Zusammenfassung der Erfindung
Es
wurde ein Selektionsverfahren entwickelt, welches ermöglicht,
die besten siRNA zu finden, die zum Knock-down eines bestimmten
Gens führen.
Die Technik beruht auf einem Positiv/Negativ-Selektionsschema und
ist daher weniger aufwendig als das direkte Testen von siRNAs und/oder
Oligonukleotiden (die die Formation von siRNAs erlauben) auf ihre
Interferenzfähigkeit.
Die Erfindung betrifft im Einzelnen:
- (1) ein
Verfahren zur Identifikation von kurzen Oligonukleotiden, die kurze
interferierenden RNAs (siRNAs) exprimieren, das folgende Schritte
umfasst:
(a) Transfektion/Transformation von Ausgangszellen
mit einem Suppressorkonstrukt, das ein erstes und ein zweites Reportergen
umfasst, wobei das erste Reportergen translatierbar und das zweite
Reportergen nicht translatierbar ist;
(b) Transfektion/Transformation
der in Schritt (a) erhaltenen transformierten Zellen mit einem Zielkonstrukt, das
eine Kopie des zweiten Reportergens, und ein beliebiges Zielgen,
dessen Expression durch die zu identifizierende siRNA vermindert
werden soll, umfasst, wobei das zweite Reportergen translatierbar
und das Zielgen nicht translatierbar ist;
(c) Transfektion/Transformation
der in Schritt (b) erhaltenen transformierten Zellen mit Plasmiden
die eine Oligonukleotid-Bank aus kurzen Oligonukleotiden enthalten;
(d)
Kultivierung der transfizierten/transformierten Zellen unter Selektionsbedingungen
für das
erste und das zweite Reportergen; und
(e) Identifikation und
Isolation der Zellen, die ein Oligonukleotid-Plasmid tragen, dessen
exprimierte siRNA die Degradation der mRNA des Zielgens induziert;
- (2) ein Suppressorkonstrukt, wie in (1) definiert;
- (3) Zellen, die mit einem Suppressorkonstrukt, wie in (1) und
(2) definiert, und optional mit einem Zielkonstrukt, wie in (1)
definiert, transfiziert/transformiert sind; und
- (4) einen Kit zur Identifikation von Oligonukleotiden, die zur
Exprimierung von siRNA einsetzbar sind, umfassend das Suppressorkonstrukt,
wie in (1) und (2) definiert, und/oder eine mit dem Suppressorkonstrukt transfizierte/transformierte
Zelle, wie in (3) definiert.
Kurzbeschreibung der Figuren
1: Schematisierte Darstellung
der Ziel- und Suppressorkonstrukte und der Oligo-Plasmidbank.
(A)
Zielkonstrukt: Unter der Kontrolle eines Promoters steht ein Fusionsgen,
umfassend die Thymidinkinase des Herpes-simplex-Virus (HSV-TDK)
mit einem Translations-Stopcodon an deren 3' Ende und die cDNA eines beliebigen
Zielgens, für
das ein kurzer Oligo, von dem eine siRNA expremiert werden kann,
gefunden werden soll. An das 5' Ende
des Zielgens schließt
sich eine Poly-A-Sequenz (pA) an. Durch Transkription entsteht eine Fusions-mRNA,
von der aber nur die HSV-TK translatierbar ist, nicht aber das Zielgen.
(B)
Suppressorkonstrukt: Unter der Kontrolle eines Promoters steht ein
Fusionsgen, umfassend das Gen für Neomycin-Resistenz
(Neomycin R) mit einem Translations-Stopcodon an dessen 3' Ende und die Gensequenz für die Thymidinkinase
des Herpes-simplex-Virus (HSV-TDK). An das 5' Ende der HSV-TDK schließt sich
eine Poly-A-Sequenz (pA) an. Durch Transkription entsteht eine Fusions-mRNA,
von der aber nur das Neomycin-R translatierbar ist, nicht aber die
HSV-TK.
(C) Oligo-Plasmidbank: Klonierung von degenerierten
zufälligen
Oligonukleotiden, umfassend 21 Nukleotide (Quadrate) in ein Plasmid
mit einem Polymerase-III-Promoter.
2: Selektion von transfizierten/transformierten
Zellen mit G418 und Gancyclovir
(A) unspezifische siRNA: Zellen
expremieren mRNAs des Ziel-Konstrukts, des Suppressorkonstrukt und
eine unspezifische siRNA, die weder an die mRNA des Ziel-Konstrukts,
noch an die des Suppresorkonstrukts anbinden kann. Die mRNAs werden
nicht degradiert, so dass der negative Selektionsmarker Thymidinkinase
exprimiert wird. Durch die Thymidinkinase wird das Nukleotidderivat-Gancyclovir
umgewandelt, was zu dessen Einbau in die zelluläre DNA führt, wodurch schließlich der
Zelltod induziert wird.
(B) siRNA spezifisch für HSV-TK:
Zellen exprimieren mRNAs des Zielkonstrukts, des Suppressorkonstrukts und
eine siRNA mit Spezifität
für die
HSV-TK-mRNA. Die
siRNA interagiert mit beiden Fusions-mRNAs des Ziel-Konstrukts und
des Suppressorkonstrukts, was zur Degradation beider mRNAs führt. Die
Zellen sind nicht mehr resistent gegen Neomycin und sterben ab.
