DE60035676T2

DE60035676T2 - Verfahren und mittel für die herstellung von sicheren rekombinanten lentiviralen vektoren mit hohem titer

Info

Publication number: DE60035676T2
Application number: DE60035676T
Authority: DE
Inventors: Luigi Foster City NALDINI; Thomas Foster City DULL; Anatoly Foster City BUKOVSKY; Deborah Foster City FARSON; Rochelle Foster City WITT
Original assignee: Cell Genesys Inc
Current assignee: Cell Genesys Inc
Priority date: 1999-04-29
Filing date: 2000-04-26
Publication date: 2008-04-30
Anticipated expiration: 2020-04-27
Also published as: CA2370103A1; JP4979851B2; US8652837B2; IL146144A0; AU4489700A; ATE368122T1; US20080241929A1; EP1849873A1; EP1849873B1; EP1171624B1; EP1171624A1; ATE528406T1; US7250299B1; CA2370103C; WO2000066759A1; EP1171624A4; DE60035676D1; JP2003508017A; AU778698B2

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft neue lentivirale Verpackungsvektoren, Transfervektoren, die ein Fremdgen von Interesse tragen, stabile Verpackungszelllinien, stabile Producerzelllinien und die Verwendung davon zur Produktion von rekombinantem Lentivirus in Säugerzellen.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Retrovirus-Vektoren sind ein allgemeines Werkzeug zur Genabgabe (Miller, Nature (1992) 357: 455-460). Die Biologie der retroviralen Proliferation gestattet eine solche Anwendung. Typischerweise dienen retrovirale Wildtyp-Vollängen-mRNA's sowohl als Templat zur Synthese von viralen Proteinen als auch des viralen Genoms. Solche mRNA's umfassen eine Region, die das Encapsidationssignal genannt wird, welches bestimmte virale Proteine bindet und dadurch eine spezielle Assoziation dieser mRNA mit den produzierten Virionen gewährleistet. Bei Infektion der Zielzelle erfolgt die Reverse Transkription der retroviralen mRNA zu doppelsträngiger proviraler DNA. Das retrovirale Enzym, Integrase, bindet dann an beide langen terminalen Wiederholungssequenzen (LTR's), die die provirale DNA flankieren, und katalysiert anschließend die Integration davon in die genomische DNA der Zielzelle. Integrierte provirale DNA dient als Templat zur Erzeugung neuer retroviraler Volllängen-mRNAs.
Retrovirale Vektoren wurden bereits getestet und als geeignete Abgabe-Vehikel zur stabilen Einbringung einer Vielzahl von Genen von Interesse in die genomische DNA eines breiten Bereiches von Zielzellen befunden, ein Verfahren, das als Transduktion der Zellen mit dem Gen von Interesse bekannt ist. Die Fähigkeit von Retrovirus-Vektoren zur Abgabe eines nicht-umgeordneten „Single Copy-Gens" in einen breiten Bereich von beispielsweise Nager-, Primaten- und menschlichen somatischen Zellen macht retrovirale Vektoren gut zur Übertragung von Genen an eine Zelle geeignet.
Ein Hauptansatz bei der Vektorkonstruktion mit Retrovirus-Ursprung beruht auf der Entfernung des Encapsidationssignals und der Sequenzen, die die LTR's aus dem viralen Genom codieren, ohne die virale Proteinexpression und den Transfer solcher Sequenzen auf das Konstrukt, einschließlich einer Nucleinsäure, die das Gen von Interesse codiert, zu beeinflussen; manchmal bezeichnet als der Transfervektor.
Ein Hilfsmittel zur Produktion von rekombinanten retroviralen Vektoren sind Verpackungszelllinien, die die Proteine, die zur Produktion infektiöser Virionen notwendig sind, in trans liefern, allerdings sind diese Zellen nicht in der Lage, endogene virale genomische Nucleinsäuren zu verpacken (Watanabe & Ternin, Molec. Cell. Biol. (1983) 3: 2241-2249; Mann et al., Cell (1983) 33: 153-159; und Embretson & Ternin, J. Virol. (1987) 61: 2675-2683). Die Expression in den Vektor-produzierenden Zellen beider viraler Kernproteine, die das Virionpartikel und mRNA, die LTR enthält, Encapsidationssequenzen und das Gen von Interesse umfassen, führt zur Freisetzung durch die Zellen von Partikeln, die phänotypisch dem parentalen Retrovirus gleichen, jedoch das Gen von Interesse anstelle des viralen Genoms tragen. Solche Partikel integrieren das Gen von Interesse, jedoch nicht die virale DNA, in das Genom von Zielzellen.
Eine Überlegung bei der Konstruktion von retroviralen Verpackungszelllinien besteht in der Produktion von Vektor-Überständen mit hohem Titer, die frei sind von rekombinantem Replikations-kompetentem Retrovirus (RCR), von dem gezeigt wurde, dass er in Nagern T-Zellen-Lymphome hervorruft (Cloyd et al. J. Exp. Med. (1980) 151: 542-552) und in Primaten (Donahue et al., J. Exp. Med. (1992) 176: 1125-1135).
In den Vektor-produzierenden Zellen kann die Restauration der physikalischen Assoziation von LTR und den Encapsidationssequenzen mit den Sequenzen, die die viralen Proteinen codieren, zu dem Auftauchen von RCR führen, das zur Selbstamplifikation in der Lage ist. Die Erzeugung von rekombinanten Viren während der Vektorproduktion ist aus mehreren Gründen äußerst unerwünscht. Erstens kann die rekombinante mRNA mit der transgenen mRNA um die Encapsidation in Virionen konkurrieren, wodurch die Anzahl der von den Producerzellen hergestellten Transgene pro Vektorpartikel herabgesetzt wird. Diese Konkurrenz sowie die Amplifikation solcher Rekombinanten in Producerzellen kann zum exponentiellen Verlust von Vektor-Transduktionspotential führen.
Zweitens können solche Rekombinanten, wenn sie während der Vektorproduktion unentdeckt sind, unbeabsichtigt in die Vektor-Rezipienten eingebracht werden. Darum kann die Übertragung des rekombinanten Genoms auf den Wirt eine ansonsten vermeidbare Toxizität oder eine Immunreaktion auf die transduzierten Zellen hervorrufen. Wichtigerweise können virale Rekombinanten pathogen sein oder können sich zu Pathogenen bei zusätzlichen Amplifikationsrunden und/oder durch zusätzliche Rekombinationsereignisse mit endogenen Sequenzen der Wirtszellen (wie endogenen retrovirale Sequenzen) entwickeln.
Ein rekombinantes Retrovirus könnte auf dem DNA- oder mRNA-Niveau erzeugt werden. Die DNA-Rekombination kann stattfinden, wenn Plasmidkonstrukte, die unabhängig als Verpackungs- und Transfer-Vektorfunktionen codieren, bei einem Versuch, transiente Producerzellen zu erzeugen, vermischt und co-transfiziert werden. Zur Herabsetzung der Rekombinationsmöglichkeit auf dem DNA-Niveau könnten die Konstrukte in Zellen nacheinander mit gleichzeitiger Selektion von Klonen eingebracht werden, nachdem jedes Konstrukt stabil mit dem zellulären Genom assoziiert ist. Somatische Zellen, die sich methodisch teilen, erfahren im Allgemeinen kein Crossing-over zwischen homologen Chromosomen, und da erwartet wird, dass jede Vektorkonstruktassoziation regellos in die genomische DNA integriert wird, ist die Wahrscheinlichkeit einer engen Assoziation und darum die Möglichkeit einer Rekombination gering.
Die Rekombination auf dem mRNA-Niveau kann während der Reversen Transkription stattfinden, wenn sowohl Verpackungs-mRNA als auch Transfervektor-mRNA (auch wenn sie von getrennten Expressionskonstrukten erzeugt werden) in viralen Teilchen zusammenverkapselt werden. Das retrovirale Enzym Reverse Transkriptase (RT) verwendet mRNA als Templat zur DNA-Synthese. Auch ist bekannt, dass RT zwischen Templaten hin oder herwechselt. Somit könnte, wenn zwei verschiedene mRNA's in einem viralen Partikel vorhanden sind, bei Kombination eine einzelne DNA-Einheit durch die RT als Ergebnis eines Templat-Switching synthetisiert werden.
Ein Ansatz zur Minimierung der Wahrscheinlichkeit der Erzeugung von RCR in Verpackungszellen besteht darin, die Verpackungsfunktionen in zwei oder mehrere Genome zu unterteilen, beispielsweise eines, welches die gag- und pol-Genprodukte exprimiert, und das andere, welches das env-Genprodukt exprimiert (Bosselman et al., Molec. Cell. Biol. (1987) 7: 1797-1806; Markowitz et al., J. Virol. (1988) 62: 1120-1124; und Danos & Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci. (1988) 85: 6460-6464). Dieser Ansatz minimiert die Fähigkeit zur gemeinsamen Verpackung und zum anschließenden Transfer der beiden oder der mehreren Genome und setzt ebenso die Rekombinationshäufigkeit aufgrund der Gegenwart von mehreren retroviralen Genomen in der Verpackungszelle zur Produktion von RCR signifikant herab.
Die Überlegung hinter dem Ansatz des Aufspaltens der Verpackungsfunktionen besteht darin, dass mehrere Rekombinationsereignisse zur Erzeugung von RCR eintreten müssen. Dieser Ansatz setzt jedoch nicht die Möglichkeit von individuellen Rekombinationsereignissen herab. Darum könnten partielle Rekombinanten erzeugt werden, die nicht zur Amplifikation in der Lage sind. Um das Auftreten von solchen partiellen Rekombinanten zu überwachen, müssen neue ergänzende Nachweissysteme konzipiert werden.
Falls Rekombinanten auftreten, können Mutationen (Danos & Mulligan, supra) oder Deletionen (Boselman et al., supra; und Markowitz et al., supra) in Vektorkonstrukten so konfiguriert werden, dass, falls Rekombinanten auftreten, diese nicht funktionell gemacht werden. Zusätzlich setzt die Deletion des 3'LTR auf beiden Verpackungskonstrukten weiterhin die Fähigkeit zum Bilden funktioneller Rekombinanten herab.
Es wurde schon für viele biologische Systeme gezeigt, dass die Rekombinationshäufigkeit zwischen zwei genetischen Elementen direkt proportional zu dem Ausmaß von homologen Sequenzen ist. Somit besteht ein weiterer Ansatz in der Minimierung des Ausmaßes der Sequenzhomologie zwischen und unter den Vektoren. Technische Schwierigkeiten, die mit der Minimierung der homologen Sequenzen zwischen Transfervektor und Verpackungskonstrukten zusammenhängen, können durch die Tatsache erklärt werden, dass einige essentielle genetische Elemente aus mindestens einem der Konstrukte entfernt werden könnten, ohne einen signifikanten Verlust an Transduktionspotential.
Lentiviren sind komplexe Retroviren, die, zusätzlich zu den allgemeinen retroviralen Genen gag, pol und env, weitere Gene mit regulatorischer oder struktureller Funktion enthalten. Die höhere Komplexität ermöglicht es dem Lentivirus den Lebenszyklus davon zu modulieren, wie im Falle einer latenten Infektion.
Lentiviren haben die Aufmerksamkeit von Gentherapieforschern auf sich gezogen aufgrund der Fähigkeit, sich in nicht-teilende Zellen zu integrieren (Lewis et al., EMBO J. (1992) 11: 3053-3058; Bukrinsky et al., Nature (1993) 365: 666-669; Gallay et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1997) 94: 9825-9830; Gallay et al., Cell (1995) 80: 379-388; und Lewis et al., J. Virol. (1994) 68: 510). Replikations-defektive Vektoren aus dem menschlichen Lentivirus Humanes Immundefizienz-Virus (HIV) transduzieren Zielzellen, die unabhängig von Mitose sind (Naldini et al., Science (1996) 272: 263-267). Die Vektoren haben sich als äußerst effizient zur in vivo Gen-Abgabe erwiesen und erzielten eine stabile Langzeitexpression des Transgens in mehreren Zielgeweben, wie dem Gehirn (Naldini et al., PNAS (1996) 93: 11382-1138; und Blomer et al., J. Virol. (1997) 71: 6641-6649), die Retina (Miyoshi et al., PNAS (1997) 94: 10319-10323), der Leber und den Muskeln (Kafri et al., Nature Genetics (1997) 17: 314-317).
Ein typisches Lentivirus ist HIV, das ätiologische Mittel von AIDS. In vivo kann HIV terminal differenzierte Zellen infizieren, die sich selten teilen, wie Lymphozyten und Makrophagen. In vitro kann HIV Primärkulturen von aus Monozyten stammenden Makrophagen (MDM) sowie HeLa-Cd4- oder T-Lymphoid-Zellen infizieren, die im Zellzyklus durch Behandlung mit Aphidiocolin oder γ-Bestrahlung arretiert wurden.
Die Komplexität des lentiviralen Genoms kann genutzt werden, um neue biologische Sicherheitsmerkmale bei der Konstruktion eines retroviralen Vektors aufzubauen. Zusätzlich zu den Strukturgenen gag, pol und env, die sämtlichen Retroviren gemeinsam sind, enthält HIV zwei regulatorische Gene, tat und rev, die für die virale Replikation essentiell sind, und vier akzessorische Gene, vif, vpr, vpu und nef, die für das virale Wachstum in vitro nicht essentiell, jedoch für die in vivo Replikation und Pathogenese kritisch sind (Luciw, in Fields et al., (Hrsg.), „Fields Virology", 3. Ausg. (1996), S. 1881-1975, Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia).
Die Tat- und Rev-Proteine regulieren die Niveaus der HIV-Genexpression auf transkriptionale bzw. posttranskriptionale Niveaus. Aufgrund der schwachen basalen transkriptionalen Aktivität der HIV-LTR ergibt die Expression des Provirus zunächst kleine Mengen von mehrfach gespleißten Transkripten, die Tat-, Rev- und Nef-Proteine codieren.
Tat erhöht die HIV-Transkription dramatisch durch Binden an eine Stamm-Schleifen-Struktur (TAR) in der entstehenden RNA, wodurch ein Cyclin-Kinase-Komplex rekrutiert wird, der die transkriptionale Elongation durch den Polymerase-II-Komplex stimuliert (Wei et al., Cell (1998) 92: 451-462). Nachdem Rev eine Schwellen-Konzentration erreicht, beschleunigt Rev die zytoplasmatische Akkumulation von ungespleißten und einfach gespleißten viralen Transkripten, was zur Produktion der späten viralen Proteine führt.
Rev erreicht diese Wirkung dadurch, dass es als Konnektor zwischen einem RNA-Motiv (das Rev-responsive Element, RRE), das in der Envelope-codierenden Region des HIV-Transkripts vorkommt, und Komponenten der zellnukleären Exportmaschinerie dient. Nur in Gegenwart von Tat und Rev werden die HIV-Strukturgene exprimiert und neue virale Partikel produziert (Luciw, oben).
Bei einer ersten Generation von aus HIV stammenden Vektoren (Naldini et al., Science, supra) wurden virale Partikel durch Expression der HIV-1-Kernproteine, Enzyme und der akzessorischen Faktoren von heterologen Transkriptionssignalen und der Hülle eines anderen Virus, am häufigsten das G-Protein des Vesikulären Stomatitis-Virus (VSV-G; Burns et al., PNAS (1993) 90: 8033-8037) von einem separaten Plasmid erzeugt.
Bei einer zweiten Version des Systems wurde die von HIV stammende Verpackungskomponente auf die gag-, pol-, tat- und rev-Gene von HIV-1 reduziert (Zufferey et al., Nat. Biotechn. (1997) 15: 871-875).
In jedem Fall trug der Vektor selbst die von HIV stammenden cis-wirkenden Sequenzen, die zur Transkription, Encapsidation, Reversen Transkription und Integration notwendig sind (Aldovini & Young, J. Virol. (1990) 64: 1920-1926; Berkowitz et al., Virology (1995) 212: 718-723, Kaye et al., J. Virol. (1995) 69: 6588-6592; Lever et al., J. Virol. (1994) 63: 4085-4087; McBride et al., J. Virol. (1989) 70: 2963-2973; McBride et al., J. Virol. (1997) 71: 4544-4554; Naldini et al., Science (supra); und Parolin et al., J. Virol (1994) 68: 3888-3895.
