DE60113448T2

DE60113448T2 - Klonierungsvektoren und expressionsvektoren aus rhodococcus

Info

Publication number: DE60113448T2
Application number: DE60113448T
Authority: DE
Inventors: G. Michael BRAMUCCI; Qiong Cheng; N. Kristy Kostichka; Jean-Francois Tomb
Original assignee: EI Du Pont de Nemours and Co
Current assignee: EIDP Inc
Priority date: 2000-12-12
Filing date: 2001-12-12
Publication date: 2006-06-29
Anticipated expiration: 2021-12-13
Also published as: JP2004517623A; AU2002245099A1; EP1337645A2; EP1337645B1; WO2002055709A3; CA2426597A1; WO2002055709A2; DE60113448D1; KR20030052242A; US20030044807A1; US6949362B2; US7416859B2; US20050170420A1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft das Gebiet der Mikrobiologie. Genauer gesagt werden Vektoren für die Klonierung und Expression von Genen in Rhodococcus-Arten und ähnlichen Organismen bereitgestellt.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Gram-positive Bakterien, die zu der Gattung Rhodococcus gehören, von welchen einige früher als Nocardia, Mycobacterium, Gordona oder Jensenia spp. oder als Mitglieder des „Rhodochrous"-Komplexes klassifiziert wurden, sind in der Umwelt weit verbreitet. Mitglieder der Gattung Rhodococcus zeigen einen weiten Bereich von metabolischen Aktivitäten einschließlich antibiotischer und Aminosäureproduktion, Biosurfactantproduktion sowie biologischer Zersetzung und Biotransformation einer großen Vielfalt von organischen und xenobiotischen Verbindungen (siehe Vogt, Singer und Finnerty, 1988, J. Bacteriol., 170:638–645; Quan und Dabbs, 1993, Plasmid, 29:74–79; Warhurst und Fewson, 1994, Crit. Rev. Biotechnol., 14:29–73). Unglücklicherweise existieren wenige geeignete genetische Werkzeuge, um diese metabolischen Aktivitäten in Rhodococcus und ähnlichen Organismen zu untersuchen und auszunutzen (siehe Finnerty, 1992, Annu. Rev. Microbiol., 46:193–218).
Kürzlich sind verschiedene Rhodococcus-Plasmide und Rhodococcus-Escherichia coli-Shuttle-Vektoren beschrieben worden. Diese Plasmide und Vektoren können in fünf verschiedene Ableitungsgruppen eingeteilt werden: a) Plasmide, abgeleitet von Rhodococcus fascians (Desomer et al., 1988, J. Bacteriol., 170:2401–2405; und Desomer et al., 1990, Appl. Environ. Microbiol., 56:2818–2815); b) Plasmide, abgeleitet von Rhodococcus erythropolis ( JP 10248578 ; EP 757101 ; JP 09028379 ; US-Patentschrift 5705386; Dabbs et al., 1990, Plasmid, 23:242–247; Quan und Dabbs, 1993, Plasmid, 29:74–79; Dabbs et al., 1995, Biotekhnologiya, 7–8:129–135; De Mot et al., 1997, Microbiol., 143:3137–3147); c) Plasmide, abgeleitet von Rhodococcus rhodochrous ( EP 482426 ; US-Patentschrift 5246857; JP 1990-270377; JP 07255484 ; JP 08038184 ; US-Patentschrift 5776771; EP 704530 ; JP 08056669 ; Hashimoto et al., 1992, J. Gen. Microbiol., 138:1003–1010; Bigey et al., 1995, Gene, 154:77–79; Kulakov et al., 1997, Plasmid, 38:61–69); d) Plasmide, abgeleitet von Rhodococcus equi (US-Patentschrift 4920054; Zheng et al., 1997, Plasmid 38:180–187) und e) Plasmide, abgeleitet von einer Rhodococcus sp. (WO 89/07151; US-Patentschrift 4952500; Vogt Singer et al., 1988, J. Bacteriol., 170:638–645; Shao et al., 1995, Lett. Appl. Microbiol., 21:261–266; Duran, 1998, J. Basic Microbiol., 38:101–106; Denis-Larose et al., 1998, Appl. Environ. Microbiol., 64:4363–4367).
Wenn auch diese früheren Studien verschiedene Plasmide und Shuttle-Vektoren beschreiben, bleibt die relative Anzahl von im Handel erhältlichen Werkzeugen, die für die genetische Manipulation von Rhodococcus und ähnlichen Organismen existieren, begrenzt. Eine der Schwierigkeiten beim Entwickeln eines geeigneten Expressionsvektors für Rhodococcus ist die begrenzte Anzahl von Sequenzen, die Replikase oder Replikationsproteine (rep) codieren, welche Plasmidreplikation in diesem Wirt erlauben. Kenntnis derartiger Sequenzen wird benötigt, um einen verwendbaren Expressions- oder Shuttle-Vektor zu gestalten. Obwohl Replikationssequenzen für andere Shuttle-Vektoren bekannt sind, die in Rhodococcus funktionieren (siehe zum Beispiel Denis-Larose et al., 1998, Appl. Environ. Microbiol., 64:4363–4367); Billington et al., J. Bacteriol. 180 (12), 3233–3236 (1998); Dasen, G. H. GI:3212128; und Mendes et al., GI:6523480), sind sie selten.
Ähnlich ist ein anderes Problem in der Gestaltung von Shuttle-Expressions- und Shuttle-Vektoren in Rhodococcus die Plasmidstabilität. Die Stabilität eines Plasmids ist oftmals veränderlich und das Aufrechterhalten der Plasmidstabilität in einem speziellen Wirt erfordert gewöhnlich die antibiotische Selektion, welche weder eine ökonomische noch eine sichere Praxis in der Produktion in industriellem Maßstab ist. Wenig ist über Gene oder Proteine bekannt, die funktionieren, indem Plasmidstabilität ohne antibiotische Selektion vergrößert oder aufrechterhalten wird.
Das Problem, das gelöst werden soll, ist daher, zusätzliches verwendbares Plasmid und Shuttle-Vektoren zur Verwendung bei der genetischen Manipulation von Rhodococcus und ähnlichen Organismen bereitzustellen. Ein derartiger Vektor muß ein robustes Replikationsprotein haben und muß imstande sein, stabil in dem Wirt gehalten zu werden.
Die Anmelder haben das festgestellte Problem durch Isolieren und Charakterisieren eines neuen kryptischen Plasmids, pAN12, aus dem Rhodococcus-erythropolis-Stamm AN12 und Konstruieren eines neuen Escherichia coli-Rhodococcus-Shuttle-Vektors unter Verwendung von pAN12 gelöst. Die Erfindung der Anmelder stellt wichtige Werkzeuge zur Verwendung bei der genetischen Manipulation von Rhodococcus-Arten (sp.) und ähnlichen Organismen bereit. Die vorliegenden Vektoren enthalten eine Replikationssequenz, die zur Replikation des Plasmids erforderlich ist und verwendet werden kann, um andere geeignete Replikationssequenzen zur Plasmidreplikation zu isolieren oder zu gestalten. Zusätzlich enthalten die vorliegenden Plasmide eine Sequenz mit Homologie zu einem Zellteilungsprotein, welches für Plasmidstabilität erforderlich ist. Die Shuttle-Vektoren der Anmelder sind besonders wünschenswert, weil sie imstande sind, mit anderen Shuttle-Vektoren in der gleichen Rhodococcus-Wirtszelle zu koexistieren. Daher können die Vektoren der Anmelder auch in Kombination mit anderen kompatiblen Plasmiden für die Coexpression in einer einzigen Wirtszelle verwendet werden.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt neue Nucleinsäuren und diese Nucleinsäuren umfassende Vektoren für die Klonierung und Expression fremder Gene in Rhodococcus sp. bereit. Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung ein neues Plasmid, isoliert aus einem Stamm AN12 des Patentinhabers von Rhodococcus erythropalis, und einen neuen Shuttle-Vektor, hergestellt aus diesem Plasmid, bereit, der in sowohl Escherichia coli als auch Mitgliedern der Rhodococcus-Gattung repliziert werden kann. Diese neuen Vektoren können verwendet werden, um eine Wirtsbakterienzelle zu klonieren und genetisch zu manipulieren, um ein Polypeptid des interessierenden Proteins zu exprimieren. Außerdem haben die Anmelder verschiedene einzigartige Codierungsregionen auf dem Plasmid identifiziert und isoliert, die allgemeine Verwendbarkeit für Plasmidreplikation und -stabilität haben. Die erste von diesen ist eine Nucleinsäure, die ein einzigartiges Replikationsprotein, rep, innerhalb des neuen Plasmids codiert. Die zweite Sequenz codiert ein Protein mit signifikanter Homologie zu einem Zellteilungsprotein, und es ist bestimmt worden, daß sie eine Rolle bei der Aufrechterhaltung der Plasmidstabilität spielt. Die Nucleotidsequenzen sowohl des Replikationsproteins als auch des Stabilitätsproteins können in einer Vielfalt von Klonierungs- und Expressionsvektoren und besonders in Shuttle-Vektoren für die Expression von homologen und heterologen Genen in Rhodococcus sp. und ähnlichen Organismen verwendet werden.
So betrifft die vorliegende Erfindung ein isoliertes Nucleinsäuremolekül, codierend ein Replikationsprotein, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: (a) einer isolierten Nucleinsäure, codierend die Aminosäuresequenz, wie sie in SEQ ID NO:2 angegeben ist; (b) einer isolierten Nucleinsäure, die mit (a) unter den folgenden Hybridisierungsbedingungen hybridisiert: 0,1X SSC, 0,1% SDS, 65°C und gewaschen mit 2X SSC, 0,1% SDS und nachfolgend 0,1X SSC, 0,1% SDS; oder einer isolierten Nucleinsäure, die komplementär zu (a) oder (b) ist.
Ähnlich stellt die vorliegende Erfindung ein isoliertes Nucleinsäuremolekül bereit, codierend ein Plasmidstabilitätsprotein, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: (a) einer isolierten Nucleinsäure, codierend die Aminosäuresequenz, wie sie in SEQ ID NO:4 angegeben ist; (b) einer isolierten Nucleinsäure, die mit (a) unter den folgenden Hybridisierungsbedingungen hybridisiert: 0,1X SSC, 0,1% SDS, 65°C und gewaschen mit 2X SSC, 0,1% SDS und nachfolgend 0,1X SSC, 0,1% SDS; oder einer isolierten Nucleinsäure, die komplementär zu (a) oder (b) ist.
Die Erfindung stellt zusätzlich durch die vorliegenden Nucleotidsequenzen codierte Polypeptide und dieselben enthaltende transformierte Wirte bereit.
Verfahren für die Isolierung von Homologen der vorliegenden Gene werden ebenfalls bereitgestellt. In einer Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zum Erhalt eines Nucleinsäuremoleküls, codierend ein Replikationsprotein oder Stabilitätsprotein, bereit, umfassend: (a) Sondieren einer Genbank mit einem Nucleinsäuremolekül der vorliegenden Erfindung; (b) Identifizieren eines DNA-Klons, der mit dem Nucleinsäuremolekül der vorliegenden Erfindung hybridisiert; und (c) Sequenzieren des genomischen Fragments, das den Klon, identifiziert in Schritt (b), umfaßt, wobei das sequenzierte genomische Fragment ein Replikationsprotein oder ein Stabilitätsprotein codiert.
In einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zum Erhalt eines Nucleinsäuremoleküls, codierend ein Replikationsprotein oder ein Stabilitätsprotein, bereit, umfassend: (a) Synthetisieren eines mindestens einen Oligonucleotid-Primers entsprechend einem Anteil der Sequenzen der vorliegenden Erfindung; und (b) Amplifizieren eines Inserts, vorhanden in einem Klonierungsvektor, unter Verwendung des Oligonucleotid-Primers von Schritt (a); wobei das amplifizierte Insert einen Anteil einer Aminosäuresequenz, codierend ein Replikationsprotein oder ein Stabilitätsprotein, codiert.
In einer bevorzugten Ausführungsform stellt die Erfindung Plasmide, umfassend die Gene, codierend die vorliegenden Replikations- und Stabilitätsproteine und gegebenenfalls auswählbare Marker, bereit. Bevorzugte Wirte für die Plasmidreplikation zur Genexpression sind die Actinomycetales-Bakterienfamilie und speziell die Rhodococcus-Gattung.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren für die Expression einer Nucleinsäure in einem Actinomycetales-Bakterium bereit, umfassend: a) Bereitstellen eines Plasmids, umfassend: (i) die Nucleinsäuren der vorliegenden Erfindung, codierend die rep- und Stabilitätsproteine; (ii) mindestens eine Nucleinsäure, codierend einen auswählbaren Marker; und (iii) mindestens einen Promotor, operativ verknüpft mit einem zu exprimierenden Nucleinsäurefragment; b) Transformieren eines Actinomycetales-Bakteriums mit dem Plasmid von (a); und c) Kultivieren des transformierten Actinomycetales-Bakteriums von (b) für eine Zeitlänge und unter Bedingungen, unter denen das Nucleinsäurefragment exprimiert wird.
In einer alternativen Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren für die Expression einer Nucleinsäure in einem Actinomycetales-Bakterium bereit, umfassend: a) Bereitstellen eines ersten Plasmids, umfassend: (i) die Nucleinsäure der vorliegenden Erfindung, codierend ein rep-Protein; (ii) mindestens eine Nucleinsäure, codierend einen auswählbaren Marker; und (iii) mindestens einen Promotor, operativ verknüpft mit einem zu exprimierenden Nucleinsäurefragment; b) Bereitstellen mindestens eines anderen Plasmids in einer andersartigen Inkompatibilitätsgruppe als das erste Plasmid, wobei das mindestens eine andere Plasmid umfaßt: (ii) mindestens eine Nucleinsäure, codierend einen auswählbaren Marker; und (iii) mindestens einen Promotor, operativ verknüpft mit einem zu exprimierenden Nucleinsäurefragment; c) Transformieren eines Actinomycetales-Bakteriums mit den Plasmiden von (a) und (b); und d) Kultivieren des transformierten Actinomycetales-Bakteriums von (c) für eine Zeitlänge und unter Bedingungen, unter denen das Nucleinsäurefragment exprimiert wird.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist eine Restriktionsendonuclease-Karte von pAN12, einem kryptischen Plasmid aus dem Rhodococcus-erythropolis-Stamm AN12.
2 ist eine Restriktionsendonuclease-Karte von pRhBR17, einem Escherichia coli-Rhodococcus-Shuttle-Vektor.
3 ist eine Restriktionsendonuclease-Karte von pRhBR171, einem Escherichia coli-Rhodococcus-Shuttle-Vektor.
4A ist eine Ausrichtung von Aminosäuresequenzen verschiedener Replikationsproteine der pIJ101/pJV1-Familie von Plasmiden mit rolling-circle-Replikation (= rollende Haarnadelreplikation).
4B ist eine Ausrichtung von Aminosäuresequenzen für verschiedene Replikationsursprünge der Plasmide mit rolling-circle-Replikation.
SEQUENZBESCHREIBUNGEN
Die Erfindung kann aus der folgenden ausführlichen Beschreibung und den begleitenden Sequenzbeschreibungen, welchen einen Teil dieser Anmeldung bilden, vollständiger verstanden werden.
Der (die) Anmelder hat (haben) 30 Sequenzen im Einklang mit 37 C.F.R. 1.821–1.825 („Requirements for Patent Applications Containing Nucleotide Sequences and/or Amino Acid Sequence Disclosures – the Sequence Rules („Anforderungen für Patentanmeldungen, die Offenbarungen von Nucleotidsequenzen und/oder Aminosäuresequenzen enthalten – die Sequenzregeln")) und übereinstimmend mit dem Standard ST 25 (1998) der World Intellectual Property Organization (WIPO) und den Anforderungen der EPO und PCT an die Sequenzauflistung (Regeln 5.2 und 49.5 (a-bis) und Abschnitt 208 und Anhang C der Verwaltungsvorschriften) bereitgestellt. Die Symbole und das Format, die für Nucleotid- und Aminosäuresequenzwerte verwendet werden, erfüllen die in 37 C.F.R. §1.822 angegebenen Regeln.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die Anmelder haben ein neues kryptisches Plasmid, pAN12, aus dem Rhodococcus-erythropolis-Stamm AN12 isoliert und charakterisiert und unter Verwendung von pAN12 einen neuen Escherichia coli-Rhodococcus-Shuttle-Vektor konstruiert. Die Erfindung der Anmelder stellt wichtige Werkzeuge zur Verwendung bei der genetischen Manipulation von Rhodococcus-Arten und ähnlichen Organismen bereit. Außerdem haben die Anmelder eine Nucleinsäure, codierend ein einzigartiges Replikationsprotein, rep, aus dem neuen Plasmid identifiziert und isoliert. Diese Replikationsprotein codierende Nucleinsäure kann in einer Vielfalt von Klonierungs- und Expressionsvektoren und insbesondere in Shuttle-Vektoren für die Expression von homologen und heterologen Genen in Rhodococcus-Arten (sp.) und ähnlichen Organismen verwendet werden. Ähnlich haben die Anmelder eine Sequenz auf dem Plasmid, codierend ein zum Aufrechterhalten der Plasmidstabilität verwendbares Protein, identifiziert und charakterisiert. Die Shuttle-Vektoren der Anmelder sind besonders wünschenswert, weil sie imstande sind, mit anderen Shuttle-Vektoren in der gleichen Rhodococcus-Wirtszelle zu koexistieren. Daher können die Vektoren der Anmelder ebenfalls in Kombination mit anderen kompatiblen Plasmiden für die Coexpression in einer einzigen Wirtszelle verwendet werden.
In einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung einen kompakten Shuttle-Vektor bereit, der die Fähigkeit hat, sowohl in Rhodococcus als auch in E. coli zu replizieren, doch klein genug ist, um große DNA zu transportieren.
In dieser Offenbarung wird eine Anzahl von Begriffen und Abkürzungen verwendet. Die folgenden Definitionen werden bereitgestellt und sollten beim Verstehen des Umfangs und der praktischen Ausführung der vorliegenden Erfindung hilfreich sein.
In einer speziellen Ausführungsform bedeutet der Begriff „etwa" oder „ungefähr" innerhalb von 20%, vorzugsweise innerhalb von 10% und stärker bevorzugt innerhalb von 5% eines gegebenen Wertes oder Bereichs.
Eine „Nucleinsäure" ist eine polymere Verbindung, die aus kovalent verknüpften Untereinheiten besteht, die Nucleotide genannt werden. Nucleinsäure schließt Polyribonucleinsäure (RNA) und Polydesoxyribonucleinsäure (DNA) ein, die beide einsträngig oder doppelsträngig sein können. DNA schließt cDNA, genomische DNA, synthetische DNA und halbsynthetische DNA ein.
Ein „isoliertes Nucleinsäuremolekül" oder „isoliertes Nucleinsäurefragment" bezeichnet die polymere Phosphatesterform von Ribonucleosiden (Adenosin, Guanosin, Uridin oder Cytidin; „RNA-Moleküle") oder Desoxyribonucleosiden (Desoxyadenosin, Desoxyguanosin, Desoxythymidin oder Desoxycytidin; „DNA-Moleküle") oder beliebige Phosphoesteranaloge davon, wie beispielsweise Phosphorothioate und -thioester in entweder einsträngiger Form oder einer doppelsträngigen Helix. Doppelsträngige DNA-DNA-, DNA-RNA- und RNA-RNA-Helices sind möglich. Der Begriff Nucleinsäuremolekül, und insbesondere DNA- oder RNA-Molekül, bezeichnet nur die primäre und sekundäre Struktur des Moleküls und begrenzt sie nicht auf irgendwelche besonderen tertiären Formen. So schließt dieser Begriff doppelsträngige DNA, gefunden unter anderem in linearen oder zirkulären DNA-Molekülen (z.B. Restriktionsfragmente), Plasmiden und Chromosomen, ein. Beim Diskutieren der Struktur von besonderen doppelsträngigen DNA-Molekülen können hier Sequenzen entsprechend der normalen Konvention, nur die Sequenz in der 5'- bis 3'-Richtung entlang dem nicht transkribierten Strang von DNA (d.h. der Strang mit einer Sequenz homolog zu der mRNA) anzugeben, beschrieben werden.