(C)
siRNA für
das Zielgen: Zellen exprimieren mRNAs des Ziel-Konstrukts, des Suppressorkonstrukt
und eine siRNA spezifisch für
das Zielgen. Die siRNA interagiert mit der mRNA des Zielgens und
induziert Degradation dieser, so dass der negative Selektionsmarker
Thymidinkinase nicht mehr exprimiert wird. Die mRNA des Suppressorkonstrukts
wird nicht angegriffen und bleibt stabil, so dass der positive Selektionsmarker
Neomycin-Acyltransferase auch translatiert wird. Die Zellen überleben
die Selektion mit Gancyclovir und G418.
3: siRNA Selektionskit
Ein
Kit umfasst eine stabil mit dem Suppressorkonstrukt transfizierte
Zelllinie (A) und einen "leeres" Zielkonstrukt (B),
in das gewünschte
Zielgene in Restriktionsstellen 3' von dem Translations-Stopcodon der
HSV-TK eingesetzt werden können.
Das "gefüllte" Ziel-Konstrukt wird
in die stabil transfizierte Zelllinie des Kits transfiziert (C).
Ebenso werden Vektoren der Oligo-Plasmidbank (D) in die Zelllinie
des Kits transfiziert. Die entstehenden Zellen tragen und exprimieren
das Suppressor-Konstrukt, das Ziel-Konstrukt und Vektoren der Oligo-Plasmidbank
(E).
4: Klonierungsstrategie
für das
Suppressorkonstrukt. Zwei Klonierungsschritte umfassende Strategie
zur Herstellung des Suppressorkonstrukts (die exakte Sequenz des
abgebildeten Suppressorkonstrukts ist in SEQ ID. NO: 13 gezeigt).
5: Klonierungsstrategie
für das
Zielkonstrukt. Drei Klonierungsschritte umfassende Strategie zur Herstellung
des Zielkonstrukts (die exakte Sequenz des abgebildeten Zielkonstrukts
ist in SEQ ID. NO: 19 gezeigt).
Detaillierte Beschreibung
der Erfindung
Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Selektionsverfahren zur Identifikation
von siRNA kodierenden Oligonukleotiden. Das Verfahren beruht auf
einer Kombination von positiver und negativer Selektion und findet vorzugsweise
in vitro statt. Zum Einsatz kommen ein Suppressorkonstrukt und ein
Zielkonstrukt sowie Plasmide einer Oligonukleotid-Expressionsbank.
Von dem Suppressionskonstrukt wird z. B. eine mRNA exprimiert, die
einen positiven als auch einen nicht-translationsfähigen negativen
Reporter (nachfolgend auch "Selektionsmarker") kodiert, wohingegen
von dem Zielkonstrukt eine mRNA exprimiert wird, die eine translationsfähige Version
des negativen Selektionsmarkers des Suppressorskonstrukts kodiert
als auch ein nicht-translationsfähiges
Zielgen, für
das eine siRNA zu identifizieren ist. Als zusätzliches Element kann das Zielkonstrukt
noch eine zweite mRNA für
ein weiteren positiven Selektionsmarker exprimieren.
Positive
und/oder negative Selektionsmarker bewirken in Zellen, die mit DNA
für Suppressions- und/oder
Zielkonstrukt transfiziert oder transformiert sind, die Ausprägung einer
positiven und/oder negativen Eigenschaft, die charakteristisch für den gewählten Selektionsmarker
ist. Die Selektion auf den positiven Selektionsmarker umfasst das
Zusammenbringen der mit Suppressor- und/oder Zielkonstrukt transfizierten
oder transformierten Zellen mit einer Substanz, die lethal für die Zelle
ist, sofern sie den entsprecheneden positiven Selektionsmarker nicht
exprimiert (mRNA und Protein). Unter negativer Selektion versteht
man das Kontaktieren der mit Suppressor- und/oder Zielkonstrukt transfizierten
oder transformierten Zellen mit einer Substanz, die lethal für die Zelle
ist, sofern sie den entsprecheneden negativen Selektionsmarker exprimiert
(mRNA und Protein).
Positive
und negative Slektionsmarker sind dem Fachmann hinreichend bekannt
(z. B. aus US-Patent Nr. 5,631,153). Positive Selektionsmarker für das Suppressorkonstrukt
und das Zielkonstrukt sind bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe von Genen,
umfassend das Neomycin-Acyltransferase-Gen (Neo), das Hygromycin-B-Kinase-Gen
(Hyg), das Histidinol-Dehydrogenase-Gen (HisD), das Xanthin-Guanine
Phosphoribosyl-Transferase-Gen (Gpt), das Bleomycin-Resistenz-Gen (Ble),
das Hypoxanthine-Phosphoribosyl-Transferase-Gen (Hprt) usw. Negative
Selektionsmarker für
das für
das Suppressorkonstrukt und das Zielkonstrukt sind bevorzugt ausgewählt aus
der Gruppe von Genen, umfassend das Herpes-simplex-Virus-Thymidinkinase-Gen
(HSV-TK), das Hypoxanthine-Phosphoribosyl-Transferase-Gen (Hprt),
das Diphterie-Toxin-Gen,
das Ricin-Toxin-Gen, das Cytosin-Deaminase-Gen usw. Als selektive
Substanzen für
die vorstehend genannten bevorzugten positiven Selektionsmarker
werden eingesetzt: G418, Kanamycin oder Neomycin-R für Neo, Hygromycin
für Hyg,
Histidinol für
HisD, Xanthine für
Gpt, Bleomycin für
Ble und Hypoxanthine für
Hprt. Als selektive Substanzen für
die negativen Selektionsmarker werden eingesetzt: Gancyclovir, Acyclovir
oder FIAU für
die HSV-TK, 6-Thioguanin
für Hprt,
6-Thioxanthin für
Gpt und 5-Fluorocytosin für
die Cytosin-Deaminase. Bei Verwendung des Ricin Toxin Gens oder
des Diphterie Toxin Gens muss keine selektive Substanz den Zellen
zugefügt
werden. Bei Verwendung des letzteren muss dieses im Zielkonstrukt
unter der Kontrolle eines induzierbaren Promoters stehen.
