DE69434072T2

DE69434072T2 - Regulierende nukleinsaeuresequenzen und verwendungen

Info

Publication number: DE69434072T2
Application number: DE69434072T
Authority: DE
Inventors: Annick Friedmann; Michel Guerineau; Juliette Hagege; Jean-Luc Pernodet; Guennady Sezonov
Original assignee: Aventis Pharma SA
Current assignee: Aventis Pharma SA
Priority date: 1993-12-08
Filing date: 1994-12-05
Publication date: 2005-11-17
Anticipated expiration: 2014-12-06
Also published as: NZ277049A; US5741675A; CA2177600C; WO1995016046A1; EP0788549A1; ATE279521T1; FR2713658A1; DE69434072D1; AU686707B2; DK0788549T3; AU1193595A; ES2229230T3; PT788549E; JPH09506257A; EP0788549B1; ZA949807B; CA2177600A1; KR100367753B1; FR2713658B1; JP3751019B2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine neue Nukleinsequenz, Vektoren für ihre Expression und ihre Verwendung bei Fermentationsverfahren bei den Actinomyceten.
Die Actinomyceten sind faserförmige und verzweigte gram(+)-Bakterien. Unter den Actinomyceten stellen die Streptomyceten die wichtigste Familie dar. Die Streptomyceten sind faserförmige, Sporen bildende Bakterien, die natürlich im Boden unter streng aerobiotischen Bedingungen leben.
Die Actinomyceten und insbesondere die Streptomyceten weisen eine große Bedeutung in industrieller Hinsicht auf. Insbesondere weisen sie die Besonderheit auf, eine große Vielfalt sekundärer Metaboliten zu erzeugen (Demain, Biology of Actinomycetes 88, Okami (Hrsg.), Tokyo, Japan scientific societies press, 1988, S. 19–25). Diese Metaboliten können sehr unterschiedliche Strukturen und biologische Eigenschaften haben (herbizide, krebshemmende, wurmhemmende, anabolische, antibiotische usw.). Die bekanntesten dieser Metaboliten sind die Antibiotika (von einem Organismus erzeugte chemische Substanzen mit einer schädlichen Wirkung auf andere Organismen). Die Streptomyces sind derzeit die Quelle von 70 % der industriell hergestellten Antibiotika. Die strukturelle Vielfalt der synthetisierten Antibiotika findet man bei keiner anderen Bakteriengattung wieder. So sind fast alle Strukturtypen vertreten: die β-Laktamine (Bsp. Ampicillin), die Polypeptidantibiotika (Bsp. Streptogramine), die Aminoglycosidantibiotika (Bsp. Streptomycin, Kanamycin usw.), die Makrolide (Bsp. Erythromycin, Spiramycin usw.) oder auch die Cycline (Bsp. Tetracyclin) usw.
Aus diesen Gründen ist es besonders interessant, über Werkzeuge (Vektoren, Promotoren usw.) verfügen zu können, die es ermöglichen, diese Mikroorganismen genetisch zu manipulieren. Solche Werkzeuge würden es nämlich ermöglichen, die Syntheseniveaus dieser Metaboliten zu verändern oder Synthesezwischenprodukte oder Derivate dieser Metaboliten herzustellen usw. Solche Werkzeuge würden es auch ermöglichen, durch diese Mikroorganismen rekombinante Produkte, insbesondere heterologe Proteine, nach den gentechnischen Verfahren herstellen zu lassen.
Diesbezüglich beschreibt die Patentanmeldung Nr. EP 350 341 vom Plasmid pSAM2 abgeleitete Vektoren mit sehr interessanten Eigenschaften. So können sich diese Vektoren ortsspezifisch in das Genom der Actinomyceten integrieren, besitzen ein breites Wirtsspektrum und eine hohe Stabilität. Im Übrigen können sie für den Transfer und die Expression von Nukleinsäuren in den Actinomyceten verwendet werden. Jedoch weisen diese Vektoren bestimmte Nachteile auf, die insbesondere in ihrer geringen Kopienzahl pro Zelle und das Fehlen von Mitteln zur Kontrolle der Kopienzahl liegen. So integrieren sich pSAM2 und seine Derivate im Allgemeinen in einem Verhältnis von einer einzigen Kopie pro Chromosom.
