SE465577B - Fagvektor, saerskilt substitutionsvektor lambda sk 15 foer framstaellning av bibliotek av cdna-strukturgener - Google Patents

Description

465 577 partiell utfyllnad av enkeltrådiga DNA-ändar.

Samtliga dessa kända vektorer har emellertid ett antal gemensamma allvarliga nackdelar. De är nämligen s k insättnings- vektorer, som lätt kan undergå replikation och som är vitala.

Införande av cDNA-insatser i dessa vektorer leder till en ökning av fagens DNA-längd, något som ogynnsamt påverkar den för fagens förökning optimala strukturen. Ju längre cDNA-insatsen är och ju längre den rekombinantiska fagen är i förhållande till den maxi- mala längden av fag /Ä, desto sämre blir fagens replikation och desto instabilare blir fagen. Detta ger upphov till två oönskade resultat. För det första förändras bibliotekets s k representati- vitet snabbt när biblioteket undergår amplifikation, vilket i praktiken betyder att många gener endast kan isoleras när biblio- teket ympas för första gången. Detta försvårar avsevärt kommersi- ellt lönsam framställning av representativa cDNA-bibliotek. För det andra bildas rekombinant-fager innehållande kortare DNA- -insatser i alltför stor utsträckning när DNA-bibliotek konstrue- ras, något som bl a leder till att biblioteket blir mindre repre- sentativt. Dessutom föreligger problem med uppkomst av "falska" rekombinanter, nämligen ursprungliga fager med inbyggda s k länksekvenser. Fenotypiskt sett ser de falska rekombinanterna ut som äkta rekombinanter, vilket avsevärt försvårar både värdering av det framställda biblioteket och efterföljande arbete med det- samma. Ingen av de kända vektorerna av detta slag gör det möjligt att lösa problemet med uppkomsten av falska rekombinanter. De me- toder som brukar användas för att lösa problemet är rent bio- kemiska. Sålunda erfordras en mera omsorgsfull rening av cDNA, avfosforylering och partiell utfyllnad av enkeltrådiga DNA-ändar.

Vidare måste extra processteg genomföras, vilket medför bestämda nackdelar (men också vissa fördelar). Med dessa kända metoder kan man emellertid icke i princip lösa problemet.

Samtliga kända vektorer (förutom /igt10) omöjliggör selek- tion gentemot de ursprungliga fagerna, vilket resulterar i en avsevärd minskning av den procentuella andelen rekombinant-fager i det framställda biblioteket samt en ökning av arbetsinsatsen och tids- och materialåtgången. /i-fagen /lgtlO gör det däremot 3 465 577 omöjligt att åstadkomma expression av cDNA, vilket i vissa fall kan vara av avgörande betydelse. Den expression av cDNA som åstadkommes av de andra Å.-vektorerna är emellertid ofördelaktig eftersom den i vissa fall medför en förstöring av cellerna.

Detta innebär att endast vissa bestämda cDNA-sekvenser kan klo- nas i de vektorer som icke åstadkommer expression. Man måste därför framställa bibliotek av cDNA-gener för såväl de vektorer som åstadkommer expression som de vektorer som icke åstadkommer någon expression, eftersom man i förväg icke vet hur den gen som skall klonas kommer att inverka på celler av E.coli. Ingen av de kända vektorerna möjliggör framställning av bibliotek av cDNA- -gener med användning av restriktionsenzymet Bam I. Detta innebär med andra ord att man icke kan använda restriktionsenzymerna Sau SAI och Mbo I, vilka i många fall möjliggör framställning av bibliotek utan användning av s k länkar. Kloning av Bam I-frag- ment gör det vidare möjligt att förena fördelarna med de båda kända metoderna, dvs den metod som icke kräver användning av metylaser och den metod som är baserad på partiell utfyllnad av enkeltrådiga DNA-ändar. Alla de ovan angivna /Q-vektorerna förutom /ï gtl0, dvs /1gt18, flgtl9, f) gt22 och ÃZAP, gör det antingen omöjligt eller mycket svårt att uppskatta den procentu- ella andelen rekombinant-fager i det framställda genbiblioteket med avseende på fenotypen.

Huvudändamålet med föreliggande uppfinning är att åstadkomma en ny fagvektor, vilken gör det möjligt att genomföra selektion gentemot s k icke-rekombinantiska fager (ursprungliga fager) samt gentemot "falska" rekombinanter och s k delrekombinanter (parti- ellt rekombinerade fager), vilken gör det möjligt att i samma system åstadkomma expression av den för tillfället aktuella genen, vilken gör det möjligt att införa valfria markeringar i ändarna i den gen som skall klonas, vilken gör det möjligt att genom användning av s k PCR-metod lätt förstärka den gen som skall förökas, vilken gör det möjligt att genom användning av en s k PCR-metod bestämma halten rekombinanter i den totala popula- tionen, och vilken snabbt och effektivt kan överföras från fag- form till plasmidform eller enkelsträngad form.

Föreliggande uppfinning avser sålunda en fagvektor, särskilt 465 577 en substitutionsvektor Ã.SK15 för framställning av bibliotek av cDNA-strukturgener, och denna vektor kännetecknas av att den har en längd av 51,2 kb och består av följande fragment: (a) ett cos-Sal I-fragment av vänstra armen av fag Ã.EMBL3 med en längd av 20,3 kb; (b) ett Sal I-Hind III-fragment av en gen som ger kanamycin- resistens, med en längd av ca 0,5 kb; (c) ett Hind III-Hind III-fragment av fag Ä,med en längd av 2 kb; (d) ett Hind III-Sal I-fragment av en gen som ger kanamycin- resistens, med en längd av ca 1 kb; (e) ett Sal I-Bgl II-fragment av fasmiden SK2A med en längd av 3,8 kb, vari Eco RI-igenkänningsstället har förstörts; fasmiden SKZA har framställts utgående från vektorn SK18, som är fram- ställd av DNA-fragment av fag,l , fag M13 och kosmid pHC79; (f) ett Bam I-Bam I-framgent av fag Å EMBL3 med en längd av 13,7 kb; (g) ett Bam I-Bgl II-framgent av fasmiden SK2A med en längd av 0,7 kb, vari Sal I-igenkänningsstället har förstörts; (h) ett Sal I-cos-fragment av högra armen av fag ÄLEMBL3 med en längd av 9,2 kb; att den innehåller ställen för eventuell insättning av främmande DNA i igenkänningssekvenser för restriktionsenzymerna Bam I och Eco RI; att den har en vektorkapacitet av 0,2-15,4 kb; och att dess värdspektrum utgöres av följande stammar av Escherichia coli: LE392 = F', hsd R514 (r§, mg), sup E44, sup F58, lac Y1 OZ (lac I ZY)6, gal K2, gal T22, met Bl, trp R55; j.M.lO9 = recAl, Alac pro, end A1, gyr A96, thi-l, hsd R17, sup E44, rel A1, F', tra D36, pro AB+, lac 1°I zAM15; 9359 = hsd Rf, hsd MQ, sup F, ø so, P2; (vektorn deponerades den 21 juli 1989 hos USSR Research Institute for Genetics and Industrial Microorganism Breeding, där den har fått numret PH 688).

Den enligt föreliggande uppfinning föreslagna fagvektorn gör det möjligt att framställa bibliotek av cDNA-strukturgener ¿ 465 577 med hjälp av restriktionsenzymerna Eco RI och Bam I, varvid vektorn är speciellt bekväm att använda för kloning av igen- känningssekvenser för restriktionsenzymet Bam I. Fagvektorn enligt föreliggande uppfinning_är den enda av de för framställ- ning av cDNA-bibliotek använda fi-vektorerna som möjliggör an- vändning av restriktionsenzymet Bam I.

Genom användning av biokemisk och genetisk selektion är det möjligt att med hjälp av fagvektorn enligt föreliggande uppfin- ning effektivt eliminera ursprungliga, icke-rekombinantiska fager vid framställning av cDNA-bibliotek. Fagvektorn enligt uppfinningen är den enda vektor av detta slag som gör det möjligt att skilja mellan äkta rekombinanter och falska rekombinanter som endast innehåller länksekvenser.

