DE102011101060A1

DE102011101060A1 - Retrovirus-Vektorsystem

Info

Publication number: DE102011101060A1
Application number: DE102011101060A
Authority: DE
Inventors: Dirk Lindemann; Erik Müllers; Sylvia Kaulfuß; Kristin Stirnnagel
Original assignee: Technische Universitaet Dresden
Current assignee: Technische Universitaet Dresden
Priority date: 2011-05-09
Filing date: 2011-05-09
Publication date: 2012-11-15
Also published as: WO2012152632A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Retrovirus-Vektorsystem mit einem Transfervektor, enthaltend mindestens eine Expressionskassette zur Aufnahme einer für ein in Bezug auf das betreffende Retrovirus heterologes, insbesondere nicht-retrovirales Genprodukt codierenden Nukleotidsequenz, der dadurch gekennzeichnet ist, dass er keine Sequenzen des betreffenden Retrovirus enthält. Weitere Gegenstände der vorliegenden Erfindung betreffen Wirtszellen, die mit dem Vektorsystem transfiziert sind, Verfahren zur Herstellung der Wirtszellen, ein Kit zur Expression eines in den Bezug auf das betreffende Retrovirus heterologen, insbesondere nicht-retroviralen Genprodukts, dass das Vektorsystem enthält, sowie ein Verfahren zur Expression eines in Bezug auf das betreffende Retrovirus heterologen, insbesondere nicht-retroviralen Genprodukts in einer Zelle unter Verwendung des Vektorsystems.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Retrovirus-Vektorsystem mit einem Transfervektor, enthaltend mindestens eine Expressionskassette zur Aufnahme einer für ein in Bezug auf das betreffende Retrovirus heterologes, insbesondere nicht-retrovirales Genprodukt codierenden Nukleotidsequenz, der dadurch gekennzeichnet ist, dass er keine Sequenzen des betreffenden Retrovirus enthält. Weitere Gegenstände der vorliegenden Erfindung betreffen Wirtszellen, die mit dem Vektorsystem transfiziert sind, Verfahren zur Herstellung der Wirtszellen, ein Kit zur Expression eines in den Bezug auf das betreffende Retrovirus heterologen, insbesondere nicht-retroviralen Genprodukts, dass das Vektorsystem enthält, sowie ein Verfahren zur Expression eines in Bezug auf das betreffende Retrovirus heterologen, insbesondere nicht-retroviralen Genprodukts in einer Zelle unter Verwendung des Vektorsystems.
Retroviren verpacken zwei Kopien ihrer RNA-Genome (+ -strängige Orientierung, einzelsträngig, daher die gleiche Struktur wie zelluläre mRNA) während der Virusgenerierung in das virale Kapsid. Während ihres Replikationszyklus werden diese verpackten RNA-Genome durch die retrovirale Reverse Transkriptase (RT) in eine Einzelkopie doppelsträngiger (ds) DNA umgewandelt und nachfolgend in das Wirtszellgenom durch einen Prozess integriert, der vom viralen Integrase-(IN)Protein abhängig ist. Der Zeitpunkt der reversen Transkription ist bei den verschiedenen Unterfamilien der Retroviren verschieden (siehe 1). Die Orthoretroviren (z. B. murines Leukämievirus (MLV), humanes Immundefizienzvirus (HIV)), revers-transkribieren ihr Genom nach dem Eintritt in die Zielzelle. Demgegenüber revers-transkribieren Spumaretroviren (Foamy Viren (FV)) ihr verpacktes RNA-Genom bereits meist während des Virusaufbaus in den virusproduzierenden Zellen. FV-Partikel, die virale dsDNA-Genome mit vollständiger Länge enthalten, sind für die Mehrheit von Infektionsereignissen verantwortlich.
Die Integration retroviraler Genome in das Wirtszellgenom führt zu einer Langzeitexpression in den infizierten Zellen. Sofern keine Integration erfolgt, sind zwei verschiedene Arten der transienten retroviralen Proteinexpression bekannt (2). Zum einen, falls weiter eine reverse Transkription stattfindet, jedoch die von der retroviralen Integrase vermittelte Integration verhindert wird, wird eine im wesentlichen transiente Transkription, ausgehend von nicht-integrierten, episomalen viralen DNA-Genomen, beobachtet. Diese episomalen viralen DNA-Genome können mit sehr geringer Häufigkeit in das Wirtszellgenom durch nicht-homologe Rekombinationsereignisse (ähnlich wie bei einer stabilen Plasmidtransfektion) integrieren, und führen zu einer Langzeitexpression in diesen Zellen. Zum zweiten können, falls keine reverse Transkription stattfindet, die zwei Kopien der verpackten viralen RNA-Genome translatiert werden, wenn sie im Zytoplasma freigesetzt werden. Im Allgemeinen führt der ersten Mechanismus zu einer längeren und stärkeren Proteintranslation als der zweite Mechanismus.
Mehrere Forschungsgruppen verwendeten diese Phänomene zur Entwicklung retroviraler Gentransfersysteme zur transienten Transgenexpression (2). So sind beispielsweise die sogenannten integrationsdefizienten retroviralen Vektoren (RV) (ΔIN-Systeme) bekannt, die eine enzymatisch inaktivierte retrovirale Integrase enthalten (Banasik et al. (2010) Gene Ther. 17:150–157). Die durch einen derartigen RV hervorgerufene Transgenexpression nimmt stetig über eine Zeitspanne von 10–14 Tagen in sich teilenden Zellen ab, kann jedoch auch stabil über Wochen in ruhenden Zellen sein. Allerdings kann selbst in sich schnell teilenden Zellen eine geringe Langzeittransgenexpression aufgrund nicht-viral vermittelter nicht-homologer Rekombination von viralen und zellulären DNA-Genomen nachgewiesen werden, die zu einer stabilen Integration des viralen Genoms in das Wirtszellgenom führt. Derartige Systeme sind auch kürzlich für auf Foamy Viren basierenden Vektoren beschrieben worden (Deyle et al. (2010) J. Virol. 84:9341–9349).
Darüber hinaus wurden transiente RV-Systeme entwickelt, bei denen ein sogenannter Partikel-vermittelnder mRNA-Transfer (PMT) stattfindet, in welchen die Umwandlung des verpackten RNA-Genoms in DNA durch katalytische Inaktivierung der Reversen-Transkriptase-Domäne des retroviralen Pol-Proteins oder durch Modifikation essentieller cis-wirkender viraler Sequenzen verhindert wird (2) (Galla et al. (2008) J. Virol. 82:3069–3077; Galla et al. (2004) Mol. Cell 16:309–315). Derartige RV ermöglichen eine transiente Transgentranslation in transduzierten Zielzellen direkt von der eingeschleusten viralen RNA, die die gleiche Struktur und Orientierung wie bei einer zellulären mRNA aufweist. Im Gegensatz zu ΔIN-Systemen ist die PMT-vermittelte Transgenexpression vollständig transient, und es wurden keine nicht-homologen Rekombinationsereignisse von viralen und zellulären Nukleinsäuren beobachtet, die in einer genetischen Langzeitmodifikation resultieren könnten. Die Höhe und Dauer der PMT-vermittelten Transgenexpression ist deutlich geringer und kürzer als diejenige durch ΔIN-RV-Systeme. Der Grund hierfür ist, dass die PMT-vermittelte Transgenexpression von den zwei Kopien des viralen RNA-Genoms pro Viruspartikel, die in das Zytoplasma der Zielzelle abgegeben werden, ausgeht, während die episomale Abgabe einer Kopie des revers transkribierten viralen DNA-Genoms pro Viruspartikel bei ΔIN-RV-Systemen zur Erzeugung mehrfacher mRNA-Kopien aufgrund der de novo Transgentranskription durch die zelluläre Transkriptionsmaschinerie und daher zur Amplifikation der Transgenexpression führt.
Beiden Systemen gemeinsam ist, dass sie sogenannte cis-wirksame virale Sequenzen zur spezifischen Verpackung von RNA in das retrovirale Partikel benötigen (2). Es wird angenommen, dass Retrovieren selektiv ihr Volllängen-RNA-Genom durch Erkennung spezifischer Verpackungssequenzen (RNA-Stamm-Schleife-Strukturen) verpacken. Es ist jedoch eine Verpackung zellulärer RNA-Sequenzen in Anwesenheit und Abwesenheit verpackter viraler RNA-Sequenzen bekannt (Piver et al. (2006) J. Virol. 80:9889–9895).