Die vorliegende Erfindung erbringt eine Lösung für dieses Problem, indem sie Werkzeuge liefert, die die Bedingungen einer industriellen Verwendung von Vektoren, die von pSAM2 abgeleitet sind, verbessern können. Die vorliegende Erfindung beschreibt nämlich ein Gen, dessen Expressionsprodukt zum Auftreten von replikativen freien Formen des Plasmids pSAM2 oder von Vektoren, die von diesem abgeleitet sind, aus integrierten Formen führt. Dies hat zur Wirkung, die Kopienzahl von pSAM2 oder seinen Derivaten zu erhöhen, weil die freien Formen mit einer hohen Kopienzahl pro Zelle vorliegen.
Die vorliegende Erfindung beschreibt auch Expressionskassetten dieses Gens, Vektoren, die es enthalten, und ihre Verwendung, um das Auftreten von freien Kopien von pSAM2 oder von integrativen Vektoren, die von diesem abgeleitet sind, zu induzieren.
Die Anmelderin hat nämlich eine Region des Plasmids pSAM2 isoliert, sequenziert und charakterisiert, die das Auftreten von replikativen freien Kopien von pSAM2 oder seinen Derivaten induzieren kann. Die Anmelderin hat auch gezeigt, dass diese Region cis (auf dem gleichen Vektor) oder trans (nicht auf dem gleichen Vektor) verwendet werden konnte, um auf pSAM2 oder seine Derivate zu wirken. Die Sequenz dieser Region ist auf der Sequenz SEQ ID NO:1 gezeigt. Genauer wurden diese Region und ihre funktionelle Rolle durch die Untersuchung von Varianten des Plasmids pSAM2 aufgezeigt: einerseits pSAM2(B2), das aus S. ambofaciens ATCC 15154 stammt, für das keinerlei freie Form beobachtet wird, andererseits pSAM2(B3) und pSAM2(B4), die aus anderen S. ambofaciens stammen, für die die freie Form mit der integrierten Form beobachtet wird. Diese Untersuchung hat es ermöglicht, zwei verschiedene punktuelle Mutationen (diejenige von pSAM2(B3) und diejenige von pSAM2(B4)) zu charakterisieren, die beide in der Promotorregion lokalisiert sind, die die Expression eines Gens von pSAM2 kontrolliert (vgl. SEQ ID NO:1). Diese Mutationen führen zum Auftreten der freien Form von pSAM2(B3) und pSAM2(B4). Dieses Gen wurde anschließend geklont und sequenziert und seine Fähigkeit, das Auftreten der freien Form von Plasmiden, die von pSAM2 abgeleitet sind, aus der integrierten Kopie zu bewirken, wurde bewiesen.
Ein erster Gegenstand der Erfindung liegt folglich in einer Nukleinsäuresequenz, die die ganze oder einen Teil der Sequenz SEQ ID NO:1 oder einer Variante von dieser, die sich aus der Degenereszenz des genetische Codes ergibt, umfasst und die Fähigkeit hat, replikative freie Formen des Plasmids pSAM2 in den Actinomyceten zu induzieren.
Im Sinne der vorliegenden Erfindung bezeichnet der Begriff Variante jede Sequenz, die sich von der Sequenz SEQ ID NO:1 hinsichtlich der Degenereszenz des genetischen Codes unterscheidet, sowie jede Sequenz, die mit diesen Sequenzen oder Fragmenten von diesen hybridisiert und deren Produkt die angegebene Aktivität besitzt. Diese Varianten können durch jedes dem Fachmann bekannte Verfahren, insbesondere Mutation, Deletion, Substitution, Addition, Hybridisierung usw., aus SEQ ID NO:1 erhalten werden. Die Hybridisierungen können unter herkömmlichen Stringenzbedingungen (Maniatis et al., vgl. allgemeine Verfahren der Molekularbiologie) oder vorzugsweise unter hohen Stringenzbedingungen durchgeführt werden. Die Fähigkeit der Varianten, das Auftreten von replikativen freien Formen von pSAM2 oder seinen Derivaten zu induzieren, kann an einem Actinomycetenstamm, der ein solches integriertes Plasmid enthält (beispielsweise an dem Stamm ATCC 15154) bewiesen werden, indem man besagte Variante in den Stamm unter Bedingungen transfektiert, die ihre Expression ermöglichen, und indem man das Auftreten von freien Formen nachweist (vgl. Beispiele).
