EP1263964A2 - Rekombinante hhv8-dna - Google Patents

Rekombinante hhv8-dna

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Publication number
EP1263964A2
EP1263964A2 EP01913890A EP01913890A EP1263964A2 EP 1263964 A2 EP1263964 A2 EP 1263964A2 EP 01913890 A EP01913890 A EP 01913890A EP 01913890 A EP01913890 A EP 01913890A EP 1263964 A2 EP1263964 A2 EP 1263964A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
hhv8
dna
gene
recombinant
cells
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP01913890A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Henri-Jacques Delecluse
Manuela Kost
Wolfgang Hammerschmidt
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Helmholtz Zentrum Muenchen Deutsches Forschungszentrum fuer Gesundheit und Umwelt GmbH
Original Assignee
Helmholtz Zentrum Muenchen Deutsches Forschungszentrum fuer Gesundheit und Umwelt GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Helmholtz Zentrum Muenchen Deutsches Forschungszentrum fuer Gesundheit und Umwelt GmbH filed Critical Helmholtz Zentrum Muenchen Deutsches Forschungszentrum fuer Gesundheit und Umwelt GmbH
Publication of EP1263964A2 publication Critical patent/EP1263964A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C12Q1/705—Specific hybridization probes for herpetoviridae, e.g. herpes simplex, varicella zoster
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16411—Rhadinovirus, e.g. human herpesvirus 8
    • C12N2710/16441—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/16443—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Definitions

  • the invention relates to recombinant HHV8 DNA and methods for their production.
  • the discovery of the genome of a herpes virus in caposarcoma cells represented a breakthrough in understanding the pathogenesis of caposarcoma 1 .
  • the virus known as Kaposisarcoma-associated herpes virus (KSHV) or human herpes virus 8 (HHV8) codes for a number of cytokines (MIP, IL-6, interferon regulatory factor), cyclin homologs and G proteins, which act as growth factors or promote cell proliferation. All of these proteins could be involved in tumor cell growth.
  • Viral apoptosis inhibitors and viral proteins with transforming properties were also identified. For these reasons, the virus appears to be directly or indirectly involved in the development of caposis sarcoma and other virus-associated diseases.
  • HHV8 cannot be propagated in culture.
  • the virus can only be obtained by treating certain cell lines with TPA and butyrate that are latently infected with HHV8.
  • all data relating to the transforming potential of this virus have been obtained from experiments with individual virals Gene products derived, and the function of these gene products in context with the whole
  • a recombinant HHV8 DNA which has at least one inactivated essential gene of HHV8 and furthermore the information for the replication of the HHV8 DNA in prokaryotic cells or yeast cells and at least one in a prokaryotic organism or a yeast cell contains selectable marker gene.
  • Information for replication is to be understood to mean those sequence regions which include in particular the origin of replication and optionally also binding sites for replication factors. They are responsible for the initiation of DNA replication. In their entirety they are also referred to as replicons.
  • both replication of the HHV8 DNA in prokaryotic cells or yeast cells can be carried out and the possibility is also opened up of the HHV8 genome to mutagenize by methods known per se, for example deliberately inserting deletions, insertions, in particular foreign genes, into the HHV8 genome.
  • antibiotic resistance genes and fluorescent genes or the lacZ gene are used as marker genes that can be selected in prokaryotic organisms or yeast cells prefers.
  • Selectable antibiotic resistance genes are known to those skilled in the art in prokaryotic organisms, for example E. coli or in yeast cells, for example S. cerevisiae or S. pombe. Examples of this are the chloramphenicol resistance gene and ampicillin resistance gene.
  • An example of a gene that codes for a fluorescent protein is the gfp gene.
  • a marker gene which can be selected in eukaryotic animal or human cells is also contained. These in turn include genes coding for fluorescent proteins and antibiotic resistance genes. Examples of antibiotic resistance genes are the hygromycin resistance gene and neomycin resistance genes.
  • the information for replication in prokaryotes comes from the F factor of E. coli.
  • HHV8 DNA Another important feature of the recombinant HHV8 DNA provided according to the invention is the inactivation of an essential gene of HHV8.
  • “Essential gene” is understood to mean those genes that are essential in the regulation of viral gene expression. These include in particular the viral transcription factors, namely the immediate-early genes, and the early genes of DNA replication.
  • An example of an immediate one -early gene is the transfection factor ORF50.
  • examples of early genes of DNA replication are the polymerase ORF9, the DNA binding protein ORF6, the primase ORF56, the helicase ORF44 and the helicase / primase ORF40 / ORF41 as well as the DNA polymerase accessory factor ORF59.
  • the essential gene can be inactivated, for example, by deletion, integration, base exchange or addition of one or more nucleotides.
  • inactivation means in particular:
  • the essential gene or genes are no longer expressed, for example by a mutation in the promoter region; b) the essential gene has been deleted or is not originally present; c) the essential gene codes for a conditional gene product, ie the gene product is present, for example, as a temperature-sensitive protein; d) the essential gene codes for a conditionally expressible protein, ie the regulation of the transcription depends, for example, on the absence or the presence of a substance, for example an antibiotic, for example tetracycline.
  • the origin of replication and / or the marker gene selectable in prokaryotes and / or the marker gene selectable in eukaryotes is integrated into a gene essential for HHV8, whereby in one step both the inactivation of the essential gene and the integration of the gene for the present invention other necessary features is feasible.
  • HHV8 homologous sections which enable homologous recombination.
  • Essential genes are therefore genes that regulate virus synthesis and maturation.
  • the HHV8 genome has a size of approximately 170 kbp (BC3).
  • BC3 170 kbp
  • HHV8 DNA molecules with a size of at least 100, 120, 130, 140, 150, 170, 200 and 230 kbp.
  • a 230 kbp HHV8 genome was created by partially duplicating the genome.
  • An example of this is the BC-1 virus. Larger molecules of, for example, 250 kbp are also conceivable. Because of their size, all these molecules cannot be replicated and mutagenized using the usual techniques in prokaryotes.
  • At least one essential viral gene is inactivated by other mechanisms, for example by deletion or by base exchange.
  • the replicon or yeast replicon and / or the marker genes can also be integrated into or between non-essential viral genes.
  • the integration of the prokaryotic replicon or yeast replicon inactivates a gene responsible for the lytic productive phase of HHV8, for example a protein responsible for DNA replication, so that virus synthesis is prevented.
  • a gene responsible for the lytic productive phase of HHV8 for example a protein responsible for DNA replication
  • virus synthesis is prevented.
  • the replicon introduced into the HHV8 genome can be any prokaryotic replicon. Examples for this are: Pl Replikon, ColEl, SC1-01, pl5A, Ti. Examples of yeast replicons are: origin of replication of "2 micron circle”, autosomal replicating sequence (ARS).
  • ARS autosomal replicating sequence
  • a replicon preferred according to the invention is the replicon of the E. coli F factor.
  • the section responsible for replication of HHV8 DNA in prokaryotes contains at least the origin of replication of the F factor.
