WO2004097042A1 - Sirna-selektionsverfahren - Google Patents

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WO2004097042A1
WO2004097042A1 PCT/EP2004/050669 EP2004050669W WO2004097042A1 WO 2004097042 A1 WO2004097042 A1 WO 2004097042A1 EP 2004050669 W EP2004050669 W EP 2004050669W WO 2004097042 A1 WO2004097042 A1 WO 2004097042A1
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Ari Waisman
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Definitions

  • the present invention relates to a method for identifying small interfering oligonucleotides which can be used in siRNA (short interfering RNA) technology for knocking down genes.
  • the invention comprises the constructs required for these methods, cells which are transfected with these constructs and a kit which contains the essential constructs and / or cells for carrying out this method.
  • RNA interference Short double-stranded RNA molecules (hereinafter also called “siRNA” - small interfering RNA) with a double-stranded region with a length of 23 or fewer base pairs. This process is called RNA interference (Elbashir et al., EMBO 20, 6877-6888 (2001)). It has long been used in lower organisms to deplete certain RNA species (Fire et. Al., Nature 391, 806-811 (1998); Guo et al., Cell 81, 611-620 (1995)). This leads to a "knock-down" phenotype.
  • siRNAs are part of the "RNA inducing silencing complex" (RISC) and that the addition of 21 to 29 nucleotide long single-stranded antisense RNAs to cells also causes RISC formation and induces mRNA degradation (Martinez et al., Cell 110, 563-574 (2002)). Single-stranded RNA molecules in an antisense orientation can thus also be used as siRNAs.
  • RISC RNA inducing silencing complex
  • siRNAs with a G / C content between 40% and 55% are more active than those with a G / C content of more than 55% (Ambion Technical Bulletin 506).
  • G / C content between 40% and 55%
  • G / C content of more than 55%
  • EP 1229134 describes a method for identifying nucleic acids which modulate the cell functions, the activity of proteins and the expression of nucleic acids in a cell.
  • a double-stranded RNA expression bank is transfected into cells and the cells are examined for a modulation effect.
  • the modulation effect is always dependent on the selected target gene and a specific analysis must be carried out depending on the target gene.
  • RNA molecules which reduce the expression of a target RNA is disclosed in US 2002/0002278.
  • a nucleic acid construct which comprises a fusion gene consisting of a reporter gene and the gene of interest to be switched off, as well as a second reporter gene and also a “target gene” which encodes the RNA molecules, are transfected into cells.
  • the identification criterion is the reduction in the expression of the first reporter gene. This identification criterion would also be met if the target RNA had sequence-specific interactions with the RNA of the first reporter gene can enter; ie a high number of false positive target genes / RNA molecules makes this method inefficient.
  • a selection procedure has been developed which enables the best siRNA to be found which leads to the knock-down of a specific gene.
  • the technique is based on a positive / negative selection scheme and is therefore less complex than directly testing siRNAs and / or oligonucleotides (which allow the formation of siRNAs) for their interference ability.
  • the invention relates in detail to:
  • siRNAs A method of identifying short oligonucleotides expressing short interfering RNAs (siRNAs), which comprises the following steps:
  • step (b) Transfection / transformation of the transformed cells obtained in step (a) with a target construct comprising a copy of the second reporter gene and any target gene whose expression is to be reduced by the siRNA to be identified, the second reporter gene being translatable and the target gene is not translatable;
  • step (c) transfection / transformation of the transformed cells obtained in step (b) with plasmids which contain an oligonucleotide bank of short oligonucleotides;
  • Fi ⁇ . 1 Schematic representation of the target and suppressor constructs and the oligo plasmid bank.
  • Target construct Under the control of a promoter is a fusion gene comprising the thymidine kinase of the herpes simplex virus (HSV-TDK) with a translation stop codon at its 3 'end and the cDNA of any target gene for which a short oligo from which an siRNA can be expressed should be found.
  • HSV-TDK herpes simplex virus
  • a poly-A sequence follows the 5 'end of the target gene. Transcription creates a fusion mRNA, of which only the HSV-TK can be translated, but not the target gene.
  • suppressor construct under the control of a promoter is a fusion gene comprising the gene for neomycin resistance (Neomycin R) with a translation stop codon at its 3 'end and the gene sequence for the thymidine kinase of the herpes simplex virus (HSV- TDK).
  • HSV- TDK herpes simplex virus
  • a poly-A sequence (pA) follows the 5 'end of the HSV-TDK. Transcription results in a fusion mRNA, of which only the neomycin-R can be translated, but not the HSV-TK.
  • Oligo plasmid bank Cloning of degenerate random oligonucleotides comprising 21 nucleotides (squares) into a plasmid with a polymerase III promoter.
  • Fig. 2 Selection of transfected / transformed cells with G418 and gan cyclovir
  • (A) unspecific siRNA Cells express mRNAs of the target construct, the suppressor construct and a nonspecific siRNA that cannot bind either to the mRNA of the target construct or to that of the suppressor construct. The mRNAs are not degraded, so that the negative selection marker thymidine kinase is expressed. The nucleotide deri- vat-Gancyclovir converted, which leads to its incorporation into the cellular DNA, which ultimately induces cell death.
  • siRNA specific for HSV-TK cells express mRNAs of the target construct, the suppressor construct and an siRNA with specificity for the HSV-TK mRNA.
  • the siRNA interacts with both fusion mRNAs of the target construct and the suppressor construct, which leads to the degradation of both mRNAs.
  • the cells are no longer resistant to neomycin and die.
  • (C) siRNA for the target gene Cells express mRNAs of the target construct, the suppressor construct and an siRNA specific for the target gene.
  • the siRNA interacts with the mRNA of the target gene and induces degradation thereof, so that the negative selection marker thymidine kinase is no longer expressed.
  • the mRNA of the suppressor construct is not attacked and remains stable, so that the positive selection marker neomycin acyltransferase is also translated.
  • the cells survive selection with gancyclovir and G418.
  • Fig. 3 siRNA selection kit
  • a kit comprises a cell line (A) stably transfected with the suppressor construct and an "empty" target construct (B) into which desired target genes can be inserted in restriction sites 3 'of the HSV-TK translation stop codon.
  • the "filled" target construct is transfected into the kit's stably transfected cell line (C).
  • Vectors from the oligo plasmid library (D) are also transfected into the cell line of the kit.
  • the resulting cells carry and express the suppressor construct, the target construct and vectors of the oligo plasmid library (E).
  • Fig. 4 Cloning strategy for the suppressor construct. Strategy comprising two cloning steps for producing the suppressor construct (the exact sequence of the suppressor construct shown is shown in SEQ ID NO: 13).
  • Fig. 5 Cloning strategy for the target construct. Three-step cloning strategy to construct the target construct (the exact sequence of the target construct depicted is shown in SEQ ID NO: 19). Detailed description of the invention
  • Positive and / or negative selection markers in cells which are transfected or transformed with DNA for the suppression and / or target construct cause the expression of a positive and / or negative property which is characteristic of the selected selection marker.
  • the selection for the positive selection marker comprises bringing together the cells transfected or transformed with the suppressor and / or target construct with a substance that is lethal for the cell, provided that it does not express the corresponding positive selection marker (mRNA and protein).
  • Negative selection means contacting the cells transfected or transformed with the suppressor and / or target construct with a substance that is lethal for the cell, provided that it expresses the corresponding negative selection marker (mRNA and protein).
  • Positive and negative slection markers are well known to those skilled in the art (e.g., from US Pat. No. 5,631,153).
  • Positive selection markers for the suppressor construct and the target construct are preferably selected from the group of genes, including the neomycin acyltransferase gene (Neo), the Hygromycin B kinase gene (Hyg), the histidinol dehydrogenase gene (HisD), the xanthine guanine phosphoribosyl transferase gene (Gpt), the bleomycin resistance gene (Ble), the hypoxanthine phosphoribosyl transferase Gene (Hprt) etc.
  • Negative selection markers for the suppressor construct and the target construct are preferably selected from the group of genes comprising the herpes simplex virus thymidine kinase gene (HSV-TK), the hypoxanthine phosphoribosyl transferase Gene (Hprt), the diphtheria toxin gene, the ricin toxin gene, the cytosine deaminase gene etc.
  • HSV-TK herpes simplex virus thymidine kinase gene
  • Hprt hypoxanthine phosphoribosyl transferase Gene
  • the following are used as selective substances for the above-mentioned preferred positive selection markers: G418, Kanamycin or Neomycin-R for Neo, Hygromycin for Hyg, Histidinol for HisD, Xanthine for Gpt, Bleomycin for Ble and Hypoxanthine for Hprt.
  • gancyclovir acyclovir or FIAU for the HSV-TK
  • 6-thioguanine for Hprt
  • 6-thioxanthine for Gpt
  • 5-fluorocytosine for the cytosine deaminase.
  • the positive and negative selection markers also include membrane-bound surface proteins and intracellular bio-fluorescent proteins, which can be determined using immuno-cytochemical, immuno-magnetic and fluorescence methods, e.g. B. FACS, MACS sorting or visual sorting according to colored (e.g. green or red) cells can be selected.
  • Suitable surface proteins are those proteins that are not naturally expressed in the cells to be transformed, such as. B. CD4, CD8 etc.
  • Suitable bio-fluorescent proteins are preferably selected from the group comprising GFP, RFP, DsRed, YFP etc. In this type of selection, the transfected or transformed cells are not brought into contact with a lethal substance.
  • the transformed cells are labeled with fluorescence-labeled antibodies or with antibodies coupled to magnetic particles brought into contact.
  • a selection is defined as positive if the cells expressing a surface marker, marker molecule or an intracellular bio-fluorescent protein can be isolated from the cell mixture and remain in culture.
  • a selection is defined as negative if the cells that do not express a surface marker, marker molecule or an intracellular bio-fluorescent protein are isolated from the cell mixture and can be further cultivated or can remain in the culture.
  • a cell line is generated that constitutively expresses a transgene that forms an mRNA that leads to the formation of the positive selection marker neomycin acyltransferase.
  • the positive selection marker neomycin acyltransferase After the translation stop of the neomycin acyltransferase RNA follows the coding sequence of the negative selection marker herpes simplex virus thymidine kinase (HSV-TK) on the same mRNA.
  • HSV-TK herpes simplex virus thymidine kinase
  • the target construct which is transfected into the established cell line described above, expresses a second heterologous transgene which comprises the negative selection marker thymidine kinase (HSV-TK) and behind whose translation stop codon on the same mRNA follows the coding sequence of the target mRNA.
  • HSV-TK negative selection marker thymidine kinase
  • An "empty" precursor of the target construct carries one or more multiple restriction enzyme interfaces downstream (3 ') of the translation stop codon of the HSV-TK, which allow any cDNA to be cloned into the target construct.
