 세포는 GFP를 발현시켰지만, 대조군 WSN 바이러스로 감염된 세포는 GFP를 발현시키지 않았다. 대조적으로, pPolIHA(O)VSVG(O) 플라스미드를 pPolIHA(9)VSVG(80) 대신 사용한 경우에 플라크는 관찰되지 않았지만, GFP 및(또는) NP 단백질을 발현시키는 단일 세포가 MDCK 세포에서 검출되었다 (데이타는 나타내지 않음). 또한, VSVG 및 GFP 둘 다는 VSVG(HA)GFP(NA) 바이러스로 감염된 MDCK 세포에서 5회 연속 계대배양 후에 지속적으로 발현되는 것으로 관찰되었다 (데이타는 나타내지 않음). 5회 계대배양 후에 VSVG(HA)GFP(NA) 바이러스의 HA(9)VSVG(80) RNA 절편의 나머지 HA 영역에서 돌연변이는 검출되지 않았다. 그러나, VSVG의 아미노산 서열에서 3 가지의 돌연변이, 즉 위치 57에서 Ile의 Leu로의 돌연변이, 위치 95에서 Gln의 His로의 돌연변이 및 위치 499에서 Gln의 정지로의 돌연변이가 발견되었다. 야생형 VSV G 단백질이 세포질 도메인의 29 개의 잔기를 갖지만, 이 도메인의 마지막 13 개의 잔기는 위치 499에서의 Gln에서 정지로의 돌연변이로 인해 결실되었다.
VSVG ( HA ) GFP (NA) 바이러스의 생물학적 특성. VSV G 단백질이 다른 인플루엔자 바이러스 단백질들로 구성된 비리온 내에 실제로 혼입되는지를 결정하기 위해, 농축 VSVG(HA)GFP(NA) 및 WSN (대조군) 바이러스에 대하여 웨스턴 블럿 분석을 수행하였다. 도 20에 나타낸 바와 같이, VSVG(HA)GFP(NA) 비리온에서 VSV G 단백질은 검출되었지만 HA는 검출되지 않았으며, 이로서 VSV G 단백질의 비리온 혼입을 확인하였다.
다음으로, VSVG(HA)GFP(NA) 바이러스의 성장 특성을 BHK, CHO 또는 MDCK 세포에서 조사하였다. 세포를 0.001의 MOI로 감염시키고, 세포 상등액 중 바이러스의 수율을 37 ℃에서 감염 후의 여러 시점에서 MDCK 세포 상의 플라크 분석에 의해 측정하였다. BHK 및 MDCK 세포 둘 다에서 VSVG(HA)GFP(NA) 바이러스의 최대 역가는 WSN 바이러스의 것보다는 낮지만 ml 당 106 이상의 PFU에 도달했다 (도 21). CHO 세포에서 WSN 바이러스의 빈약한 성장과는 달리, VSVG(HA)GFP(NA) 바이러스는 이 세포에서 시험된 다른 2가지 세포주에서와 같이 잘 성장하였다 (도 21). 또한, 세포주 각각에서의 복제 동안, VSVG(HA)GFP(NA) 바이러스로 감염된 세포는 GFP를 발현시켰다.
상기 결과는 HA(9)VSVG(80) 및 NA(183)GFP(157)Met(-) 절편 모두가 인플루엔자 비리온으로 효율적으로 혼입되며, 그러한 2 가지 외래 유전자는 반복된 계대배양 동안 인플루엔자 A 바이러스에서 안정하게 유지될 수 있음을 나타냈다.