WO-A-20101111608 beschreibt ein Foamy Virus-Vektorsystem, in dem mindestens ein rekombinanter Vektor eine Expressionssequenz umfasst, die mindestens eine Komponente eines Foamy-Virus-Partikels codiert, wobei mindestens ein Codon der Expressionssequenz zur Expression in Homo sapiens optimiert ist.
Es besteht weiter Bedarf an der Verbesserung retroviraler Expressionssysteme hinsichtlich unerwünschter Einschleusungen retroviraler Sequenzen in das Wirtsgenom.
Zur Lösung dieser Aufgabe wird erfindungsgemäß ein Retrovirus-Vektorsystem bereitgestellt, das (a) einen oder mehrere rekombinante Vektor(en), der/die Expressionssequenzen enthält/enthalten, welche mindestens für die zur Herstellung verpackungsfähiger Viruspartikel essentiellen Proteine des Retrovirus codieren, und (b) einen Transfervektor umfasst, der mindestens eine Expressionskassette zur Aufnahme einer für ein in Bezug auf das Retrovirus heterologes Genprodukt, vorzugsweise ein nicht-retrovirales Genprodukt codierenden Nukleotidsequenz enthält, wobei der Transfervektor keine Sequenzen des betreffenden Retrovirus aufweist.
Des Weiteren wurde erfindungsgemäß festgestellt, dass es für eine retroviral vermittelte transiente Expression eines Genprodukts in Zielzellen ausreichend ist, in Verpackungszellen Gag- und Env-Proteine bereitzustellen, die in der Verpackungzellinie über einen geeigneten Transfervektor bereitgestellte, verpackbare RNA verpacken und so zur Transduktion geeigneter Zielzellen führen, in denen das eingeführte genetische Material zu einer transienten Expression des Genprodukts führt. Daher stellt die vorliegende Erfindung auch allgemein ein minimales retrovirales Vektorsystem bereit, dass (1) einen oder mehrere rekombinante Vektor(en), der/die in Bezug auf den betreffenden Virus nur solche Expressionssequenzen enthält/enthalten, die für die Proteine Env und Gag des Retrovirus codieren und (2) einen (beliebigen) Transfervektor umfasst, der mindestens eine Expressionskassette zur Aufnahme einer für ein Genprodukt codierenden Nukleotidsequenz enthält. Unter diesem Aspekt der vorliegenden Erfindung kann der Transfervektor auch retrovirale Sequenzen, wie bspw. cis-aktive Verpackungssequenzen enthalten.
Geeignete Retrovirus-Vektorsysteme gemäß der vorlegenden Erfindung sind bspw. HIV-1-, MLV- und Foamy-Virus-Vektorsysteme.
Die Vektoren oder der Vektor gemäß Komponente (a) des erfindungsgemäßen Vektorsystems stellt bzw. stellen bei Expression in einer geeigneten Verpackungszellinie mindestens diejenigen Virus-Proteine bereit, die für die Erzeugung und Ausschleusung verpackungsfähiger Virus-Partikel essentiell sind.
Wie bereits vorstehend dargestellt, sind dies üblicherweise mindestens die Proteine Gag und Env. Darüber hinaus können durch die Komponente (a) auch Pol und/oder weitere retrovirale Proteine, wie bspw. bei HIV-1 z. B. eines oder mehrere der Proteine Tat, Rev, Vpr und Vpu bereitgestellt werden.
Eine besonders bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Foamy-Virus-Vektorsystem, das (a1) einen rekombinanten Vektor, der eine Expressionssequenz enthält, die für ein Gag Protein eines Foamy Virus codiert, und einen rekombinanten Vektor, der eine Expressionssequenz enthält, die für ein Env Protein eines Foamy Virus codiert; oder (a2) einen rekombinanten Vektor, der eine Expressionssequenz enthält, die für ein Gag Protein eines Foamy Virus codiert, und eine Expressionssequenz enthält, die für ein Env Protein eines Foamy Virus codiert; und (b) einen Transfervektor umfasst, der mindestens eine Expressionskassette zur Aufnahme einer für ein Nicht-Foamy-Virus-Genprodukt codierenden Nukleotidsequenz enthält.
Die vorliegende Erfindung beruht auf der überraschenden Erkenntnis, dass – entgegen der Lehre des Standes der Technik – in einem retroviralen Vektorsystem wie beispielsweise HIV-1-, MLV- oder Foamy-Virus-Vektorsystemen Transfervektoren eingesetzt werden können, die keinerlei von dem betreffenden Retrovirus wie einem Foamy-Virus abgeleitete Nukleotidsequenzen, insbesondere keine cis-wirksamen Sequenzen, wie bspw. im Fall des Foamy Virus CAS I/CAS II, enthalten und zu einer ausschließlich transienten Expression eines Transgens in entsprechenden Zielzellen verwendet werden können.
Gemäß der Erfindung ist somit ein Transfervektor, der keine Sequenzen des betreffenden Retrovirus enthält, insbesondere ein Transfervektor, dessen Nukleotidsequenz derart ausgebildet ist, dass sie in einer Sequenz-Fenstergröße von etwa 100 oder mehr Nukleotiden eine Homologie zu einer Nukleotidsequenz des betreffenden Retrovirus, vorzugsweise eines beliebigen Retrovirus, von höchstens 50%, vorzugsweise höchstens 40%, mehr bevorzugt höchstens 10% oder weniger aufweist.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde, wie bereits vorstehend erwähnt, festgestellt, dass für ein erfindungsgemäß bevorzugtes funktionales Vektorsystem, basierend auf einem Foamy Virus, insbesondere prototypischen FV (PV; auch bekannt als humaner FV(HFV)), für eine effiziente Verpackung lediglich die Proteine Gag und Env über zwei rekombinante Vektoren (Komponente (a1) des erfindungsgemäßen Foamy-Virus-Vektorsystems) oder einen rekombinanten Vektor (Komponente (a2) des Foamy-Virus-Vektorsystems der vorliegenden Erfindung), der/die entsprechende Expressionssequenzen enthält/enthalten, zur Verfügung gestellt werden müssen, um infektiöse Partikel, die über den erfindungsgemäßen Transfer-Vektor bereitgestellte RNA enthält, herzustellen. In bestimmten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung kann es jedoch vorteilhaft sein, eine Expressionssequenz für ein Pol-Protein eines Foamy-Virus bereitzustellen. Eine derartige Pol-Expressionssequenz kann auf einem oder beiden der Vektoren gemäß Komponente (a1) und/oder auf dem Vektor gemäß Komponente (a2) bereitgestellt werden. In einer anderen Ausführungsform der Erfindung kann jedoch auch ein weiterer rekombinanter Vektor (c) bereitgestellt werden, der eine Expressionssequenz enthält, die für ein Pol-Protein des Foamy-Virus codiert. In einer weiteren vorteilhaften Variante dieser Ausführungsform der Erfindung ist die jeweilige Expressionssequenz für das Pol-Protein genetisch biosynthetisch inaktiviert. Weiterhin wird erfindungsgemäß ins Auge gefasst, einen oder beide der rekombinanten Vektoren gemäß (a1) oder den rekombinanten Vektor gemäß (a2) und/oder gegebenenfalls den rekombinanten Vektor gemäß (c) mit einer Expressionssequenz auszustatten, die für eine nicht-funktionale Foamy-Virusntegrase und/oder eine nicht-funktionale Foamy-Virus-Reverse-Transkriptase und/oder eine nicht-funktionale Foamy-Virus-Protease codiert.
Das Foamy-Virus-Vektorsystem der vorliegenden Erfindung ist vorzugsweise von einem humanen Foamy Virus (HFV oder auch PFV, s. o.) abgeleitet, kann jedoch auch von aus Affen isolierten Foamy Viren (SFV) oder anderen Säugetieren isolierten Foamy Viren oder Mischformen abgeleitet sein bzw. auf solchen basieren.
