JP2003521883A - クロラムフェニコール生合成経路および遺伝子クラスターの特徴付け - Google Patents
クロラムフェニコール生合成経路および遺伝子クラスターの特徴付けInfo
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、クロラムフェニコール遺伝子クラスターおよびその使用方法を提供する。このような遺伝子クラスターはクロラムフェニコール産生に有用である。
Description
【０００１】
発明の背景
クロラムフェニコールは、ストレプトマイセス ベネズエラ（Streptomyces ve
nezuelae）により産生されるN-ジクロロアシルフェニルプロパノイド抗生物質で
ある。クロラムフェニコールを産生する他の株として、ストレプトマイセス フ
ェオクロモジェネス（Streptomyces pheochromogenes）およびストレプトマイセ
ス ベネズエラ 13Sが挙げられる。コリネバクテリウム ヒドロカルボクラスタス
（Corynebacterium hydrocarboclastus）により、コリネシンと呼ばれる関連代
謝産物が作られる。
nezuelae）により産生されるN-ジクロロアシルフェニルプロパノイド抗生物質で
ある。クロラムフェニコールを産生する他の株として、ストレプトマイセス フ
ェオクロモジェネス（Streptomyces pheochromogenes）およびストレプトマイセ
ス ベネズエラ 13Sが挙げられる。コリネバクテリウム ヒドロカルボクラスタス
（Corynebacterium hydrocarboclastus）により、コリネシンと呼ばれる関連代
謝産物が作られる。
【０００２】
クロラムフェニコールは広域抗生物質であり、ヒトにおいていくつかの副作用
が証明されているが、腸チフス、髄膜炎、および他の微生物に関連する疾患に対
して特に有効である臨床上重要な薬物である。
が証明されているが、腸チフス、髄膜炎、および他の微生物に関連する疾患に対
して特に有効である臨床上重要な薬物である。
【０００３】
以下のように、クロラムフェニコールはストレプトマイセス ベネズエラによ
り合成される。
り合成される。
【０００４】
コリスミン酸→p-アミノフェニルアラニン→p-アミノフェニルセリン→ジクロ
ロアセチル-p-アミノフェニルセリン→クロラムフェニコール
ロアセチル-p-アミノフェニルセリン→クロラムフェニコール
【０００５】
クロラムフェニコール生合成遺伝子は、ストレプトマイセス ベネズエラ ATCC
10712の染色体上に位置している。クロラムフェニコール産生がブロックされた
変異体が、ダルハウジー大学（Dalhousie University）のL．C．ヴィニング（Vi
ning）およびC．スタッタード（Stuttard）の研究室で作製されている（Doullら
、1985）。これらの変異体に存在するcml変異を用いて、この生物におけるcml遺
伝子の構成を明らかにした。接合解析および形質導入解析により、全てのcml遺
伝子が染色体上に緊密なクラスターを形成することが示された（図1、Vatsら、1
987）。
10712の染色体上に位置している。クロラムフェニコール産生がブロックされた
変異体が、ダルハウジー大学（Dalhousie University）のL．C．ヴィニング（Vi
ning）およびC．スタッタード（Stuttard）の研究室で作製されている（Doullら
、1985）。これらの変異体に存在するcml変異を用いて、この生物におけるcml遺
伝子の構成を明らかにした。接合解析および形質導入解析により、全てのcml遺
伝子が染色体上に緊密なクラスターを形成することが示された（図1、Vatsら、1
987）。
【０００６】
発明の概要
本発明は、クロラムフェニコール合成遺伝子クラスターを提供する。一態様で
は、この遺伝子クラスターは、クロラムフェニコール産生微生物のゲノムクロー
ンライブラリーを作製することと、（b）該ライブラリーに由来するクローンを
供与宿主細胞にトランスフェクトすることと、（c）トランスフェクトされた供
与宿主細胞を、クロラムフェニコール遺伝子クラスターに変異を含むクロラムフ
ェニコール産生微生物と接合させることと、（d）結果として生じる組換えクロ
ーンをクロラムフェニコール産生についてスクリーニングすることと、（e）ク
ロラムフェニコール産生について陽性のクローンから該遺伝子クラスターを単離
することを含むプロセスにより作製される。好ましい態様では、供与宿主細胞は
大腸菌（E. coli）である。好ましくは、クロラムフェニコール産生微生物はス
トレプトマイセス ベネズエラである。好ましくは、遺伝子クラスターの変異に
より、クロラムフェニコール合成経路に関与するタンパク質をコードする遺伝子
の不活化、および／またはこのような経路に関与する非機能的なタンパク質の産
生が起こる。
は、この遺伝子クラスターは、クロラムフェニコール産生微生物のゲノムクロー
ンライブラリーを作製することと、（b）該ライブラリーに由来するクローンを
供与宿主細胞にトランスフェクトすることと、（c）トランスフェクトされた供
与宿主細胞を、クロラムフェニコール遺伝子クラスターに変異を含むクロラムフ
ェニコール産生微生物と接合させることと、（d）結果として生じる組換えクロ
ーンをクロラムフェニコール産生についてスクリーニングすることと、（e）ク
ロラムフェニコール産生について陽性のクローンから該遺伝子クラスターを単離
することを含むプロセスにより作製される。好ましい態様では、供与宿主細胞は
大腸菌（E. coli）である。好ましくは、クロラムフェニコール産生微生物はス
トレプトマイセス ベネズエラである。好ましくは、遺伝子クラスターの変異に
より、クロラムフェニコール合成経路に関与するタンパク質をコードする遺伝子
の不活化、および／またはこのような経路に関与する非機能的なタンパク質の産
生が起こる。
【０００７】
本発明は、クロラムフェニコール遺伝子クラスターを含むクローンを生成する
方法をさらに提供する。該方法は、（a）クロラムフェニコール産生微生物のゲ
ノムクローンライブラリーを作製することと、（b）該ライブラリーに由来する
クローンを供与宿主細胞にトランスフェクトすることと、（c）トランスフェク
トされた供与宿主細胞を、クロラムフェニコール遺伝子クラスターに変異を含む
クロラムフェニコール産生微生物と接合させることと、（d）結果として生じる
組換えクローンをクロラムフェニコール産生についてスクリーニングすることと
、（e）クロラムフェニコール産生について陽性のクローンを単離することをさ
らに含む。
方法をさらに提供する。該方法は、（a）クロラムフェニコール産生微生物のゲ
ノムクローンライブラリーを作製することと、（b）該ライブラリーに由来する
クローンを供与宿主細胞にトランスフェクトすることと、（c）トランスフェク
トされた供与宿主細胞を、クロラムフェニコール遺伝子クラスターに変異を含む
クロラムフェニコール産生微生物と接合させることと、（d）結果として生じる
組換えクローンをクロラムフェニコール産生についてスクリーニングすることと
、（e）クロラムフェニコール産生について陽性のクローンを単離することをさ
らに含む。
【０００８】
本発明はまた、クロラムフェニコールを産生する方法を提供する。該方法は、
（a）本明細書に記載の方法により生成されたクローンを培養することと、（b）
結果として生じるクロラムフェニコールを単離することを含む。好ましい態様で
は、クロラムフェニコールの産生はストレプトマイセス ベネズエラの野生型株
と比較して増加している。
（a）本明細書に記載の方法により生成されたクローンを培養することと、（b）
結果として生じるクロラムフェニコールを単離することを含む。好ましい態様で
は、クロラムフェニコールの産生はストレプトマイセス ベネズエラの野生型株
と比較して増加している。
【０００９】
発明の詳細な説明
cml遺伝子をクローニングするために用いられたストラテジーは、cml-5変異ま
たはcml-12変異を相補し、クロラムフェニコール産生について調べることであっ
た。
たはcml-12変異を相補し、クロラムフェニコール産生について調べることであっ
た。
【００１０】
材料
VS153（trpC，cml?5）は、変異誘発によりVS35から作製されたクロラムフェニ
コール非産生株である。VS35は、野生型株（Stuttard、C FEMS．Microbiol．Let
t．20：467-470（1983））から作製された。これは、経路のp-アミノフェニルセ
リン中間体の前と、p-アミノフェニルアラニン中間体の後ろの段階でブロックさ
れている。
コール非産生株である。VS35は、野生型株（Stuttard、C FEMS．Microbiol．Let
t．20：467-470（1983））から作製された。これは、経路のp-アミノフェニルセ
リン中間体の前と、p-アミノフェニルアラニン中間体の後ろの段階でブロックさ
れている。
【００１１】
VS503（cml-12、pdx-4、hsp-11）は、野生型株から作製されたクロラムフェニ