  • marker genes for example antibiotic resistance genes and fluorescent genes, are also introduced into the HHV8 DNA.
  • Further examples are the low affinity nerve growth factor receptor 1NGF-R, the secretory alkaline phosphatase, resistance genes against the antibiotics puromycin, zeomycin, neomycin.
  • Another example of an antibiotic resistance gene is chloramphenicol acetyl transferase.
  • An example of a fluorescent gene is the "green fluorescence protein".
  • a marker gene which can be selected in animal or human eukaryotic cells is introduced into the HHV8 DNA.
  • This in turn can be a fluorescent protein or an antibiotic resistance gene.
  • An example of an antibiotic resistance gene is the hygromycin phosphotransferase.
  • the prokaryotic replicon or the yeast replicon and the marker genes are preferably located on a coherent gene segment. However, they cannot be introduced into the HHV8 DNA contiguously, i.e. individually. It is crucial that at least one essential HHV8 gene is inactivated by the integration.
  • the foreign DNA is preferably integrated into the HHV8 DNA by homologous recombination via flanking DNA sections which flank the foreign DNA to be introduced.
  • the flanking sequences are homologous with the integration sites of the HHV8 DNA.
  • the length of the flanking homologous sequences is at least 300 bp, preferably one kbp or greater, for example 1.5, 2, 2.5 and 3 kbp.
  • Recombination occurs in eukaryotic cells infected with HHV8.
  • Examples of such cell lines are the cell lines BC-1, BC-2, BC-3, BCBL1 and BCP1.
  • eukaryotic cells are characterized in that they contain HHV8 molecules whose essential genes have not been inactivated, in particular wild-type HHV8 viurs molecules.
  • the HHV8 genome is, for example, in latent form in these eukaryotic cells, ie there is no virus production. They are stable cell lines that do not produce HHV8 virus if virus production is not actively induced. There are however, cells that are persistently infected with HHV8 and cells that have a balance between the virus and the host can also be used.
  • the successful and location-specific recombination can be demonstrated by techniques known per se, for example hybridization techniques, preferably Southern blot hybridization, and by PCR techniques.
  • the recombinant HHV8 genomes obtained in this way should be transferable in prokaryotic organisms, for example in E. coli, or yeast cells. In many subsequent experiments, however, it proved impossible to transfer these recombinant HHV8 genomes directly into E. coli.
  • a new special strategy therefore had to be developed in order to enable the recombinant HHV8 molecules to be transferred into a prokaryotic cell or yeast cell.
  • One possibility is induction via chemical agents, for example phorbol esters.
  • the recombinant virus particles are distinguished from the wild-type virus particles.
  • transformed cells for example 293 cells, are infected with the virus supernatant (containing a mixed virus population). Infected cells are selected from non-infected cells by selection, for example with an antibiotic, if the recombinant virus genomes carry an antibiotic resistance gene.
  • An example of an antibiotic resistance gene is the hygromycin resistance gene.
  • the transformed cells used represent a type of biological filter through which recombinant and non-recombinant wild-type HHV8 viruses can be discriminated.
  • Virus DNA is prepared from the cells thus obtained and is transferred into the prokaryotic cell, preferably E. coli or a yeast cell.
  • E.coli is only a prokaryote cell that can be used with preference.
  • other hosts such as Enterobacteriaceae, Pseudomonads, Bacillus and also yeast can also be used.
  • the recombinant HHV8 genome in these cells can be modified by manipulation methods known per se.
  • the entire HHV8 genome was successfully cloned in E. coli on the basis of a recombinant plasmid based on an F factor.
  • the recombinant HHV8 DNA obtained in this way can be manipulated in prokaryotes, preferably E. coli, by methods known per se.
  • the cloned viral genome can be introduced into transformed cells, preferably 293 cells, and infectious particles can then be produced in these cells without the addition of further chemical agents such as TPA or butyrate.
  • the transfection of the recombinant HHV8 DNA can be extended to any cells that are difficult or even not infectable by HHV8. Since the recombinant HHV8 genome provided according to the invention now carries marker genes which can be identified in prokaryotes and / or eukaryotes, for example genes which code for fluorescent proteins such as GFP, the infection pathway of HHV8 can be followed directly, and the target cells of HHV8 are now essential easier than identifiable by the methods known from the prior art.
  • HHV8 infectable cells for example 293 cells. Endothelial cells, B cells and spindle cells can generally be used instead of the 293 cells.
  • the production of virus particles is made possible by the fact that the inactivated essential HHV8 gene is complemented by methods known per se (rescueing).
  • the recombinant HHV8 DNA can also be introduced into mammalian cells that contain wild-type HHV8 DNA.
  • the DNA plasmids can be prepared from the virus particles thus obtained and again in, for example, E -coli cells are transferred.
  • the plasmid DNA can also be isolated directly from the cells infected with wild-type HHV8 and recombinant HHV8 molecules and transferred, for example, to E. coli.
  • the E. coli distinguishes the recombinant molecules from the wild-type molecules in that, for example, selection is made for an antibiotic resistance gene which is only present in the recombinant molecules.
  • Figure 1 Schematic representation of the used for homologous recombination
  • a plasmid backbone consisting of an F plasmid replicon, the hygromycin resistance gene and the GFP gene, is flanked by HHV8 sequences located to the left and right of the spel site of the ORF56 gene.
  • the F plasmid, the hygromycin resistance gene and the GFP gene are inserted into the ORF56 gene locus with this gene switched off. Since cosmids of the HHV8 virus strain BC1 were used to create the flanking sequences and since this strain is known to show some sequence differences from the BC3 virus, the entire 8 kbp section was replaced by the ORF56- Gene contained the Spel site sequenced. Sequencing showed only four mutations.
  • FIG. 2 Gardella gene analysis of the hygromycin-resistant 293 cell clones. 293 cells were infected with supernatants from induced BC3 cell clones containing the recombinant HHV8 / F plasmid.
  • Hygromycin selection seven clones were analyzed for the presence of the circular molecules carrying the F-plasmid. After hybridization with a probe specific for the F plasmid, it could be shown that all cell lines carried the recombinant virus genome.
  • FIG. 3 Restriction analysis of the recombinant HHV8 DNA.
  • Circular molecules were extracted from a hygromycin resistant 293 HHV8 / FIII cell clone, which was believed to contain the HHV8 / F plasmid in recombinant form. After electroporation into the E. coli strain DH10B and chloramphenicol selection, plasmid DNA was extracted and digested with Nhel and BamHI restriction enzymes.
  • Figure 4 Infection of 293 cells with the recombinant HHV8 / F plasmid virus.
  • the 293 HHV8 / FIII cell line was transfected with ORF56 cloned on an expression plas. After three days, the supernatants from this transfected cell line were incubated with HHV8-negative 293 cells. After two days, GFP-positive, HHV8-infected 293 cells were observed.