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft jede Expressionskassette der Sequenz SEQ ID NO:1 oder einer Variante von dieser, wie zuvor definiert, die besagte Sequenz oder Variante unter Kontrolle eines konstitutiven oder regulierten Promotors umfasst.
Die Verwendung eines konstitutiven Promotors ist besonders vorteilhaft, wenn die Kassette trans verwendet wird, um freie Formen eines integrierten Plasmids zu induzieren. In diesem Fall werden die Zellen, die die integrierte Form des Plasmids enthalten, mit der Expressionskassette transfektiert, um das Auftreten von replikativen freien Formen zu induzieren, was es beispielsweise ermöglicht, das Plasmid zu isolieren und/oder zu reinigen.
Die Verwendung eines regulierten Promotors ist besonders vorteilhaft, wenn die Kassette cis (auf dem von pSAM2 abgeleiteten Vektor selbst) verwendet wird, beispielsweise bei einem industriellen Fermentationsverfahren. In diesem Fall wird die ganze Phase der Proliferation und des Wachstums der Zellen ohne Expression des Gens der Erfindung ausgeführt, das heißt mit einer einzigen Kopie des Plasmids pro Chromosom, und für die Phase der Produktion (eines rekombinanten Produkts, eines Gens zur Biosynthese oder zur Regulierung der Synthese eines Metaboliten usw.) wird der regulierte Promotor eingeführt, was das Auftreten von mehreren freien Kopien des Plasmids und so eine gesteigerte Produktionsaktivität mit sich bringt. Diese Durchführungsform ist besonders vorteilhaft, wenn der von pSAM2 abgeleitete Vektor heterologe Sequenzen trägt, deren Gegenwart in mehreren Kopienzahlen für die Zellen toxisch sein und/oder ihr Wachstum beeinträchtigen kann.
Unter den im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendbaren konstitutiven Promotoren kann man spezieller jeden bei den Actinomyceten funktionellen konstitutionellen Promotor anführen, wie beispielsweise der Promotor des Gens ermE oder eine Variante von diesem (Bibb et al., Gene 41 (1986) E357), der Promotor p14 der Phage 119 von S. ghanaensis (Labes et al., Sixth DFGWT/AFAST, 27–30/11/92) oder jedes Fragment, das eine Promotorregion eines ribosomalen Operons von S. ambofaciens enthält (Pernodet et al., Gene 79 (1989) 33).
Unter den im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendbaren regulierbaren Promotoren kann man spezieller jeden bei den Actinomyceten funktionellen regulierbaren Promotor anführen. Es kann sich um Promotoren handeln, die spezifisch durch ein Mittel, das in das Kulturmedium eingeführt wird, induziert werden, wie beispiels weise der Promotor tipA, der durch Thiostrepton induzierbar ist, (Murakami et al., J. Bactt. 171 (1989) 1459) oder thermoinduzierbare Promotoren, wie beispielsweise derjenige der Gene groEL (Mazodier et al., J. Bact. 173 (1991) 7382). Es kann sich auch um einen Actinomycetenpromotor handeln, der in den späten Phasen des Proliferationszyklus der Actinomyceten spezifisch aktiv ist, wie beispielsweise bestimmte Promotoren von Genen des sekundären Metabolismus (insbesondere Gene zur Produktion von Antibiotika).
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft die Verwendung der Sequenzen der Erfindung, wie zuvor definiert, oder der sie enthaltenden Kassetten zur Induktion des Auftretens von freien Kopien von Vektoren, die von pSAM2 abgeleitet sind, die in einen Actinomyceten integriert sind.