Erfindungsgemäß ist es weiter bevorzugt, mindestens eine der Expressionssequenzen (also z. B. im Fall des Foamy-Virus-Vektorsystems insbesondere Gag und/oder Env und/oder Pol) zur Expression in Homo sapiens zu optimieren. In Bezug auf das Foamy-Virus-Vektorsystem wird in diesem Zusammenhang ausdrücklich auf die WO-A-2010/116111608 und deren diesbezüglichen Offenbarungsgehalt verwiesen.
Besonders bevorzugte Transfervektoren der vorliegenden Erfindung weisen eine Nukleotidsequenz auf, die aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 2, ausgewählt ist. Der Vektor gemäß SEQ ID NO: 1 wird auch als Vektor pczi bezeichnet und wurde auf Basis des pcDNA3.1 +zeo Vektors (Invitrogen) und des CMV Introns A der pHIT Vektoren (Soneoka et al. (1995) Nucleic Acids Res. 23(4), 628–633) hergestellt (siehe Heinkelein et al. (2002) J. Virol. 76(9), 3774–3783). Der Vektor gemäß SEQ ID NO: 2 wird auch als Vektor pSFFVU3 bezeichnet und basiert auf dem pEGFP-Vektor (Clontech), bei dem der CMV Promoter durch eine SFFV U3 Promotor-Variante ersetzt wurde, bei der eine 42 Bp-Duplikation (GCAGTTTCGGCCCCGGCCCGGGGCCAAGAACAGATGGTCACC; SEQ ID NO: 3) des vollständigen SFFV U3 Promotors fehlt. Weitere Merkmale der Vektoren gemäß SEQ ID NO: 1 und 2 sind dem beigefügten Sequenzprotokoll zu entnehmen.
Ein „Genprodukt” gemäß der vorliegenden Erfindung kann jegliches Produkt sein, das über eine Expressionskassette in einem in der vorliegenden Offenbarung definierten Transfervektor in geeigneten Zielzellen exprimierbar ist. Dabei umfasst erfindungsgemäß der Ausdruck „Genprodukt” unmittelbar aus der Transkription hervorgehende Expressionsprodukte als auch auf von dem Transkriptionsprodukt abgeleitete Expressionsprodukte wie insbesondere Translationsprodukte oder Produkte, die aus einer Prozessierung des unmittelbaren Genprodukts hervorgehen. Eine in einer Expressionskassette eines Transfervektors der vorliegenden Erfindung eingefügte Nukleotidsequenz kann in einer Ausführungsform für Peptide oder Proteine, insbesondere nicht-retroviralen Ursprungs, insbesondere in Bezug auf den jeweiligen Retrovirus heterologe Peptide und/oder Proteine (z. B. ein Nicht-Foamy-Virus-Protein) codieren. Der Fachmann kennt selbstverständlich weitere Transkriptionsprodukte, die in Zellen nicht in Peptide/Proteine translatiert werden. Beispiele hierfür sind tRNAs. Weitere nicht-peptidische bzw. nicht-proteianartige Genprodukte sind Antisense-RNAs, siRNAs, shRNAs, miRNAs (auch als microRNAs bekannt), pre-miRNAs und pri-miRNAs.
Bevorzugt ist in dem Transfervektor der erfindungsgemäßen Vektorsysteme in die Expressionskassette funktional eine Nukleotidsequenz eingefügt, die für mindestens ein heterologes, insbesondere nicht-retrovirales Protein codiert. Die Nukleotidsequenz kann ebenfalls mindestens teilweise für ein Reporterprotein oder – peptid codieren. Geeignete Reporterproteine bzw. -peptide sind im Stand der Technik bekannt. Beispielsweise kann das Reporterprotein ein GFP-Protein oder eine Derivat davon wie beispielsweise EGFP und ähnliche Fluoreszenz generierende Proteine sein.
Der Begriff „Expressionssequenz” bedeutet erfindungsgemäß eine Nukleotidsequenz, in welcher eine Nukleotidsequenz, die für ein Protein, beispielsweise eines Foamy-Virus-Proteins wie Gag, Env bzw. Pol codiert, vorliegt und gegebenenfalls operabel mit geeigneten Promotor und Terminator-Sequenzen verbunden ist, so dass das Protein in einer geeigneten Wirtszelle exprimiert wird. Weitere funktionale Sequenzen, die mit der Expressionssequenz verbunden sein können, sind Enhancersequenzen, IRES-Sequenzen und andere einem Fachmann bekannte funktionale Elemente, die zur Steuerung der Expression eines Proteins in einer Wirtszelle geeignet sind. Selbstverständlich stellt auch ein erfindungsgemäßer Transfervektor, in dem eine für mindestens ein Genprodukt codierende Nukleotidsequenz in die Expressionskassette eingefügt ist, einen Vektor dar, der im Sinne der vorliegenden Erfindung eine entsprechende „Expressionssequenz” enthält. Somit gelten auch für den Transfervektor die obigen Ausführungen in Bezug auf mit der Expressionskassette (d. h. ohne eingefügte Nukleotidsequenz, die für mindestens ein Genprodukt codiert) bzw. der Expressionssequenz (d. h. mit eingefügter Nukleotidsequenz, die für mindestens ein Genprodukt codiert) operabel verbundener funktionaler Sequenzelemente entsprechend.
Die in dem Transfervektor gemäß der vorliegenden Erfindung vorhandene Expressionskassette ist somit eine Nukleotidsequenz, die wie vorstehend dargelegte expressionssteuerende Elemente enthält und vorzugsweise mit einer multiplen Klonierungsstelle (MCS) ausgestattet ist und/oder Sequenzen zur homologen Rekombination zur Einfügung einer für das gewünschte Genprodukt, wie bspw. ein Protein, insbesondere ein nicht-retrovirales Protein, z. B. ein Nicht-Foamy-Virus-Protein, codierenden Nukleotisequenz enthält.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Anmeldung ist eine Wirtszelle, die mit einem Vektorsystem der vorliegenden Erfindung transfiziert ist.
Geeignete Wirtszellen sind beispielsweise bakterielle Zellen wie E. coli, um das erfindungsgemäße Vektorsystem und/oder dessen Komponenten zu propagieren. Weitere bevorzugte Wirtszellen sind solche, die zur Herstellung und Ausschleusung von Retrovirus-Partikeln durch Expression mindestens der essentiellen VirusProteine über den/die Vektoren gemäß Bestandteil (a) bzw. Bestandteil (1) der Vektorsysteme der vorliegenden Erfindung ausgelegt sind. Im Fall eines bevorzugten retroviralen Systems wie einem erfindungsgemäßen Foamy-Virus-Systems sind die bevorzugten Wirtszellen daher z. B. solche, die zur Herstellung und Ausschleusung von Foamy-Virus-Partikeln durch Expression mindestens der Gag- und Env-Proteine eines Foamy Virus über die Vektoren gemäß (a1) beziehungsweise den Vektor gemäß (a2) ausgelegt sind. Beispiele solcher Zellen sind insbesondere Zelllinien wie humane 293 oder 293T-Zellen und Primaten-Zelllinien wie Cos1- oder Cos7-Zellen.
Derartige Wirtszellen (auch als Verpackungszelllinien bezeichnet) dienen somit der Herstellung infektiöser Viruspartikel bzw. Virus-ähnlicher Partikel (engl. virus-like particles, VLPs), welche die genetische Information zur Expression des gewünschten Genprodukts enthalten und bei Einschleusung in mit Retrovirus-Partikeln (Virionen) transduzierbare Zellen zur Expression des vom Transfervektor codierten Genprodukts führen.
Durch das jeweilige Retrovirus transduzierbare Zellen sind einem Fachmann bekannt. So sind z. B. aufgrund der großen Wirtsbreite von Foamy Viren eine Vielzahl an Zellen zur Infektion mit Foamy-Virus-Partikeln geeignet und schließen beispielsweise Säugetier-, Vogel-, Reptilien- und Amphibien-Zellen ein. Bevorzugte Zellen zur Infektion mit retroviralen Partikeln wie bspw. Foamy-Virus-Partikeln sind humane Zellen wie beispielsweise die in den unten aufgeführten Beispielen verwendete Zelllinie HT1080.
Die erfindungsgemäßen Gegenstände werden vorteilhafter Weise zu Kits zusammengestellt, mit denen die Expression eines gewünschten Genprodukts wie bspw. eines heterologen, insbesondere nicht-retroviralen wie bspw. eines Nicht-Foamy-Virus-Proteins bewerkstelligt werden kann. So umfasst unter einem weiteren Gesichtspunkt der Erfindung ein Kit zur Expression eines erfindungsgemäßen Genprodukts wie bspw. eines in Bezug auf das betreffende Retrovirus heterologen, vorzugsweise nicht-retroviralen Proteins wie eines Nicht-Foamy-Virus-Proteins