  • a prerequisite for manipulating the HHV8 genome in E. coli cells is the introduction of a prokaryotic replicon into the virus genome. Since herpes viruses have a large genome, we chose the replicon of the F plasmid, which is known to accept large DNA insertions and to replicate stably in E. coli. The genes encoding hygromycin resistance and the green fluorescent protein were inserted, plasmid pl919 was obtained. Flanking HHV8 regions were added to promote its homologous recombination with the virus genome. We decided to insert the 1919-F plasmid derivative into the open reading frame 56 (ORF56) of HHV8.
  • This gene is the homologue of the EBV virus gene BSLF1, which is indispensable for the lytic virus DNA replication.
  • the final mutant virus is replication-incompetent, but its defect is easily complemented.
  • the linearized plasmid DNA fragment was then introduced into the BC3 cell line, which contains several extrachromosomal copies of the HHV8 genome.
  • the cells were subjected to hygromycin selection (300 ⁇ g / ml) after plating in 96-well cluster plates.
  • the 293-HHV8 / F cell clones infected with supernatant from the BC3 cell line contained extrachromosomal copies of the recombinant HHV8 genome, as shown in FIG. 2.
  • the rescue of these circular molecules resulted in chloramphenicol-resistant E. co / ⁇ cell clones, which obviously contained the HHV8 / F plasmid hybrid (FIG. 3).
  • the comparison of the generated restriction pattern with that from the analysis published genomic HHV8 sequences derived revealed that the saved genome was the full HHV8 genome. Minor variations in certain restriction enzymes were detectable, but subcloning of the HHV8 / F plasmid and partial sequencing of certain subclones confirmed the successful cloning of the BC3 genome in E. coli.
  • Cells. 293 is a human embryonic renal epithelial cell line transformed with the proteins ela and elb of adenovirus strain 5 2 . This cell line was grown in RPMI 1640 with 10% fetal calf serum (Life Technologies, Eggenstein, Germany). The BC3 cell line is a cave lymphoma cell line that has been shown to contain the HHV8 virus 3 . This cell line was grown in RPMI with 20% fetal calf serum. Recombinant DNA plasmids.
  • pl919 is an F-factor prokaryotic replicon that contains the F factor replication origin, the chloramphenicol resistance gene, the distribution genes A and B, the hygromycin resistance cassette and the previously described gene 4 , which encodes the green fluorescent protein.
  • a DNA fragment (nucleotide coordinates # 77407 to # 87155) from the HHV8 genome BC1 5 , which was derived from the HHV8 cosmid GA21, was inserted into the plasmid cleaved with Nhel pACYC177 introduced so that p2388 was obtained.
  • This subclone comprises the ORF56 from HHV8, the homologue of the EBV-BSLFl gene.
  • the entire plasmid pl919 was introduced into the single spell site of p2388, so that the final plasmid p2421 was obtained (FIG. 1).
  • Hygromycin selection One day after infection or transfection, hygromycin (Calbiochem, Germany) was added to the culture medium of the BC3 or 293 cells (300 or 100 ⁇ g / ml). The cells were supplied weekly with fresh RPMI 1640 with the same hygromycin concentration.
  • Circular DNA molecules were isolated from F-factor positive 293 and BC3 clones using a denaturation / renaturation procedure as described 6 .
  • E. coli from strain DH10B were electroporation (1800 V, 25 4 ⁇ F, 100 ohms) transformed with the isolated DNA. The cells were plated on agar plates containing 15 ⁇ g / ml chloramphenicol.
  • 293 cells (2 x 10 5 ) were filtered (0.45 mm pore size) supernatants from BC3 / F plasmid cells in which the lytic cycle was induced by TPA and butyrate, or from 293-HHV8 / F- Plasmid cells which had been transfected with an expression plasmid containing the ORF56 gene were infected. In some cases, 293 cells were then selected for hygromycin resistance in 6-well cluster plates (2 x 10 7 ) and provided with RPMI1640 containing 10% fetal calf serum once a week.
  • Latent Marek's disease virus can be activated from its chromosomally integrated state in herpesvirus-transformed lymphoma cells. EMBO J. 12, 3277-3286 (1993).

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Abstract

Die Erfindung betrifft rekombinante HHV8-DNA sowie Verfahren zu ihrer Herstellung.

Description

REKOMBINANTE HHV8-DNA
Die Erfindung betrifft rekombinante HHV8-DNA sowie Verfahren zu ihrer Herstellung.
Die Entdeckung des Genoms eines Herpesvirus in Kaposisarkomzellen stellte einen Durchbruch beim Verständnis der Pathogenese des Kaposisarkoms dar1. Das als Kaposisarkom-as soziierte Herpesvirus (KSHV) oder humanes Herpesvirus 8 (HHV8) bezeichnete Virus kodiert für eine Anzahl von Cytokinen (MIP, IL-6, Interferon- Regulationsfaktor), Cyclin-Homologen und G-Proteinen, die als Wachstumsfaktoren wirken oder die Zellproliferation fördern. All diese Proteine könnten am Tumorzellwachstum beteiligt sein.
Weiterhin identifiziert wurden virale Apoptoseinhibitoren und virale Proteine mit transformierenden Eigenschaften. Aus diesen Gründen scheint das Virus an der Entstehung von Kaposisarkomen und anderen, Virus-assoziierten Erkrankungen direkt oder indirekt beteiligt zu sein.
Gleichwohl bleibt eine Anzahl grundlegender Fragen zu beantworten:
Bisher kennt man die Targetzelle von HHV8 nicht, und auch der Zellstammbaum des Kaposisarkoms ist umstritten. Weiterhin kann HHV8 in Kultur nicht vermehrt werden. Das Virus kann nur durch Behandlung bestimmter Zellinien mit TPA und Butyrat erhalten werden, die latent mit HHV8 infiziert sind. Weiterhin wurden bisher alle Daten, die das transformierende Potential dieses Virus betreffen, aus Experimenten mit einzelnen viralen Genprodukten abgeleitet, und die Funktion dieser Genprodukte im Kontext mit dem gesamten
Virus ist bisher unbekannt.
Weiterhin ist unbekannt, ob alle oder nur einzelne virale Transformationsproteine zur Transformation der Zellen erforderlich sind. Hierzu ist es beispielsweise notwendig, das virale Genom von HHV8 gezielt zu mutieren, was natürlich am einfachsten in Prokaryontenzellen, beispielsweise E.coli-Zellen, durchführbar ist.
Es ist eine Aufgabe der Erfindung, HHV8-DNA bereitzustellen, die in prokaryonten Organismen wie E.coli replizierbar ist und die eine Produktion infektiöser Teilchen ohne induzierende Agenzien wie TPA oder Butyrat ermöglicht.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß eine rekombinante HHV8-DNA bereitgestellt wird, die zumindest ein inaktiviertes essentielles Gen von HHV8 aufweist und weiterhin die Information für die Replikation der HHV8-DNA in Prokaryontenzellen oder Hefezellen und zumindest ein in einem prokaryonten Organismus oder einer Hefezelle selektierbares Markergen enthält.