  • Suitable restriction enzyme interfaces are known to the person skilled in the art and he knows how to select them according to the marker genes selected in each case; singular interfaces which are not present in the selection markers themselves or which only occur in their untranslated 5 'and 3' regions are preferred.
  • the oligonucleotides to be tested which code for potential siRNA molecules, are produced as oligonucleotides with a random sequence and in suitable vectors, such as B. a phage bank (similar to a phage display library) or an siRNA expression vector, which can also be a retroviral vector, cloned.
  • suitable vectors such as B. a phage bank (similar to a phage display library) or an siRNA expression vector, which can also be a retroviral vector, cloned.
  • an additional selection step can be carried out. This includes an annealing reaction of the short oligonucleotides to the isolated denatured target gene and a subsequent nuclease-mediated degradation of the unpaired regions. This leaves short double-stranded fragments of the same length as the original oligonucleotides, which are then ligated into a vector.
  • An alternative way to obtain double-stranded fragments with a length of up to 23 nucleotides is the partial DNAse I or restriction enzyme digestion of the cDNA of the target gene.
  • the fragments generated in this way are purified on a sequence gel and fragments with the correct length are isolated. These are cloned into the siRNA expression plasmids or phage plasmids, which can also be retroviral vectors.
  • the fragments of the desired length it is also possible to ligate to the 3 'and 5' ends of the fragments obtained by DNAse I digestion or by means of restriction enzyme digestion using a short hairpin-shaped DNA adapter which has a recognition site for a restriction enzyme with 21 to Includes 23 base pairs of staggered interface.
  • the recognition sites can be selected from the group of Mmel, Alol, Ball, BsaXI, Fall, etc. A recognition site for M el is preferred.
  • the fragments are amplified by means of PCR (primer 3 SEQ ID NO: 27), and the amplified products or the non-amplified fragments are digested with restriction enzyme with Ml ⁇ l in an RNA expression vector pSilencer 1.0-U6 (blunt) opened with restriction enzyme Mscl and StuI (SEQ ID NO: 14).
  • the RNA expressed by this vector forms hairpin-like structures.
  • plasmids are generated which carry the oligonucleotide-coding sequence behind a polymerase III promoter .
  • the cloned oligonucleotide is flanked on both its 5 'and 3' flanks by a polymerase III promoter.
  • either hairpin-shaped or linear siRNAs are produced during expression.
  • the oligonucleotide-coding sequences are also used behind a polymerase III promoter, which controls their expression.
  • the cloned oligonucleotide sequence has a polymerase III promoter on both its 5 'and 3' flanks.
  • the mRNA of the latter is also degraded as a result, and the cells thus lose not only the negative selection marker thymidine kinase, but also the positive selection marker neomycin resistance, and do not survive the selection with G418. Only cells which express an oligonucleotide-encoded siRNA specifically for the target gene, ie in which the siRNA interacts with regions of the target construct mRNA-3 'from the HSV-TK, survive the selection (see FIG. 2).
  • the oligonucleotide encoding siRNA can be amplified and sequenced.
  • the entire expression construct can also be obtained from the cells by PCR or other methods and used for RNAi experiments in other systems such as, for. B. transgenic mice or other cell lines can be used.
  • the method described above is characterized by a suppressor construct that has a promoter upstream (5 ') of the first reporter gene (positive selection marker) and a second reporter gene (negative selection marker) downstream (3') of the stop codon of the first reporter gene. Furthermore, the method described above is characterized by a target construct in which the reporter gene (negative selection marker) identical to the second reporter gene of the suppressor construct is flanked upstream (5 ') by a second promoter and flanked downstream (3') of the stop codon by the coding sequence of the target gene.
  • the suppression construct and / or the target construct preferably contain at least one RNA / mRNA stabilizing element.
  • RNA / mRNA stabilizing element in particular a poly-A sequence, can be located downstream (3 ') of the second reporter gene (negative selection marker) in the suppressor construct.
  • An RNA / mRNA can stabilize in the target construct of the element, in particular a polyA sequence, are located downstream (3 7 ) of the target gene.
  • the first reporter gene and the second reporter gene of the suppressor construct and / or the second reporter gene and the target gene of the target construct are linked directly to one another or separated from one another by an identical short spacer with a length of up to 20 nucleotides, shorter spacers with a length of up to 10 nucleotides are preferred.
  • the suppressor construct and / or target construct and / or the siRNA expression bank can comprise further functional sequences which are selected in particular from further reporter genes / selection markers and / or recombinase recognition sequences (RRS), such as, for. B. loxP, FRT, attP and / or attB sequences, etc.
  • Additional reporter genes / selection markers, such as z. B. are used to control transfection efficiency, have their own expression control elements (promoters, termination signals, translation signals, etc.), d. H. their expression is independent of that of the first and second reporter gene.
  • the first and second promoters are selected independently of one another from the group of constitutively active promoters, inducible promoters, cell-specific or tissue-specific promoters, and in particular from Pol I, Pol II, Pol III promoters, Sp6 or T7 Promotem.
  • a promoter for an additional reporter gene / selection marker is also to be selected from this group. If Sp6 and / or T7 promoters are selected for any gene, the above cells must express the Sp6 and / or T7 polymerase.
  • the reporter genes are independently positive and / or negatively selectable marker genes (selection markers).
  • Marker genes are preferably selected from the group of genes comprising the acyltransferase gene (Neo), the hygromycin B kinase (Hyg) gene, the histidinol dehydrogenase gene (HisD), the xanthine Guanine phosphoribosyl transferase (Gpt) gene, the bleomycin resistance gene (Ble), the hypoxanthine phosphoribosyl transferase (Hprt) gene, the herpes simplex virus thymidine kinase gene (HSV-TK), the hypoxanthine phosphoribosyl transferase (Hprt) gene, the Diphtheria toxin gene, the ricin toxin gene and the cytosine deaminase gene.
  • the first reporter gene is a positively selectable reporter gene (positive selection marker), in particular a neomycin acyltransferase gene (Neo) is preferred, and / or as the second reporter gene a negatively selectable marker gene (negative selection marker), in particular a thymidine kinase gene of the herpes simplex virus (HSV-TK).
  • a suppressor construct that can be used in the method described above has SEQ ID NO: 13 and a target construct has SEQ ID NO: 19.
  • the target construct can contain a further expression cassette for a positive selection marker, in particular a puromycin resistance gene, which makes it possible to select for transfectants.
  • the above-described selection method for siRNAs uses eukaryotic cells including lower eukaryotic cells such as yeast cells, algae and slime mold cells, plant cells, vertebrate cells such as mammalian, avian, fish and reptile cells, as invertebrate cells such as nematodes, as starting cells which are transfected or transformed in vitro - And insect cells, with mammalian cells, in particular human and murine cells, nematode cells, in particular cells from C. elegans, and insect cells, in particular cells from Drosophila melanogaster and Tribolium confusum (rice flour beetle) being particularly preferred.
  • the eukaryotic cells can be both primary and transformed (i.e. immortalized) cells. Human K562 and murine A20 cells are particularly preferred.
  • the cells can carry the suppressor construct and / or target construct transiently or stably. In particular, the suppressor construct can be stably integrated into the genome of the cell.
  • the selection process for siRNA described above comprises the transfection / transformation of the above-mentioned eukaryotic cells with plasmids of an oligonucleotide plasmid bank or a comparable one Oligonucleotide expression library.
  • the oligonucleotides contained in these plasmids encode the siRNA molecules to be selected and their expression is controlled by the promoter.
  • the promoters are selected from the group of promoters specific for short RNA molecules.
  • the group of promoters includes double-stranded and single-stranded (U6 or HI) promoters for Pol III and Sp6 and T7 promoters. If Sp6 and T7 promoters are selected, the cells mentioned above must express Sp6 and / or T7 polymerase.
  • the oligonucleotides preferably encode a siRNA with a random sequence that has 19 to 25 nucleotides (NT), preferably a random sequence that has 21 to 23 NT, most preferably a sequence that has 21 NT.
  • the oligonucleotides preferably encode a double-stranded siRNA which has a random central base paired sequence with 19 to 25 nucleotides (NT), preferably a base paired random central sequence with 21 to 23 NT and most preferably a base paired random central sequence with 21 NT ,
  • the method described above involves culturing the cells in a selection medium.
  • the choice of medium is determined by the cell type and the reporter genes / selection markers used.
  • the transformed cells are cultivated in a selection medium which enables selection for the selected first and second reporter gene / selection marker.
  • the first reporter gene is neomycin acyltransferase
  • the second reporter gene is HSV-TK
  • the selection is made with G418 and Gancyclovir and / or Acyclovir and / or FIAU.
  • the selection allows the identification of cells that express an siRNA that causes the degradation of the mRNA of the target gene.
  • Cells which transfected / transformed with an suppressor construct, a target construct and an mRNA degradation-inducing siRNA molecule-expressing oligonucleotide expression plasmid are so identifiable. This first identification is followed by a second identification step with which the exact identity of the oligonucleotide encoding the siRNA is to be determined.
  • the oligonucleotide encoding mRNA degradation-inducing siRNA molecule is preferably identified by PCR and sequencing.
  • the suppressor construct is essential for the selection process of siRNA described above.
  • the various embodiments of the suppressor construct described above are claimed.
  • Cells which are transfected / transformed with a suppressor construct as defined above and optionally with a target construct are also claimed.
  • the above-described selection method for siRNAs can be carried out with high efficiency for any target gene if cells which are stably transfected with the suppression construct, i. H. Cells in whose genome the suppression construct is integrated are present.
  • Cell clones in the genome of which the suppression construct is integrated represent a new cell line.
  • a kit for identifying oligonucleotides which can be used for expressing mRNA-inducing siRNA molecules comprises the suppressor construct or a cell transfected / transformed with the suppressor construct.
  • Such a kit further comprises a target construct or a precursor thereof, and / or a plasmid for cloning the random oligonucleotide sequences; preferably the target construct downstream (3 ') of the translation stop codon of the second reporter gene / selection marker has multiple restriction sites.
  • the thymidine kinase gene (SEQ ID NO: 9), including the promoter, is primed with the primers 5 '-CGAGCAGTGTGGTTTTGCAAG-3' (SEQ ID NO: 1) and 5 '-CTCGAGCCTGCAGGTTAGCCTCCCCCATCTCCCG-3' (SEQ ID NO: 2) amplified by PCR from the plasmid pEasyflox and cloned in pGEM-Teasy (Promega) (pGEM-Teasy + TK (SEQ ID NO: 10)).