Ein „Gen" bezeichnet eine Anordnung von Nucleotiden, die ein Polypeptid codieren, und schließt Nucleinsäuren von cDNA und genomischer DNA ein. „Gen" bezeichnet auch ein Nucleinsäurefragment, das ein spezielles Protein, einschließend Regulationssequenzen vorausgehend (5' nicht codierende Sequenzen) und folgend (3' nicht codierende Sequenzen) der Codierungssequenz, exprimiert. „Natives Gen" bezeichnet ein Gen, wie es in der Natur mit seinen eigenen Regulationssequenzen gefunden wird. „Chimäres Gen" bezeichnet ein Gen, das nicht ein natives Gen ist und Regulations- und Codierungssequenzen umfaßt, die in der Natur nicht zusammen gefunden werden. Dementsprechend kann ein chimäres Gen Regulationssequenzen und Codierungssequenzen umfassen, die aus verschiedenen Ausgangsstoffen abgeleitet sind, oder Regulationssequenzen und Codierungssequenzen, die aus dem gleichen Ausgangsstoff abgeleitet sind, aber in einer Weise, verschieden von der in der Natur gefundenen, angeordnet sind. „Endogenes Gen" bezeichnet ein natives Gen an seinem natürlichen Standort im Genom eines Organismus. Ein „fremdes" Gen bezeichnet ein Gen, das normalerweise nicht in dem Wirtsorganismus gefunden wird, aber das durch Gentransfer in den Wirtsorganismus eingeführt wird. Fremde Gene können native Gene, insertiert in einen nicht nativen Organismus, oder chimäre Gene umfassen. Ein „Transgen" ist ein Gen, das durch ein Transformationsverfahren in das Genom eingeführt worden ist.
Ein Nucleinsäuremolekül ist mit einem anderen Nucleinsäuremolekül, wie beispielsweise eine cDNA, genomische DNA oder RNA, „hybridisierbar", wenn eine einsträngige Form des Nucleinsäuremoleküls unter den geeigneten Bedingungen von Temperatur und Ionenstärke der Lösung an das andere Nucleinsäuremolekül annealen kann. Hybridisierungs- und Waschbedingungen sind bekannt und beispielhaft in Sambrook, J., Fritsch, E. F. und Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Molekulares Klonieren: Ein Laborhandbuch), Zweite Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (1989), insbesondere Kapitel 11 und Tabelle 11.1 darin (nachstehend „Maniatis", insgesamt hier durch Bezugnahme einbezogen) veranschaulicht. Die Bedingungen von Temperatur und Ionenstärke bestimmen die „Stringenz" der Hybridisierung. Stringenzbedingungen können eingestellt werden, um auf moderat ähnliche Fragmente, wie beispielsweise homologe Sequenzen von entfernt verwandten Organismen, bis stark ähnliche Fragmente, wie beispielsweise Gene, die funktionelle Enzyme von nahe verwandten Organismen duplizieren, zu screenen. Waschungen nach der Hybridisierung bestimmen die Stringenzbedingungen. Eine Gruppe von bevorzugten Bedingungen verwendet eine Serie von Waschungen, beginnend mit 6X SSC, 0,5% SDS bei Raumtemperatur für 15 min, dann wiederholt mit 2X SSC, 0,5% SDS bei 45°C für 30 min, und dann zweimal wiederholt mit 0,2X SSC, 0,5% SDS bei 50°C für 30 min. Eine stärker bevorzugte Gruppe von stringenten Bedingungen verwendet höhere Temperaturen, bei denen die Waschungen identisch mit den vorstehenden sind, ausgenommen, daß die Temperatur der finalen zwei 30-min-Waschungen in 0,2X SSC, 0,5% SDS auf 60°C erhöht wurde. Eine andere bevorzugte Gruppe von äußerst stringenten Bedingungen verwendet zwei finale Waschungen in 0,1X SSC, 0,1% SDS bei 65°C. Eine andere Gruppe von äußerst stringenten Bedingungen ist durch Hybridisierung bei 0,1X SSC, 0,1% SDS, 65°C und Waschen mit 2X SSC, 0,1% SDS und nachfolgend 0,1X SSC, 0,1% SDS definiert.
Hybridisierung erfordert, daß die zwei Nucleinsäuren komplementäre Sequenzen enthalten. Obwohl sie von der Stringenz der Hybridisierung abhängen, sind Fehlpaarungen zwischen Basen möglich. Die geeignete Stringenz zum Hybridisieren von Nucleinsäuren hängt von der Länge der Nucleinsäuren und dem Grad der Komplementation ab, Variablen, die auf dem Fachgebiet gut bekannt sind. Je größer der Grad der Ähnlichkeit oder Homologie zwischen zwei Nucleotidsequenzen ist, desto größer ist der Wert von Tm für Hybride von Nucleinsäuren mit diesen Sequenzen. Die relative Stabilität (entsprechend höherer Tm) von Nucleinsäurehybridisierungen nimmt in der folgenden Reihenfolge: RNA:RNA, DNA:RNA, DNA:DNA ab. Für Hybride mit einer Länge von mehr als 100 Nucleotiden sind Gleichungen zum Berechnen der Tm abgeleitet worden (siehe Maniatis, supra, 9.50–9.51). Für Hybridisierungen mit kürzeren Nucleinsäuren, d.h. Oligonucleotide, wird die Position von Fehlpaarungen wichtiger, und die Länge des Oligonucleotids bestimmt seine Spezifität (siehe Maniatis, supra, 11.7–11.8). In einer Ausführungsform beträgt die Länge für eine hybridisierbare Nucleinsäure mindestens etwa 10 Nucleotide. Eine zu bevorzugende minimale Länge für eine hybridisierbare Nucleinsäure beträgt mindestens etwa 15 Nucleotide; stärker bevorzugt mindestens etwa 20 Nucleotide; und am meisten bevorzugt beträgt die Länge mindestens 30 Nucleotide. Weiterhin erkennt der Fachmann, daß die Temperatur und die Salzkonzentration der Waschlösung eingestellt werden können, wie es entsprechend Faktoren wie beispielsweise Länge der Sonde notwendig ist.
Der Begriff „Prozent Identität", wie er auf dem Fachgebiet bekannt ist, ist eine Beziehung zwischen zwei oder mehreren Polypeptidsequenzen oder zwei oder mehreren Polynucleotidsequenzen, wie sie durch Vergleichen der Sequenzen bestimmt wird. Auf dem Fachgebiet bedeutet „Identität" auch den Grad der Sequenzverwandtschaft zwischen Polypeptid- oder Polynucleotidsequenzen, je nachdem, wie sie durch die Übereinstimmung zwischen Strings derartiger Sequenzen bestimmt wird. „Identität" und „Ähnlichkeit" können durch bekannte Verfahren, einschließlich, ohne aber darauf begrenzt zu sein, derjenigen, beschrieben in: Computational Molecular Biology (Computer-Molekularbiologie) (Lesk, A. M., Hrsg.) Oxford University Press, NY (1988); Biocomputing: Informatics and Genome Projects (Biocomputing: Informatik und Genomprojekte) (Smith, D. W., Hrsg.) Academic Press, NY (1993); Computer Analysis of Sequence Data, Part I (Computeranalyse von Sequenzdaten, Teil I) (Griffin, A. M., und Griffin, H. G., Hrsg.) Humana Press, NJ (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology (Sequenzanalyse in Molekularbiologie) (von Heinje, G., Hrsg.), Academic Press (1987); und Sequence Analysis Primer (Primer für Sequenzanalyse)(Gribskov, M., und Devereux, J., Hrsg.), Stockton Press, NY (1991) leicht berechnet werden. Bevorzugte Verfahren zur Bestimmung der Identität werden gestaltet, um die beste Übereinstimmung zwischen den getesteten Sequenzen zu ergeben. Verfahren zur Bestimmung von Identität und Ähnlichkeit sind in öffentlich zugänglichen Computerprogrammen kodifiziert. Sequenzausrichtungen und Berechnungen der Prozent Identität können unter Verwendung des Megalign-Programms der LASERGENE-Bioinformatik-Rechenfolge (DNASTAR Inc., Madison, WI) durchgeführt werden. Mehrfache Ausrichtung der Sequenzen wurde unter Verwendung des Clustal-Verfahrens der Ausrichtung (Higgins und Sharp (1989), CABIOS, 5:151–153) mit den Default-Parametern (GAP PENALTY=10, GAP LENGTH PENALTY=10) durchgeführt. Default-Parameter für paarweise Ausrichtungen unter Verwendung des Clustal-Verfahrens waren KTUPLE 1, GAP PENALTY=3, WINDOW=5 und DIAGONALS SAVED=5.
Geeignete Nucleinsäurefragmente (isolierte Polynucleotide der vorliegenden Erfindung) codieren Polypeptide, die zu mindestens etwa 70% identisch, vorzugsweise mindestens etwa 80% identisch mit den hier angegebenen Aminosäuresequenzen sind. Bevorzugte Nucleinsäurefragmente codieren Aminosäuresequenzen, die zu etwa 85% identisch mit den hier angegebenen Aminosäuresequenzen sind. Stärker bevorzugte Nucleinsäurefragmente codieren Aminosäuresequenzen, die zu mindestens etwa 90% identisch mit den hier angegebenen Aminosäuresequenzen sind. Am meisten bevorzugt sind Nucleinsäurefragmente, die Aminosäuresequenzen codieren, die zu mindestens etwa 95% identisch mit den hier angegebenen Aminosäuresequenzen sind. Geeignete Nucleinsäurefragmente haben nicht nur die vorstehenden Homologien, sondern codieren typischerweise ein Polypeptid mit mindestens 50 Aminosäuren, vorzugsweise mindestens 100 Aminosäuren, stärker bevorzugt mindestens 150 Aminosäuren, noch stärker bevorzugt mindestens 200 Aminosäuren und am meisten bevorzugt mindestens 250 Aminosäuren.
Der Begriff „Sonde" bezeichnet ein einsträngiges Nucleinsäuremolekül, das mit einer komplementären einsträngigen Zielnucleinsäure ein Basenpaar bilden kann, wobei ein doppelsträngiges Molekül erzeugt wird.
Der Begriff „komplementär" wird verwendet, um die Beziehung zwischen Nucleotidbasen zu beschreiben, die imstande sind, miteinander zu hybridisieren. Zum Beispiel ist im Hinblick auf DNA Adenosin komplementär zu Thymin, und Cytosin ist komplementär zu Guanin. Demgemäß schließt die vorliegende Erfindung auch isolierte Nucleinsäurefragmente, die komplementär zu den vollständigen Sequenzen, wie in der begleitenden Sequenzauflistung angegeben, sind, ebenso wie die im wesentlichen ähnlichen Nucleinsäuresequenzen ein.
Wie hier verwendet bezeichnet der Begriff „Oligonucleotid" eine Nucleinsäure, im allgemeinen von etwa 18 Nucleotiden, die mit einem genomischen DNA-Molekül, einem cDNA-Molekül oder einem mRNA-Molekül hybridisierbar ist. Oligonucleotide können markiert werden, z.B. mit ³²P-Nucleotiden oder Nucleotiden, welche mit einer Markierung, wie beispielsweise Biotin, kovalent konjugiert worden sind. Ein Oligonucleotid kann als Sonde verwendet werden, um die Anwesenheit einer Nucleinsäure gemäß der Erfindung nachzuweisen. Ähnlich können Oligonucleotide (von denen eines oder beide markiert sein können) als PCR-Primer verwendet werden, entweder zum Klonieren der vollen Länge oder eines Fragments einer Nucleinsäure der Erfindung oder um die Anwesenheit von Nucleinsäuren gemäß der Erfindung nachzuweisen. In einer weiteren Ausführungsform kann ein Oligonucleotid der Erfindung eine Tripelhelix mit einem DNA-Molekül bilden. Im allgemeinen werden Oligonucleotide synthetisch hergestellt, vorzugsweise auf einem Nucleinsäuresynthetisierer. Demgemäß können Oligonucleotide mit nicht natürlich vorkommenden Phosphoester-analogen Bindungen, wie beispielsweise Thioesterbindungen usw., hergestellt werden.
Eine DNA-„Codierungssequenz" ist eine doppelsträngige DNA-Sequenz, welche in vitro oder in vivo transkribiert und in ein Polypeptid in einer Zelle translatiert wird, wenn sie unter die Kontrolle von geeigneten Regulationssequenzen plaziert wird. „Geeignete Regulationssequenzen" bezeichnen Nucleotidsequenzen, die sich stromaufwärts (5' nicht kodierende Sequenzen), innerhalb oder stromabwärts (3' nicht kodierende Sequenzen) einer Codierungssequenz befinden, und welche die Transkription, RNA-Verarbeitung oder -Stabilität oder Translation der assoziierten Codierungssequenz beeinflussen. Regulationssequenzen können Promotoren, Translations-Leader-Sequenzen, RNA-Verarbeitungsstelle, Effektorbindungsstelle und Stamm-Schleifen-Struktur einschließen. Die Grenzen der Codierungssequenz werden durch ein Startcodon an dem 5'-(Amino)-Ende und ein Translations-Stop-Codon an dem 3'-(Carboxyl)-Ende bestimmt. Eine Codierungssequenz kann, ohne aber darauf begrenzt zu sein, prokaryotische Sequenzen, cDNA aus mRNA, genomische DNA-Sequenzen und sogar synthetische DNA- Sequenzen einschließen. Wenn die Codierungssequenz für Expression in einer eukaryotischen Zelle vorgesehen ist, befindet sich gewöhnlich ein Polyadenylierungssignal und eine Transkriptionsterminierungssequenz 3' zu der Codierungssequenz.
„Offener Leserahmen" ist abgekürzt ORF und bedeutet eine Länge von Nucleinsäuresequenz, entweder DNA, cDNA oder RNA, die ein Translationsstartsignal oder Initiationscodon, wie beispielsweise ein ATG oder AUG, und ein Terminationscodon umfaßt, und kann potentiell in eine Polypeptidsequenz translatiert werden.
„Promotor" bezeichnet eine DNA-Sequenz, die imstande ist, die Expression einer Codierungssequenz oder funktionellen RNA zu steuern. Im allgemeinen befindet sich eine Codierungssequenz 3' zu einer Promotorsequenz. Promotoren können in ihrer Gesamtheit von einem nativen Gen abgeleitet sein oder können aus verschiedenen Elementen, abgeleitet von verschiedenen in der Natur gefundenen Promotoren, zusammengesetzt sein oder sogar synthetische DNA-Segmente umfassen. Es ist für den Fachmann selbstverständlich, daß verschiedene Promotoren die Expression eines Gens in verschiedenen Geweben oder Zelltypen oder in verschiedenen Stadien der Entwicklung oder in Reaktion auf verschiedene umweltmäßige oder physiologische Bedingungen lenken können. Promotoren, welche bewirken, daß ein Gen in den meisten Zelltypen zu den meisten Zeiten exprimiert wird, werden gewöhnlich als „konstitutive Promotoren" bezeichnet. Es wird weiter anerkannt, daß, da in den meisten Fällen die exakten Grenzen von Regulationssequenzen nicht vollständig definiert worden sind, DNA-Fragmente verschiedener Längen identische Promotoraktivität haben können.
Eine „Promotorsequenz" ist eine DNA-Regulationsregion, die imstande ist, RNA-Polymerase in einer Zelle zu binden und Transkription einer stromabwärts (3'-Richtung) codierenden Sequenz zu initiieren. Für Zwecke der Definierung der vorliegenden Erfindung ist die Promotorsequenz an ihrem 3'- Ende durch die Transkriptions-Initiierungsstelle gebunden und erstreckt sich stromaufwärts (5'-Richtung), um die minimale Anzahl von Basen oder Elementen einzuschließen, die notwendig sind, um Transkription mit Niveaus zu initiieren, die über dem Untergrund nachweisbar sind. Innerhalb der Promotorsequenz werden eine Transkriptions-Initiierungsstelle (bequemerweise zum Beispiel durch Kartieren mit Nuclease S1 definiert) ebenso wie Proteinbindungsdomänen (Consensus-Sequenzen), verantwortlich für die Bindung von RNA-Polymerase, gefunden.
Eine Codierungssequenz ist „unter der Kontrolle" von transkriptionalen und translationalen Kontrollsequenzen in einer Zelle, wenn RNA-Polymerase die Codierungssequenz in mRNA transkribiert, welche dann trans-RNA-gespleißt (wenn die Codierungssequenz Introns enthält) und in das Protein, codiert durch die Codierungssequenz, translatiert wird.
„Transkriptionale und translationale Kontrollsequenzen" sind DNA-Regulationssequenzen, wie beispielsweise Promotoren, Enhancer, Terminatoren und dergleichen, die die Expression einer Codierungssequenz in einer Wirtszelle bereitstellen. In eukaryotischen Zellen sind Polyadenylierungssignale Kontrollsequenzen.
Der Begriff „operativ verknüpft" bezeichnet die Assoziation von Nucleinsäuresequenzen auf einem einzelnen Nucleinsäurefragment, so daß die Funktion von einem durch den anderen beeinflußt wird. Zum Beispiel ist ein Promotor operativ mit einer Codierungssequenz verknüpft, wenn er imstande ist, die Expression dieser Codierungssequenz zu beeinflussen (d.h., daß die Codierungssequenz unter der transkriptionalen Kontrolle des Promotors ist). Codierungssequenzen können mit Regulationssequenzen in Sense- oder Antisense-Orientierung operativ verknüpft sein.
Der Begriff „Expression" bezeichnet, wie hier verwendet, die Transkription und stabile Akkumulation von Sense- (mRNA) oder Antisense-RNA, abgeleitet von dem Nucleinsäurefragment der Erfindung. Expression kann auch Translation von mRNA in ein Polypeptid bezeichnen.
Die Begriffe „Restriktionsendonuclease" und „Restriktionsenzym" bezeichnen ein Enzym, welches innerhalb einer speziellen Nucleotidsequenz innerhalb doppelsträngiger DNA bindet und schneidet.
„Regulationsregion" bedeutet eine Nucleinsäuresequenz, welche die Expression einer zweiten Nucleinsäuresequenz reguliert. Eine Regulationsregion kann Sequenzen einschließen, welche natürlicherweise für das Exprimieren einer besonderen Nucleinsäure verantwortlich sind (eine homologe Region) oder kann Sequenzen eines andersartigen Ursprungs einschließen, welche für das Exprimieren andersartiger Proteine oder sogar synthetischer Proteine verantwortlich sind (eine heterologe Region). Insbesondere können die Sequenzen Sequenzen von prokaryotischen, eukaryotischen oder viralen Genen oder abgeleitete Sequenzen sein, welche die Transkription eines Gens in einer spezifischen oder nicht spezifischen Weise und in einer induzierbaren oder nicht induzierbaren Weise stimulieren oder reprimieren. Regulationsregionen schließen Replikationsursprünge, RNA-Spleißstellen, Promotoren, Enhancer, transkriptionale Terminierungssequenzen und Signalsequenzen ein, welche das Polypeptid in die Sekretionswege der Zielzelle lenken.
Eine Regulationsregion aus einem „heterologen Ausgangsstoff" ist eine Regulationsregion, welche nicht natürlicherweise mit der exprimierten Nucleinsäure assoziiert ist. Eingeschlossen in die heterologen Regulationsregionen sind Regulationsregionen aus einer andersartigen Art, Regulationsregionen aus einem andersartigen Gen, Hybrid-Regulationsregionen und Regulationssequenzen, welche in der Natur nicht vorkommen, sondern welche durch einen gewöhnlichen Fachmann gestaltet werden.