コール非産生株である（Sushma Vats、1987 Ph．D．Thesis、Daihousie Univers
ity、Halifax、N．S．、Canada）。これは、p-アミノフェニルアラニン形成前の
段階でブロックされている。
コール非産生株である（Sushma Vats、1987 Ph．D．Thesis、Daihousie Univers
ity、Halifax、N．S．、Canada）。これは、p-アミノフェニルアラニン形成前の
段階でブロックされている。
【００１２】
DS154（trpC、cml-5、jad-1：：hygR）は、jad-1：：hyg変異の導入によりVS1
53から作製された。このノックアウトは、orf1（jad-1）内にハイグロマイシン
耐性遺伝子（hyg）（Zalacainら、1986）を挿入することにより構築された。jad
1：：hyg変異は、ストレプトマイセス ベネズエラにより産生される別の抗生物
質であるジャドマイシン（jadomycin）の産生を止めるためにVS153株に導入され
た（Hanら、1994もまた参照のこと）。
53から作製された。このノックアウトは、orf1（jad-1）内にハイグロマイシン
耐性遺伝子（hyg）（Zalacainら、1986）を挿入することにより構築された。jad
1：：hyg変異は、ストレプトマイセス ベネズエラにより産生される別の抗生物
質であるジャドマイシン（jadomycin）の産生を止めるためにVS153株に導入され
た（Hanら、1994もまた参照のこと）。
【００１３】
方法
VS153におけるcml-5変異とVS503におけるcml-12変異を相補するDNA断片のクロー
ニング a．ストレプトマイセス ベネズエラ ライブラリーの構築 ストレプトマイセス ベネズエラ ATCC10712のゲノムDNAを、標準的な方法（Ho
pwoodら、1985、「ストレプトマイセス属の遺伝子操作、実験室マニュアル（Gen
etic Manipulations of Streptomyces、a laboratory manual）」、Norwic
h、UK、John Innees Foundation）を用いて単離し、Sau3A1で部分的に消化し
た。切断されたゲノムDNAをショ糖勾配によりサイズ分画し、サイズが24kbを超
える断片をコスミドpOJ446アーム（Biermanら、1992）に連結した。このコスミ
ドアームは、最初にpOJ446をHpaIで切断し、次いで、エビアルカリホスファター
ゼで処理した後、BamHIで消化することにより調製された。結果として生じる連
結混合物をλパッケージングシステムでパッケージングし、大腸菌 STR611にト
ランスフェクトした。STR611は、DNAライブラリーをストレプトマイセス ベネズ
エラへ接合により導入するための供与株として用いられるDiversa株である。STR
611は、変異mcrC-mrrを組み込み、可動化プラスミドpUZ8002を導入することによ
りGM2163（dam）株から作製された。STR611株のDNAはメチル化されておらず、従
って、高い効率でストレプトマイセス ベネズエラに導入される。
ニング a．ストレプトマイセス ベネズエラ ライブラリーの構築 ストレプトマイセス ベネズエラ ATCC10712のゲノムDNAを、標準的な方法（Ho
pwoodら、1985、「ストレプトマイセス属の遺伝子操作、実験室マニュアル（Gen
etic Manipulations of Streptomyces、a laboratory manual）」、Norwic
h、UK、John Innees Foundation）を用いて単離し、Sau3A1で部分的に消化し
た。切断されたゲノムDNAをショ糖勾配によりサイズ分画し、サイズが24kbを超
える断片をコスミドpOJ446アーム（Biermanら、1992）に連結した。このコスミ
ドアームは、最初にpOJ446をHpaIで切断し、次いで、エビアルカリホスファター
ゼで処理した後、BamHIで消化することにより調製された。結果として生じる連
結混合物をλパッケージングシステムでパッケージングし、大腸菌 STR611にト
ランスフェクトした。STR611は、DNAライブラリーをストレプトマイセス ベネズ
エラへ接合により導入するための供与株として用いられるDiversa株である。STR
611は、変異mcrC-mrrを組み込み、可動化プラスミドpUZ8002を導入することによ
りGM2163（dam）株から作製された。STR611株のDNAはメチル化されておらず、従
って、高い効率でストレプトマイセス ベネズエラに導入される。
【００１４】
b．ストレプトマイセス ベネズエラゲノムライブラリーのDS154への導入
以下のような接合プロトコールにより、ストレプトマイセス ベネズエラ ライ
ブラリーを含む大腸菌 STR611をストレプトマイセス ベネズエラ DS154（cml-5
）株と接合させた。
ブラリーを含む大腸菌 STR611をストレプトマイセス ベネズエラ DS154（cml-5
）株と接合させた。
【００１５】
ストレプトマイセス ベネズエラの胞子100μlをMYM液体培地（マルトース-酵
母エキス-麦芽エキス）0.4mlに懸濁し、50℃で10分間ヒートショック処理した。
胞子を遠心分離機で沈降させ、次いで、MYM液体培地0.4mlで1回洗浄した。大腸
菌ライブラリー細胞0.2mlをLB＋kan＋apr＋cml（ルリアブロス＋カナマイシン＋
アプラマイシン（apramycin）＋クロラムフェニコール）0.5mlに再懸濁し、シェ
ーカー中で37℃で15分間インキュベートした後、ヒートショック処理されたスト
レプトマイセス ベネズエラ胞子と混合した。次いで、ストレプトマイセス ベネ
ズエラ−大腸菌細胞混合物を遠心分離し、ペレットをMYM 0.5mlで1回洗浄し、
細胞混合物をMYM培地1．1mlに再懸濁した。続いて、この混合物を、R2-S＋Trp寒
天（R2-SはHopwoodら、1985年に記載のR2培地とほぼ同じであり、スクロースを
含まない；trpはトリプトファンである）に広げた（プレート1枚あたり0.1ml）
。接合混合物を室温で一晩増殖させた後、抗生物質であるアプラマイシン、ナリ
ジキシン酸、およびクロラムフェニコールを重層して、接合完了体（組換えクロ
ーン）だけを増殖させた。
母エキス-麦芽エキス）0.4mlに懸濁し、50℃で10分間ヒートショック処理した。
胞子を遠心分離機で沈降させ、次いで、MYM液体培地0.4mlで1回洗浄した。大腸
菌ライブラリー細胞0.2mlをLB＋kan＋apr＋cml（ルリアブロス＋カナマイシン＋
アプラマイシン（apramycin）＋クロラムフェニコール）0.5mlに再懸濁し、シェ
ーカー中で37℃で15分間インキュベートした後、ヒートショック処理されたスト
レプトマイセス ベネズエラ胞子と混合した。次いで、ストレプトマイセス ベネ
ズエラ−大腸菌細胞混合物を遠心分離し、ペレットをMYM 0.5mlで1回洗浄し、
細胞混合物をMYM培地1．1mlに再懸濁した。続いて、この混合物を、R2-S＋Trp寒
天（R2-SはHopwoodら、1985年に記載のR2培地とほぼ同じであり、スクロースを
含まない；trpはトリプトファンである）に広げた（プレート1枚あたり0.1ml）
。接合混合物を室温で一晩増殖させた後、抗生物質であるアプラマイシン、ナリ
ジキシン酸、およびクロラムフェニコールを重層して、接合完了体（組換えクロ
ーン）だけを増殖させた。
【００１６】
c．クロラムフェニコール産生についての接合完了体のバイオアッセイ
3〜4日後、接合完了体をつつき、MYM寒天＋アプラマイシンを含む大きなバイ
オアッセイプレート上に斑点状につけた。組換えクローンを30℃で3〜4日増殖さ
せた後、クローンを含むプレートに、クロラムフェニコール感受性細菌であるマ
イクロコッカス ルテウス（Micrococcus luteus）を重層した。プレートを30℃
で2日インキュベートした後、143個のクローンのうち1個のクローン（クローン1
0）が、その周りに大きな阻害区画を示したが（図2）、残りの接合完了体は阻害
区画を示さなかった。クローン10をMYM＋Apr寒天培地に再度、斑点状につけ、増
殖させ、M．luteusに対してバイオアッセイすると、再度、生物活性が観察され
た。
オアッセイプレート上に斑点状につけた。組換えクローンを30℃で3〜4日増殖さ
せた後、クローンを含むプレートに、クロラムフェニコール感受性細菌であるマ
イクロコッカス ルテウス（Micrococcus luteus）を重層した。プレートを30℃
で2日インキュベートした後、143個のクローンのうち1個のクローン（クローン1
0）が、その周りに大きな阻害区画を示したが（図2）、残りの接合完了体は阻害
区画を示さなかった。クローン10をMYM＋Apr寒天培地に再度、斑点状につけ、増
殖させ、M．luteusに対してバイオアッセイすると、再度、生物活性が観察され
た。
【００１７】
d．クローン10における生物活性がクロラムフェニコールによるものであること
を確認するための解析 クローン10を、クロラムフェニコール耐性である大腸菌 ESS株と、クロラムフ