  • polyA poly-adenylation site
  • pGEM-Teasy + TK + polyA is filled with sall and Spei cut and religated. This will remove an Sbfl interface.
  • a puromycin gene isolated from pPur (Clontech) (SEQ ID NO: 18) is inserted into the target construct; the puromycin gene is cut out of pPur using Pvu II and Bam HI and the Bam HI overhangs are filled with Klenow polymerase; the fragment is ligated into pGem-Teasy + TK + PolyA (SEQ ID NO: 11) opened with Sac II and smoothed with the T4 polymerase, and pGem-Teasy + TK + PolyA + Puro (SEQ ID NO: 19) is formed , Any target cDNA to be tested can be inserted into the Sbfl interface of the construct pGem-Teasy + TK + PolyA + Puro (SEQ ID NO: 19).
  • SEQ ID NO: 21 for the preparation of a complete target construct carrying the BCL10 sequence was determined by the primer bcIlO-F (5'-GGCCTGCAGGCCGCTTCTGTTCCTAGTCCCC-3 '; and bdlO-r (5'-GGCCTGCAGGTGTTAATAGCAAATTTTCATTTC-3 22 SEQ ID NO)' 23) the BCL10 gene (target gene) isolated.
  • the purified BCL10 PCR product (SEQ ID NO: 20) was digested with Sbfl and inserted into the Sbfl interface of the empty target construct pGem-Teasy + TK + PolyA + Puro (SEQ ID NO: 19).
  • the resulting target construct with BCL10 sequence was transformed into ToplO bacteria. Plasmid DNA for transfections was isolated using Maxi Prep (Qiagen).
  • the gene for the thymidine kinase is generated without a promoter but with a polyadenylation site by means of PCR using the primers 5 '-TTAATTAAATGGCTTCGTACCCCGGCCAT-3' (SEQ ID NO: 7) and 5 '-TTAATTAACCTGCAGCCAAGCTTGGGTCG-3' (SEQ ID NO: 8) or 5 '-TT TTA GCTTGGGTCGTCCACCAGAC-3' (SEQ ID NO: 30) amplified by pEasyflox or pBS-TK and cloned into the Pacl interface of pGEM-Teasy + Neomycin resistance (Suppression Construct (SEQ ID NO: 13)).
  • the ORF of thymidine kinase is on the mRNA produced by this construct, but cannot be translated because there is a translation stop in front of it.
  • a "random" 21mer random oligonucleotide library is synthesized.
  • the cDNA of the target gene for which homologous and hybridizable oligonucleotides must be selected, is isolated from a plasmid (pGem-Teasy-bcHO) using restriction enzymes (Sbfl).
  • the DNA of the target gene is separated on an agarose gel (0.7 to 1.5%) from the remaining plasmid DNA, and then purified using QuiaQuick column (Quiagen) or QuiEx2 milk (Quiagen) according to the manufacturer's instructions.
  • the isolated cDNA of the target gene and the oligonucleotides are mixed in a molar ratio of 1:10 "u .
  • the mixture is heated for 5 minutes at 95 ° C and then slowly cooled to room temperature, so as to attach the oligonucleotides to the single-stranded cDNA
  • the overhangs of the cDNA are removed by digestion with mung bean nuclease or another exonuclease.
  • Oligonucleotides which have not been completely bound are removed by T7 endonuclease or corresponding endonucleases.
  • the remaining double-stranded fragments with a length of 21 nucleotides are purified and are ready for cloning into the siRNA expression plasmids or phage plasmids.
  • the vectors opened with a restriction enzyme which creates blunt ends are blended with shrimp alkaline phosphatase (USB, Cleveland) dephosphorized for 1 h at 37 ° C. The enzyme is then inactivated at 65 ° C for 15 min.
  • the phosphorylated oligonucleotides or the purified fragments are ligated using ligase (NEB) according to the manufacturer's instructions for 1 h at 20 ° C. or overnight at 16 ° C. Chemically competent ToplO bacteria are transformed in half of the ligation approach.
  • the modified vector pSilencer 1.0-U6 (SEQ ID NO: 14) is opened smoothly ("blunt end") with Msc I and Stu I and ligated with the double-stranded 21-mer fragments (21-mer bank).
  • Anti-sense RNA transcribed from this vector has an overhang of 2 nucleotides at the 3 'end.
  • Murine A20 cells are transfected with suppressor and / or target construct according to steps (A) to (C) described above.
  • FIGS. 4A-4D Human K562 cells that are transfected with the suppressor construct and the target construct (stable or transient) (see FIGS. 4A-4D) are over-transfected with the oligonucleotide expression plasmids (see FIG. 3B). Transfection of 1-5 ⁇ g / ⁇ l plasmids mixed with nucleofector (Amaxa) is carried out according to the transfection conditions described by the manufacturer. 48 h post-transfection of all plasmids (suppressor construct, target construct and oligonucleotide expression vectors), the cell culture medium G418 (between 0.8 and 1 mg / ml) and Gancyclovir in a concentration of 100 ⁇ M are added.
  • the cells are cultivated under these conditions for 5 to 10 days.
  • the surviving cells become lated and isolated. DNA is isolated from the surviving cells (Sambrook et al., Molecular Clonfng: A Laboratory Manual).
  • PCR reactions are carried out with the primer siRNA-F (CCTTAATTAAGTACCCGCTCTAGAACTAGTG) located in the region of nucleotide 654 (SEQ ID NO: 16) and the primer siRNA-R (CCTTAATTAACTGGAGCTCCACCGCGGTQGGCG) (SEQ ID NO: 16) Taq

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Identifikation von kleinen interferierenden Oligonukleotiden, die in der siRNA (Short interfering RNA) Technologie zum Knock-Down von Genen eingesetzt werden können. Die Erfindung umfasst die zu diesem Verfahren benötigten Konstrukte, Zellen, die mit diesen Konstrukten transfiziert sind und einen Kit der die essentiellen Konstrukte und/oder Zellen zur Ausführung dieses Verfahrens enthält.

Description

siRNA-Selektionsverfahren
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Verfahren zur Identifikation von kleinen interferierenden Oligonukleotiden, die in der siRNA (Short interfering RNA) Technologie zum Knock-Down von Genen eingesetzt werden können. Die Erfindung umfasst die zu diese Verfahren benötigten Konstrukte, Zellen, die mit diesen Konstrukten transfiziert sind und einen Kit der die essentiellen Konstrukte und/oder Zellen zur Ausführung dieses Verfahrens enthält.
Hintergrund der Erfindung
Kurze doppelsträngige RNA Moleküle (dsRNA) (nachfolgend auch "siRNA" - small interfering RNA genannt) mit einem doppelsträngigen Bereich von einer Länge von 23 oder weniger Basenpaaren können die Degradation von mRNA mit komplementären Sequenzen, hervorrufen. Diesen Vorgang nennt man RNA Interferenz (Elbashir et al., EMBO 20, 6877-6888 (2001)). Er wurde in niederen Organismen schon lange verwendet, um bestimmte RNA-Spezies zu depletieren (Fire et. al., Nature 391, 806-811 (1998); Guo et al., Cell 81, 611- 620 (1995)). Dies führt zu einem "Knock-down"-Phänotyp. In Drosophila ist dieses Phänomen auch bekannt und wird für in vitro und in vivo Studien genutzt (WO 01/75164; WO 02/44321). Erst seit kurzem wird diese Technik auch bei humanen und murinen Zellen angewandt (Elbashir et al, Nature 411: 494-498. (2001); Holen et al., Nucleic Acids Research 30(8): 1757-1766 (2002); Brown et al., (TechNotes 9(l):3-5 (2002)) (2000); Doi et al., (Curr Biol. 2003 Jan 8;13(l):41-6) (2003); WO 02/44321). Kürzlich wurde beobachtet, dass kurze einzelsträngige siRNAs Teil des "RNA inducing silencing complex" (RISC) sind und das der Zusatz von 21 bis 29 Nukleotid langen ein- zelsträngigen antisense RNAs zu Zellen auch die RISC-Bildung bewirkt und mRNA-Degradation induziert (Martinez et al., Cell 110, 563-574 (2002)). Einzelsträngige RNA-Moleküle in antisense-Orientierung können somit auch als siRNAs eingesetzt werden. Ein Problem bei der Nutzung der siRNA Technik ist die Auswahl von siRNAs. Nicht alle komplementären siRNA induzieren Degradation ihrer Ziel-mRNA. Die Gründe hierfür sind unbekannt. Beim Design von siRNAs wurden bislang gewisse Erfahrungswerte berücksichtigt; beispielsweise ist bekannt, dass siRNAs mit einem G/C Anteil zwischen 40% und 55% aktiver sind, als solche mit einem G/C Anteil von mehr als 55% (Ambion Technical Bulletin 506). Von den so entworfenen siRNAs reduzieren in der Regel die Hälfte ihre korrespondierenden Ziel-mRNAs um 50%. Lediglich eine siRNA von vier entworfenen siRNAs induziert eine Reduktion ihrer Ziel mRNA zwischen 75% und 95% (Brown et al., TechNotes 9(l):3-5 (2002)). Es müssen daher immer mehrere Oligonukleotide ausgetestet werden. Die Anzahl der verschiedenen Oligonukleotide die komplementär zu einer bestimmten mRNA sind, ist aber zu groß, um alle einzeln auf ihre Fähigkeit zur Interferenz zu testen. Eine Methode zur effizienten Identifikation von aktiven siRNAs mit hohem Knock- Down-Potential fehlt bislang.
EP 1229134 beschreibt eine Methoden zur Identifikation von Nukleinsäuren, die die Zellfunktionen, die Aktivität von Proteinen und die Exprimierung von Nukleinsäuren einer Zelle modulieren. Dabei wird eine doppelsträngige RNA Expressionsbank in Zellen transfiziert und die Zellen auf einen Modulationseffekt hin untersucht. Dabei ist der Modulationseffekt immer abhängig von dem ausgewählten Zielgen und es muss eine spezifische Untersuchung je nach Zielgen erfolgen.
Eine weitere Methode zur Identifikation von RNA-Molekülen, die die Exprimierung einer Ziel-RNA reduzieren, ist in US 2002/0002278 offenbart. Bei dieser Methode wird ein Nukleinsäurekonstrukt, das ein Fusionsgen bestehend aus einem Reportergen und dem auszuschaltendem Gen von Interesse umfasst, sowie ein zweites Reportergen und auch ein "Zielgen" das die RNA-Moleküle kodiert, in Zellen transfiziert. Identifikationskriterium ist die Reduktion der Exprimierung des ersten Reportergens. Dieses Identifikationskriterium wäre auch erfüllt, wenn die Ziel-RNA sequenz-spezifische Interaktionen mit der RNA des ersten Reportergens eingehen kann; d. h. eine hohe Anzahl an falsch-positiven Zielgenen/RNA-Molekülen macht diese Methode ineffizient.