Fagvektorn enligt uppfinningen gör det vidare möjligt att åstadkomma expression av cDNA och translation av mRNA i celler av E.coli innehållande mutationen sup C och/eller sup G, sup¿} eller sup B ("ockra"). Med den nya vektorn kan man framställa bibliotek såväl enligt kända metoder som enligt modifierade metoder, bl a sådana som är baserade på partiell utfyllnad av enkeltrådiga DNA-ändar och som icke kräver användning av metylaser. Den procentuella andelen rekombinanter kan bestämmas genom s k omstickning av',Å-fagens skivor på en matta av celler av E.coli, stam Q359, eller genom användning av en s k dubbel- matta med celler av stammarna K803 (LE392) och 359. Utgångsfagen och de falska rekombinanterna förökas icke i celler av stammen Q359, under det att de äkta rekombinanterna förökas.

Fagvektorn enligt föreliggande uppfining gör det möjligt att lätt förstärka den gen som skall förökas med hjälp av den s k PCR-metoden. vektorn fïSK15 enligt föreliggande uppfinning gör det dess- utom möjligt att undvika fagens "armar" och överföra insatsen till plasmidform. När plasmidhaltiga celler av E.coli infekteras med den s k hjälpfagen M13, packas plasmiden i proteinerna av fagen M13 och överföres till enkelsträngad form. Fagvektorn en- ligt föreliggande uppfining har den högsta kapaciteten av de vektorer av detta slag som användes för framställning av cDNA- 465 577 6 -bibliotek. Fagvektorn har sålunda en kapacitet av upp till 15,4 kb, vilket är tillräckligt för att man skall kunna klona fullständiga mRNA-kopior av praktiskt taget alla gener. = Även om vissa av de kommersiellt tillgängliga vektorerna av detta slag kan uppvisa några av de ovan angivna egenskaperna, är 1 kombinationen av samtliga dessa egenskaper karakteristisk för fagvektorn enligt föreliggande uppfinning.

Uppfinningen beskrives närmare nedan under hänvisning till den bifogade ritningen, på vilken fig la och lb schematiskt visar konstruktion av en s k difasmid SKl8'; fig 2 schematiskt visar konstruktion av en difasmid SK18; fig 3 schematiskt visar konstruktion av en vektor Å_gES7 utgående från en fasmid gSR; fig 4 schematiskt visar konstruktion av fagvektorn /iSKl5; fig 5 schematiskt visar konstruktion av ett bibliotek av cDNA-gener i fagvektorn,1 SKl5 med användning av restriktionsenzymet Bam I; fig 6 schematiskt visar konstruktion av ett cDNA-bibliotek i fagvektorn flSKl5 med användning av metoden för partiell utfyll- nad av enkeltrådiga DNA-ändar; och fig 7 schematiskt visar kon- struktion av ett cDNA-bibliotek med hjälp av fagvektorn Å SKl5 och användning av speciella länkar.

Fagvektorn Å SKl5 enligt föreliggande uppfinning kan fram- ställas på nedan beskrivet sätt.

Först framställes en vektor SK18 (se fig la, lb och 2). Ett fragment med en längd av 1,86 kb utskäres från fagen Ml3 mp 18 med hjälp av restriktionsenzymerna Bal I och Bgl II, och detta fragment renas genom elektrofores på lättsmält agaros. Förutom ori-segmentet av fagen Ml3 innehåller detta DNA-fragment en operator, en promotor, gener lac i och lac z för laktos-operonet, en s k polylänk och en sekvens som är komplementär till en stan- dardiserad oligonukleotidprimer för sekvenser i fager hörande till mp-serien. Parallellt hydrolyseras kosmíden pHC79 medelst restriktionsenzymerna Eco RI och Sal I. De enkeltrådiga ändarna av dels det renade fragmentet innehållande ori-segmentet av fagen Ml3 och dels de erhållna fragmenten av kosmíden pHC79 om- vandlas därefter till dubbeltrådiga ändar medelst ett Klenow- -fragment av DNA-polymeras I från celler av E.coli. Därefter li- geras de linjära DNA-molekylerna med dubbeltrådiga ändar. Den , 465 577 ligerade DNA införes sedan enligt känd teknik i celler av E.coli, stam j.M.lO9, varefter DNA isoleras på känt sätt och analyseras medelst restriktionsenzymerna Eco RI, Pst I, Hind III, Bam I, Bgl II och Sal I. Den härvid erhållna difasmiden SKI användes i efterföljande steg. För minskning av längden av difasmiden SK1 hydrolyseras denna difasmid med hjälp av restriktionsenzymerna Hind III och Bgl II, varefter man renar det fragment som inne- håller en gen som ger ampicillinresistens. Parallellt behandlas DNA från fagen Ml3 mp 18 medelst samma restriktionsenzymer, var- efter det lågmolekylära fragmentet isoleras och de båda fragmen- ten ligeras. Celler av E.coli, stam j.M.l09, transformeras medelst den erhållna lösningen, varefter de transformerade cell- erna ympas på ett näringsmedium som innehåller ampicillin, X-gal och IPTG..DNA isoleras från cellerna, spjälkas medelst restrik- tionsenzymerna Eco RI, Pst I, Hind III, Bam I, Bgl II och Sal I samt analyseras. Härvid isoleras fasmiden SK2, som användes i efterföljande steg.

Kosmiden pHC79 spjälkas medelst restriktionsenzymet Bgl II, varefter ett fragment med cos-sekvens isoleras. Fasmiden SK2 hydrolyseras, och den hydrolyserade DNA ligeras med fragmentet innehållande cos-sekvensen. Med den erhållna lösningen trans- formeras celler av E.coli, stam j.M.109. De transformerade cell- erna ympas på ett ampicillinhaltigt näringsmedium. Från de odla- de cellkolonierna tages avtryck på nitrocellulosafilter, och cellerna hybridiseras medelst ett Bgl II-fragment av kosmiden pHC79, vilket fragment innehåller en cos-sekvens som märkes medelst 32P såsom markör genom s k nick-translation. Celler från de med cos-sekvensen hybridiserade kolonierna får tillväxa i ett ampicillinhaltigt näringsmedium, varefter DNA isoleras, spjälkas medelst restriktionsenzymerna Eco RI, Pst I, Hind III, Bam I, Bgl II och Sal I samt analyseras. En av de isolerade difasmider- na, nämligen difasmiden SK6, användes i efterföljande steg.

Difasmiden SK6 hydrolyseras med hjälp av restriktionsenzymet Eco RI, varefter de enkeltrådiga ändarna omvandlas till dubbel- trådiga ändar medelst ett Klenow-fragment i närvaro av dNTP. Den lineäriserade difasmiden renas och ligeras. Celler av E.coli, stam j.M.109, transformeras med den erhållna lösningen, och de 465 577 8 transformerade cellerna ympas på ett näringsmedium innehållande ampicillin, X-gal och IPTG. Från kolonierna uttagna celler får tillväxa på ett ampicillinhaltigt medium, varefter difasmid-DNA ß isoleras. Denna DNA spjälkas medelst restriktionsenzymerna Eco RI, Pst I, Hind III, Bam I, Bgl II och Sal I samt analyseras. ; Härvid isoleras difasmiden SK18', som hydrolyseras medelst re- striktionsenzymet Acc I. De enkeltrådiga ändarna av det utanför polylänken liggande Acc I-avsnittet omvandlas till dubbeltrådiga ändar medelst ett Klenow-fragment i närvaro av dATP och dTTP.

Det härvid erhållna preparatet behandlas med DNA-ligas av fag T4 i en buffertlösning, varefter celler av E.coli, stam j.M.109, transformeras med den erhållna lösningen. De transformerade cellerna (transformanterna) ympas på ett näringsmedium innehåll- ande ampicillin, X-gal och IPTG. Från kolonierna utvalda celler får tillväxa i ett ampicillinhaltigt näringsmedium, varefter DNA isoleras, spjälkas medelst restriktionsenzymet Acc I och analyse- ras. Härvid isoleras difasmiden SK18, som innehåller endast ett Acc I-avsnitt.