(i) ein wie vorstehend definiertes Vektorsystem und
(ii) Zellen, die als wie vorstehend definierte Verpackungszellen geeignet sind. In einer weiteren Ausführungsform umfasst das erfindungsgemäße Kit außerdem
(iii) Zellen, die zur Infektion mit Retrovirus-Partikeln wie z. B. Foamy-Virus-Partikeln geeignet sind. In diesem Zusammenhang ist noch einmal darauf hinzuweisen, dass derartige Zellen vorzugsweise auch durch entsprechende VLPs des betreffenden Virus transduzierbar sind.

Das erfindungsgemäße Kit kann somit auch wie vorstehend definierte Wirtszellen (Verpackungszellen) zusammen mit den zur Infektion mit Retrovirus-Partikeln geeigneten Zellen enthalten.
Durch die Verwendung des erfindungsgemäßen Vektorsystems in Verbindung mit geeigneten Zellen ergibt sich als weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung auch ein Verfahren zur Expression des jeweils gewünschten Genprodukts wie z. B. eines heterologen, insbesondere nicht-retroviralen wie bspw. Nicht-Foamy-Virus-Proteins in einer Zelle, das die Schritte

(A) Transfizieren einer Zelle mit einem Vektorsystem gemäß der vorliegenden Erfindung, bei dem der Transfervektor eine in die Expressionskassette funktional eingefügte Nukleotidsequenz enthält, die für mindestens ein Genprodukt , insbesondere ein in Bezug auf das Retrovirus heterologes Genprodukt, wie bspw. ein nicht-retrovirales Protein codiert, wobei die Nukleotidsequenz auch für ein Reporterprotein oder –peptid codieren kann, und wobei die Zelle zur Bildung und Ausschleusung von Retrovirus-Partikeln (z. B. Foamy-Virus-Partikeln) aufgrund der Expression mindestens der essentiellen Virus-Proteine über den/die Vektor(en) gemäß Bestandteil (a) bzw. (1) der erfindungsgemäßen Vektorsysteme (also z. B. Gag- und Pol-Proteine eines Foamy Virus über die Vektoren gemäß (a1) beziehungsweise den Vektor gemäß (a2) nach obiger Definition) ausgelegt ist,
(B) Kultivieren der transfizierten Zelle in einem Kulturmedium unter Bedingungen, die die Bildung und Ausschleusung von Retrovirus-Partikeln in das Kulturmedium erlauben,
(C) Gewinnen eines Retrovirus-Partikel enthaltenen Überstands aus der Kultur von Schritt (B) und
(D) Transduzieren von Zellen, die zur Infektion mit Retrovirus-Partikeln geeignet sind, mit dem gegebenenfalls verdünnten Kulturüberstand von Schritt (C), umfasst.