Unter „Information für die Replikation" sind solche Sequenzbereiche zu verstehen, die insbesondere den Replikationsursprung und wahlweise auch Bindungsstellen für Replikationsfaktoren umfassen. Sie sind für die Initiation der DNA Replikation verantwortlich. In ihrer Gesamtheit bezeichnet man sie auch als Replikons.
Durch das Einführen eines prokaryonten Replikons oder Hefereplikons in die HHV8-DNA zusammen mit zumindest einem in Prokaryontenzellen oder Hefezellen selektierbaren Markergen, ist sowohl eine Replikation der HHV8-DNA in Prokaryontenzellen oder Hefezellen durchführbar, und es wird auch die Möglichkeit eröffnet, das HHV8-Genom durch an sich bekannte Verfahren zu mutagenisieren, beispielsweise gezielt Deletionen, Insertionen, insbesondere Fremdgene in das HHV8-Genom einzuführen.
Als Markergene, die in prokaryonten Organismen oder Hefezellen selektierbar sind, werden insbesondere Antibiotikaresistenzgene und fluoreszierende Gene oder das lacZ-Gen bevorzugt. In prokaryonten Organismen, beispielsweise E.coli oder in Hefezellen, z.B. S. cerevisiae oder S. pombe, selektierbare Antibiotikaresistenzgene sind dem Fachmann bekannt. Beispiele hierfür sind das Chloramphenicolresistenzgen und Ampicillinresistenzgen. Ein Beispiel für ein Gen, welches für ein fluoreszierendes Protein kodiert, ist das gfp-Gen. In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist auch ein in eukaryonten tierischen oder menschlichen Zellen selektierbares Markergen enthalten. Hierzu gehören wiederum für fluoreszierende Proteine kodierende Gene und Antibiotikumresistenzgene. Beispiele für Antibiotikumresistenzgene sind das Hygromycinresistenzgen und Neomycinresistenzgene.
Die Information für die Replikation in Prokaryonten stammt in einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung aus dem F-Faktor von E.coli.
Ein weiteres wichtiges Merkmal der erfindungsgemäß bereitgestellten rekombinanten HHV8- DNA ist die Inaktivierung eines essentiellen Gens von HHV8. Unter „essentielles Gen" sind solche Gene zu verstehen, die bei der Regulation der viralen Genexpression essentiell sind. Hierzu gehören insbesondere die viralen Transkriptions faktoren, nämlich die immediate-early Gene, und die frühen Gene der DNA-Replikation. Ein Beispiel für ein immediate-early Gen ist der Trans fektionsfaktor ORF50. Beispiele für frühe Gene der DNA-Replikation sind die Polymerase ORF9, das DNA-Bindungsprotein ORF6, die Primase ORF56 die Helicase ORF44 und die Helicase/Primase ORF40/ORF41 sowie der DNA-Polymerase-akzessorische Faktor ORF59.
Die Inaktivierung des essentiellen Gens kann beispielsweise durch Deletion, Integration, Basenaustausch oder Addition eines oder mehrerer Nukleotide erfolgen. Unter „Inaktivierung" wird erfindungsgemäß insbesondere verstanden:
a) das oder die essentiellen Gene werden nicht mehr exprimiert, beispielsweise durch eine Mutation im Promotorbereich; b) das essentielle Gen wurde deletiert bzw. ist bereits ursprünglich nicht vorhanden; c) das essentielle Gen codiert für ein konditionales Genprodukt, d.h. das Genprodukt liegt beispielsweise als temperatursensitives Protein vor; d) das essentielle Gen codiert für ein konditional exprimierbares Protein, d.h. die Regulation der Transkription ist beispielsweise abhängig von der Abwesenheit bzw. der Anwesenheit einer Substanz, beispielsweise eines Antibiotikums, beispielsweise von Tetracyclin.
In einer bevorzugten Ausgestaltungsform der Erfindung wird der Replikationsursprung und/oder das in Prokaryonten und/oder das in Eukaryonten selektierbare Markergen in ein für HHV8 essentielles Gen integriert, wodurch in einem Schritt sowohl die Inaktivierung des essentiellen Gens als auch die Integration der für die vorliegende Erfindung weiteren notwendigen Merkmale durchführbar ist. Selbstverständlich sind auch andere Ausgestaltungen möglich. Die Integration in das essentielle Gen wird dadurch erleichtert und ist zielgerichtet durchführbar, daß die in das essentielle Gen zu integrierende DNA von HHV8 homologen Abschnitten flankiert wird, die eine homologe Rekombination ermöglichen.
Essentielle Gene sind somit solche Gene, die die Virussynthese und Virusreifung regulieren.
Das HHV8-Genom hat eine Größe von ca. 170 kbp (BC3). Es können selbstverständlich aber auch HHV8-Moleküle mit den Merkmalen des Anspruchs 1 hergestellt werden, die andere Größen haben. Beispiele hierfür sind HHV8-DNA-Moleküle mit einer Größe von mindestens 100, 120, 130, 140, 150, 170, 200 und 230 kbp. Ein HHV8-Genom mit 230 kbp ist durch eine partielle Duplikation des Genoms entstanden. Ein Beispiel hierfür ist das BC-1 -Virus. Denkbar sind aber auch größere Moleküle von beispielsweise 250 kbp. Alle diese Moleküle sind aufgrund ihrer Größe mit den üblichen Techniken in Prokaryonten nicht replizierbar und mutagenisierbar.
Untersuchungen über die Funktion einzelner Abschnitte auf dem HHV8-Genom wurden deshalb bisher an isolierten HHV8-DNA-Bruchstücken durchgeführt und nicht am Gesamtgenom.
Ein Fachmann würde zunächst aufgrund der Größe die Möglichkeit einer Replikation der HHV8-DNA als Gesamtgenom in Prokaryonten für nicht möglich halten. Selbst wenn er aber versuchen würde, ein prokaryontes Replikon in die HHV8-DNA einzuführen, würde er vernünftigerweise versuchen, dieses Replikon an einer Stelle im HHV8-Genom zu integrieren, die essentielle Gene nicht schädigt, um die Replikation der HHV8-DNA in tierischen oder menschlichen Eukaryontenzellen, die Expression von HHV8-Genen in diesen Eukaryontenzellen und die Bildung von HHV8-Viurspartikeln nicht zu gefährden. Dieser Weg hat sich erfindungs gemäß als nicht gangbar herausgestellt. Völlig überraschend wurde gefunden, daß das Einbringen eines prokaryonten Replikons oder Hefereplikons in die HHV8-DNA nur dann zielführend ist, wenn die Integration des Replikons in ein essentielles virales Gen erfolgt, so daß dieses inaktiviert wird.
Wie oben bereits dargestellt ist es aber auch zielführend, wenn zumindest ein essentielles virales Gen durch andere Mechanismen, beispielsweise durch eine Deletion oder durch einen Basenaustausch, inaktiviert wird. In einem solchen Fall kann die Integration des Replikons oder Hefereplikons und/oder der Markergene auch in oder zwischen nicht-essentielle virale Gene erfolgen.