Difasmiden SK18 hydrolyseras medelst restriktionsenzymet Bgl II, varpå självligering genomföres. Celler av E.coli, stam j.M.109, transformeras medelst den ligerade DNA, och de trans- formerade cellerna ympas på ett ampícillinhaltigt näringsmedium, Celler från de tillväxta kolonierna odlas på ett ampicillinhal- tigt medium, varefter man från cellerna isolerar DNA genom lysis medelst alkali. Denna DNA spjälkas medelst restriktionsenzymerna Eco RI, Bam I, Sal I och Bgl II samt analyseras. Av de analysera- de fasmiderna isoleras fasmiden SK2A. Fasmiden SK2A skiljer sig från fasmiden SK2 huvudsakligen genom att den saknar de igenkän- ningssekvenser för restriktionsenzymerna Eco RI och Acc I som ligger utanför polylänken. Från fasmiden SK2A avlägsnas därefter igenkänningssekvensen för restriktionsenzymet Sal I. Härvid hydrolyseras fasmiden SK2A medelst restriktionsenzymet Sal I, varefter de enkeltrådiga DNA-ändarna omvandlas till dubbeltrådiga ändar genom behandling med ett Klenow-fragment av DNA-polymeras I från E.coli. Den lineäriserade DNA bringas att självligera, och den ligerade DNA införes i celler av E.coli, stam j.M.109. DNA isoleras från cellkolonierna på i och för sig känt sätt och 9 465 577 analyseras medelst restriktionsenzymerna Eco RI, Bam I och Sal I.

Man isolerar fasmiden SK2¿lS, som innehåller igenkänningssekven- ser för restriktionsenzymerna Eco RI och Bam I men icke innehål- ler någon igenkänningssekvens för restriktionsenzymet Sal I. Från fasmiden SK¿lS avlägsnas därefter igenkänningssekvensen för re- striktionsenzymet Eco RI. Härvid hydrolyseras fasmiden SK2¿1S medelst restriktionsenzymet Eco RI, varefter de enkeltrådiga DNA-ändarna omvandlas till dubbeltrådiga ändar genom behandling med ett Klenow-fragment av DNA-polymeras I. Den lineäriserade DNA-molekylen ligeras, och den ligerade DNA spjälkas medelst restriktionsenzymet Eco RI och införes i celler av E.coli, stam j.M.l09. DNA isoleras från cellkolonierna på i och för sig känt sätt och analyseras medelst restriktionsenzymerna Eco RI, Bam I och Sal Ir Man isolerar fasmiden SKZLISR, som innehåller en igenkänningssekvens för restriktionsenzymet Bam I men icke inne- håller några igenkänningssekvenser för restriktionsenzymerna Eco RI och Sal I. Därefter konstrueras rekombinantfasmiden (hybridfasmiden) gSR. Fag flgtll hydrolyseras medelst restrik- tionsenzymet Bam I, och enzymet inaktiveras. Fagens enkeltrådiga ändar avlägsnas sedan genom uppvärmning, och ett centralt Bam I- -fragment med en längd av ca 6,5 kb renas (preparat A). Fasmiden SK2¿3SR hydrolyseras fermentivt medelst restriktionsenzymet Bam I. Efter avslutad inaktivering av enzymet ligeras DNA-frag- mentet med preparatet A. Den ligerade DNA införes i celler av E.coli, stam j.M.lO9, och de resulterande cellerna ympas på ett näringsmedium innehållande L-agar och ampicillin. Med hjälp av nitrocellulosafilter tages avtryck av de tillväxta cellkolonier- na, varefter cellerna hybridiseras med preparatet A, vars DNA märkes medelst 32P såsom markör genom s k nick-translation.

Celler från de med preparatet A hybridiserade kolonierna får tillväxa, och plasmid-DNA isoleras på känt sätt. Restriktions- analys av den erhållna_DNA medelst restriktionsenzymerna Eco RI, Bam I och Sal I bekräftar att Ã.gtl1-fragmentet har klonats i fasmiden SK2¿3SR. Den erhållna fasmiden gSR användes i efterfölj- ande steg. En fagvektor /lgES7 (se fig 3) framställes genom att fasmiden gSR hydrolyseras medelst restriktionsenzymet Bgl II, varpå enzymet inaktiveras. Fagen ;\EMBL3 hydrolyseras med re- 465 577 10 striktionsenzymet Bam I, varpå enzymet inaktiveras. De båda DNA-preparaten blandas i ekvimolära mängder och ligeras. Den ligerade DNA packas in vitro i proteiner av fag /1, och de här- ' vid erhållna fagpartiklarna ympas på en "matta" av celler av E.coli, stam LE392, innehållande O,l% X-gal. En fag får tillväxa + på tio blåfärgade skivor. DNA isoleras och analyseras med hjälp av restriktionsenzymerna Eco RI, Bam I och Sal I. Man isolerar fagen }LgES7, som användes i efterföljande steg.

Vidare framställes plasmiden p4KL-1 genom att plasmiden pUC4-K hydrolyseras med restriktionsenzymet Hind III, varvid reaktionen avbrytes genom värmning vid en temperatur av 65°C under en tid av 15 minuter. Fag Äïspjälkas därefter med restrik- tionsenzymet Hind III, och ett DNA-fragment med en längd av ca 2 kb renas genom gelelektrofores i en 0,7-procentig lösning av lättsmält agaros (Sigma). Det renade DNA-fragmentet och Hind III- -fragmentet av plasmiden pUC4K blandas i ekvimolära mängder och ligeras. Celler av E.coli, stam j.M.l09, transformeras med den ligerade DNA, varpå de transformerade cellerna ympas på ett näringsmedium innehållande L-agar och ampicillin. Medelst ett nitrocellulosafilter tages avtryck av cellkolonierna, varpå cellkolonierna hybridiseras med 32P-märkt DNA från fag /1. Cel- ler från sex hybridiserande cellkolonier får tillväxa i 10 ml ampicillinhaltigt L-medium. DNA isoleras genom lysís medelst alkali. 0,5 pg DNA spjälkas medelst restriktionsenzymerna Eco RI, Bam I, Sal I och Hind III samt analyseras genom elektrofores i _ en 1-procentig lösning av agarosgel. En av plasmiderna, som har det önskade restriktionsmönstret (se fig 4) och betecknas p4KL-1, användes i efterföljande steg, som utgör framställning av fagen ,ÄgSK5. Plasmiden p4KL-1 hydrolyseras fermentivt medelst restrik- tionsenzymerna Eco RI och Sal I, varvid reaktionen avbrytes genom värmning vid 65°C under 15 minuter. Pag Å\gES7 spjälkas medelst restriktionsenzymet Sal I, varpå enzymet inaktiveras genom värm- ning vid 65°C under 15 minuter. De båda DNA-preparaten blandas i ekvimolära mängder och ligeras. Den ligerade DNA packas in vitro i proteiner av fag /L, och de härvid erhållna fagpartiklarna ympas på en matta av celler av E.coli, stam LE392. Från Petri- skålen tages ett avtryck på ett filter av nitrocellulosa, var- 465 577 ll efter hybridisering genomföres med ett 32P-märkt Sal I-fragment av plasmiden pUC4K innehållande en gen som ger kanamycinresi- stens. Fager utvinnes från sex hybridiserande kolonier, och DNA isoleras och analyseras medelst restriktionsenzymerna Eco RI, Bam I och Sal I. Alla fagerna innehåller en inaktiverad gen för kanamycinresistens, varvid en av fagerna, nämligen fagen Å_gSK5, som har den i fig 4 visade strukturen, användes för framställning av fagvektorn,Ã SKl5. Härvid hydrolyseras fagen,Ã-EMBL3 medelst restriktionsenzymet Bam I. Ett insättningsfragment med en längd av ca 13,7 kb renas genom gelelektrofores i en 0,7-procentig lös- ning av lättsmält agaros. Fagen flgSK5 hydrolyseras medelst re- striktionsenzymet Bam I, varefter enzymet inaktiveras genom värm- ning vid 65°C under 15 minuter. De båda DNA-preparaten blandas i ekvimolära mängder och ligeras. Den ligerade DNA packas in vitro i proteiner av fag fl, och de härvid erhållna fagpartiklarna ympas på en matta av celler av E.coli, stam LE392. De tillväxta kolonierna omympas på en matta av celler av stammen Q359 lysogena med avseende på fagen P2. Insättningsfragmentet från fagen ,ÄEMBL3 säkerställer spi+-fenotyp, vilket innebär att icke- -rekombinantfagerna inte kan förökas i celler av E.coli lysogena med avseende på fagen P2. Man odlar därför fager från de sex kolonier som icke har tillväxt på stammen Q359, och DNA isoleras och analyseras medelst restriktionsenzymerna Eco RI, Bam I och Sal I. En av fagerna har den förmodade strukturen (se fig 4) och har fått namnet Å.SK15.