Ein solcher Vektor umfasst somit, vom 5'- zum 3'-Ende, die HIV-5'LTR, die Leadersequenz und die 5'-Spleiß-Donorstelle, ungefähr 360 Basenpaare des gag-Gens (wobei das gag-Leseraster durch ein synthetisches Stopp-Kodon geschlossen ist), 700 Basenpaare des env-Gens, enthaltend das RRE und eine Spleiß-Akzeptorstelle, einen internen Promotor, beispielsweise typischerweise den unmittelbaren frühen Enhancer/Promotor des humanen Zytomegalovirus (CMV) oder denjenigen des Phosphoglycerokinase-Gens (PGK), das Transgen und die HIV-3'LTR. Die Vektorpartikel werden durch Co-Transfektion der Konstrukte in 293T-Zellen produziert (Naldini et al., Science, supra). Bei dieser Konstruktion treten signifikante Niveaus der Transkription aus dem Vektor-LTR und der Akkumulation aus ungespleißter genomischer RNA nur in Gegenwart von Tat und Rev auf.
Die Infektion von Zellen hängt von dem aktiven nuklearen Import von HIV-Präintegrationskomplexen durch die nuklearen Poren der Zielzellen ab. Dies erfolgt durch die Wechselwirkung von mehreren, z. T. redundanten molekularen Determinanten in dem Komplex mit der nuklearen wichtigen Maschinerie der Zielzelle. Die identifizierten Determinanten umfassen ein funktionelles nukleares Lokalisierungssignal (NLS) in dem gag-Matrix-(MA)-Protein, dem karyophilen Virion-assoziierten Protein, vpr, und einem C-terminalen Phosphotyrosinrest in dem gag-MA-Protein.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Demnach betrifft die vorliegende Erfindung neue abgeschwächte lentivirale Vektoren, wie Verpackungs- und Transfervektoren, die die Synthese sowohl von lentiviralen Vektortranskripten, die verpackt werden können, als auch lentiviralen Proteinen zur schnellen Produktion von rekombinantem Lentivirus mit hohem Titer in Säugerzellen steuern. Die Ergebnisse sind infektiöse Teilchen zur Abgabe eines Fremdgens von Interesse an eine Zielzelle. Die Erfindung stellt auch Zelllinien zur Virusproduktion bereit.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 beschreibt verschiedene Lentivirus-Vektoren. RSV ist der Rous-Sarkom-Virus-Enhancer/Promotor; R ist die R-Region des LTR; U5 ist die U5-Region des LTR; SD ist eine Spleiß-Donorstelle, wie die HIV-5'-Hauptspleiß-Donorstelle; ψ ist die Psi-Encapsidationssignalsequenz; Ga ist ein Teil des gag-Gens; RRE ist das rev-responsive Element; SA ist eine Spleißakzeptor-Sequenz; und U3 ist die U3-Region der LTR.
2 beschreibt zusätzliche Lentivirus-Vektoren. CMV bedeutet Zytomegalovirus. Ansonsten werden die Symbole in der Legende zu 1 gefunden.
3 ist ein Graph, der die abgestufte Vektorproduktion mit zunehmenden Mengen von Transfer-Vektor beschreibt.
4 beschreibt 5'-Modifikationen von Lentivektor-Transferkonstrukten. Die angegebene Typenzahl für ein bestimmtes Konstrukt ist je nach Entfernung oder Modifikation von angegebenen Elementen zugeordnet. Als Beispiel: Der Konstruktname, wie RRL7, gibt an, dass der Vektor aus der Typ-7-Konstruktfamilie stamme und den RSV-Enhancer in der U3-Region aufweisen kann. Gag ist das gag-Gen; fs ist Rasterverschiebung; Env-OFR ist das Envelope-Gen-Leseraster; RRE ist das rev-responsive Element; SA ist ein Spleiß-Akzeptor; und RSV ist das Rous-Sarkom-Virus.
5 beschreibt schematische Diagramme neuer Verpackungskonstrukte. Pro ist Protease; Δenv ist ein verkürztes Envelope-Gen; pol ist Polymerase; poly-A ist eine Polyadenylierungsstelle; TetO7 ist der tet-Regulator; MA ist Matrix und VSV/G ist Vesikuläres Stomatitis-Virus-G-Protein.
6 beschreibt Diagramme, die homologe Sequenzen zwischen Verpackungs-(pMDLg/pRRE)- und angegebenen Transfervektorkonstrukten hervorhebt. Prom ist Promotor und Min-gag ist ein verkürztes oder minimiertes gag.
7 beschreibt Diagramme, die homologe Sequenzen zwischen den Verpackungskonstrukten pMDLg/pRRE.2 oder pMDLg/pRRE.3 und einem Typ-7-Transfervektorkonstrukt hervorheben. MA ist Matrix; CA ist Capsid. P2 ist gag-Spaltungsprodukt; NC ist Nucleocapsid; P1 ist ein weiteres gag-Spaltungsprodukt; P6 ist ein weiteres gag-Spaltungsprotein und Nicht-HIV-Enh ist ein Nicht-HIV-Enhancer.
8 beschreibt Darstellungen von FACS-(Fluorescence Activated Cell Sorting)-Plots, die hocheffiziente Transduktion von im Wachstum arretierten HeLa-Zellen (durch Amphidicolin-Behandlung) mit Vektorpartikeln angeben, die durch Calciumphosphat-Transfektion und von nicht-überlappenden Lentivektor-Konstrukten produziert wurden. Die folgenden Plasmide wurden transfiziert: 10 μg CCL7sinCMVGFPpre, 5 μg pMDLg/pRRE oder pMDLg/pRRE.2 oder pMDLg/pRRE.3 und 3 μg pMD.G.
9 beschreibt Darstellungen von RNA-Schutzanalysen von Vektorpartikeln, die durch vorübergehende Transfektion von angegebenen Plasmiden erhalten wurden. (Plasmid pCMVΔR8.2 ist bei Naldini et al., Science, supra, beschrieben). Mut ist Mutation.
10 beschreibt die Produktion und den Titer von Vektorpartikeln, die durch eine Verpackungszelllinie der zweiten Generation (Klon 2.54) produziert wurden, die durch einen Tetracyclin-regulierbaren Transfervektor verwandelt wurden.
11 beschreibt eine Darstellung einer Northern-Analyse von transduzierten HeLa-Zellen unter Verwendung der angegebenen Vektoren. Gesamt-RNA wurde mit einer GFP-spezifischen Sonde getestet.
12 beschreibt Darstellungen von FACS-Plots, die angeben, dass keine Aktivierung des Tet°/HIV-Promotors bei HIV-1-Infektion stattfindet.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt ein rekombinantes Lentivirus bereit, das zur Infektion sich nicht teilender Zellen in der Lage ist, sowie Verfahren und Mittel zur Herstellung desselben. Das Virus ist zum in vivo und ex vivo Transfer und zur Expression von Nucleinsäuresequenzen geeignet.
Das lentivirale Genom und die provirale DNA besitzen die drei Gene, die in Retroviren vorkommen: gag, pol und env, die durch zwei LTR-Sequenzen flankiert sind. Das gag-Gen codiert die internen Struktur-(Matrix, Capsid und Nucleocapsid)-Proteine; das pol-Gen codiert die RNA-gerichtete DNA-Polymerase (Reverse Transkriptase), eine Protease und eine Integrase; und das env-Gen codiert virale Envelope-Glycoproteine. Die 5'- und 3'LTR's dienen zur Beschleunigung von Transkription und Polyadenylierung der Virion-RNAs. Die LTR enthält alle anderen cis-wirkenden Sequenzen, die zur viralen Replikation notwendig sind. Lentiviren besitzen zusätzliche Gene, einschließlich vif, vpr, tat, rev, vpu, nef und vpx (in HIV-1, HIV-2 und/oder SIV).
Neben der 5'LTR befinden sich Sequenzen, die zur Reversen Transkription des Genoms (die tRNA-Primer-Bindungsstelle) und zur wirksamen Encapsidation viraler RNA in Teilchen (die Psi-Stelle) notwendig sind. Wenn die Sequenzen, die zur Encapsidation (oder zum Verpacken von retroviraler RNA in infektiöse Virionen) notwendig sind, in dem viralen Genom fehlen, verhindert der cis-Defekt die Encapsidation genomischer RNA. Allerdings bleibt die resultierende Mutante zur Steuerung der Synthese von sämtlichen Virion-Proteinen in der Lage.
Die Erfindung stellt ein Verfahren zur Produktion eines rekombinanten Lentivirus bereit, das zur Infizierung einer sich nicht teilenden Zelle in der Lage ist, umfassend die Transfektion einer geeigneten Wirtszelle mit zwei oder mehreren Vektoren, die die Verpackungsfunktionen tragen, nämlich gag, pol und env, sowie rev und tat. Wie hier im Folgenden offenbart, sind Vektoren, denen ein funktionelles tat-Gen fehlt, für bestimmte Anwendungen erwünscht. Somit kann beispielsweise ein erster Vektor eine Nucleinsäure bereitstellen, die ein virales gag und ein virales pol codiert, und ein anderer Vektor kann eine Nucleinsäure bereitstellen, die ein virales env codiert, um eine Verpackungszelle zu produzieren. Das Einbringen eines Vektors, der ein heterologes Gen bereitstellt, hier als Transfervektor bezeichnet, in diese Verpackungszelle, ergibt eine Producerzelle, die infektiöse virale Partikel freisetzt, die das Fremdgen von Interesse tragen.
Ein lentiviraler Vektor, der hier beschrieben ist, kann durch drei nicht-überlappende Expressionskonstrukte verpackt werden, zwei HIV-Expressionsproteine, und das andere die Hülle eines unterschiedlichen Virus. Ferner fehlen sämtliche HIV-Sequenzen, von denen bekannt ist, dass sie zur Encapsidation und zur Reversen Transkription erforderlich sind (Lever et al., supra; Aldovini & Young, supra; Kaye et al., supra; McBride & Panganiban, supra; McBride et al., supra; Parolin et al., supra, und Luciw. supra) in den Konstrukten, mit der Ausnahme des Teils des gag-Gens, das zu der Stamm-Schleifen-Struktur des HIV-1-Verpackungsmotivs beiträgt (McBride et al., supra).
Eine zweite Strategie zur Verbesserung der biologischen Vektor-Sicherheit nutzt die Komplexität des lentiviralen Genoms. Die kleinstmögliche Serie von HIV-1-Genen, die zur Erzeugung eines wirksamen Vektors erforderlich ist, wurde identifiziert, und alle anderen HIV-Leseraster wurden aus dem System beseitigt. Da die Produkte der entfernten Gene für die Vervollständigung des viralen Lebenszyklus und für die Pathogenese wichtig sind, kann keine Kombinante die pathogenen Merkmale des parentalen Virus erwerben. Alle vier akzessorischen Gene von HIV könnten aus dem Verpackungskonstrukt deletiert werden, ohne dass die Gentransduktion beeinträchtigt ist (Zufferey et al., supra).
Das tat-Gen ist für die HIV-Replikation essentiell. Das tat-Genprodukt ist eine der besonders wirksamen transkriptionalen Aktivatoren, die bekannt sind, und spielt eine Schlüsselrolle bei den außergewöhnlich hohen Replikationsraten, die eine HIV-induzierte Krankheit kennzeichnen (Haynes et al., Science (1996) 271: 324-328; Ho et al. Nature (1995) 373: 123-126; und Wei et al., Nature (1995) 373: 117-122).
Die trans-wirkende Funktion von Tat wird entbehrlich, wenn ein Teil der Aufwärts-LTR in dem Vektorkonstrukt durch konstitutiv aktive Promotorsequenzen ersetzt wird. Außerdem gestattet die Expression von rev in trans die Produktion von HIV-abgeleiteten Vektor-Stämmen mit hohem Titer aus einem Verpackungskonstrukt, das nur gag/pol enthält. Diese Konstruktion macht die Expression der Verpackungsfunktionen von der nur in Producerzellen verfügbaren Komplementation abhängig. Das resultierende Gen-Abgabesystem, das nur drei der neun Gene von HIV-1 konserviert und auf vier getrennten transkriptionalen Einheiten für die Produktion von transduzierenden Partikeln beruht, bietet hinsichtlich der biologischen Sicherheit wesentliche Vorteile.
Tat ist in Producerzellen zur Erzeugung eines Vektors von wirksamer Transduktionsaktivität erforderlich. Allerdings kann diese Anforderung durch Induktion einer konstitutiven Expression von Vektor-RNA auf hohem Niveau kompensiert werden. Aufgrund der niedrigen basalen Transkription aus der HIV-LTR, ist Tat zur Erhöhung der Abundanz von Vektortranskripten und zur Ermöglichung einer wirksamen Encapsidation durch die Vektorpartikel notwendig. Bei Produktion in Abwesenheit von Tat weisen die Vektorpartikel eine 10- bis 20fach herabgesetzte Transduktionsaktivität auf. Wenn jedoch starke konstitutive Promotoren die HIV-Sequenz in der 5'LTR des Transferkonstruktes ersetzen, zeigen Vektoren, die ohne Tat produziert wurden, eine weniger als 2fach reduzierte Transduktionsaktivität. Da Tat stark die Transkription aus der chimären LTR aufregulierte, muss die Transduktionsaktivität der ausgegebenen Partikel Sättigung erreichen. Die Abundanz von Vektor-RNA in Producerzellen scheint somit ein Geschwindigkeitsbestimmender Faktor der Transduktion zu sein, bis ein Schwellenwert erreicht ist. Begreiflicherweise wird eine Obergrenze durch die Gesamtausgabe von Partikeln, die zur Encapsidation von Vektor-RNA verfügbar sind, eingestellt.
Eine erfolgreiche Deletion des tat-Gens war hinsichtlich einer beschriebenen zusätzlichen Rolle für Tat bei der Reversen Transkription unerwartet (Harrich et al., EMBO J. (1997) 16: 1224-1235; und Huang et al., EMBO J. (1994) 13: 2886-2896). Allerdings ahmt der Transduktionsweg des lentiviralen Vektors nur teilweise den Infektionsweg von HIV nach. Der Vektor ist durch die Hülle eines nicht-verwandten Virus pseudotypisiert und enthält nur die Kernproteine von HIV ohne irgendein akzessorisches Genprodukt. Die VSV-Hülle richtet den Vektor auf den endozytischen Reaktionsweg, und es hat sich gezeigt, dass die Redirektion von HIV-1 von dem normalen Weg des Eintritts durch Fusion an der Plasmamembran die Biologie der Infektion signifikant verändert. Beispielsweise sind Nef und Cyclophilin A für die optimale Infektiosität von Wildtyp-HIV-1, jedoch nicht für einen (VSV.G)HIV-Pseudotyp, erforderlich (Aiken J. Virol. (1997) 71: 5871-5877). Auch kann die Kinetik der Reversen Transkription für die Entwicklung einer viralen Infektion kritischer sein als für die Gen-Transduktion, angesichts der Unterschiede in Größe und Sequenz zwischen dem Virus- und dem Vektor-Genom.
Auch die Rev-Abhängigkeit der gag-pol-Expression und der Akkumulation von ungespleißten verpackungsfähigen Transkripten wurde ausgenutzt. Yu et al. [J. Virol. (1996) 70: 4530-4537] zeigten bereits, dass die Abhängigkeit von Rev dazu eingesetzt werden kann, die Expression von HIV-Genen induzierbar zu gestalten. Ein Kern-Verpackungssystem, das in zwei getrennte, nicht-überlappende Expressionskonstrukte aufgespalten ist, eines für die gag-pol-Leseraster, die auf die Rev-abhängige Expression optimiert wurden, und das andere für die Rev-cDNA, kann darum eingesetzt werden. Ein solches Verpackungssystem stimmt mit der Leistung von Vorgängern hinsichtlich sowohl Ausbeute als auch Transduktionswirksamkeit überein. Allerdings steigert es die vorhergesagte biologische Sicherheit des Vektors signifikant.
Es wurde nahegelegt, dass die Rev-RRE-Schiene durch die Verwendung von konstitutiven RNA-Transportelementen anderer Viren ersetzt werden könnte, obwohl vielleicht zu dem Preis herabgesetzter Wirksamkeit (Srinivasakumar et al., J. Virol. (1997) 71: 5841-5848); und Corbeau et al., Gene Ther. (1998) 5: 99-104). Die Aufrechterhaltung der Rev-Abhängigkeit des Systems gestattet ein zusätzliches Niveau an biologischer Sicherheit durch die Aufspaltung der von HIV stammenden Komponenten des Verpackungssystems.