In einer bevorzugten Form der Erfindung erfolgt durch die Integration des prokaryonten Replikons oder Hefereplikons eine Inaktivierung eines für die lytische produktive Phase von HHV8 - erantwortlichen Gens, beispielsweise eines für die DNA-Replikation verantwortlichen Proteins, so daß die Virussynthese unterbunden wird. Ohne „knock-out" eines essentiellen Gens, beispielsweise durch eine Insertionsmutagenese, ist eine Übertragung des HHV8-Genoms in stabiler und latenter Form in transformierte Zellen, beispielsweise 293 Zellen, nicht möglich.
Das in das HHV8-Genom eingeführte Replikon kann ein beliebiges prokaryontes Replikon sein. Beispiele hierfür sind: Pl Replikon, ColEl, SC1-01, pl5A, Ti. Beispiele für Hefereplikons sind: Replikationsursprung von „2 micron circle", autosomal replicating sequence (ARS).
Ein erfindungsgemäß bevorzugtes Replikon ist das Replikon des F-Faktors von E.coli. Der für die Replikation der HHV8-DNA in Prokaryonten verantwortliche Abschnitt enthält zumindest den Replikationsursprung des F-Faktors. Zur Selektion des rekombinanten HHV8-Genoms in Prokaryonten oder Hefen werden weiterhin Markergene in die HHV8-DNA eingeführt, beispielsweise Antibiotikaresistenzgene und fluoreszierende Gene. Weitere Beispiele sind der low affmity nerve growth factor receptor 1NGF-R, die sekretorische alkalische Phosphatase, Resistenzgene gegen die Antibiotika Puromycin, Zeomycin, Neomycin. Ein weiteres Beispiel für ein Antibiotikaresistenzgen ist die Chloramphenicolacetyltransferase. Ein Beispiel für ein fluoreszierendes Gen ist das „green fluorescence protein". Weiterhin bevorzugt wird in die HHV8-DNA ein in tierischen oder menschlichen Eukaryontenzellen selektierbares Markergen eingeführt. Hierbei kann es sich wiederum um ein Fluoreszenzprotein oder ein Antibiotikumresistenzgen handeln. Ein Beispiel für ein Antibiotikumresistenzgen ist die Hygromycinphosphotransferase.
Das prokaryonte Replikon oder das Hefereplikon und die Markergene liegen bevorzugt auf einem zusammenhängenden Genabschnitt. Sie können aber auch nicht zusammenhängend, also einzeln, in die HHV8-DNA eingeführt werden. Entscheidend ist, daß zumindest ein essentielles Gen von HHV8 durch die Integration inaktiviert wird.
Die Integration der Fremd-DNA in die HHV8-DNA erfolgt vorzugsweise durch homologe Rekombination über flankierende DNA- Abschnitte, die die einzubringende Fremd-DNA flankieren. Die flankierenden Sequenzen sind homolog mit den Integrationsorten der HHV8- DNA. Die Länge der flankierenden homologen Sequenzen beträgt mindestens 300 bp, bevorzugt ein kbp oder größer, beispielsweise 1,5, 2, 2,5 und 3 kbp.
Die Rekombination erfolgt in Eukaryontenzellen, die mit HHV8 infiziert sind. Beispiele für derartige Zellinien sind die Zellinien BC-1, BC-2, BC-3, BCBL1 und BCP1.
Diese Eukaryontenzellen sind dadurch gekennzeichnet, daß sie HHV8-Molküle enthalten, deren essentielle Gene nicht inaktiviert wurden, insbesondere HHV8-Viursmoleküle vom Wildtyp. In diesen Eukaryontenzellen liegt das HHV8-Genom beispielsweise in latenter Form vor, d.h. es findet keine Virusproduktion statt. Es handelt sich um stabile Zellinien, die kein HHV8-Virus produzieren, falls die Virus-Produktion nicht aktiv induziert wird. Es sind jedoch auch Zellen verwendbar, die mit HHV8 persistent infiziert sind und Zellen, bei denen ein Gleichgewicht zwischen dem Virus und dem Wirt vorliegt.
Die erfolgreiche und ortsgenaue Rekomination kann durch an sich bekannte Techniken, beispielsweise Hybridisierungstechniken, bevorzugt Southern-Blot-Hybridisierung, und durch PCR-Techniken nachgewiesen werden.
Die so erhaltenen rekombinanten HHV8-Genome sollten in prokaryonte Organismen, beispielsweise in E.coli, oder Hefezellen, übertragbar sein. Es erwies sich jedoch in vielen nachfolgenden Versuchen als unmöglich, diese rekombinanten HHV8-Genome direkt in E. coli zu übertragen. Es mußte deshalb eine neue besondere Strategie entwickelt werden, um ein Überführen der rekombinanten HHV8-Moleküle in eine prokaryonte Zelle oder Hefezelle zu ermöglichen. Erfindungsgemäß wurde gefunden, daß es zielführend war, in den latent mit HHV8 infizierten Zellen, die sowohl die rekombinanten HHV8-Genommoleküle als auch HHV8-Wildtyp-Genommoleküle enthalten, den lytischen Zyklus zu induzieren. Eine Möglichkeit ist die Induktion über chemische Agenzien, beispielsweise Phorbolester. Die Inkubation dieser Zellen mit diesen Verbindungen führt zur Induktion der Virusproduktion. Da die Zellen sowohl rekombinante HHV8-Genome als auch Wildtyp-HHV8-Genome tragen, entsteht eine Mischpopulation, und die Viren dieser Mischpopulation werden in den Zellkulturüberstand abgegeben.
In einem nächsten Schritt werden die rekombinanten Viruspartikel von den Wildtyp- Viruspartikel unterschieden. Hierzu werden transformierte Zellen, beispielsweise 293 Zellen, mit dem Virusüberstand (enthaltend eine Virusmischpopulation) infiziert. Infizierte Zellen werden von nicht-infϊzierten Zellen durch Selektion, beispielsweise mit einem Antibiotikum, selektiert, wenn die rekombinanten Virusgenome ein Antibiotikumresistenzgen tragen. Ein Beispiel für ein Antibiotikumresistenzgen ist das Hygromycinresistenzgen. Die verwendeten transformierten Zellen stellen eine Art biologisches Filter dar, durch welche rekombmante und nicht-rekombinante Wildtyp-HHV8-Viren diskriminierbar sind. Für den Erfolg dieses Schrittes war es wiederum entscheidend, daß das rekombinante HHV8 -Virus genom einen stabilen, latenten Zustand in den infizierten Zellen, beispielsweise 293 Zellen, einnimmt. Hierzu wiederum, und hier schließt sich der Kreis, ist die Inaktivierung eines essentiellen viralen Gens, wie es im vorliegenden HHV8-DNA-Genom erzeugt wurde, essentiell.