Geeignete Bedingungen und Kulturmedien gemäß Schritt (B) sind einem Fachmann bekannt und können beispielsweise der neuestens Ausgabe von Ausubel et al. (Ed.) „Current Protocols in Molecular Biology", Wiley, New York, entnommen werden. Diesbezüglich wird für Foamy-Virus-Systeme der vorliegenden Erfindung insbesondere auch auf die Beispiele in WO-A-2010/111608 verwiesen. Gleiches gilt entsprechend auch für die zur Infektion mit Foamy-Virus-Partikeln geeigneten Zellen.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Expression eines wie vorliegend definierten Genprodukts, vorzugsweise eines nichtretroviralen Genprodukts wie einem nicht-retroviralen, insbesondere Nicht-Foamy-Virus-Protein in einem Wirtsorganismus, umfassend das Einbringen einer wie vorstehend definierten Wirtszelle (Verpackungszelle), die zur Bildung und Ausschleusung von Retrovirus-Partikeln (z. B. Foamy-Virus-Partikeln) aufgrund der Expression mindestens der essentiellen Virus-Proteine über den/die Vektor(en) gemäß Bestandteil (a) bzw. (1) der erfindungsgemäßen Vektorsysteme (also z. B. Gag- und Pol-Proteine eines Foamy Virus über die Vektoren gemäß (a1) beziehungsweise den Vektor gemäß (a2) nach obiger Definition) ausgelegt ist, in den Wirtsorganismus, wobei ein oder mehrere Zelle(n) des Wirtsorganismus durch Retrovirus-Partikel wie z. B. Foamy-Virus-Partikel transduzierbar ist/sind.
Der Wirtsorganismus kann ein humaner oder nicht-humaner, insbesondere Säugetier-Wirtsorganismus sein. Die Expression des Genprodukts wie eines heterologen Genprodukts, insbesondere eines nicht-retroviralen, vorzugsweise Nicht-Foamy-Virus-Proteins in dem Wirtsorganismus kann vorteilhafter Weise dazu genutzt werden, einen genetischen Defekt des Wirtsorganismus zu behandeln. Bspw. ist es so möglich, ein in dem Wirtsorganismus aufgrund eines genetischen Defekts nicht oder unzureichend exprimiertes Protein durch Expression über das Vektorsystem der vorliegenden Erfindung dem Wirtsorganismus in ausreichender Menge bereitzustellen. Gleiches gilt auch für eine aufgrund eines genetischen Defekts exprimierte Proteinmutante, das die natürliche Funktion des Wildtyp-Proteins nicht oder nur in unzureichender Weise ausübt. In weiteren bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung kann durch Expression von RNAi auslösenden Genprodukten (z. B. siRNA, shRNA, miRNA, pre-miRNA, pri-miRNA) in dem Wirtsorganismus eine Genregulation durchgeführt werden, um bspw. ein mit einer Erkrankung assoziiertes Gen herunterzuregulieren bzw. abzuschalten.
Die Figuren zeigen:
1: zeigt eine schematische Darstellung verschiedener retroviraler Replikationsstrategien.
2: zeigt eine schematische Darstellung unterschiedlicher retroviraler Vektorsysteme zur transienten Transgenexpression.
3: zeigt graphische Darstellungen der durchflusszytometrischen Analyse des zeitlichen Verlaufs der Transgenexpression verschiedener FV Vektoren in Zielzellen. PFV Vektorüberstände wurden durch transiente Transfektion von 293T Zellen unter Verwendung eines expressions-optimierten 4-Komponenten PFV Vektorsystems hergestellt. Dieses Vektorsystem besteht aus dem Transfervektor puc2MD9, der eine interne SFFV U3 getriebene EGFP Expressionskassette enthält, sowie den Verpackungskonstrukten pcoPE (Env), pcoPG4 (Gag) and pcoPP (Pol). Die Vektorpartikel unterscheiden sich in der Art des kotransfizierten Pol Verpackungskonstruktes. Wt: pcoPP (wt, alle enzymatischen Aktivitäten intakt); pcoPP1 (iPR, enzymatisch inaktivierte Protease); pcoPP2 (iRT, enzymatisch inaktivierte Reverse Transkriptase); pcoPP3 (iIN, enzymatisch inaktivierte Integrase). Anschließend wurden HT1080 Zielzellen mit unverdünntem viralen Vektorüberstand transduziert und die EGFP Expression in den Zellpopulationen mittels Durchflusszytometrie im zeitlichen Verlauf analysiert. Virale Partikel mit enzymatisch inaktivierter Protease (iPR) oder Reversen Transkriptase (iRT) ermöglichen eine schwache und kurz anhaltenden transienten EGFP Expression. Partikel mit einer enzymatisch inaktivierten Integrase (iIN) führen zu einer stärkeren aber weitestgehend transienten EGFP Expression wohingegen wildtypische Partikel zu einer starken konstitutiven Transgenexpression führen.
4: zeigt die Eigenschaften verschiedener Ausführungsformen von PFV-Transfervektorkonstrukten der vorliegenden Erfindung.

(A) Schematische Darstellung der Transfervektoren pMD9, SFFV U3 EGFP PFV3' und des erfindungsgemäßen Vektors SFFV U3 EGFP. pMD9: Standard PFV-Transfervektor mit einer internen SFFV-U3-getriebenen EGFP-Transgenkassette und essentiellen PFV cis-aktiven Verpackungssequenzen (CAS I, CAS II); SFFV U3 EGFP PFV 3': SFFV U3-getriebene EGFP-Expressionsvektoren der 3'-Teile des PFV-Vektorgenoms enthält, jedoch keine cis-aktiven Verpackungssequenzen aufweist; SFFV U3 EGFP: SFFV U3-getriebener EGFP-Expressionsvektor, der keinerlei PFV-Sequenzen enthält.
(B) FACS Dotblot Profile von HT1080 Zielzellen 48 h nach Transduktion mit unverdünntem zellfreiem 293T Überstand. MFI: Mittlere Fluoreszenzintensität.
(C) Es wurden HT1080 Zielzellen mit unverdünntem viralen Vektorüberstand transduziert, und die stabile als auch transiente EGFP-Transgenexpression durch Durchflusszytometrie bestimmt. Die Partikelfreisetzung und Pol-Verpackung wurde durch Western blot von Partikel- und Zelllysaten überprüft. Die Viruspartikel-assoziierte Nukleinsäurezusammensetzung wurde mittels qPCR bestimmt. Gezeigt sind die jeweiligen Werte, ausgehend von den jeweiligen Transfervektoren.

5: zeigt den Einfluss von transgenen Transkriptionskontrollelementen auf die RNA-Transfereffizient.

(A) Schematische Darstellung der Transfervektoren pSFFV U3 EGFP und pcziEGgP (CMV immediate early Promoter/Enhancer Intron A).
(B) PFV-Vektoren wurden durch transiente Transfektion von 293T-Zellen unter Verwendung eines Codon-optimierten 4-Komponenten PFV-Vektorsystems gemäß WO-A-2010/111608 unter der Verwendung der Transfervektoren gemäß (A) hergestellt. Nachfolgend wurden HT1080-Zielzellen mit unverdünntem Virusvektorüberstand oder einer 1:10-Verdünnung davon transduziert und die EGFP-Transgenexpression durch Durchflusszytometrie zeitabhängig gemessen.
(C) Durchschnittliche EGFP-Fluoreszenzintensität der gesamten Zielzellenpopulation über die Zeit.

6: Zeitverlauf der transienten EGFP-Expression in transduzierten HT1080-Zellen. PFV-Vektoren wurden durch transiente Transfektion von 293T-Zellen unter Verwendung eines expressionsoptimierten 4-Komponenten PFV-Vektorsystems gemäß WO-A-2010/111608 unter Verwendung des pcziEGgP-Transfervektors der vorliegenden Erfindung wie bei 3 beschrieben hergestellt. Nachfolgend wurden HT1080-Zielzellen mit unverdünntem Virusvektorüberstand transduziert und die EGFP-Transgenexpression zeitabhängig durch Durchflusszytometrie gemessen.