논의
게놈 패키징 메카니즘의 결정은 인플루엔자 바이러스의 생활환을 이해하는 데 있어서 뿐만 아니라 외래 단백질의 발현을 위한 인플루엔자 바이러스계 벡터를 개발하는 데 있어서도 중요하다. 이 연구에서, HA vRNA에서 코딩 영역의 3' 및 5' 말단 둘 다의 서열이 상기 절편을 비리온으로 효율적으로 혼입시키는 데 필요했음을 입증하였다. 또한, 이러한 지식을 이용해서, 각각 HA vRNA 및 NA vRNA의 비리온 혼입에 필요한 서열에 의해 플랭킹된 VSV G 및 GFP의 코딩 서열을 함유하는 2 가지 재조합 RNA 절편을 보유하는 신규 인플루엔자계 바이러스를 생성시켰으며, 2 가지 외래 유전자의 안정한 발현을 입증하였다.
관련되지 않은 감염성 물질로부터 유전자 또는 유전자 일부의 발현을 위한, 인플루엔자 A 바이러스 기초의 백신 벡터를 개발하는 여러 방법들이 보고되었다. 짧은 폴리펩티드를 HA의 항원성 부위에 삽입시켜 삽입된 펩티드에 대한 양성 면역 반응을 일으켰다. 더 긴 폴리펩티드 및 단백질 발현의 경우, 외래 유전자를 인플루엔자 바이러스 유전자의 하나에 삽입하였으며, 내부 리보솜 진입 부위 (IRES) 또는 구제역 바이러스 2A 프로테아제를 이용하여 외래 단백질을 발현시켰다. 여기서, NA 및 HA vRNA에서 시스-작용성 비리온 혼입 신호를 이용하여 외래 단백질의 발현을 위한 새로운 시스템을 확립하였다. 이러한 시스템에 의해 인플루엔자계 바이러스에 1.5 kb가 넘는 외래 유전자 (예, VSV G)를 혼입시킬 수 있었으며, 그러한 벡터 시스템의 잠재성을 입증하였다. 마우스에서 복제-불능 인플루엔자 VLP의 백신 효능이 밝혀졌기 때문에, 관련되지 않은 병원체 유래의 유전자를 함유하는 재조합 RNA 절편을 갖는 복제-불능 인플루엔자계 VLP는 유망한 백신으로서의 역할을 수행할 수 있다. 이러한 잠재성은 HIV, 구제역 및 다른 감염증에 대한 백신화의 경우에서 특히 흥미로우며, 이 경우 생 (live) 백신 바이러스를 임의로 야생형으로 복구하는 것이 절대로 허용되지 않거나 또는 불활성화된 백신의 효능이 점막 면역성 및 세포독성 T-림프구 반응의 한정된 유도로 인해 제한될 수 있다. 따라서, 이러한 방법을 이용해서, 인플루엔자 바이러스를 백신 벡터로 사용할 수 있다. 예를 들어, HA 대신 HIV gap160 코딩 영역 및 NA 대신 gag 코딩 영역을 함유하는 바이러스를 제조할 수 있다 (도 24 및 25). 또한, VSV G가 HA를 대체하는 경우, M2는 더 이상 필요하지 않으며, 그러한 3 가지 바이러스 유전자는 이종 유전자로 대체될 수 있다. 예를 들어, HA는 HIV gp160, gag를 갖는 NA 및 nef를 갖는 M2로 대체될 수 있다. 생성된 재조합 인플루엔자 바이러스를 백신으로 사용하거나 또는 다른 HIV 백신, 예를 들어 HIV DNA 백신을 위한 부스터 (booster)로 사용하여 점막 면역성을 비롯한 면역성을 증강시키거나 유도할 수 있다. 또는, 백신은 재조합 인플루엔자 바이러스 기초의 다가 백신일 수 있는데, 이 경우 NA 코딩 절편은 다른 병원체의 절편, 예를 들어 헤르페스 바이러스의 당단백질로 대체되며, 그러한 백신은 인플루엔자 바이러스 및 헤르페스 바이러스 감염에 대한 보호 면역 반응을 일으킬 수 있다.