Zusammenfassung der Erfindung
Es wurde ein Selektionsverfahren entwickelt, welches ermöglicht, die besten siRNA zu finden, die zum Knock-down eines bestimmten Gens führen. Die Technik beruht auf einem Positiv/Negativ-Selektionsschema und ist daher weniger aufwendig als das direkte Testen von siRNAs und/oder Oligonukleoti- den (die die Formation von siRNAs erlauben) auf ihre Interferenzfähigkeit. Die Erfindung betrifft im Einzelnen:
(1) ein Verfahren zur Identifikation von kurzen Oligonukleotiden, die kurze interferierenden RNAs (siRNAs) exprimieren, das folgende Schritte umfasst:
(a) Transfektion/Transformation von Ausgangszellen mit einem Suppressor- konstrukt, das ein erstes und ein zweites Reportergen umfasst, wobei das erste Reportergen translatierbar und das zweite Reportergen nicht translatierbar ist;
(b) Transfektion/Transformation der in Schritt (a) erhaltenen transformierten Zellen mit einem Zielkonstrukt, das eine Kopie des zweiten Reportergens, und ein beliebiges Zielgen, dessen Expression durch die zu identifizierende siRNA vermindert werden soll, umfasst, wobei das zweite Reportergen translatierbar und das Zielgen nicht translatierbar ist;
(c) Transfektion/Transformation der in Schritt (b) erhaltenen transformierten Zellen mit Plasmiden die eine Oligonukleotid-Bank aus kurzen Oligonukleotiden enthalten;
(d) Kultivierung der transfizierten/transformierten Zellen unter Selektionsbedingungen für das erste und das zweite Reportergen; und
(e) Identifikation und Isolation der Zellen, die ein Oligonukleotid-Plasmid tragen, dessen exprimierte siRNA die Degradation der mRNA des Zielgens induziert;
(2) ein Suppressorkonstrukt, wie in (1) definiert;
(3) Zellen, die mit einem Suppressorkonstrukt, wie in (1) und (2) definiert, und optional mit einem Zielkonstrukt, wie in (1) definiert, transfi- ziert/transformiert sind; und (4) einen Kit zur Identifikation von Oligonukleotiden, die zur Exprimierung von siRNA einsetzbar sind, umfassend wenigstens ein Suppressorkonstrukt, wie in (1) und (2) definiert, und/oder mit dem Suppressorkonstrukt transfizierte/transformierte Zellen, wie in (3) definiert.
Kurzbeschreibung der Figuren
Fiα. 1: Schematisierte Darstellung der Ziel- und Suppressorkonstrukte und der Oligo-Plasmidbank.
(A) Zielkonstrukt: Unter der Kontrolle eines Promoters steht ein Fusionsgen, umfassend die Thymidinkinase des Herpes-simplex-Virus (HSV-TDK) mit einem Translations-Stopcodon an deren 3' Ende und die cDNA eines beliebigen Zielgens, für das ein kurzer Oligo, von dem eine siRNA exprimiert werden kann, gefunden werden soll. An das 5' Ende des Zielgens schließt sich eine Poly-A-Sequenz (pA) an. Durch Transkription entsteht eine Fusions-mRNA, von der aber nur die HSV-TK translatierbar ist, nicht aber das Zielgen.
(B) Suppressorkonstrukt: Unter der Kontrolle eines Promoters steht ein Fusionsgen, umfassend das Gen für Neomycin-Resistenz (Neomycin R) mit einem Translations-Stopcodon an dessen 3' Ende und die Gensequenz für die Thymidinkinase des Herpes-simplex-Virus (HSV-TDK). An das 5' Ende der HSV-TDK schließt sich eine Poly-A-Sequenz (pA) an. Durch Transkription entsteht eine Fusions-mRNA, von der aber nur das Neomycin-R translatierbar ist, nicht aber die HSV-TK.
(C) Oligo-Plasmidbank: Klonierung von degenerierten zufälligen Oligonukleotiden, umfassend 21 Nukleotide (Quadrate) in ein Plasmid mit einem Polyme- rase-III-Promoter.
Fig. 2: Selektion von transfizierten/transformierten Zellen mit G418 und Gan- cyclovir
(A) unspezifische siRNA: Zellen exprimieren mRNAs des Ziel-Konstrukts, des Suppressorkonstrukt und eine unspezifische siRNA, die weder an die mRNA des Ziel-Konstrukts, noch an die des Suppressorkonstrukts anbinden kann. Die mRNAs werden nicht degradiert, so dass der negative Selektionsmarker Thymidinkinase exprimiert wird. Durch die Thymidinkinase wird das Nukleotidderi- vat-Gancyclovir umgewandelt, was zu dessen Einbau in die zelluläre DNA führt, wodurch schließlich der Zelltod induziert wird.
(B) siRNA spezifisch für HSV-TK: Zellen exprimieren mRNAs des Zielkon- strukts, des Suppressorkonstrukts und eine siRNA mit Spezifität für die HSV- TK-mRNA. Die siRNA interagiert mit beiden Fusions-mRNAs des Ziel-Konstrukts und des Suppressorkonstrukts, was zur Degradation beider mRNAs führt. Die Zellen sind nicht mehr resistent gegen Neomycin und sterben ab.
(C) siRNA für das Zielgen : Zellen exprimieren mRNAs des Ziel-Konstrukts, des Suppressorkonstrukt und eine siRNA spezifisch für das Zielgen. Die siRNA interagiert mit der mRNA des Zielgens und induziert Degradation dieser, so dass der negative Selektionsmarker Thymidinkinase nicht mehr exprimiert wird. Die mRNA des Suppressorkonstrukts wird nicht angegriffen und bleibt stabil, so dass der positive Selektionsmarker Neomycin-Acyltransferase auch translatiert wird. Die Zellen überleben die Selektion mit Gancyclovir und G418.
Fig. 3: siRNA Selektionskit
Ein Kit umfasst eine stabil mit dem Suppressorkonstrukt transfizierte Zelllinie (A) und einen "leeres" Zielkonstrukt (B), in das gewünschte Zielgene in Restriktionsstellen 3' von dem Translations-Stopcodon der HSV-TK eingesetzt werden können. Das "gefüllte" Ziel-Konstrukt wird in die stabil transfizierte Zelllinie des Kits transfiziert (C). Ebenso werden Vektoren der Oligo-Plasmidbank (D) in die Zelllinie des Kits transfiziert. Die entstehenden Zellen tragen und exprimieren das Suppressor-Konstrukt, das Ziel-Konstrukt und Vektoren der Oligo-Plasmidbank (E).
Fig. 4: Klonierungsstrategie für das Suppressorkonstrukt. Zwei Klonie- rungsschritte umfassende Strategie zur Herstellung des Suppressorkonstrukts (die exakte Sequenz des abgebildeten Suppressorkonstrukts ist in SEQ ID NO: 13 gezeigt).
Fig. 5: Klonierungsstrategie für das Zielkonstrukt. Drei Klonierungsschritte umfassende Strategie zur Herstellung des Zielkonstrukts (die exakte Sequenz des abgebildeten Zielkonstrukts ist in SEQ ID NO: 19 gezeigt). Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Selektionsverfahren zur Identifikation von siRNA kodierenden Oligonukleotiden. Das Verfahren beruht auf einer Kombination von positiver und negativer Selektion und findet vorzugsweise in vitro statt. Zum Einsatz kommen ein Suppressorkonstrukt und ein Zielkonstrukt sowie Plasmide einer Oligonukleotid-Expressionsbank. Von dem Sup- pressionskonstrukt wird z. B. eine mRNA exprimiert, die einen positiven als auch einen nicht-translationsfähigen negativen Reporter (nachfolgend auch "Selektionsmarker") kodiert, wohingegen von dem Zielkonstrukt eine mRNA exprimiert wird, die eine translationsfähige Version des negativen Selektions- markers des Suppressorskonstrukts kodiert als auch ein nicht-translationsfähiges Zielgen, für das eine siRNA zu identifizieren ist. Als zusätzliches Element kann das Zielkonstrukt noch eine zweite mRNA für ein weiteren positiven Selektionsmarker exprimieren.
Positive und/oder negative Selektionsmarker bewirken in Zellen, die mit DNA für Suppressions- und/oder Zielkonstrukt transfiziert oder transformiert sind, die Ausprägung einer positiven und/oder negativen Eigenschaft, die charakteristisch für den gewählten Selektionsmarker ist. Die Selektion auf den positiven Selektionsmarker umfasst das Zusammenbringen der mit Suppressor- und/oder Zielkonstrukt transfizierten oder transformierten Zellen mit einer Substanz, die lethal für die Zelle ist, sofern sie den entsprechenden positiven Selektionsmarker nicht exprimiert (mRNA und Protein). Unter negativer Selektion versteht man das Kontaktieren der mit Suppressor- und/oder Zielkonstrukt transfizierten oder transformierten Zellen mit einer Substanz, die lethal für die Zelle ist, sofern sie den entsprechenden negativen Selektionsmarker exprimiert (mRNA und Protein).
Positive und negative Slektionsmarker sind dem Fachmann hinreichend bekannt (z. B. aus US-Patent Nr. 5,631,153). Positive Selektionsmarker für das Suppressorkonstrukt und das Zielkonstrukt sind bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe von Genen, umfassend das Neomycin-Acyltransferase-Gen (Neo), das Hygromycin-B-Kinase-Gen (Hyg), das Histidinol-Dehydrogenase-Gen (HisD), das Xanthin-Guanine Phosphoribosyl-Transferase-Gen (Gpt), das Bleomycin- Resistenz-Gen (Ble), das Hypoxanthine-Phosphoribosyl-Transferase-Gen (Hprt) usw. Negative Selektionsmarker für das für das Suppressorkonstrukt und das Zielkonstrukt sind bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe von Genen, umfassend das Herpes-simplex-Virus-Thymidinkinase-Gen (HSV-TK), das Hypoxanthine-Phosphoribosyl-Transferase-Gen (Hprt), das Diphterie-Toxin- Gen, das Ricin-Toxin-Gen, das Cytosin-Deaminase-Gen usw. Als selektive Substanzen für die vorstehend genannten bevorzugten positiven Selektionsmarker werden eingesetzt: G418, Kanamycin oder Neomycin-R für Neo, Hygromycin für Hyg, Histidinol für HisD, Xanthine für Gpt, Bleomycin für Ble und Hypoxanthine für Hprt. Als selektive Substanzen für die negativen Selektionsmarker werden eingesetzt: Gancyclovir, Acyclovir oder FIAU für die HSV- TK, 6-Thioguanin für Hprt, 6-Thioxanthin für Gpt und 5-Fluorocytosin für die Cytosin-Deaminase. Bei Verwendung des Ricin Toxin Gens oder des Diphterie Toxin Gens muss keine selektive Substanz den Zellen zugefügt werden. Bei Verwendung der letzteren muss dieses im Zielkonstrukt unter der Kontrolle eines induzierbaren Promoters stehen. Die Selektionsmarker können auch als Fusionsproteine eingesetzt werden.