„Heterologe" DNA bezeichnet DNA, die sich nicht natürlicherweise in der Zelle oder in einer chromosomalen Stelle der Zelle befindet. Vorzugsweise schließt die heterologe DNA ein für die Zelle fremdes Gen ein.
„RNA-Transkript" bezeichnet das Produkt, das aus RNA-Polymerase-katalysierter Transkription einer DNA-Sequenz entsteht. Wenn das RNA-Transkript eine perfekte komplementäre Kopie der DNA-Sequenz ist, wird es als primäres Transkript bezeichnet, oder es kann eine RNA-Sequenz, abgeleitet von post-transkriptionaler Verarbeitung des primären Transkripts, sein und wird als reife RNA bezeichnet. „Messenger-RNA (mRNA)" bezeichnet die RNA, die ohne Introns ist und die durch die Zelle in Protein translatiert werden kann. „cDNA" bezeichnet eine doppelsträngige DNA, die komplementär zu und abgeleitet von mRNA ist. „Sense"-RNA bezeichnet ein RNA-Transkript, das die mRNA einschließt und so durch die Zelle in Protein translatiert werden kann. „Antisense-RNA" bezeichnet ein RNA-Transkript, das komplementär zu allem oder einem Teil eines primären Zieltranskripts oder mRNA ist und das die Expression eines Zielgens blockiert (US-Patentschrift 5107065; WO 9928508). Die Komplementarität einer Antisense-RNA kann mit einem beliebigen Teil des spezifischen Gentranskripts, d.h. an der 5' nicht codierenden Sequenz, der 3' nicht codierenden Sequenz oder der codierenden Sequenz, sein. „Funktionelle RNA" bezeichnet Antisense-RNA, Riborym-RNA oder andere RNA, die nicht translatiert ist, doch eine Wirkung auf zelluläre Prozesse hat.
Ein „Polypeptid" ist eine polymere Verbindung, bestehend aus kovalent verknüpften Aminosäureresten. Aminosäuren haben die folgende allgemeine Struktur:
Aminosäuren werden auf der Basis der Seitenkette R in sieben Gruppen klassifiziert: (1) aliphatische Seitenketten, (2) Seitenketten, enthaltend eine Hydroxyl-(OH)-Gruppe, (3) Seitenketten, enthaltend Schwefelatome, (4) Seitenketten, enthaltend eine saure oder Amidgruppe, (5) Seitenketten, enthaltend eine basische Gruppe, (6) Seitenketten, enthaltend einen aromatischen Ring, und (7) Prolin, eine Iminosäure, in welcher die Seitenkette mit der Aminogruppe kondensiert ist. Ein Polypeptid der Erfindung umfaßt vorzugsweise mindestens etwa 14 Aminosäuren.
Ein „Protein" ist ein Polypeptid, das eine strukturelle oder funktionelle Rolle in einer lebenden Zelle spielt.
Ein „heterologes Protein" bezeichnet ein Protein, das nicht natürlicherweise in der Zelle erzeugt wird.
Ein „reifes Protein" bezeichnet ein posttranslational bearbeitetes Polypeptid; d.h. eines, aus dem alle in dem primären Translationsprodukt vorhandenen Prä- oder Propeptide entnommen worden sind. „Vorläufer"-Protein bezeichnet das primäre Produkt der Translation von mRNA; d.h. mit noch vorhandenen Prä- oder Propeptiden. Prä- oder Propeptide können, ohne aber darauf begrenzt zu sein, intrazelluläre Lokalisationssignale sein.
Der Begriff „Signalpeptid" bezeichnet ein aminoterminales Polypeptid, das dem sekretierten reifen Protein vorausgeht. Das Signalpeptid wird von dem reifen Protein abgespalten und ist deswegen darin nicht vorhanden. Signalpeptide haben die Funktion, sekretierte Proteine durch die Zellmembrane zu lenken und zu translozieren. Signalpeptid wird auch als Signalprotein bezeichnet.
Eine „Signalsequenz" wird am Beginn der Codierungssequenz eines zu exprimierenden Proteins auf der Oberfläche einer Zelle eingeschlossen. Diese Sequenz codiert ein Signalpeptid, N-terminal zu dem reifen Polypeptid, das die Wirtszelle lenkt, um das Polypeptid zu translozieren. Der Begriff „Translokations-Signalsequenz" wird hier verwendet, um diese Sorte von Signalsequenz zu bezeichnen. Translokations-Signalsequenzen können mit einer Vielfalt von für Eukaryoten und Prokaryoten nativen Proteinen assoziiert gefunden werden und sind oft funktionell in beiden Typen von Organismen.
Wie hier verwendet bezeichnet der Begriff „homolog" in all seinen grammatikalischen Formen und Schreibvariationen die Beziehung zwischen Proteinen, die einen „gemeinsamen evolutionären Ursprung" besitzen, einschließlich Proteinen aus Superfamilien und homologen Proteinen aus verschiedenen Spezies (Reeck et al., 1987, Cell 50:667). Derartige Proteine (und ihre codierenden Gene) weisen Sequenzhomologie auf, wie durch ihren hohen Grad von Sequenzähnlichkeit widergespiegelt wird.
Der Begriff „entsprechend" wird hier verwendet, um ähnliche oder homologe Sequenzen zu bezeichnen, sei es, daß die exakte Position identisch oder daß sie verschieden von dem Molekül ist, mit welchem die Ähnlichkeit oder Homologie gemessen wird. Eine Nucleinsäure- oder Aminosäuresequenzanordnung kann Zwischenräume einschließen. So bezeichnet der Begriff „entsprechend" die Sequenzähnlichkeit und nicht die Numerierung der Aminosäurereste oder Nucleotidbasen.
Ein „wesentlicher Anteil" einer Aminosäure- oder Nucleotidsequenz umfaßt genügend von der Aminosäuresequenz eines Polypeptids oder der Nucleotidsequenz eines Gens, um dieses Polypeptid oder Gen mutmaßlich zu identifizieren, entweder durch manuelle Auswertung der Sequenz durch den Fachmann oder durch Computer-automatisierten Sequenzvergleich und Identifizierung unter Verwendung von Algorithmen wie beispielsweise BLAST (Basic Local Alignment Search Tool; Altschul, S. F., et al., (1993), J. Mol. Biol. 215:403–410; siehe auch www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). Im allgemeinen ist eine Sequenz von zehn oder mehr zusammenhängenden Aminosäuren oder dreißig oder mehr Nucleotiden notwendig, um eine Polypeptid- oder Nucleinsäuresequenz als homolog zu einem bekannten Protein oder Gen mutmaßlich zu identifizieren. Darüber hinaus können im Hinblick auf Nucleotidsequenzen genspezifische Oligonucleotidsonden, umfassend 20–30 zusammenhängende Nucleotide, in sequenzabhängigen Verfahren der Genidentifikation (z.B. Southern-Hybridisierung) und -isolierung (z.B. in-situ-Hybridisierung von Bakterienkolonien oder Bakteriophagenplaquen) verwendet werden. Außerdem können kurze Oligonucleotide von 12–15 Basen als Amplifikationsprimer in PCR verwendet werden, um ein die Primer umfassendes spezielles Nucleinsäurefragment zu erhalten. Demgemäß umfaßt ein „wesentlicher Anteil" einer Nucleotidsequenz genug von der Sequenz, um ein die Sequenz umfassendes Nucleinsäurefragment spezifisch zu identifizieren und/oder zu isolieren. Die vorliegende Beschreibung lehrt teilweise oder vollständige Aminosäure- und Nucleotidsequenzen, die ein oder mehrere spezielle mikrobielle Proteine codieren. Der Fachmann, der den Vorteil der wie hier angegebenen Sequenzen hat, kann jetzt alle oder einen wesentlichen Anteil der offenbarten Sequenzen für dem Fachmann bekannte Zwecke verwenden. Demgemäß umfaßt die vorliegende Erfindung die vollständigen Sequenzen, wie sie in der begleitenden Sequenzauflistung angegeben sind, ebenso wie wesentliche Anteile derjenigen Sequenzen, wie sie vorstehend definiert sind.
Der Begriff „Sequenzanalysesoftware" bezeichnet einen Computeralgorithmus oder ein Softwareprogramm, das für die Analyse von Nucleotid- oder Aminosäuresequenzen verwendbar ist. „Sequenzanalysesoftware" kann im Handel erhältlich sein oder unabhängig entwickelt werden. Typische Sequenzanalysesoftware schließt ein, ohne aber darauf begrenzt zu sein, die GCG-Folge von Programmen (Wisconsin Package Version 9.0, Genetics Computer Group (GCG), Madison, WI), BLASTP, BLASTN, BLASTX (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403–410 (1990)) und DNASTAR (DNASTAR, Inc. 1228 S. Park St. Madison, WI 53715 USA) und das FASTA-Programm, das den Smith-Waterman-Algorithmus einschließt (W. R. Pearson, Comput. Methods Genome Res., [Proc. Int. Symp.] (1994), Meeting Date 1992, 111–20. Herausgeber: Suhai, Sandor. Verleger: Plenum, New York, NY). Innerhalb des Zusammenhangs dieser Anmeldung ist es selbstverständlich, daß, wo Sequenzanalysesoftware zur Analyse verwendet wird, die Ergebnisse der Analyse auf den „Default-Werten" des in Bezug genommenen Programms basieren, wenn es nicht anderweitig vorgegeben ist. Wie hier verwendet bedeuten „Default-Werte" eine Gruppe von Werten oder Parametern, welche ursprünglich mit der Software geladen werden, wenn sie zuerst initialisiert wird.
Ein „Vektor" ist ein Mittel für die Überführung einer Nucleinsäure in eine Wirtszelle. Ein Vektor kann ein Replikon sein, an welches ein anderes DNA-Segment angefügt werden kann, um die Replikation des angefügten Segments zustande zu bringen. Ein „Replikon" ist ein genetisches Element (z.B. Plasmid, Phage, Cosmid, Chromosom, Virus) das in vivo als autonome Einheit von DNA-Replikation funktioniert, d.h. fähig zur Replikation unter seiner eigenen Kontrolle ist. Der Begriff „Vektor" schließt sowohl vitale als auch nichtvirale Mittel zum Einführen der Nucleinsäure in eine Zelle in vitro, ex vivo oder in vivo ein. Zu vitalen Vektoren gehören Retrovirus-, Adeno-assoziierter-Virus-, Pox-, Baculovirus-, Vaccinia-, Herpessimplex-, Epstein-Barr- und Adenovirus-Vektoren. Zu nichtviralen Vektoren gehören Plasmide, Liposome, elektrisch geladene Lipide (Cytofectine), DNA-Protein-Komplexe und Biopolymere. Zusätzlich zu einer Nucleinsäure kann ein Vektor auch eine oder mehrere Regulationsregionen und oder auswählbare Marker enthalten, die beim Auswählen, Messen und Überwachen von Nucleinsäuretransferergebnissen (Transfer zu welchen Geweben, Dauer der Expression usw.) verwendbar sind.
Der Begriff „Plasmid" bezeichnet ein extra chromosomales Element, das oft ein Gen trägt, das nicht Teil des zentralen Metabolismus der Zelle ist und gewöhnlich in der Form von zirkulären doppelsträngigen DNA-Molekülen ist. Derartige Elemente können autonom replizierende Sequenzen sein, Genom-integrierende Sequenzen, Phagen- oder Nucleotidsequenzen, linear, zirkulär oder supercoiled (= stark ineinander verdreht), von einer ein- oder doppelsträngigen DNA oder RNA, abgeleitet von einem beliebigen Ausgangsstoff, in dem eine Anzahl von Nucleotidsequenzen in einer einzigartigen Konstruktion verbunden oder rekombiniert worden ist, welche zur Einführung eines Promotorfragments und einer DNA-Sequenz für ein ausgewähltes Genprodukt zusammen mit einer passenden 3'-untranslatierten Sequenz in eine Zelle fähig ist.
Ein „Klonierungsvektor" ist ein „Replikon", welches eine Einheitslänge von DNA ist, die sequentiell repliziert und welche einen Replikationsursprung, wie beispielsweise ein Plasmid, einen Phagen oder ein Cosmid, umfaßt, an welchen ein anderes DNA-Segment angefügt werden kann, so daß die Replikation des angefügten Segments zustande gebracht wird. Klonierungsvektoren können zur Replikation in einem Zelltyp und Expression in einem andern fähig sein („Shuttle-Vektor"). Eine Zelle ist durch exogene oder heterologe DNA „transfiziert" worden, wenn eine derartige DNA im Inneren der Zelle eingeführt worden ist. Eine Zelle ist durch exogene oder heterologe DNA „transformiert" worden, wenn die transfizierte DNA eine phänotypische Änderung bewirkt. Die transformierende DNA kann in chromosomale DNA, die das Genom der Zelle ausmacht, integriert (kovalent verknüpft) werden.
„Transformation" bezeichnet den Transfer eines Nucleinsäurefragments in das Genom eines Wirtsorganismus, was zu genetisch stabiler Vererbung führt. Wirtsorganismen, die die transformierten Nucleinsäurefragmente enthalten, werden als „transgene" oder „rekombinante" oder „transformierte" Organismen bezeichnet.
„Polymerasekettenreaktion" ist abgekürzt PCR und bedeutet ein in-vitro-Verfahren zum enzymatischen Amplifizieren spezieller Nucleinsäuresequenzen. PCR beinhaltet eine repetitive Serie von Temperaturzyklen, wobei jeder Zyklus drei Stadien umfaßt: Denaturierung der Templat-Nucleinsäure, um die Stränge des Zielmoleküls zu trennen, Annealen eines einsträngigen PCR-Oligonucleotid-Primers an die Templat-Nucleinsäure und Extension des (der) annealten Primer(s) durch DNA-Polymerase.
Der Begriff „rep" oder „repA" bezeichnet ein Replikationsprotein, das die Fähigkeit eines Rhodococcus-Plasmids zur Replikation kontrolliert. Wie hier verwendet wird das rep-Protein auch als „Replikationsprotein" oder „Replikase" bezeichnet. Der Begriff „rep" wird verwendet, um das das rep-Protein codierende Gen zu beschreiben.
Der Begriff „div" bezeichnet ein Protein, das zum Aufrechterhalten der Plasmidstabilität notwendig ist. Das div-Protein hat bedeutsame Homologie zu Zellteilungsproteinen und wird hier auch als „Plasmidstabilitätsprotein" bezeichnet.
Die Begriffe „Replikationsursprung" oder „ORI" bedeuten eine spezielle Stelle oder Sequenz innerhalb eines DNA-Moleküls, an der DNA-Replikation initiiert wird. Bakterien- und Phagenchromosome haben einen einzigen Replikationsursprung.
Der Begriff „pAN12" bezeichnet ein Plasmid, umfassend alles oder einen wesentlichen Anteil der Nucleotidsequenz, wie sie in SEQ ID NO:5 angegeben ist, wobei das Plasmid eine rep codierende Nucleinsäure, umfassend eine Nucleotidsequenz, wie sie in SEQ ID NO:1 angegeben ist, eine div codierende Nucleinsäure, umfassend eine Nucleotidsequenz, wie sie in SEQ ID NO:3 angegeben ist, und einen Replikationsursprung, umfassend eine Nucleotidsequenz, wie sie in SEQ ID NO:8 angegeben ist, umfaßt.
Der Begriff „pRHBR17" bezeichnet einen Escherichia coli-Rhodococcus-Shuttle-Vektor, umfassend alles oder einen wesentlichen Anteil der Nucleotidsequenz, wie sie in SEQ ID NO:6 angegeben ist, wobei der Shuttle-Vektor eine rep codierende Nucleinsäure, umfassend eine Nucleotidsequenz, wie sie in SEQ ID NO:1 angegeben ist, eine div codierende Nucleinsäure, umfassend eine Nucleotidsequenz, wie sie in SEQ ID NO:3 angegeben ist, und einen Replikationsursprung, umfassend eine Nucleotidsequenz, wie sie in SEQ ID NO:8 angegeben ist, umfaßt.
Der Begriff „pRHBR171" bezeichnet einen Escherichia coli-Rhodococcus-Shuttle-Vektor, umfassend alles oder einen wesentlichen Anteil der Nucleotidsequenz, wie sie in SEQ ID NO:7 angegeben ist, wobei der Shuttle-Vektor eine rep codierende Nucleinsäure, umfassend eine Nucleotidsequenz, wie sie in SEQ ID NO:1 angegeben ist, eine div codierende Nucleinsäure, umfassend eine Nucleotidsequenz, wie sie in SEQ ID NO:3 angegeben ist, und einen Replikationsursprung, umfassend eine Nucleotidsequenz, wie sie in SEQ ID NO:8 angegeben ist, umfaßt.
Der Begriff „genetische Region" bezeichnet eine Region eines Nucleinsäuremoleküls oder einer Nucleotidsequenz, die ein ein Polypeptid codierendes Gen umfaßt.
Der Begriff „auswählbarer Marker" bedeutet einen identifizierenden Faktor, gewöhnlich ein antibiotisches oder chemisches Resistenzgen, das imstande ist, basierend auf der Wirkung des Markergens, d.h. Resistenz gegenüber einem Antibiotikum, ausgewählt zu werden, wobei die Wirkung verwendet wird, um die Vererbung einer interessierenden Nucleinsäure zu verfolgen und/oder um eine Zelle oder einen Organismus zu identifizieren, die die interessierende Nucleinsäure vererbt haben.
Der Begriff „Inkompatibilität", wie er für Plasmide angewendet wird, bezeichnet die Unfähigkeit von zwei beliebigen Plasmiden, in der gleichen Zelle zu koexistieren. Alle zwei Plasmide, die die gleiche Inkompatibilitätsgruppe bilden, können nicht in der gleichen Zelle gehalten werden. Plasmide von unterschiedlichen „Inkompatibilitätsgruppen" können zur gleichen Zeit in der gleichen Zelle sein. Inkompatibilitätsgruppen sind am ausgiebigsten für konjugative Plasmide in den gram-negativen Bakterien ausgearbeitet.
Der Begriff „Actinomycetales-Bakterienfamilie" bedeutet eine Bakterienfamilie, bestehend aus den Gattungen, einschließlich, ohne aber darauf begrenzt zu sein, Actinomyces, Actinoplanes, Arcanobacterium, Corynebacterium, Dietzia, Gordonia, Mycobacterium, Nocardia, Rhodococcus, Tsukamurella, Brevibacterium, Arthrobacter, Propionibacterium, Streptomyces, Micrococcus und Micromonospora.
NUCLEINSÄUREN DER ERFINDUNG
Die Anmelder haben eine Nucleinsäure, codierend ein einzigartiges Replikationsprotein, rep, innerhalb eines neuen Rhodococcus-Plasmids der Erfindung identifiziert und isoliert. Diese Replikationsprotein codierende Nucleinsäure kann in einer Vielfalt von Klonierungs- und Expressionsvektoren und insbesondere in Shuttle-Vektoren für die Expression von homologen und heterologen Genen in Rhodococcus sp. und ähnlichen Organismen verwendet werden. Vergleiche der Nucleotid- und Aminosäuresequenzen des vorliegenden Replikationsproteins zeigten an, daß die Sequenz einzigartig war, wobei sie nur 51% Identität und eine 35%-Ähnlichkeit mit dem 459-Aminosäuren-Rep-Protein von Arcanobacterium pyogenes (Billington, S. J., et al., J. Bacteriol. 180, 3233–3236, 1998), wie ausgerichtet über den Algorithmus der Smith-Waterman-Ausrichtung (W. R. Pearson, Comput. Methods Genome Res., [Proc. Int. Symp.] (1994), Meeting Date 1992, 111–20. Herausgeber: Suhai, Sandor. Verleger: Plenum, New York, NY), hat.