아데노바이러스, 레트로바이러스 및 폭스바이러스로부터 유도된 바이러스 벡터는 외래 유전자를 표적 세포로 효율적으로 도입한다. 이러한 바이러스는 DNA를 함유하거나, 또는 숙주 염색체로 통합될 수 있는 DNA 복제 중간체를 갖기 때문에, 불리한 결과가 발생할 위험을 제거할 수 없다. 대조적으로, 그러한 통합은 감염된 세포내 DNA 상 (phase)의 결핍으로 인해 인플루엔자 바이러스에서는 일어날 수 없다. 또한, VSVG(HA)GFP(NA) 바이러스는 HA 절단을 위한 트립신을 필요로 하지 않기 때문에, 통상의 인플루엔자 바이러스와는 달리, 더 넓은 용도를 제공할 수 있다. 또한, 목적하는 세포 향성 (tropism)을 갖는 재조합 바이러스는 비리온 표면상의 당단백질을 변형함으로써 생성시킬 수 있다. 따라서, 비리온 혼입을 위해 vRNA 절편에서 시스-작용성 신호를 이용하는 시스템은 여러 외래 유전자들을 표적 세포로 전달할 수 있는 재조합 인플루엔자계 바이러스 벡터의 설계를 가능케 한다.
상피 세포로부터 바이러스의 조립 및 방출은 일부 바이러스에서 분극화되며, 첨단부 (apical) 또는 기저측 (basolateral) 표면에서 선택적으로 일어날 수 있다. 분극화된 바이러스 버딩 (budding)은 바이러스 감염의 발병기전을 결정하는 데 있어서 역할을 하는 것으로 생각된다. 인플루엔자 A 바이러스는 감염된 상피 세포의 첨단부로부터 버딩하며, 또한 개별적으로 발현된 HA, NA 및 M2 단백질은 세포의 첨단부 표면으로 표적화된다. 한편, VSV는 감염된 세포의 기저측 표면으로부터 방출되며, VSV G 단백질은 기저측 표면으로 운반된다. 본 연구에서, HA 및 NA 단백질 대신에 VSV G를 보유하는 재조합 VSVG(HA)GFP(NA) 바이러스가 성공적으로 생성되었다. 그러나, 이러한 재조합 바이러스의 VSV G 단백질은 점 돌연변이로 인해 세포질 도메인의 마지막 13 개의 잔기가 결핍되었다. 세포질 도메인내 이들 13 개 잔기의 결실은 기저측 표면보다는 첨단부 표면으로 보다 효율적으로 운반되는 단백질을 생성시키는 것으로 알려져 있다. 따라서, VSVG(HA)GFP(NA) 바이러스에서 VSV G 단백질로 도입된 돌연변이는 아마도 첨단부 표면으로의 효율적인 운반을 촉진시켜 VSVG(HA)GFP(NA) 바이러스를 효율적으로 버딩시켰을 것이다.
인플루엔자 전염병은 기존의 순환하는 균주의 것들과 면역학적으로 구별되는 HA 및(또는) NA를 갖는 바이러스가 인플루엔자 바이러스 RNA 절편의 재배열시에 나타나는 경우에 발생하는 것이 일반적이다. HA, NA, M 및 NS vRNA내의 코딩 영역의 3' 및 5' 말단의 서열은 상기 RNA가 비리온으로 효율적으로 혼입되는데 필요하다. vRNA 절편 (가장 가능하게는 바이러스 리보뉴클레오단백질 복합체로서의 vRNA 절편)의 패키징은 바이러스 RNA 절편들 사이에서 트랜스로 일어나는 RNA-RNA 상호작용에 의해 매개된다. 그러한 경우, 각 절편내의 특이적 혼입 신호는 RNA 절편의 재배열를 제한할 수 있다. 실험적으로, 인플루엔자 바이러스 RNA 절편은 무작위적으로 재배열하지 않는 것으로 알려져 있다. 단백질들 사이의 기능적 상호작용 (예를 들어, 폴리머라제 복합체, HA-NA 및 절단가능한 HA-M2 기능적 결합의 형성)은 무작위적 재배열를 제한하는 것으로 생각된다. 단백질 수준에서의 재배열에 대한 이러한 제한 이외에도, 유사한 제한이 RNA 수준에서 존재할 수 있다. 이러한 상황에서, 1957년 및 1968년의 전염병에서는 HA 및(또는) NA 유전자 이외에도 PB1 유전자가 조류 바이러스 유래의 인간 바이러스에 도입되었으며, 이는 HA와 PB1 RNA 절편 사이의 가능한 관련성을 시사한다. 다른 RNA 절편의 비리온 혼입을 위한 중요한 영역들을 추가로 특성화하여 RNA 절편의 재배열를 이해하기 위한 실마리를 제공할 수 있으며, 이에 따라 인플루엔자 A 바이러스의 새로운 전염병 균주의 발생을 예상할 수 있다.