Zu
den positiven und negativen Selektionsmarkern werden auch membranständige Oberflächenproteine
und intrazelluläre
bio-fluoreszierende Proteine gerechnet, die mittels immuno-cytochemischer,
immuno-magnetischer und Fluoreszenz Methoden, z. B. FACS, MACS Sortierung
oder visueller Sortierung nach farbigen (z. B. grünen oder
roten) Zellen, selektioniert werden können. Geignete Oberflächenproteine
sind solche Proteine, die natürlicherweise
nicht in den zu transformierenden Zellen exprimiert werden, wie
z. B. CD4, CD8 usw. Geeignete bio-fluoreszierende Proteine sind
vorzugsweise ausgewählt
aus der Gruppe umfassend GFP, RFP, DsRed, YFP usw. Bei dieser Art
von Selektion werden die transfizierten oder transformierten Zellen
nicht mit einer lethalen Substanz in Kontakt gebracht. Falls Oberflächenproteine
als Marker eingesetzt werden, werden die transformierten Zellen
mit Fluoreszenz-markierten Antikörpern
oder mit an magnetische Partikel gekoppelten Antikörpern in
Kontakt gebracht. Eine Selektion wird als positiv definiert, wenn
die Zellen, die ein Oberflächenmarker,
Markermolekül
oder ein intrazelluläres
biofluoreszierende Protein exprimieren, aus dem Zellgemisch isoliert
werden und in Kultur verbleiben können. Eine Selektion wird als
negativ definiert, wenn die Zellen, die ein Oberflächenmarker,
Markermolekül
oder ein intrazelluläres
biofluoreszierendes Protein nicht exprimieren, aus dem Zellgemisch
isoliert werden und weiter kultiviert werden können bzw. in der Kultur verbleiben
können.
Die
Erfindung wird nachfolgen in Bezug auf die genannten bevorzugten
Reportergenen beschrieben. Zunächst
wird durch Transfektion einer Zelllinie mit einem Suppressorkonstrukt
eine Zelllinie generiert, die konstitutiv ein Transgen ausprägt, welches
eine mRNA bildet, die zur Bildung des positiven Selektionsmarkers Neomycin-Acyltransferase
führt.
Nach dem Translationsstop der Neomycin-Acyltransferase RNA folgt
auf derselben mRNA die kodierende Sequenz des negativen Selektionsmarkers
Herpes-simplex-Virus-Thymidinkinase (HSV-TK). Dieses gesamte Transgen
ist im Folgenden das Suppressorkonstrukt.
Das
Zielkonstrukt, das in die oben beschriebene etablierte Zelllinie
transfiziert wird, exprimiert ein zweites heterologes Transgen,
das den negativen Selektionsmarker Thymidinkinase (HSV-TK) umfasst,
und hinter dessen Translations-Stopcodon
auf derselben mRNA die kodierende Sequenz der Ziel-mRNA folgt. Ein "leere" Vorstufe des Zielkonstrukt
trägt stromabwärts (3') des Translations-Stopcodon
der HSV-TK eine oder mehrere multiple Restriktionsenzymsschnittstellen,
die es erlauben eine jede beliebige cDNA in das Zielkonstrukt einzuklonieren.
Geeignete Restriktionsenzymschnittstellen sind dem Fachmann bekannt
und er weiß sie entsprechend
den jeweilig ausgewählten
Markergenen auszuwählen;
bevorzugt sind dabei singuläre
Schnittstellen, die nicht in den Selektionmarkern selber vorliegen,
oder nur in deren untranslatierten 5'- und 3'-Regionen vorkommen.
Die
auszutestenden Oligonukleotide, die für potentielle siRNA Moleküle kodieren,
werden als Oligonukleotide mit zufälliger Sequenz hergestellt
und in geeigneten Vektoren, wie z. B. einer Phagenbank (ähnlich einer
Phage-Display-Library)
oder einen siRNA Expressionsvektor, kloniert. Alternativ zu der
direkten Klonierung der kommerziell synthetisierten Oligonukleotide,
kann ein zusätzlicher
Selektionsschritt durchgeführt
werden. Dieser umfasst eine Anlagerungsreaktion ("Annealing") der kurzen Oligonukleotide
an das isolierte denaturierte Zielgen und eine anschließende Nuclease-vermittelte
Degradation der ungepaarten Bereiche. Es verbleiben somit kurze
doppelsträngige
Fragmente mit der gleichen Länge
wie die ursprünglichen
Oligonukleotide, die dann in einen Vektor ligiert werden.