Die Anmelder haben eine Nucleinsäure, codierend ein einzigartiges Plasmidstabilitätsprotein mit Homologie zu einem mutmaßlichen Zellteilungs-(div)-Protein innerhalb eines neuen Rhodococcus-Plasmids der Erfindung identifizier und isoliert. Das Stabilitätsprotein ist einzigartig im Vergleich zu Sequenzen in der öffentlichen Datenbank mit nur 24% Identität und einer 40%-Ähnlichkeit mit dem C-terminalen Anteil des mutmaßlichen 529-Aminosäuren-Zellteilungs-Proteins aus Haemophilus influenzae (Fleischmann et al., Science 269 (5223), 496–512 (1995)).
So ist eine Sequenz innerhalb des Umfangs der Erfindung, wenn sie eine Replikationsfunktion codiert und eine Nucleotidsequenz, codierend ein Polypeptid aus mindestens 379 Aminosäuren, umfaßt, das mindestens 70% Identität, basierend auf der Smith-Waterman-Methode der Ausrichtung (W. R. Pearson, supra) im Vergleich zu einem Polypeptid mit der Sequenz, wie sie in SEQ ID NO:2 angegeben ist, oder einer zweiten Nucleotidsequenz, umfassend das Komplement der ersten Nucleotidsequenz, hat.
Ähnlich ist eine Sequenz innerhalb des Umfangs der Erfindung, wenn sie eine Stabilitätsfunktion codiert und eine Nucleotidsequenz, codierend ein Polypeptid aus mindestens 296 Aminosäuren, umfaßt, die mindestens 70% Identität, basierend auf der Smith-Waterman-Methode der Ausrichtung (W. R. Pearson, supra), im Vergleich zu einem Polypeptid mit der Sequenz, wie sie in SEQ ID NO:4 angegeben ist, oder einer zweiten Nucleotidsequenz, umfassend das Komplement der ersten Nucleotidsequenz, hat.
Demgemäß sind bevorzugte Aminosäurefragmente zu mindestens etwa 70%–80% identisch mit den Sequenzen hier. Am meisten bevorzugt sind Aminosäurefragmente, die zu mindestens 90%–95% identisch mit den hier angegebenen Aminosäurefragmenten sind. Ähnlich sind bevorzugte codierende Nucleinsäuresequenzen entsprechend den vorliegenden rep- und div-Genen diejenigen, die aktive Proteine codieren und welche zu mindestens 70% identisch mit den Nucleinsäuresequenzen von den hier angegebenen sind. Stärker bevorzugte rep- oder div-Nucleinsäurefragmente sind zu mindestens 80% identisch mit den Sequenzen hier. Am meisten bevorzugt sind rep- und div-Nucleinsäurefragmente, die zu mindestens 90–95% identisch mit den hier angegebenen Nucleinsäurefragmenten sind.
Die Nucleinsäurefragmente der vorliegenden Erfindung können verwendet werden, um Gene, codierend homologe Proteine aus der gleichen oder einer anderen mikrobiellen Art, zu isolieren. Isolierung von homologen Genen unter Verwendung sequenzabhängiger Protokolle ist auf dem Fachgebiet bekannt. Zu Beispielen von sequenzabhängigen Protokollen gehören, ohne aber darauf beschränkt zu sein, Verfahren der Nucleinsäurehybridisierung und Verfahren der DNA- und RNA-Amplifikation, wie durch verschiedene Verwendungen von Technologien der Nucleinsäureamplifikation [z.B. Polymerasekettenreaktion, Mullis et al., US-Patentschrift 4683202; Ligasekettenreaktion (LCR), Tabor, S., et al., Proc. Acad. Sci. USA 82, 1074, (1985)] oder Strangverdrängungsamplifikation [SDA, Walker et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 89, 392, (1992)] beispielhaft veranschaulicht wird.
Zum Beispiel könnten Gene, die ähnliche Proteine oder Polypeptide wie diejenigen der vorliegenden Erfindung codieren, direkt isoliert werden, indem alle oder ein Anteil der vorliegenden Nucleinsäurefragmente als DNA-Hybridisierungssonden verwendet werden, um unter Verwendung von dem Fachmann bekannter Methodik Genbanken nach allen gewünschten Bakterien zu screenen. Spezifische Oligonucleotidsonden, basierend auf den vorliegenden Nucleinsäuresequenzen, können durch auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren (Maniatis, supra 1989) gestaltet und synthetisiert werden. Darüber hinaus können die ganzen Sequenzen direkt verwendet werden, um durch dem Fachmann bekannte Verfahren, wie beispielsweise DNA-Markierung mit statistischen Primern, Nick-Translation oder Endmarkierungstechniken, DNA-Sonden oder unter Verwendung verfügbarer in-vitro-Transkriptionssysteme RNA-Sonden zu synthetisieren. Außerdem können spezielle Primer gestaltet und verwendet werden, um einen Teil oder die volle Länge der vorliegenden Sequenzen zu amplifizieren. Die entstehenden Amplifikationsprodukte können direkt während Amplifikationsreaktionen markiert oder nach Amplifikationsreaktionen markiert und als Sonden verwendet werden, um unter Bedingungen geeigneter Stringenz DNA-Fragmente mit voller Länge zu isolieren.
Typischerweise haben in Amplifikationstechniken vom PCR-Typ die Primer unterschiedliche Sequenzen und sind nicht komplementär miteinander. Abhängig von den gewünschten Testbedingungen sollten die Sequenzen der Primer gestaltet sein, um sowohl wirksame als auch getreue Replikation der Zielnucleinsäure bereitzustellen. Verfahren der PCR-Primer-Gestaltung sind allgemein gebräuchlich und auf dem Fachgebiet bekannt. (Thein und Wallace, „The use of oligonucleotide as specific hybridization probes in the Diagnosis of Genetic disorders" („Die Verwendung von Oligonucleotid als spezifische Hybridisierungssonden in der Diagnose genetischer Erkrankungen"), in Human Genetic Diseases: A Practical Approach (Genetische Erkrankungen beim Menschen: Eine praktische Herangehensweise), K. E. Davis, Hrsg., (1986) S. 33–50 IRL Press, Herndon, Virginia); Rychlik, W. (1993) in White, B. A. (Hrsg.), Methods in Molecular Biology (Methoden in der Molekularbiologie), Bd. 15, Seite 31–39, PCR Protocols: Current Methods and Applications (PCR-Protokolle: Gegenwärtige Methoden und Anwendungen). Humania Press, Inc., Totowa, NJ).
Im allgemeinen können zwei kurze Segmente der vorliegenden Sequenzen in Polymerasekettenreaktions-(PCR)-Protokollen verwendet werden, um homologe Gene aus DNA oder RNA codierende längere Nucleinsäurefragmente zu amplifizieren. Die Polymerasekettenreaktion kann auch an einer Genbank von klonierten Nucleinsäurefragmenten durchgeführt werden, wobei die Sequenz eines Primers von den vorliegenden Nucleinsäurefragmenten abgeleitet ist und die Sequenz des anderen Primers die Anwesenheit der Polyadenylsäureabschnitte an dem 3'-Ende des mikrobielle Gene codierenden mRNA-Vorläufers ausnutzt. Alternativ kann die zweite Primersequenz auf Sequenzen basieren, die von dem Klonierungsvektor abgeleitet sind. Zum Beispiel kann der Fachmann dem RACE-Protokoll [Frohman et al., PNAS USA 85:8998 (1988)] folgen, um cDNAs zu erzeugen, indem PCR verwendet wird, um Kopien der Region zwischen einem einzelnen Punkt in dem Transkript und dem 3'- oder 5'-Ende zu amplifizieren. Primer, die in der 3'- und 5'-Richtung orientiert sind, können aus den vorliegenden Sequenzen gestaltet werden. Unter Verwendung von im Handel erhältlichen 3'-RACE- oder 5'-RACE-Systemen (BRL) können spezifische 3'- oder 5'-cDNA-Fragmente isoliert werden [Ohara et al., PNAS USA 86:5673 (1989); Loh et al., Science 243:217 (1989)].
Alternativ können die vorliegenden Sequenzen als Hybridisierungsreagenzien für die Identifizierung von Homologen angewendet werden. Zu den grundlegenden Komponenten eines Nucleinsäurehybridisierungstests gehören eine Sonde, eine Probe, von der vermutet wird, daß sie das interessierende Gen oder Genfragment enthält, und ein spezifisches Hybridisierungsverfahren. Sonden der vorliegenden Erfindung sind typischerweise einsträngige Nucleinsäuresequenzen, welche komplementär zu den nachzuweisenden Nucleinsäuresequenzen sind. Sonden sind mit der nachzuweisenden Nucleinsäuresequenz „hybridisierbar". Die Sondenlänge kann von 5 Basen bis zu Zehntausenden von Basen variieren und hängt von dem auszuführenden speziellen Test ab. Typischerweise ist eine Sondenlänge von etwa 15 Basen bis etwa 30 Basen geeignet. Nur ein Teil des Sondenmoleküls muß mit der nachzuweisenden Nucleinsäuresequenz komplementär sein. Außerdem braucht die Komplementarität zwischen der Sonde und der Zielsequenz nicht perfekt zu sein. Hybridisierung erfolgt zwischen unperfekt komplementären Molekülen mit dem Ergebnis, daß eine bestimmte Fraktion der Basen in der hybridisierten Region nicht mit der richtigen komplementären Base gepaart wird.
Hybridisierungsverfahren sind gut definiert und sind vorstehend beschrieben worden. Typischerweise müssen die Sonde und die Probe unter Bedingungen gemischt werden, welche Nucleinsäurehybridisierung gestatten. Dies beinhaltet Inkontaktbringen der Sonde und der Probe in Anwesenheit eines anorganischen oder organischen Salzes unter den richtigen Konzentrations- und Temperaturbedingungen. Die Nucleinsäuren der Sonde und der Probe müssen für eine Zeit in Kontakt sein, die lang genug ist, daß eine mögliche Hybridisierung zwischen den Nucleinsäuren der Sonde und der Probe erfolgen kann. Die Konzentration von Sonde oder Ziel in dem Gemisch bestimmt die Zeit, die notwendig ist, damit die Hybridisierung erfolgt. Je höher die Konzentration von Sonde oder Ziel ist, desto kürzer ist die benötigte Inkubationszeit der Hybridisierung. Gegebenenfalls kann ein chaotropes Mittel hinzugegeben werden. Das chaotrope Mittel stabilisiert Nucleinsäuren durch Hemmen der Nucleaseaktivität. Weiterhin erlaubt das chaotrope Mittel empfindliche und stringente Hybridisierung kurzer Oligonucleotidsonden bei Raumtemperatur [Van Ness und Chen (1991), Nucl. Acids Res. 19:5143–5151]. Zu geeigneten chaotropen Mitteln gehören unter anderem Guanidiniumchlorid, Guanidiniumthiocyanat, Natriumthiocyanat, Lithiumtetrachloracetat, Natriumperchlorat, Rubidiumtetrachloracetat, Kaliumiodid und Cäsiumtrifluoracetat. Typischerweise ist das chaotrope Mittel mit einer Endkonzentration von etwa 3M vorhanden. Wenn gewünscht kann man Formamid zu dem Hybridisierungsgemisch hinzufügen, typischerweise 30–50% (Vol./Vol.).
Verschiedene Hybridisierungslösungen können angewendet werden. Typischerweise umfassen diese von etwa 20 bis 60 Volumen-%, vorzugsweise 30%, eines polaren organischen Lösungsmittels. Eine allgemein gebräuchliche Hybridisierungslösung wendet etwa 30–50% Vol./Vol. Formamid, etwa 0,15 bis 1M Natriumchlorid, etwa 0,05 bis 0,1 M Puffer, wie beispielsweise Natriumcitrat, Tris-HCl, PIPES oder HEPES (pH-Bereich etwa 6–9), etwa 0,05 bis 0,2% Detergens wie beispielsweise Natriumdodecylsulfat oder zwischen 0,5–20 ml EDTA, FICOLL (Pharmacia Inc.) (etwa 300–500 Kilodalton), Polyvinylpyrrolidon (etwa 250–500 kdal) und Serumalbumin an. Ebenfalls eingeschlossen in die typische Hybridisierungslösung sind unmarkierte Trägernucleinsäuren von etwa 0,1 bis 5 mg/ml, fragmentierte Nuclein-DNA, z.B. Kalbsthymus- oder Lachssperma-DNA oder Hefe-RNA und gegebenenfalls von etwa 0,5 bis 2% Gew./Vol. Glycin. Andere Zusatzstoffe können ebenfalls eingeschlossen werden, wie beispielsweise Volumenausschlußmittel, welche eine Vielfalt von polaren wasserlöslichen oder quellbaren Mitteln, wie beispielsweise Polyethylenglycol, anionische Polymere wie beispielsweise Polyacrylat oder Polymethylacrylat und anionische saccharidische Polymere wie beispielsweise Dextransulfat einschließen.
Nucleinsäurehybridisierung ist an eine Vielfalt von Assayformaten anpaßbar. Eines der am meisten geeigneten ist das Sandwich-Assayformat. Das Sandwich-Assay ist besonders an Hybridisierung unter nicht denaturierenden Bedingungen anpaßbar. Eine primäre Komponente eines Assays vom Sandwich-Typ ist ein fester Träger. Der feste Träger weist eine auf ihm adsorbierte oder kovalent an ihn gekoppelte immobilisierte Nucleinsäuresonde auf, die unmarkiert und komplementär zu einem Teil der Sequenz ist.
PLASMIDE UND VEKTOREN DER ERFINDUNG
Plasmide, die für Genexpression in Bakterien verwendbar sind, können entweder selbstreplizierende (autonom replizierende) Plasmide oder chromosomal integriert sein. Die selbstreplizierenden Plasmide haben den Vorteil, mehrfache Kopien von interessierenden Genen zu haben, und daher kann das Expressionsniveau sehr hoch sein. Chromosomenintegrationsplasmide werden durch Rekombination in das Genom integriert. Sie haben den Vorteil stabil zu sein, aber sie können an einem niedrigeren Niveau der Expression leiden. In einer bevorzugten Ausführungsform sind Plasmide oder Vektoren gemäß der vorliegenden Erfindung selbstreplizierend und werden gemäß den Verfahren der Erfindung verwendet.
Vektoren oder Plasmide, die für die Transformation geeigneter Wirtszellen verwendbar sind, sind auf dem Fachgebiet bekannt. Typischerweise enthält der Vektor oder das Plasmid Sequenzen, die Transkription und Translation des relevanten Gens lenken, einen auswählbaren Marker und Sequenzen, die autonome Replikation oder chromosomale Integration erlauben. In einer speziellen Ausführungsform umfaßt das Plasmid oder der Vektor eine Nucleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung. Geeignete Vektoren umfassen eine Region 5' von dem Gen, welche transkriptionale Initiationskontrollen beherbergt, und eine Region 3' von dem DNA-Fragment, welche transkriptionale Terminierung kontrolliert. Es wird am meisten bevorzugt, wenn beide Kontrollregionen von Genen abgeleitet sind, die homolog zu der transformierten Wirtszelle sind, obwohl es selbstverständlich ist, daß derartige Kontrollregionen nicht von den Genen abgeleitet zu sein brauchen, die nativ für die als Produktionswirt ausgewählte spezielle Art sind. Vektoren der vorliegenden Erfindung enthalten zusätzlich, wie vorstehend beschrieben, ein einzigartiges Replikationsprotein (rep), das die Replikation des Vektors in dem Rhodococcus-Wirt erleichtert. Außerdem umfassen die vorliegenden Vektoren eine Stabilitätskodierungssequenz, die zum Aufrechterhalten der Stabilität des Vektors in dem Wirt verwendbar ist und einen bedeutsamen Grad der Homologie mit mutmaßlichen Zellteilungsproteinen hat. Die Vektoren der vorliegenden Erfindung enthalten bequeme Restriktionsstellen für die leichte Insertion von interessierenden Genen, die in dem Rhodococcus-Wirt exprimiert werden sollen.
Die vorliegende Erfindung betrifft zwei spezielle Plasmide, pAN12, isoliert aus einem Rhodococcus-erythropolis-Wirt, und daraus abgeleitete und konstruierte Shuttle-Vektoren. Der pAN12-Vektor enthält einen einzigartigen Ori sowie Replikations- und Stabilitätssequenzen für Rhodococcus, während die Shuttle-Vektoren zusätzlich einen Replikationsursprung (ORI) für Replikation in E. coli und antibiotische Resistenzmarker für Selektion in Rhodococcus und E. coli enthalten.
Bakterielle Plasmide reichen typischerweise in der Größe von etwa 1 kb bis etwa 200 kb und sind im allgemeinen autonom replizierende genetische Einheiten in dem bakteriellen Wirt. Wenn ein bakterieller Wirt identifiziert worden ist, der ein wünschenswerte Gene enthaltendes Plasmid enthalten kann, werden Kulturen von Wirtszellen gezüchtet, lysiert und das Plasmid von dem zellulären Material gereinigt. Wenn das Plasmid von der Sorte mit der hohen Kopienzahl ist, ist es möglich, es ohne zusätzliche Amplifikation zu reinigen. Wenn zusätzliche Plasmid-DNA benötigt wird, kann eine Bakterienzelle in Anwesenheit eines Proteinsyntheseinhibitors wie beispielsweise Chloramphenical, gezüchtet werden, welches die Proteinsynthese der Wirtszelle hemmt und zusätzliche Kopien des herzustellenden Plasmids erlaubt. Die Zell-Lyse kann entweder enzymatisch (d.h. Lysozym) in Anwesenheit eines milden Detergens, durch Kochen oder Behandlung mit starker Base bewerkstelligt werden. Das ausgewählte Verfahren hängt von einer Anzahl von Faktoren ab, zu denen die charakteristischen Eigenschaften der Wirtsbakterien und die Größe des zu isolierenden Plasmids gehören.
Nach der Lyse kann die Plasmid-DNA durch Gradientenzentrifugation (CsCl-Ethidiumbromid zum Beispiel) oder durch Phenol:Chloroform-Lösungsmittelextraktion gereinigt werden. Außerdem kann Größen- oder Ionenaustauschchromatographie ebenso wie differentielle Trennung mit Polyethylenglycol verwendet werden.
Sobald die Plasmid-DNA gereinigt worden ist, kann das Plasmid durch Restriktionsenzymanalyse analysiert und sequenziert werden, um die Sequenz der auf dem Plasmid enthaltenen Gene und die Position jeder Restriktionsstelle zu bestimmen, um eine Plasmid-Restriktionskarte zu erzeugen. Verfahren zum Konstruieren oder Isolieren von Vektoren sind allgemein gebräuchlich und auf dem Fachgebiet bekannt (siehe zum Beispiel Manitas, supra, Kapitel 1; Rohde, C., World J. Microbiol. Biotechnol. (1995), 11(3), 367–9); Trevors, J. T., J. Microbiol. Methods (1985), 3 (5–6), 259–71).
Unter Verwendung dieser allgemeinen Verfahren wurde das 6,3-kb-pAN12 aus Rhodococcus erythropolis AN12 isoliert, gereinigt und kartiert (siehe 1) und die Position der Restriktionsstellen bestimmt (siehe Tabelle 1, nachstehend).