Zu den positiven und negativen Selektionsmarkern werden auch membranständige Oberflächenproteine und intrazelluläre bio-fluoreszierende Proteine gerechnet, die mittels immuno-cytochemischer, immuno-magnetischer und Fluoreszenz Methoden, z. B. FACS, MACS Sortierung oder visueller Sortierung nach farbigen (z. B. grünen oder roten) Zellen, selektioniert werden können. Geignete Oberflächenproteine sind solche Proteine, die natürlicherweise nicht in den zu transformierenden Zellen exprimiert werden, wie z. B. CD4, CD8 usw. Geeignete bio-fluoreszierende Proteine sind vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend GFP, RFP, DsRed, YFP usw. Bei dieser Art von Selektion werden die transfizierten oder transformierten Zellen nicht mit einer lethalen Substanz in Kontakt gebracht. Falls Oberflächenproteine als Marker eingesetzt werden, werden die transformierten Zellen mit Fluoreszenz-markierten Antikörpern oder mit an magnetische Partikel gekoppelten Antikörpern in Kontakt gebracht. Eine Selektion wird als positiv definiert, wenn die Zellen, die ein Oberflächenmarker, Markermolekül oder ein intrazelluläres bio-fluoreszierende Protein exprimieren, aus dem Zellgemisch isoliert werden und in Kultur verbleiben können. Eine Selektion wird als negativ definiert, wenn die Zellen, die ein Oberflächenmarker, Markermolekül oder ein intrazelluläres bio-flu- oreszierendes Protein nicht exprimieren, aus dem Zellgemisch isoliert werden und weiter kultiviert werden können bzw. in der Kultur verbleiben können.
Die Erfindung wird nachfolgend in Bezug auf die genannten bevorzugten Reportergenen beschrieben. Zunächst wird durch Transfektion einer Zelllinie mit einem Suppressorkonstrukt eine Zeillinie generiert, die konstitutiv ein Transgen ausprägt, welches eine mRNA bildet, die zur Bildung des positiven Selektionsmarkers Neomycin-Acyltransferase führt. Nach dem Translationsstop der Neomycin-Acyltransferase RNA folgt auf derselben mRNA die kodierende Sequenz des negativen Selektionsmarkers Herpes-simplex-Virus-Thymidinkinase (HSV-TK). Dieses gesamte Transgen ist im Folgenden das Suppressorkonstrukt.
Das Zielkonstrukt, das in die oben beschriebene etablierte Zelllinie transfiziert wird, exprimiert ein zweites heterologes Transgen, das den negativen Selektionsmarker Thymidinkinase (HSV-TK) umfasst, und hinter dessen Translations- Stopcodon auf derselben mRNA die kodierende Sequenz der Ziel-mRNA folgt. Ein "leere" Vorstufe des Zielkonstrukt trägt stromabwärts (3') des Translations-Stopcodon der HSV-TK eine oder mehrere multiple Restriktionsenzymsschnittstellen, die es erlauben eine jede beliebige cDNA in das Zielkonstrukt einzuklonieren. Geeignete Restriktionsenzymschnittstellen sind dem Fachmann bekannt und er weiß sie entsprechend den jeweilig ausgewählten Markergenen auszuwählen; bevorzugt sind dabei singuläre Schnittstellen, die nicht in den Selektionmarkern selber vorliegen, oder nur in deren untranslatierten 5'- und 3'- Regionen vorkommen.
Die auszutestenden Oligonukleotide, die für potentielle siRNA Moleküle kodieren, werden als Oligonukleotide mit zufälliger Sequenz hergestellt und in ge- eigneten Vektoren, wie z. B. einer Phagenbank (ähnlich einer Phage-Display- Library) oder einen siRNA Expressionsvektor, der auch ein retroviraler Vektor sein kann, kloniert. Alternativ zu der direkten Klonierung der kommerziell synthetisierten Oligonukleotide, kann ein zusätzlicher Selektionsschritt durchgeführt werden. Dieser umfasst eine Anlagerungsreaktion ("Annealing") der kurzen Oligonukleotide an das isolierte denaturierte Zielgen und eine anschließende Nuclease-vermittelte Degradation der ungepaarten Bereiche. Es verbleiben somit kurze doppelsträngige Fragmente mit der gleichen Länge wie die ursprünglichen Oligonukleotide, die dann in einen Vektor ligiert werden.
Ein alternativer Weg zur Gewinnung von doppelsträngigen Fragmenten mit einer Länge von bis zu 23 Nukleotiden (23 bzw. 21mer Bank) ist der partielle DNAse I- oder Restriktionsenzymsverdau der cDNA des Zielgens. Die dabei generierten Fragmente werden auf einem Sequenzgel aufgereinigt und Fragmente mit der korrekten Länge isoliert. Diese werden in die siRNA Expressionsplasmide oder Phagenplasmide kloniert, die auch retrovirale Vektoren sein können.
Als Alternative zu der Aufreinigung der Fragmente mit gewünschter Länge ist es auch möglich an die 3' und 5' Enden der durch DNAse I Verdau oder mittels Restriktionsenzymverdau gewonnenen Fragmente mit einem kurzen haarnadelförmigen DNA Adaptor zu ligieren, der eine Erkennungsstelle für ein Restriktionsenzym mit 21 bis 23 Basenpaare versetzter Schnittstelle umfasst. Die Erkennungsstellen können ausgewählt sein aus der Gruppe von Mmel, Alol, Ball, BsaXI, Fall, etc. Bevorzugt ist eine Erkennungsstelle für M el. Nach der Ligation des Adaptormoleküls wurden die Fragmente mittels Mmel verdaut, was zur Freisetzung von um zwei Nukleotide 3' überhängenden Fragmenten, die 20 oder 21 Nukleotide des Zielgens enthielten führte. Diese Fragmente wurden mit einem zweiten Adaptormolekül ligiert, welches 2 degenerierte Nukleotide an seinem 3' Ende trug, um die überstehenden Enden aufzufüllen. Dies geschieht mit den beiden phosphorilierten Primern Primer-up (SEQ ID NO:25), der an seinem 3' Ende 2 degenerierte Basen trägt und dem Primer Primer-down (SEQ ID NO:26), der an den Primer-up unter Standardreaktionsbedingungen hybridisiert ("annealed") wurde. Optional kann eine Amplifikation der Fragmente mittels PCR erfolgen (Primer 3 SEQ ID NO:27), und die Amplifikate oder die nicht amplifizierten Fragmente werden nach Restriktionsenzymverdau mit Mlγl in einen mit Restriktionsenzym Mscl und StuI glatt (blunt) geöffneten RNA Expressionsvektor pSilencer 1.0-U6 (SEQ ID NO: 14) ligiert. Die von diesem Vektor exprimierte RNA bildet haarnadelartige Strukturen.
Bei der Klonierung der ursprünglichen Oligonukleotide oder der selektionierten Fragmente in Vektoren der Plasmidbank, die auch solche Reportergene tragen können, die weder im Suppressorkonstrukt noch im Zielkonstrukt enthalten sind, werden Plasmide generiert, welche die Oligonukleotid-kodierende Sequenz hinter einem Polymerase-III-Promoter tragen. In einer weiteren Ausführungsform wird das klonierte Oligonukleotid sowohl an seiner 5'- als auch 3'- Flanke von einem Polymerase-III-Promoter flankiert. Je nach Herstellungsweise der Oligonukleotide, entstehen bei der Exprimierung entweder haarnadelförmige oder lineare siRNAs.
Bei der Klonierung der ursprünglichen Oligonukleotide oder der selektionierten Fragmente in einen siRNA Expressionsvektor, zu denen pSilencer 1.0-U6 (Ambion) gehört, werden die Oligoπukleotid-kodierenden Sequenzen ebenfalls hinter einen Polymerase III Promoter eingesetzt, der deren Exprimierung steuert. In einer weiteren Ausführungsform weist die klonierte Oligonukleotidse- quenz sowohl an seiner 5'- als auch der 3'- Flanke einen Polymerase-III-Promoter auf. Diese Phagen-DNA oder siRNA-Expressionsvektoren werden nun in die etablierte Zelllinie oder auch mit Suppressor- und Zielkonstrukt transient transfizierte Zellen übertransfiziert, die das Suppressor- sowie das Zielkonstrukt exprimieren Die Gesamtheit der transfizierten Zellen wird einer G418- (positive Selektion) und Gancidovir-Selektion (negative Selektion) unterzogen.
Unter dieser Selektionsbedingungen überleben nur solche Zellen, deren Thymidinkinase kodierende und translationsfähige mRNA (d.h. die Ganciclovir- Sensitivität) durch Bindung einer siRNA, exprimiert von einem Oligonukleotid eines siRNA Expressionsvektors, an die 3'-untranslatierte Region (die Test- mRNA), abgebaut wird. Natürlich ist dies auch durch Bindung von Oligonukle- otid-kodierten siRNAs an die Sequenz der Thymidinkinase möglich. Diese Zellen werden aber durch das Suppressorkonstrukt gegenselektioniert. In diesem Fall bindet die Oligo-kodϊerte siRNA auch an die Thymidinkinase-Sequenz 3' von der Neomycin-Resistenz. Die mRNA der letzteren wird hierdurch ebenfalls abgebaut, und die Zellen verlieren so nicht nur den negativen Selektionsmarker Thymidinkinase, sondern auch den positiven Selektionsmarker Neomycin- Resistenz, und überleben nicht die Selektion mit G418. Nur Zellen die eine Oligonukleotid-kodierte siRNA spezifisch für das Zielgen ausprägen, d. h. in denen die siRNA mit Bereichen der Zielkonstrukt-mRNA-3' von der HSV-TK interagiert, überleben die Selektion (siehe Figur 2).
Nach Klonierung der Zellen kann das siRNA kodierende Oligonukleotid amplifi- ziert und sequenziert werden. Durch PCR oder andere Methoden kann auch das ganze Expressionskonstrukt aus den Zellen gewonnen und für RNAi- Experimente in anderen Systemen wie z. B. transgenen Mäusen oder anderen Zelllinien verwendet werden.