Bei
der Klonierung der ursprünglichen
Oligonukleotide oder der selektionierten Fragmente in Vektoren der
Plasmidbank werden Plasmide generiert, welche die Oligonukleotid-kodierende
Sequenz hinter einem Polymerase-III-Promoter tragen. In einer weiteren
Ausführungsform
wird das klonierte Oligonukleotid sowohl an seiner 5'- als auch 3'-Flanke von einem
Polymerase-III-Promoter flankiert.
Bei
der Klonierung der ursprünglichen
Oligonukleotide oder der selektionierten Fragmente in einen siRNA
Expressionsvektor, zu denen pSilencer 1.0-U6 (Ambion) gehört, werden
die Oligonukleotid-kodierenden Sequenzen ebenfalls hinter einen
Polymerase III Promoter eingesetzt, der deren Exprimierung steuert.
In einer weiteren Ausführungsform
weist die klonierte Oligonukleotidsequenz sowohl an seiner 5'- als auch der 3'-Flanke einen Polymerase-III-Promoter
auf. Diese Phagen-DNA oder siRNA-Expressionsvektoren werden nun
in die etablierte Zelllinie oder auch mit Suppressor- und Zielkonstrukt
transient transfizierte Zellen übertransfiziert,
die das Suppressor- sowie das Zielkonstrukt exprimieren Die Gesamtheit
der transfizierten Zellen wird einer G418- (positive Selektion) und Ganciclovir-Selektion
(negative Selektion) unterzogen.
Unter
dieser Selektionsbedingungen überleben
nur solche Zellen, deren Thymidinkinase kodierende und translationsfähige mRNA
(d. h. die Ganciclovir-Sensitivität) durch Bindung einer siRNA,
exprimiert von einem Oligonukleotid eines siRNA Expressionsvektors,
an die 3'-untranslatierte
Region (die Test-mRNA), abgebaut wird. Natürlich ist dies auch durch Bindung
von Oligonukleotid-kodierten
siRNAs an die Sequenz der Thymidinkinase möglich. Diese Zellen werden
aber durch das Suppressorkonstrukt gegenselektioniert. In diesem Fall
bindet die Oligo-kodierte siRNA auch an die Thymidinkinase-Sequenz
3' von der Neomycin-Resistenz.
Die mRNA der letzteren wird hierdurch ebenfalls abgebaut, und die
Zellen verlieren so nicht nur den negativen Selektionsmarker Thymidinkinase,
sondern auch den positiven Selektionsmarker Neomycin-Resistenz, und überleben
nicht die Selektion mit G418. Nur Zellen die eine Oligonukleotid-kodierte
siRNA spezifisch für
das Zielgen ausprägen,
d. h. in denen die siRNA mit Bereichen der Zielkonstrukt-mRNA-3' von der HSV-TK interagiert, überleben
die Selektion (siehe 2).
Nach
Klonierung der Zellen kann das siRNA kodierende Oligonukleotid amplifiziert
und sequenziert werden. Durch PCR kann auch das ganze Expressionskonstrukt
aus den Zellen gewonnen und für
RNAi-Experimente in anderen Systemen wie z. B. transgenen Mäusen oder
anderen Zelllinien verwendet werden.
Das
oben beschriebene Verfahren zeichnet sich durch ein Suppressorkonstrukt
aus, dass einen Promoter stromaufwärts (5') des ersten Reportergens (positiven
Selektionsmarkers), und ein zweites Reportergen (negativer Selektionsmarker)
stromabwärts
(3') des Stopcodons
des ersten Reportergens besitzt. Weiterhin zeichnet sich das oben
beschriebene Verfahren durch ein Zielkonstrukt aus, in welchem das
mit dem zweiten Reportergen des Suppressor konstrukt identische Reportergen
(negativer Selektionsmarker) stromaufwärts (5') von einem zweiten Promoter flankiert
wird, und stromabwärts
(3') des Stopcodons
flankiert wird von der kodierenden Sequenz des Zielgens. Vorzugsweise
enthalten das Suppressionskonstrukt und/oder das Zielkonstrukt zumindest
ein RNA/mRNA stabilisierendes Element. Ein RNA/mRNA stabilisierendes
Element, insbesondere eine Poly-A-Sequenz, kann sich im Suppressorkonstrukt
stromabwärts
(3') des zweiten
Reportergens (negativer Selektionsmarker) befinden. Im Zielkonstrukt
kann sich ein RNA/mRNA stabilisierendes Element, insbeondere eine
PolyA-Sequenz, stromabwärts
(3') des Zielgens
befinden.
Das
erste Reportergen und das zweite Reportergen des Suppressorkonstrukts
und/oder das zweite Reportergen und das Zielgen des Zielkonstrukts,
sind direkt miteinander verknüpft
oder durch einen kurzen Spacer mit einer Länge von bis zu 20 Nukleotiden
voneinander getrennt sind, wobei kürzere Spacer mit einer Länge von
bis zu 10 Nukleotiden bevorzugt sind.
Das
Suppressorkonstrukt und/oder Zielkonstrukt können weitere funktionelle Sequenzen
umfassen, die insbesondere ausgewählt sind aus weiteren Reportergenen/Selektionsmarkern
und/oder Rekombinase Erkennungssequenzen (Recombinase Recognition
sites (RRS)), wie z. B. loxP-, FRT-, attP- und/oder attB-Sequenzen
usw. Zusätzliche
Reportergene/Selektionsmarker, wie sie z. B. eingesetzt werden zur
Kontrolle der Transfektionseffizienz, haben eigene Expressionskontrollelemente
(Promoter, Terminationssignale, Translationssignale usw.), d. h.
ihre Exprimierung ist unabhängig
von der des ersten und zweiten Reportergens. In dem Suppressionskonstrukt
und Zielkonstrukt sind der erste und zweite Promoter unabhängig voneinander
ausgewählt
aus der Gruppe von konstitutiv aktiven Promotern, induzierbaren
Promotern, zellspezifischen oder gewebsspezifischen Promotern, und
insbesondere aus Pol I-, Pol II-, Pol III – Promotern, Sp6-, oder T7-Promotern.