TABELLE 1. RESTRIKTIONSENDONUCLEASE-SPALTUNG VON PAN12 (SEQ ID NO:5)
Sobald kartiert, können isolierte Plasmide auf einer Anzahl von Wegen modifiziert werden. Unter Verwendung der existierenden Restriktionsstellen können spezifische Gene, gewünscht für eine Expression in der Wirtszelle, innerhalb des Plasmids insertiert werden. Außerdem können unter Verwendung von auf dem Fachgebiet bekannten Techniken neue oder andersartige Restriktionsstellen in dem Plasmid hergestellt werden, um die Geninsertion zu erleichtern. Viele native bakterielle Plasmide enthalten Gene, die Resistenz oder Empfindlichkeit gegenüber verschiedenen Antibiotika codieren. Jedoch kann es nützlich sein, zusätzliche auswählbare Marker zu insertieren, um die existierenden mit anderen zu ersetzen. Zu in der vorliegenden Erfindung verwendbaren auswählbaren Markern gehören, ohne aber darauf begrenzt zu sein, Gene, die antibiotische Resistenz oder Empfindlichkeit übertragen, Gene, die eine auswählbare Markierung wie beispielsweise eine Farbe (z.B. lac) oder Licht (z.B. Luc; Lux) codieren, oder Gene, die Proteine codieren, die ein besonderes phänotypisches metabolisches oder morphologisches Merkmal übertragen. Im allgemeinen werden Marker, die in sowohl gram-negativen als auch gram-positiven Wirten auswählbar sind, bevorzugt. Besonders geeignet in der vorliegenden Erfindung sind Marker, die antibiotische Resistenz oder Empfindlichkeit codieren, einschließlich, ohne aber darauf begrenzt zu sein, Ampicillin-Resistenzgen, Tetracyclin-Resistenzgen, Chloramphenicol-Resistenzgen, Kanamycin-Resistenzgen und Thiostrepton-Resistenzgen.
Plasmide der vorliegenden Erfindung enthalten ein interessierendes Gen, das in dem Wirt exprimiert werden soll. Die zu exprimierenden Gene können entweder nativ oder endogen für den Wirt oder fremde oder heterologe Gene sein. Besonders geeignet sind Gene, die Enzyme codieren, die mit verschiedenartigen Synthese- oder Abbauwegen verbunden sind.
Zu endogenen Genen, die von Interesse für die Expression in einem Rhodococcus unter Verwendung von Vektoren und Verfahren der Anmelder sind, gehören, ohne aber darauf begrenzt zu sein: a) Gene, die Enzyme codieren, die an der Erzeugung von Isoprenoidmolekülen beteiligt sind, zum Beispiel kann das 1-Desoxyxylulose-5-phosphat-Synthase-Gen (dxs), in Rhodococcus exprimiert werden, wobei der hohe Fluß für den Isoprenoidweg in diesem Organismus ausgenutzt wird; b) Gene, die Polyhydroxyalkansäure-(PHA)-Synthasen (phaC) codieren, welche auch für die Herstellung von biologisch abbaubaren Kunststoffen exprimiert werden können; c) Gene, die Carotinoidweg-Gene (eg, crtl) codieren, können exprimiert werden, wobei die Pigmenterzeugung in Rhodococcus vergrößert wird; d) Gene, die Nitrilhydratasen codieren, für die Erzeugung von Acrylamid in Rhodococcus und dergleichen, und d) Gene, die Monooxygenasen codieren, die von Bakterien des Abwasserstroms abgeleitet sind.
Zu heterologen Genen, die von Interesse für die Expression in einem Rhodococcus sind, gehören, ohne aber darauf begrenzt zu sein: a) Ethylen erzeugendes Enzym (efe) aus Pseudomonas syringae für die Ethylenerzeugung, b) Pyruvatdecarboxylase (pdc), Alkoholdehydrogenase (adh) für die Alkoholerzeugung, c) Terpensynthasen aus Pflanzen für die Erzeugung von Terpenen in Rhodococcus, d) Cholesteroloxidase (choD) aus Mycobacterium tuberculosis für die Erzeugung des Enzyms in Rhodococcus; und dergleichen und e) Gene, die Monooxygenasen codieren, die von Bakterien des Abwasserstroms abgeleitet sind.
Die Plasmide oder Vektoren gemäß der Erfindung können weiterhin mindestens einen Promotor, geeignet zum Steuern der Expression eines Gens in Rhodococcus, umfassen. Typischerweise werden diese Promotoren, die die Initiationskontrollregionen einschließen, von einer Rhodococcus sp. abgeleitet sein. Terminationskontrollregionen können ebenfalls von verschiedenen Genen, nativ für die bevorzugten Wirte, abgeleitet sein. Gegebenenfalls kann eine Terminationsstelle unnötig sein, jedoch wird am meisten bevorzugt, wenn sie eingeschlossen ist.
Gegebenenfalls kann gewünscht werden, das vorliegende Genprodukt als Sekretionsprodukt des transformierten Wirts herzustellen. Sekretion von gewünschten Proteinen in das Wachstumsmedium hat die Vorteile vereinfachter und weniger kostspieliger Reinigungsprozeduren. Es ist auf dem Fachgebiet bekannt, daß Sekretionssignalsequenzen oftmals nützlich sind, um den aktiven Transport von exprimierbaren Proteinen durch Zellmembrane zu erleichtern. Die Erzeugung eines zur Sekretion fähigen transformierten Wirts kann durch die Einbringung einer DNA-Sequenz bewerkstelligt werden, die für ein Sekretionssignal codiert, welches in dem Wirt der Produktion des Wirts funktionell ist. Verfahren zum Auswählen passender Signalsequenzen sind auf dem Fachgebiet bekannt (siehe zum Beispiel EP 546049 ; WO 9324631). Die Sekretionssignal-DNA oder der Facilitator kann sich zwischen der expressionskontrollierenden DNA und dem vorliegenden Gen oder Genfragment und in dem gleichen Leserahmen mit dem letzteren befinden.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Plasmid oder einen Vektor, der imstande ist, zu replizieren oder zwischen mindestens zwei verschiedenen Organismen zu „shuttle" (pendeln). Shuttle-Vektoren sind verwendbar, um genetisches Material von einem Organismus zu einem anderen zu tragen. Der Shuttle-Vektor wird von anderen Vektoren durch seine Fähigkeit unterschieden, in mehr als einem Wirt zu replizieren. Dies wird durch die Anwesenheit eines Replikationsursprungs entsprechend jedem Wirt, in welchem er replizieren muß, erleichtert. Die vorliegenden Vektoren sind gestaltet, um in Rhodococcus für den Zweck der Genexpression zu replizieren. Als solche enthält jeder einen einzigartigen Replikationsursprung zur Replikation in Rhodococcus. Diese Sequenz ist in SEQ ID NO:8 angegeben. Viele von den genetischen Manipulationen für diesen Vektor können leicht in E. coli bewerkstelligt werden. Es ist daher besonders nützlich, einen Shuttle-Vektor zu haben, der einen Replikationsursprung umfaßt, der in E. coli und anderen gram-positiven Bakterien funktioniert. Eine Anzahl von ORI-Sequenzen für grampositive Bakterien ist bestimmt worden und die Sequenz für den ORI in E. coli bestimmt worden (siehe zum Beispiel Hirota et al., Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. (1981), 26, 33–48); Zyskind, J. W.; Smith, D. W., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 77, 2460–2464 (1980), GenBank ACC. NO. (GBN): J01808). Bevorzugt zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung sind diejenigen ORI-Sequenzen, die aus gram-positiven Bakterien und insbesondere den Mitgliedern der Actinomycetales-Bakterienfamilie isoliert sind. Zu Mitgliedern der Actinomycetales-Bakterienfamilie gehören zum Beispiel die Gattungen Actinomyces, Actinoplanes, Arcanobacterium, Corynebacterium, Dietzia, Gordonia, Mycobacterium, Nocardia, Rhodococcus, Tsukamurella, Brevibacterium, Arthrobacter, Propionibacterium, Streptomyces, Micrococcus und Micromonospora.
Zwei Shuttle-Vektoren werden hier beschrieben, pRhBR17 und pRhBR171, jeweils gesondert konstruiert und isoliert, aber mit den gleichen wesentlichen Merkmalen. Die vollständige Sequenz von pRhBR17 ist in SEQ ID NO:6 gegeben und die vollständige Sequenz des pRhBR171 ist in SEQ ID NO:7 gegeben.
pRhBR17 hat eine Größe von etwa 11,2 kb und die charakteristischen Eigenschaften der Spaltung mit Restriktionsenzymen, wie sie in Tabelle 2 und 2 angegeben sind.
TABELLE 2. RESTRIKTIONSENDONUCLEASE-SPALTUNG VON PRHBR17 (SEQ ID NO:6)
pRhBR171 hat eine Größe von etwa 9,7 kb und die charakteristischen Eigenschaften der Spaltung mit Restriktionsenzymen, wie sie in Tabelle 3 und 3 angegeben sind.
TABELLE 3. RESTRIKTIONSENDONUCLEASE-SPALTUNG VON PRHBR171 (SEQ ID NO:7)
Die Vektoren der vorliegenden Erfindung sind besonders nützlich bei der Expression von Genen in Rhodococcus sp. und anderen ähnlichen Bakterien. Zu Arten von Rhodococcus, die besonders geeignet zur Verwendung mit diesen Vektoren sind, gehören, ohne aber darauf beschränkt zu sein, Rhodococcus equi, Rhodococcus erythropolis, Rhodococcus opacus, Rhodococcus rhodochrous, Rhodococcus globerulus, Rhodococcus koreensis, Rhodococcus fascians und Rhodococcus ruber.
VERFAHREN ZUR GENEXPRESSION
Die Erfindung der Anmelder stellt Verfahren zur Genexpression in Wirtszellen, insbesondere in den Zellen von mikrobiellen Wirten, bereit. Expression in rekombinanten mikrobiellen Wirten kann für die Expression verschiedener Zwischenverbindungen des Weges, für die Modulation von Wegen, die bereits in dem Wirt für die Synthese von bisher unter Verwendung des Wirts nicht möglichen neuen Produkten dem Wirt für die Synthese von bisher unter Verwendung des Wirts nicht möglichen neuen Produkten existieren, nützlich sein. Außerdem können die Genprodukte für das Übertragen höherer Wachstumsausbeuten des Wirts oder für das Ermöglichen einer zu benutzenden alternativen Wachstumsart verwendbar sein.
Sobald geeignete Plasmide konstruiert sind, werden sie verwendet, um passende Wirtszellen zu transformieren. Einführung des Plasmids in die Wirtszelle kann durch bekannte Verfahrensweisen wie beispielsweise durch Tranformation, z.B. unter Verwendung von Calcium-permeabilisierten Zellen, Elektroporation, Transduktion oder durch Transfektion unter Verwendung eines rekombinanten Phagenvirus bewerkstelligt werden. (Maniatis, supra)
In einer bevorzugten Ausführungsform können die vorliegenden Vektoren mit zusätzlichen Vektoren, die ebenfalls DNA heterolog zu dem Wirt enthalten, cotransformiert werden. Es wird anerkannt, daß sich sowohl der vorliegende Vektor als auch der zusätzliche Vektor in der gleichen Inkompatibilitätsgruppe befinden müssen. Die Fähigkeit für zwei der Plasmide, in dem gleichen Wirt zu coexistieren, hängt davon ab, ob sie zu der gleichen Inkompatibilitätsgruppe gehören. Im allgemeinen sind Plasmide, die nicht um die gleichen metabolischen Elemente konkurrieren, in dem gleichen Wirt kompatibel. Für einen vollständigen Überblick der Ausgaben, die die Plasmidkoexistenz umgeben, siehe Thomas et al., Annu. Rev. Microbiol. (1987), 41, 77–101. Vektoren der vorliegenden Erfindung umfassen die rep-Protein codierende Sequenz, wie sie in SEQ ID NO:1 angegeben ist, und die ORI-Sequenz, wie sie in SEQ ID NO:8 angegeben ist. Es wird erwartet, daß jeder Vektor, der die vorliegende rep codierende Sequenz und den ORI enthält, in Rhodococcus repliziert. Jedes Plasmid, das die Fähigkeit hat, mit dem rep exprimierenden Plasmid der vorliegenden Erfindung zu coexistieren, ist in der andersartigen Kompatibilitätsgruppe als das vorliegende Plasmid und wird für die Coexpression von heterologen Genen in einem vorgegebenen Wirt verwendbar sein.
RHODOCOCCUS-TRANSFORMANTEN ALS PLATTFORM MIKROBIELLER PRODUKTION
Sobald ein geeigneter Rhodococcus-Wirt erfolgreich mit dem passenden Vektor der vorliegenden Erfindung transformiert ist, kann er auf einer Vielzahl von Wegen kultiviert werden, um die kommerzielle Produktion des gewünschten Genprodukts zu erlauben. Zum Beispiel kann die Produktion eines speziellen Genprodukts in großem Maßstab, überexprimiert aus einem rekombinanten mikrobiellen Wirt, durch Methodiken sowohl chargenweiser als auch kontinuierlicher Kultur erzeugt werden.
Ein klassisches chargenmäßiges Kultivierungsverfahren ist ein geschlossenes System, wo die Zusammensetzung des Mediums am Beginn der Kultur eingestellt wird und nicht Gegenstand künstlicher Veränderungen während des Kultivierungsprozesses ist. So wird am Beginn des Kultivierungsprozesses das Medium mit dem gewünschten Organismus oder den Organismen beimpft und es wird gestattet, daß das Wachstum oder die metabolische Aktivität erfolgen, wobei nichts zu dem System hinzugegeben wird. Typischerweise ist jedoch eine „Chargen"-Kultur eine Charge in Bezug auf die Zugabe der Kohlenstoffquelle, und es werden oft Versuche mit kontrollierenden Faktoren wie beispielsweise pH und Sauerstoffkonzentration gemacht. In Chargensystemen ändern sich die Metabolit- und Biomassezusammensetzungen des Systems konstant bis zu der Zeit, daß die Kultur beendet wird. Innerhalb von Chargenkulturen moderieren Zellen durch eine statische lag-Phase zu einer log-Phase mit hohem Wachstum und schließlich zu einer stationären Phase, wo die Wachstumsrate vermindert oder angehalten wird. Wenn unbehandelt sterben Zellen in der stationären Phase schließlich ab. Zellen in der log-Phase sind in manchen Systemen oft für die Masse der Produktion des Endprodukts oder der Zwischenverbindung verantwortlich. Produktion in der stationären oder postexponentiellen Phase kann in anderen Systemen erhalten werden.
Eine Variation des Standarchargensystems ist das Fed-Batch-System. Verfahren mit Fed-Batch-Kultur sind in der vorliegenden Erfindung ebenfalls geeignet und umfassen ein typisches Chargensystem mit der Ausnahme, daß das Substrat in Inkrementen hinzugegeben wird, wenn die Kultur voranschreitet. Fed-Batch-Systeme sind nützlich, wenn Katabolitrepression dazu neigt, den Metabolismus der Zellen zu hemmen, und wo es wünschenswert ist, begrenzte Mengen von Substrat in dem Medium zu haben. Die Messung der tatsächlichen Substratkonzentration in Fed-Batch-Systemen ist schwierig und wird daher auf der Basis der Veränderungen meßbarer Faktoren, wie beispielsweise pH, gelöster Sauerstoff und der Partialdruck von Abfallgasen wie beispielsweise CO₂, abgeschätzt. Chargen- und Fed-Batch-Kultivierungsverfahren sind allgemein gebräuchlich und auf dem Fachgebiet bekannt, und Beispiele können bei Thomas D. Brock in Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology (Biotechnologie: Ein Lehrbuch der industriellen Mikrobiologie), Zweite Auflage (1989), Sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA, oder Deshpande, Mukund V., Appl. Biochem. Biotechnol., 36, 227, (1992), hier durch Bezugnahme einbezogen, gefunden werden.
Kommerzielle Herstellung der vorliegenden Proteine kann auch mit einer kontinuierlichen Kultur bewerkstelligt werden. Kontinuierliche Kulturen sind ein offenes System, wo ein definiertes Kulturmedium kontinuierlich in einen Bioreaktor gegeben wird und eine gleiche Menge von konditioniertem Medium gleichzeitig zur Verarbeitung entnommen wird. Kontinuierliche Kulturen halten im allgemeinen die Zellen bei einer konstanten hohen Dichte der flüssigen Phase, wo die Zellen hauptsächlich im Wachstum der log-Phase sind. Alternativ kann kontinuierliche Kultur mit immobilisierten Zellen praktiziert werden, wo Kohlenstoff und Nährstoffe kontinuierlich hinzugegeben werden und wertvolle Produkte, Nebenprodukte oder Abfallprodukte kontinuierlich aus der Zellmasse entnommen werden. Zellimmobilisierung kann unter Verwendung eines breiten Bereichs von festen Trägern, bestehend aus natürlichen und/oder synthetischen Materialien, durchgeführt werden.
Kontinuierliche oder semikontinuierliche Kultur erlaubt die Modulation eines Faktors oder einer Anzahl von Faktoren, die Zeltwachstum oder Endproduktkonzentration beeinflussen. Zum Beispiel erhält ein Verfahren einen begrenzenden Nährstoff, wie beispielsweise die Kohlenstoffquelle oder das Stickstoffniveau, bei einer festgelegten Rate aufrecht und erlaubt allen anderen Parametern zu moderieren. In anderen Systemen kann eine Anzahl von Faktoren, die Wachstum beeinflussen, kontinuierlich verändert werden, während die Zellkonzentration, gemessen durch Trübung des Mediums, konstant gehalten wird. Kontinuierliche Systeme bemühen sich, Wachstumsbedingungen im stationären Zustand aufrecht zu erhalten, und so muß der Zellverlust, zurückzuführen darauf, daß das Medium abgezogen wird, gegenüber der Zellwachstumsrate in der Kultur ausgeglichen werden. Verfahren der Modulierung von Nährstoffen und Wachstumsfaktoren für Verfahren mit kontinuierlicher Kultur ebenso wie Techniken zur Maximierung der Rate der Produktbildung sind auf dem Fachgebiet der industriellen Mikrobiologie bekannt und eine Vielzahl von Methoden wird ausführlich von Brock, supra, beschrieben.
BEISPIELE
Die vorliegende Erfindung ist weiterhin in den folgenden Beispielen definiert. Es sollte selbstverständlich sein, daß diese Beispiele, wenn sie auch bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung anzeigen, lediglich zur Veranschaulichung angegeben sind. Aus der vorstehenden Diskussion und diesen Beispielen kann der Fachmann die wesentlichen charakteristischen Eigenschaften dieser Erfindung in Erfahrung bringen und kann, ohne vom Geist und Umfang davon abzuweichen, verschiedene Änderungen und Modifizierungen der Erfindung ausführen, um sie an verschiedenartige Verwendungen und Bedingungen anzupassen.
ALLGEMEINE VERFAHREN
Standardmäßige rekombinante DNA und molekulare Klonierungstechniken, die hier verwendet werden, sind auf dem Fachgebiet bekannt und sind von Sambrook, J., Fritsch, E. F., und Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Molekulares Klonieren: Ein Laborhandbuch); Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor (1989) (Maniatis) und von T. J. Silhavy, M. L. Bennan und L. W. Enquist, Experiments with Gene Fusions (Experimente mit Genfusionen), Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, NY (1984) und von Ausubel, F.M., et al., Current Protocols in Molecular Biology (Gegenwärtige Protokolle in der Molekularbiologie), veröffentlicht von der Green Publishing Assoc. and Wiley-Interscience (1987) beschrieben.
Materialien und Methoden, die für die Pflege und Aufzucht von Bakterienkulturen geeignet sind, sind auf dem Fachgebiet bekannt. Techniken, die für die Verwendung in den folgenden Beispielen geeignet sind, können gefunden werden, wie sie in Manual of Methods for General Bacteriology (Handbuch der Methoden für die allgemeine Bakteriologie) (Phillipp Gerhardt, R. G. E. Murray, Ralph N. Costilow, Eugene W. Nester, Willis A. Wood, Noel R Krieg und G. Briggs Phillips, Hrsg.), American Society for Microbiology, Washington, DC (1994)) oder von Thomas D. Brock in Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology (Biotechnologie: Ein Lehrbuch der industriellen Mikrobiologie), Zweite Auflage, Sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA (1989) dargelegt sind. Alle Reagenzien, Restriktionsenzyme und Materialien, die für die Aufzucht und Pflege von Bakterienzellen verwendet werden, wurden von Aldrich Chemicals (Milwaukee, WI), DIFCO Laboratories (Detroit, MI), GIBCO/BRL (Gaithersburg, MD) oder Sigma Chemical Company (St. Louis, MO) erhalten, wenn nicht anderweitig vorgegeben.