Wie oben angegeben kann diese Verwendung cis (wobei das Gen oder die Kassette von dem von pSAM2 abgeleiteten integrativen Vektor getragen werden) oder trans (wobei sich das Gen oder die Kassette auf einem anderen Vektor befinden oder sogar so, wie sie sind, direkt eingeführt werden) ausgeführt werden.
Die von pSAM2 abgeleiteten integrativen Vektoren, wie oben erwähnt, sind Vektoren, die wenigstens die zur Integration, Exzision und Replikation notwendigen Elemente von pSAM2 umfassen. Spezieller umfassen diese Vektoren folglich wenigstens die Regionen attP und int, wie in der Anmeldung EP 350 341 beschrieben, das Gen Xis, das Gen repSA und den Replikationsursprung (ori). Diese verschiedenen Regionen sind dargestellt auf der Karte des Plasmids pSAM2, die in 1 angegeben ist, die auch bestimmte Restriktionsstellen, die es ermöglichen, diese Regionen zu extrahieren, erwähnt.
Vorteilhafterweise umfassen die von pSAM2 abgeleiteten integrativen Vektoren auch eine Sequenz rekombinanter DNA, die für ein gesuchtes Produkt kodiert. Es kann sich um ein Peptid, Polypeptid oder Protein handeln, das eine Bedeutung für die Pharmazie oder das Agrofood-Gewerbe aufweist. In diesem Fall ermöglicht es das System der Erfindung, die Kopienzahl dieser Sequenz pro Zelle zu erhöhen und folglich die Produktionsniveaus dieses Produkts zu erhöhen und so die Ausbeuten des Herstellungsverfahrens zu erhöhen. Das gesuchte Produkt kann auch ein Peptid, Polypeptid oder Protein sein, das in die Biosynthese (Synthese, Abbau, Transport oder Regulierung) eines Metaboliten durch den betreffenden Actinomycetenstamm eingreift. In diesem Fall ermöglicht es das System der Erfindung, die Kopienzahl dieser Sequenz pro Zelle zu erhöhen und folglich die Produktionsniveaus dieses Produkts zu erhöhen und so entweder die Produktionsniveaus des Metaboliten zu erhöhen oder die Biosynthese des Metaboliten zu blockieren oder Derivate des Metaboliten zu erzeugen.
Die Sequenzen der Erfindung können so in jedem Actinomyceten verwendet werden, in dessen Genom sich die Vektoren pSAM2 oder seine Derivate integrieren können. Insbesondere können sie bei Verfahren zur Fermentation, die Stämme von Streptomyces, Mykobakterien usw. beinhalten, verwendet werden. Als Beispiel kann man die Stämme von S. pristinaespiralis (ATCC 25486), S. antibioticus (DSM 40868), S. bikiniensis (ATCC 11062), S. parvulus (ATCC 12434), S. glaucescens (ETH 22794), S. actuosus (ATCC25421), S. coelicolor (A3(2)), S. ambofaciens, S. lividans, S. griseofuscus, S. limosus usw. anführen (siehe auch Smokvina et al., Applications of the integrated plasmid pSAM2, GIM90, Proceedings, Vol. 1, S. 403-407).
Von pSAM2 abgeleitete Vektoren, die die oben beschriebenen Elemente umfassen, können vom Fachmann auf der Basis seiner allgemeinen Kenntnisse und der Lehren der vorliegenden Anmeldung konstruiert werden (vgl. auch die allgemeinen Verfahren der Molekularbiologie).
Die Sequenzen der Erfindung sind ganz besonders für eine Verwendung bei einem industriellen Verfahren zu Herstellung von Antibiotika (Spiramycin, Streptogramine, β-Lactame usw., deren Gene insbesondere in den Anmeldungen EP 346 000 und PCT/FR93/00923 beschrieben sind) geeignet.
Die vorliegende Erfindung wird mittels der folgenden Beispiele, die als erläuternd und nicht beschränkend anzusehen sind, vollständiger beschrieben.