Ein Promoter für
ein zusätzliches
Reportergen/Selektionsmarkern ist auch aus dieser Gruppe auszuwählen. Falls
Sp6- und/oder T7-Promoter ausgewählt
sind für
ein jegliches Gen, müssen
die oben genannten Zellen die Sp6 und/oder T7 Polymerase exprimieren.
In
dem oben besagten Selektionsverfahren, sind die Reportergene unabhängig voneinander
positiv und/oder negativ selektierbare Markergene (Selektionsmarker).
Vorzugsweise werden Markergene ausgewählt aus der Gruppe von Genen
umfassend das Acyltransferase Gen (Neo), das Hygromycin B Kinase
(Hyg) Gen, das Histidinol Dehydrogenase Gen (HisD), das Xanthin-Guanine Phosphoribosyl-transferase
(Gpt) Gen, das Bleomycin Resistenz Gen (Ble), das Hypoxanthine Phosphoribosyl-transferase
(Hprt) Gen, das Herpes simplex Virus Thymidinkinase Gen (HSV-TK),
das Hypoxanthine Phosphoribosyl-transferase (Hprt) Gen, das Diphterie
Toxin Gen, das Ricin Toxin Gen und das Cytosin Deaminase Gen. Besonders
bevorzugt wird als erstes Reportergen ein positiv selektierbares
Reportergen (positiver Selektionsmarker), insbesondere wird bevorzugt
ein Neomycin-Acyltransferase Gen (Neo), und/oder als zweites Reportergen
ein negativ selektierbares Markergen (negativer Selektionsmarker),
insbesondere ein Thymidinkinase Gen des Herpes simplex Virus (HSV-TK).
Ein in dem oben beschriebenen Verfahren einsetzbares Suppressorkonstrukt
weist die SEQ ID No: 13 auf und ein Zielkonstrukt die SEQ ID NO:
19. Das Zielkonstrukt kann eine weitere Expressionskassette für einen
positiven Selektionmarker enthalten, insbeondere ein Puromycin Resistenzgen,
das es ermöglicht,
auf Transfektanten zu selektieren.
Das
oben beschriebene Selektionsverfahren für siRNAs verwendet als Ausgangszellen,
die in vitro transfiziert oder transformiert werden, Eukaryontenzellen
einschließlich
niederer Eukaryontenzellen wie Hefezellen, Algen- und Schleimpilzzellen,
Pflanzenzellen, Vertebratenzellen wie Säuger-, Vögel-, Fisch- und Reptilienzellen, Invertebratenzellen
wie Nematoden- und Insektenzellen, wobei Säugerzellen, insbesondere humane
und murine Zellen, Nematodenzellen, insbesondere Zellen von C. elegans,
und Insektenzellen, insbesondere Zellen von Drosophila melanogaster
und Tribolium confusum (Reismehlkäfer) besonders bevorzugt sind.
Die Eukaryontenzellen können dabei
sowohl primäre
als auch transformierte (d. h. immortalisierte) Zellen sein. Besonders
bevorzugt sind humane K562- und murine A20-Zellen. Dabei können die
Zellen das Suppressorkonstrukt und/oder Zielkonstrukt transient
oder stabil tragen. Insbesondere kann das Suppressorkonstrukt stabil
in das Genom der Zelle integriert sein.
Das
oben beschriebene Selektionsverfahren für siRNA umfasst die Transfektion/Transformation
der oben benannten eukaryontischen Zellen mit Plasmiden einer Oligonukleotid-Plasmidbank
oder einer vergleichbaren Oligonukleotid-Expressionsbank. Die in
diesen Plasmiden enthaltenen Oligonukleotide kodieren die zu selektionierenden
siRNA Moleküle
und deren Exprimierung ist Promoter gesteuert. Die Promoter sind
ausgewählt
aus der Gruppe der Promoter spezifisch für kurze RNA Moleküle. Die
Gruppe der Promoter umfasst doppelsträngige und einzelsträngige (U6
oder H1) Promoter für
Pol III und Sp6 und T7 Promoter. Falls Sp6 und T7 Promoter ausgewählt sind,
müssen
die oben genannten Zellen Sp6 und/oder T7 Polymerase exprimieren. Die
Oligonukleotide kodieren vorzugsweise eine siRNA mit einer zufälligen Sequenz,
die 19 bis 25 Nucleotide (NT) aufweist, bevorzugt eine zufällige Sequenz,
die 21 bis 23 NT aufweist, am stärksten
bevorzugt eine Sequenz, die 21 NT aufweist. In einer besonderen
Ausführungsform
kodieren die Oligonukleotide vorzugsweise eine doppelsträngige siRNA,
die eine zufällige
zentralen basengepaarten Sequenz mit 19 bis 25 Nukleotiden (NT),
bevorzugt eine basengepaarte zufällige
zentrale Sequenz mit 21 bis 23 NT und am stärksten bevorzugt eine basengepaarte
zufällige
zentrale Sequenz mit 21 NT.