Manipulationen genetischer Sequenzen wurden unter Verwendung der Folge von Programmen, die von der Genetics Computer Group Inc. (Wisconsin Package Version 9.0, Genetics Computer Group (GCG), Madison, WI) erhältlich ist, ausgeführt. Wo das GCG-Programm „Pileup" verwendet wurde, wurden der Default-Wert der Lückenerzeugung von 12 und der Default-Wert der Lückenerweiterung von 4 verwendet. Wo die CGC-Programme „Gap" oder „Bestfit" verwendet wurden, wurden die Default-Lückenerzeugungsstrafe von 50 und die Default-Lückenerweiterungsstrafe von 3 verwendet. Mehrfache Ausrichtungen wurden unter Verwendung des FASTA-Programms unter Einbeziehung des Smith-Waterman-Algorithmus erzeugt (W. R. Pearson, Comput. Methods Genome Res., [Proc. Int. Symp.] (1994), Meeting Date 1992, 111–20, Herausgeber: Suhai, Sandor. Verleger: Plenum, New York, NY). In jedem Fall wurden, wo Programmparameter nicht veranlaßt wurden, in diesen oder allen anderen Programmen Default-Werte verwendet.
Die Bedeutung von Abkürzungen ist wie folgt: „h" bedeutet Stunde(n), „min" bedeutet Minute(n), „s" bedeutet Sekunde(n), „d" bedeutet Tag(e), „μl" bedeutet Mikroliter, „ml" bedeutet Milliliter, „l" bedeutet Liter, „μM" bedeutet mikromolar, „mM" bedeutet millimolar, „μg" bedeutet Mikrogramm, „mg" bedeutet Milligramm, „psi" bedeutet Pound pro Quadratfuß, „ppm" bedeutet Teile pro Million, „A" bedeutet Adenin oder Adenosin, „T" bedeutet Thymin oder Thymidin, „G" bedeutet Guanin oder Guanosin, „C" bedeutet Cytidin oder Cytosin, „x g" bedeutet mal Schwerkraft, „nt" bedeutet Nucleotid(e), „aa" bedeutet Aminosäure(n), „bp" bedeutet Basenpaar(e) und „kb" bedeutet Kilobase(n).
ISOLIERUNG VON RHODOCOCCUS ERYTHROPOLIS AN12
Der vorliegende Stamm Rhodococcus erythropolis AN12 wurde aus Abwasserschlamm isoliert, wie nachstehend in Beispiel 1 beschrieben ist.
HERSTELLUNG VON GENOMISCHER DNA ZUR SEQUENZIERUNG UND SEQUENZERZEUGUNG
Genomische DNA wurde aus Rhodococcus erythropolis AN12 entsprechend Standardprotokollen isoliert.
Genomische DNA und Genbankkonstruktion wurden entsprechend veröffentlichten Protokollen (Fraser et al. The Minimal Gene Complement of Mycoplasma genitalium (Das minimale Genkomplement von Mycoplasma genitalium); Science 270, 1995) hergestellt. Ein Zellpellet wurde in einer Lösung resuspendiert, die 100 mM Na-EDTA pH 8,0, 10 mM Tris-HCl pH 8,0, 400 mM NaCl und 50 mM MgCl₂ enthielt.
Herstellung genomischer DNA.
Nach der Resuspendierung wurden die Zellen sanft in 10% SDS lysiert und für 30 Minuten bei 55°C inkubiert. Nach Inkubation bei Raumtemperatur wurde Proteinase K (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) zu 100 μg/ml hinzugegeben und bei 37°C inkubiert, bis die Suspension klar war. DNA wurde zweimal mit Tris-äquilibriertem Phenol und zweimal mit Chloroform extrahiert. DNA wurde in 70 %igem Ethanol ausgefällt und in einer Lösung resuspendiert, die 10 mM Tris-HCl und 1 mM Na-EDTA (TE-Puffer) pH 7,5 enthielt. Die DNA-Lösung wurde mit einer Mischung von RNAasen behandelt, dann zweimal mit Tris-äquilibriertem Phenol und zweimal mit Chloroform extrahiert. Nachfolgend wurde in Ethanol ausgefällt und in TE resuspendiert.
Genbankkonstruktion.
200 bis 500 μg chromosomale DNA wurden in einer Lösung von 300 mM Natriumacetat, 10 mM Tris-HCl, 1 mM Na-EDTA und 30% Glycerol resuspendiert und in einer Aeromist-Downdraft-Nebulizer-Kammer (IBI Medical Products, Chikago, IL) der Scherwirkung mit 12 psi für 60 s ausgesetzt. Die DNA wurde ausgefällt, resuspendiert und mit Bal31-Nuclease (New England Biolabs, Beverly, MA) behandelt. Nach der Größenfraktionierung wurde eine Fraktion (2,0 kb oder 5,0 kb) ausgeschnitten, gereinigt und eine Zweistufen-Ligationsprozedur wurde verwendet, um eine Genbank mit hohem Titer mit mehr als 99% einzelnen Inserts herzustellen.
Sequenzierung.
Eine Herangehensweise mit Shotgun-Sequenzierungsstrategie wurde für die Sequenzierung des gesamten mikrobiellen Genoms angenommen (Fleischmann, Robert et al., Whole-Genome Random sequencing and assembly of Haemophilus influenzae Rd (Statistische Sequenzierung und Anordnung des gesamten Genoms von Haemophilus influenzae Rd) Science, 269:1995).
Eine Sequenz wurde auf einem automatischen ABI-Sequenzierer unter Verwendung der Farbstoffterminator-Technologie (US-Patentschrift 5366860; EP 272007 ) unter Verwendung einer Kombination von Vektor und Insert-spezifischen Primern erzeugt. Die Sequenzausgabe wurde in entweder Sequencher (Gene Codes Corporation, Ann Arbor, MI) oder dem Wisconsin-GCG-Programm (Wisconsin Package Version 9.0, Genetics Computer Group (GCG), Madison, WI) und dem CONSED-Paket (Version 7.0) durchgeführt. Alle Sequenzen stellen mindestens zweimal Deckung in beiden Richtungen dar.
Identifizierung und Charakterisierung von repA-Codierungsregionen
DNA, codierend das repA-Protein, wurde identifiziert, indem Suchen mit BLAST (Basic Local Alignment Search Tool; Altschul, S. F., et al., (1993) J. Mol. Biol. 215:403–410; siehe auch www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) für Ähnlichkeit mit Sequenzen, enthalten in der BLAST-„nr"-Datenbank (umfassend alle nicht-redundanten GenBank-CDS-Translationen, Sequenzen, abgeleitet von der Brookhaven Protein Data Bank mit 3-dimensionaler Struktur, der SWISS-PROT-Proteinsequenz-Datenbank, EMBL- und DDBJ-Datenbanken) durchgeführt wurden. Die Sequenzen wurden auf Ähnlichkeit mit allen in der „nr"-Datenbank enthaltenen öffentlich zugänglichen DNA-Sequenzen analysiert, indem der BLASTN-Algorithmus, bereitgestellt von dem National Center for Biotechnology Information (NCBI) verwendet wurde. Die DNA-Sequenzen wurden in allen Leserahmen translatiert und auf Ähnlichkeit mit allen öffentlich zugänglichen Proteinsequenzen, enthalten in der „nr"-Datenbank, verglichen, indem der BLASTX-Algorithmus (Gish, W., und States, D. J., (1993) Nature Genetics 3:266–272), bereitgestellt von der NCBI, verwendet wurde. Alle Vergleiche wurden unter Verwendung entweder des BLASTNnr- oder des BLASTXnr-Algorithmus gemacht. Die Ergebnisse des BLAST-Vergleichs sind in Tabelle 4 angegeben, die die Sequenzen zusammenfaßt, mit welchen sie die meiste Ähnlichkeit haben. Tabelle 4 zeigt Daten, basierend auf dem BLASTXnr-Algorithmus, mit Werten, angegeben in Erwartungswerten. Der Erwartungswert schätzt die statistische Signifikanz der Übereinstimmung ab, spezifiziert die Anzahl der Übereinstimmungen mit einer gegebenen Punktbewertung, die in einer Suche einer Datenbank dieser Größe absolut zufällig erwartet wird.
BEISPIEL 1
ISOLIERUNG UND CHARAKTERISIERUNG DES STAMMES AN12
Dieses Beispiel beschreibt die Isolierung des Stammes AN12 von Rhodococcus erythropolis auf der Basis seiner Fähigkeit, auf Anilin als dem einzigen Ausgangsstoff von Kohlenstoff und Energie zu wachsen. Die Analyse einer 16S-rRNA-Gensequenz zeigte an, daß der Stamm AN12 verwandt mit grampositiven Bakterien mit hohem G + C war, die zu der Gattung Rhodococcus gehören.
Bakterien, die auf Anilin wachsen, wurden aus einer Anreicherungskultur isoliert. Die Anreicherungskultur wurde erzeugt, indem 1 ml Belebtschlamm in 10 ml S12-Medium (10 mM Ammoniumsulfat, 50 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 7,0), 2 mM MgCl₂, 0,7 mM CaCl₂, 50 μM MnCh₂ 1 μM FeCl₃, 1 μM ZnCl₃, 1,72 μM CuSO₄, 2,53 μM CoCl₂, 2,42 µM Na₂MoO₂, und 0,0001% FeSO₄) in einem 125-ml-Erlenmeyerkolben mit Schraubkappe eingeimpft wurde. Der Belebtschlamm wurde von einer Abwasserbehandlungsanlage erhalten. Die Anreicherngskultur wurde mit 100 ppm Anilin, hinzugegeben direkt zu dem Kulturmedium, ergänzt und wurde bei 25°C unter Hin- und Herschütteln inkubiert. Die Anreicherungskultur wurde aufrechterhalten, indem alle 2–3 Tage 100 ppm Anilin hinzugegeben wurden.
Die Kultur wurde alle 14 Tage verdünnt, indem 9,9 ml der Kultur mit dem gleichen Volumen von S12-Medium ersetzt wurden. Bakterien, die Anilin als einzigen Ausgangsstoff von Kohlenstoff und Energie nutzen, wurden isoliert, indem Proben der Anreicherungskultur auf S12-Agar ausgebreitet wurden. Anilin wurde auf das Innere des Deckels jeder Petrischale gegeben. Die Petrischalen wurden mit Parafilm verschlossen und mit der Oberseite nach unten bei Raumtemperatur (25°C) inkubiert. Repräsentative Bakterienkolonien wurden dann auf die Fähigkeit getestet, Anilin als einzigen Ausgangsstoff von Kohlenstoff und Energie zu verwenden. Die Kolonien wurden von den für anfängliche Isolierung verwendeten ursprünglichen S12-Agarplatten auf neue S12-Agarplatten überführt und im Innenraum des Deckels jeder Petrischale mit Anilin versorgt. Die Petrischalen wurden mit Parafilm verschlossen und mit der Oberseite nach unten bei Raumtemperatur (25°C) inkubiert.
Die 16S-rRNA-Gene jedes Isolats wurden durch PCR amplifiziert und wie folgt analysiert. Jedes Isolat wurde auf R2A-Agar (Difco Laboratories, Bedford, MA) gezüchtet. Verschiedene Kolonien von einer Kulturplatte wurden in 100 μl Wasser suspendiert. Das Gemisch wurde eingefroren und dann aufgetaut. Die 16S-rRNA-Gensequenzen wurden durch PCR amplifiziert, indem ein kommerzielles Kit entsprechend den Instruktionen des Herstellers (Perkin Elmer) mit den Primern HK 12 (5'-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3') (SEQ ID NO:9) und HK 13 (5'-TACCTTGTTACGACTT-3') (SEQ ID NO:10) verwendet wurde. Die PCR wurde in einem Perkin Elmer GeneAmp 9600 durchgeführt. Die Proben wurden für 5 Minuten bei 94°C inkubiert und dann 35 Mal bei 94°C für 30 Sekunden, 55°C für 1 Minute und 72°C für 1 Minute im Kreislauf geführt. Die amplifizierten 16S-rRNA-Gene wurden gereinigt, indem ein kommerzielles Kit entsprechend den Instruktionen des Herstellers (QIAquick PCR Purification Kit) verwendet wurde, und auf einem automatisierten ABI-Sequenzer sequenziert. Die Sequenzierungsreaktionen wurden mit den Primern HK 12, HK 13 und HK 14 (5'-GTGCCAGCAGYMGCGGT-3') (SEQ ID NO:11, wo Y=C oder T, M=A oder C) initiiert. Die 16S-rRNA-Gensequenz von jedem Isolat wurde als Anfragesequenz für eine BLAST-Suche (Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389–3402 (1997)] von GenBank für ähnliche Sequenzen verwendet.
Ein 16S-rRNA-Gen des Stammes AN12 wurde sequenziert (SEQ ID NO:12) und mit anderen 16S-rRNA-Sequenzen in der GenBank-Sequenzdatenbank verglichen. Die 16S-rRNA-Gensequenz aus dem Stamm AN12 war zu mindestens 98% homolog zu den 16S-rRNA-Gensequenzen von gram-positiven Bakterien mit hohem G + C, die zu der Gattung Rhodococcus gehören.
BEISPIEL 2
ISOLIERUNG UND PARTIELLE SEQUENZIERUNG VON PLASMID-DNA AUS DEM STAMM AN12
Auf die Anwesenheit von kleiner Plasmid-DNA in dem Rhodococcus-AN12-Stamm, isoliert wie in Beispiel 1 beschrieben, wurde durch die Beobachtung der Anmelder einer DNA-Verunreinigung mit niedrigem Molekulargewicht in einer Zubereitung von genomischer DNA aus AN12 hingewiesen. Plasmid-DNA wurde nachfolgend aus dem AN12-Stamm isoliert, indem ein modifiziertes Qiagen-Plasmidreinigungsprotokoll, dargestellt wie folgt, verwendet wurde. AN12 wurde in 25 ml NBYE-Medium (0,8% Nährbrühe, 0,5% Hefeextrakt und 0,05% Tween 80) bei 30°C für 24 Stunden gezüchtet. Die Zellen wurden mit 3850 × g für 30 min zentrifugiert. Das Zellpellet wurde mit 50 mM Natriumacetat (pH 5) und 50 mM Natriumbicarbonat und KCl (pH 10) gewaschen. Das Zellpellet wurde dann in 5 ml Qiagen-P1-Lösung mit 100 μg/ml RNaseA und 2 mg/ml Lysozym resuspendiert und bei 37°C für 30 min inkubiert, um die Zell-Lyse zu sichern. Fünf ml von Qiagen-P2- und 7 ml von Qiagen-N3-Lösung wurden hinzugegeben, um chromosomale DNA und Proteine auszufällen. Plasmid-DNA wurde durch die Zugabe von 12 ml Isopropanol gewonnen. Die DNA wurde gewaschen und in 800 μl Wasser resuspendiert. Diese DNA wurde auf eine Qiagen Miniprep Spin Column aufgebracht und zweimal mit 500 μl PB-Puffer gewaschen und nachfolgend einmal mit 750 μl PE-Puffer gewaschen, um die DNA weiter zu reinigen. Die DNA wurde mit 100 μl Elutionspuffer eluiert. Ein Aliquot der DNA-Probe wurde auf einem 0,8%-Agarose-Gel untersucht und eine DNA-Bande mit kleinem Molekulargewicht wurde beobachtet.
Die DNA wurde dann mit einer Serie von Restriktionsenzymen digestiert und eine Restriktionskarte von pAN12 wird in 1 dargeboten. Wenn auch HindIII pAN12 an drei Stellen spaltet (siehe Tabelle 1), wurden nur die zwei größeren Banden für weitere Analyse gewonnen. Diese zwei HindIII-erzeugten Banden, eine von 1,7 kb und eine von 4,4 kb, wurden aus dem Agarosegel ausgeschnitten und in die HindIII-Stelle des pUC19-Vektors kloniert. Die Enden von beiden Inserts wurden aus den pUC-Konstrukten unter Verwendung des universellen M13-Primers (–20; GTAAAACGACGGCCAGT) (SEQ ID NO:13) und des reversen M13-Primers (–48; AGCGGATAACAATTTCACACAGGA) (SEQ ID NO:14) sequenziert. Consensus-Sequenzen wurden aus der Sequenzierung von zwei Klonen jedes Inserts erhalten und umfassen die Nucleotidsequenzen, wie sie in den SEQ ID Nos:15–17 angegeben sind. Die Sequenz, die von einem Ende des 4,4-kb-Inserts erhalten wurde, war schlecht und ist nicht angegeben. Die HindIII-Erkennungsstelle ist in den SEQ ID Nos:15–17 in fett hervorgehoben und unterstrichen.
BEISPIEL 3
VOLLSTÄNDIGE SEQUENZIERUNG UND BESTÄTIGUNG EINES KRYPTISCHEN PLASMIDS IM STAMM AN12
Die Sequenzen, erzeugt aus den zwei HindIII-Fragmenten der Plasmid-DNA, wurden verwendet, um die interne AN12-Genom-Datenbank von DuPont zu durchsuchen. Alle drei Sequenzen hatten 100% Übereinstimmung mit Regionen von Contig 2197 aus der Anordnung 4 von AN12-Genomsequenzen. Contig 2197 hatte eine Länge von 6334 bp. Es gab statistisch sequenzierte Klone in der Datenbank, die beide Enden von Contig 2197 überspannten, was anzeigt, daß dieses ein zirkuläres Stück von DNA ist. Die Anmelder haben das zirkuläre 6334-bp-Plasmid aus dem Stamm AN12 als pAN12 bezeichnet. Die vollständige Nucleotidsequenz von pAN12 bezeichnet die einzigartige SspI-Stelle als Position 1 und ist in SEQ ID NO:5 angegeben. Ein Ende des 1,7-kb-HindIII-Inserts (SEQ ID NO:15) stimmte mit der 6313–5592-bp-Region des Komplementstranges der pAN12-Sequenz (SEQ ID NO:5) überein. Ein anderes Ende des 1,7-kb-HindIII-Inserts (SEQ ID NO:16) stimmte mit der 4611–5133-bp-Region der pAN12-Sequenz (SEQ ID NO:5) überein. Ein Ende des 4,4-kb-HindIII-Inserts (SEQ ID NO:17) stimmte mit der 4616–4011-bp-Region des Komplementstranges der pAN12-Sequenz (SEQ ID NO:5) überein. Es wurde vorhergesagt, daß, basierend auf der vollständigen Sequenz, drei HindIII-Restriktionsstellen auf dem pAN12-Plasmid sind. Drei Restriktionsfragmente, erzeugt aus HindIII-Digest, sollten in den Größen als 4550 bp, 1687 bp und 87 bp sein. Die 4,4-bp- und 1,7-kb-Banden, die die Anmelder auf dem Gel beobachteten, stimmten gut mit den behaupteten 4550-bp- und 1687-bp-Fragmenten überein. Das 87-bp-Fragment würde auf einem 0,8%-Agarosegel nicht leicht nachgewiesen werden. Es wurde geschätzt, daß die Kopienzahl des pAN12- Plasmids rund 10 Kopien pro Zelle beträgt, basierend auf der Statistik, daß Contig 2197 mit 80x Deckung sequenziert wurde, wobei mit dem Mittelwert von etwa 8x Deckung von anderen Contigs, darstellend chromosomale Sequenzen, verglichen wurde.