Legende der Figuren:
1: Restriktionskarte des Plasmids pSAM2
2: Restriktionskarte des Vektors pOS531
3: Restriktionskarte des Vektors pOS532
4: Restriktionskarte des Vektors pOS541
5: Restriktionskarte des Vektors pOS544
6: Restriktionskarte des Vektors pOS666. Dieser Vektor wird konstruiert aus dem Plasmid pPM927 (Smokvina et al. gene 94 (1990) 53) durch Insertion des Gens rmf (das auch mit pra bezeichnet wird) und dem Replikationsursprung von pSAM2; tsr: Gen der Resistenz gegen Thiostrepton; stm/spc: Gen der Resistenz gegen Streptomycin/Spectinomycin; oriR: Replikationsursprung E. coli; oripSAM2: Replikationsursprung von pSAM2; ter: Transkiptionsterminator.
7: Aktivität der Vektoren.
Allgemeine Verfahren der Molekularbiologie
Die herkömmlicherweise in der Molekularbiologie verwendeten Verfahren, wie die präparativen Extraktionen von Plamid-DNA, das Zentrifugieren von Plasmid-DNA in einem Cäsiumchloridgradienten, die Elektrophorese auf Agarose- oder Acrylamidgelen, die Reinigung von DNA-Fragmenten durch Elektroelution, die Extraktionen von Proteinen mit Phenol oder Phenol-Chloroform, das Ausfällen von DNA in salzhaltigem Medium durch Ethanol oder Isopropanol, die Transformation in Escherichia coli usw...., sind dem Fachmann gut bekannt und sind in der Literatur ausgiebig beschrieben [Maniatis T. et al., "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982; Ausubel F.M. et al. (Hrsg.), "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, New York, 1987].
Die Plasmide vom Typ pBR322, pUC und die Phagen der Serie M13 sind kommerziellen Ursprungs (Bethesda Research Laboratories).
Für die Ligaturen können die DNA-Fragmente nach ihrer Größe durch Elektrophorese in Agarose- oder Acrylamidgelen getrennt, mit Phenol oder mit einem Gemisch Phenol/Chloroform extrahiert, mit Ethanol ausgefällt, dann in Gegenwart von DNA-Ligase des Phagen T4 (Biolabs) gemäß den Empfehlungen der Lieferfirma inkubiert werden.
Das Auffüllen der überhängenden 5'-Enden kann durch das Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I von E. coli (Biolabs) gemäß den Spezifikationen der Lieferfirma ausgeführt werden. Der Abbau der überhängenden 3'-Enden wird in Gegenwart von DNA-Polymerase des Phagen T4 (Biolabs), die gemäß den Empfehlungen des Herstellers verwendet wird, ausgeführt. Der Abbau der überhängenden 5'-Enden wird durch eine schonende Behandlung durch die S1-Nuklease durchgeführt.
Die gerichtete Mutagenese in vitro durch synthetische Oligodeoxynukleotide kann gemäß dem von Taylor et al. [Nucleic Acids Res. 13 (1985) 8749–8764] entwickelten Verfahren unter Verwendung des von Amersham vertriebenen Kits ausgeführt werden.
Die enzymatische Amplifikation von DNA-Fragmenten durch die Technik, die PCR [Polymerase-catalyzed Chain Reaction, Saiki R.K. et al., Science 230 (1985) 1350–1354; Multis K.B. und Faloona F.A., Meth. Enzym. 155 (1987) 335–350] genannt wird, kann ausgeführt werden, indem man einen "DNA thermal cycler" (Perkin Elmer Cetus) gemäß den Spezifikationen des Herstellers verwendet.
Der Nachweis der Nukleotidsequenzen kann durch das Verfahren, das von Sangen et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 5463–5467] entwickelt wurde, unter Verwendung des von Amersham vertriebenen Kits ausgeführt werden.