In
dem oben beschriebenen Verfahren zur Selektion von siRNAs erfolgt
die Transfektion/Transformation von in vitro kultivierten Zellen
mit den verschiedenen Konstrukten und Plamiden gemäß bekannter
Methoden.
Das
oben beschriebene Verfahren umfasst die Kultivierung der Zellen
in einem Selektionsmedium. Die Wahl des Mediums wird von dem Zelltyp
und den verwendeten Reportergenen/Selektionsmarkern bestimmt. Die
transformierten Zellen werden in einem Selektionsmedium kultiviert,
das eine Selektion auf das gewählte erste
und zweite Reportergen/Selektionsmarker ermöglicht. Insbesondere falls
das erste Reportergen die Neomycin-Acyltransferase und das zweite
Reportergen die HSV-TK ist, erfolgt die Selektion mit G418 und Gancyclovir
und/oder Acyclovir und/oder FIAU. Die Selektion erlaubt die Identifikation
von Zellen, die eine siRNA exprimieren, welche die Degradation der
mRNA des Zielgens bewirkt. Zellen, die mit einem Suppressorkonstrukt,
einem Zielkonstrukt und einem mRNA Degradation induzierenden siRNA
Molekül
exprimierenden Oligonukleotid-Expressionsplasmid transfiziert/transformiert
sind, sind so identifizierbar. An diese erste Identifikation schließt sich
ein zweiter Identifikationsschritt an, mit dem die genaue Identität des die
siRNA kodierenden Oligonucleotids zu bestimmen ist. Die Identifikation
des mRNA Degradation induzierenden siRNA Moleküls kodierenden Oligonucleotids
erfolgt vorzugsweise durch PCR und Sequenzierung.
Für das oben
beschriebene Selektionsverfahren von siRNA ist das Suppressorkonstrukt
essentiell. Die oben beschriebenen verschiedenen Ausführungsformen
des Suppressorkonstrukts werden beansprucht. Weiterhin werden Zellen,
die mit einem Suppressorkonstrukt wie es oben definiert ist, und
optional mit einem Zielkonstrukt transfiziert/transformiert sind,
beansprucht. Das oben beschriebene Selektionsverfahren für siRNAs
ist mit hoher Effizienz für
ein beliebiges Zielgen ausführbar,
wenn mit dem Suppressionskonstrukt stabil transfizierte Zellen,
d. h. Zellen in deren Genom das Suppressionskonstrukt integriert
ist, vorliegen. Zellklone in deren Genom das Suppressionskonstrukt
integriert ist, stellen eine neue Zelllinie dar. Ein Kit zur Identifikation
von Oligonucleotiden, die zur Exprimierung von mRNA induzierenden
siRNA Molekülen
einsetzbar sind, umfasst das Suppressorkonstrukt oder eine mit dem
Suppressorkonstrukt transfizierte/transformierte Zelle. Ein solcher
Kit umfasst weiterhin ein Zielkonstrukt oder eine Vorstufe davon,
und/oder ein Plasmid zur Klonierung der zufälligen Oligonukleotidsequenzen;
vorzugsweise weist das Zielkonstrukt stromabwärts (3') des Translations-Stopcodon des zweiten
Reportergens/Selektionsmarkers multiple Restriktionsschnittstellen
auf.
Beispiele
1. Herstellung des Zielkonstrukts:
Das
Thymidinkinase-Gen (SEQ ID No. 9) wird einschliesslich Promoter
mit den Primern 5'-CGAGCAGTGTGGTTTTGCAAG-3' (SEQ ID NO: 1) und
5'-CTCGAGCCTGCAGGTTAGCCTCCCCCATCTCCCG-3' (SEQ ID NO: 2) durch
PCR vom Plasmid pEasyflox amplifiziert und in pGEM-Teasy(Promega)
kloniert (pGEM-Teasy+TK (SEQ ID NO: 10)).
Aus
demselben Plasmid wird die Poly-Adenylierungsstelle (polyA) mittels
PCR durch die Primer 5'-CTCGAGTTTGTTCATAAACGCGGGGTT-3' (SEQ ID NO: 3) und
5'-CTCGAGCCTGCAGCCAAGCTTGGGTC-3' (SEQ ID NO: 4) amplifiziert
und in richtiger Orientierung in die XhoI Schnittstelle von pGEM-Teasy+TK
eingesetzt (= pGEM-Teasy+TK+polyA (SEQ ID NO: 11)). pGEM-Teasy+TK+polyA
wird mit SalI und SpeI geschnitten aufgefüllt und religiert. Hierdurch
wird eine SbfI Schnittstelle entfernt. Als weiterer Selektionsmarker
wird ein aus pPur (Clontech) (SEQ ID NO.: 18) isoliertes Puromycin
Gen in das Zielkonstrukt eingesetzt; das Puromycin Gen wird mittels
Pvu II and Bam HI aus pPur herausgeschnitten und die Überhänge mit
Klenow Polymerase gefüllt;
das Fragment wird in das mit Sac II geöffnete und mit der T4 Polymerase
geglättete
pGem-Teasy+TK+PolyA (SEQ 11) ligiert, und es entsteht pGem-Teasy+TK+PolyA +Puro
(SEQ ID: NO. 19). In die SbfI Schnittstelle des Konstrukts pGem-Teasy+TK+PolyA
+Puro (SEQ ID: NO. 19) kann eine jede beliebige zu testende Ziel-cDNA
eingesetzt werden.