Fagvektorn ,1SK15 enligt föreliggande uppfinning kan använ- das för framställning av cDNA-bibliotek med användning av Eco RI- -sekvenser.

För eliminering av icke-rekombinantfager och "falska" rekom- binanter är det tillräckligt att man ympar fagerna på en cell- matta av E.coli, stam Q359, eftersom antingen de ursprungliga fagerna eller de fager som innehåller en insats hopkopplad med en länk icke kommer att förökas på dessa celler. De fager som bildats genom hopkoppling av "armarna" av fagen Å.SK15 med län- ken kommer att bli livsodugliga på grund av att DNA-längden är för kort för alla stammar av E.coli. Den minsta DNA-längd som kan ge livsdugliga partiklar av fag Ä-är 37,7 kb, under det att 465 577 12 armarna av fagen Å.SKl5 har en längd av 37,5 kb, dvs 0,2 kb kortare än den erforderliga DNA-längden. Det är uppenbart att insättning av även många länkkopior icke leder till någon märkbar förändring av DNA-längden och till bildning av vitala falska rekombinanter. Icke heller bildas partiella rekombinanter, dvs fager som innehåller såväl den ursprungliga insatsen som cDNA- -insatsen, eftersom storleken av fagen./lSK15 (ca 51,2 kb) är nära den maximala storleken (ca 52,9 kb) för fagen fl. Denna metods effektivitet kan förbättras ytterligare genom att armarna av fagen Å.SKl5 underkastas förberedande rening genom elektro- fores eller centrifugering. För framställning av cDNA-bibliotek med hjälp av Eco RI-sekvenser kan fagen ;iSK15 användas i form av en difasmid, vilken innehåller endast armarna av fagen Ä-SK15 och därför icke effektivt kan packas i proteiner av fagen Ãzpå grund av otillräcklig längd. För framställning av difasmiden är det tillräckligt att spjälka fagen Å.SKl5 medelst restriktions- enzymet Eco RI och återförena DNA-molekylerna vid låg DNA-kon- centration, varvid huvudsakligen ringformig men icke s k kon- katemer DNA bildas. Med denna DNA transformeras celler av exem- pelvis stammen HBl0l av E.coli, vilket gör det omöjligt för fagen Å.att undergå hela den lytiska cykeln. Det är självklart att alla de vitala fagerna kommer att vara rekombinantfager när genbiblioteket konstrueras i denna difasmid. I denna form påmin- ner fagen ;LSKl5 om fasmid-vektorerna /ipMYF och flpsbäl.

Det är emellertid lämpligare att använda fagvektorn Å.SKl5 enligt föreliggande uppfinning för framställning av cDNA-biblio- tek med användning av Bam I-sekvenser (se fig 5). Dubbelsträngad DNA syntetiserades på känt sätt men behandlades icke med restrik- tionsenzymet Eco RI utan med Bam I-metylas (eller dam-metylas).

DNA-molekylen kopplas därefter till Bam I-länkar och behandlas med restriktionsenzymet Bam I (eller Mbo I). Fagvektorn Ã.SKl5 hydrolyseras samtidigt med restriktionsenzymerna Bam I och Eco RI. Reaktionen avbrytes genom att reaktionsblandningen vär- mes vid en temperatur av 65°C under 15 minuter, och DNA renas från Bam I-Eco RI-oligonukleotidlänkar genom utfällning medelst polyetylenglykol 6000.

Härigenom erhåller armarna enkelsträngade Bam I-ändar, 13 465 577 under det att insatsen innehåller en Eco RI-sekvens. Detta inne- bär med andra ord att den ursprungliga fagen vid ligeringen en- dast kan bildas medelst restlänkar Bam I-Eco RI, varvid denna reaktion är av högre ordning än reaktionen för bildning av re- kombinantfagen. Vid konstruering av cDNA-biblioteket enligt denna metod behöver man därför icke använda stammen Q359 av E.coli. Det är klart att de falska rekombinanterna även i detta fall kommer att vara livsodugliga.

Genom användning av Bam I-sekvensen i fagvektorn Ä.SKl5 för konstruering av cDNA-bibliotek blir det sålunda möjligt att för- ena fördelarna med de båda metoderna, dvs metoden med partiell utfyllnad av enkeltrådiga DNA-ändar och metoden för konstruering av genbibliotek utan användning av metylaser. Enligt denna prin- cip (se fig 6) hopkopplas Sal I-länkar (eller Xho I-länkar) med cDNA utan förberedande behandling med metylas. Eftersom restrik- tionsenzymet Sal I sällan spjälkar eukaryotisk DNA (en igenkän- ningssekvens per ca 50 kb) och företrädesvis i regleringsområden, vilka saknas i cDNA, medför den efterföljande hydrolysen av cDNA medelst restriktionsenzymet Sal I icke någon nämnvärd förändring av längden av CDNA. Efter avslutad inaktivering av enzymet (re- striktionsenzymet Sal I) utfylles de enkelsträngade DNA-ändarna delvis i ett inkubationsmedium medelst ett Klenow-fragment (eller medelst revertas) i närvaro av dCTP och dTTP. Fagvektorn ÄlSK15 hydrolyseras medelst restriktionsenzymerna Eco RI och Bam I, och de enkelsträngade ändarna utfylles delvis med ett Klenow-fragment eller revertas i närvaro av dATP och dGTP. De båda preparaten blandas och ligeras, varvid ligeringen i det aktuella fallet en- dast kan ske i ena riktningen. cDNA ligeras med vektor-DNA, eftersom självligering av vektor-DNA eller cDNA icke är möjlig.

Den ligerade DNA packas in vitro på känt sätt i proteiner av fag /1, och medelst de erhållna fagpartiklarna infekteras celler av E.coli, stam LE392. När denna framställningsmetod jämföres med den metod enligt vilken cDNA-bibliotek konstrueras i andra vekto- rer, exempelvis Å-gtl8/19, Ã.gt22 och fiZAP, med användning av principen för partiell utfyllnad av enkelsträngade DNA-ändar, kan man konstatera att fagvektorn ;lSKl5 är den mest hanterliga av samtliga vektorer av detta slag. 465 577 14 Genom syntes av den speciella länken kan man klara sig utan metylering av cDNA och utan efterföljande hydrolys därav medelst restriktionsenzymet, vilket underlättar konstruktionen av biblío- ß teket.

I fig 7 illustreras användning av speciella länkar enligt - andra möjliga utföringsformer. A', A" B och C avser användning av olika länkar för hopkoppling av cDNA. A avser kloning i fag- vektorn fl.SKl5 med användning av Bam I-sekvens utan utfyllnad av enkeltrådiga ändar. A' avser användning av länkar med ett enda kodon ATG. A" avser användning av länkar med tre startkodoner ATG för hopkoppling av olika nukleotidsekvenser. B avser kloning i fagvektorn,Ã SK15 med användning av Bam I-sekvens och komplet- tering med två nukleotider. C avser kloning i fagvektorn Ã.SK15 med användning av Bam I-sekvens och komplettering med en enda nukleotid.

Utföringsformerna B och C, där länkar användes för hopkopp- ling av cDNA, är lämpligast att använda för framställning av cDNA-bibliotek, eftersom de icke kräver någon partiell utfyllnad av enkelsträngade cDNA-ändar och dessutom omöjliggör självlige- ring av såväl cDNA som fagvektorn.

I fagvektorn enligt föreliggande uppfinning kan man dessutom införa s k riktade cDNA-bibliotek genom användning av två re- striktionsenzymer (exempelvis enzymparen Eco RI-Xba I och Sac I-Bam D.

Expression i fagvektorn Å-SKl5 åstadkommes, liksom i andra fagvektorer av detta slag, med användning av lac-promotorn (exem- pelvisglgtll, ÄIZAP, etc), varvid effektiv translation av mRNA kan genomföras endast under strängt kontrollerade betingelser om cellerna av kulturen E.coli bär mutationer sup C och/eller sup G, sup B, sup V (eller om en plasmid som bär respektive gen införes i cellerna). Detta beror på att man enligt föreliggande uppfinning sex tripletter efter startkodonet AUG har inbyggt ett stoppkodon UAA ("ockra"), vars inverkan undertryckes av mutatio- nerna sup C, sup G, sup V och sup B.