Die Vektoren an sich, die hier außerhalb der neu konstruierten Vektoren offenbart sind, sind auf dem Fachgebiet bekannt, siehe Naldini et al., Science, supra; und Zufferey et al. Im Allgemeinen beruhen die Vektoren auf Plasmiden oder Viren und sind so konfiguriert, dass sie die essentiellen Sequenzen zum Einbringen von Fremd-Nucleinsäure, zur Selektion und zum Transfer der Nucleinsäure in eine Wirtszelle beinhalten. Die gag-, pol- und env-Gene der Vektoren von Interesse sind ebenfalls auf dem Fachgebiet bekannt. Somit werden die relevanten Gene in den selektierten Vektor kloniert und dann zur Transformation der Zielzelle von Interesse verwendet.
Gemäß der oben angegebenen Konfiguration von Vektoren und Fremdgenen kann ein Vektor eine Nucleinsäure bereitstellen, die ein virales Envelope-(env)-Gen codiert. Das env-Gen kann aus einem beliebigen Virus, einschließlich Retroviren, stammen. Das Env ist vorzugsweise ein amphotropes Envelope-Protein, welches die Transduktion von Zellen von menschlichen und anderen Spezies erlaubt.
Es kann wünschenswert sein, das rekombinante Virus durch Verknüpfen des Envelope-Proteins mit einem Antikörper oder einem bestimmten Liganden zum Ausrichten auf einen Rezeptor eines bestimmten Zelltyps auszurichten. Durch Insertion einer Sequenz (einschließlich einer regulatorischen Region) von Interesse in den viralen Vektor, zusammen mit einem weiteren Gen, das den Liganden für einen Rezeptor für eine spezifischen Zielzelle codiert, ist z. B. der Vektor nun zielspezifisch. Retrovirale Vektoren können durch Insertion, beispielsweise eines Glycolipids oder eines Proteins, zielspezifisch gemacht werden. Die Ausrichtung auf ein bestimmtes Ziel wird oft unter Verwendung eines Antigen-bindenden Teils eines Antikörpers oder eines rekombinanten Antikörper-artigen Moleküls, wie ein einkettiger Antikörper, erreicht, um den retroviralen Vektor auszurichten. Der Fachmann kennt oder kann leicht, ohne übertriebenes Experimentieren, spezifische Verfahren zum Erreichen der Abgabe eines retroviralen Vektors auf ein spezifisches Ziel herausfinden.
Beispiele für retroviral abgeleitete env-Gene umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf: Molomey-Maus-Leukämievirus (MoMuLV oder MMLV), Harvey-Maus-Sarkom-Virus (HaMuSV oder HSV), Maus-Mammary Tumor Virus (MuMTV oder MMTV) z. B. Gibbon-Affen-Leukämievirus (GaLV oder GALV), Humanes Immundefizienz-Virus (HIV) und Rous-Sarkom-Virus (RSV). Weitere env-Gene, wie das Vesikuläre Stomatitis-Virus (VSV)-G Protein (VSV-G), dasjenige von Hepatitisviren und von Influenza können ebenfalls eingesetzt werden.
Der Vektor, der die virale env-Nucleinsäuresequenz bereitstellt, ist operabel mit regulatorischen Sequenzen, z. B. einem Promotor oder Enhancer, verknüpft. Die regulatorische Sequenz kann jeder eukaryotische Promotor oder Enhancer sein, einschließlich beispielsweise des Moloney-Maus-Leukämievirus-Promotor-Enhancer-Elements, des humanen Zytomegalovirus-Enhancers oder des Vaccinia-P7.5-Promotors. In einigen Fällen, wie bei dem Moloney-Maus-Leukämievirus-Promotor-Enhancer-Element, sind die Promotor-Enhancer-Elemente innerhalb oder unmittelbar im Anschluss an die LTR-Sequenzen lokalisiert.
Vorzugsweise ist die regulatorische Sequenz eine Sequenz, die für das Lentivirus, aus dem der Vektor konstruiert wird, nicht endogen ist. Wenn somit der Vektor aus SIV hergestellt wird, würde die SIV-regulatorische Sequenz, die in der SIV-LTR vorkommt, durch ein regulatorisches Element ersetzt werden, das nicht aus SIV stammt.
Obgleich VSV-G-Protein ein erwünschtes env-Gen ist, das VSV-G auf das rekombinante Virus eines breiten Wirtsbereichs überträgt, kann VSV-G für die Wirtszellen von Nachteil sein. Wenn somit ein Gen, wie dasjenige für VSV-G, verwendet wird, ist es bevorzugt, ein induzierbares Promotorsystem einzusetzen, so dass die VSV-G-Expression reguliert werden kann, um die Wirtstoxizität zu minimieren, wenn die VSV-G-Expression nicht erforderlich ist.
Beispielsweise kann das Tetracylin-regulierbare Genexpressionssystem von Gossen & Bujard (Proc. Natl. Acad. Sci. (1992) 89: 5547-5551) eingesetzt werden, um eine konditionale oder induzierbare Expression von VSV-G bereitzustellen, wenn Tetracyclin aus der transferierten Zelle abgezogen wird. Somit ist der tet/VP-16-Transaktivator auf einem ersten Vektor vorhanden, und die VSV-G-codierende Sequenz wird stromabwärts von einem Promotor, der durch die tet-Operatorsequenzen auf einem anderen Vektor kontrolliert wird, kloniert.
Ein solcher Hybridpromotor kann anstelle der 3'U3-Region der LTR eines Transfervektors inseriert werden. Als Ergebnis der Transduktion von Zielzellen durch die Vektorpartikel, die durch die Verwendung eines solchen Transfervektors produziert werden, wird der Hybridpromotor auf die 5'U3-Region bei reverser Transkription kopiert. In den Zielzellen kann eine solche konditionale Expression eines Gens aktiviert werden, um verpackungsfähige Volllängen-Vektortranskripte nur in Gegenwart von tTa zu exprimieren – beispielsweise nach Transduktion einer entsprechenden Verpackungszelllinie, die tTA exprimiert.
Die Verwendung solcher Vektoren in Producerzellen gestattet, dass die Produktion der verpackungsfähigen Vektor-mRNA-Messages auf hohen Niveaus nur bei Bedarf „eingeschaltet" wird. Im Gegensatz dazu wird bei Transduktion von Zellen, die tTa nicht exprimieren, der Hybridpromotor transkriptional stumm. Ein solches transkriptionales Verstummen wurde auch in Gegenwart von HIV-Tat-Protein beibehalten, das bekanntlich in der Lage ist, die basale transkriptionale Aktivität von heterologen Promotoren aufzuregulieren. Das Promotorsystem reduziert die Möglichkeit der Mobilisierung des Vektorgenoms signifikant, auch wenn transduzierte Zellen durch Wildtyp-HIV-1 infiziert werden.
Eine weitere Ausführungsform betrifft ein retrovirales Vektorsystem auf der Grundlage von Lentivirus, in dem Sequenzhomologie (Sequenzüberlappung) zwischen codierenden Sequenzen von Verpackungs- und Transfer-Vektorkonstrukten beseitigt wird. Wichtigerweise behalten Vektorpartikel, die durch die Verwendung solcher Konstrukte produziert werden, hohe Niveaus an Transduktionspotential bei. Die Verwendung solcher Konstrukte in einem Vektorproduktionssystem vermindert besonders signifikant erwartungsgemäß die Häufigkeit von Rekombinationsereignissen, was ein wesentlicher Fortschritt in der biologischen Sicherheit ist, die mit einem solchen Vektorsystem zusammenhängt.
Es ist bekannt, dass überall die gag-pol-codierende mRNA, mehrere cis-wirkende Repressionssequenzen (CRS) vorhanden sind. Die Sequenzen verhindern den Transport von mRNA's in das Zellzytoplasma und verhindern daher codierte Proteinexpression. Zur Unterdrückung der Wirkung von CRS enthalten HIV-1-mRNA's ein Antirepressionssignal, das RRE genannt wird, an welches Rev-Protein binden kann. HIV-1-mRNA-Rev-Komplexe werden dann wirksam in das Zellzytoplasma transportiert, wo der Komplex dissoziiert und die mRNA zur Translation verfügbar wird.
Mindestens zwei Ansätze stehen für die Wahl der minimalen Mengen von HIV-Sequenzen zur Verfügung, die in Gag- und Gag-Pol exprimierenden Verpackungsvektoren notwendig sind. Zuerst könnte nur das gag-pol-Gen inseriert werden. In diesem Fall muss alles oder mindestens der größte Teil der CRS identifiziert und mutiert werden, ohne Beeinflussung der codierten Aminosäuresequenz. Wenn dies erreicht ist, kann das rev-Gen aus dem Vektorsystem beseitigt werden.
Zweitens kann das minimale RRE-Element in die gag-pol-Expressionskassette eingebracht werden, so dass die Sequenz davon Teil der resultierenden mRNA ist. In diesem Fall erfordert die Expression von Gag und Gag-Pol-Polyproteinen die Gegenwart des Antirepressors Rev. Rev-Protein an sich braucht allerdings nicht Teil des gag-pol-Expressionsvektors sein, sondern könnte in trans-Form unabhängig und vorzugsweise nicht-überlappend mit der gag-pol-Expressionskassette bereitgestellt werden.
In dem System, wobei Rev-Protein nicht zur wirksamen Produktion von Transfervektor-mRNA erforderlich ist, kann das rev-Gen und RRE-Element aus dem Vektorsystem als weitere biologische Sicherheitsmaßnahme beseitigt werden. In einem solchen System kann allerdings, wenn das gag-pol-Gen im Ganzen oder zum Teil in einen Vektorempfänger als Ergebnis eines homologen oder eines nicht-homologen Rekombinationsereignisses transferiert wird, die Expression auftreten.
Im Gegensatz dazu kann ein Vektorsystem, in dem die gag-pol-Genexpression von Rev abhängt, eine wertvolle Sicherheitsalternative sein. Wenn somit ein Rev-verwendendes Vektorsystem so konstruiert wird, dass sämtliche der Komponenten keine homologen Sequenzen aufweisen, tritt bei dem unwahrscheinlichen Ereignis der Rekombination, das zu dem Transfer der gag-pol-Sequenzen auf den Vektorempfänger führen würde, die Expression davon viel weniger wahrscheinlich ein, da die transferierte Rekombinante sowohl das RRE-Element als auch die Rev-codierende Sequenz enthalten muss, die in der Lage ist, exprimiert zu werden.

Geeignete Vektoren sind Typ-7-Vektoren, die im Vergleich zu Typ-2-Vektoren weitere Modifikationen von HIV-1-Sequenzen umfassen: eine Base-Mutation innerhalb der SD-Stelle, um das Spleißen von Volllängen-mRNA zu verhindern; Abwesenheit der HIV-1-SA- Stelle und flankierenden Sequenzen; enthält nur 43 Basen von 5'gag-ORF; und Abwesenheit des RRE-Elements. Die Typ-7-Vektoren umfassen nur 43 Basen, die zu pMDLg/pRRE homolog sind und nicht homolog sind zu pMDLg/pRRE.2- und pMDLg/pRRE.3-Verpackungsvektoren. Tabelle 1 nachstehend stellt ein Beispiel für die Vektor-Titerausbeuten bereit, die durch Transfektion der beschriebenen minimal überlappenden und nicht-überlappenden Konstrukte erhalten werden. TABELLE 1

Verpackungsvektor (12 μg Plasmid-DNA transfiziert)	Transfervektor (10 μg Plasmid-DNA transfiziert)	Revexprimierendes Plasmid (2,5 μg Plasmid-DNA transfiziert)	VSV/G-Expressionsplasmid (3,5 μg Plasmid-DNA transfiziert)	Titer (Transduktionseinheiten pro 1 ml Überstand)
pMDLg/pRRE	pCCL7sinCMVGF Ppre	pRSV-Rev	pMD.G	4,71 × 10⁶
pMDLg/pRRE.2	pCCL7sinCMVGF Ppre	pRSV-Rev	pMD.G	2,74 × 10⁶
pMDLg/pRRE.3	pCCL7sinCMVGF Ppre	pRSV-Rev	pMD.G	1,16 × 10⁶

Da die Haupteigenschaft von Interesse für HIV-abgeleitete Vektoren die Fähigkeit zur Transduktion von nicht-teilenden und langsam-teilenden Zellen und Geweben ist, wurden nicht-überlappende Vektoren auf die Transduktion von im Zellzyklus arretierten Zellen getestet. Im Gegensatz zu MoMLV-Vektoren behielten die minimalen HIV-abgeleiteten Vektoren das Transduktionspotential sowohl der in der Teilung als auch im Wachstum arretierten Zellen bei.
Außerdem wurde festgestellt, dass ein HIV-1-RNA-Element, das in der Verpackungsvektor-gag-pol-mRNA vorhanden ist, zu spezifischer Encapsidation von signifikanten Mengen der Messages in freigesetzte Vektorpartikel unter bestimmten Umständen führt. Das Element dient als die HIV-1-Hauptspleiß-Donorstelle (SD) und besteht aus mindestens den Nucleotiden GACUGGUGAG. In Abwesenheit von Transfervektorexpression besitzen die Vektorpartikel, die nur durch das pMDLg/pRRE-Verpackungskonstrukt erzeugt wurden, keine nachweisbare gag-pol-RNA-Message. Die Analyse von Gesamt-RNA, die aus den Zellen extrahiert wurde, die die Vektorpartikel produzierten, zeigte, dass die Expressionsniveaus in allen Fällen ähnlich waren. Wenn 5'-mRNA-Regionen der getesteten Verpackungsvektoren verglichen wurden, wurde offensichtlich, dass die festgelegte obige Sequenz die Determinante ist, die spezifische Encapsidation der Messages bereitstellt.
Die heterologe oder fremde Nucleinsäuresequenz, das Transgen, ist operabel mit einer regulatorischen Nucleinsäuresequenz verknüpft. Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „heterologe" Nucleinsäuresequenz auf eine Sequenz, die aus einer fremden Spezies stammt, oder, wenn sie aus derselben Spezies stammt, im Wesentlichen von der ursprünglichen Form modifiziert werden kann. Alternativ ist eine unveränderte Nucleinsäuresequenz, die normalerweise nicht in einer Zelle exprimiert wird, eine heterologe Nucleinsäuresequenz.
Der Begriff „operabel verknüpft" bezieht sich auf eine funktionelle Verknüpfung zwischen einer regulatorischen Sequenz und einer heterologen Nucleinsäuresequenz, die zur Expression von letzteren führt. Vorzugsweise ist die heterologe Sequenz mit einem Promotor verknüpft, was zu einem chimären Gen führt. Die heterologe Nucleinsäuresequenz steht vorzugsweise unter der Kontrolle entweder der viralen LTR-Promotor-Enhancer-Signale oder eines internen Promotors, und die innerhalb der retroviralen LTR zurückgehaltenen Signale können immer noch eine wirksame Expression des Transgens zustande bringen.
Das Fremdgen kann jede beliebige Nucleinsäure von Interesse sein, die transkribiert werden kann. Im Allgemeinen codiert das fremde Gen ein Polypeptid. Vorzugsweise besitzt das Polypeptid einen gewissen therapeutischen Vorteil. Das Polypeptid kann die defiziente oder nicht-existente Expression eines endogenen Proteins in einer Wirtszelle ergänzen. Das Polypeptid kann neue Eigenschaften auf die Wirtszelle übertragen, wie ein chimärer Signalgebungsrezeptor, siehe US-Patentschrift Nr. 5,359,046 . Der Fachmann kann die Eignung von Fremdgen-Praktiken, die hier gelehrt und auf dem Fachgebiet bekannt sind, bestimmen. Beispielsweise erkennt der Fachmann, ob ein Fremdgen von geeigneter Größe zur Encapsidation geeignet ist und ob das Fremdgen-Produkt ordnungsgemäß exprimiert wird.