Zur
Herstellung eines kompletten Zielkonstrukts, welches die BCL10 Sequenz
trägt wurde
mittels der Primer bcl10-F (GGCCTGCAGGCCGCTTCTGTTCCTAGTC-CCC; SEQ
ID: NO: 22) und bcl10-r (GGCCTGCAGGTGTTAATAGCAAATTTTCAT-TTC; SEQ
ID: NO.: 23) das BCL10 Gen (Zielgen) isoliert Das aufgereinigte
BCL10 PCR Produkt (SEQ ID: NO.: 20) wurde mit Sbf1 verdaut und in
die SbfI Schnittstelle des leeren Zielkonstrukts pGem-Teasy+TK+PolyA
+Puro (SEQ ID: NO. 19) eingesetzt. Das entstehende komplette Zielkonstrukt
mit BCL10 Sequenz (SEQ. ID. NO.: 21) wurde in Top10 Bakterien transformiert.
Plasmid DNA für
Transfktionen wurde mittels Maxi Prep (Qiagen) isoliert.
2. Herstellung des Suppressorkonstrukts:
Das
Gen für
die Neomycin-Resistenz wird aus dem Plasmid pEasyFlox (SEQ ID NO:
15) durch PCR mit den Primern 5'-AATTCTACCGGGTAGGGGAGG-3
(SEQ ID NO: 5) und 5'-TTAATTAACCTCAGAAGAACTCGTCAAGAAG-3
(SEQ ID NO: 6) mit Promoter aber ohne Polyadenylierungsstelle amplifiziert
und in pGEM-Teasy kloniert (= pGEM-Teasy+Neomycin-R (SEQ ID NO: 12)).
Das
Gen für
die Thymidinkinase wird ohne Promoter aber mit Polyadenylierungstelle
mittels PCR unter Verwendung der Primer 5'-TTAATTAAATGGCTTCGTACCCCGGCCAT-3' (SEQ ID NO: 7) und 5'-TTAATTAACCTGCAGCCAAGCTTGGGTCG-3 (SEQ
ID NO: 8) von pEasyflox amplifiziert und in die PacI-Schnittstelle
von pGEM-Teasy+Neomycin-Resistenz kloniert (Suppression Construct
(SEQ ID NO: 13)). Der ORF der Thymidinkinase befindet sich zwar
auf der mRNA, die von diesem Konstrukt produziert wird, kann aber
nicht translatiert werden, da sich ein Translationsstop davor befindet.
3. Herstellung einer siRNA
Expressions Plasmidbank:
- (A) Generierung der Oligonukleotide: Eine "random" 21mer Zufallsoligonukleotidbibliothek
wird synthetisiert. Die cDNA des Zielgens, für die homologe und hybridisierungsfähige Oligonukleotide
ausgewählt
werden müssen,
wird aus einem Plasmid (pGem-Teasy-bcl10) mittels Restriktionsenzymen
(SbfI) isoliert. Die DNA des Zielgen wird auf einem Agarosegel (0,7
bis 1,5%) von der verbleibenden Plasmid DNA getrennt, und dann mittels
QuiaQuick (Quiagen) oder QuiEx2 Säulen (Quiagen) gemäß der Angaben
des Herstellers aufgereinigt. Die isolierte cDNA des Zielgens und
die Oligonukleotide werden in einem molaren Mengenverhältnis von
1 : 10–11 gemischt.
Das Gemisch wird für
5 Minuten auf 95°C
erhitzt und dann langsam auf Raumtemperatur abkühlt, um so die Anlagerung der
Oligonukleotide an die einzelsträngige
cDNA zu ermöglichen.
Die Überhänge der cDNA
werden durch Verdau mit Mung Bean Nuclease oder einer anderen Exonuclease
beseitigt. Oligonukleotide die nicht vollständig gebunden haben werden
durch T7 Endonuclease oder entsprechende Endonucleasen beseitigt.
Die verbleibenden doppelsträngigen
Fragmente mit einer Länge
von 21 Nukleotiden werden aufgereinigt und stehen der Klonierung
in die siRNA Expressionsplasmide oder Phagenplasmide zur Verfügung. Das
mit einem Restriktionsenzym, das glatte Enden ("blunt-end") schafft, geöffneten Vektoren werden mit Shrimp
Alkaline Phosphatase (USB, Cleveland) für 1 h bei 37°C dephosphoriliert,
und das Enzym wird anschließend
für 15
min bei 65°C
inaktiviert. Die Ligation der phosphorilierten Oligonukleotide bzw.
der aufgereinigten Fragmente erfolgt mittels Ligase (NEB) gemäß der Angaben
des Herstellers für
1 h bei 20°C
oder über Nacht
bei 16°C.
Chemisch kompetente Top10 Bakterien werden einem Hälfte des
Ligationsansatzes transformiert.
Ein alternativer Weg zur Gewinnung
von doppelsträngigen
Fragmente mit einer Länge
von 21 Nukleotiden (21mer Bank) ist der partielle DNAse I Verdau
der cDNA des Zielgens. Die dabei generierten Fragmente werden auf
einem Sequenzgel aufgereinigt und Fragmente mit der korrekten Länge isoliert.
Diese werden in die siRNA Expressionsplasmide oder Phagenplasmide
kloniert.