Genom framställning av cDNA-bibliotek i fagvektorn Ã_SK15 _blir det sålunda möjligt att eliminera okontrollerad expression av cDNA, varigenom cDNA-biblioteket blir mera representativt. 465 577 15 Detta innebär med andra ord att fagvektorn Ä SK15 i detta avse- ende utgör en ny typ av vektorer för framställning av bibliotek av cDNA-strukturgener, eftersom fagvektorn ;lSK15 i beroende av vilken typ av stam av E.coli som användes antingen icke kan undergå expression eller kan undergå expression. Fagvektorn SK15 uppvisar sålunda fördelarna med båda typerna av vektorer.

När ett cDNA-bibliotek framställes med hjälp av fagvektorn fiSKl5, blir det dessutom möjligt att åstadkomma okontrollerad expression liksom i andra expressionsvektorer av detta slag. I detta syfte är det tillräckligt att införa kodonet ATG (se fig 7) i den länk som skall hopkopplas med cDNA. Härvid kommer det bildade proteinet att vara praktiskt taget fritt från extra, främmande aminosyror. cDNA plasmidform. Härvid användes en annan princip än vid omvandling av cDNA-insatsen i fagvektorn /ÅZAP till plasmidform. DNA i en rekombinant av fagvektorn Å.SK15 hydrolyseras partiellt medelst restriktionsenzymet Sal I (eller medelst restriktionsenzymet Cla I), varefter enzymet inaktiveras genom trefaldig frysning och upptining. Dessa båda restriktionsenzymer spjälkar ganska sällan eukaryotisk DNA, varvid Sal I- och Cla I-igenkännings- sekvenserna huvudsakligen är koncentrerade till regleringsområ- dena, vilka saknas i cDNA. DNA utspädes därefter och ligeras.

Den ligerade DNA införes i s k kompetenta celler av E.coli, vilka ympas på ett näringsmedium bestånde av L-agar och ampicil- lin. De tillväxta kolonierna innehåller en CDNA-insats i plasmid- form, varvid plasmiden antingen icke alls innehåller fagens nukleotidsekvenser (om restriktionsenzymet Sal I användes) eller innehåller en obetydlig andel därav (om restriktionsenzymet Sal I användes). cDNA-insatsen kan snabbt (3-4 timmar) och effek- tivt omvandlas till plasmidform. 0,1 pg rekombinant av fag- vektorn,iSKl5 ger flera hundra eller t o m tusentals cellkoloni- er. Såväl fagen Å SK15 som dess rekombinanter kan också om så erfordras (t ex vid speciella försök) omvandlas till plasmidform enligt en annan metod. Det är i detta fall tillräckligt att adsorbera fagen på celler av E.coli som icke ger någon förökning av fagen (exempelvis stammarna HB och j.M.109) under en tid av 465 577 16 5-10 minuter vid en temperatur av 0-37°C och att ympa cellerna på näringsmedium innehållande ampicillin. Härvid kommer emeller- tid plasmiden att också innehålla alla i fagen Å- SKl5 förekomman- de nukleotidsekvenser. Ã andra sidan kan en dylik plasmid lätt omvandlas till fagform, vilket kan vara önskvärt för speciella ändamål.

När plasmidhaltiga celler av E.coli "superinfekteras" me- delst fagen M13, packas plasmid-DNA i fagens proteiner i enkel- strängad form, som är lämplig för sekvensbestämning med hjälp av den s k Sanger-metoden. Den andra fördelen med att fagvektorn ;lSK15 är en s k substitutionsvektor är att man vid konstruering av cDNA-bibliotek i denna vektor kan klona långa cDNA-insatser (med en längd av t ex 2-8 kb), under det att avsevärt kortare cDNA-insatser klonas vid framställning av cDNA-bibliotek med alla andra vektorer av detta slag, vilka är insättningsvektorer. Fag- vektorn fLSK15 har en kapacitet av 15,4 kb, vilket är tillräck- ligt för att man fullständigt skall kunna klona mRNA-kopior av praktiskt taget alla gener.

Den procentuella andelen rekombinanter i det med hjälp av fagvektorn R-SK15 konstruerade cDNA-biblioteket kan lätt bestäm- mas med ledning av fenotypen genom s k omympning av kolonier på en cellmatta av E.coli, stam Q359, eller genom användning av en s k dubbelmatta av celler av stammarna LE392 och Q359 av E.coli.

Vid omympning på en Q359-cellmatta kommer icke-rekombinantfagerna inte att förökas, medan rekombinanterna kommer att förökas. Om- ympningen kräver emellertid en avsevärd arbetsinsats, under det att direkt ympning av fagerna på en matta av stammen Q359 kan re- sultera i bildning av s k artefakter.

Användning av en s k dubbelmatta gör det möjligt att undan- röja dessa nackdelar. De fager som skall analyseras inkuberas en- ligt denna metod i Petri-skålar tillsammans med celler av E.coli, stam LE392, efter tillsättning av en 0,6-procentig lösning av L-agar. Ovanpå den resulterande mattan anbringas en matta av celler av stammen Q359 (även i detta fall efter tillsättning av en 0,6-procentig lösning av L-agar). Rekombinantfagerna ger här- vid genomskinliga skivor, under det att icke-rekombinantfagerna ger grumliga skivor, något som är lätt att observa visuellt. 465 577 17 Fagvektorn Ã_SKl5 enligt föreliggande uppfinning är sålunda den enda substitutionsvektor som kan användas för framställning av CDNA-bibliotek.

Fagvektorn enligt föreliggande uppfinning gör det möjligt att framställa cDNA-bibliotek enligt såväl kända standardmetoder som nya metoder, bl a sådana som är baserade på partiell utfyll- nad av enkelsträngade DNA-ändar och sådana som icke kräver an- vändning av metylaser. Fagvektorn enligt uppfinningen gör det dessutom möjligt att använda restriktionsenzymet Bam I för klo- ning. Med vektorn enligt uppfinningen förenas fördelarna med vektorer som undergår expression och vektorer som icke undergår expression, och fagvektorn kan användas såsom expressionsvektor eller icke-expressionsvektor i beroende av vilken stam av E.coli som användes. Med ledning av det fenotypiska kännetecknet kan man dessutom bestämma den procentuella andelen rekombinantfager, varigenom cDNA-bibliotekets kvalitet kan kontrolleras. Med vek- torn enligt uppfinningen kan man också genomföra biokemisk gene- tisk selektion gentemot ursprungliga icke-rekombinantfager. Man kan vidare genomföra selektion gentemot "falska" och partiella rekombinanter. Man kan vidare snabbt och effektivt omvandla cDNA-insatsen till plasmidform som saknar fagens "armar". Dess- utom kan cDNA-insatsen omvandlas till enkelsträngad form för bestämning av primärstrukturen enligt Sanger-metoden. Det är dessutom möjligt att säkert utesluta okontrollerad omvandling av CDNA-insatsen i fagen/1 SKl5 till enkelsträngad form. Man kan också specifikt märka både 5'- och 3'-ändar av cDNA-insatsen med användning av konventionella, kommersiellt tillgängliga preparat, nämligen s k start- eller initieringsmedel.

Uppfinningen illustreras genom följande utföringsexempel, som beskriver framställning och användning av fagvektorn enligt uppfinningen.

Exempel 1 Först framställes en s k difasmid SKI8 (se fig 1 och 2).

Ur 5 pg av fagen Ml3 mp 18 utskäres ett DNA-fragment med en längd av 1,8 kb med hjälp av restriktionsenzymerna Bal I och Bgl II (10 aktivitetsenheter av vardera). DNA-fragmentet renas 465 577 18 genom elektrofores i lättsmält agaros. Förutom ori-sekvensen i fag M13 innehåller detta fragment även en operator, en promotor, gener lac i och lac z för laktos-operonet, en polylänksekvens * och en sekvens som är komplementär till en standardiserad oligo- nukleotidprimer för sekvenser i fager i mp-serien. Parallellt hydrolyseras 2 pg av kosmiden pHC79 under standardbetingelser medelst restriktionsenzymerna Eco RI och Sal I (20 aktivitets- enheter av vardera). De enkeltrådiga ändarna av såväl det renade fragmentet innehållande ori-sekvensen av fag M13 som Eco RI- -Sal I-fragmentet av kosmiden pHC79 omvandlas därefter till dubbeltrådiga ändar med hjälp av fem aktivitetsenheter av ett Klenow-fragment av DNA-polymeras från E.coli i 50 pl av en buf- fertlösning innehållande 20 mmol tris-HCl (pH 7,4), 5 mmol MgCl2, 10 mmol 2-merkaptoetanol och 50 mmol NaCl i närvaro av 15 pmol av alla fyra deoxinukleosidtrifosfaterna. Provet innehåller 50 pg DNA per ml.