Aus den so erhaltenen Zellen wird Virus-DNA präpariert, die in die prokaryonte Zelle, bevorzugt E.coli oder eine Hefezelle, übertragen wird. Bei E.coli handelt es sich lediglich um eine bevorzugt verwendbare Prokaryontenzelle. Es sind jedoch auch andere Wirte wie Enterobacteriaceae, Pseudomonaden, Bacillen und auch Hefen einsetzbar. In diesen Zellen ist das rekombinante HHV8-Genom durch an sich bekannte Manipulationsverfahren veränderbar.
Durch die hier beschriebene Vorgehensweise gelang erstmals die erfolgreiche Klonierung des gesamten HHV8-Genoms in E.coli auf der Grundlage eines rekombinanten, auf einem F- Faktor basierenden Plasmids. Die so erhaltene rekombinante HHV8-DNA kann in Prokaryonten, bevorzugt E.coli, durch an sich bekannte Verfahren manipuliert werden. Das klonierte virale Genom kann in transformierte Zellen, bevorzugt 293 Zellen, eingebracht werden, und in diesen Zellen können dann infektiöse Teilchen ohne Zugabe weiterer chemischer Agenzien wie TPA oder Butyrat produziert werden.
Die Transfektion der rekombinanten HHV8-DNA kann auf beliebige Zellen ausgedehnt werden, die von HHV8 schwierig oder sogar gar nicht infizierbar sind. Da das erfϊndungsgemäß bereitgestellte rekombinante HHV8-Genom nunmehr Markergene trägt, die in Prokaryonten und/oder Eukaryonten identifizierbar sind, beispielsweise Gene, die für fluoreszierende Proteine wie GFP kodieren, kann der Infektionsweg von HHV8 direkt verfolgt werden, und die Targetzellen von HHV8 sind nunmehr wesentlich einfacher als durch die aus dem Stand der Technik bekannten Methoden identifizierbar.
Für den Fachmann sind selbstverständlich weitere Abänderungen des vorstehend beschriebenen Verfahrens möglich, ohne von der Erfindung abzuweichen. Die in beispielsweise E.coli veränderten rekombinanten HHV8-Moleküle könne wiederum in HHV8 infizierbare Zellen, beispielsweise 293 Zellen, eingebracht werden. Anstatt der 293 Zellen können allgemein Endothelzellen, B-Zellen und Spindelzellen eingesetzt werden. Die Produktion von Viruspartikeln wird dadurch ermöglicht, daß das inaktivierte essentielle HHV8-Gen durch an sich bekannte Verfahren komplementiert wird (rescueing). Alternativ kann die rekombinante HHV8-DNA auch in Säuger-Zellen eingeführt werden, die Wildtyp HHV8-DNA enthält. Nach Induktion der Virusproduktion z.B. durch Expression von frühen viralen Trankriptionsfaktorgenen durch heterologe Promotoren, die z.B. zusammen mit der rekombinanten HHV8-DNA in die Zelle eingeführt und z.B. konstitutiv exprimiert werden, können aus den so erhaltenen Viruspartikeln die DNA-Plasmide präpariert und wiederum in beispielsweise E-coli-Zellen transferiert werden. Alternativ kann auch direkt aus den mit Wildtyp HHV8 und rekombinanten HHV8-Molkülen infizierten Zellen die Plasmid-DNA isoliert und beispielsweise in E.coli transferiert werden. Die rekombinanten Moleküle werden dadurch in E.coli von den Wildtyp-Molekülen unterschieden, daß beispielsweise auf ein Antibiotikumresistenzgen, das ausschließlich in den rekombinanten Molekülen vorliegt, selektioniert wird.
Nachfolgend wird die Erfindung anhand eines Ausführungsbeispiels und der beiliegenden Figuren beschrieben. Die Erfindung ist jedoch nicht hierauf beschränkt. Zur Ausführung der Erfindung werden übliche Techniken aus der rekombinanten Gentechnologie eingesetzt. Verwiesen sei hier z.B. auf (9) und (10)
Die Figuren zeigen:
Figur 1: Schematische Darstellung des zur homologen Rekombination eingesetzten
Konstrukts. Ein Plasmid-Rückgrat, bestehend aus einem F-Plasmid-Replikon, dem Gen für die Hygromycinresistenz und dem GFP-Gen, wird von HHV8- Sequenzen flankiert, die links und rechts von der Spel-Site des ORF56-Gens lokalisiert sind. Durch eine erfolgreiche homologe Rekombination wird das F- Plasmid, das Hygromycinresistenzgen und das GFP-Gen in den ORF56- Genlokus unter Ausschaltung dieses Gens insertiert. Da zur Schaffung der flankierenden Sequenzen Cosmide des HHV8-Virusstamms BC1 eingesetzt wurden und da dieser Stamm bekannterweise einige Sequenzunterschiede vom BC3-Virus zeigt, wurde der gesamte 8 kbp große Abschnitt um die im ORF56- Gen enthaltene Spel-Stelle sequenziert. Die Sequenzierung zeigte nur vier Mutationen.
Figur 2: Gardella-Genanalyse der hygromycinresistenten 293 Zellklone. 293 Zellen wurden mit Überständen aus induzierten BC3-Zellklonen, die das rekombinante HHV8/F-Plasmid enthielten, infiziert. Nach
Hygromycinselektion wurden sieben Klone auf das Vorliegen der das F- Plasmid tragenden zirklären Moleküle hin analysiert. Nach Hybridisierung mit einer für das F-Plasmid spezifischen Sonde konnte gezeigt werden, daß alle Zellinien das rekombinante Virusgenom trugen.
Figur 3: Restriktionsanalyse der rekombinanten HHV8-DNA.
Aus einem hygromycinresistenten 293 HHV8/FIII-Zellklon, von dem man annahm, daß er das HHV8/F-Plasmid in rekombinanter Form enthielt, wurden zirkuläre Moleküle extrahiert. Nach Elektroporation in den E.coli-Stamm DH10B und Chloramphenicolselektion, wurde Plasmid-DNA extrahiert und mit Nhel und BamHI Restriktionsenzymen verdaut.
Figur 4: Infektion von 293 Zellen mit dem rekombinanten HHV8/F-Plasmidvirus.
Die 293 HHV8/FIII-Zellinie wurde mit auf einem Expressionsplas id Monierten ORF56 transfiziert. Nach drei Tagen wurden die Überstände dieser transfizierten Zellinie mit HHV8-negativen 293 Zellen inkubiert. Nach zwei Tagen konnte man GFP-positive, HHV8-infizierte 293 Zellen beobachten.