ェニコール感受性である同質遺伝子型大腸菌 ESS株に対してバイオアッセイした
。（元のESS株はスーザン ジャンセン（Susan Jensen）博士（Univ．of Alberta
、Edmonton）およびアールノルド デマイン（Arnold Demain）博士（MIT、Cambr
idge）から入手し、Diversa社で改良された）。図2に示すように、阻害区画は、
クロラムフェニコール感受性大腸菌 ESSの場合でのみ見られたが、クロラムフェ
ニコール耐性大腸菌 ESSの場合では見られなかった。このことから、生物活性は
クロラムフェニコールによるものであることが示唆される。
を確認するための解析 クローン10を、クロラムフェニコール耐性である大腸菌 ESS株と、クロラムフ
ェニコール感受性である同質遺伝子型大腸菌 ESS株に対してバイオアッセイした
。（元のESS株はスーザン ジャンセン（Susan Jensen）博士（Univ．of Alberta
、Edmonton）およびアールノルド デマイン（Arnold Demain）博士（MIT、Cambr
idge）から入手し、Diversa社で改良された）。図2に示すように、阻害区画は、
クロラムフェニコール感受性大腸菌 ESSの場合でのみ見られたが、クロラムフェ
ニコール耐性大腸菌 ESSの場合では見られなかった。このことから、生物活性は
クロラムフェニコールによるものであることが示唆される。
【００１８】
生物活性がクロラムフェニコールによるものであるという第2の証拠はh.p.l.c
.解析により得られた。DS154クローン10とストレプトマイセス ベネズエラ ATCC
10712（陽性対照）株およびVS153（陰性対照）株を、MYM液体培地（DS154クロー
ン10の場合、アプラマイシンを添加した）で3〜4日間増殖させ、上清を固相抽出
法を用いて抽出した。抽出物をメタノールに再懸濁し、h.p.l.c.分析にかけた。
図3に示すように、DS154-クローン10は、野生型株と同様にクロラムフェニコー
ルのピーク（保持時間 10.7分）を示したが、対照株VS153は予想どおりクロラム
フェニコールを示さなかった。
.解析により得られた。DS154クローン10とストレプトマイセス ベネズエラ ATCC
10712（陽性対照）株およびVS153（陰性対照）株を、MYM液体培地（DS154クロー
ン10の場合、アプラマイシンを添加した）で3〜4日間増殖させ、上清を固相抽出
法を用いて抽出した。抽出物をメタノールに再懸濁し、h.p.l.c.分析にかけた。
図3に示すように、DS154-クローン10は、野生型株と同様にクロラムフェニコー
ルのピーク（保持時間 10.7分）を示したが、対照株VS153は予想どおりクロラム
フェニコールを示さなかった。
【００１９】
e．cml相補活性がコスミド10-4のインサート断片によるものであることについて
の確認 DS154株（クローン10）をMYM液体培地（＋アプラマイシン）で48時間増殖させ
、この菌糸体を使用し、「ストレプトマイセス属のマニュアル（The Streptomyc
es manual)」（Hopwoodら、1985）に記載の方法を用いてプラスミドDNAを調製し
た。結果として生じるプラスミドDNA調製物を使用して、エレクトロコンピテン
トDH10B細胞を形質転換した。得られたいくつかのアプラマイシン耐性コロニー
のうち20個のコロニーをプラスミドの内容について調べた。4個のコロニーが、
大きいインサートDNAを有するプラスミドを含んでいた。これらのコロニーから1
個のプラスミドpOJ446：10-4を、最初に大腸菌供与株STR611に導入し、STR611か
らストレプトマイセス ベネズエラ DS154（cml-5）およびストレプトマイセス
ベネズエラ VS503（cml-12）へ接合により導入した。コスミドpOJ446（インサー
ト断片なし）もまた、STR611からストレプトマイセス ベネズエラ DS154株およ
びDS503株へ接合により導入した。14個の接合完了体（それぞれ、DS154（pOJ446
）、DS154（pOJ446：クローン10-4）、VS503（pOJ446）、およびVS503（pOJ446
：クローン10-4））をMYM寒天＋アプラマイシンに斑点状につけ、4〜5日増殖さ
せ、クロラムフェニコール産生を検出するためにM．luteusを用いてバイオアッ
セイした。図4に示すように、クロラムフェニコールによる生物活性は、VS503（
pOJ446：クローン10）の14個のクローンのうち13個で検出されたが、ベクターの
みの対照を含むVS503の場合では検出されなかった。このことから、コスミド10-
4は、cml-12を相補するDNAインサート断片を含むことが示唆される。しかしなが
ら、VS154（クローン10-4）クローンは、ベクターのみの対照にはない不明瞭な
阻害区画が見られたが、明瞭な阻害区画を示さなかった。DS154株のcml-5変異を
相補した、ライブラリーに含まれる元のコスミド10は、DS154株中での増殖の際
に欠失もしくは再編成されたか、または大腸菌中で欠失または再編成されて、VS
503株のcml-12変異を相補できるが、VS153株のcml-5変異を部分的にしか相補し
ないコスミド10-4を生じた可能性がある。
の確認 DS154株（クローン10）をMYM液体培地（＋アプラマイシン）で48時間増殖させ
、この菌糸体を使用し、「ストレプトマイセス属のマニュアル（The Streptomyc
es manual)」（Hopwoodら、1985）に記載の方法を用いてプラスミドDNAを調製し
た。結果として生じるプラスミドDNA調製物を使用して、エレクトロコンピテン
トDH10B細胞を形質転換した。得られたいくつかのアプラマイシン耐性コロニー
のうち20個のコロニーをプラスミドの内容について調べた。4個のコロニーが、
大きいインサートDNAを有するプラスミドを含んでいた。これらのコロニーから1
個のプラスミドpOJ446：10-4を、最初に大腸菌供与株STR611に導入し、STR611か
らストレプトマイセス ベネズエラ DS154（cml-5）およびストレプトマイセス
ベネズエラ VS503（cml-12）へ接合により導入した。コスミドpOJ446（インサー
ト断片なし）もまた、STR611からストレプトマイセス ベネズエラ DS154株およ
びDS503株へ接合により導入した。14個の接合完了体（それぞれ、DS154（pOJ446
）、DS154（pOJ446：クローン10-4）、VS503（pOJ446）、およびVS503（pOJ446
：クローン10-4））をMYM寒天＋アプラマイシンに斑点状につけ、4〜5日増殖さ
せ、クロラムフェニコール産生を検出するためにM．luteusを用いてバイオアッ
セイした。図4に示すように、クロラムフェニコールによる生物活性は、VS503（
pOJ446：クローン10）の14個のクローンのうち13個で検出されたが、ベクターの
みの対照を含むVS503の場合では検出されなかった。このことから、コスミド10-
4は、cml-12を相補するDNAインサート断片を含むことが示唆される。しかしなが
ら、VS154（クローン10-4）クローンは、ベクターのみの対照にはない不明瞭な
阻害区画が見られたが、明瞭な阻害区画を示さなかった。DS154株のcml-5変異を
相補した、ライブラリーに含まれる元のコスミド10は、DS154株中での増殖の際
に欠失もしくは再編成されたか、または大腸菌中で欠失または再編成されて、VS
503株のcml-12変異を相補できるが、VS153株のcml-5変異を部分的にしか相補し
ないコスミド10-4を生じた可能性がある。
【００２０】
これらの結果から、コスミド10は、cml-12変異およびcml-5変異を相補するDNA
断片を含み、従って、他のクロラムフェニコール生合成遺伝子がコスミド10に存
在する可能性が非常に高いことが示唆される。現在、コスミド10-4のDNA配列が
解析されている。
断片を含み、従って、他のクロラムフェニコール生合成遺伝子がコスミド10に存
在する可能性が非常に高いことが示唆される。現在、コスミド10-4のDNA配列が
解析されている。
【００２１】
本明細書に引用された全ての参考文献は参照として組み入れられる。
【００２２】
参考文献
「ストレプトマイセス ベネズエラ ISP5230のp-アミノベンゾエート合成酵素
遺伝子pabABのクロラムフェニコール生合成における役割（A role for pabAB、a
p-aminobenzoate synthase gene of Streptomyces venezuelae ISP5230、in ch
loramphenicol biosynthesis）」Microbiology．1996 Jun；142（Pt6）：1345-5
5．Brown MP、Aidoo KA、ヴィニング（Vining） LC、Department of Biology、D
alhousie University、Halifax、Nova Scotia、Canada。
遺伝子pabABのクロラムフェニコール生合成における役割（A role for pabAB、a