De båda fragmenten, vilka innehåller ori-sekvensen av fag M13 och cos-sekvensen av fag Ål, blandas i ekvimolära mängder och ligeras i en lösning med volymen 100 pl innehållande 50 mmol tris-HCl (pH 7,5), 10 mmol MgCl2, 10 mmol ditiotreitol, 3 mmol adenosintrifosfat, 25 aktivitetsenheter DNA-ligas av fag T4 och totalt 50 pg DNA per ml. Den ligerade DNA införes på känt sätt i celler av E.coli, stam j.M.109. Bakterierna ympas på närings- medium i Petri-skålar. Näringsmediet innehåller en 2-procentig lösning av L-agar, 25 pg ampicillin per ml, 0,1% IPTG och O,1% av färgämnet X-gal. Från tio blåfärgade kolonier isoleras på känt sätt ca 10 pg DNA, som analyseras medelst restriktions- enzymerna Eco RI, Pst I, Hind III, Bam I, Bgl II och Sal I.

Härvid erhålles en difasmid SK1 med önskat restriktionsmönster (se fig 1). Difasmiden SK1 användes i efterföljande steg.

För minskning av längden av difasmiden SK1 hydrolyseras 5 pg av denna difasmid medelst restriktionsenzymerna Hind III och Bgl II (5 aktivitetsenheter av vardera). Ett DNA-fragment inne- hållande en gen som ger ampicillinresistens renas genom elektro- fores i lättsmält agaros. Parallellt behandlas 5 pg DNA från M13 mp 18 medelst samma restriktionsenzymer, dvs Hind III och Bgl II.

Efter avslutad elektrofores isoleras ett lågmolekylärt DNA-frag- 465 577 19 ment från den lättsmälta agarosen. De båda DNA-fragmenten ligeras i 0,1 ml av en lösning innehållande 50 mmol tris-HCl (pH 7,5), 10 mmol MgCl2, 10 mmol ditiotreitol, 3 mmol adenosintrifosfat och fem aktivitetsenheter DNA-ligas av fag T4. Den totala kon- centrationen av DNA-fragmenten är 50 pg/ml. 10 pl av den erhållna lösningen användes för transformering av celler av E.coli, stam j.M.109. De transformerade cellerna ympas på ett näringsmedium innehållande L-agar, 25 pg ampicillin, 0,1% X-gal och 0,l% IPTG.

Celler från de blåfärgade kolonierna får tillväxa i 10 ml L- -näringsmedium innehållande 100 pg ampicillin per ml, varefter man genom alkalisk lysis isolerar ca 10 pg DNA. 0,5 pg DNA spjäl- kas därefter medelst restriktionsenzymerna Eco RI, Pst I, Hind III, Bam I, Bgl II och Sal I samt analyseras genom elektro- fores i en agaroshaltig gel. Härvid erhålles en fasmid SK2 med önskat restriktionsmönster (se fig 1). Denna fasmid SK2 användes i efterföljande steg. 5 pg av kosmiden pHC79 spjälkas medelst restriktionsenzymet Bgl II, varefter ett DNA-fragment innehållande en cos-sekvens elueras ur lättsmält agaros efter avslutad elektrofores. 2 pg av fasmiden SK2 hydrolyseras medelst restriktionsenzymet Bgl II.

Det härvid erhållna DNA-preparatet ligeras med DNA-fragmentet innehållande cos-sekvensen i en buffertlösning innehållande 50 mmol tris-HCl (pH 7,5), 10 mmol MgCl2, 10 mmol ditiotreitol, 3 mmol adenosintrifosfat och fem aktivitetsenheter DNA-ligas av fag T4. Härvid användes DNA-fragmentet i dubbelt molärt över- skott, under det att den totala DNA-koncentrationen är ca 50 pg/ml. 10 pl av den erhållna lösningen användes för transforme- ring av celler av E.coli, stam j.M.109. De transformerade celler- na ympas på L-agar innehållande 25 pg per ml. Från de tillväxta cellkolonierna uttages avtryck på nitrocellulosafilter, varpå cellkolonierna hybridiseras medelst ett Bgl II-fragment av kos- miden pHC79 innehållande cos-sekvens, som har märkts medelst 32P genom s k nick-translation. Celler från de fem cellkolonier som hybridiserats med cos-sekvensen får tillväxa i 10 ml L-medium in- nehållande ca 100 pg ampicillin per ml. Ca 10 pg DNA isoleras därefter från cellerna genom lysis medelst alkali. 0,5 ug DNA spjälkas medelst restriktionsenzymerna Eco RI, Pst I, Hind III, 465 577 20 Bam I, Bgl II och Sal I samt analyseras genom elektrofores på agarosgel. Alla fem difasmiderna uppvisar det önskade restrik- tionsmönstret (se fig 1). En av difasmiderna, nämligen SK6, användes i efterföljande steg. 5 pg av difasmiden SK6 hydrolyseras partiellt med restrik- tionsenzymet Eco RI, varvid den den lineäriserade difasmiden renas genom elektrofores i lättsmält agaros. Det härvid erhållna DNA-preparatet behandlas under en tid av 20 minuter vid en tempe- ratur av 20°C i 45 pl av en lösning innehållande 20 mmol tris-HCl (pH 7,4), 5 mmol MgCl2, 10 mmol 2-merkaptoetanol, 50 mmol NaCl, 15 pmol av vart och ett av alla fyra deoxinukleosidtrifosfaterna och fem aktivitetsenheter Klenow-fragment av DNA-polymeras I. Z Lösningen försättes därefter med 5 ml buffertlösning innehållande 500 mmol tris-HCl (pH 7,5), 100 mmol MgCl2, 100 mmol ditiotreit- ol, 30 mmol adenosintrifosfat och 20 aktivitetsenheter DNA-ligas av fag T4. De lineära DNA-molekylerna med dubbeltrådiga ändar ligeras vid en temperatur av 60°C under en tid av 14 timmar. 10 pl av den erhållna lösningen användes för transformering av cel- ler av E.coli, stam j.M.l09. De transformerade cellerna ympas på ett näringsmedium innehållande L-agar, 25 pg ampicillin per ml, 0,1% X-gal och 0,1% IPTG. Celler från de fem blåfärgade cellkolo- nierna får tillväxa i 10 ml L-medium innehållande 10 pg ampicil- lin. Från de tillväxta cellerna isoleras 10 pg difasmid-DNA, som därefter spjälkas medelst restriktionsenzymerna Eco RI, Pst I, Hind III, Bam I, Bgl II och Sal I samt analyseras genom elektro- fores på agarosgel. Av de fem analyserade difasmiderna har två visat sig vara identiska med den ursprungliga difasmiden SK6, medan de övriga tre saknar Eco RI-sekvensen före tetracyklin- promotorn och således uppvisar det önskade restriktionsmönstret (se fig 1).

En dylik difasmid har fått namnet SK18'. 0,5 ug av difasmi- den SK18' hydrolyseras fullständigt medelst restriktionsenzymet Acc I. Det utanför polylänken befintliga Acc I-fragmentets enkel- trådiga ändar omvandlas till dubbeltrådiga ändar medelst ett Klenow-fragment i närvaro av dATP och dTTP. Det härvid erhållna DNA-preparatet behandlas med fem aktivitetsenheter DNA-ligas av fag T4 i 50 ul av en lösning innehållande 50 mmol tris-HCl (pH 465 577 21 7,5), 10 mmol MgCl2, 10 mmol ditiotreitol och 3 mmol adenosintri- fosfat vid en temperatur av 16°C över natten. 10 pl av den här- vid erhållna lösningen användes för transformering av celler av E.coli, stam j.M.109. De transformerade cellerna ympas på ett näringsmedium innehållande L-agar, 25 pg ampicillin per ml, 0,1% X-gal och O,l% IPTG. Celler från de sex blåfärgade kolonierna får därefter tillväxa i 10 ml L-medium innehållande 100 pg ampi- cillin per ml. Ca 10 pg DNA isoleras från de tillväxta kolonierna genom lysis medelst alkali. 0,5 pg DNA spjälkas medelst restrik- tionsenzymet Aco I och analyseras genom elektrofores på agaros- gel. Fyra fasmider visar sig därvid likna difasmiden SK18', under det att de båda andra fasmiderna innehåller en enda Acc I- -sekvens. De sistnämnda fasmiderna har fått namnet difasmid SKl8 (se fig 2). Denna difasmid användes i efterföljande steg.