Beispiele
Beispiel 1: Klonen und Sequenzieren der Sequenz SEQ ID NO:1
Die freie Form von pSAM2 (B2) wird in S. lividans TK24 nicht beobachtet (Hopwood et al., J. Gen. Microbiol. 129 (1983) 2257), nur die integrierte Form wird beobachtet. Mit pSAM2 (B3) koexistiert die freie Form des Plamids mit der integrierten Form. Aus pSAM2 (B3) wurden Hybridplasmide konstruiert, in denen verschiedene Regionen durch die gleichwertigen Regionen, die aus pSAM2 (B2) stammen, ersetzt wurden. Dies hat es ermöglicht zu zeigen, dass die Mutation, die es pSAM2 (B3) ermöglicht, in freier Form zu existieren, in einem Restriktionsfragment KpnI mit 2 kb lokalisiert ist. Die Sequenz dieses Fragments KpnI wurde für pSAM2 (B2) und pSAM2 (63) bestimmt. Ein einziges Nukleotid ist zwischen diesen beiden Sequenzen unterschiedlich: ein G/C-Paar in pSAM2 (B2) ist durch ein A/T-Paar in pSAM2 (B3) ersetzt. Die Analyse der Sequenz hat gezeigt, dass sich diese Mutation vor einem offenen Leseraster befindet, das sich weiter als die Stelle KpnI erstreckt. Die Sequenz dieses offenen Leserasters wurde bestimmt, sie ist auf der Sequenz SEQ ID NO:1 gezeigt. Dieses offene Leseraster, bezeichnet mit rmf (oder pra), liegt zwischen den Genen korSA und traSA. Die Mutation lässt eine Erkennungsstelle für das Restriktionsenzym ApaLI (Erkennungsstelle: 5'GTGCAC 3') verschwinden. Diese Stelle ist bei pSAM2 (B2) vorhanden, fehlt aber bei pSAM2 (B3).
Die Sequenz SEQ ID NO:1 umfasst auch 100 bp vor der kodierenden Region, umfassend einen Teil des Promotors (Reste 1 bis 101) und die nicht kodierende, aber transkribierte Region 5' (Reste 102 bis 154), die insbesondere die Ribosomen-Bindungsstelle (RBS) trägt.
In der Mutante pSAM2 (B4), für die die freie Form beobachtet werden kann, ist die Stelle ApaLI noch vorhanden, was anzeigt, dass die Mutation nicht an der gleichen Stelle lokalisiert ist wie in pSAM2 (B3). Die Sequenz von pSAM2 (B4) für die entsprechende Region hat gezeigt, dass die Sequenzen von pSAM2 (B2) und pSAM2 (B4) sich durch ein Nukleotid unterscheiden. Diese Mutation war 8 Nukleotide vor der in pSAM2 (B3) detektierten Mutation lokalisiert. So ist in zwei voneinander unabhängigen Fällen die freie Form von pSAM2 (B3) und pSAM2 (B4), die mit der integrierten Form koexistiert, auf Grund einer punktuellen Mutation vor einem Gen von pSAM2 vorhanden. Diese beiden voneinander unabhängigen Mutationen befinden sich beide in einer Region, bei der die Versuche zur Analyse der messenger-RNA gezeigt haben, dass sie den Promotor dieses Gens darstellt.
Beispiel 2: Konstruktion von Kassetten und Vektoren zur Expression der Sequenz SEQ ID NO:1
Mehrere Konstruktionen wurden unter Verwendung der folgenden Promotoren und Plasmide hergestellt:

– modifizierter Promotor ermE (ermE*). Der verwendete modifizierte Promotor ermE entspricht dem von Bibb et al, zuvor angeführt, beschriebenen Promotor, der eine Deletion von 3 Nukleotiden besitzt (Basen 252–254, 2 von Bibb et al., zuvor angeführt). Dieser modifizierte Promotor ergibt eine starke und konstitutive Expression. Er wurde in Form eines Fragments KpnI-BamHI mit 275 bp isoliert.
– Promotor tipA: dieser Promotor (Murakami et al., zuvor angeführt) ist in dem Plasmid pPM927 (Smokvina et al., Gene 94 (1990) 53) vorhanden. Er wird spezifisch in Gegenwart von Thiostrepton induziert.
– Plasmide pIJ486 und pIJ487. Diese beiden Plasmide wurden von Ward et al. (Mol. Gen. Genet. 203 (1986) 468) beschrieben. Diese Plasmide allein haben keinen Einfluss auf den Status (frei oder integriert) von pSAM2.