p-aminobenzoate synthase gene of Streptomyces venezuelae ISP5230、in ch
loramphenicol biosynthesis）」Microbiology．1996 Jun；142（Pt6）：1345-5
5．Brown MP、Aidoo KA、ヴィニング（Vining） LC、Department of Biology、D
alhousie University、Halifax、Nova Scotia、Canada。
【００２３】
ストレプトマイセス ベネズエラ ISP5230の変異誘発と、スルファニルアミド
の存在下でのp-アミノ安息香酸依存性増殖の選択により、クロラムフェニコール
（Cm）を産生し続けるが、培地依存性が増したPab変異体（VS519およびVS620）
が得られた。これらの変異体を、pDQ102またはpDQ103（ストレプトマイセス ベ
ネズエラ ISP5230に由来するPab相補断片を別方向で有する）で形質転換するこ
とにより、VS620では均一に高いCm産生が回復したが、VS519ではCm産生の培地依
存性は変化しなかった。クローニングされたストレプトマイセス ベネズエラのD
NA断片をサブクローニングし、Pabを相補する最小サイズまで切り取った。結果
として生じる2．8kbのBamHI-SacI断片を配列決定した。コドン優先（codon pre
ference）解析により、670アミノ酸のポリペプチドをコードする1個の完全なORF
が明らかになった。推定アミノ酸配列とデータベースタンパク質との比較により
、N末端領域およびC末端領域がそれぞれ多数の細菌のPabAおよびPabBに似ている
ことが示された。この遺伝子産物は、ストレプトマイセス グリセウス（Strepto
myces griseus）の二次代謝に関連する融合pabAB遺伝子産物と配列全体で類似性
を示した。アプラマイシン耐性遺伝子を、分離に対して不安定なベクターにクロ
ーニングされたpabABに挿入し、ストレプトマイセス ベネズエラ染色体pabABを
破壊されたコピーで置換することにより、スルファニルアミド耐性が25μg／ml
から5μg／mlへ低下し、Cm産生がブロックされた。
の存在下でのp-アミノ安息香酸依存性増殖の選択により、クロラムフェニコール
（Cm）を産生し続けるが、培地依存性が増したPab変異体（VS519およびVS620）
が得られた。これらの変異体を、pDQ102またはpDQ103（ストレプトマイセス ベ
ネズエラ ISP5230に由来するPab相補断片を別方向で有する）で形質転換するこ
とにより、VS620では均一に高いCm産生が回復したが、VS519ではCm産生の培地依
存性は変化しなかった。クローニングされたストレプトマイセス ベネズエラのD
NA断片をサブクローニングし、Pabを相補する最小サイズまで切り取った。結果
として生じる2．8kbのBamHI-SacI断片を配列決定した。コドン優先（codon pre
ference）解析により、670アミノ酸のポリペプチドをコードする1個の完全なORF
が明らかになった。推定アミノ酸配列とデータベースタンパク質との比較により
、N末端領域およびC末端領域がそれぞれ多数の細菌のPabAおよびPabBに似ている
ことが示された。この遺伝子産物は、ストレプトマイセス グリセウス（Strepto
myces griseus）の二次代謝に関連する融合pabAB遺伝子産物と配列全体で類似性
を示した。アプラマイシン耐性遺伝子を、分離に対して不安定なベクターにクロ
ーニングされたpabABに挿入し、ストレプトマイセス ベネズエラ染色体pabABを
破壊されたコピーで置換することにより、スルファニルアミド耐性が25μg／ml
から5μg／mlへ低下し、Cm産生がブロックされた。
【００２４】
「ストレプトマイセス ベネズエラにおけるブロモペルオキシダーゼ-カタラー
ゼ遺伝子のクローニング、配列決定、および破壊：クロラムフェニコール生合成
には塩素化が必要とされない証拠（Cloning、sequencing and disruption of a
bromoperoxidase-catalase gene in Streptomyces venezuelae：evidence that
it is not required for chlorination in chloramphenicol biosynthesis）」
Microbiology．1996 Mar；142（Pt3）：657-65．ファセイ（Facey） SJ、グロス
（Gross） F、ヴィニング（Vining） LC、ヤング（Yang） K、ヴァン ピー（van
Pee） KH、Institute fur Mikrobiologie、Universitat Hohenheim、Stuttgart
、Germany。
ゼ遺伝子のクローニング、配列決定、および破壊：クロラムフェニコール生合成
には塩素化が必要とされない証拠（Cloning、sequencing and disruption of a
bromoperoxidase-catalase gene in Streptomyces venezuelae：evidence that
it is not required for chlorination in chloramphenicol biosynthesis）」
Microbiology．1996 Mar；142（Pt3）：657-65．ファセイ（Facey） SJ、グロス
（Gross） F、ヴィニング（Vining） LC、ヤング（Yang） K、ヴァン ピー（van
Pee） KH、Institute fur Mikrobiologie、Universitat Hohenheim、Stuttgart
、Germany。
【００２５】
野生型株から精製されたブロモペルオキシダーゼ-カタラーゼのN末端アミノ酸
配列に対応する合成オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションにより、ス
トレプトマイセス ベネズエラ ISP5230と、クロラムフェニコール生合成の塩素
化段階でブロックされている変異体のゲノムDNAライブラリーをプローブした。2
つの株から得られたハイブリダイズした断片をクローニングし、配列決定した。
ヌクレオチド配列の解析により、これらの断片は同じ1449bpのオープンリーディ
ングフレームを含み、ヌクレオチド配列に差違がないことが証明された。推定ポ
リペプチドは、計算分子量（M(r)）54,200の483アミノ酸をコードしていた。こ
のN末端配列は、野生型ストレプトマイセス ベネズエラから精製されたブロモペ
ルオキシダーゼ-カタラーゼのN末端配列と同一であった。クローニングされたブ
ロモペルオキシダーゼ-カタラーゼ遺伝子（bca）の推定アミノ酸配列とデータベ
ースタンパク質配列との比較により、原核生物および真核生物のカタラーゼグル
ープと有意な類似性があるが、他のペルオキシダーゼともハロペルオキシダーゼ
とも類似性がないことが示された。ストレプトマイセス ベネズエラ野生型株のb
ca遺伝子を、アプラマイシン耐性をコードするDNA断片を挿入することにより破
壊されたコピーで置換しても、クロラムフェニコール産生は阻害されなかった。
配列に対応する合成オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションにより、ス
トレプトマイセス ベネズエラ ISP5230と、クロラムフェニコール生合成の塩素
化段階でブロックされている変異体のゲノムDNAライブラリーをプローブした。2
つの株から得られたハイブリダイズした断片をクローニングし、配列決定した。
ヌクレオチド配列の解析により、これらの断片は同じ1449bpのオープンリーディ
ングフレームを含み、ヌクレオチド配列に差違がないことが証明された。推定ポ
リペプチドは、計算分子量（M(r)）54,200の483アミノ酸をコードしていた。こ
のN末端配列は、野生型ストレプトマイセス ベネズエラから精製されたブロモペ
ルオキシダーゼ-カタラーゼのN末端配列と同一であった。クローニングされたブ
ロモペルオキシダーゼ-カタラーゼ遺伝子（bca）の推定アミノ酸配列とデータベ
ースタンパク質配列との比較により、原核生物および真核生物のカタラーゼグル
ープと有意な類似性があるが、他のペルオキシダーゼともハロペルオキシダーゼ
とも類似性がないことが示された。ストレプトマイセス ベネズエラ野生型株のb
ca遺伝子を、アプラマイシン耐性をコードするDNA断片を挿入することにより破
壊されたコピーで置換しても、クロラムフェニコール産生は阻害されなかった。
【００２６】
「O-リン酸化によるクロラムフェニコールの不活性化。クロラムフェニコール
産生菌ストレプトマイセス ベネズエラ ISP5230における新規の耐性機構（Inact
ivation of chloramphenicol by O-phosphorylation．A novel resistance mech