- (B) In den siRNA Expressionsvektor pSilencer 1.0-U6 (Ambion)
werden mittels Sequenz-spezifische Mutagenese vermittelt durch den
ExSite Kit von Stratagene ("site
directed mutagenesis")
vorhandene Restriktionsschnittstellen umgewandelt und Terminations-signale
eingebracht; die 30 Nukleotide stromabwärts der TATA Sequenz gelegene
singuläre
Apa I Restriktionsschnittstelle (Position 994 in pSilencer 1.0-U6)
wird in eine Msc I Restriktionsschnittstelle umgewandelt; die singuläre Not I
Schnittsstelle (Position 1069 in pSilencer 1.0-U6) wird in eine
Stu I Schnittstelle umgewandelt und fünf T Nukleotide angefügt als Transkriptions-Terminationssignal.
Der
modifizierte Vektor pSilencer 1.0-U6 (SEQ ID No: 14) wird mit Msc
I and Stu I glatt ("blunt
end") geöffnet und
mit den doppelsträngigen
21mer Frag mente (21mer Bank) ligiert. Von diesen Vektor transkribierte
anti-sense RNA hat am 3' Ende
einen Überhang
von 2 Nukleotiden.
4. Herstellung der mit
Zielkonstrukt und Suppressorkonstrukt transformierten Zellen:
- (A) Humane K562 werden mit dem Suppressorkonstrukt transfiziert.
Dafür werden
die Zellen 48 h vor der Transfektion mit einer Zelldichte von 1 × 104 Zellen/ml ausgesät. Die Transfektion von 1–5 μg/μl Plasmid
DNA erfolgt mittels Nukleofektor (Amaxa) gemäß der Transfektionsvorschriften
des Herstellers. 48 h nach der Transfektion wird dem Zellkultivierungsmedium
G418 (1 mg/ml) zur Selektion des Suppressionskonstrukt zugefügt. Die
Zellen werden für
5 bis 10 Tage unter anhaltenden Selektionsbedingungen selektioniert
und vereinzelt bis stabile Zellklone vorliegen. Es folgt die Isolation
von zellulärer
DNA, die mittels Southern Blot, PCR und Sequenzierung auf die Integration
des Suppressorkonstrukts hin untersucht wird.
- (B) Transfektion der mit dem Suppressorkonstrukt stabil transfizierten
Zelllinie mit dem Zielkonstrukt. Zellen der Suppressorzelllinie
werden mit Plasmid-DNA des Zielkonstrukts mittels Nukleofaktor (Amaxa)
transfiziert. 48 h nach der Transfektion wird dass Medium mit Puromycin
(5 mg/ml) versetzt, um die Selektion des Zielkonstrukts zu erzielen.
Zellklone werden nach 2 Tagen vereinzelt.
- (C) Transiente Tansfektion von Suppressorkonstrukt und Zielkonstrukt.
Anstelle der Herstellung einer stabil mit dem Suppressorkonstrukt
transfizierten Zelllinie und der anschließenden Transfektion mit dem
Zielkonstrukt werden humane K562- transient mit beiden Konstrukten
parallel transfiziert. Die Transfektion erfolgt mittels Nukleofaktor
(Amaxa) gemäß der Anweisung
des Herstellers.
- (D) Murine A20 Zellen werden entsprechend der oben beschriebenen
Schritte (A) bis (C) mit Suppressor und/oder Zielkonstrukt transfiziert.
5. Selektion und Identifikation
der siRNA:
- (A) Humane K562 Zellen, die mit dem Suppressorkonstrukt
und dem Zielkonstrukt transfiziert (stabil oder transient) sind
(siehe 4A–4D),
werden übertransfiziert
mit den Oligonukleotidexpressionsplasmiden (siehe 3B). Transfektion
von 1–5 μg/μl Plasmiden
vermischt mit Nukleofektor (Amaxa) erfolgt gemäß der vom Hersteller beschriebenen
Transfektionsbedingungen. 48 h post-Transfektion aller Plasmide (Suppressorkonstrukt,
Zielkonstrukt und Oligonukleotidexpressionsvektoren) wird dem Zellkultivierungsmedium
G418 (zwichen 0,8 und 1 mg/ml) sowie Gancyclovir in einer Konzentration
von 100 μ M
zugesetzt. Je höher
die Konzentration an Gancyclovir gewählt ist, desto stringenter
sind die Selektionsbedingungen. Die Zellen werden unter diesen Bedingungen
für 5 bis
10 Tage kultiviert. Die überlebenden
Zellen werden isoliert und vereinzelt. Aus den überlebenden Zellen wird DNA
isoliert (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual).
- (B) Aus der isolierten DNA werden mittels PCR die Bereiche des
Oligonukleotidexpressionsvektor amplifiziert, in welche die Oligonukleotide
bzw Fragmente (siehe 3A) kloniert wurden. PCR Reaktionen werden
mit den sich im Bereich von Nukleotid 654 anlagenden Primer siRNA-F
(CCTTAATTAAGTACCCGCTCTAGAACTAGTG) (SEQ ID NO.: 16) und dem sich
im Bereich von Nukleotid 1078 anlagernden Primer siRNA-R (CCTTAATTAACTGGAGCTCCACCGCGGTGGCG)
(SEQ ID. NO. 17), Taq Polymerase sowie Pfu. DNA aus positiven Reaktionen
wird auf einem ABI Sequenzer sequenziert.