(A) Übereinandergelegte Histogramme der EGFP-Expression über die Zeit.
(B) Durchschnittliche EGFP-Fluoreszenzintensität der gesamten Zielzellpopulation über die Zeit.

7: Vergleich der transienten und stabilen Gentransfereffizienz durch retrovirale Vektorsysteme, die von verschiedenen Retrovirusspezies abgeleitet sind. Retrovirale Vektoren wurden durch transiente Transfektion von 293T-Zellen unter Verwendung eines Codonoptimierten 4-Komponenten PFV-Vektorsystems (PFV) oder konventionellen Maus Leukämie Virus (MLV) oder Humanen Immundefizienz Virus (HIV)-basierten Vektorsystemen unter Verwendung von Transfervektoren der vorliegenden Erfindung zur transienten (A) oder stabilen (B) Transgenexpression erzeugt. Nachfolgend wurden HT1080-Zielzellen mit unverdünntem viralen Vektorüberstand im Falle der transienten Transfervektoren (A) oder einer Serie 10-facher Verdünnungen für die stabilen Transfervektoren (B) transduziert und die EGFP-Transgenexpression zeitabhängig durch Durchflusszytometrie gemessen. Die Titer der stabilen Transfervektorüberstände wurden aus den Tag 3 Postinfektion d3-Durchflusszytometriedaten berechnet.
8, Bestimmung essentieller viraler Komponenten für den stabilen bzw. transienten Gentransfer. Retrovirale Vektoren wurden durch transiente Transfektion von 293T-Zellen unter Verwendung von verschiedenen Kombinationen aus Verpackungsplasmiden und Transfervektoren für eine stabile (MD9 qP) oder transient Markergenexpression (EGgP) hergestellt. Es wurden Verpackungskonstrukte für wildtypisches Gag (Gag wt), Pol (Pol wt) und Env (Env wt) wie auch Pol Varianten mit enzymatisch inaktivierter RT Domäne (Pol iRT) oder Integrase Domäne (iIN) und Env Varianten für fusions-inaktives Hüllprotein (Env iSU/TM) in einzelnen Kombinationen verwendet. Nachfolgend wurden HT1080-Zielzellen mit seriell verdünntem Vektorüberstand transduziert und die EGFP-Transgenexpression zeitabhängig durch Durchflusszytometrie gemessen. A) Die Titer der Transfervektorüberstände wurden aus den Tag 2 Postinfektion-Durchflusszytometriedaten berechnet. Dargestellt sind die relativen Infektiositäten im Vergleich zum authentischen 4-Komponenten PFV Vektorsystem. B) Mittlere Fluoreszenzintensität der gesamten Zielzellpopulation 48 h nach Transduktion mit unverdünntem Vektorüberstand. Wt: wildtypisches Plasmid; –: entsprechendes Verpackungsplasmid wurde durch pUC19 DNA ersetzt.
9 RNA Transfer-vermittelte Cre Rekombinase Expression in R26R-YFP Maus Embryo Fibroblasten. PFV Vektorüberstände wurden durch transiente Transfektion von 293T Zellen unter Verwendung eines expressions-optimierten 4-Komponenten PFV Vektorsystems gemäß WO-A-2010/111608 unter Verwendung von verschiedenen retroviralen (MD9 qP, MD9 Cre) oder RNA (EGgP, Cre) Transfervektoren der vorliegenden Erfindung wie unter 3 beschrieben hergestellt. Nach Transduktion von R26R-YFP embryonalen Maus Fibroblasten (MEF) mit unverdünnten zellfreien Vektorüberständen wurde die EGFP/EYFP Expression im zeitlichen Verlauf durchflusszytometrisch analysiert. Dargestellt ist A) der Prozentsatz markergenpositiver Zellen und B) die mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) der ganzen Zellpopulation.
Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden nicht-einschränkenden Bespiele näher erläutert:
BEISPIELE
Beispiel 1
Um die Notwendigkeit der foamyviralen enzymatischen Funktionen für die stabile genetische Modifikation von Zielzellen mittels foamyviraler Vektoren zu bestimmen, wurden mit einem Standard-PFV-Transfervektor (pMD9, 4A) verschiedene EGFP-Transgen enthaltende FV-Vektorpartikel produziert. Diese unterschieden sich in der Art des verwendeten FV-Pol-Verpackungsplasmids. Es wurden Partikel hergestellt, die ein wildtypisches Pol-Protein (wt), oder Pol-Protein-Varianten enthielten, die entweder eine enzymatisch inaktive Domäne der Protease (IPR), der Reversen Transkriptase (iR) oder der Integrase (iIN) beinhalteten. Nach Transduktion von permissiven Zielzellen wurde die EGFP-Transgenexpression durchflusszytometrisch über einen Zeitraum von 14 Tagen analysiert (3). Bei Vektorüberständen, die Pol-Proteine mit inaktiver Integrase enthielten, wurde initial eine nahezu wildtypische Transgenexpression beobachtet, die aber innerhalb einer Woche auf ein stark verringerte stabile Expression zurückging. Diese Viren können ihr verpacktes RNA-Genom revers transribieren, allerdings nicht über die virale Enzymfunktion sondern nur über nicht-homologe Rekombinationsmechanismen (ähnlich stabil transfizierten Plasmiden) in das Wirtsgenom integrieren. Bei Vektorüberständen, die Pol-Proteine mit inaktiver Protease oder inaktiver Reverser Transkriptase enthielten, wurde im Vergleich zu wildtypischen FV-Vektoren eine sehr schwache und nur wenige Tage anhaltende Transgenexpression gemessen. Diese Partikel sind nicht in der Lage, das verpackte RNA-Genom in DNA umzuschreiben. Die Transgenexpression erfolgt hier also als direkte Translation der verpackten RNA. Welche Art von verpackter RNA für die Transgenexpression translatiert wird ist unklar. Die genomische Volllängen-RNA, welche die essentiellen cis-aktiven viralen Sequenzen CASI und CASII enthält, sollte auf Grund der enthaltenden extensiven 5'-untranslatierten (UT-) Regionen nicht zu einer Transgenexpression führen (4A). Auch die im FV 5' LTR initierende, einfach gespleisste mRNA vertügt noch über große 5'-UT-Bereiche, so dass auch sie keine Transgenexpression ermöglichen sollte (4A). Lediglich die vom internen Promotor initierende, ungespleisste mRNA der Transgenkassette verfügt über gutes translationales Potential (4A). Dies legt nahe, dass FV-Vektorpartikel neben der viralen genomischen RNA auch signifikante Mengen an subgenomischen mRNAs verpacken, die hauptsächlich zur transienten Transgenexpression von Vektoren beitragen, die keine reverse Transkription der verpackten RNAs durchlaufen können. Deshalb sollte getestet werden, ob FV-Vektorpartikel, denen in der Verpackungszelle nur Transgen-haltige RNAs ohne die essentiellen viralen cis-aktiven Sequenzen (CASI und CASII) angeboten werden, diese verpacken und zu deren Translation in Zielzellen führen können. Hierzu wurde neben den FV-Verpackungsplasmiden für Gag, Pol und Env während der Vektorproduktion Expressionsvektoren kotransfiziert, die entweder nur die im Standard PFV Vektor pMD9 enhaltende Transgenexpressionkassette mit einem zusätzlichen Poly-Adenylierungssignal enthielten (pSFFV U3 EGFP) oder anstelle dessen über die 3'-LTR-Sequenzen des pMD9-Vektors (pSSFV U3 EGFP PFV 3') verfügten (4A). Die Analyse der verschiedenen Vektorpartikel und der durch sie transduzierten Zielzellen ergab, dass die transiente Transgenexpression auf einem ähnlichen oder sogar leicht erhöhtem Niveau lag wie sie bei einem Standard-Transfervektor und RT inaktivierter Polymerase gemessen wurde (4B, C). Auch der Gehalt an EGFP-Gen haltiger RNA in den viralen Partikeln war nahezu identisch (4C). Dieser Befund legt nahe, dass PFV-Partikel mRNAs, die keine authentischen PFV Sequenzen enthalten effizient verpacken und nach Transduktion in Zielzellen zu deren Translation bringen können.