anism in Streptomyces venezuelae ISP5230、a chloramphenicol producer）」 J Biol Chem．1995 Nov 10；270（45）：27000-6．モッシャー（Mosher） RH、
キャンプ（Camp） DJ、ヤング（Yang） K、ブラウン（Brown） MP、シャウ（Sha
w） WV、ヴィニング（Vining） LC、Biology Department、Dalhousie Universit
y、Halifax、Nova Scotia、Canada。
産生菌ストレプトマイセス ベネズエラ ISP5230における新規の耐性機構（Inact
ivation of chloramphenicol by O-phosphorylation．A novel resistance mech
anism in Streptomyces venezuelae ISP5230、a chloramphenicol producer）」 J Biol Chem．1995 Nov 10；270（45）：27000-6．モッシャー（Mosher） RH、
キャンプ（Camp） DJ、ヤング（Yang） K、ブラウン（Brown） MP、シャウ（Sha
w） WV、ヴィニング（Vining） LC、Biology Department、Dalhousie Universit
y、Halifax、Nova Scotia、Canada。
【００２７】
クロラムフェニコール（Cm）産生菌ストレプトマイセス ベネズエラ ISP5230
に由来する2．4キロ塩基対のゲノムDNAインサート断片を含むプラスミドpJV4は
、形質転換によりCm感受性宿主ストレプトマイセス リビダンス（Streptomyces lividans） M252（Mosher、R．H．、Rande、N．P．、Schrempf、H．およびVin
ing、L．C．（1990）J．Gen．Microbial．136、293-301））に導入されると耐性
を与える。形質転換体は、Cmを、逆相クロマトグラフィーにより単離および精製
された1つの主要生成物へ急速に代謝した。この代謝産物は、核磁気共鳴分光法
および質量分析法により、3’-O-ホスホ-Cmとして同定され、Cm感受性マイクロ
コッカス ルテウスに対してごくわずかな阻害活性を有することが示された。pJV
4に含まれるストレプトマイセス ベネズエラ DNAインサート断片のヌクレオチド
配列は、ヌクレオチド結合アミノ酸配列（モチーフAまたはPループ；Walker、J
．E．、Saraste、M．、Runswick、M．J．およびGay、N．J．（1982）EMBO J．1
、945-951）に対応するNH2末端コンセンサスモチーフを有するポリペプチド（19
kDa）をコードするオープンリーディングフレーム（ORF）を含んでいる。このOR
Fを1.6キロ塩基対SmaI-SmaI断片として含む組換えベクターを用いて、ストレプ
トマイセス リビダンス（S．lividans） M252を形質転換すると、均一にCm耐性
である形質転換体が得られた。ORFが内部欠失により破壊されているベクターで
形質転換された1つのストレプトマイセス リビダンス株は、Cmをリン酸化するこ
とができず、この抗生物質に対して正常な感受性を示すクローンを生じた。
に由来する2．4キロ塩基対のゲノムDNAインサート断片を含むプラスミドpJV4は
、形質転換によりCm感受性宿主ストレプトマイセス リビダンス（Streptomyces lividans） M252（Mosher、R．H．、Rande、N．P．、Schrempf、H．およびVin
ing、L．C．（1990）J．Gen．Microbial．136、293-301））に導入されると耐性
を与える。形質転換体は、Cmを、逆相クロマトグラフィーにより単離および精製
された1つの主要生成物へ急速に代謝した。この代謝産物は、核磁気共鳴分光法
および質量分析法により、3’-O-ホスホ-Cmとして同定され、Cm感受性マイクロ
コッカス ルテウスに対してごくわずかな阻害活性を有することが示された。pJV
4に含まれるストレプトマイセス ベネズエラ DNAインサート断片のヌクレオチド
配列は、ヌクレオチド結合アミノ酸配列（モチーフAまたはPループ；Walker、J
．E．、Saraste、M．、Runswick、M．J．およびGay、N．J．（1982）EMBO J．1
、945-951）に対応するNH2末端コンセンサスモチーフを有するポリペプチド（19
kDa）をコードするオープンリーディングフレーム（ORF）を含んでいる。このOR
Fを1.6キロ塩基対SmaI-SmaI断片として含む組換えベクターを用いて、ストレプ
トマイセス リビダンス（S．lividans） M252を形質転換すると、均一にCm耐性
である形質転換体が得られた。ORFが内部欠失により破壊されているベクターで
形質転換された1つのストレプトマイセス リビダンス株は、Cmをリン酸化するこ
とができず、この抗生物質に対して正常な感受性を示すクローンを生じた。
【００２８】
「ストレプトマイセス属におけるクロラムフェニコール耐性：ストレプトマイ
セス ベネズエラ由来クロラムフェニコール加水分解酵素遺伝子のクローニング
および特徴付け（Chloramphenicol resistance in Streptomyces：cloning and
characterization of a chloramphenicol hydrolase gene from Streptomyces v
enezuelae）」 J Gen Microbiol．1990 Feb；136（Pt2）：293-301．モッシャー
（Mosher） RH、ラナデ（Ranade） NP、シュレンプ（Schrempf） H、ヴィニング
（Vining） LC、Department of Biology、Dalhousie University、Halifax、Nov
a Scotia、Canada。
セス ベネズエラ由来クロラムフェニコール加水分解酵素遺伝子のクローニング
および特徴付け（Chloramphenicol resistance in Streptomyces：cloning and
characterization of a chloramphenicol hydrolase gene from Streptomyces v
enezuelae）」 J Gen Microbiol．1990 Feb；136（Pt2）：293-301．モッシャー
（Mosher） RH、ラナデ（Ranade） NP、シュレンプ（Schrempf） H、ヴィニング
（Vining） LC、Department of Biology、Dalhousie University、Halifax、Nov
a Scotia、Canada。
【００２９】
ストレプトマイセス ベネズエラ ISP5230のクロラムフェニコール耐性遺伝子
を含む6.5kb DNA断片を、高コピー数プラスミドベクターpIJ702を用いてストレ
プトマイセス リビダンス（Streptomyces lividans） M252にクローニングした
。この遺伝子は、クローニングされたDNAの2.4kb KpnI-SstI断片内に位置し、抗
生物質からのジクロロアセチル部分除去を触媒する酵素（クロラムフェニコール
加水分解酵素）をコードしていた。アシル基が除去された産物であるp-ニトロフ
ェニルセリノールは、ストレプトマイセス リビダンス M252に存在する酵素によ
りp-ニトロベンジルアルコールと他の化合物に代謝された。ストレプトマイセス
ベネズエラ ISP5230からクローニングされた6.5kb SstI断片をプローブとして
用いて、いくつかの供給源に由来するゲノムDNAを調べると、ストレプトマイセ
ス ベネズエラ 13sに由来するDNAにはハイブリダイズする領域があるが、別のク
ロラムフェニコール産生菌であるストレプトマイセス フェオクロモジェネス（S
treptomyces phaeochromogenes） NRRLB3559に由来するDNAにはハイブリダイズ
する領域がないことが示された。6.5kb SstI断片または細断片が、大腸菌におい
てプラスミドpTZ18Rのlacプロモーター下流にサブクローニングされた場合、耐
性表現型は観察されなかった。
を含む6.5kb DNA断片を、高コピー数プラスミドベクターpIJ702を用いてストレ
プトマイセス リビダンス（Streptomyces lividans） M252にクローニングした
。この遺伝子は、クローニングされたDNAの2.4kb KpnI-SstI断片内に位置し、抗
生物質からのジクロロアセチル部分除去を触媒する酵素（クロラムフェニコール
加水分解酵素）をコードしていた。アシル基が除去された産物であるp-ニトロフ
ェニルセリノールは、ストレプトマイセス リビダンス M252に存在する酵素によ
りp-ニトロベンジルアルコールと他の化合物に代謝された。ストレプトマイセス
ベネズエラ ISP5230からクローニングされた6.5kb SstI断片をプローブとして
用いて、いくつかの供給源に由来するゲノムDNAを調べると、ストレプトマイセ