Difasmiden SK18 hydrolyseras medelst restriktionsenzymet Bgl II, och reaktionen avbrytes genom värmning vid en temperatur av 65°C under 15 minuter. DNA-lösningen utspädes därefter tre- faldigt och ligeras. Den ligerade DNA användes för transformering av celler av E.coli, stam j.M.109, och de transformerade cellerna ympas på L-agar innehållande antibiotikumet ampicillin. Celler från de tio tillväxta cellkolonierna odlas i 10 ml L-medium inne- hållande ampicillin. DNA isoleras genom alkalisk lysis, varefter 0,5 pg DNA spjälkas medelst restriktionsenzymerna Eco RI, Bam I, Sal I och Bgl II samt analyseras genom elektrofores i 1-procentig agarosgel. Sex fasmider uppvisar det önskade restriktionsmönst- ret, och en av dessa fasmider, nämligen SKZA, användes i efter- följande steg.

Fasmiden SKZA skiljer sig från fasmiden SK2 genom att den saknar de utanför polylänken befintliga igenkänningssekvenserna för restriktionsenzymerna Eco RI och Acc I. Sålunda innehåller fasmiden SK2A dels ett fragment av plasmiden pBR322 med ett replikationsstartställe och en gen som ger ampicillinresistens och dels ett fragment av fagen MI3 mp 18 med polylänk, gen lac z och en sekvens som svarar för packning av enkelsträngad DNA i fagens M13 proteiner. Fasmiden SKZA har en längd av ca 4,5 kb.

Igenkänningssekvensen för restriktionsenzymet Sal I avlägs- nas därefter från fasmiden SKZA. Härvid hydrolyseras fasmiden 465 577 22 SKZA medelst restriktionsenzymet Sal I, varvid reaktionen avbry- tes genom värmning vid en temperatur av 65°C under en tid av 15 minuter. DNA-fragmentets enkeltrådiga ändar omvandlas därefter till dubbeltrådiga ändar medelst ett Klenow-fragment av DNA-poly- meras I från E.coli i närvaro av alla fyra deoxinukleosidtrifos- faterna. Därefter utspädes DNA-lösningen trefaldigt och lígeras.

Den ligerade DNA införes i celler av E.coli, stam j.M.109. De resulterande bakteriecellerna ympas i Petri-skålar på 2-procentig agarlösning innehållande 25 pg ampicillin per ml, O,1% IPTG och O,1% X-gal. DNA isoleras från tio vitfärgade kolonier på känt sätt och analyseras medelst restriktionsenzymerna Eco RI, Bam I och Sal I. Den fasmid som innehåller igenkänningssekvenser för restriktionsenzymerna Eco RI och Bam I men saknar igenkännings- sekvens för restriktionsenzymet Sal I har fått namnet SK2¿LS.

Denna fasmid användes i efterföljande steg, vid vilket fasmidens igenkänningssekvens för restriktionsenzymet Eco RI avlägsnas.

Härvid hydrolyseras fasmiden SK2=QS medelst restriktionsenzymet Eco RI, varvid reaktionen avbrytes genom värmning vid en tempera- tur av 65°C under en tid av 15 minuter. De enkeltrådiga DNA- -ändarna omvandlas därefter till dubbeltrådiga ändar genom be- handling med ett Klenow-fragment av DNA-polymeras I från E.coli i närvaro av alla fyra deoxinukleosidtrifosfaterna. DNA-lösningen utspädes trefaldigt, varefter DNA-molekylerna lígeras. Den lige- rade DNA spjälkas medelst restriktionsenzymet Eco RI och införes i celler av E.coli, stam j.M.109. De resulterande cellerna ympas på en L-agarlösning innehållande 25 pg ampicillin per ml. DNA isoleras på känt sätt från tio cellkolonier och analyseras medelst restriktionsenzymerna Eco RI, Bam I och Sal I. Den fas- mid som innehåller igenkänningssekvens för restriktionsenzymet Bam I men saknar igenkänningssekvenser för restriktionsenzymerna Eco RI och Sal I har fått namnet SK2¿\SR. Denna fasmid användes för framställning av rekombinantfasmiden (hybridfasmiden) gSR.

Faq /lgtll hydrolyseras medelst restriktionsenzymet Bam I, varefter enzymet inaktiveras genom uppvärmning. De enkeltrådiga DNA-ändarna avlägsnas därefter genom inkubering av DNA-lösningen vid en temperatur av 42°C under en tid av 1 timme. Det kvarvaran- de Bam I-fragmentet med en längd av ca 6,5 kb renas genom gel- 465 577 23 elektrofores i 0,7-procentig lättsmält agaros (preparat A). Fas- miden SK2¿}SR hydrolyseras medelst restriktionsenzymet Bam I.

Sedan enzymet inaktiverats genom uppvärmning ligeras DNA-fragmen- tet med preparatet A. Den ligerade DNA införes i celler av E.coli, stam j.M.l09. De transformerade cellerna ympas på ett näringsmedium innehållande L-agar och 25 pg ampicillin per ml.

Från de tillväxta cellkolonierna uttages avtryck på nitrocellu- losafilter. Cellerna hybridiseras med preparatet A, vars DNA märkes medelst 32P genom s k nick-translation. Celler från de fem cellkolonier som hybridiseras med preparatet A får tillväxa i 10 ml L-medium innehållande 100 pg ampicillin per ml, varefter plasmid-DNA isoleras på i och för sig känt sätt. Restriktions- analys av isolerad DNA med hjälp av restriktionsenzymerna Eco RI, Bam I och Sal I bekräftar kloning av /igtll-sekvensen i fasmiden SK2¿§SR. Den erhållna fasmiden, som fått namnet gSR, användes därefter för framställning av fagvektorn ;ÄgES7 (se fig 3). 0,5 pg fasmid gSR hydrolyseras medelst restriktionsenzymet Bgl II, varpå enzymet inaktiveras genom upphettning. 3 pg av fag ,ÄEMBL3 hydrolyseras medelst restriktionsenzymet Bam I, varpå enzymet inaktiveras. De båda DNA-preparaten blandas i ekvimolära mängder och ligeras. Den ligerade DNA packas in vitro i proteiner av fag ;i. En hundradel av de erhållna fagpartiklarna ympas på en cellmatta av E.coli, stam LE392, innehållande O,l% X-gal. Fag- -DNA isoleras från tio blåfärgade skivor. Isolerad DNA analyseras medelst restriktionsenzymerna Eco RI, Bam I och Sal I. En av fa- gerna, som har givits namnet /zgES7, har den förväntade struktu- ren (se fig 3), och denna fag användes i efterföljande steg. 0,5 ng av plasmiden pUC4K hydrolyseras medelst restriktions- enzymet Hind III, och reaktionen avbrytes genom värmning vid en temperatur av 65°C under en tid av 15 minuter. 4 ng av fag /I spjälkas medelst restriktionsenzymet Hind III, och ett DNA-frag- ment med en längd av ca 2 kb renas genom gelelektrofores i 0,7- -procentig lättsmält agaros (Sigma). Det renade DNA-fragmentet och den med restriktionsenzymet Hind III hydrolyserade plasmiden pUC4K blandas i ekvimolära mängder och ligeras. Den ligerade DNA användes för transformering av celler av E.coli, stam j.M.lO9.