Das oben beschriebene Verfahren zeichnet sich durch ein Suppressorkonstrukt aus, dass einen Promoter stromaufwärts (5') des ersten Reportergens (positiven Selektionsmarkers), und ein zweites Reportergen (negativer Selektionsmarker) stromabwärts (3') des Stopcodons des ersten Reportergens besitzt. Weiterhin zeichnet sich das oben beschriebene Verfahren durch ein Zielkonstrukt aus, in welchem das mit dem zweiten Reportergen des Suppressorkonstrukt identische Reportergen (negativer Selektionsmarker) stromaufwärts (5') von einem zweiten Promoter flankiert wird, und stromabwärts (3') des Stopcodons flankiert wird von der kodierenden Sequenz des Zielgens. Vorzugsweise enthalten das Suppressionskonstrukt und/oder das Zielkonstrukt zumindest ein RNA/mRNA stabilisierendes Element. Ein RNA/mRNA stabilisierendes Element, insbesondere eine Poly-A-Sequenz, kann sich im Suppressorkonstrukt stromabwärts (3') des zweiten Reportergens (negativer Selektionsmarker) befinden. Im Zielkonstrukt kann sich ein RNA/mRNA stabilisieren- des Element, insbesondere eine PolyA-Sequenz, stromabwärts (37) des Zielgens befinden.
Das erste Reportergen und das zweite Reportergen des Suppressorkonstrukts und/oder das zweite Reportergen und das Zielgen des Zielkonstrukts, sind direkt miteinander verknüpft oder durch einen in beiden Konstrukten vorhandenen identischen kurzen Spacer mit einer Länge von bis zu 20 Nukleotiden voneinander getrennt sind, wobei kürzere Spacer mit einer Länge von bis zu 10 Nukleotiden bevorzugt sind.
Das Suppressorkonstrukt und/oder Zielkonstrukt und/oder die siRNA- Expressionsbank können weitere funktionelle Sequenzen umfassen, die insbesondere ausgewählt sind aus weiteren Reportergenen/Selektionsmarkern und/oder Rekombinase Erkennungssequenzen (Recombinase Recognition Sites (RRS)), wie z. B. loxP-, FRT-, attP- und/oder attB- Sequenzen usw. Zusätzliche Reportergene/Selektionsmarker, wie sie z. B. eingesetzt werden zur Kontrolle der Transfektionseffizienz, haben eigene Expressionskontrollelemente (Promoter, Terminationssignale, Translationssignale usw.), d. h. ihre Exprimierung ist unabhängig von der des ersten und zweiten Reportergens. In dem Suppressionskonstrukt und Zielkonstrukt sind der erste und zweite Promoter unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe von konstitutiv aktiven Promotern, induzierbaren Promotern, zellspezifischen oder gewebsspezifischen Promotern, und insbesondere aus Pol I-, Pol II-, Pol III - Promotern, Sp6-, oder T7-Promotem. Ein Promoter für ein zusätzliches Reportergen/Selektionsmarkern ist auch aus dieser Gruppe auszuwählen. Falls Sp6- und/oder T7- Promoter ausgewählt sind für ein jegliches Gen, müssen die oben genannten Zellen die Sp6 und/oder T7 Polymerase exprimieren.
In dem oben besagten Selektionsverfahren, sind die Reportergene unabhängig voneinander positiv und/oder negativ selektierbare Markergene (Selektionsmarker). Vorzugsweise werden Markergene ausgewählt aus der Gruppe von Genen umfassend das Acyltransferase Gen (Neo), das Hygromycin B Kinase (Hyg) Gen, das Histidinol Dehydrogenase Gen (HisD), das Xanthin- Guanine Phosphoribosyl-transferase (Gpt) Gen, das Bleomycin Resistenz Gen (Ble), das Hypoxanthine Phosphoribosyl-transferase (Hprt) Gen, das Herpes Simplex Virus Thymidinkinase Gen (HSV-TK), das Hypoxanthine Phosphoribosyl-transferase (Hprt) Gen, das Diphterie Toxin Gen, das Ricin Toxin Gen und das Cytosin Deaminase Gen. Besonders bevorzugt wird als erstes Reportergen ein positiv selektierbares Reportergen (positiver Selektionsmarker), insbesondere wird bevorzugt ein Neomycin-Acyltransferase Gen (Neo), und/oder als zweites Reportergen ein negativ selektierbares Markergen (negativer Selektionsmarker), insbesondere ein Thymidinkinase Gen des Herpes Simplex Virus (HSV-TK). Ein in dem oben beschriebenen Verfahren einsetzbares Suppressorkonstrukt weist die SEQ ID NO: 13 auf und ein Zielkonstrukt die SEQ ID NO:19. Das Zielkonstrukt kann eine weitere Expressionskassette für einen positiven Selektionsmarker enthalten, insbesondere ein Puromycin Resistenzgen, das es ermöglicht, auf Transfektanten zu selektieren.
Das oben beschriebene Selektionsverfahren für siRNAs verwendet als Ausgangszellen, die in vitro transfiziert oder transformiert werden, Eukaryonten- zellen einschließlich niederer Eukaryontenzellen wie Hefezellen, Algen- und Schleimpilzzellen, Pflanzenzellen, Vertebratenzellen wie Säuger-, Vögel-, Fisch- und Reptilienzellen, Invertebratenzellen wie Nematoden- und Insektenzellen, wobei Säugerzellen, insbesondere humane und murine Zellen, Nema- todenzellen, insbesondere Zellen von C. elegans, und Insektenzellen, insbesondere Zellen von Drosophila melanogaster und Tribolium confusum (Reismehlkäfer) besonders bevorzugt sind. Die Eukaryontenzellen können dabei sowohl primäre als auch transformierte (d. h. immortalisierte) Zellen sein. Besonders bevorzugt sind humane K562- und murine A20-Zellen. Dabei können die Zellen das Suppressorkonstrukt und/oder Zielkonstrukt transient oder stabil tragen. Insbesondere kann das Suppressorkonstrukt stabil in das Genom der Zelle integriert sein.
Das oben beschriebene Selektionsverfahren für siRNA umfasst die Transfektion/Transformation der oben benannten eukaryontischen Zellen mit Plasmiden einer Oligonukleotid-Plasmidbank oder einer vergleichbaren Oligonukleotid-Expressionsbank. Die in diesen Plasmiden enthaltenen Oligonukleotide kodieren die zu selektionierenden siRNA Moleküle und deren Exprimierung ist Promoter gesteuert. Die Promoter sind ausgewählt aus der Gruppe der Promoter spezifisch für kurze RNA Moleküle. Die Gruppe der Promoter umfasst doppelsträngige und einzelsträngige (U6 oder Hl) Promoter für Pol III und Sp6 und T7 Promoter. Falls Sp6 und T7 Promoter ausgewählt sind, müssen die oben genannten Zellen Sp6 und/oder T7 Polymerase exprimieren. Die Oligonukleotide kodieren vorzugsweise eine siRNA mit einer zufälligen Sequenz, die 19 bis 25 Nukleotide (NT) aufweist, bevorzugt eine zufällige Sequenz, die 21 bis 23 NT aufweist, am stärksten bevorzugt eine Sequenz, die 21 NT aufweist. In einer besonderen Ausführungsform kodieren die Oligonukleotide vorzugsweise eine doppelsträngige siRNA, die eine zufällige zentralen basengepaarten Sequenz mit 19 bis 25 Nukleotiden (NT), bevorzugt eine basengepaarte zufällige zentrale Sequenz mit 21 bis 23 NT und am stärksten bevorzugt eine basengepaarte zufällige zentrale Sequenz mit 21 NT.
In dem oben beschriebenen Verfahren zur Selektion von siRNAs erfolgt die Transfektion/Transformation von in vitro kultivierten Zellen mit den verschiedenen Konstrukten und Plasmiden gemäß bekannter Methoden.
Das oben beschriebene Verfahren umfasst die Kultivierung der Zellen in einem Selektionsmedium. Die Wahl des Mediums wird von dem Zelltyp und den verwendeten Reportergenen/Seiektionsmarkern bestimmt. Die transformierten Zellen werden in einem Selektionsmedium kultiviert, das eine Selektion auf das gewählte erste und zweite Reportergen/Selektionsmarker ermöglicht. Insbesondere falls das erste Reportergen die Neomycin-Acyltransferase und das zweite Reportergen die HSV-TK ist, erfolgt die Selektion mit G418 und Gancyclovir und/oder Acyclovir und/oder FIAU. Die Selektion erlaubt die Identifikation von Zellen, die eine siRNA exprimieren, welche die Degradation der mRNA des Zielgens bewirkt. Zellen, die mit einem Suppressorkonstrukt, einem Zielkonstrukt und einem mRNA Degradation induzierenden siRNA Molekül exprimierenden Oligonukleotid-Expressionsplasmid transfiziert/transformiert sind, sind so identifizierbar. An diese erste Identifikation schließt sich ein zweiter Identifikationsschritt an, mit dem die genaue Identität des die siRNA kodierenden Oligonukleotids zu bestimmen ist. Die Identifikation des mRNA Degradation induzierenden siRNA Moleküls kodierenden Oligonkcleotids erfolgt vorzugsweise durch PCR und Sequenzierung.
Für das oben beschriebene Selektionsverfahren von siRNA ist das Suppressorkonstrukt essentiell. Die oben beschriebenen verschiedenen Ausführungsformen des Suppressorkonstrukts werden beansprucht. Weiterhin werden Zellen, die mit einem Suppressorkonstrukt wie es oben definiert ist, und optional mit einem Zielkonstrukt transfiziert/transformiert sind, beansprucht. Das oben beschriebene Selektionsverfahren für siRNAs ist mit hoher Effizienz für ein beliebiges Zielgen ausführbar, wenn mit dem Suppressionskonstrukt stabil transfizierte Zellen, d. h. Zellen in deren Genom das Suppressionskonstrukt integriert ist, vorliegen. Zellklone in deren Genom das Suppressionskonstrukt integriert ist, stellen eine neue Zelllinie dar. Ein Kit zur Identifikation von Oligonucleotiden, die zur Exprimierung von mRNA induzierenden siRNA Molekülen einsetzbar sind, umfasst das Suppressorkonstrukt oder eine mit dem Suppressorkonstrukt transfizierte/transformierte Zelle. Ein solcher Kit umfasst weiterhin ein Zielkonstrukt oder eine Vorstufe davon, und/oder ein Plasmid zur Klonierung der zufälligen Oligonukleotidsequenzen; vorzugsweise weist das Zielkonstrukt stromabwärts (3') des Translations-Stopcodon des zweiten Reportergens/Selektionsmarkers multiple Restriktionsschnittstellen auf.