ス ベネズエラ 13sに由来するDNAにはハイブリダイズする領域があるが、別のク
ロラムフェニコール産生菌であるストレプトマイセス フェオクロモジェネス（S
treptomyces phaeochromogenes） NRRLB3559に由来するDNAにはハイブリダイズ
する領域がないことが示された。6.5kb SstI断片または細断片が、大腸菌におい
てプラスミドpTZ18Rのlacプロモーター下流にサブクローニングされた場合、耐
性表現型は観察されなかった。
【００３０】
「ストレプトマイセス ベネズエラにおけるクロラムフェニコール生合成遺伝
子の形質導入解析（Transductional analysis of chloramphenicol biosynthesi
s genes in Streptomyces venezuelae）」 J Bacteriol．1987 Aug；169（8）：
3809-13．ヴァッツ（Vats） S、スタッタード（Stuttard） C、ヴィニング（Vin
ing） LC。
子の形質導入解析（Transductional analysis of chloramphenicol biosynthesi
s genes in Streptomyces venezuelae）」 J Bacteriol．1987 Aug；169（8）：
3809-13．ヴァッツ（Vats） S、スタッタード（Stuttard） C、ヴィニング（Vin
ing） LC。
【００３１】
ストレプトマイセス ベネズエラの2つのクロラムフェニコール非産生変異体か
ら単離された栄養要求体は、3つのピリドキサール要求体（Pxl-）VS248（cml-11 pdx2）、VS253（cml-11 pdx-3）、VS258（cml-12 pdx-4）、および1つのチ
オ硫酸塩要求体VS263（cml-12 cys-28）を含んだ。SV1を介した形質導入の結果
は、相対的なマーカーの順番cys-28-cml-12-cml-11-pdx-2、3、4、5と一致した
。これらの全マーカーは同時形質導入することができ、従って、SV1を介したパ
ッケージングされるDNAのおおよその長さである45キロ塩基未満のDNAにまたがっ
ているのにちがいない。cys-28はまたarg-4およびarg-6と同時形質導入すること
ができるが、argおよびpdxは同時形質導入することができない。11個のcml変異
のいずれか1つを有する供与菌と交雑した結果は、cys-28マーカーとpdxマーカー
との間の全cml変異の位置と一致した。また、形質導入によりVS263から作製され
たcys-28 cml＋株の限局的なヒドロキシルアミン変異誘発の後に、1種類の新規P
xl-栄養要求体（pdx-6）と2種類の新規Cml-変異体が元に戻った。
ら単離された栄養要求体は、3つのピリドキサール要求体（Pxl-）VS248（cml-11 pdx2）、VS253（cml-11 pdx-3）、VS258（cml-12 pdx-4）、および1つのチ
オ硫酸塩要求体VS263（cml-12 cys-28）を含んだ。SV1を介した形質導入の結果
は、相対的なマーカーの順番cys-28-cml-12-cml-11-pdx-2、3、4、5と一致した
。これらの全マーカーは同時形質導入することができ、従って、SV1を介したパ
ッケージングされるDNAのおおよその長さである45キロ塩基未満のDNAにまたがっ
ているのにちがいない。cys-28はまたarg-4およびarg-6と同時形質導入すること
ができるが、argおよびpdxは同時形質導入することができない。11個のcml変異
のいずれか1つを有する供与菌と交雑した結果は、cys-28マーカーとpdxマーカー
との間の全cml変異の位置と一致した。また、形質導入によりVS263から作製され
たcys-28 cml＋株の限局的なヒドロキシルアミン変異誘発の後に、1種類の新規P
xl-栄養要求体（pdx-6）と2種類の新規Cml-変異体が元に戻った。
【００３２】
PMID：3475271、UI：87279938。
【００３３】
「ストレプトマイセス ベネズエラの接合稔性と染色体連鎖地図上でのクロラ
ムフェニコール生合成遺伝子の位置（Conjugational fertility and location o
f chloramphenicol biosynthesis genes on the chromosomal linkage map of S
treptomyces venezuelae）」 J Gen Microbiol．1986 May；132（Pt5）：1327-3
8．ドウル（Doull） JL、ヴァッツ（Vats） S、チャリシオポウロス（Chaliciop
oulos） M、スタッタード（Stuttard） C、ウォング（Wong） K、ヴィニング（V
ining） LC。
ムフェニコール生合成遺伝子の位置（Conjugational fertility and location o
f chloramphenicol biosynthesis genes on the chromosomal linkage map of S
treptomyces venezuelae）」 J Gen Microbiol．1986 May；132（Pt5）：1327-3
8．ドウル（Doull） JL、ヴァッツ（Vats） S、チャリシオポウロス（Chaliciop
oulos） M、スタッタード（Stuttard） C、ウォング（Wong） K、ヴィニング（V
ining） LC。
【００３４】
ストレプトマイセス ベネズエラでは、染色体遺伝子組換えとして定義される
稔性は、2親接合交雑において一方の親が物理的に検出されないプラスミドSVP1
を欠く場合、両親がSVP1を有する場合の交雑と比較して1000倍以上増加した。プ
ラスミドがある菌糸体とプラスミドがない菌糸体との接触により誘発される「致
死接合」により、SVP1と他の少なくとも2つの稔性プラスミドSVP2およびSVP3が
ストレプトマイセス ベネズエラに存在することが検出された。接合交雑を用い
てストレプトマイセス ベネズエラの連鎖地図を作成した。この連鎖地図は、ス
トレプトマイセス コエリカラー（S．coelicolor） A3（2）における類似遺伝子
座の地図とかなり一致していた。クロラムフェニコール生合成を支配する遺伝子
のクラスターは、arg遺伝子、cys遺伝子、およびpdxB遺伝子の近くに、S．coeli
color A3（2）地図の1-2’oclock領域とほぼ同じ位置で位置していた。
稔性は、2親接合交雑において一方の親が物理的に検出されないプラスミドSVP1
を欠く場合、両親がSVP1を有する場合の交雑と比較して1000倍以上増加した。プ
ラスミドがある菌糸体とプラスミドがない菌糸体との接触により誘発される「致
死接合」により、SVP1と他の少なくとも2つの稔性プラスミドSVP2およびSVP3が
ストレプトマイセス ベネズエラに存在することが検出された。接合交雑を用い
てストレプトマイセス ベネズエラの連鎖地図を作成した。この連鎖地図は、ス
トレプトマイセス コエリカラー（S．coelicolor） A3（2）における類似遺伝子
座の地図とかなり一致していた。クロラムフェニコール生合成を支配する遺伝子
のクラスターは、arg遺伝子、cys遺伝子、およびpdxB遺伝子の近くに、S．coeli
color A3（2）地図の1-2’oclock領域とほぼ同じ位置で位置していた。
【００３５】
「クロラムフェニコール生合成がブロックされたストレプトマイセス ベネズ
エラ変異体の単離および特徴付け（Isolation and characterization of Strept
omyces venezuelae mutants blocked in chloramphenicol biosynthesis）」 J
Gen Microbiol．1985 Jan；131（Pt1）：97-104．ドウル（Doull） J、アーメド
（Ahmed） Z、スタッタード（Stuttard） C、ヴィニング（Vining） LC。
エラ変異体の単離および特徴付け（Isolation and characterization of Strept
omyces venezuelae mutants blocked in chloramphenicol biosynthesis）」 J
Gen Microbiol．1985 Jan；131（Pt1）：97-104．ドウル（Doull） J、アーメド
（Ahmed） Z、スタッタード（Stuttard） C、ヴィニング（Vining） LC。
【００３６】
クロラムフェニコール生合成がブロックされた12個のストレプトマイセス ベ
ネズエラ変異体が単離された。これらのうち2個（Cml-1およびCml-12）はコリス
ミン酸からp-アミノフェニルアラニンへの変換が明らかにブロックされた。3個
（Cml-4、Cml-5、およびCml-8）はp-アミノフェニルアラニンを蓄積し、この中
間体をp-アミノフェニルセリンに変換するヒドロキシル化反応がブロックされた
可能性がある。1個の変異体（Cml-2）が、D-スレオ-1-p-ニトロフェニル-2-プロ