요컨대, vRNA 패키징 신호에 대한 정보를 이용해서 신규 인플루엔자 백신 및 인플루엔자계 백신 벡터를 개발할 수 있다.
실시예 6
도 26에 예시된 바와 같이, 단백질, 예를 들어 NS2를 코딩하는 인플루엔자-바이러스-유사 RNA를 연속적으로 발현시키는 세포주를 만들 수 있지만, 이러한 RNA에는 혼입 신호가 결핍되어 있다. NS2 코딩 서열 (NS2 KO)이 결핍된 바이러스는 문헌 [Neumann et al., 2000; Watanabe et al., 2002]에 따라 제조할 수도 있다. NS2 KO 바이러스가 정상 세포를 감염시키는 경우에 후대 바이러스는 생성되지 않는데, 그 이유는 바이러스에 NS2가 결핍되어 있기 때문이다. 대조적으로, NS2 KO 바이러스가, NS2를 코딩하지만 혼입 신호가 없는 인플루엔자 바이러스-유사 RNA를 발현시키는 세포를 감염시키는 경우, NS2는 바이러스 감염시 발현되며, 후대 NS2 KO 바이러스가 생산된다. 그러나, NS2를 코딩하는 인플루엔자 바이러스-유사 RNA는 비리온 혼입 신호가 없기 때문에 NS2 KO 바이러스에 혼입되지 않을 것이다. 따라서, NS2 KO는 정상 세포에서 복제-불능으로 남아있다. 이 시스템은 복제-불능 바이러스를 위한 생산자 세포의 생성을 위해 사용될 수 있다. 상기 시스템을 사용해서, 전형적으로는 바이러스 단백질을 연속적으로 발현하는 세포주의 생성을 억제하는 세포 독성을 갖는 바이러스 단백질을 발현시키는 생산자 세포를 만들 수 있다. 따라서, 본 출원에서, 비리온 혼입 신호에 대한 지식을 이용해서 특정 절편이 비리온으로 혼입되지 않도록 하는 시스템을 설계할 수 있다.
참고문헌
Figure pat00001
Figure pat00002
Figure pat00003
모든 공보, 특허 및 특허원은 참고로 본원에 인용된다. 상기 명세서에서 본 발명은 그의 특정의 바람직한 실시양태에 관련하여 기술되어 있고 다수의 상세한 설명이 예시를 목적으로 기재되어 있지만, 본 발명이 추가의 실시양태를 허용하며 본원에 기재된 어떠한 상세한 설명도 본 발명의 기본 원리를 벗어나지 않으면서 상당히 변화될 수 있음은 당업자에게는 명백할 것이다.