Beispiele
1. Herstellung des Zielkonstrukts: Das Thymidinkinase-Gen (SEQ ID NO:9) wird einschliesslich Promoter mit den Primern 5 '-CGAGCAGTGTGGTTTTGCAAG-3 ' (SEQ ID NO:l) und 5 '-CTCGAGCCTGCAGGTTAGCCTCCCCCATCTCCCG-3 ' (SEQ ID NO:2) durch PCR vom Plasmid pEasyflox amplifiziert und in pGEM-Teasy(Promega) kloniert (pGEM-Teasy+TK (SEQ ID NO: 10)). Aus demselben Plasmid pEasyflox oder auch aus pBS-TK, wird die Poly- Adenylierungsstelle (polyA) mittels PCR durch die Primer 5 '-CTCGAGTTTGTTCATAAACGCGGGGTT-3 ' (SEQ ID NO:3), 5 '-CTCGAGCTGAAACACGGAAGGAGACAA-3 ' (SEQ ID NO:28), 5 '-CTCGAGCCTGCAGCCAAGCTTGGGTC-3 ' (SEQ ID NO: 4) und/oder 5 '-CTCGAGAGCTTGGGTCGTCCACCAGAC (SEQ ID NO:29) amplifiziert und in richtiger Orientierung in die Xhol Schnittstelle von pGEM-Teasy+TK eingesetzt (=pGEM-Teasy+TK+polyA (SEQ ID NO: 11)). pGEM-Teasy+TK+polyA wird mit Sall und Spei geschnitten aufgefüllt und religiert. Hierdurch wird eine Sbfl Schnittstelle entfernt. Als weiterer Selektionsmarker wird ein aus pPur (Clontech) (SEQ ID NO:18) isoliertes Puromycin Gen in das Zielkonstrukt eingesetzt; das Puromycin Gen wird mittels Pvu II and Bam HI aus pPur herausgeschnitten und die Bam HI Überhänge mit Klenow Polymerase gefüllt; das Fragment wird in das mit Sac II geöffnete und mit der T4 Polymerase geglättete pGem-Teasy+TK+PolyA (SEQ ID NO: 11) ligiert, und es entsteht pGem-Teasy+TK+PolyA +Puro (SEQ ID NO:19). In die Sbfl Schnittstelle des Konstrukts pGem-Teasy+TK+ PolyA +Puro (SEQ ID NO: 19) kann eine jede beliebige zu testende Ziel-cDNA eingesetzt werden.
Zur Herstellung eines kompletten Zielkonstrukts, welches die BCL10 Sequenz trägt wurde mittels der Primer bcIlO-F (5'-GGCCTGCAGGCCGCTTCTGTTCCTAGTCCCC-3'; SEQ ID NO:22) und bdlO-r (5'-GGCCTGCAGGTGTTAATAGCAAATTTTCATTTC-3 ' ; SEQ ID NO:23) das BCL10 Gen (Zielgen) isoliert Das aufgereinigte BCL10 PCR Produkt (SEQ ID NO:20) wurde mit Sbfl verdaut und in die Sbfl Schnittstelle des leeren Zielkonstrukts pGem-Teasy+TK+ PolyA +Puro (SEQ ID NO: 19) eingesetzt. Das entstehende komplette Zielkonstrukt mit BCL10 Sequenz (SEQ ID NO:21) wurde in ToplO Bakterien transformiert. Plasmid DNA für Transfktionen wurde mittels Maxi Prep (Qiagen) isoliert.
2. Herstellung des Suppressorkonstrukts: Das Gen für die Neomycin-Resistenz wird aus dem Plasmid pEasyFlox (SEQ ID NO: 15) durch PCR mit den Primern 5 '-AATTCTACCGGGTAGGGGAGG-3' (SEQ ID NO:5) und 5 '-TTAATTAACCTCAGAAGAACTCGTCAAGAAG-3' (SEQ ID NO:6) mit Promoter aber ohne Polyadenylierungsstelle amplifiziert und in pGEM- Teasy kloniert (=pGEM-Teasy+Neomycin-R (SEQ ID NO: 12)). Das Gen für die Thymidinkinase wird ohne Promoter aber mit Polyadenylie- rungstelle mittels PCR unter Verwendung der Primer 5 '-TTAATTAAATGGCTTCGTACCCCGGCCAT-3 ' (SEQ ID NO:7) und 5 '-TTAATTAACCTGCAGCCAAGCTTGGGTCG-3 ' (SEQ ID NO:8) oder 5 '-TT TTA GCTTGGGTCGTCCACCAGAC-3 ' (SEQ ID NO: 30) von pEasyflox bzw. pBS-TK amplifiziert und in die Pacl-Schnittstelle von pGEM-Teasy+Neomycin-Resistenz kloniert (Suppression Construct (SEQ ID NO: 13)). Der ORF der Thymidinkinase befindet sich zwar auf der mRNA, die von diesem Konstrukt produziert wird, kann aber nicht translatiert werden, da sich ein Translationsstop davor befindet.
3. Herstellung einer siRNA Expressions Plasmidbank:
(A) Generierung der Oligonukleotide: Eine "random" 21mer Zufallsoligonukleo- tidbibliothek wird synthetisiert. Die cDNA des Zielgens, für die homologe und hybridisierungsfähige Oligonukleotide ausgewählt werden müssen, wird aus einem Plasmid (pGem-Teasy-bcHO) mittels Restriktionsenzymen (Sbfl) isoliert. Die DNA des Zielgen wird auf einem Agarosegel (0,7 bis 1,5%) von der verbleibenden Plasmid DNA getrennt, und dann mittels QuiaQuick-Säule (Quiagen) oder QuiEx2 Milch (Quiagen) gemäß der Angaben des Herstellers aufgereinigt. Die isolierte cDNA des Zielgens und die Oligonukleotide werden in einem molaren Mengenverhältnis von l: 10"u gemischt. Das Gemisch wird für 5 Minuten auf 95 °C erhitzt und dann langsam auf Raumtemperatur abkühlt, um so die Anlagerung der Oligonukleotide an die einzelsträngige cDNA zu ermöglichen. Die Überhänge der cDNA werden durch Verdau mit Mung Bean Nuclease oder einer anderen Exonuclease beseitigt. Oligonukleotide die nicht vollständig gebunden haben werden durch T7 Endonuclease oder entsprechende Endonucleasen beseitigt. Die verbleibenden doppelsträngigen Fragmente mit einer Länge von 21 Nukleotiden werden aufgereinigt und stehen der Klonierung in die siRNA Expressionsplasmide oder Phagenplasmide zur Verfügung. Die mit einem Restriktionsenzym, welche glatte Enden ("blunt-end" ) schafft, geöffneten Vektoren werden mit Shrimp Alkaline Phosphatase (USB, Cleveland) für 1 h bei 37 °C dephosphoriliert. Das Enzym wird anschließend für 15 min bei 65 °C inaktiviert. Die Ligation der phosphorilierten Oligonukleotide bzw. der aufgereinigten Fragmente erfolgt mittels Ligase (NEB) gemäß der Angaben des Herstellers für 1 h bei 20 °C oder über Nacht bei 16 °C. Chemisch kompetente ToplO Bakterien werden einem Hälfte des Ligations- ansatzes transformiert.
(B) In den siRNA Expressionsvektor pSilencer 1.0-U6 (Ambion) werden mittels Sequenz-spezifische Mutagenese vermittelt durch den ExSite Kit von Stratage- ne ("site directed mutagenesis") vorhandene Restriktionsschnittstellen umgewandelt und Terminations-signale eingebracht; die 30 Nukleotide stromabwärts der TATA Sequenz gelegene singuläre Apa I Restriktionsschnittstelle (Position 994 in pSilencer 1.0-U6) wird in eine Msc I Restriktionsschnittstelle umgewandelt; die singuläre Not I Schnittsstelle (Position 1069 in pSilencer 1.0-U6) wird in eine Stu I Schnittstelle umgewandelt und fünf T Nukleotide angefügt als Transkriptions-Terminationssignal.
Der modifizierte Vektor pSilencer 1.0-U6 (SEQ ID NO: 14) wird mit Msc I and Stu I glatt ("blunt end") geöffnet und mit den doppelsträngigen 21mer Fragmente (21mer Bank) ligiert. Von diesen Vektor transkribierte anti-sense RNA hat am 3' Ende einen Überhang von 2 Nukleotiden.
4. Herstellung der mit Zielkonstrukt und Suppressorkonstrukt transformierten Zellen:
(A) Humane K562 werden mit dem Suppressorkonstrukt transfiziert. Dafür werden die Zellen 48 h vor der Transfektion mit einer Zelldichte von 1 x 104 Zellen/ml ausgesät. Die Transfektion von 1 - 5 μg/μl Plasmid DNA erfolgt mittels Nukleofektor (Amaxa) gemäß der Transfektionsvorschriften des Herstellers. 48 h nach der Transfektion wird dem Zellkultivierungsmedium G418 (1 mg/ml) zur Selektion des Suppressionskonstrukt zugefügt. Die Zellen werden für 5 bis 10 Tage unter anhaltenden Selektionsbedingungen selektioniert und vereinzelt bis stabile Zellklone vorliegen. Es folgt die Isolation von zellulä- rer DNA, die mittels Southern Blot, PCR und Sequenzierung auf die Integration des Suppressorkonstrukts hin untersucht wird.
(B) Transfektion der mit dem Suppressorkonstrukt stabil transfizierten Zelllinie mit dem Zielkonstrukt. Zellen der Suppressorzelllinie werden mit Plasmid-DNA des Zielkonstrukts mittels Nukleofaktor (Amaxa) transfiziert. 48 h nach der Transfektion wird das Medium mit Puromycin (5 mg/ml) versetzt, um die Selektion des Zielkonstrukts zu erzielen. Zellklone werden nach 2 Tagen vereinzelt.
(C) Transiente Tansfektion von Suppressorkonstrukt und Zielkonstrukt. Anstelle der Herstellung einer stabil mit dem Suppressorkonstrukt transfizierten Zelllinie und der anschließenden Transfektion mit dem Zielkonstrukt werden humane K562- transient mit beiden Konstrukten parallel transfiziert. Die Transfektion erfolgt mittels Nukleofaktor (Amaxa) gemäß der Anweisung des Herstellers.
(D) Murine A20 Zellen werden entsprechend der oben beschriebenen Schritte (A) bis (C) mit Suppressor und/oder Zielkonstrukt transfiziert.