BLASTX-Analyse zeigte, daß zwei offene Leserahmen (ORFs), codiert auf pAN12, eine bestimmte Homologie mit Proteinen in der „nr"-Datenbank (umfassend alle nicht-redundanten GenBank-CDS-Translationen, Sequenzen, abgeleitet von der Brookhaven Protein Data Bank mit 3-dimensionaler Struktur, SWISS-PROT-Proteinsequenz-Datenbank, EMBL, und DDBJ-Datenbanken) teilten. Ein ORF (bezeichnet rep) an dem Komplementstrang der Nucleotide 3052–1912 von SEQ ID NO:5 zeigte die größte Homologie zu dem Replikationsprotein des Plasmids pAP1, aus Arcanobacterium pyogenes (Billington, S. J., et al., J. Bacteriol. 180, 3233–3236, 1998). Der zweite ORF (bezeichnet div) an dem Komplementstrang der Nucleotide 5179 288 von SEQ ID NO:5 zeigte die größte Homologie zu einem mutmaßlichen Zellteilungsprotein aus Haemophilus influenzae, identifiziert durch genomische Sequenzierung (Fleischmann et al., Science 269 (5223), 496–512 (1995)). Es wird vorhergesagt, daß die rep-Nucleinsäure (SEQ ID NO:1) auf pAN12 ein Rep-Protein mit einer Länge von 379 Aminosäuren (SEQ ID NO:2) codiert. Es teilt eine 51%-Identität und eine 35%-Ähnlichkeit mit dem 459-Aminosäuren-Rep-Protein aus Arcanobacterium (siehe Tabelle 4). Es wird vorhergesagt, daß die div-Nucleinsäure (SEQ ID NO:3) auf pAN12 ein Div-Protein mit einer Länge von 296 Aminosäuren (SEQ ID NO:4) codiert. Es teilt nur eine 24%-Identität und eine 40%-Ähnlichkeit mit dem inneren Anteil des mutmaßlichen 529-Aminosäuren-Zellteilungsproteins aus Haemophilus (siehe Tabelle 4). TABELLE 4: BLASTX-ANALYSE DER ZWEI OFFENEN LESERAHMEN (ORFS) VON PAN 12

^a% Identität ist definiert als Prozentsatz von Aminosäuren, die zwischen den zwei Proteinen identisch sind.
^b% Ähnlichkeit ist definiert als Prozentsatz von Aminosäuren, die zwischen den zwei Proteinen identisch oder konserviert sind.
^c Erwartungswert. Der Erwartungswert schätzt die statistische Signifikanz der Übereinstimmung ab, spezifiziert die Anzahl von Übereinstimmungen mit einer gegebenen Punktbewertung, die in einer Suche einer Datenbank dieser Größe absolut zufällig erwartet werden.

BEISPIEL 4
KONSTRUKTION EINES ESCHERICHIA COLI-RHODOCOCCUS-SHUTTLE-VEKTORS MIT DEM KRYPTISCHEN Pan12-PLASMID
Ein E. coli-Rhodococcus-Shuttle-Vektor erfordert eine Gruppe von Markern für Replikationsfunktion und antibiotische Resistenz, die sowohl in E. coli als auch in Rhodococcus funktioniert. Die Anmelder haben ein kryptisches pAN12-Plasmid identifiziert, welches die Replikationsfunktion für Rhodococcus codiert. Um einen Marker für antibiotische Resistenz für Rhodococcus zu identifizieren, wurde das Plasmid pBR328 (ATCC 37517) auf E. coli getestet, um zu sehen, ob es in Rhodococcus funktionieren würde. Das Plasmid pBR328 trägt Ampicillin-, Chloramphenicol- und Tetracyclin-Resistenzmarker, die in E. coli funktionieren. pBR328 wurde mit PvuII linearisiert, welches das Chloramphenicol-Resistenzgen zerstörte und mit pAN12, digestiert mit SspI, ligierte. Der resultierende Klon wurde als pRhBR17 bezeichnet (SEQ ID NO:6).
Es wurde bestätigt, daß pRhBR17 in E. coli Ampicillin-resistent, Chloramphenicol-empfindlich und Tetracyclin-resistent war. DNA von pRhBR17 wurde aus E. coli DH10B (GIBCO, Rockville, MD) hergestellt und in Rhodococcus erythropolis (ATCC 47072) elektroporiert, welches das pAN12-Plasmid nicht enthält. Die elektrokompetenten Zellen von ATCC 47072 wurden wie folgt hergestellt:
ATCC 47072 wurde in einem Medium aus NBYE (0,8% Nährbrühe und 0,5% Hefeextrakt) + Tween 80 (0,05%) bei 30°C mit Belüftung zu einer OD600 von etwa 1,0 gezüchtet. Die Zellen wurden bei 4°C für mehr als 30 Minuten gekühlt, bevor sie durch Zentrifugation pelletiert wurden. Die Pellets wurden mit eiskaltem sterilen Wasser dreimal und eiskaltem sterilen 10 %igem Glycerol zweimal gewaschen und in 10 %igem Glycerol als Aliquots zum schnellen Gefrieren resuspendiert. Elektroporation wurde mit 50 μl kompetenter Zellen, gemischt mit 0,2–2 μg Plasmid-DNA, durchgeführt. Die verwendete Elektroporationseinstellung war ähnlich der der Elektroporation von E. coli: 200 Ohm, 25 μF und 2,5 kV für 0,2-cm-Lücken-Küvette. Nach einem Elektroporationsimpuls wurden 0,5–1 ml NBYE-Medium sofort hinzugegeben und Zellen wurden auf Eis für mindestens 5 Minuten gewonnen. Die transformierten Zellen wurden bei 30°C für 4 Stunden inkubiert, um den Macker der antibiotischen Resistenz zu exprimieren, und auf NBYE-Platten mit 5 μg/ml Tetracyclin aufgebracht. Tetracyclinresistenz-Transformanten wurden erhalten, wenn ATCC 47072 mit pRhBR17 transformiert wurde. Keine Tetracyclin-resistente Kolonie wurde für Scheintransformation von ATCC 47072 mit sterilem Wasser erhalten. Die Ergebnisse ließen vermuten, daß der Tetracyclin-Resistenzmarker auf pBR328 in Rhodococcus funktionierte und das Plasmid pRhBR17 imstande war, zwischen E. coli und Rhodococcus zu pendeln. Die Transformationsfrequenz betrug etwa 10⁶ koloniebildende Einheiten (=colony forming units) (cfu)/μg von DNA für ATCC 47072. Die Shuttle-Plasmide waren ebenfalls imstande, den AN12-Stamm, enthaltend das angeborene kryptische Plasmid pAN12, mit etwa 10-fach niedrigerer Häufigkeit zu transformieren.
BEISPIEL 5
pAN12-REPLIKON IST KOMPATIBEL MIT DEM NOCARDIOPHAGEN-Q4-REPLIKON VON pDA71
Das Replikon ist ein genetisches Element, das sich während der Replikation wie eine autonome Einheit verhält. Um die wesentlichen Elemente wie beispielsweise das Replikationsprotein und den Replikationsursprung, die die Funktion des pAN12-Replikons definieren, zu identifizieren und zu bestätigen, wurde die pAN12-Sequenz durch mehrfache Sequenzausrichtung mit anderen Plasmiden weiter untersucht. Obwohl Rep von pAN12 nur 35% Gesamtaminosäureidentität mit Rep von Arcanobacterium-Plasmid pAP1 hat, wurden durch mehrfache Sequenzausrichtung mit ClustalW fünf Motive in pAN12 Rep identifiziert, die in der pIJ101/pJV1-Familie von rolling-circle-Replikations-Plasmiden einschließlich pAP1 konserviert sind (Ilyina, T. V., et al., Nucleic Acids Research, 20:3279–3285; Billington, S. J., et al., J. Bacteriol. 180, 3233–3236, 1998) (4A). Zu einigen von den anderen Mitgliedern in dieser Familie von Plasmiden gehören pIJ101 aus Streptomyces lividans (Kendall, K. J., et al., J. Bacteriol. 170:4634–4651, 1988), pJV1aus Streptomyces phaeochromogenes (Servin-Gonzalez, L., Plasmid, 30:131–140, 1993; Servin-Gonzalez, L., Microbiology, 141:2499–2510, 1995) und pSN22 aus Streptomyces nigrifaciens (Kataoka, M., et al. Plasmid 32:559, 1994). Die Zahlen in 4A zeigen die Ausgangsaminosäure für jedes Motiv innerhalb des Rep an. Ebenfalls identifiziert wurde der mutmaßliche Replikationsursprung (Khan, S. A., Microbiol. and Mol. Biology Reviews, 61:442–455, 1997) in pAN12 durch mehrfache Sequenzausrichtung (4B). Die Zahlen in 4B zeigen die Positionen des ersten Nucleotids auf dem Plasmid für die Replikationsursprünge an. Die Replikationsursprünge in pIJ101, pJV1 und pSN22 sind kürzlich experimentell bestätigt worden (Servin-Gonzales, L., Plasmid, 30:131–140, 1993; Suzuki, I., et al., FEMS Microbiol. Lett. 150:283–288, 1997). Die GG-Dinucleotide an der Position der Nick-Stelle, wo die Replikation beginnt, werden ebenfalls in pAN 12 konserviert.
Es wurde gefunden, daß das pAN12-Replikon kompatibel mit mindestens einem anderen Rhodococcus-Replikon Q4, abgeleitet von dem Nocardiophagen, ist (Dabbs, 1990, Plasmid 23:242–247). pDA71 ist ein E. coli-Rhodococcus-Shuttle-Plasmid, konstruiert basierend auf dem Nocardiophagen-Q4-Replikon und trägt einen Chloramphenicol-Resistenzmarker, der in Rhodococcus exprimiert (ATCC 77474, Dabbs, 1993, Plasmid 29:74–79). Transformation von pDA71 in den Rhodococcus-erythropolis-Stamm AN12 und nachfolgende Plasmid-DNA-Isolierung von den Transformanten zeigte an, daß das Chloramphenicol-resistente pDA71-Plasmid (~9 kb) mit dem angeborenen 6,3-kb-pAN12-Plasmid in dem AN12-Stamm koexistierte. Außerdem wurde die Reihenfolge der Plasmideinführung in den Wirt umgekehrt. Das Chloramphenicol-resistente pDA71 wurde zuerst in den Plasmid-freien Rhodococcus-erythropolis-Stamm ATCC 47072 eingeführt. Kompetente Zellen wurden aus einem Chloramphenicol-resistenten Transformanten von ATCC 47072 (pDA71) hergestellt und dann mit dem Tetracyclin-resistenten pRhBR17-Shuttle-Plasmid, konstruiert basierend auf dem pDA71-Replikon, transformiert (Beispiel 4). Transformanten mit sowohl Chloramphenicol- als auch Tetracyclin-Resistenz wurden isoliert, was vermuten läßt, daß sowohl pDA71 als auch pRhBR17 in dem ATCC-47072-Wirt aufrecht erhalten wurden. Die Kompatibilität des pAN12-Replikons mit dem Nocardiophagen-Q4-Replikon könnte für die Coexpression verschiedener Gene in einem einzigen Rhodococcus Wirt ausgenutzt werden, wobei Shuttle-Plasmide, abgeleitet von einem pAN12-Replikon wie beispielsweise pRhBR17, und Shuttle-Plasmide, abgeleitet von dem Nocardiophagen-Q4-Replikon wie beispielsweise pDA71, verwendet werden.
BEISPIEL 6
REP AUF pAN12 IST WESENTLICH FÜR DIE SHUTTLE-VEKTOR-FUNKTION
Die früheren Beispiele demonstrierten, daß pAN12 die Replikationsfunktion in Rhodococcus für das konstruierte Shuttle-Plasmid bereitstellt. Um die wesentliche Region von pAN12 für die Shuttle-Plasmid-Funktion zu charakterisieren, haben die Anmelder in-vitro-Transposon-Mutagenese der Shuttle-Plasmide, pRhBR17, durchgeführt, wobei das GPS-1-Genom-Priming-System von den New England Biolabs (Beverly, MA) verwendet wurde. Die in-vitro-Transpositionsreaktion wurde nach den Instruktionen des Herstellers durchgeführt. Die resultierenden Transposon-Insertionen von pRhBRl7 wurden in E. coli DH10B (GIBCO, Rockville, MD) transformiert und Kanamycin-resistente Kolonien wurden durch Aufbringen auf LB-Agarplatten, umfassend 25 μg/ml Kanamycin, ausgewählt. Transposon-Insertionen in den Ampicillin-Resistenz- und Tetracyclin-Resistenzgenen wurden durch Empfindlichkeit auf Ampicillin bzw. Tetracyclin ausgescreent. Plasmid-DNA von 34 der Ampicillin-resistenten, Tetracyclin-resistenten und Kanamycin-resistenten Kolonien wurden gereinigt und die Insertionsstellen wurden durch Sequenzieren unter Verwendung des Primers N (ACTTTATTGTCATAGTTTAGATCTATTTTG; SEQ ID NO:18) komplementär zu dem rechten Ende des Transposons kartiert. Die Anmelder haben auch die Fähigkeit der Shuttle-Plasmide, umfassend die Transposon-Insertionen, getestet, Rhodococcus ATCC 47072 zu transformieren. Tabelle 5 faßt die Daten des Kartierens der Insertion und der Transformationsfähigkeit zusammen. Die Insertionsstelle auf Tabelle 5 bezeichnet die Basenpaar-(bp)-Numerierung auf dem Shuttle-Plasmid pRhBRl7 (SEQ ID NO:6), welche die Position 1 von pBR328 als Position 1 des Shuttle-Plasmids verwendet. Eine Verbindungssequenz hoher Qualität wurde für die meisten von den Insertionen erhalten, so daß der exakte Standort der Transposon-Insertionen auf den Plasmiden identifiziert werden konnte. In den Klonen 17, 33 und 37 konnte die Sequenz der Transposon-Enden, um die exakten Insertionsstellen zu kartieren, nicht identifiziert werden. TABELLE 5: KARTIERUNG DER TRANSPOSON-INSERTION VON PRHBRI7 UND DIE AUSWIRKUNGEN AUF DIE TRANSFORMATION VON RHODOCOCCUS ATCC 47072

+++ die Transformationshäufigkeit war mit der des Wildtyp-Plasmids vergleichbar.
+ die Transformationshäufigkeit nahm um etwa das 100-fache ab.
– die Transformationshäufigkeit war null.
ND die Transformationshäufigkeit wurde nicht bestimmt.

Transposon-Insertionen an den meisten Stellen des Shuttle-Plasmids hoben die Fähigkeit der Plasmide, Rhodococcus ATCC 47072 zu transformieren, nicht auf. Die Insertionen, die die Shuttle-Plasmid-Funktion aufhoben, waren in der rep-Region angehäuft. Die Klone 5, 9, 11, 12, 16 und 28 enthielten alle Transposon-Insertionen, die innerhalb des rep-Gens von pAN12 kartierten. Diese mutanten Plasmide waren nicht länger imstande, Rhodococcus ATCC 47072 zu transformieren. Klon 6 enthielt eine Insertion an 6743 bp, welche 100 bp stromaufwärts von dem Startcodon (6642 bp) der rep-Region ist. Diese Insertion zerstörte auch die Shuttle-Plasmid-Funktion, da sie sehr wahrscheinlich die Transkription des rep-Promotors unterbrach. Klon 7 enthielt eine Insertion an 5546 bp, welche sehr nahe an dem C-terminalen Ende (5502 bp) der Rep-Region ist. Die Transformationshäufigkeit dieses Plasmids war um mindestens das 100-fache vermindert. Dies ist wahrscheinlich auf die restliche Aktivität des verkürzten Rep zurückzuführen, dem wegen der Transposon-Insertion 14 Aminosäuren an dem C-terminalen Ende fehlten. Zusammenfassend zeigten die Daten an, daß die Rep-Region an dem Komplementstrang der Nucleotide 3052–1912 von pAN12 (SEQ ID NO:5) wesentlich für die Shuttle-Plasmid-Funktion in Rhodococcus war.
BEISPIEL 7: DIV AUF pAN12 IST AN DER AUFRECHTERHALTUNG DER PLASMIDSTABILITÄT BETEILIGT
Die Transposon-Insertionen innerhalb des div-Gens von pAN12 beeinflußten die Fähigkeit des Shuttle-Plasmids, Rhodococcus zu transformieren, nicht. Um zu bestimmen, ob das durch div codierte mutmaßliche Zellteilungsprotein eine Rolle in der Zellteilung, insbesondere der Plasmidpartition, spielte, wurde die Plasmidstabilität des Rhodococcus-Stammes AN12 oder ATCC 47072, umfassend ein pRhBR17-Plasmid mit unterschiedlichen Insertionen, untersucht. Nach Vermehren der Zellen in dem Medium NBYE + Tween80 mit und ohne antibiotische Selektion (Tetracyclin mit 10 μg/ml) für etwa 30 Generationen, wurden Verdünnungen (10^–4, 10^–5 und 10^–6) der Zellen auf LB-Platten ausgebracht. Kolonien, gezüchtet auf den nichtselektiven LB-Platten, wurden nachfolgend auf eine Gruppe von LB- und LB+ Tetracyclin-Platten aufgeflickt. Zweihundert Kolonien von jedem wurden auf Tetracyclin-Empfindlichkeit bewertet. Typische Vertreter der Tetracyclin-empfindlichen Zellen wurden ebenfalls untersucht, um den Verlust des Plasmids durch PCR und Plasmidisolierung zu bestätigen. Die Primer für PCR wurden basierend auf der rep-Gensequenz von pAN12 gestaltet. Ein 1,1-kb-PCR-Fragment konnte mit dem Rep1-Primer: 5'-ACTTGCGAACCGATATTATC-3' (SEQ ID NO:19) und dem Rep2-Primer: 5'-TTATGACCAGCGTAAGTGCT-3' (SEQ ID NO:20) erhalten werden, wenn das auf pAN12 basierende Shuttle-Plasmid in der Zelle vorhanden war, um als Templat zu dienen. Der Prozentsatz des Plasmids, aufrechterhalten nach 30 Generationen, ist in Tabelle 6 zusammengefaßt. Das Wildtyp-pRhBR17-Plasmid war sehr stabil in AN12 und etwas weniger stabil in ATCC 47072. Klon #15 enthielt eine Insertion in der Region stromaufwärts von dem rep auf pRhBR17 (Tabelle 5) und zeigte leicht verminderte Stabilität in sowohl AN 12 als auch ATCC 47072, vergleichbar mit der des Wildtyp-Plasmids. Sowohl das Wildtyp-pRhBR17-Plasmid als auch das Plasmid mit Insertion #15 wurden in Anwesenheit der Tetracyclin-Selektion in beiden Rhodococcus-Stämmen zu 100% aufrechterhalten. Im Gegensatz dazu enthielt Klon #23 eine Insertion, die das mutmaßliche Zellteilungsprotein div zerstörte, und zeigte verminderte Plasmidstabilität. Verlust von Plasmid wurde sogar in Anwesenheit der Tetracyclin-Selektion beobachtet. Die Stabilität wurde mehr in ATCC 47072 als in AN12 beeinflußt. Diese Ergebnisse lassen vermuten, daß das mutmaßliche Zellteilungsprotein auf pAN12 Plasmidpartitionierung während der Zellteilung reguliert und wichtig für die Aufrechterhaltung der Plasmidstabilität ist.