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Claims (34)

  1. a) 인플루엔자 바이러스 HA vRNA의 3' 비코딩 영역, 이종 핵산 절편, 5' HA 혼입 서열, 및 HA vRNA의 5' 비코딩 영역에 상응하는 서열;
    b) 인플루엔자 바이러스 M vRNA의 3' 비코딩 영역, 3' M 혼입 서열, 이종 핵산 절편, 5' M 혼입 서열, 및 M vRNA의 5' 비코딩 영역에 상응하는 서열;
    c) 인플루엔자 바이러스 NS vRNA의 3' 비코딩 영역, 3' NS 혼입 서열, 이종 핵산 절편, 및 NS vRNA의 5' 비코딩 영역에 상응하는 서열;
    d) 인플루엔자 바이러스 PB2 vRNA의 3' 비코딩 영역, 이종 핵산 절편, 5' PB2 혼입 서열, 및 PB2 vRNA의 5' 비코딩 영역에 상응하는 서열;
    e) 인플루엔자 바이러스 PB1 vRNA의 3' 비코딩 영역, 이종 핵산 절편, 5' PB1 혼입 서열, 및 PB1 vRNA의 5' 비코딩 영역에 상응하는 서열; 또는
    f) 인플루엔자 바이러스 PA vRNA의 3' 비코딩 영역, 이종 핵산 절편, 5' PA 혼입 서열, 및 PA vRNA의 5' 비코딩 영역에 상응하는 서열
    을 포함하며, 여기서 벡터에 상응하는 vRNA가 인플루엔자 바이러스 단백질을 발현하고 벡터에 상응하는 vRNA 이외의 vRNA를 포함하는 세포 내에 존재하는 경우에 비리온 내에 패키징되는, 인플루엔자 바이러스 혼입 서열을 포함하는 인플루엔자 바이러스 벡터.
  2. 제1항에 있어서, a)에서 5' HA 혼입 서열이 HA에 대한 80개의 3' 코딩 뉴클레오티드에 상응하는 80개 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 것인 벡터.
  3. 제1항에 있어서, a)에서 5' HA 혼입 서열이 HA에 대한 291개의 3' 코딩 뉴클레오티드에 상응하는 291개 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 것인 벡터.
  4. 제1항에 있어서, a)에서 3' HA 혼입 서열을 추가로 포함하는 벡터.
  5. 제4항에 있어서, 3' HA 혼입 서열이 HA에 대한 최초 3개의 코딩 뉴클레오티드에 상응하는 3개 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 것인 벡터.
  6. 제4항에 있어서, 3' HA 혼입 서열이 HA에 대한 최초 9개의 코딩 뉴클레오티드에 상응하는 9개 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 것인 벡터.
  7. 제1항에 있어서, 이종 핵산 절편이 내부 리보솜 진입 서열에 상응하는 서열을 포함하는 것인 벡터.
  8. 제1항에 있어서, 이종 핵산 절편이 마커 유전자에 대한 오픈 리딩 프레임에 상응하는 서열을 포함하는 것인 벡터.
  9. 제1항에 있어서, 이종 핵산 절편이 병원체의 면역원성 단백질 또는 펩티드, 또는 치료용 단백질에 대한 오픈 리딩 프레임에 상응하는 서열을 포함하는 것인 벡터.
  10. 제1항에 있어서, 혼입 서열이 A형 인플루엔자 바이러스로부터 유래되는 것인 벡터.
  11. 제1항에 있어서, 혼입 서열이 B형 인플루엔자 바이러스로부터 유래되는 것인 벡터.
  12. 제1항에 있어서, 이종 핵산 절편이 또다른 핵산 절편에 융합되어 융합 단백질을 코딩하는 것인 벡터.
  13. 제1항의 벡터에 상응하는 vRNA를 포함하는 재조합 인플루엔자 바이러스.
  14. 제13항에 있어서, 이종 핵산 절편이 마커 유전자에 대한 오픈 리딩 프레임에 상응하는 서열을 포함하는 것인 재조합 바이러스.
  15. 제13항에 있어서, 이종 핵산 절편이 병원체의 면역원성 단백질 또는 펩티드에 대한 오픈 리딩 프레임에 상응하는 서열을 포함하는 것인 재조합 바이러스.
  16. 제15항에 있어서, 오픈 리딩 프레임이 HA 단백질을 코딩하는 것인 재조합 바이러스.
  17. 제15항에 있어서, 오픈 리딩 프레임이 NA 단백질을 코딩하는 것인 재조합 바이러스.