De transformerade cellerna ympas på ett näringsmedium innehållan- 465 577 24 de L-agar och ca 25 ug ampicillin per ml. Från de tillväxta kolo- nierna tages ett avtryck på nitrocellulosafilter, och cellerna hybridiseras med 32?-märkt DNA av fag ;L. Celler från de sex hybridiserande kolonierna får tillväxa i 10 ml L-medium innehåll- ande ampicillin. Ca 10 pg DNA isoleras från de tillväxta cellerna genom lysis medelst alkali. 0,5 pg DNA spjälkas medelst restrik- tionsenzymerna Eco RI, Bam I, Sal I och Hind III samt analyseras genom elektrofores i 1-procentig agarosgel. En av plasmiderna, som har fått namnet p4KL-1, har det förväntade restriktionsmönst- ret. Denna plasmid användes i efterföljande steg. 0,5 pg av plasmiden p4KL-1 hydrolyseras medelst restrik- tionsenzymerna Eco RI och Sal I, och reaktionen avbrytes genom värmning vid 65°C under 15 minuter. 2 pg av fag Å.gES7 spjälkas medelst restriktionsenzymet Sal I, varpå enzymet inaktiveras vid en temperatur av 65°C. De båda preparaten blandas i ekvimolära mängder och ligeras. Den ligerade DNA packas in vitro, och 1/500 av de erhållna fagpartiklarna ympas på en cellmatta av E.coli, stam LE392.

Från cellkolonierna i Petri-skålen tages ett avtryck på ett filter av nitrocellulosa. Cellkolonierna hybridiseras med ett Sal I-fragment av plasmiden pUC4K, som har märkts med 32P och in- nehåller en gen som ger kanamycinresistens. Fager från sex hybri- diserande skivor får tillväxa i 10 ml medium innehållande celler av E.coli, stam LE392, varefter DNA isoleras. Den isolerade DNA analyseras medelst restriktionsenzymerna Eco RI, Bam I och Sal I.

Alla fagerna innehåller en inaktiverad gen för kanamycinresi- stens. En av fagerna, nämligen Ä-gSK5, användes för framställning av fagen Ã.SK15. 10 pg av fagen Å-EMBL3 hydrolyseras medelst restriktions- enzymet Bam I, och ett insatsfragment med en längd av ca 13,7 kb renas genom gelelektrofores i 0,7-procentig lättsmält agaros. 2 pg av fagen /\gSK5 hydrolyseras medelst restriktionsenzymet Bam I, varpå enzymet inaktiveras genom värmning vid en temperatur av 65°C under en tid av 15 minuter. De båda DNA-preparaten blan- das i ekvimolära mängder och ligeras. Den ligerade DNA packas in vitro i proteiner av fag Å-, och en hundradel av de erhållna fag- partiklarna ympas på en cellmatta av E.coli, stam LE392. De till- 465 577 25 växta kolonierna omympas på en matta av celler av E.coli, stam Q359, som är lysogena med avseende på fagen P2. Insatsfragmentet från fagen ;lEMBL3 säkerställer spi+-fenotyp, vilket innebär att kolonierna icke kan förökas på de med avseende på fagen P2 lyso- gena cellerna av E.coli. Fag-DNA isoleras därför från de sex på stammen Q359 icke tillväxta kolonierna. Den isolerade DNA ana- lyseras medelst restriktionsenzymerna Eco RI, Bam I och Sal I.

En av fagerna har den förväntade strukturen, och denna fag har fått namnet Ã.SK15.

Exempel 2 I detta exempel beskrives kloning av human-DNA i fagen ASKl5. 3 pg-human-DNA spjälkas medelst restriktionsenzymet Bam I under standardiserade betingelser. Enzymet inaktiveras därefter genom värmning vid en temperatur av 65°C under en tid av 15 minu- ter. 3 ug av fagen f2SK15 hydrolyseras medelst restriktions- enzymerna Bam I och Eco RI. Det hydrolyserade DNA-preparatet re- nas från oligonukleotidlänkar genom utfällning medelst poly- etylenglykol 6000.

De båda DNA-preparaten blandas i ett viktförhållande mellan DNA från fagvektorn och human-DNA av 2:1. Ligering genomföres vid en total DNA-koncentration av 250 ug/ml. l0'2 pg ligerad DNA packas in vitro i proteiner av fag /1. 1/500 av den totala mängden fagpartiklar ympas på en cellmatta av E.coli, stam LE392. Vid omympning av 50 skivor på en cellmatta av bakteriestammen Q359 tillväxer alla skivor utom en, vilket in- nebär att andelen rekombinantfager (hybridfager) är minst 95%.

Fager från sex slumpvis valda skivor på cellmattan av stammen LE392 av E.coli får tillväxa i 10 ml L-medium tillsammans med stammen LE392. DNA isoleras därefter från de tillväxta fagerna.

Elektroforetisk analys av isolerad DNA har visat att alla de tillväxta fagerna är rekombinanter innehållande en DNA-insats med en längd av 4-7 kb. 0,5 pg DNA från en av fagerna, nämligen fag nr 1, hydrolyseras med en enhet av restriktionsenzymet Sal I under en tid av 30 minuter. Enzymet inaktiveras sedan genom tre- 465 577 26 faldig frysning och upptining. DNA-lösningen utspädes och ligeras vid rumstemperatur under en tid av 1 timme. 0,1 pg ligerad DNA sättes till s k kompetenta celler av E.coli, stam j.M.109. Reak- tionsblandningen inkuberas först vid en temperatur av O°C under en tid av 10 minuter och därefter vid en temperatur av 38°C under en tid av 3 minuter. Efter tillsättning av 1 ml L-medium fortsät- tes inkuberingen under ytterligare 45 minuter vid en temperatur av 37°C. 0,2 ml av lösningen med celler ympas därefter på ett näringsmedium innehållande L-agar och 25 pg ampicillin per ml.

Celler från tre cellkolonier får tillväxa i 10 ml L-medium inne- hållande 50 pg ampicillin per ml. DNA isoleras från de tillväxta cellerna genom lysis medelst alkali. Elektroforetisk analys av DNA har visat, att plasmiderna innehåller samma DNA-insats som den ursprungliga fagen nr 1.

Fagvektorn Ä[SK15 enligt föreliggande uppfinning kan använ- das för framställning av bibliotek av cDNA-gener samt för kloning av gener av praktiskt intresse från dessa bibliotek.

Claims (1)

1. 27' P a t e n t k r a v Fagvektor, särskilt substitutionsvektorl.SK15 för framställning av bibliotek av cDNA-strukturgener, k ä n n e t e c k n a d a v att den har en längd av 51,2 kb och består av följande fragment: (a) (b) (C) (d) (G) (f) (9) (h) ett cos-Sal I-fragment av vänstra armen av fagïk EMBL3 med en längd av 20,3 kb; ett Sal I-Hind III-fragment av en gen som ger kanamycin- resistens, med en längd av ca 0,5 kb; ett Hind III - Hind III-fragment av fagïi med en längd av 2 kb; ett Hind III - Sal I-fragment av en gen som ger kanamycin- resistens, med en längd av ca 1 kb; ett Sal I-Bgl II-fragment av fasmiden SKZA med en längd av 3,8 kb, vari Eco RI-igenkänningsstället har förstörts; fasmiden SKZA har framställts utgående från vektorn SK18, som är framställd av DNA-fragment av fag Ä. , fag M13 och kosmid pHC79; ett Bam I-Bam I-fragment av fag Ä EMBL3 med en längd av 13,7 kb; ett Bam I-Bgl II-fragment av fasmiden SK2A med en längd av 0,7 kb, vari Sal I-igenkänningsstället har förstörts; ett Sal I-cos-fragment av högra armen av fag?\ EMBL3 med en längd av 9,2 kb; att den innehåller ställen för eventuell insättning* av främmande DNA i igenkänningssekvenser för restriktionsenzymerna Bam I och Eco RI; att den har en vektorkapacitet av 0,2 - 15,4 kb; och att dess värdspektrum utgöres av följande stammar av Escherichia coli: 465 577 za Lzssz à F' hsa R 514 (rå, nä), sup E44, sup F ss, lac 21 oz (lac I ZY)6, gal K2, gal T22, met Bl, trp R55; j.M.1o9 = recó. 1,A lac pro, end A1, gyr A96, tni-l, hsa 1217, sup E44, rel A1, FI, :ra nas, pro Ant lac lqzarns; Q359 = hsd Rk-, hsd Hk+, sup F, ø 80, P2; (vektorn deponerades den 21 juli 1989 hos USSR Research Insti- tute for Genetics and Industrial Microorganism Breeding, där den har fått numret PH 688).