Es kann wünschenswert sein, die Expression eines Gen-regulierenden Moleküls in einer Zelle durch das Einbringen eines Moleküls durch das erfindungsgemäße Verfahren zu modellieren. Der Begriff „modulieren" bezeichnet die Suppression von Expression eines Gens, wenn es überexprimiert wird oder den Expressionsanstieg, wenn es unterexprimiert ist. Wo eine Zell proliferative Störung mit der Expression eines Gens zusammenhängt, können Nucleinsäuresequenzen, die in die Expression eines Gens auf dem transkriptionalen Niveau eingreifen, verwendet werden. Der Ansatz kann beispielsweise Antisense-Nucleinsäure, Ribozyme oder Triplexmittel zur Blockierung der Transkription oder Translation einer spezifischen mRNA verwenden, entweder durch Maskieren dieser mRNA mit einer Antisense-Nucleinsäure oder einem Triplexmittel oder durch Abspaltung derselben mit einem Ribozym.
Antisense-Nucleinsäuren sind DNA- oder RNA-Moleküle, die komplementär sind zu mindestens einem Teil eines spezifischen mRNA-Moleküls (Weintraub, Sci. Am. (1990) 262: 40). In der Zelle hybridisieren die Antisense-Nucleinsäuren an die entsprechende mRNA und bilden ein doppelsträngiges Molekül. Die Antisense-Nucleinsäuren greifen in die Translation der mRNA ein, da die Zelle keine mRNA translatiert, die doppelsträngig ist. Antisense-Oligomere von etwa 15 Nucleotiden oder mehr sind bevorzugt, da solche leicht synthetisiert werden und weniger wahrscheinlich Probleme verursachen als größere Moleküle bei Einbringung in die Zielzelle. Die Verwendung von Antisense-Verfahren zur Hemmung der in vitro Translation von Genen ist auf dem Fachgebiet wohlbekannt (Marcus-Sakura, Anal. Biochem. (1988) 172: 289).
Die Antisense-Nucleinsäure kann zur Blockierung der Expression eines mutanten Proteins oder eines dominant-aktiven Genprodukts verwendet werden, wie ein Amyloid-Vorläuferprotein, das sich bei Alzheimer-Krankheit ansammelt. Solche Verfahren sind auch zur Behandlung der Huntington-Krankheit, des erblichen Parkinsonismus und anderer Krankheiten geeignet. Antisense-Nucleinsäuren sind auch zur Hemmung der Expression von Proteinen, die mit Toxizität einhergehen, geeignet.
Die Verwendung eines Oligonucleotids zur Einführung einer Transkription kann durch den Mechanismus erfolgen, der als Triplex-Strategie bekannt ist, da sich das Oligomer um die doppelhelikale DNA wickelt und eine Drei-Strang-Helix bildet. Darum können die Triplex-Verbindungen dazu ausgelegt sein, eine einzige Stelle auf einem gewählten Gen zu erkennen (Maher et al., Antisense Res. and Dev. (1991) 1(3): 227; Helene, Anticancer Drug Dis. (1991) 6(6): 569).
Ribozyme sind RNA-Moleküle, die die Fähigkeit besitzen, andere einzelsträngige RNA auf eine Weise spezifisch zu spalten, die den DNA-Restriktionsendonukleasen entspricht. Durch die Modifikation von Nucleotidsequenzen, die diese RNAs codieren, ist es möglich, Moleküle maßzuschneidern, die spezifische Nucleotidsequenzen in einem RNA-Molekül erkennen und spalten (Cech, J. Amer. Med. Assn. (1988) 260: 3030). Ein großer Vorteil dieses Ansatzes besteht darin, dass nur mRNA's mit bestimmten Sequenzen inaktiviert werden.
Es kann wünschenswert sein, eine Nucleinsäure, die einen biologischen „Response-Modifizierer" codiert, zu transferieren. Eingeschlossen in dieser Kategorie sind immunpotenzierende Mittel, einschließlich Nucleinsäuren, die eine Anzahl der Zytokine codieren, die als „Interleukine" klassifiziert sind, beispielsweise die Interleukine 1 bis 12. Ebenfalls eingeschlossen in dieser Kategorie, obwohl nicht notwendigerweise nach dem gleichen Mechanismus arbeitend, sind Interferone und insbesondere Gamma-Interferon (γ-IFN), Tumornekrosefaktor (TNF) und Granulozyten-Makrophagen koloniestimulierender Faktor (GM-CSF). Es kann wünschenswert sein, solche Nucleinsäuren an Knochenmarkszellen oder Makrophagen abzugeben, um angeborene enzymatische Fehler oder Immundefekte zu behandeln. Nucleinsäuren, die Wachstumsfaktoren, toxische Peptide, Liganden, Rezeptoren oder andere physiologisch wichtige Proteine codieren, können ebenfalls in spezifische, sich nicht teilende Zellen eingebracht werden.
Somit kann das erfindungsgemäße rekombinante Lentivirus zur Behandlung einer HIV-infizierten Zelle (z. B. T-Zelle oder Makrophage) mit einem Anti-HIV-Molekül verwendet werden. Zusätzlich kann das Atemwegsepithel beispielsweise mit einem erfindungsgemäßen rekombinanten Lentivirus mit einem Gen für Zystischen Fibrose-Transmembran-Konduktanz-Regulator (CFTR) zur Behandlung von Zystischer Fibrose infiziert werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch für neuronale, gliale Fibroblasten oder mesenchymale Zelltransplantation oder für „Grafting" geeignet sein, welches die Transplantation von Zellen umfasst, die mit dem erfindungsgemäßen rekombinanten Lentivirus ex vivo infiziert wurden, oder die Infektion in vivo in das zentrale Nervensystem oder die Bauchhöhlen oder subdural auf die Oberfläche eines Wirtsgehirnes umfasst. Solche Verfahren zum „Grafting" sind den Fachleuten bekannt und sind in Neural Grafting in the Mammalian CNS, Bjorklund & Stenevi, Hrsg. (1985) beschrieben.
Für Erkrankungen aufgrund eines Mangel eines Proteinprodukts könnte der Gentransfer ein normales Gen in die befallenen Gewebe als Ersatztherapie einbringen sowie zum Erzeugen von tierischen Modellen für die Krankheit unter Verwendung von Antisense-Mutationen. Es kann beispielsweise wünschenswert sein, einen Faktor VIII oder IX, der Nucleinsäure codiert, in ein Lentivirus zur Infektion einer Muskel-, Milz- oder Leberzelle zu inserieren.
Die Promotorsequenz kann homolog oder heterolog für die gewünschte Gensequenz sein. Ein breiter Bereich von Promotoren kann verwendet werden, einschließlich eines viralen oder eines Säuger-Promotors. Zell- oder Gewebe-spezifische Promotoren können zur Ausrichtung der Expression von Gensequenzen auf spezifische Zellpolulationen verwendet werden. Geeignete Säuger-Promotoren und virale Promotoren für die vorliegende Erfindung stehen auf dem Fachgebiet zur Verfügung. Ein geeigneter Promotor ist ein Promotor, der induzierbar oder konditional ist.
Gegebenenfalls enthält während des Klonierungsstadiums das Nucleinsäurekonstrukt, das als der Transfervektor bezeichnet wird, mit dem Verpackungssignal und der heterologen Klonierungsstelle auch ein selektierbares Markergen. Markergene werden zum Testen der Gegenwart des Vektors und somit zur Bestätigung von Infektion und Integration verwendet. Die Gegenwart eines Markergens stellt die Selektion und das Wachstum von nur denjenigen Wirtszellen sicher, die die Inserts exprimieren. Typische Selektionsgene codieren Proteine, die resistent auf Antibiotika und andere toxische Substanzen, z. B. Histidinol, Puromycin, Hygromycin, Neomycin, Methotrexat etc. übertragen, und Zelloberflächenmarker konferieren.
Der erfindungsgemäße rekombinante Virus ist in der Lage, eine Nucleinsäuresequenz in eine Säugerzelle zu transferieren. Der Begriff „Nucleinsäuresequenz" bezieht sich auf jedes Nucleinsäuremolekül, vorzugsweise DNA, wie ausführlich hier besprochen. Das Nucleinsäuremolekül kann einer Vielzahl von Quellen entstammen, einschließlich DNA, cDNA, synthetische DNA, RNA oder Kombinationen davon. Solche Nucleinsäuresequenzen können genomische DNA einschließen, die natürlich vorkommende Introns einschließen kann oder nicht. Ferner kann eine solche genomische DNA in Verbindung mit Promotorregionen, Poly-A-Sequenzen oder anderen assoziierten Sequenzen erhalten werden. Genomische DNA kann aus geeigneten Zellen durch auf dem Fachgebiet wohlbekannter Mittel extrahiert werden. Alternativ kann Messenger-RNA (mRNA) aus Zellen isoliert und zur Produktion von cDNA durch Reverse Transkription oder andere Mittel verwendet werden.
Vorzugsweise ist das durch das erfindungsgemäße Verfahren produzierte rekombinante Lentivirus ein Derivat des Humanen Immundefizienz-Virus (HIV). Env stammt aus einem Virus, der anders ist als HIV.
Das erfindungsgemäße Verfahren stellt bei einigen Ausführungsformen drei Vektoren bereit, die alle Funktionen, die zum Verpacken von rekombinanten Virionen, wie gag, pol, env, tat und rev, wie vorstehend besprochen, nötig sind, bereitstellen. Wie hier festgestellt, kann tat funktionell für unerwartete Vorteile deletiert werden. Es besteht keine Einschränkung hinsichtlich der Anzahl von Vektoren, die verwendet wird, solange die Vektoren zur Transformation und Produktion der Verpackungszelllinie eingesetzt werden, um das rekombinante Lentivirus zu ergeben.
Die Vektoren werden über Transfektion oder Infektion in die Verpackungszelllinie eingebracht. Die Verpackungszelllinie produziert virale Partikel, die das Vektorgenom enthalten. Verfahren zur Transfektion oder Infektion sind den Fachleuten wohlbekannt. Nach Co-Transfektion der Verpackungsvektoren und des Transfervektors auf die Verpackungszelllinie wird das rekombinante Virus aus dem Kulturmedium gewonnen und durch Standardverfahren, die von den Fachleuten eingesetzt werden, titriert.
Somit können Verpackungskonstrukte in menschliche Zelllinien durch Calciumphosphat-Transfektion, Lipofektion, Elektroporation oder andere Verfahren, im Allgemeinen zusammen mit einem dominanten selektierbaren Marker, wie neo, DHFR, Gln-Synthethase oder ADA, und anschließende Selektion in Gegenwart eines entsprechenden Arzneimittels und Isolierung von Klonen eingebracht werden. Das selektierbare Markergen kann physikalisch an die Verpackungsgene in dem Konstrukt gebunden sein.
Stabile Zelllinien, bei denen die Verpackungsfunktionen konfiguriert sind, um durch eine geeignete Verpackungszelle exprimiert zu werden, sind bekannt. Siehe beispielsweise US-Pat. Nr. 5,686,279 ; und Ory et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (1996) 93: 11400-11406, die Verpackungszellen beschreibt.
Zufferey et al., supra, lehren ein lentivirales Verpackungsplasmid, wobei die Sequenzen 3' von pol, einschließlich des HIV-1-env-Gens, deletiert sind. Das Konstrukt enthält tat- und rev-Sequenzen, und die 3'LTR ist durch poly-A-Sequenzen ersetzt. Die 5'LTR und psi-Sequenzen sind durch einen anderen Promotor, wie einen, der induzierbar ist, ersetzt. Beispielsweise kann ein CMV-Promotor oder ein Derivat davon verwendet werden.
Die Verpackungsvektoren von Interesse enthalten zusätzliche Änderungen zu den Verpackungsfunktionen, um die lentivirale Proteinexpression und die Sicherheit zu verstärken. Beispielsweise können alle HIV-Sequenzen stromaufwärts von gag entfernt werden. Auch Sequenzen stromabwärts von env können entfernt werden. Zudem können Schritte unternommen werden, um den Vektor zu modifizieren, um das Spleißen und die Translation der RNA zu verstärken.
Zur Bereitstellung eines Vektors mit einer noch entfernteren Möglichkeit der Erzeugung von Replikations-kompetentem Lentivirus stellt die vorliegende Erfindung Lentivirus-Verpackungsplasmide bereit, wobei tat-Sequenzen, ein regulierendes Protein, das die virale Expression über einen transkriptionalen Mechanismus beschleunigt, funktionell deletiert sind. Somit kann das tat-Gen zum Teil oder vollständig deletiert sein, oder verschiedene Punktmutationen oder andere Mutationen können an der tat-Sequenz vorgenommen werden, um das Gen nicht-funktionell zu machen. Ein Fachmann kann bekannte Techniken ausführen, um das tat-Gen nicht-funktionell zu machen.
Die zur Konstruktion von Vektoren verwendeten Techniken und zur Transfektion und zur Infektion von Zellen verwendeten Techniken werden auf dem Fachgebiet breit eingesetzt. Fachleute sind mit den standardmäßigen Materialressourcen bereit, die spezielle Bedingungen und Vorgehensweisen beschreiben. Allerdings können aus Gründen der Zweckmäßigkeit die folgenden Abschnitte als Richtlinie dienen.
Die Konstruktion der erfindungsgemäßen Vektoren verwendet Standard-Ligations- und -Restriktionstechniken, die auf dem Fachgebiet gut verstanden sind (siehe Maniatis et al., in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y., 1982). Isolierte Plasmide, DNA-Sequenzen oder synthetisierte Oligonucleotide werden gespalten, maßgeschneidert und in der gewünschten Form wieder ligiert.
Ortsspezifische DNA-Spaltung wird durch Behandeln mit einem geeigneten Restriktionsenzym (oder -enzymen) unter Bedingungen durchgeführt, die auf dem Fachgebiet verstanden werden, und wovon bestimmte, von dem Hersteller der im Handel erhältlichen Restriktionsenzyme ausgeführt sind, siehe z. B. New England Biolabs, Produktkatalog. Im Allgemeinen wird etwa 1 μg Plasmid oder DNA-Sequenzen durch eine Enzymeinheit in etwa 20 μl Pufferlösung gespalten. Typischerweise wird ein Überschuss an Restriktionsenzym verwendet um den vollständigen Verdau des DNA-Substrates sicherzustellen. Die Inkubationszeiten von etwa einer Stunde bis zwei Stunden bei etwa 37° C sind praktikabel, obwohl Schwankungen toleriert werden können. Nach jeder Inkubation wird Protein durch Extraktion mit Phenol/Chloroform entfernt, worauf eine Äther-Extraktion folgen kann, und die Nucleinsäure wird aus den wässrigen Fraktionen durch Präzipitation mit Ethanol gewonnen. Falls gewünscht, kann die Größenauftrennung der gespaltenen Fragmente durch Polyacrylamidgel- oder Agarosegel-Elektrophorese unter Anwendung von Standardtechniken durchgeführt werden. Eine allgemeine Beschreibung der Auftrennungen nach Größe wird in Methods of Enzymology 65: 499-560 (1980) gefunden.
Restriktions-gespaltene Fragmente können stumpfendig sein, durch Behandeln mit dem großen Fragment der E.-coli-DNA-Polymerase-1 (Klenow) in Gegenwart der vier Deoxynucleotidtriphosphate (dNTP's) unter Verwendung von Inkubationszeiten von etwa 15 bis 25 min bei 20° C in 50 mM Tris (pH 7,6), 50 mM NaCl, 6 mM MgCl2, 6mM DTT und 5-10 μM dNTP's. Das Klenow-Fragment füllt klebrige 5'-Enden auf, baut jedoch überstehende 3'-Einzelstränge ab, obwohl die vier dNTP's vorhanden sind. Falls gewünscht, kann selektive Reparatur durch Zuführen nur von einem der dNTP's oder mit ausgewählten dNTP's innerhalb der Grenzen, die von der Natur der klebrigen Enden vorgegeben sind, durchgeführt werden. Nach Behandlung mit Klenow wird das Gemisch mit Phenol/Chloroform extrahiert und Ethanol-präzipitiert. Die Behandlung unter entsprechenden Bedingungen mit SI-Nuklease oder Bal-31 führt zur Hydrolyse von jedem einzelsträngigen Teil.