Einfuhren eines F-Plasmids in das HHV8-Genom
Eine Voraussetzung zur Manipulation des HHV8-Genoms in E. coli-Zellen ist das Einführen eines prokaryotischen Replikons in das Virusgenom. Da Herpesviren ein großes Genom besitzen, wählten wir das Replikon des F-Plasmids, das bekanntlich große DNA-Insertionen akzeptieren und stabil in E. coli replizieren kann. Die Gene, für die Hygromycin-Resistenz und das Grün- Fluoreszenzprotein codieren, wurden eingefügt, wobei Plasmid pl919 erhalten wurde. Zur Förderung seiner homologen Rekombination mit dem Virusgenom wurden flankierende HHV8-Regionen hinzugefügt. Wir entschlossen uns, das 1919-F- Plasmidderivat in den offenen Leserahmen 56 (ORF56) von HHV8 zu inserieren. Dieses Gen ist das Homologon des EBV- Virus-Gens BSLFl, das für die lytische Virus-DNA-Replikation unentbehrlich ist. Folglich ist die endgültige Virusmutante replikationsinkompetent, aber ihr Defekt lässt sich leicht komplementieren. Dazu konstruierten wir das endgültige Plasmid p2421 mit dem Grundgerüst von pl919, flankiert von HHV8-Sequenzen mit etwa 3 und 4 kbp Länge, um den ORF56-Locus anzusteuern (Fig. 1). Das linearisierte Plasmid-DNA-Fragment wurde dann in die BC3-Zellinie eingebracht, die mehrere extrachromosomale Kopien des HHV8-Genoms enthält. Die Zellen wurden nach der Plattierung in 96-Loch-Clusterplatten einer Hygromycinselektion (300 μg/ml) unterworfen. Vier Wochen nach der Selektion wurden mehr als 40 hygromycinresistente Zellklone, die positiv für das Grünfluoreszenzprotein waren, etabliert und mittels Southern-Blot- Analyse charakterisiert. Es wurde gefunden, dass ein Zeilklon das korrekt in das HHV8-Genom inserierte F-Plasmid trug (Daten nicht gezeigt). Von diesem Klon wurde Zellkulturüberstand nach Inkubation mit TPA und Butyrat erzeugt. Dieser Überstand enthielt infektiöse Virionen, wie durch die Expression des Grünfluoreszenzproteins nach der Infektion von 293 -Zellen angezeigt wurde. Nach der Selektion mit Hygromycin (100 μg/ml) wurden sieben 293 -Zellklone erhalten, die das Virusgenom enthielten, wie durch eine Gardella-Gel-Analyse gezeigt wurde (Fig. 2). Keiner dieser 293 -HHV8/F -Klone produzierte spontan Virionen, wie durch die Insertionsmutagenese des offenen Leserahmens 56 während der Rekombination erwartet worden war. Die Southern- Blot-Analyse der 293-HHV8/F-Zellklone zeigte, dass sie nur rekombinante Plasmide enthielten, was eine Coinfektion mit Wildtyp-HHV8 ausschloss (Daten nicht gezeigt).
Gewinnung des rekombinanten Virusgenoms in E. coli
Die mit Überstand der BC3-Zellinie infizierten 293-HHV8/F-Zellklone enthielten extrachromosomale Kopien des rekombinanten HHV8-Genoms, wie in Fig. 2 gezeigt ist. Die Rettung dieser zirkulären Moleküle ergab chloramphenicolresistente E. co/ϊ-Zellklone, die offensichtlich das HHV8/F-Plasmid-Hybrid enthielten (Fig. 3). Der Vergleich des erzeugten Restriktionsmusters mit dem aus der Analyse veröffentlichter genomischer HHV8-Sequenzen abgeleiteten ergab, dass das gerettete Genom das vollständige HHV8-Genom war. Kleinere Variationen bei bestimmten Restriktionsenzymen waren nachweisbar, aber die Subklonierung des HHV8/F-Plasmids und die partielle Sequenzierung bestimmter Subklone bestätigten die erfolgreiche Klonierung des BC3-Genoms in E. coli.
Transfektion des BSLFl-Genprodukts führt zur Produktion infektiöser Partikel
Als nächstes wollten wir die Fähigkeit der 293-Zellinie, die das rekombmante HHV8/F- Plasmid-Genom enthielt, zur Unterstützung der lytischen Phase des HHV8 -Lebenszyklus untersuchen. Die transiente Transfektion eines Expressionsplasmids, das das ORF56-Gen trug, in 293-HHV8/F-Zellen führte zur Produktion infektiöser Partikel, wie durch Infektion der parentalen 293-Zellen angezeigt wird (Fig. 4). Die Anzahl der für das Grünfluoreszenzprotein positiven Zellen war ähnlich wie die mit Überständen, die 105 infektiöse EBV-Partikel pro ml enthalten, erhaltene11. Es ist schwierig, den Virustiter in diesen Überständen zu bestimmen, da unklar ist, ob alle 293-Zellen mit HHV8 infiziert werden können16. Es lässt sich folgern, dass sich das rekombinante Virus hinsichtlich der Infektiösität als vollständig funktionell erwies. Auch stabil mit der aus E. coli gereinigten HHV8/F-Plasmid-DNA transfizierte 293-Zellen produzierten nach der Transfektion mit dem ORF56-Expressionsplasmid infektiöse Virionen, was zeigt, dass die Passage der Virus-DNA ihre Eigenschaften nicht änderte.
Material und Methoden
Zellen. 293 ist eine menschliche embryonale Nierenepithel-Zellinie, die mit den Proteinen Ela und Elb des Adenovirusstamms 5 transformiert ist2. Diese Zellinie wurde in RPMI 1640 mit 10% fötalem Kälberserum (Life Technologies, Eggenstein, Deutschland) gezüchtet. Die BC3-Zellinie ist eine Körperhöhlenlymphom-Zellinie, von der gezeigt wurde, dass sie das HHV8-Virus enthält3. Diese Zellinie wurde in RPMI mit 20% fötalem Kälberserum vermehrt. Rekombinante DNA-Plasmide.
pl919 ist ein prokaryotisches Replikon auf F-Faktor-Basis, das den Replikationsursprung des F-Faktors, das Chloramphenicolresistenzgen, die Verteilungsgene A und B, die Hygromycinresistenz-Kassette und das zuvor beschriebene Gen4, das das Grünfluoreszenzprotein codiert, enthält. Um flankierende Bereiche für die homologe Rekombination mit dem HHV8-Genom bereitzustellen, wurde ein DNA-Fragment (Nukleotidkoordinaten # 77407 bis # 87155) aus dem HHV8-Genom BC15, das aus dem HHV8-Cosmid GA21 stammte, in das mit Nhel gespaltene Plasmid pACYC177 eingebracht, so dass p2388 erhalten wurde. Dieser Subklon umfasst den ORF56 aus HHV8, das Homologon des EBV-BSLFl-Gens. Das gesamte Plasmid pl919 wurde in die einzelne Spel- Stelle von p2388 eingebracht, so dass das endgültige Plasmid p2421 erhalten wurde (Fig. 1).