ピオンアミド-1，3-プロパンジオールとD-スレオ-1-p-ニトロフェニル-2-イソブ
チルアミド-1，3-プロパンジオールを蓄積した。このことから、クロラムフェニ
コールのα-N-アシル基の塩素化がブロックされたことが示される。残りの6個の
株は、検出可能なクロラムフェニコール経路中間体を分泌しなかった。
ネズエラ変異体が単離された。これらのうち2個（Cml-1およびCml-12）はコリス
ミン酸からp-アミノフェニルアラニンへの変換が明らかにブロックされた。3個
（Cml-4、Cml-5、およびCml-8）はp-アミノフェニルアラニンを蓄積し、この中
間体をp-アミノフェニルセリンに変換するヒドロキシル化反応がブロックされた
可能性がある。1個の変異体（Cml-2）が、D-スレオ-1-p-ニトロフェニル-2-プロ
ピオンアミド-1，3-プロパンジオールとD-スレオ-1-p-ニトロフェニル-2-イソブ
チルアミド-1，3-プロパンジオールを蓄積した。このことから、クロラムフェニ
コールのα-N-アシル基の塩素化がブロックされたことが示される。残りの6個の
株は、検出可能なクロラムフェニコール経路中間体を分泌しなかった。
【００３７】
「ストレプトマイセス ベネズエラにおけるクロラムフェニコール産生をコー
ドする遺伝子の染色体位置の証拠（Evidence for a chromosomal location of t
he genes coding for chloramphenicol production in Streptomyces venezuela
e）」 J Bacteriol．1983 Apr；154（1）：239-44．アーメド（Ahmed） ZU、ヴ
ィニング（Vining） LC。
ドする遺伝子の染色体位置の証拠（Evidence for a chromosomal location of t
he genes coding for chloramphenicol production in Streptomyces venezuela
e）」 J Bacteriol．1983 Apr；154（1）：239-44．アーメド（Ahmed） ZU、ヴ
ィニング（Vining） LC。
【００３８】
調べられた7つのクロラムフェニコール産生放線菌のうちストレプトマイセス
ベネズエラ 13s株だけが、アガロースゲル電気泳動と塩化セシウム-臭化エチジ
ウム密度勾配遠心分離により検出可能な染色体外DNAを含んでいた。この株に存
在する1つの17メガダルトンプラスミドは、変異誘発された培養菌から以前に単
離されたプラスミドpUC3と区別がつかなかった。アクリフラビンまたは臭化エチ
ジウムで処理した後に、クロラムフェニコールを産生できないことについて選択
された株は、プラスミドpUC3と同じ電気泳動移動度を有し、制限エンドヌクレア
ーゼで消化するとほぼ同じ断片を生じるプラスミドをまだ含んでいた。13s株の
プロトプラストを再生し、細胞外DNAを欠く分離菌をスクリーニングすることに
より、PC51-5株が得られた。この株にプラスミドpUC3配列がないことは、32P標
識プラスミドをプローブとして用いたサザンハイブリダイゼーションにより確認
された。このプラスミドを欠く株は親株と同じくらいクロラムフェニコールを産
生したので、pUC3は、抗生物質産生のための構造遺伝子も調節遺伝子も含まない
。野生型および色素処理された非産生子孫に由来する全細胞DNAのBamHI消化物の
電気泳動解析からの証拠により、アクリフラビンは染色体に構造変化を引き起こ
したことが示された。
ベネズエラ 13s株だけが、アガロースゲル電気泳動と塩化セシウム-臭化エチジ
ウム密度勾配遠心分離により検出可能な染色体外DNAを含んでいた。この株に存
在する1つの17メガダルトンプラスミドは、変異誘発された培養菌から以前に単
離されたプラスミドpUC3と区別がつかなかった。アクリフラビンまたは臭化エチ
ジウムで処理した後に、クロラムフェニコールを産生できないことについて選択
された株は、プラスミドpUC3と同じ電気泳動移動度を有し、制限エンドヌクレア
ーゼで消化するとほぼ同じ断片を生じるプラスミドをまだ含んでいた。13s株の
プロトプラストを再生し、細胞外DNAを欠く分離菌をスクリーニングすることに
より、PC51-5株が得られた。この株にプラスミドpUC3配列がないことは、32P標
識プラスミドをプローブとして用いたサザンハイブリダイゼーションにより確認
された。このプラスミドを欠く株は親株と同じくらいクロラムフェニコールを産
生したので、pUC3は、抗生物質産生のための構造遺伝子も調節遺伝子も含まない
。野生型および色素処理された非産生子孫に由来する全細胞DNAのBamHI消化物の
電気泳動解析からの証拠により、アクリフラビンは染色体に構造変化を引き起こ
したことが示された。
【００３９】
DS154（jad：：hyg株）の構築に関連する参考文献
1．ビアマン（Bierman）ら（1992） 「大腸菌からストレプトマイセス属（Str
eptomyces spp.）へDNAを接合により導入するためのプラスミドクローニングベ
クター（Plasmid cloning vectors for the conjugal transfer of DNA from Escherichia coli to Streptomyces spp）」 Gene 116：43-49。
eptomyces spp.）へDNAを接合により導入するためのプラスミドクローニングベ
クター（Plasmid cloning vectors for the conjugal transfer of DNA from Escherichia coli to Streptomyces spp）」 Gene 116：43-49。
【００４０】
2．ザラカイン（Zalacain）ら（1986）「ストレプトマイセス ハイグロコピカ
ス（Streptomyces hygroscopicus）由来ハイグロマイシンBリン酸転移酵素遺伝
子のヌクレオチド配列（Nucleotide sequence of the hygromycin B phosphotra
nsferase gene from Streptomyces hygroscopicus）」
ス（Streptomyces hygroscopicus）由来ハイグロマイシンBリン酸転移酵素遺伝
子のヌクレオチド配列（Nucleotide sequence of the hygromycin B phosphotra
nsferase gene from Streptomyces hygroscopicus）」
【００４１】
3．ハン（Han）ら（1994）「ストレプトマイセス ベネズエラ ISP5230におけ
るジャドマイシンb生合成のためのポリケチド合成酵素遺伝子のクローニングお
よび特徴付け（Cloning and characterization of polyketide synthase
genes for jadomycin b biosynthesis in Streptomyces venezuelae ISP
5230）」 Microbiology 140：3379-3389。
るジャドマイシンb生合成のためのポリケチド合成酵素遺伝子のクローニングお
よび特徴付け（Cloning and characterization of polyketide synthase
genes for jadomycin b biosynthesis in Streptomyces venezuelae ISP
5230）」 Microbiology 140：3379-3389。
【図１】 cml遺伝子クラスター内でのcml遺伝子の相対位置を示す模式図で
ある。
ある。
【図２】 MYM寒天とアプラマイシンを含むバイオアッセイプレート上で増
殖された接合完了体の結果を示す図である。
殖された接合完了体の結果を示す図である。
【図３】 クロラムフェニコール産生を比較したh.p.l.c.分析を示す図であ
る。
る。
【図４】 MYM寒天とアプラマイシンを含むバイオアッセイプレート上で増
殖され、マイクロコッカス ルテウス（Micrococcus luteus）と共にバイオアッ
セイされた接合完了体の結果を示す図である。
殖され、マイクロコッカス ルテウス（Micrococcus luteus）と共にバイオアッ
セイされた接合完了体の結果を示す図である。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
(Ｃ１２Ｐ 13/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ
Ｃ１２Ｒ 1:61）
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，
ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ
Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ
，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，
ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ
Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ
)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，
ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，
ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，Ｃ
Ｎ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ
，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，
ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，Ｋ
Ｐ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ
，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，
ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，Ｓ
Ｇ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ
，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ
(72)発明者 マテュール エリック ジェイ．
アメリカ合衆国 カリフォルニア州 カー
ルスバド ギャリシア ウェイ 2654
(72)発明者 グリーン ブライアン ディー．
アメリカ合衆国 カリフォルニア州 サン
ディエゴ パゴダ ウェイ 8677
Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA67 CA04 DA06 DA08
EA06 GA11 HA20
4B063 QA01 QQ43 QQ98 QR32 QR55
QS34
4B064 AE02 CA03 CC24 DA02
4C206 AA04 GA23 MA01 MA04 ZB35
Claims (13)
- 【請求項１】 クロラムフェニコール合成遺伝子クラスター。
- 【請求項２】 （a）クロラムフェニコール産生微生物のゲノムクローンラ
イブラリーを作製することと、 （b）ライブラリーに由来するクローンを供与宿主細胞にトランスフェクトする
ことと、 （c）トランスフェクトされた供与宿主細胞を、クロラムフェニコール遺伝子ク
ラスターに変異を含むクロラムフェニコール産生微生物と接合させることと、 （d）結果として生じる組換えクローンをクロラムフェニコール産生についてス
クリーニングすることと、 （e）クロラムフェニコール産生について陽性のクローンから前記遺伝子クラス
ターを単離することを含むプロセスによって作製される、請求項1に記載の遺伝
子クラスター。 - 【請求項３】 供与宿主細胞が大腸菌（E. coli）である、請求項2に記載の
遺伝子クラスター。 - 【請求項４】 クロラムフェニコール産生微生物がストレプトマイセス ベ
ネズエラ（S．venezuelae）である、請求項2に記載の遺伝子クラスター。 - 【請求項５】 （a）クロラムフェニコール産生微生物のゲノムクローンラ
イブラリーを作製することと、 （b）ライブラリーに由来するクローンを供与宿主細胞にトランスフェクトする
ことと、 （c）トランスフェクトされた供与宿主細胞を、クロラムフェニコール遺伝子ク
ラスターに変異を含むクロラムフェニコール産生微生物と接合させることと、 （d）結果として生じる組換えクローンをクロラムフェニコール産生についてス
クリーニングすることと、 （e）クロラムフェニコール産生について陽性のクローンを単離することを含む
、クロラムフェニコール遺伝子クラスターを含むクローンを作製する方法。 - 【請求項６】 （a）請求項5に記載の方法により作製されたクローンを培養
することと、 （b）結果として生じるクロラムフェニコールを単離することを含む、クロラム
フェニコールを産生する方法。 - 【請求項７】 （a）クロラムフェニコール生合成遺伝子クラスターからヌ
クレオチド配列を単離することと、 （b）前記配列を含むプローブを構築することと、 （c）前記プローブを微生物に由来するゲノムライブラリーまたはDNAライブラリ
ーと接触させ、それによりクロラムフェニコール生合成遺伝子クラスターまたは
その類似体を同定することを含む、微生物におけるクロラムフェニコール生合成
遺伝子クラスターまたはその類似体を同定する方法。 - 【請求項８】 類似体がコリネシン（corynecin）である、請求項7に記載の
方法。 - 【請求項９】 ヌクレオチド配列が請求項4に記載のクロラムフェニコール
生合成遺伝子クラスターに由来する、請求項7に記載の方法。 - 【請求項１０】 （a）クロラムフェニコール生合成遺伝子クラスターから
ヌクレオチド配列を単離することと、 （b）前記ヌクレオチド配列に変異を導入することと、 （c）結果として生じるヌクレオチド配列を微生物のクロラムフェニコール生合
成遺伝子クラスターと接触させ、該ヌクレオチド配列が遺伝子クラスターと相同
組換えし、それにより該クラスターに含まれる遺伝子をノックアウトすることを
含む、クロラムフェニコール生合成遺伝子クラスターに含まれる遺伝子をノック
アウトする方法。 - 【請求項１１】 変異が1つまたは複数のヌクレオチドの欠失、置換、また
は挿入である、請求項10に記載の方法。 - 【請求項１２】 ヌクレオチド配列が請求項4に記載のクロラムフェニコー
ル生合成遺伝子クラスターに由来する、請求項10に記載の方法。 - 【請求項１３】 請求項10に記載の方法により作製される遺伝子クラスター
の発現産物。
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US13432399P | 1999-05-14 | 1999-05-14 | |
| US60/134,323 | 1999-05-14 | ||
| US57022000A | 2000-05-12 | 2000-05-12 | |
| US09/570,220 | 2000-05-12 | ||
| PCT/US2000/013394 WO2000070056A1 (en) | 1999-05-14 | 2000-05-15 | Chloramphenicol biosynthetic pathway and gene cluster characterization |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003521883A true JP2003521883A (ja) | 2003-07-22 |
Family
ID=26832214
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000618462A Pending JP2003521883A (ja) | 1999-05-14 | 2000-05-15 | クロラムフェニコール生合成経路および遺伝子クラスターの特徴付け |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20020072062A1 (ja) |
| JP (1) | JP2003521883A (ja) |
| CA (1) | CA2376722A1 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001023542A1 (fr) * | 1999-09-29 | 2001-04-05 | Meiji Seika Kaisha, Ltd. | Transformant produisant un metabolite secondaire modifie par un groupe fonctionnel et nouveaux genes de biosynthese |
-
2000
- 2000-05-15 CA CA002376722A patent/CA2376722A1/en not_active Abandoned
- 2000-05-15 JP JP2000618462A patent/JP2003521883A/ja active Pending
-
2001
- 2001-08-07 US US09/924,207 patent/US20020072062A1/en not_active Abandoned
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA2376722A1 (en) | 2000-11-23 |
| US20020072062A1 (en) | 2002-06-13 |
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