Ligationen können in 15-50 μl Volumina unter den folgenden Standardbedingungen und Temperaturen durchgeführt werden: 20 mM Tris-Cl pH 7,5, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 33 mg/ml BSA, 10 mM-50 mM NaCl und entweder 40 μM ATP, 0,01-0,02 (Weiss) Einheiten T4-DNA-Ligase bei 0° C (für Ligation von „klebrigen Enden") oder 1 mM ATP, 0,3-0,6 (Weiss) Einheiten T4-DNA-Ligase bei 14° C (für Ligation von „stumpfen Enden"). Intermolekulare „klebrige Enden"-Ligationen werden im Allgemeinen bei Gesamt-DNA- Konzentrationen von 33-100 μg/ml (5-100 mM Gesamtendkonzentration) durchgeführt. Intermolekulare „stumpfe Enden"-Ligationen (die in der Regel einen 10- bis 30fachen molaren Überschuss an Linker verwenden) werden bei 1 μM Gesamtendkonzentration durchgeführt.
Somit wird erfindungsgemäß ein lentiviraler Verpackungsvektor so hergestellt, dass er einen Promotor und andere fakultative und erforderliche regulatorische Sequenzen, wie durch den Fachmann bestimmt, gag, pol, rev, env oder eine Kombination davon mit spezifischer funktioneller oder aktueller Exzision von tat und ggf. anderen lentiviralen akzessorischen Genen enthält.
Lentivirale Transfervektoren (Naldini et al., Science, supra; Proc. Natl. Acad. Sci., supra) werden zur Infizierung von menschlichen Zellen, die in vitro im Wachstum arretiert sind und zur Transduktion von Neuronen nach direkter Injektion in das Gehirn erwachsener Ratten verwendet. Der Vektor war beim Transfer von Markergenen in vivo in die Neuronen effizient, und eine Langzeitexpression in Abwesenheit von nachweisbarer Pathologie wurde erreicht. Tiere, die 10 Monate nach einer einzigen Injektion des Vektors analysiert wurden, der längste Testzeitraum bisher, zeigten keine Abnahme in dem durchschnittlichen Niveau der Transgenexpression und kein Zeichen von Gewebepathologie oder Immunreaktion (Blomer et al., supra). Eine verbesserte Version des lentiviralen Vektors, in dem die HIV-Virulenzgene env, vif, vpr, vpu und nef deletiert waren, ohne Abstriche in der Fähigkeit des Vektors zur Transduktion von sich nicht teilenden Zellen, wurde entwickelt. Die mehrfach abgeschwächte Version stellt eine wesentliche Verbesserung in der biologischen Sicherheit des Vektors dar (Zufferey et al., supra).
In transduzierten Zellen besitzt der integrierte lentivirale Vektor im Allgemeinen eine LTR an jedem Terminus. Die 5'LTR kann die Akkumulation von „viralen" Transkripten verursachen, die das Substrat der Rekombination sein können, insbesondere in HIV-infizierten Zellen. Die 3'LTR kann die Stromabwarts-Transkription mit dem konsequenten Risiko der Aktivierung eines zellulären Protoonkogens beschleunigen.
Die U3-Sequenzen umfassen den Großteil der HIV-LTR. Die U3-Region enthält das Enhancer- und Promotorelement, die die basale und induzierte Expression des HIV-Genoms in infizierten Zellen modulieren und als Reaktion auf die Zellaktivierung modulieren.
Mehrere der Promotorelemente sind für die virale Replikation essentiell. Einige der Enhancerelemente sind unter den viralen Isolaten hoch konserviert und wurden als kritische Virulenzfaktoren bei der viralen Pathogenese vermutet. Die Enhancerelemente können zur Beeinflussung der Replikationsraten in den verschiedenen Zellzielen des Virus wirken (Marthas et al., J. Virol. (1993) 67: 6047-6055).
Da die virale Transkription am 3'-Ende der U3-Region der 5'LTR beginnt, sind diese Sequenzen nicht Teil der viralen mRNA, und eine Kopie davon aus der 3'LTR wirkt als Templat zur Generierung beider LTR's in dem integrierten Provirus. Wenn die 3'-Kopie der U3-Region in einem retroviralen Vektorkonstrukt geändert ist, produziert die Vektor-RNA in Producerzellen immer noch aus der intakten 5'LTR, kann allerdings nicht in den Zielzellen regeneriert werden. Die Transduktion eines solchen Vektors führt zur Inaktivierung beider LTR's in dem nachkommenden Virus. Somit ist das Retrovirus selbst inaktivierend (SIN) und diese Vektoren sind als Sin-Transfervektoren bekannt.
Allerdings gibt es in dem Ausmaß der Deletion an der 3'LTR Grenzen. Zuerst dient das 5'-Ende der U3-Region in einer anderen essentiellen Funktion beim Vektortransfer, der zur Integration erforderlich ist (terminales Dinucleotid + att-Sequenz). Somit kann das terminale Dinucleotid und die att-Sequenz die 5'-Grenze der U3-Sequenzen, die deletiert werden kann, darstellen. Zusätzlich können einige ungenau definierte Regionen die Aktivität der stromabwärts gelegenen Polyadenylierungsstelle in der R-Region beeinflussen. Eine übermäßige Deletion von U3-Sequenz aus der 3'LTR kann die Polyadenylierung von Vektortranskripten herabsetzen, mit nachteiligen Folgen sowohl auf den Titer des Vektors in Producerzellen als auch auf die Transgenexpression in den Zielzellen. Andererseits können eingeschränkte Deletionen die transkriptionale Aktivität der LTR in transduzierten Zellen nicht beseitigen.
Neue Versionen eines Lentivirus-Transfervektors, die hier beschrieben sind, tragen zunehmende Deletionen der U3-Region der 3'LTR (1: Die U3-Deletionen umspannen das Nucleotid 418 der U3-LTR bis zu der angegebenen Position: SIN-78, SIN-45, SIN-36 und SIN-18). Lentivirale Vektoren mit fast vollständiger Deletion der U3-Sequenzen aus der 3'LTR wurden entwickelt, ohne Abstriche im Titer des Vektors in Producerzellen, noch in der Transgenexpression in Zielzellen zu erhalten. Die besonders extensive Deletion (–418 bis –18) erstreckt sich so weit wie bis zu der TATA-Box und beseitigt darum jede transkriptionale Aktivität der LTR in transduzierten Zellen. Somit kann die Untergrenze der 3'-Deletion sich so weit erstrecken, wie einschließlich zur TATA-Box. Die Deletion kann vom Rest der U3-Region bis zu der R-Region reichen. Dies stellt einen dramatischen Gewinn in der Vektorsicherheit dar. Die verschiedenen Deletionen wurden unter praktischer Anwendung auf dem Fachgebiet bekannter Verfahren produziert.
Überraschenderweise war das durchschnittliche Expressionsniveau des Transgens höher in Zellen, die durch die SIN-Vektoren transduziert wurden, im Vergleich zu intakteren Vektoren. Dies beruhte wahrscheinlich auf der Entfernung der transkriptionalen Interferenz von dem Stromaufwärts-HIV-LTR auf dem internen Promotor. SIN-Typ-Vektoren mit solchen extensiven Deletionen der U3-Region konnten nicht aus Maus-Leukämievirus-(MLV)-basierenden retroviralen Vektoren erzeugt werden, ohne Abstriche in der Transduktionseffizienz zu erhalten.
Die 5'LTR des Transfervektorkonstrukts wurde durch Substitution eines Teils oder aller transkriptionaler regulatorischer Elemente der U3-Region durch heterologe Enhancer/Promotoren modifiziert. Die Änderungen wurden vorgenommen, um die Expression der Transfervektor-RNA in Producerzellen zu verstärken; um die Vektorproduktion in Abwesenheit des HIV-tat-Gens zu erlauben; und um die Stromaufwärts-Wildtyp-Kopie der HIV-LTR zu entfernen, die mit der 3'-deletierten Version rekombinieren kann, um die oben beschriebenen SIN-Vektoren zu „retten".
Somit können Vektoren, die die oben beschriebenen Änderungen an der 5'LTR enthalten, 5'-Vektoren, als Transfervektoren Anwendung finden aufgrund der Sequenzen zur Verstärkung der Expression und in Kombination mit Verpackungszellen, die tat nicht exprimieren.
Solche 5'-Vektoren können auch Modifikationen an der 3'LTR tragen, wie hier zuvor besprochen, um verbesserte Transfervektoren zu ergeben, die nicht nur eine verstärkte Expression aufweisen und in Verpackungszellen verwendet werden können, die tat nicht exprimieren, sondern die auch selbst inaktivierend sein können.
Die Transkription aus der HIV-LTR ist sehr stark abhängig von der Transaktivatorfunktion des Tat-Proteins. In Gegenwart von Tat, oft exprimiert durch das Kern-Verpackungskonstrukt, das in Producerzellen vorkommt, wird die Vektortranskription aus der HIV-LTR stark stimuliert. Da diese virale „Volllangen-RNA" ein vollständiges Komplement von Verpackungssignalen aufweist, wird die RNA wirksam in Vektorpartikel verkapselt und auf Zielzellen transferiert. Die Menge an Vektor-RNA, die zum Verpacken in Producerzellen zur Verfügung steht, ist ein Geschwindigkeits-begrenzender Schritt bei der Produktion des infektiösen Vektors.
Der Enhancer oder die Enhancer- und Promotorregion der 5'-LTR wurden mit dem Enhancer oder dem Enhancer und Promotor des menschlichen Cytomegalovirus (CMV) bzw. des Rous Sarcoma-Virus (RSV) substituiert, für ein Schema der Konstrukte und für die Codenamen der Hybridvektoren siehe 2. Die CCL- und RRL-Vektoren weisen eine vollständige Substitution der 5'-U3-Region auf.
Der Kontroll-Lentivektor HR2 und das Panel von 5'-Hybriden wurden in Producerzellen verglichen, die mit dem Transfervektor transfiziert, und mit oder ohne Verpackungskonstrukte waren, die den tat-Transaktivator bereitstellen. Das transkriptionale Niveau der vier chimären Vektoren ist höher als dasjenige eines Kontroll-Lentivektors sowohl in Gegenwart als auch in Abwesenheit des Verpackungskonstrukts. Sämtliche chimäre Vektoren transferieren wirksam das Transgen in Zielzellen und der RRL-Vektor hat dieselbe Leistung wie der Kontroll-HR2-Vektor. Schließlich wurde die Integration des Vektors in Zielzellen durch Überprüfung transduzierter Zellen in einer frühen und einer späteren Passage nach der Transduktion bestätigt. Es wurde im prozentualen Gehalt an Transgen-positiven Zellen keine Abnahme festgestellt, was anzeigt, dass der Vektor integriert worden ist.
Das hohe Expressionsniveau der 5'-LTR-modifizierten Transfervektor-RNA, das in Producerzellen in Abwesenheit eines Verpackungskonstrukts erhalten wurde, gibt an, dass der produzierende Vektor in Abwesenheit eines funktionellen tat-Gens funktionell ist. Die funktionelle Deletion des tat-Gens, wie für das hier vorstehend offenbarte Verpackungsplasmid angegeben, würde ein höheres Niveau an biologischer Sicherheit auf das lentivirale Vektorsystem bei gegebener Anzahl von pathogenen Aktivitäten, die mit dem tat-Protein zusammenhängen, übertragen. Somit ist ein lentiviraler Vektor von signifikant verbesserter biologischer Sicherheit ein SIN-Transfervektor, der keine Wildtypkopie der HIV-LTR weder am 5'- oder am 3'-Ende aufweist, der in Verbindung mit tat-losen Verpackungsvektoren, wie hier beschrieben, verwendet wird.
Virale Überstände werden unter Verwendung von Standardtechniken, wie Filtration von Überständen, 48 Stunden nach Transfektion geerntet. Der virale Titer wird durch Infektion von beispielsweise 106 NIH-3T3-Zellen oder 105 HeLa-Zellen mit einer entsprechenden Menge an viralem Überstand in Gegenwart von 8 g/ml Polybrene (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) bestimmt. Achtundvierzig Stunden später wird die Transduktionseffizienz überprüft.
Somit stellt die vorliegende Erfindung Verfahren und Mittel zur Produktion von rekombinantem Virus mit hohem Titer bereit. Diese Viruspartikel-Präparationen können zur Infizierung von Zielzellen unter Verwendung von auf dem Fachgebiet bekannten Techniken eingesetzt werden. Die vorliegende Erfindung findet somit bei Anwendungen der ex-vivo-Gentherapie Verwendung, wobei Zielzellen aus einem Wirt entfernt, in Kultur unter Durchführung bekannter Techniken transformiert und dann wieder in den Wirt zurückgeführt werden.
Nachdem nun die Erfindung ausführlich beschrieben wurde, werden im Folgenden nicht einschränkende Beispiele bereitgestellt, die verschiedene Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung zeigen.
Beispiel 1
KONSTRUKTION VON LENTIVIRALEN VERPACKUNGSPLASMIDEN
Die lentiviralen Verpackungsplasmide entstammten dem Plasmid pCMVΔR8.9 (ΔVprΔVifΔVpuΔNef), das bereits bei Zufferey et al., supra, beschrieben wurde. Alle restlichen Sequenzen des nef-Gens in pCMVΔR8.9 wurden durch Verdau mit XhoI und BstEII, Auffüllen mit Klenow und Religation entfernt. Die Konstruktion deletierte 100 Basenpaare, wobei das verkürzte env-Leseraster von HIV-1 mit der genomischen Insulin-Polyadenylierungsstelle verknüpft wurde und sich das Plasmid pCMVΔR8.73 ergab.
Bei einer anderen Ausführungsform der Erfindung wurden unter 133 Basenpaare von CMV-abgeleiteten Sequenzen stromabwärts von dem CMV-Promotor in dem Plasmid pCMVΔR8.73 deletiert. Diese Sequenz enthält eine Splice-Donorstelle, und sie wurde durch Verdau des Plasmids pCMVΔR8.73 mit SacII und Religation des größeren Fragments entfernt, wodurch das Plasmid pCMVΔR8.74 erhalten wurde.
Bei einer anderen Ausführungsform der Erfindung wurden sämtliche HIV-abgeleiteten Sequenzen, die in dem Plasmid pCMVΔR8.74 stromaufwärts von dem Initiationscodon des gag-Gens zurückblieben, mit der Ausnahme der Konsensus-5'-Splice-Donorstelle entfernt. Gleichzeitig wurde die Sequenz stromaufwärts des gag-Gens zur optimalen Translationseffizienz verändert, wodurch das Plasmid pCMVΔR8.75 erhalten wurde. pCMVΔR8.75 wurde von pCMVΔR8.74 durch Ersatz des 94 bp SstII-ClaI-Fragments mit einem SstII-ClaI-Oligonucleotidlinker abgeleitet, der bestand aus
5'-GGGACTGGTGAGTGAATTCGAGATCTGCCGCCGCCATGGGTGCGAGAGCGTCAGTATTAAGCGGGGGAGAATTAGAT-3' und
5'-CGATCTAATTCTCCCCCGCTTAATACTGACGCTCTCGCACCCATGGCGGCGGCAGATCTCGAATTCACTCACCAGTCCCGC-3'.
Bei einer anderen Ausführungsform der Erfindung wurde ein induzierbares Verpackungskonstrukt durch Ersatz des PstI-SacII-Fragments von pCMVΔR8.74, das den CMV-Promotor enthielt, mit sieben Tandemkopien der Tetracyclin-Operatorsequenzen, die an einen minimalen CMV-Promotor gebunden waren, erhalten. Das tet-regulierte Verpackungsplasmid pTetΔR8.74 wurde erhalten.
Beispiel 2
KONSTRUKTION VON LENTIVIRALEN TRANSFERVEKTOREN
Die lentiviralen Transfervektorplasmide wurden aus dem Plasmid pHR'-CMV-LacZ, das bereits bei Naldini et al., Science, supra, beschrieben wurde, abgeleitet. pHR2 ist ein lentiviraler Transfervektor, in dem 124 bp von nef-Sequenzen stromaufwärts der 3'-LTR in pHR' mit einem Polylinker ersetzt waren, sowohl zur Reduktion von HIV1-Sequenzen als auch zur Erleichterung des Transgenklonierens. pHR2 wurde von pHR'-CMV-LacZ durch Ersatz des 4,6 kB ClaI-StuI-Fragments mit dem 828 bp ClaI-StuI-Fragment, das durch PCR unter Verwendung von pHR'-CMV-LacZ als das Template und des Oligonucleotids
5'-CCATCGATCACGAGACTAGTCCTACGTATCCCCGGGGACGGGATCCGCGGAATTCCGTTTAAGAC-3' und 5'-TTATAATGTCAAGGCCTCTC-3' in einer dreiteiligen Ligation mit einem 4,4 kB StuI-NcoI-Fragment und einem 4,5 kB NcoI-ClaI-Fragment aus pHR'-CMV-LacZ erzeugt wurde, abgeleitet.