5. Selektion und Identifikation der siRNA:
(A) Humane K562 Zellen, die mit dem Suppressorkonstrukt und dem Zielkonstrukt transfiziert (stabil oder transient) sind (siehe 4 A - 4D), werden über- transfiziert mit den Oligonukleotidexpressionsplasmiden (siehe 3B). Transfektion von 1-5 μg/μl Plasmiden vermischt mit Nukleofektor (Amaxa) erfolgt gemäß der vom Hersteller beschriebenen Transfektionsbedingungen. 48 h post- Transfektion aller Plasmide (Suppressorkonstrukt, Zielkonstrukt und Oligo- nukleotidexpressionsvektoren) wird dem Zellkultivierungsmedium G418 (zwischen 0,8 und 1 mg/ml) sowie Gancyclovir in einer Konzentration von 100 μM zugesetzt. Je höher die Konzentration an Gancyclovir gewählt ist, desto stringenter sind die Selektionsbedingungen. Die Zellen werden unter diesen Bedingungen für 5 bis 10 Tage kultiviert. Die überlebenden Zellen werden iso- liert und vereinzelt. Aus den überlebenden Zellen wird DNA isoliert (Sambrook et al., Molecular Clonfng: A Laboratory Manual).
(B) Aus der isolierten DNA werden mittels PCR die Bereiche des Oligonukleo- tidexpressionsvektor amplifiziert, in welche die Oligonukleotide bzw Fragmente
(siehe 3A) kloniert wurden. PCR Reaktionen werden mit den sich im Bereich von Nukleotid 654 anlagenden Primer siRNA-F (CCTTAATTAAGTACCCGCTCTAGAACTAGTG) (SEQ ID NO: 16) und dem sich im Bereich von Nukleotid 1078 anlagernden Primer siRNA-R (CCTTAATTAACTGGAGCTCCACCGCGGTGGCG) (SEQ ID NO: 17), Taq
Polymerase sowie Pfu. DNA aus positiven Reaktionen wird auf einem ABI
Sequenzer sequenziert.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Identifikation von kurzen Oligonukleotiden, die kurze interferierenden RNAs (siRNAs) exprimieren, das folgende Schritte umfasst:
(a) Transfektion/Transformation von Ausgangszellen mit einem Suppressorkonstrukt, das ein erstes und ein zweites Reportergen umfasst, wobei das erste Reportergen translatierbar und das zweite Reportergen nicht translatierbar ist;
(b) Transfektion/Transformation der in Schritt (a) erhaltenen transformierten Zellen mit einem Zielkonstrukt, das eine Kopie des zweiten Reportergens, und ein beliebiges Zielgen, dessen Expression durch die zu identifizierende siRNA vermindert werden soll, umfasst, wobei das zweite Reportergen translatierbar und das Zielgen nicht translatierbar ist;
(c) Transfektion/Transformation der in Schritt (b) erhaltenen transformierten Zellen mit Plasmiden einer Oligonukleotid-Bank aus kurzen Oligonukleotiden;
(d) Kultivierung der transfizierten/transformierten Zellen unter Selektionsbedingungen für das erste und das zweite Reportergen; und
(e) Identifikation und Isolation der Zellen, die ein Oligonukleotid-Plasmid tragen, dessen exprimierte siRNA die Degradation der mRNA des Zielgens induziert.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei
(i) im Suppressorkonstrukt das erste Reportergen stromaufwärts (51) flankiert ist von einem ersten Promoter und stromabwärts (3') von einem Stopcodon, und das zweite Reportergen sich stromabwärts (3') vom Stopcodon befindet; (ii) im Zielkonstrukt das dritte Reportergen, das identisch ist mit dem zweiten Reportergen des Suppressorkonstrukts, stromaufwärts (5') flankiert ist von einem zweiten Promoter und stromabwärts (3') flankiert ist von einem Stopcodon, und das Zielgen sich stromabwärts (3') vom Stopcodon befindet, und (iii) wobei vorzugsweise ein RNA stabilisierendes Element, insbesondere eine Poly A Sequenz, sich stromabwärts (3') des zweiten Reportergens des Suppressorkonstrukts und/oder stromabwärts (3') des Zielgens des Zielkonstrukts befindet.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Reportergene unabhängig voneinander positiv und/oder negativ selektierbare Markergene sind, wobei die positiven vorzugsweise ausgewählt sind aus der Gruppe von Genen umfassend das Acyltransferase Gen (Neo), das Hygromycin B Kinase (Hyg) Gen, das Histidinol Dehydrogenase Gen (HisD), das Xanthin-Guanine Phosphoribosyl- transferase (Gpt) Gen, das Bleomycin Resistenz Gen (Ble) und das Hypoxanthine Phosphoribosyl-transferase (Hprt) Gen usw., und die negativen ausgewählt sind aus der Gruppe von von Genen umfassend das Herpes Simplex Virus Thymidinkinase Gen (HSV-TK), das Hypoxanthine Phosphoribosyl-Trans- ferase (Hprt) Gen, das Diphterie Toxin Gen, das Ricin Toxin Gen und das Cy- tosin Deaminase Gen usw., und besonders bevorzugt das erste Reportergen ein positiv selektierbares Reportergen ist, insbesondere ein Neomycin- Acyltransferase Gen (Neo), und das zweite Reportergen ein negativ slektier- bares Reportergen, insbesondere ein Thymidinkinase Gen des Herpes Simplex virus (HSV-TK) ist.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei
(i) die Ausgangszellen Eukaryontenzellen, vorzugsweise niedere Eukaryontenzellen, einschließlich Hefezellen, Algen, Schleimpilze usw., Pflanzenzellen, Ver- tebratenzellen, einchließlich Säuger-, Vögel-, Fisch- und Reptilienzelle, Inver- tebratenzellen, einschließlich Würmer- und Insektenzellen usw. sind, wobei Säugerzellen, insbesondere humane und murine Zellen, und Nematodenzellen besonders bevorzugt sind; und/oder
(ii) das Suppressorkonstrukt und/oder das Zielkonstrukt, insbesondere das Suppressorkonstrukt stabil in das Genom der Zelle integriert sind; und/oder (iiii) das Suppressorkonstrukt und/oder das Zielkonstrukt weitere funktionelle Sequenzen, insbesondere ausgewählt aus weiteren Reporter- gene/Selektionsmarkern und Rekombinase Erkennungssequenzen ("Recombinase recognition Sites" (RRS)) wie loxP-, FLP-, attB und/oder attP Sequenzen umfasst; und/oder
(iv) das erste Reportergen und das zweite Reportergen des Suppressorkonstrukts und/oder des Zielkonstrukts direkt miteinander verknüpft sind oder durch zusätzliche kurze Sequenzen voneinander getrennt sind.
5. Verfahren nach Ansprüchen 2 bis 4, wobei der erste und zweite Promoter unabhängig voneinander aus konstitutiv aktiven Promotern, induzierbaren Promotern, zellspezifischen oder gewebsspezifischen Promotern ausgewählt ist und insbesondere aus Pol I, Pol II Pol III Promotern, Sp6, oder T7 Promotern ausgewählt ist.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Suppressorkonstrukt und das Zielkonstrukt die in SEQ ID NO: 13 und 11 gezeigten Sequenzen aufweisen.
7. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Oligonukleotid-Bank Expressionsplasmide umfasst, die eine Promoter-gesteuerte Exprimierung von Oligonukleotiden zu siRNAs erlaubt, wobei die siRNA vorzugsweise
(i) eine zufällige Sequenz von 19 bis 25 Nukleotiden (NT) umfasst, bevorzugt mit einer Länge von 21 bis 23, am stärksten bevorzugt eine Sequenz mit einer Länge von 21 NT, oder
(ii) eine zufällige zentralen basengepaarten Sequenz von 19 bis 25 Nukleotiden (NT) umfasst, bevorzugt mit einer Länge von 21 bis 23, am stärksten bevorzugt eine zentrale basengepaarte Sequenz mit einer Länge von 23 NT.
8. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 7, umfassend die Fragmentation der Zielgen-cDNA und Isolation der der DNA-Fragmente mit gewünschter Länge oder Synthese von zufälligen Oligonukleotidsequenzen mit gewünschter Länge und nachfolgende Klonierung, wobei zusätzlich ein Hybri- disierungs- und Verdauschritt der Klonierung vorgeschaltet sein kann.
9. Ein Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Fragmentation der Zielgen-cDNA mittels DNAse I Verdau erfolgt, und der Isolationsschritt der DNA-Fragmente mit gewünschter Länge ersetzt ist durch die nachfolgenden Schritte: (i) Ligation eines kurzen haarnadelförmigen DNA Adaptor Molekül, umfassend eine Erkennungststelle für ein Restriktionsenzym mit bis zu 23 vorzugsweise mit bis zu 21 Basenpaare versetzter Schnittstelle, an das 3'- und das 5'-
Enden der Fragmente;
(ii) Verdau mit dem Restriktionssenzym aus Schritt (i);
(iii) Ligation eines zweiten DNA Adaptormoleküls zur Auffüllung des überhängenden 3' Enden;
(iv) Primer Extension der Fragmente; und
(v) Subklonierung in einen Oligonukleotid Expressionsvektor.
10. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 9, wobei in Schritt (d) die transformierten Zellen mit Selektionsmedium kultiviert werden, das eine Selektion auf das gewählte erste und zweite Reportergens ermöglicht, insbesondere falls das erste Reportergen Neomycin-Acyltransferase und das zweite Reportergen HSV-TK ist, Selektion mit G418 und Gancyclovir erfolgt.
11. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 10, das weiterhin den Schritt (f) Identifikation des die Degradation der mRNA des Zielgens induzierten Oligonukleotids in dem in Schritt (e) identifizierten Zellen umfasst, wobei diese Identifikation vorzugsweise durch PCR und Sequenzierung erfolgt.
12. Suppressorkonstrukt, wie in Ansprüchen 1 bis 6 definiert.
13. Zellen, die mit einem Suppressorkonstrukt, wie in Anspruch 12 definiert, und optional mit einem Zielkonstrukt, wie in Ansprüchen 1 bis 6 definiert, transfiziert/transformiert sind.
14. Kit zur Identifikation von Oligonukleotiden, die zur Exprimierung von siRNA einsetzbar sind, umfassend wenigstens ein Suppressorkonstrukt gemäß Anspruch 12 und/oder mit dem Suppressorkonstrukt transfizierten/transformierte Zellen gemäß Anspruch 12.
15. Kit gemäß Anspruch 14, der weiterhin ein Zielkonstrukt, wie in Ansprüchen 1 bis 6 definiert, oder eine Vorstufe davon, und/oder ein Plasmid zur Klonie- rung von zufälligen Oligonukleotidsequenzen, wie in Ansprüchen 1 bis 7 definiert, umfasst, wobei vorzugsweise die Vorstufe des Zielkonstrukts stromabwärts (3') des Translations-Stopcodon multiple Restriktionsenzymsschnittstellen aufweist.
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