Beispiel 2
Es ist bekannt, dass Spleissen von mRNAs mit der Bindung von snRNAs und des Spleissosom-Komplexes diese stabilisieren und für den nukleären Export markieren kann. Um den Einfluss der Transkriptionskassette auf den FV-Kapsid-vermittelten RNA Transfer zu analysieren, wurden gleiche Mengen verschiedener EGFP-transgenhaltiger Expressionsvektoren mit PFV Gag, Pol und Env Verpackungsplasmiden zur Vektorpartikelproduktion kotransfiziert (5A). Nach Transduktion von Zielzellen mit verschiedenen Verdünnungen vektorhaltiger Überstände wurde die Transgenexpression im zeitlichen Verlauf durchflusszytometrisch analysiert. Die Ergebnisse zeigen, dass die Zielzell-Transgenexpression (gekennzeichnet durch die gemessene MFI) durch Vektorpartikel, die mit einem CMV Promoter – Intron getriebenen Transfervektor produziert wurden, zu allen Zeitpunkten wesentlich höher war als diejenige von Vektorpartikeln, die mit einem intronlosen, SFFVU3 Promoter getriebenen Transfer erreicht wurde (5B, C). Die transiente Expression nahm bei den höchsten eingesetzten Virusmengen im zeitlichen Verlauf der Messungen innerhalb von 6 Tagen kontinuierlich bis auf negative Kontrollwerte ab (5B, C).
Eine genauere Analyse des zeitlichen Verlaufs der transienten EGFP-Transgenexpression, die durch Vektorpartikel, die mit Hilfe eines CMV Promoter – Intron getriebenen Transfervektors hergestellt wurden, ermöglicht wurde, ergab, dass eine maximale Fluoreszenzintensität nach 36–48 Std beobachtet werden konnte (6). Allerdings konnte bereits 1 Std. nach Transduktion eine deutliche Transgenexpression gemessen werden.
Beispiel 3
Als nächstes wurde analysiert, ob andere retrovirale Vektorsysteme ebenfalls zu einem RNA-Transfer fähig sind, der unabhängig von viralen Sequenzen auf dem Transfervektor ist, und deren Effizienz mit den FV-Vektorsystemen verglichen. Hierzu wurden HIV-1-, MLV- und PFV-Vektorpartikel durch Kotransfektion eines CMV Promoter – Intron getriebenen Transfervektors mit den jeweiligen Verpackungsplasmiden kotransfiziert und die Transgenexpression in Zielzellen nach Transduktion mit unverdünnten Vektorüberständen durchflusszytometrisch bestimmt (7). Zum Vergleich wurden parallel analoge Vektorpartikel mit den entsprechenden Standard-Transfervektoren für eine konstitutive, stabile Transgenexpression hergestellt, und deren Titer mittels durchflusszytometrischer Analyse 72 Std. nach Transduktion auf der gleichen Zielzellart bestimmt. Die Ergebnisse zeigen, dass absolut gesehen der PFV-vermittelte RNA-Transfer mindestens 3-fach stärker als der HIV-1 vermittelte ist, während nur ein sehr schwacher MLV-vermittelter RNA-Transfer gemessen wurde (7A). Zieht man die Titer der analogen Vektorüberstände für eine stabile Transgenexpression als Maß für die physikalische Partikelmenge mit in die Betrachtung ein, so ist die RNA-Transfereffizienz pro Vektorpartikel bei PFV Vektoren im Vergleich zu derjenigen von HIV-1 etwa 50-fach höher (7B).
Beispiel 4
Für einen stabilen Gentransfer mit konstitutiver Transgenexpression mittels retroviraler Vektoren sind neben dem Transfervektor, der über bestimmte essentielle cis-aktive Sequenz verfügen muss, Verpackungsplasmide der Strukturproteine Gag und Env, wie auch der Enzymaktivitäten des Pol Proteins, Protease, Reverse Transkriptase und Integrase unabdingbar (8A). Um zu bestimmen, welche Komponenten des PFV-Vektorsystems für den RNA-Transfer, der zu einer transienten Transgenexpression in Zielzellen führt, notwendig sind, wurde ein CMV Promoter – Intron getriebener Transfervektor mit verschiedenen Kombinationen von Verpackungsplasmiden kotransfiziert. Das Potential der so erzeugten Vektorüberstände, eine transiente Markergenexpression in Zielzellen zu erzeugen, wurde anschließend mittels durchflußzytometrischer Analyse bestimmt (8B). Die Ergebnisse zeigen, dass das FV-Kapsidprotein Gag essentiell ist. Allerdings spielt es keine Rolle, ob nur das p71^Gag-Vorläufer, das p68^Gag-Prozessierungsprodukt oder ein Gemisch aus beiden verwendet wurde. Gag alleine reichte allerdings nicht für eine Markergenexpression in Zielzellen aus. Für einen effizienten RNA-Transfer mussten Partikel neben Gag auch ein fusionsfähiges FV-Env-Protein enthalten. Env alleine konnte zwar einen RNA-Transfer in Ziellzellen ermöglichen, die Effizienz der Transgenexpression war jedoch mindestens 150-fach geringer als in der Anwesenheit von Gag. FV-Pol, seine Reverse-Transkriptase- oder Integrase-Aktivität hingegen waren für eine RNA-Transduktion nicht essentiell.
Beispiel 5
Sämtliche bisherigen Daten zeigen, dass ein effizienter Transfer und eine Translation EGFP-ORF-haltiger RNAs mittels FV-Vektorpartikeln in Zielzellen möglich ist. Um eine breitere Fähigkeit dieses Systems zu demonstrieren, wurden FV-Transfervektoren für eine stabile bzw. transiente Expression einer humanisierten Form der Cre-Rekombinase hergestellt, entsprechende virale Vektorüberstände produziert und die enzymatische Funktion in Zielzellen bestimmt (9A). Es wurden embryonale Maus-Fibroblasten als Zielzellen transduziert, die eine LoxP flankierte EYFP-Expressionskassette im ROSA26-Locus enthielten, die nur nach erfolgter Cre-vermittelter Rekombination transkriptionell aktiv wird (Srinivas 2001) (9). Die Daten zeigen, dass auch ein Cre-Transgen effizient in Zielzellen transient funktionell exprimiert werden kann, das eine YFP-Markergenexpression nach genomischer Rekombination aktiviert. Der direkte EGFP-Markergentransfer mittels Standard-PFV-Transfervektoren führte zu einem stabilen Markergentransfer, während die EGFP-Expression nach RNA-Transfer kontinuierlich im Beobachtungszeitraum abnahm.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
Zitierte Patentliteratur