Bei einer anderen Ausführungsform der Erfindung ist pHR3 ein lentiviraler Transfervektor, in dem 148 bp von env-codierenden Sequenzen (einschließlich einer ATG) stromaufwärts des Rev-Response-Elements (RRE) in pHR2 deletiert waren. pHR3 wurde von pHR2 durch Ersatz des 893 bp NotI-SpeI-Fragments von pHR2 mit einem 747 bp NotI-SpeI-Fragment, das durch PCR unter Verwendung von pHR2 als Template mit den Oligonucleotidprimern 5'-GCGGCCGCAGGAGCTTTGTTCCTTGG-3' und 5'-TACGTAGGACTAGTCTCG-3' erzeugt wurde, abgeleitet.
Bei einer anderen Ausführungsform der Erfindung ist pHR5 ein lentiviraler Transfervektor, in dem 310 bp gag-codierende Sequenzen (sämtliche gag-codierende Sequenzen stromabwärts von Aminosäure 15 des Gag-Proteins) aus pHR2 deletiert waren. pHR5 wurde durch Verdau von pHR2 mit NruI, Addition eines NotI-Linkers (synthetisches Oligonucleotid 5'-TTGCGGCCGCAA-3'), Verdau mit NotI zur Exzision des 310-bp-Fragments und anschließende Religation abgeleitet.
Bei einer anderen Ausführungsform der Erfindung ist pHR6 ein lentiviraler Vektor, in dem das 5'-Splice-Donorsignal mutiert war (TGGT zu TGAT), um die Produktion von Volllängentranskripten zu verstärken, die in der Lage sind, verpackt zu werden. pHR6 wurde von pHR5 durch Ersatz des 239 bp AflII-ApoI-Fragments mit einem 239 bp AflII-ApoI-Fragment, das durch PCR unter Verwendung eines pHR2 als Template mit den Oligonucleotidprimern 5'-CCACTGCTTAAGCCT-3' und 5'-CAAAATTTTTGGCGTACTCATCAGTCGCCGCCCCTCG-3' generiert wurde, abgeleitet.
Sämtliche PCR-Fragmente wurden erzeugt, indem zunächst das PCR-Reaktionsprodukt direkt in den TA-Klonierungsvektor pCR2.1 (Invitrogen) kloniert und die Sequenz anschließend verifiziert und mit den entsprechenden Enzymen ausgeschnitten wurde.
Beispiel 3
KONSTRUKTION DER 5'-LTR-CHIMÄREN LENTIVIRALEN TRANSFERVEKTOREN
Bei einer anderen Ausführungsform der Erfindung enthält die 5'-LTR des lentiviralen Vektors den Enhancer und Promotor aus der U3-Region des Rous Sarcoma-Virus (RSV), verknüpft mit der R-Region von HIV-1 (Plasmid pRRL).
pRRL ist ein lentiviraler Transfervektor, in dem der Enhancer und Promotor (Nucleotide –233 bis –1 relativ zu der transkriptionalen Startstelle) von RSV exakt mit der R-Region von HIV-1 unter Verwendung eines Oligonucleotidlinkers fusioniert sind. pRRL wurde von den Plasmiden pRT43.RSV.F3, siehe WO 97/07225 , und pHR2 durch Ersatz des 3,4 kB EcoRI-HpaI-Fragments von pRT43.RSV.F3 mit dem 0,67 kB BglII-NotI-Fragment aus pHR2 und dem 1,7 kB NotI-StuI-Fragment aus pHR2 zusammen mit einem synthetischen EcoRI-BglII-Oligonucleotidlinker abgeleitet, bestehend aus den Oligonucleotiden
5'-AATTGCCGCATTGCAGAGATATTGTATTTAAGTGCCTAGCTCGATACAATAAACGGGTCTCTCTGGTTAGACCA-3' und
5'-GATCTGGTCTAACCAGAGAGACCCGTTTATTGTATCGAGCTAGGCACTTAAATACAATATCTCTGCAATGCGGC-3'.
Bei einer weiteren Ausführungsform der Erfindung enthält die 5'-LTR des lentiviralen Vektors den Enhancer (Nucleotide –233 bis –50 relativ zu der transkriptionalen Startstelle) des Rous Sarcoma-Virus (RSV), verknüpft mit der Promotorregion (von der Position –78 bp relativ zu der transkriptionalen Startstelle) von HIV-1 (Plasmid pRLL).
pRLL ist ein lentiviraler Transfervektor, in dem der Enhancer von RSV mit der Promotorregion von HIV-1 unter Verwendung eines Oligonucleotidlinkers fusioniert ist. pRRL wurde von den Plasmiden pRT43.RSV.F3 und pHR2 abgeleitet, indem das 3,4 kB EcoRI-HpaI-Fragment von pRT43.RSV.F3 mit dem 0,724 kB AlwNI-NotI-Fragment aus pHR2 und dem 1,7 kB NotI-StuI-Fragment aus pHR2 zusammen mit einem synthetischen EcoRI-A1wNI-Oligonucleotidlinker, bestehend aus dem Oligonucleotid 5'-AATTGGAGGCGTGGCCTGGGCGGGACTGGGGAGTGGCGAGCCCTCAGATC-3' und dem Oligonucleotid 5'-CTGAGGGCTCGCCACTCCCCAGTCCCGCCCAGGCCACGCCTCC-3' ersetzt wurde.
Bei einer weiteren Ausführungsform der Erfindung (Plasmid pCCL) enthält die 5'-LTR des lentiviralen Vektors den unmittelbaren frühen Enhancer und Promotor (Nucleotide –673 bis –1, relativ zu der transkriptionalen Startstelle) nach Boshart et al. (Cell (1985) 41: 521-530) des menschlichen Cytomegalovirus (CMV), verknüpft mit der R-Region von HIV-1. pCCL wurde von den Plasmiden 5'-GATATGATCAGATC-3' und 5'-CTGATCA-3' und einer dreiteiligen Ligation zusammen mit einem 0,54 kB AlwN-AvrII-Fragment und einem 6,1 kB AvrII-BbsI-Fragment aus pRRL abgeleitet.
pRRL.SIN-45 wurde von pRRL durch Ersatz des 493 bp BbsI-AlwNI-Fragments in dem 3'-LTR mit einem Oligonucleotidlinker, bestehend aus den synthetischen Oligonucleotiden 5'-GATATGATCAGAGCCCTCAGATC-3' und 5'-CTGAGGGCTCTGATCA-3', in einer dreiteiligen Ligation zusammen mit einem 0,54 kB AlwNI-AvrII-Fragment und einem 6,1 kB AvrII-BbsI-Fragment aus pRRL abgeleitet.
pRRL.SIN-78 wurde aus pRRL durch Ersatz des 493 bp BbsI-AlwNI-Fragments in dem 3'-LTR mit einem Oligonucleotidlinker, bestehend aus 5'-GATATGATCAGGAGGCGTGGCCTGGGCGGGACTGGGGAGTGGCGAGCCCTCAGATC-3' und einem Oligonucleotid 5'-CTGAGGGCTCGCCACTCCCCAGTCCCGCCCAGGCCACGCCTCCTGATCA-3', in einer dreiteiligen Ligation zusammen mit einem 0,54 kB AlwNI-AvrII-Fragment und einem 6,1 kB AvrII-BbsI-Fragment aus pRRL abgeleitet.
Beispiel 5
KONSTRUKTION VON STABILEN LENTIVIRALEN VERPACKUNGSZELLEN 10-28 UND VON STABILEN PRODUCERN EINES LENTIVIRALEN VEKTORS
Die 293G-Zelllinie wurde zur Erzeugung stabiler lentiviraler Verpackungszellen verwendet. 293G-Zellen exprimieren den tetR/VP16-Transaktivator aus der MD-Kassette (CMV-Promotor und intervenierende Sequenzen – Exons 2 und 3, Intron 2- und poly(A)-Stelle aus dem menschlichen β-Globin-Gen) und dem VSV-Envelope aus einem minimalen CMV- Promotor, gebunden an eine Tandem-Wiederholungssequenz von sieben Tetracyclinoperatorstellen (tet0). Die Expression von VSV G wird somit durch die Konzentration von Tetracyclin in dem Kulturmedium reguliert, das in Gegenwart des Antibiotikums blockiert ist (Gossen & Bujard, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992) 89: 5547-5551; und Ory et al., supra (1997)). Die 293G-Zellen wurden routinemäßig in DMEM/glukosearmem Kulturmedium, angereichert mit 10 % Donor-Kälberserum und enthaltend 1 μg/m1 Tetracyclin, gehalten. Eine 15-cm-Platte von 293G-Zellen wurde unter Verwendung von Lipofectamin (GIBCO BRL) mit 13,36 μg des Verpackungsplasmids pCMVΔR8.74 und 1,33 μg des Selektionsplasmids pZeoSV2 transfiziert. Das Medium wurde nach 24 h und 48 h ausgetauscht, die Zellen wurden auf Medium aufgeteilt, das 250 μg/ml Zeocin und 1 μg/ml Tetracyclin enthielt. Nach 3-4 Wochen der Selektion wurden 250 Klone herausgenommen und auf 96-Wellplatten übergeführt und das Medium auf HIV-1 p24 Gag-Antigen durch Immunocapture unter Verwendung eines handelsüblichen Testsatzes gescreent. Zweiundfünfzig p24-positive Klone wurden zur weiteren Analyse heranwachsen gelassen. Es wurde bestimmt, dass die besten 5 Klone p24-Werte von 12-23 ng/ml aufwiesen. Von den 5 Klonen waren 4 auf die VSV.G-Expression nach Tetracyclinentzug durch Westernblot-Analyse positiv.
Die vier p24/VSV.G-positiven Klone wurden weiterhin auf die Fähigkeit zum Verpackungen von lentiviralen Transfervektoren analysiert. Die Klone wurden mit vorübergehend produziertem lentiviralem Vektor (VSV.G-Pseudotyp), der eine Expressionskassette für das Grün Fluoreszierende Protein von A. victoria (GFP) enthielt, angetrieben durch den CMV-Promotor, in einer Infektionsmultiplizität von 10 und in Gegenwart von Polybrene (8 μg/ml) infiziert. Die infizierten Klone wurden dann expandiert und das Tetracyclin entfernt. Nach 72 Stunden der Induktion wurde eine 24-h-Medium-Sammlung durchgeführt, und die Überstände wurden filtriert und blitzgefroren. Die eingefrorenen Überstände wurden auf native HeLa-Zellen zur Transduktion des GFP-Gens titriert. Durch FACS-Analyse wurde bestimmt, dass die Population der Zellen (bezeichnet 10-28), die aus der Infektion der Verpackungsklone 10-28 erzeugt wurden, die höchsten Titer von 5 × 10⁴ Transduktionseinheiten (T.U.)/ml aufwiesen.
Die infizierte Verpackungspopulation, 10-28, wurde zur Erzeugung von Producerklonen mit hohem Titer des lentiviralen GFP-Virus verwendet. 10-28 Zellen wurden durch FACS aussortiert, und die höchsten GFP-exprimierenden Zellen wurden zurückgehalten und expandiert. Diese Population wurde dann zusätzliche 4-mal mit vorübergehend produziertem GFP lentiviralen Vektor (VSV.G Pseudotyp) seriell infiziert ("provoziert"). Nach jeder Infektion wurden die Überstände nach einer 72-96 h-VSV.G-Induktion gesammelt. Die Überstände wurden auf HeLa-Zellen titriert und auf den p24-Gehalt durch Immunocapture-Assay analysiert. Die infektiösen Titer waren nach der dritten Infektion am höchsten und erreichten 1,5 × 10⁶ T.U./ml (siehe 3). Die Population von Zellen aus der dritten Infektion wurde dann subkloniert, um Vektorproducer mit hohem Titer zu isolieren.
Beispiel 6
LENTIVIRALE VERPACKUNGSKONSTRUKTE
pMDLg/p ist ein CMV, das durch ein Expressionsplasmid angetrieben wird, das nur die gag/pol-codierenden Sequenzen aus HIV-1 enthält. Als Erstes wurde pkat2Lg/p durch Ligation eines 4,2 kB ClaI-EcoRI-Fragments aus pCMVΔR8.74 mit einem 3,3 kB EcoRI-HindIII-Fragment aus pkat2 (Finer et al., Blood (1994), 83: 43-50) und einem 0,9 kB HindIII-NcoI-Fragment aus pkat2 zusammen mit einem NcoI-ClaI-DNA-Linker, bestehend aus den synthetischen Oligonucleotiden 5'-CATGGGTGCGAGAGCGTCAGTATTAAGCGGGGGAGAATTAGAT-3' und 5'-CGATCTAATTCTCCCCCGCTTAATACTGACGCTCTCGCACC-3', konstruiert. Als Nächstes wurde pMDLg/p durch Insertion des 4,25 kB EcoRI-Fragments aus pkat2Lg/p in die EcoRI-Stelle von pMD-2 konstruiert. pMD-2 ist ein Derivat von pMD.G (Ory et al., supra), in dem das pXF3-Plasmidgerüst von pMD.G mit einem minimalen pUC18 (Invitrogen)-Plasmidgerüst ersetzt und das 1,6 kB VSV.G-codierende EcoRI-Fragment entfernt wurde.
pMDLg/pRRE unterscheidet sich von pMDLg/p durch die Addition einer 374 bp RRE-enthaltenden Sequenz aus HIV-1 (HXB2) unmittelbar stromabwärts von den pol-codierenden Sequenzen. Um pMDLg/pRRE zu erzeugen, wurde das 374 bp NotI-HindII RRE-enthaltende Fragment aus pHR3 in das 9,3 kB NotI-BglII-Fragment von pVL1393 (Invitrogen) zusammen mit einem HindIII-BglII-DNA-Linker, bestehend aus den synthetischen Oligonucleotiden 5'-AGCTTCCGCGGA-3' und 5'-GATCTCCGCGGA-3', ligiert, um pVL1393RRE zu erzeugen (pHR3 wurde von pHR2 durch Entfernung der HIV env-codierenden Sequenzen stromaufwärts von den RRE-Sequenzen in pHR2 abgeleitet). Eine NotI-Stelle verbleibt an der Verbindungsstelle zwischen der gag- und der RRE-Sequenz. pMDLg/pRRE wurde dann durch Ligation des 380 bp EcoRI-SstII-Fragments aus pV1393RRE mit dem 3,15 kB SstII-NdeI-Fragment aus pMD-2FIX (pMD-2FIX ist ein menschlicher Faktor IX, der eine Variante von pMD-2 enthält, die an dem 3'-Ende des Faktor IX-Inserts eine SstII-Stelle aufweist), dem 2,25 kB NdeI-AvrII-Fragment aus pMDLg/p und dem 3,09 kB AvrII-EcoRI-Fragment aus pkat2Lg/p konstruiert (Finer et al., supra).
pMDLg/pRRE.2 ist ein gag/pol-exprimierender lentiviraler Verpackungsvektor, in dem die Codons für die gag-Aminosäuren 2-13 mutiert wurden (ohne Veränderung der Aminosäurensequenz). pMDLg/pRRE.2 wurde durch Ligation eines 8,4 kB ClaI-Bsu36I-Fragments und eines 1,4 kB Bsu36I-EcoRI-Fragments aus pMDLg/pRRE mit einem DNA-Linker, bestehend aus den synthetischen Oligonucleotiden
5'-aattcgagatctgccgccgccatgggagcccgggccagcgtcctgtctggaggggagctggac-3' und
5'-cggtccagctcccctccagacaggacgctggcccgggctcccatggcggcggcagatctcg-3', erzeugt.