TABELLE 6 PLASMIDSTABILITÄT IN RHODOCOCCUS-STÄMMEN NACH 30 GENERATIONEN
BEISPIEL 8: KONSTRUKTION DES pRHBR171-SHUTTLE-VEKTORS MIT KLEINERER GRÖSSE
Transposon-Mutagenese des Shuttle-Plasmids pRhBR17 ließ vermuten, daß bestimmte Regionen des Shuttle-Plasmids nicht wesentlich für die Plasmidfunktion sein mögen (TABELLE 5). Eine der Regionen war an der Verbindung von pBR328 und pAN12. Es wurde entschieden zu untersuchen, ob diese Region des Plasmids entbehrlich war und ob die Größe des Shuttle-Plasmids zurechtgeschnitten werden könnte. Das Shuttle-Plasmid pRhBR17 wurde mit Pst I (2 Stellen/2520, 3700 bp) und mlu I (1 Stelle/4105 bp) digestiert, was drei Fragmente der folgenden Größen ergab: 9656, 1180 und 405 bp. Die digestierten DNA-Fragmente wurden nach der Instruktion des Herstellers mit Mungobohnen-Nuclease (New England Biolabs, Beverly, MA) abgestumpft. Das größte 9,7-kb-Fragment wurde auf einem Agarosegel nach der Größe aufgetrennt und unter Verwendung des Gelextraktions-Kits QIAEX II (Qiagen Inc., Valencia, CA) gereinigt. Dieses 9,7-kb-DNA-Fragment mit Deletion der Region 2520–4105 bp von pRhBR17 war selbstligiert, wobei ein zirkuläres Plasmid, bezeichnet mit pRhBR171, erzeugt wurde (3). Plasmidisolierung aus den E. coli-DH10B-Transformanten und Restriktionsenzym-Charakterisierung zeigten die korrekte Größe und das Digestionsmuster von pRhBR171. E. coli-Zellen, die das pRhBR171-Plasmid beherbergen, verloren in Anwesenheit von Ampicillin (100 μg/ml) die Fähigkeit zu wachsen, da das Pst I und Mlu I den entnommenen Teil der Codierungsregion für das Ampicillin-resistente Gen auf dem parenteralen Plasmid digestieren. Das Tetracyclin-Resistenzgen auf pRhBR171 diente als Selektionsmarker für sowohl E. coli als auch Rhodococcus. Die Transformation von pRhBR171 zu Rhodococcus wurde getestet. Es transformierte kompentente Zellen von Rhodococcus erythropolis ATCC 47072 und AN12 durch Elektroporation mit ähnlicher Häufigkeit wie verglichen mit seinem Elternplasmid pRhBR17. Diese Ergebnisse demonstrieren, daß diese Region (2520–4105 bp) von pRhBR17 nicht wesentlich war, wie durch Transposon-Mutagenese nahegelegt wurde. Sie stellte auch einen kleineren Shuttle-Vektor bereit, der bequemer zum Klonieren ist.
BEISPIEL 9: VERGRÖSSERTE CAROTINOID-PRODUKTION MIT MULTIKOPIEN-EXPRESSION VON Dxs AUF pRhBR171
Das dxs-Gen codiert 1-Desoxyxylulose-5-phosphat-Synthase, die den ersten Schritt der Synthese von 1-Desoxyxylulose-5-phosphat aus Glyceraldehyd-3-phosphat und Pyruvat-Vorverbindungen auf dem Isoprenoid-Weg für die Carotinoid-Synthese katalysiert. Das mutmaßliche dxs-Gen aus AN12 wurde auf dem Multicopy-Shuttle-Vektor pRhBR171 exprimiert und die Auswirkung der dxs-Expression auf die Carotinoid-Expression wurde bewertet.
Das dxs-Gen mit seinem nativen Promotor wurde durch PCR aus dem Rhodococcus-AN12-Stamm amplifiziert. Zwei Primer stromaufwärts, New dxs 5'-Primer: 5'-ATT TCG TTG AAC GGC TCG CC-3' (SEQ ID NO:28) und New2 dxs 5'-Primer: 5'-CGG CAA TCC GAC CTC TAC CA-3' (SEQ ID NO:29) wurden gestaltet, um die native Promotorregion von dxs mit unterschiedlichen Längen einzuschließen. Der Primer stromabwärts, New dxs 3'-Primer: 5'-TGA GAC GAG CCG TCA GCC TT-3 (SEQ ID NO:30), schloß das unterstrichene Stopcodon des dxs-Gens ein. PCR-Amplifikation von AN12-Gesamt-DNA unter Verwendung von New dxs 5' + New dxs 3' lieferte ein Produkt von 2519 bp in der Größe, welches die AN12-dxs-Codierungsregion in voller Länge und etwa 500 bp von der unmittelbaren Region stromaufwärts (nt. #500–#3019) einschloß. Wenn das Primerpaar New2 dxs 5' + New dxs 3' verwendet wird, ist das PCR-Produkt 2985 bp in der Größe, einschließlich des vollständigen AN12-dxs-Gens und der Region etwa 1 kb stromaufwärts (nt. #34–#3019). Beide PCR-Produkte wurde in dem pCR2.1-TOPO- Klonierungsvektor entsprechend der Instruktion des Herstellers (Invitrogen, Carlsbad, CA) kloniert. Die erhaltenen Klone wurden gescreent und sequenziert. Die bestätigten Plasmide wurden mit EcoRI digestiert und die 2,5-kb- und 3,0-kb-Fragmente, enthaltend das dxs-Gen und die stromaufwärts-Region von jedem Plasmid, wurden mit dem Klenow-Enzym behandelt und in die einzigartige SspI-Stelle des E. coli-Rhodococcus-Shuttle-Plasmids pRhBR171 kloniert. Die erhaltenen Konstrukte pDCQ22 (Klone #4 und #7) und pDCQ23 (Klone #10 und #11) wurden in Rhodococcus erythropolis ATCC 47072 mit Tetracyclin-10 μg/ml-Selektion elektroporiert.
Das Pigment der Rhodococcus-Transformanten von pDCQ22 und pDCQ23 schien dunkler zu sein, wenn mit denjenigen, transformiert mit der Vektorkontrolle, verglichen wurde. Um die Carotinoidproduktion von jedem Rhodococcus-Stamm zu quantifizieren, wurde 1 ml von frisch kultivierten Zellen zu 200 ml frischem LB-Medium mit 0,05% Tween-80 und 10 μg/ml Tetracyclin hinzugegeben und bei 30°C für 3 Tage bis zur stationären Phase gezüchtet. Die Zellen wurden durch Zentrifugation bei 4000 g für 15 min pelletiert und das Feuchtgewicht wurde für jedes Zellpellet gemessen. Carotinoide wurden aus dem Zellpellet über Nacht unter Schütteln in 10 ml Aceton extrahiert und an dem Extinktionsmaximum (465 nm) quantitativ bestimmt. 465 nm ist der diagnostische Extinktionspeak für das Carotinoid, isoliert aus der Rhodococcus sp. ATCC 47072. Die Absorptionsdaten wurden verwendet, um die Menge des erzeugten Carotinoids, berechnet und normiert in jedem Stamm, basierend entweder auf dem Gewicht der Zellpaste oder der Zelldichte (OD600), zu berechnen. Die Carotinoidproduktion, berechnet nach jedem Verfahren, zeigte etwa 1,6-fache Zunahme in ATCC 47072 mit pDCQ22, welches das dxs-Gen mit der kürzeren Promotorregion enthielt.
Die Carotinoidproduktion vergrößerte sich noch mehr (2,2-fach), wenn das dxs-Gen mit der längeren Promotorregion exprimiert wurde. Es ist wahrscheinlich, daß die DNA 1 kb stromaufwärts den Promotor und einige Elemente zur Vergrößerung der Expression enthält. HPLC-Analyse bestätigte ebenfalls, daß in dem Stamm mit dxs-Expression die gleichen Carotinoide wie diejenigen des Wildtypstammes erzeugt wurden. TABELLE 2 ERZEUGUNG VON CAROTINOIDEN DURCH RHODOCOCCUS-STÄMME

^a% der Carotinoiderzeugung, basierend auf OD465nm.
^b% der Carotinoiderzeugung (OD465nm), normiert mit dem Gewicht der feuchten Zellpaste.
^c% der Carotinoiderzeugung (OD465nm), normiert mit der Zelldichte (OD600nm).
^d% der Carotinoiderzeugung (OD465nm), gemittelt aus den Normierungen mit dem Gewicht der feuchten Zellpaste und der Zelldichte

SEQUENZAUFLISTUNG

Claims

Isoliertes Nucleinsäuremolekül, codierend ein Replikationsprotein, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: (a) einer isolierten Nucleinsäure, codierend die Aminosäuresequenz, wie sie in SEQ ID NO:2 angegeben ist; (b) einer isolierten Nucleinsäure, die mit (a) unter den folgenden Hybridisierungsbedingungen hybridisiert: 0,1X SSC, 0,1% SDS, 65°C und gewaschen mit 2X SSC, 0,1% SDS und nachfolgend 0,1X SSC, 0,1% SDS; oder einer isolierten Nucleinsäure, die komplementär zu (a) oder (b) ist.
Isolierte Nucleinsäure nach Anspruch 1, wie sie in SEQ ID NO:1 angegeben ist.
Polypeptid, codiert durch die isolierte Nucleinsäure nach Anspruch 1.
Polypeptid nach Anspruch 3, wie es in SEQ ID NO:2 angegeben ist.
Isoliertes Nucleinsäuremolekül, umfassend eine erste Nucleotidsequenz, codierend ein Polypeptid von mindestens 379 Aminosäuren, das mindestens 70% Identität, basierend auf der Smith-Waterman-Methode der Ausrichtung, im Vergleich zu einem Polypeptid mit der Sequenz, wie sie in SEQ ID NO:2 angegeben ist, hat, oder eine zweite Nucleotidsequenz, umfassend das Komplement der ersten Nucleotidsequenz.
Verfahren zum Erhalt eines Nucleinsäuremoleküls, codierend ein Replikationsprotein, umfassend: (a) Sondieren einer Genbank mit dem Nucleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 oder 5; (b) Identifizieren eines DNA-Klons, der mit dem Nucleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 oder 5 hybridisiert; und (c) Sequenzieren des genomischen Fragments, das den Klon, identifiziert in Schritt (b), umfaßt, wobei das sequenzierte genomische Fragment ein Replikationsprotein codiert.
Verfahren zum Erhalt eines Nucleinsäuremoleküls, codierend ein Replikationsprotein, umfassend: (a) Synthetisieren eines mindestens einen Oligonucleotid-Primers entsprechend einem Anteil der Sequenz, wie sie in SEQ ID NO:2 angegeben ist; und (b) Amplifizieren eines Inserts, vorhanden in einem Klonierungsvektor, unter Verwendung des Oligonucleotid-Primers von Schritt (a); wobei das amplifizierte Insert einen Anteil einer Aminosäuresequenz, codierend ein Replikationsprotein, codiert.
Nucleinsäure, erhalten nach dem Verfahren der Ansprüche 6 oder 7.
Isoliertes Nucleinsäuremolekül, codierend ein Plasmidstabilitätsprotein, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: (a) einer isolierten Nucleinsäure, codierend die Aminosäuresequenz, wie sie in SEQ ID NO:4 angegeben ist; (b) einer isolierten Nucleinsäure, die mit (a) unter den folgenden Hybridisierungsbedingungen hybridisiert: 0,1X SSC, 0,1% SDS, 65°C und gewaschen mit 2X SSC, 0,1% SDS und nachfolgend 0,1X SSC, 0,1% SDS; oder einer isolierten Nucleinsäure, die komplementär zu (a) oder (b) ist.
Isolierte Nucleinsäure nach Anspruch 9, wie sie in SEQ ID NO:3 angegeben ist.
Polypeptid, codiert durch die isolierte Nucleinsäure nach Anspruch 9.
Polypeptid nach Anspruch 11, wie es in SEQ ID NO:4 angegeben ist.
Isoliertes Nucleinsäuremolekül, umfassend eine erste Nucleotidsequenz, codierend ein Polypeptid von mindestens 296 Aminosäuren, das mindestens 70% Identität, basierend auf der Smith-Waterman-Methode der Ausrichtung, im Vergleich zu einem Polypeptid mit der Sequenz, wie sie in SEQ ID NO:4 angegeben ist, hat, oder eine zweite Nucleotidsequenz, umfassend das Komplement der ersten Nucleotidsequenz.
Verfahren zum Erhalt eines Nucleinsäuremoleküls, codierend ein Plasmidstabilitätsprotein, umfassend: (a) Sondieren einer Genbank mit dem Nucleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 9 oder 13; (b) Identifizieren eines DNA-Klons, der mit dem Nucleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 9 oder 13 hybridisiert; und (c) Sequenzieren des genomischen Fragments, das den Klon, identifiziert in Schritt (b), umfaßt, wobei das sequenzierte genomische Fragment ein Plasmidstabilitätsprotein codiert.
Verfahren zum Erhalt eines Nucleinsäuremoleküls, codierend ein Plasmidstabilitätsprotein, umfassend: (a) Synthetisieren eines mindestens einen Oligonucleotid-Primers entsprechend einem Anteil der Sequenz, wie sie in SEQ ID NO:3 angegeben ist; und (b) Amplifizieren eines Inserts, vorhanden in einem Klonierungsvektor, unter Verwendung des Oligonucleotid-Primers von Schritt (a); wobei das amplifizierte Insert einen Anteil einer Aminosäuresequenz, codierend ein Plasmidstabilitätsprotein, codiert.
Nucleinsäure, erhalten nach dem Verfahren der Ansprüche 14 oder 15.
Plasmid, umfassend die Nucleinsäure nach Anspruch 1.
Plasmid, umfassend die Nucleinsäure nach Anspruch 1 und die Nucleinsäure nach Anspruch 13.
Plasmid mit der Nucleotidsequenz, wie sie in SEQ ID NO:5 angegeben ist.
Plasmid nach Anspruch 17 oder 18, weiterhin umfassend mindestens eine Nucleinsäure, codierend einen auswählbaren Marker.
Plasmid nach Anspruch 19, wobei der auswählbare Marker in sowohl gram-negativen als auch gram-positiven Bakterien auswählbar ist.
Plasmid nach Anspruch 17 oder 18, weiterhin umfassend einen Replikationsursprung, der in einem gram-positiven Bakterium funktionell ist.
Plasmid nach Anspruch 22, wobei das gram-positive Bakterium ein Mitglied der Actinomycetales-Bakterienfamilie ist.
Plasmid nach Anspruch 23, wobei das gram-positive Bakterium aus der Gruppe, bestehend aus Actinomyces, Actinoplanes, Arcanobacterium, Corynebacterium, Dietzia, Gordonia, Mycobacterium, Nocardia, Rhodococcus, Tsukamurella, Brevibacterium, Arthrobacter, Propionibacterium, Streptomyces, Micrococcus und Micromnospora, ausgewählt ist.
Plasmid nach Anspruch 17 oder 18, weiterhin umfassend mindestens einen Promotor, geeignet für die Expression eines Gens in Rhodococcus.
Plasmid mit der Nucleotidsequenz, wie sie in SEQ ID NO:6 angegeben ist.
Plasmid mit der Nucleotidsequenz, wie sie in SEQ ID NO:7 angegeben ist.
Verfahren für die Expression einer Nucleinsäure in einem Actinomycetales-Bakterium, umfassend: a) Bereitstellen eines Plasmids, umfassend: (i) die Nucleinsäure nach Anspruch 1 und die Nucleinsäure nach Anspruch 13; (ii) mindestens eine Nucleinsäure, codierend einen auswählbaren Marker; und (iii) mindestens einen Promotor, operativ verknüpft mit einem zu exprimierenden Nucleinsäurefragment; b) Transformieren eines Actinormycetales-Bakteriums mit dem Plasmid von (a); und c) Kultivieren des transformierten Actinomycetales-Bakteriums von (b) für eine Zeitlänge und unter Bedingungen, unter denen das Nucleinsäurefragment exprimiert wird.
Verfahren nach Anspruch 28, wobei das Plasmid weiterhin einen Replikationsursprung umfaßt, der in gram-positivem Bakterium funktionell ist.
Verfahren nach Anspruch 29, wobei das auswählbare Markergen aus der Gruppe, bestehend aus Ampicillin-Resistenzgen, Tetracyclin-Resistenzgen, Chloramphenicol-Resistenzgen, Kanamycin-Resistenzgen und Thiostrepton-Resistenzgen, ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 28, wobei das zu exprimierende Nucleinsäurefragment aus der Gruppe, bestehend aus Genen, codierend: Enzyme, beteiligt an der Produktion von Isoprenoidmolekülen, Polyhydroxyalkansäure-(PHA)-Synthasen, Carotinoidbiosynthese-Enzymen, Nitrilhydratasen, Ethylen erzeugendem Enzym, Pyruvatdecarboxylase, Alkoholdehydrogenase, Terpensynthasen und Cholesteroloxidase, ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 28, wobei das Actinomycetales-Bakterium aus der Gruppe, bestehend aus Actinomyces, Actinoplanes, Arcanobacterium, Corynebacterium, Dietzia, Gordonia, Mycobacterium, Nocardia, Rhodococcus, Tsukamurella, Brevibacterium, Arthrobacter, Propionibacterium, Streptomayces, Micrococcus und Micromonospora, ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 32, wobei das Actinomycetales-Bakterium aus der Gruppe, bestehend aus: Rhodococcus equi, Rhodococcus erythropolis, Rhodococcus opacus, Rhodococcus rhodochrous, Rhodococcus globerulus, Rhodococcus koreensis, Rhodococcus fascians und Rhodococcus ruber, ausgewählt ist.
Transformiertes Bakterium, umfassend das Plasmid nach Anspruch 17 oder 18.
Transformiertes Bakterium nach Anspruch 34, wobei das Bakterium ein Mitglied der Actinomycetales-Bakterienfamilie ist.
Transformiertes Bakterium nach Anspruch 35, wobei das Bakterium aus der Gruppe, bestehend aus Actinomyces, Actinoplanes, Arcanobacterium, Corynebacterium, Dietzia, Gordonia, Mycobacterium, Nocardia, Rhodococcus, Tsukamurella, Brevibacterium, Arthrobacter, Propionibacterium, Streptomyces, Micrococcus und Micromonospora, ausgewählt ist.
Transformiertes Bakterium nach Anspruch 36, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: Rhodococcus equi, Rhodococcus erythropolis, Rhodococcus opacus, Rhodococcus rhodochrous, Rhodococcus globerulus, Rhodococcus koreensis, Rhodococcus fascians und Rhodococcus ruber.
Transformiertes Bakterium nach Anspruch 34, umfassend ein zweites Plasmid, gehörend zu einer andersartigen Inkompatibilitätsgruppe.
Verfahren für die Expression einer Nucleinsäure in einem Actinomycetales-Bakterium, umfassend: a) Bereitstellen eines ersten Plasmids, umfassend: (i) die Nucleinsäure nach Anspruch 1; (ii) mindestens eine Nucleinsäure, codierend einen auswählbaren Marker; und (iii) mindestens einen Promotor, operativ verknüpft mit einem zu exprimierenden Nucleinsäurefragment; b) Bereitstellen mindestens eines anderen Plasmids in der andersartigen Inkompatibilitätsgruppe als das erste Plasmid, wobei das mindestens eine andere Plasmid umfaßt: (ii) mindestens eine Nucleinsäure, codierend einen auswählbaren Marker; und (iii) mindestens einen Promotor, operativ verknüpft mit einem zu exprimierenden Nucleinsäurefragment; c) Transformieren eines Actinomycetales-Bakteriums mit den Plasmiden von (a) und (b); und d) Kultivieren des transformierten Actinomycetales-Bakteriums von (c) für eine Zeitlänge und unter Bedingungen, unter denen das Nucleinsäurefragment exprimiert wird.
Verfahren nach Anspruch 39, wobei das Actinomycetales-Bakerium aus der Gruppe, bestehend aus Actinomyces, Actinoplanes, Arcanobacterium, Corynebacterium, Dietzia, Gordonia, Mycobacterium, Nocardia, Rhodococcus, Tsukamurella, Brevibacterium, Arthrobacter, Propionibacterium, Streptomyces, Micrococcus und Micromonospora, ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 39, wobei das mindestens eine andere Plasmid pDA7 mit der ATCC-Bezeichnung ATCC 47072 ist.