2.1. Konstruktion des Vektors pOS531
Der Vektor pOS531 wurde durch Klonen des kodierenden Teils des Gens rmf (Reste 155 bis 505 der Sequenz SEQ ID NO:1) an den Stellen BamHI-HindIII des Plasmids pIJ487 konstruiert. Dieser Vektor trägt folglich das nackte Gen rmf (ohne Expressionssignal und nicht kodierende 5'-Region). Eine Karte dieses Vektors ist in 2 angegeben.
2.2. Konstruktion des Vektors pOS532
Der Vektor pOS532 wurde durch Klonen des Fragments mit 275 bp, das den modifizierten Promotor ermE trägt, an den Stellen EcoRI-BamHI des Vektors pOS531 konstruiert. Dieser Vektor trägt folglich das nackte Gen rmf unter Kontrolle des modifizierten Promotors ermE (3).
2.3. Konstruktion des Vektors pOS541
Der Vektor pOS541 wurde in 2 Stufen konstruiert:

– Klonen eines Fragments, das den kodierenden Teil des Gens rmf und die nicht kodierende 5'-Region umfasst (Reste 102 bis 505 der Sequenz SEQ ID NO:1), an den Stellen BamHI-HindIII des Plasmids pIJ487,
– Addition des Fragments mit 275 bp, das den modifizierten Promotor ermE trägt, an den Stellen EcoRI-BamHI des oben erhaltenen Vektors.

Dieser Vektor trägt folglich das Gen rmf mit seiner nicht kodierenden 5'-Region unter Kontrolle des modifizierten Promotors ermE (4).
2.4. Konstruktion des Vektors pOS544
Der Vektor pOS544 trägt ein in seinem 3'-Teil deletiertes Gen rmf (die Reste 102 bis 276 der Sequenz SEQ ID NO:1 sind vorhanden). Er wurde durch Klonen dieser Region in Form eines Fragments BamHI-BspHI (BspHI-Ende behandelt mit dem Klenowfragment der DNA-Polymerase I von E. coli) an den Stellen BamHI HindIII des Plasmids pIJ487 (HindIII-Ende behandelt mit dem Klenowfragment der DNA-Polymerase I von E. coli) konstruiert. Der Vektor pOS544 trägt folglich den 5'- Teil des Gens rmf (nicht kodierende 5'-Region + kodierende 5'-Region), aber nicht seinen Promotor. Eine Karte dieses Vektors ist in 5 angegeben.
Beispiel 3: Auftreten von replikativen freien Formen von integrativen Vektoren, die von pSAM2 abgeleitet sind, auf Grund des Expressionsprodukts des Gens rmf
Dieses Beispiel zeigt, dass die Überexpression des Gens SEQ ID NO:1 das Auftreten einer integrierten Kopie von pSAM2 in freier Form hervorrufen kann.

3.1. Ein direkter Nachweis der die Replikation aktivierenden Rolle, die rmf spielt, kann erhalten werden, indem man durch Expression von rmf das Auftreten einer integrierten Kopie von pSAM2 (B2) in freier Form hervorruft. Die Tatsache, dass pSAM2 (B2) im Vergleich zu pSAM2 (B3) eine zusätzliche Stelle ApaLI besitzt, ermöglicht es, einfach durch Beobachtung des ApaLI-Digestionsprofils nachzuweisen, dass das freie Plasmid wirklich pSAM2 (B2) ist.
3.2. Die Aktivität der Sequenz SEQ ID NO:1 wurde auch durch Transformation von S. lividans, das eine integrierte Kopie von pSAM2(B2) mit den verschiedenen oben beschriebenen Vektoren trägt, dann Suche von freien Formen gezeigt. Dazu wurde S. lividans, das das Plasmid pSAM2(B2) enthält, durch die Protoplastentechnik durch die verschiedenen, in Beispiel 2 beschriebenen Vektoren transformiert. Die gesamte Plasmid-DNA oder Zell-DNA wird aus einer Kultur in stationärer Phase aus den transformierten Klonen extrahiert. Die Plasmid-DNA wird von dem Enzym ApaLI abgebaut und die Digestionsfragmente durch Elektrophorese in Agarosegel getrennt. Die Beobachtung des Restriktionsprofils ermöglicht es zu erfahren, ob die freien Kopien von pSAM2(B2) vorhanden sind. Diese Ergebnisse werden anschließend durch Hybridisierungsversuche der Gesamt-DNA mit einer pSAM2-Sonde bestätigt.