pMDLg/pRRE.3 ist ein gag/pol-exprimierender lentiviraler Verpackungsvektor, in dem die Codons für die gag-Aminosäuren 2-7 mutiert wurden (ohne Veränderung der Aminosäurensequenz) und in dem die gag-codierenden Sequenzen für die Aminosäuren von 8 bis 87 des Gag-Polyproteins deletiert wurden. Bereits beschriebene Experimente, die durchgeführt wurden zur Untersuchung der HIV-1 MA-Proteinfunktionen (Reil et al., EMBO J. (1998), 17: 2699-708) zeigen, dass die Deletion der Aminosäuren von 8 bis 87 des Matrixproteins (MA), das Teil des Gag-Polyproteins ist, keine Auswirkung auf die Wirksamkeit des Wildtyp-HIV-1-Eintritts in infizierte Zellen besitzt, wenn ausgewertete Virionen mit VSV/G pseudotypisiert wurden. pMDLg/pRRE.3 wurde durch Ligation eines 6,8 kB SphI-Bsu36I-Fragments und eines 1,4 kB Bsu36I-EcoRI-Fragments aus pMDLg/pRRE mit einem 0,4 kB XbaI-SphI-Fragment aus dem Plasmid HXBI0ΔCT.Δ8-87, beschrieben bei (Reil et al., supra), und einem DNA-Linker, bestehend aus den synthetischen Oligonucleotiden 5'-aattcgagatctgccgccgccatgggagcccgggccagcgtc-3' und 5'-ctagagacgctggcccgggctcccatggcggcggcagatctcg-3', erzeugt.
ptetMDrev ist ein Expressionsvektor, in dem die HIV-1-Rev-Proteinexpression unter der Kontrolle des tet-induzierbaren tet°7/CMV-Hybridpromotors steht. Die einzigen HIV-Sequenzen, die in dem Vektor enthalten sind, sind HXB2 rev cDNA, die das erste (Nucleotide 5937 bis 6045) und zweite (Nucleotide 8379 bis 8653) Exon (Genbank-Zugangsnummer K03455) einschlossen. Zur Erzeugung von ptetMDrev wurde der CMV-Enhancer/Promotor von pMD-2 mit dem tet°/CMV-Hybridpromotor aus ptet/splice (Gibco/BRL) ersetzt, was ptetMD ergab. Als Nächstes wurde ptetMDNcoI(ATG) durch Insertion eines DNA-Linkers, bestehend aus den synthetischen Oligonucleotiden
5'-aattcacgcgtgccgccaccatggcaggaagaagcggagacagcgacgaagacctcctcgcggccgccagtagctgt-3'
und 5'-aattacagctactggcggccgcgaggaggtcttcgtcgctgtctccgcttcttcctgccatggtggcggcacgcgtg-3'
in EcoRI-verdautes ptetMD erzeugt. Schließlich wurde ptetMDrev durch Ligation eines 4,6 kB AlwNI-BamHI-Fragments und eines 615 bp BamHI-BbsI-Fragments aus ptetMDNcoI(ATG) mit einem 354 bp BbsI-AlWNI-Fragment aus pRSVrev (Plasmid, das bei Dull et al., J. Virol. (1998), 72: 8463-71 beschrieben ist), erzeugt.
Beispiel 7
KONSTRUKTION VON LENTIVIRALEN TRANSFERVEKTOREN
pHR7 ist ein maximal deletierter lentiviraler Vektor, in dem alle HIV-Sequenzen zwischen nt 43 der gag-codierenden Sequenz und des Transgens deletiert wurden, um die Homologie zwischen dem Transfervektor und dem Verpackungsvektor weiter herabzusetzen. pHR7 wurde von pHR6 abgeleitet durch Ligation eines 8,2 kB SacII-NotI-Fragments und eines 1,3 kB XhoI-SacII-Fragments aus pHR6 mit einem DNA-Linker, bestehend aus den synthetischen Oligonucleotiden 5'-GGCCATTGAC-3' und 5'-TCGAGTCAAT-3', abgeleitet.
pCCL7sinCMVGFPpre ist ein lentiviraler Vektor, der die maximal deletierte 5' untranslatierte Region von pHR7 mit einer selbstinaktivierenden 3'-LTR, einem CMV 5'-U3 und einem posttranskriptionalen regulatorischen (Prä)element aus dem Waldmurmeltier-Hepatitisvirus einschließt. Zur Erzeugung von pCCL7sinCMVGFPpre wurde zuerst ein 329 bp AflII-XhoI-Fragment aus pHR7 an ein 1,9 kB XhoI-AvrII-Fragment und ein 3,2 kB AvrII-AflII-Fragment aus pRRLsin18bPGK.GFP ligiert, um pRRL7sinhPGK.GFP zu erzeugen. Als Nächstes wurde der hPGK-interne Promotor durch einen hCMV-internen Promotor durch Ligation eines 606 bp ClaI-BamHI-Fragments (in dem die ClaI-Stelle "aufgefüllt" war) aus pRRLsinCMV.GFP mit einem 4,9 kB BamHI-AvaI-Fragment (in dem die AvaI-Stelle "aufgefüllt" war) aus pRRL7sinhPGK.GFP ersetzt, um pRRL7sinhCMV.GFP zu erzeugen. Als Nächstes wurde ein 600 bp SalI bis EcoRI-Waldmurmeltier-Hepatitisvirus-Präfragment (erzeugt durch PCR unter Verwendung von pWHV8 (Genbank-Zugangsnummer J04514) als Template mit den Primern 5'-tctagaggatccgtcgacaatcaacctctggattacaa-3' und 5'-gagctcgaattccaggcggggaggcggcccaa-3' und anschließenden Verdau mit SalI und EcoRI) in SalI- und EcoRI-verdautes pRRL7sinhCMV.GFP insertiert, um pRRL7sinhCMV.GFPpre zu erzeugen. Als Nächstes wurde das 704 bp AflIII- bis AflII-Fragment von pRRL7sinhCMV.GFP mit dem 1147 bp AflIII- bis AflII-Fragment aus pCCL ersetzt, um pCCL7sinhCMV.GFPpre zu erzeugen.
Beispiel 8
KONSTRUKTION VON KONDITIONALEN SELBSTINAKTIVIERENDEN VEKTOREN (cSIN)
pRRLsin36PGKGFPtet°3' ist ein lentiviraler Vektor, in dem die 3'-LTR ein hybrides tet°/HIV U3 enthält. Das Hybrid 3'-U3 besteht aus sieben Kopien des tet-Operators (teto7), verknüpft mit den 36 Nucleotiden des 3'-Teils des HIV U3, welches die "TATA"-Box einschließt. pRRLsin36PGKGFPtet°3' ist ein konditionaler selbstinaktivierender (cSIN)-Vektor, der nach Transduktion aktiviert werden kann, um verpackungsfähige Volllängenvektortranskripte nur in Gegenwart eines Tetracyclin-responsiven Transaktivators (tTA) zu exprimieren – beispielsweise nach Transduktion einer entsprechenden Verpackungszelllinie, die tTA exprimiert. Nach Transduktion von beliebigen Zellen, die tTA nicht exprimieren, ist der resultierende 5'-tet°/HIV U3 transkriptional nicht-funktionell, auch in Gegenwart von HIV Tat-Protein, das bekanntlich die basale transkriptionale Aktivität von heterologen Promotoren aufreguliert. Dies setzt die Möglichkeit der Mobilisierung des Vektorgenoms signifikant herab, auch wenn transduzierte Zellen durch den Wildtyp HIV-1 infiziert werden.
pRRLsin36PGKGFPtet°3' gestattet einen neuen Ansatz für eine SIN-Vektorkonstruktion und ein Vektorsystem im Allgemeinen. Der Ansatz beruht auf der Tatsache, dass ein solcher Vektor für serielle Transduktionen ("pings") in tTA-exprimierende Verpackungszelllinien verwendet werden kann, um ein Producerklon mit hohem Titer zu erhalten, während der SIN-Phänotyp in nicht-tTA-exprimierenden Zielzellen beibehalten wird.
Zur Erzeugung von pRRLsin36PGKGFPtet°3' wurde zunächst ein 5,6 kB Asp718-BamHI-Fragment aus pRRL5sin18PGKGFP mit einem 303 bp XhoI-Asp718-Fragment aus ptet/splice (GibcoBRL) zusammen mit dem DNA-Linker, bestehend aus den synthetischen Oligonucleotiden 5'-GATCCCGGGC-3' und 5'-TCGAGCCCGG-3' ligiert, um ptetINT zu erzeugen. (pRRL5sin18PGKGFP ist ein Vektor, in dem die untranslatierte Region von pRRLsin18PGKGFP (Zufferey et al., J. Virol (1998), 72: 9873-9880) durch die entsprechende Region aus pHR5 ersetzt wurde. Als Nächstes wurde ein 2,8 kB AflIII-Asp718-Fragment aus ptetINT mit einem 3,1 kB BclI-AflIII-Fragment aus pRRLsin36PGKGFP (Zufferey et al. (1998), supra) zusammen mit dem DNA-Linker, bestehend aus den synthetischen Oligonucleotiden 5'-GTACCCGGGTCGAGTAGGCTT-3' und 5'-GATCAAGCCTACTCGACCCGG-3' ersetzt, um ptet36INT zu erzeugen. Schließlich wurde ein 3,4 kB BamHI-AflIII-Fragment aus ptet36INT mit einem 3,6 kB AflIII-BclI-Fragment aus pRRLsin36PGKGFP ligiert, um pRRLsin36PGKGFPtet°3' zu ergeben.
pCCL7sinCMVGFPpreTet°3' ist ein lentiviraler Transfervektor, der in der 5'-untranslatierten Region maximal deletiert ist, in der die 3'-LTR von pCCL7sinCMVGFPpre mit der tet-responsiven 3'-LTR aus pRRLsin36PGKGFPtet°3 ersetzt wurde. pCCL7sinCMVGFPpreTet°3' wurde durch Ligation eines 3,44 kB AflIII-EcoRI-Fragments aus pCCL7sinCMVGFPpre mit einem 3,5 kB EcoRI-AflIII-Fragment aus pRRLsin36PGKGFPtet°3' erzeugt.
Beispiel 9
Zur Isolierung viraler RNA wurden 0,45 Mikron-Porengröße (Millipore)-filtrierte Überstände, die die Vektorpartikel enthielten, auf einen p24-Gehalt eingestellt und bei 14.000 U/min mikrozentrifugiert, um die Virionen zu pelletieren. Die Überstände wurden abgesaugt, und 50 μg Hefe-RNA wurde jedem Pellet als Träger zugesetzt. Die Gesamt-RNA wurde aus den Proben unter Verwendung des RNAqueous^TM-Kits (Ambion) nach den Anweisungen des Herstellers isoliert. Das DNA-Sondentemplate für die in-vitro-Transkription wurde durch zwei PCR-Zyklen unter Verwendung eines Lig'nScribe^TM-Kits (Ambion), wie vom Hersteller vorgegeben, hergestellt. Sonde 1 wurde durch PCR unter Verwendung der Primer 5'-CATCAGGCCATATCACCTAGA-3' und 5'-GTACTAGTAGTTCCTGCTATGT-3' und des Plasmids pCMVΔR8.74 zur Amplifikation eines 298 bp-Fragments, das die Nucleotide 1215 bis 1513 von HIV-1 HXB2 (Genbank-Zugangsnummer K03455) enthielt, erzeugt. Die Sonde 2 wurde durch PCR unter Verwendung der Primer 5'-CTGCTGACATCGAGCTTGCTACA-3' und 5'-CTAGCTCCCTGCTTGCCCATACT-3' und des Plasmids pHR2 als Template zur Amplifikation eines 577 bp-Fragments, das die Nucleotide 336 bis 913 von HIV-1 HXB2 (Genbank-Zugangsnummer K03455) enthielt, erzeugt. ³²P-Antisense-Ribosonde wurde dann durch T7 RNA-Polymerase in Gegenwart von [α-³²P]UTP (800 Ci/ml, DuPont NEN^TM) synthetisiert. Volllängensonden wurden gelgereinigt und in 0,5 M Ammoniumacetat, 1 mM EDTA und 0,2 % SDS-Elutionspuffer bei –20 °C gelagert. Der RNA-Protektionsassay wurde unter Verwendung eines HybSpeed^TM-Kits (Ambion) nach den Angaben des Herstellers durchgeführt. rnase A/T1-Gemisch (0,5 U/20 U pro Reaktion, Ambion)-verdaugeschützte Sondenfragmente wurden auf 4 % Polyacrylamid, TBE, und 8 M Harnstoffgelen aufgetrennt. Zur Fragmentgrößenbestimmung wurden ³²P-markierte RNA-Marker auf einer RNA-Century^TM-Templateserie synthetisiert und parallel elektrophoresiert. Zur Bandendetektion und Intensitätsquantifikation wurden die getrockneten Gele entweder Photofilmen oder einer Phosphorbildgebungsplatte (Molecular Dynamics) ausgesetzt.
Beispiel 10
Transfervektorkonstrukte. pHR'CMV-LacZ und pHR'CMV-Luciferase wurden bereits beschrieben (Naldini et al., Science, supra). pHR2 ist ein lentiviraler Transfervektor, in dem der Polylinker und die stromabwärts gelegenen nef-Sequenzen bis zu der KpnI-Stelle von pHR' mit einem ClaI/SpeI/SnaBI/SmaI/BamHI/SacII/EcoRI-Polylinker ersetzt wurden. pHR2 wurde durch Ersatz des 3,7 kB ClaI-SacI-Fragments von pHR'CMV-LacZ mit einem 607 bp ClaI-SacI-Fragment, das durch PCR unter Verwendung von pHR'CMV-LacZ als Template mit den Oligonucleotidprimern 5'-CCATCGATGGACTAGTCCTACGTATCCCCGGGGACGGGATCCGCGGAATTCCGTTTAAGACCAATGAC-3' und 5'-TTATAATGTCAAGGCCTCTC-3' und anschließenden Abbau mit ClaI und SacI erzeugt wurde, erzeugt.
pHR2PGK-NGFR, pHR2CMV-NGFR und pHR2MFG-NGFR sind lentivirale Transfervektoren, in denen die verkürzten affinitätsarmen NGF-Rezeptor (Bordignon et al., Hum. Gene Therap. (1995), 6: 813-819) Transgene unter der Kontrolle des murinen PGK, des menschlichen CMV bzw. des Moloney Leukämie-Viruspromotors in den Polylinker von pHR2 insertiert wurden. Das Transgen pHR2PGK-NGFR codiert keine Intronsequenzen, während der pHR2CMV-NGFR-Vektor das Intron aus dem Plasmid pMD (Ory et al., supra) einschließt, und der pHR2MFG-NGFR-Vektor das MLV-Intron aus MFG-S (Ory et al., supra) enthält.
pRRL, pRLL, pCCL und pCLL sind lentivirale Transfervektoren, die das chimäre Rous-Sarcoma-Virus(-RSV)/HIV oder CMV/HIV-5`LTRs und Vektor-Grundgerüste enthalten, in denen die SV40-Polyadenylierung und die (Enhancer-losen) Replikationsursprungssequenzen stromabwärts der HIV-3'LTR eingeschlossen wurden, die den größten Teil der menschlichen Sequenz ersetzen, wobei sie aus der HIV-Integrationsstelle zurückbleibt. In pRRL sind der Enhancer und Promotor (Nucleotide –233 bis –1 relativ zu der transkriptionalen Startstelle: Genbank-Zugangsnummer J02342) aus der U3-Region von RSV mit der R-Region von HIV-1-LTR verknüpft. In pRLL sind die RSV-Enhancer-Sequenzen (Nucleotide –233 bis –50) sind mit der Promotor-Region (von Position –78 Bp relativ zu der transkriptionalen Startstelle) von HIV-1 verknüpft. In pCCL wurden der Enhancer und Promotor (Nucleotide –673 bis –220) relativ zu der transkriptionalen Startstelle, Genbank-Zugangsnummer K03104) von CMV mit der R-Region von HIV-1 verknüpft. In pCLL wurde der CMV-Enhancer (Nucleotide –673 bis –220) mit der Promotor-Region (Position –78 Bp) von HIV-1 verknüpft.
pHR2hPGK-GFP, pCCLhPGK-GFP, pCLLhPGK-GFP, pRRLhPGK-GFP, pRLLhPGK.GFP sind lentivirale Transfervektoren, die die codierende Region des verstärkten grün fluoreszierendenProteins (70 Bp BamHI-NotI-Fragment aus pEGFP-1(Clontech)) unter der Kontrolle des menschlichen PGK-Promotors (Nucleotide 5-516, Genbank-Zugangsnummer M11958), inseriert in die Polylinker-Region eines jeden parentalen Vektors, enthalten. pRRLGFP wurde durch Deletion des XhoI-BamHI-Fragments, das den PGK-Promotor aus pRRLhPGK-GFP enthält, erhalten.
pRRLhPGK.GFP.SIN-18 ist ein Vektor, in dem die 3'LTR-Sequenzen von –418 bis –18 relativ zu der U3/R-Grenze aus pRLLhPGK.GFP deletiert wurden.