WO 20101111608 A [0007]
WO 2010/116111608 A [0019]
WO 2010/111608 A [0032, 0040, 0041, 0044]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

Banasik et al. (2010) Gene Ther. 17:150–157 [0004]
Deyle et al. (2010) J. Virol. 84:9341–9349 [0004]
Galla et al. (2008) J. Virol. 82:3069–3077 [0005]
Galla et al. (2004) Mol. Cell 16:309–315 [0005]
Soneoka et al. (1995) Nucleic Acids Res. 23(4), 628–633 [0020]
Heinkelein et al. (2002) J. Virol. 76(9), 3774–3783 [0020]
Ausubel et al. (Ed.) „Current Protocols in Molecular Biology”, Wiley, New York [0032]

Claims

Retrovirus-Vektorsystem, umfassend (a) einen oder mehrere rekombinante(r) Vektor(en), der/die Expressionssequenzen enthält/enthalten, welche mindestens für die zur Herstellung verpackungsfähiger Viruspartikel essentiellen Proteine des Retrovirus codieren, und (b) einen Transfervektor, der mindestens eine Expressionskassette zur Aufnahme einer Nukleotidsequenz, die für ein in Bezug auf das Retrovirus heterologes Genprodukt Genprodukt codiert, enthält, wobei der Transfervektor keine Sequenzen des betreffenden Retrovirus enthält.
Vektorsystem nach Anspruch 1, wobei das Retrovirus aus der Gruppe, bestehend aus HIV-1, MLV und Foamy Virus, ausgewählt ist.
Vektorsystem nach Anspruch 2, umfassend (a1) einen rekombinanten Vektor, der eine Expressionssequenz enthält, die für ein Gag Protein eines Foamy Virus codiert, und einen rekombinanten Vektor, der eine Expressionssequenz enthält, die für ein Env Protein eines Foamy Virus codiert; oder (a2) einen rekombinanten Vektor, der eine Expressionssequenz enthält, die für ein Gag Protein eines Foamy Virus codiert, und eine Expressionssequenz enthält, die für ein Env Protein eines Foamy Virus codiert; und (b) einen Transfervektor, der mindestens eine Expressionskassette zur Aufnahme einer für ein Nicht-Foamy-Virus-Genprodukt codierenden Nukleotidsequenz enthält, wobei der Transfervektor keine Foamy-Virus-Sequenzen enthält.
Vektorsystem nach Anspruch 3, wobei einer oder beide der Vektoren gemäß (a1) weiter eine Expressionssequenz enthält, die für ein Pol Protein eines Foamy Virus codiert, oder wobei der Vektor gemäß (a2) weiter eine Expressionssequenz enthält, die für ein Pol Protein eines Foamy Virus codiert, oder wobei das Vektorsystem weiter (c) einen rekombinanten Vektor umfasst, der eine Expressionssequenz enthält, die für ein Pol Protein eines Foamy Virus codiert.
Vektorsystem nach Anspruch 4, wobei die Expressionssequenz für ein nicht-funktionales Pol Protein eines Foamy Virus codiert.
Vektorsystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Expressionskassette des Transfervektors einen Promotor umfasst, der aus der Gruppe, bestehend aus SFFV U3, CMV, CAGG und MLV LTR, ausgewählt ist.
Vektorsystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei mindestens eine der Expressionssequenzen zur Expression in Homo sapiens optimiert ist.
Vektorsystem nach einem der Ansprüche 3 bis 7, wobei mindestens einer der rekombinanten Vektoren gemäß (a1) oder der rekombinante Vektor gemäß (a2) und/oder ggf. der rekombinante Vektor gemäß (c) eine Expressionssequenz enthält/enthalten, die für eine nicht-funktionale Foamy Virus Integrase und/oder eine nicht-funktionale Foamy-Virus-Reverse-Transkriptase und/oder eine nicht-funktionale Foamy-Virus-Protease codiert.
Vektorsystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Transfervektor eine Nukleotidsequenz aufweist, die aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 2 ausgewählt ist.
Vektorsystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Transfervektor eine in die Expressionskassette funktional eingefügte Nukleotidsequenz enthält, die für mindestens ein in Bezug auf das Retrovirus heterologes Genprodukt codiert.
Vektorsystem nach Anspruch 10, wobei das Genprodukt aus der Gruppe, bestehend aus Peptiden, Proteinen, siRNAs, shRNAs, miRNAs, pri-miRNAs, pre-miRNAs und Antisense-RNAs, ausgewählt ist.
Vektorsystem nach Anspruch 11, wobei die Nukleotidsequenz für ein Reporterprotein oder -peptid codiert.
Wirtszelle, die mit einem Vektorsystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche transfiziert ist.
Wirtszelle nach Anspruch 13, die zur Herstellung und Ausschleusung von Retrovirus-Partikeln durch Expression mindestens der essentiellen Virus-Proteine über den/die Vektor(en) gemäß (a) ausgelegt ist.
Verfahren zur Herstellung der Wirtszelle nach Anspruch 13 oder 14, umfassend das Transfizieren einer geeigneten Zelle mit dem Vektorsystem nach einem der Ansprüche 1 bis 12.
Kit zur Expression eines nicht-retroviralen Genprodukts, umfassend (i) ein Vektorsystem nach einem der Ansprüche 1 bis 12 und (ii) Zellen, die als Wirtszellen gemäß Anspruch 14 geeignet sind.
Kit nach Anspruch 16, weiter umfassend (iii) Zellen, die zur Infektion mit Retrovirus-Partikeln geeignet sind.
Verfahren zur Expression eines nicht-retroviralen Genprodukts in einer Zelle, umfassend die Schritte: (A) Transfizieren einer Zelle mit einem Vektorsystem nach einem der Ansprüche 10 bis 12, wobei die Zelle zur Herstellung und Ausschleusung von Retrovirus-Partikeln durch Expression mindestens der essentiellen Virus-Proteine über den/die Vektor(en) gemäß (a) ausgelegt ist, (B) Kultivieren der transfizierten Zelle in einem Kulturmedium unter Bedingungen, die die Bildung und Ausschleusung von Retrovirus-Partikeln in das Kulturmedium erlauben, (C) Gewinnen eines Retrovirus-Partikel enthaltenden Überstands aus der Kultur von Schritt (B) und (D) Transduzieren von Zellen, die mit den Retrovirus-Partikeln infizierbar sind, mit dem ggf. verdünnten Kulturüberstand von Schritt (C).
Verfahren zur Expression eines nicht-retroviralen Genprodukts in einem Wirtsorganismus, umfassend das Einbringen einer Wirtszelle nach Anspruch 14 in den Wirtsorganismus, wobei ein oder mehrere Zelle(n) des Wirtsorganismus durch Retrovirus-Partikel infizierbar ist/sind.