Die erhaltenen Ergebnisse sind in 7 dargestellt.
Diese Ergebnisse zeigen, dass pOS541, das den modifizierten Promotor ermE, die nicht transkribierte Region vor rmf mit der ribosomalen Bindungsstelle und die kodierende Phase rmf umfasst, das Auftreten von replikativen freien Formen von pSAM2(B2) bewirkt. Wie erwartet wird keinerlei Wirkung mit einem Vektor beobachtet, der nur den kodierenden Teil rmf umfasst (pOS531), oder mit einem Vektor, der modifiziertes ermE und den kodierenden Teil von rmf umfasst, aber keinerlei ribosomale Bindungsregion (pOS532). Mit einem Vektor, der eine Deletion in der 3'-Region von rmf trägt (pOS544) wurde keinerlei Wirkung beobachtet.
Der gleiche Typ von Wirkung wird erzielt, wenn die Kassette, die die induzierbare Expression von rmf ermöglicht, auf dem Plasmid lokalisiert ist, für das man das Auftreten von freien Formen bewirken möchte (Vektor pOS666, 6).
Die Gesamtheit dieser Ergebnisse zeigt gut, dass die Sequenz der Erfindung cis oder trans das Auftreten von freien Formen von Vektoren, die von pSAM2 abgeleitet sind, induzieren kann.

Claims

Nukleinsäuremolekül, dadurch gekennzeichnet, dass es ausgewählt ist unter: a) der durch die SEQ ID NO:1 dargestellten Nukleinsäurefrequenz, b) den Fragmenten dieser Frequenz, kodierend für ein Polypeptid, das aus integrierten Formen das Auftreten von replikativen freien Formen des Plasmids pSAM2 in den Actinomyceten ermöglichen kann, c) den Varianten dieser Sequenz, die aus der Degeneration des genetischen Codes resultieren und für ein Polypeptid kodieren, das aus integrierten Formen das Auftreten von replikativen freien Formen des Plasmids pSAM2 in den Actinomyceten ermöglichen kann.
Expressionskassette, umfassend eine Sequenz gemäß Anspruch 1 unter Kontrolle eines konstitutiven oder regulierten Promotors.
Expressionskassette gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass der konstitutive Promotor ausgewählt ist unter dem Promotor des Gens ermE oder einer Variante von diesem, dem Promotor p14 der Phage 119 von S. ghanaensis oder jedem Fragment, das eine Promotorregion eines ribosomalen Operons von S. ambofaciens enthält.
Expressionskassette gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass der regulierte Promotor ausgewählt ist unter den Promotoren, die spezifisch durch ein Mittel induziert werden, das in das Kulturmedium eingeführt wird, wie beispielsweise der Promotor tipA, der durch Thiostrepton induzierbar ist, oder thermoinduzierbaren Promotoren, wie derjenige der Gene groEL.
Expressionskassette gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass der regulierte Promotor ausgewählt ist unter den Promotoren von Actinomyceten, die in den späten Phasen des Proliferationszyklus der Actinomyceten spezifisch aktiv sind, wie beispielsweise die Promotoren von Genen des sekundären Metabolismus (insbesondere Gene zur Produktion von Antibiotika).
Verwendung einer Sequenz oder Kassette gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche zum Induzieren des Auftretens freier Kopien von Vektoren, die von pSAM2 abgeleitet sind, integriert in einen Actinomycet.
Verwendung gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Sequenz oder die Kassette durch den integrativen Vektor, der von pSAM2 abgeleitet ist, getragen werden.
Verwendung gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Sequenz oder die Kassette von einem anderen Vektor getragen werden oder direkt so, wie sie sind, eingeführt werden.
Verwendung gemäß den Ansprüchen 6 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass der Actinomycet ausgewählt ist unter den Streptomyces und den Mykobakterien.