DNA-Transfektionen. Trans fektionen von Zellinien mit Plasmid-DNA wurden unter Verwendung von Lipidmizellen oder Elektroporation durchgeführt. 293 -Zellen wurden 2 Stunden mit Optimem-Minimalmedium (Life Technologies, Eggenstein, Deutschland) inkubiert, und die in Lipidmizellen eingebettete DNA wurde 4 Stunden lang zugegeben (Lipofectamin, Life Technologies, Eggenstein, Deutschland). BC3-Zellen (107 Zellen) wurden in RPMI1640 ohne fötales Kälberserum gewaschen, in 250 μl des gleichen Mediums resuspendiert und mit der Plasmid-DNA in Elektroporationsküvetten mit 0,4 cm-Spalt überführt. Die Zellen wurden unter Verwendung eines Elektroporators (BioRad, München, Deutschland) bei 230 V und 960 μF transfiziert.
Hygromycin-Selektion. Einen Tag nach der Infektion oder Transfektion wurde Hygromycin (Calbiochem, Deutschland) zum Kulturmedium der BC3- oder 293-Zellen (300 bzw. 100 μg/ml) gegeben. Die Zellen wurden wöchentlich mit frischem RPMI 1640 mit der gleichen Hygromycϊnkonzentration versorgt.
Plasmidrettung in E. coli. Zirkuläre DNA-Moleküle wurden aus F-Faktor-positiven 293- und BC3-Klonen unter Verwendung eines Denaturierungs-/Renaturierungsverfahrens, wie beschrieben6, isoliert. E. coli vom Stamm DH10B wurden mittels Elektroporation (1800 V, 25 4 μF, 100 Ohm) mit der isolierten DNA transformiert. Die Zellen wurden auf Agarplatten plattiert, die 15 μg/ml Chloramphenicol enthielten.
Infektionen. 293-Zellen (2 x 105) wurden mit filtrierten (0,45 mm Porengröße) Überständen von BC3/F-Plasmid-Zellen, in denen der lytische Zyklus mittels TPA und Butyrat induziert worden war, oder von 293-HHV8/F-Plasmid-Zellen, die mit einem das ORF56-Gen enthaltenden Expressionsplasmid transfϊziert worden waren, infiziert. In einigen Fällen wurden 293-Zellen dann in 6-Loch-Clusterplatten auf Hygromycinresistenz selektiert (2 x 107) und einmal wöchentlich mit RPMI1640, das 10% fötales Kälberserum enthielt, versorgt.
Southern-Blot-Analyse und Gardella-Gel-Analyse. Das Verfahren zur Gardella- Gelelektrophorese, gefolgt von Southern-Blot-Hybridisierung ist zuvor beschrieben worden ' .
L I T E R A T U R
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Claims

P atentansprüche
1. Rekombinante HHV8 DNA, dadurch gekennzeichnet, daß sie zumindest die Information für die Replikation der HHV8 DNA in Prokaryonten oder Hefen und zumindest ein in Prokaryonten oder Hefen selektierbares Markergen enthält, und zumindest ein für HHV8 essentielles Gen inaktiviert ist.
2. HHV8 DNA nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß sie weiterhin ein in tierischen oder menschlichen Eukaryontenzellen selektierbares Markergen enthält.
3. HHV8 DNA nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Markergen ein Antibiotikumresistenzgen oder ein für ein fluoreszierendes Protein kodierendes Gen oder das lacZ Gen ist.
4. HHV8 DNA nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das essentielle Gen durch Integration, Deletion, Addition oder Austausch eines oder mehrerer Nukleotide inaktiviert ist.
5. HHV8 DNA nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das essentielle Gen ein für die Regulation der Genexpresssion oder ein für virale Transkriptionsfaktoren kodierendes Gen ist.
6. HHV8 DNA nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Inaktivierung im essentiellen Gen in einem für ein HHV8 DNA Replikationsprotein kodierenden Gen ist.
7. HHV8 DNA nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß zumindest die Information für die Replikation in Prokaryonten aus dem E.coli- Plasmid F Faktor stammt.
8. HHV8 DNA nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß sie zumindest eine Größe von 100, 150, 170, 200 oder bis zu 230 kbp oder darüber aufweist.
9. Prokaryontenzelle oder Hefezelle, enthaltend HHV8 DNA nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche.
10. Prokaryontenzelle nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine E. coli Zelle ist.
11. Tierische oder menschliche Eukaryontenzelle, enthaltend eine rekombinante HHV8 DNA nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche.
12. Eukaryontenzelle nach Anspruch 11 , enthaltend weiterhin die genetische Information, die für das inaktivierte essentielle Gen kodiert.
13. Eukaryontenzelle nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennezeichnet, daß sie weiterhin HHV8 DNA enthält, deren essentielle Gene nicht inaktiviert sind.
14. Eukaryontenzelle nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennezeichnet, daß die HHV8 DNA mit nicht inaktivierten essentiellen Genen in latenter Form vorliegt.
15. HHV8 Viruspartikel, enthaltend HHV8 DNA nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche.
16. Verfahren zur Herstellung einer rekombinanten HHV8 DNA durch Einführen von DNA in das Genom von HHV8, die eine Replikation der HHV8 DNA in Prokaryonten oder Hefen sicherstellt, und von zumindest einem in Prokaryonten oder Hefezellen selektierbaren Markergen und durch Inaktivierung zumindest eines für HHV8 essentiellen Gens.
17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß die eingeführte DNA von Abschnitten des HHV8 Genoms flankiert ist, die eine homologe Rekombination mit der HHV8 DNA ermöglichen.
18. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die flankierenden homologen HHV8 Sequenzen eine Größe von > 300 bp, bevorzugt > lkbp oder darüber aufweisen.
19. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die eingeführten DNA-Sequenzen aus dem F-Plasmid von E.coli stammen.
20. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die homologen flankierenden Sequenzen aus einem für HHV8 essentiellen Gen stammen.
21. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die homologen flankierenden Sequenzen aus einem für die lytische virale DNA Replikation von HHV8 verantwortlichen Gen stammen.
22. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die rekombinante HHV8 DNA, die zumindest ein inaktiviertes essentielles Gen von HHV8, ein in Prokaryontenzellen oder Hefezellen selektierbares Markergen und die Information für die Replikation der HHV8 DNA in Prokaryonten oder Hefezellen trägt, in eine tierische oder menschliche Eukaryontenzelle eingeführt wird, die HHV8- DNA ohne die Inaktivierung des essentiellen Gens enthält.
23. Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß die rekombinante HHV8 DNA linearisiert vorliegt.
24. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß in den Eukaryontenzellen, die die rekombinante HHV8 DNA und HHV8-DNA ohne die Inaktivierung des essentiellen Gens enthalten, der lytische Zyklus von HHV8 induziert wird, um die Produktion von rekombinantem HHV8 Virusgenom zu induzieren.
25. Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß auf solche Eukaryontenzellen selektiert wird, die rekombmante HHV8 DNA enthalten.
26. RNA, die sich von der HHV8-DNA nach einem oder mehreren der Ansprüche 1-8 ableitet.
27. Verwendung einer rekombinanten DNA oder RNA nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche zur weiteren Mutagenese von HHV8 Genen und funktionellen Untersuchungen von HHV8.
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