  18. 제13항에 있어서, 이종 핵산 절편이 막횡단 단백질에 대한 오픈 리딩 프레임에 상응하는 서열을 포함하는 것인 재조합 바이러스.
  19. 제13항에 있어서, 이종 핵산 절편이 막 융합 활성을 갖는 단백질에 대한 오픈 리딩 프레임에 상응하는 서열을 포함하는 것인 재조합 바이러스.
  20. 제13항에 있어서, 이종 핵산 절편이 바이러스 캡시드 단백질에 대한 오픈 리딩 프레임에 상응하는 서열을 포함하는 것인 재조합 바이러스.
  21. 제13항에 있어서, 이종 핵산 절편이 수포성 구내염 바이러스 G 단백질에 대한 오픈 리딩 프레임에 상응하는 서열을 포함하는 것인 재조합 바이러스.
  22. 제13항에 있어서, 이종 핵산 절편이 치료용 단백질에 대한 오픈 리딩 프레임에 상응하는 서열을 포함하는 것인 재조합 바이러스.
  23. 제16항에 있어서, HA 단백질이 B형 HA 단백질인 재조합 바이러스.
  24. 제13항의 재조합 바이러스와 세포를 접촉시키는 것, 및 이종 핵산 절편에 의해 코딩되는 생성물이 세포에서 발현되는지를 검출 또는 결정하는 것을 포함하는, 세포에서의 이종 핵산 절편의 발현 방법.
  25. NS의 5' 코딩 영역 및 이종 핵산 절편에 상응하는 인플루엔자 바이러스 NS 혼입 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자.
  26. HA의 3' 코딩 영역 및 이종 핵산 절편에 상응하는 인플루엔자 바이러스 HA 혼입 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자.
  27. PB2의 3' 코딩 영역 및 이종 핵산 절편에 상응하는 인플루엔자 바이러스 PB2 혼입 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자.
  28. M의 3' 코딩 영역 및 M의 5' 코딩 영역, 및 이종 핵산 절편에 상응하는 인플루엔자 바이러스 M 혼입 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자.
  29. 제1항에 있어서, 벡터에 상응하는 vRNA가 세포 내에 존재하는 경우에 상응하는 야생형 vRNA에 비해 10％ 이상의 효율로 비리온 내에 패키징되는 것인 벡터.
  30. 제1항에 있어서, 벡터에 상응하는 vRNA가 세포 내에 존재하는 경우에 상응하는 야생형 vRNA에 비해 30％ 이상의 효율로 비리온 내에 패키징되는 것인 벡터.
  31. 제1항에 있어서, 벡터에 상응하는 vRNA가 세포 내에 존재하는 경우에 상응하는 야생형 vRNA에 비해 60％ 이상의 효율로 비리온 내에 패키징되는 것인 벡터.
  32. a) 야생형 NS 코딩 서열을 갖는 vRNA가 없고 재조합효소에 대한 서열을 포함하는 재조합 인플루엔자 바이러스를 재조합 숙주 세포와 접촉시키며, 여기서 재조합 숙주 세포가 NS2 오픈 리딩 프레임을 포함하지만 재조합효소 5'에 의해 인식되는 2개의 부위-특이적 재조합 서열에 작동가능하게 연결된, NS2 오픈 리딩 프레임에 대한 혼입 서열을 포함하지 않는 재조합 핵산 분자를 포함하고, 재조합효소의 부재하에서는 NS2가 발현되지 않는 단계; 및
    b) 재조합 숙주 세포로부터 복제 불능 인플루엔자-유사 바이러스를 단리하는 단계
    를 포함하는 복제 불능 인플루엔자-유사 바이러스의 제조 방법.
  33. 제32항에 있어서, 재조합효소가 Cre이고, 부위-특이적 재조합 서열이 loxP 서열인 방법.
  34. 제32항에 있어서, 재조합효소가 FLP이고, 부위-특이적 재조합 서열이 frt 서열인 방법.
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