Verpackungskonstrukte. Das tat-defekte Verpackungskonstrukt pCMVΔR8.93 wurde durch Austausch eines EcoRI-SacI-Fragments aus dem Plasmid R7/pneo(–) (Feinberg et al., PNAS (1991) 88: 4045-4049) mit dem entsprechenden Fragment von pCMVΔR8.91, einem bereits beschriebenen Gag-, Pol-, Tat- und Rev-exprimierenden Plasmid (Zufferey et al., 1997, supra), erhalten. Das Fragment besitzt eine Deletion, die das Startcodon des tat-Gens und eine durch Insertion eines MluI-Linkers in die Bsu36I-Stelle erzeugte Rasterverschiebung aufweist, wie zuvor beschrieben. pCMVΔR8.74 ist ein Derivat von pCMVΔR8.91, in dem ein 133-Bp-SacII-Fragment, das eine Spleiß-Donorstelle enthält, aus der CMV-abgeleiteten Region stromaufwärts von den HIV-Sequenzen zur Optimierung der Expression deletiert wurde.
PMDLg/p ist ein CMV-angetriebenes Expressionsplasmid, das nur die gag/pol-codierenden Sequenzen aus HIV-1 enthält. Zuerst wurde pkat2Lg/p durch Ligation eines 4,2-kb-ClaI-EcoRI-Fragments aus pCMVΔR8.74 mit einem 3,3-kb-EcoRI-HindIII-Fragment aus pkat2 (Finer et al., supra) und einem 0,9-kb-HindIII-NcoI-Fragement aus pkat2 zusammen mit einem NcoI-ClaI-Linker, bestehend aus den synthetischen Oligonucleotiden 5'-CATGGGTGCGAGAGCGTCAGTATTAAGCGGGGGAGAATTAGAT-3' und 5'-CGATCTAATTCTCCCCCGCTTAATACTGACGCTCTCGCACC-3' konstruiert. Als Nächstes wurde PMDLg/p durch Insertion des 4,25-kb-EcoRI-Fragments aus pkat2Lg/p in die EcoRI-Stelle von pMD-2 konstruiert. pMD-2 ist ein Derivat von pMD.G (Ory et al., supra), in dem das pXF3-Plasmidgerüst von pMD.G durch ein minimales pUC-Plasmidgerüst ersetzt wurde, und das 1,6-kb-VSV.G-codierende EcoRI-Fragment entfernt wurde.
PMDLg/pRRE unterscheidet sich von PMDLg/p durch die Addition einer 374-Bp-RRE-enthaltenden Sequenz aus HIV-1 (HXB2), unmittelbar stromabwärts von den pol-codierenden Sequenzen. Zur Erzeugung von pMDLg/pRRE wurde das 374-Bp-NotI-HindII-RRE enthaltende Fragment von pHR3 in das 9,3-kb-NotI-BglII-Fragment von pVL1393 (Invitrogen), zusammen mit einem HindIII-BglII-Oligonucleotidlinker, bestehend aus den synthetischen Oligonucleotiden 5'AGCTTCCGCGGA-3"und 5'ATCTCCGCGGA-3', zur Erzeugung von pVL1393RRE (pHR3 wurde von pHR2 durch die Entfernung von HIV-encodierenden Sequenzen stromabwärts von den RRE-Sequenzen in pHR2 abgeleitet) ligiert. Eine NotI-Stelle verbleibt an der Verknüpfungsstelle zwischen der gag- und RRE-Sequenz. PMDLg/pRRE wurde dann durch Ligation des 380-Bp-EcoRI-SstII-Fragments aus pV1393RRE mit dem 3,15-kb-SstII-NdeI-Fragment aus pMD-2FIX (pMD-2FIX ist eine menschliche Faktor-IX-enthaltende Variante von pMD-2, die eine SstII-Stelle an dem 3'-Ende des Faktor-IX-Inserts aufweist), des 2,25-kb-NdeI-AvrII-Fragments aus PMDLg/p und des 3,09-kb-AvrII-EcoRI-Fragments aus pkat1Lg/p, konstruiert (Finer et al., supra).
PRSV-Rev und pTK-Rev (großzügiges Geschenk von T. Hope, Salk Institute) sind revcDNA-exprimierende Plasmide, in denen die verknüpften zweiten und dritten Exons von HIV-1-rev unter der transkriptionalen Kontrolle entweder von RSV-U3 bzw. des Herpes simplex-Virus1-Thymidinkinase-Promotors stehen. Beide Expressionsplasmide verwenden Polyadenylierungssignalsequenzen aus der HIV-LTR in einem pUC118-Plasmid-Gerüst.
Vektorproduktion und Assays. Die Vektoren wurden durch vorübergehende Transfektion in 293T-Zellen, wie bereits beschrieben (Naldini et al., PNAS, supra), mit den folgenden Modifikationen hergestellt. Etwa 5 × 10⁶ 293T-Zellen wurden in 10-cm-Schalen 24 h vor der Transfektion in IMDM-Kulturmedien (JRH Biosciences) mit 10 % FBS und Penicillin (100 IU/ml) und Streptomycin (100 μg/ml) in einem 5%-CO₂-Inkubator ausgesät, und das Kulturmedium wurde 2 h vor der Transfektion ausgetauscht. Insgesamt wurden 20 μg Plasmid-DNA zur Transfektion einer Schale verwendet, 3,5 μg des Envelope-Plasmids pMD.G, 6,5 μg Verpackungsplasmid und 10 μg Transfervektorplasmid pro Schale verwendet. Das Präzipitat wurde durch Zugabe der Plasmide zu einem Endvolumen von 450 μl von 0,1 X TE (TE: 10 mM Tris pH = 8,0, 1 mM EDTA) und 50 μl 2,5 M CaCl₂, gutes Mischen und anschließendes Zutropfen von 500 μl 2X HBS (281 mM NaCl, 100 mM HEPES, 1,5 mM Na₂HPO₄ pH = 7,12) unter Verwirbeln und unmittelbare Zugabe des Präzipitats zu den Kulturen gebildet. Das Medium (10 ml) wurde nach 14-16 h ausgetauscht, und das konditionierte Medium wurde nach weiteren 24 h gesammelt, durch niedrige Geschwindigkeitszentrifugation geklärt und über 0,22 μm Celluloseacetat-Filter filtriert. Für in vitro Experimente wurden serielle Verdünnungen von frisch geerntetem konditioniertem Medium zur Infektion von 10⁵ Zellen in einer 6-Well-Platte in Gegenwart von 8 μg/m1 Polybren verwendet. Die virale p24-Antigenkonzentration wurde durch Immunabfang (Alliance, DuPont-NEN) bestimmt. Vektorchargen wurden auf das Fehlen von Replikationskompetentem Virus durch Aufzeichnen der p24-Antigenexpression in dem Kulturmedium von transduzierten SupT1-Lymphozyten für drei Wochen getestet. In allen getesteten Fällen war p24 nicht nachweisbar (Nachweisgrenze 3 pg/ml), nachdem das eingegebene Antigen aus der Kultur beseitigt worden war.
Northern-Blot-Analyse. Gesamt-RNA wurde aus 1 – 2 × 10⁷ Zellen, die bei Konfluenz unter Verwendung von RNAsolB, wie vom Hersteller vorgeschlagen, geerntet wurden, isoliert. Etwa 10-20 μg RNA wurden pro Vertiefung auf 1%-Agarosegele unter Verwendung von NorthernMax-(Ambion, Austin TX)-Reagenzien, wie vom Hersteller beschrieben, geladen. Die Übertragung erfolgte auf Zetabind-Membran (Cuno Inc., Meridien CT) entweder durch Kapillartransfer oder durch Druckblotten (Stratagene). ³²P-markierte Sonden wurden durch regelloses Priming hergestellt.
Intrazerebrale Injektion von Vektoren. 12 männliche Fischer-344-Ratten, die ungefähr 220 g wogen, wurden von Harlan Sprague-Dawley (Indianapolis, IN) erhalten und mit Zugang ad libitum zu Nahrung und Wasser über einen 12-h-Licht/Dunkel-Zyklus in Käfigen gehalten und wurden gemäß den veröffentlichten NIH-Richtlinien gehalten und behandelt. Alle operativen Vorgänge wurden mit den Ratten unter Isoflurangas-Anästhesie unter Verwendung aseptischer Vorgehensweisen durchgeführt. Nach Anästhesie einer Ratte in einer „Einschlafkiste" wurde sie in eine kleine Tier-Stereotaxievorrichtung (Kopf Instruments, Tujunga, CA) unter Verwendung von Ohrstäben, die die tympanische Membran nicht brechen, verbracht. Die Ratten wurden zufällig in eine Kontroll- und vier Behandlungsgruppen aufgeteilt. Nachdem die Ratten in den Stereotaxierahmen gesetzt wurden, wurden 2 μl lentiviraler Vektor, konzentriert durch Ultrazentrifuation bei 50000 × g für 140 min bei 20° C (Naldini et al., PNAS, supra) in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS), nacheinander in beiden Hemisphären über 4 min mit einer Geschwindigkeit von 0,5 μl pro Minute (AP 0,0, LAT ± 3,0, DV –5,5, –4,5, –3,5, wobei die Einschnittstange auf –3,3 mm unterhalb der Intraaurallinie eingestellt war; Paxinos & Watson, „The Rat Brain In Stereotaxic Coordinates" (1987) Academic Press, SD) unter Verwendung eines kontinuierlichen Infusionssystems in das Striatum injiziert. Während der Injektion wurde die Nadel alle 40 sec langsam in dorsale Richtung (3 mm Gesamtrückzug) angehoben. Eine Minute nach Aufhören der Injektion wurde die Nadel noch weitere 1 mm zurückgezogen und noch 4 Minuten an Ort und Stelle belassen, bevor sie langsam aus dem Gehirn herausgezogen wurde.
Histologie. Einen Monat nach der Vektorinjektion wurde jedes Tier tief mit i.p. Pentobarbital anästhesiert und über die Aorta mit steriler PBS und anschließend mit eiskalter 4%-Paraformaldehyd-(PFA)-Perfusion perfundiert. Die Gehirne wurden aus der Gehirnschale entfernt, durch Eintauchen für 24 h in 4 % PFA nachfixiert und dann 3-4 Tage lang in eine 30%-Saccharose/PBS-Lösung überführt, bis die Gehirne auf den Boden der Behälter absanken. Die Gehirne wurden dann auf Trockeneis eingefroren, und 40 um dicke koronale kranzförmige Schnitte wurden auf einem Gleitmikrotom geschnitten. Die Schnitte wurden in Serien in Mikrotiter-Wellplatten gesammelt, die eine auf Glycerin basierende Antigefrierlösung enthielten, und sie wurden bei –30° C bis zur weiteren Bearbeitung gehalten. Die Immunzytochemie wurde unter Befolgung der allgemeinen, bereits beschriebenen Verfahrensweise (Sternberger et al., J. Histochem. Cytochem. (1970) 18: 315- 333) durchgeführt. Nach mehreren PBS-Spülungen und einer Inkubation in 3 % Wasserstoffperoxid wurden die Schnitte in ein 3 % normales Ziegenserum (NGS) verbracht. Die Schnitte wurden dann in dem primären Anti-GFP-Antikörper (1:1000, Clontech, Palo Alto, CA) in 1 % NGS und 0,1 % Triton X-100 über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dem Spülen wurden die Schnitte in den biotinylierten Kaninchen-Anti-Ziegen-Sekundär-Antikörper (Vector, Burlingame, CA) 3 h inkubiert. Nach dem Spülen wurden die Schnitte mit Meerrettichperoxidase-Streptavidin inkubiert und anschließend unter Verwendung des Purple Chromagen Kit VIP (Vector) umgesetzt, fixiert, getrocknet, dehydratisiert und auf einen Objektträger verbracht.
Tat ist zur Produktion von Vektor mit einer wirksamen Transduktionsaktivität erforderlich. Um die Rolle von Tat bei der Produktion von transduzierenden Partikeln zu untersuchen, wurde die Expression aus lentiviralen Vektoren zuerst durch Northern-Analyse überprüft. Die Muster de RNAs, die durch Transfervektoren induziert wurden, in denen das Transgen durch einen internen PGK-, CMV- oder retroviralen MFG-Promotor angetrieben wurde, wurden sowohl in Producer- als auch Zielzellen untersucht. In transfizierten 293T-Zellen erfolgte die Expression hauptsächlich aus dem internen Promotor. Wenn ein Verpackungskonstrukt, das sowohl Tat als auch Rev exprimierte, co-transfiziert wurde, wurde eine drastische Verstärkung der Transkription aus der LTR festgestellt, mit einer Akkumulation von ungespleißter Vektor-RNA. In Zellen, die mit den Vektoren transduziert wurden, d. h., in Abwesenheit von Tat und Rev, wurde die Transkription aus der LTR fast vollständig unterdrückt, die restlichen Transkripte durchliefen ein Spleißen, und der interne Promotor war für den größten Teil der Expression verantwortlich.

Anschließend wurde ein Verpackungsplasmid, das zwei Mutationen in tat (pCMVΔR8.93) trägt, konstruiert. Die erste Mutation ist eine Deletion des T in dem ATG-Startcodon des tat-Gens, die zweite eine Insertion eines MluI-Linkers, der ein Translationsstoppcodon nach Rest 46 des Tat-Proteins produziert. Diese Änderungen tragen zu einem tat-defekten Phänotyp von HIV-1 bei (Feinberg et al., supra). Nach Transfektion der Kontrolle oder der tat-defekten Verpackungskonstrukte in 293T-Zellen wurden vergleichbare Ausbeuten von Vektorpartikeln in dem Kulturmedium gewonnen, die durch das Gag-p24-Antigen getestet wurden (siehe Tabelle 2). Eine solche Tat-Unabhängigkeit wurde aus dem Ersatz der HIV-LTR durch den konstitutiven CMV-Promotor in dem Verpackungskonstrukt erwartet. Allerdings wiesen die in Abwesenheit von Tat produzierten Partikel eine dramatisch herabgesetzte Transduktionsaktivität auf (Tabelle 3): 5 bis 15 % derjenigen der Teilchen, die durch das Tat-positive Kontroll-Verpackungskonstrukt produziert wurden. TABELLE 2. GFP-Transduktion in HeLa-Zellen durch lentivirale Vektoren, die durch Transferkonstrukte mit Wildtyp- oder 5'-chimärer LTR und mit Verpackungskonstrukten mit oder ohne ein funktionelles tat-Gen hergestellt wurden

Transferkonstrukt	Tat-Gen im Verpackungskonstrukt	Endpunkt-Titer (T.U./ml)	p24-Antigen (ng/ml)	Transduktions-Effizient (T.U./ng p24)
pHR2	+	4,1 × 10⁶	297	13.805
pHR2	–	2,4 × 10⁵	545	440
PRRL	+	1,3 × 10⁷	546	23.810
PRRL	–	4,9 × 10⁶	344	14.244

Vektoren, die eine PGK-eGFP-Expressionskassette tragen, wurden durch die Transfektion des angegebenen Transfer- und Verpackungsplasmids plus des pMD.G-Plasmids in 293T-Zellen produziert. Serielle Verdünnungen von Transfektionsmittel-konditioniertem Medium wurden mit HeLa-Zellen inkubiert, und die Kulturen wurden nach 6 Tagen bewertet. Zur Berechnung des Endpunkt-Titers wurden Proben aus dem linearen Teil der Vektor-Dosis-Antwortkurve selektiert. Der Durchschnitt aus zwei Bestimmungen ist für ein repräsentatives Experiment für fünf durchgeführte Bestimmungen angezeigt. T.U. bedeutet Transduktionseinheiten. TABELLE 3. Transduktionsaktivität von lentiviralen Vektoren, hergestellt mit und ohne ein funktionelles tat-Gen in dem Verpackungskonstrukt

		Transduktionsaktivität (Transduktionseinheit/ng p24)
Transfervektor	Zielzellen	mit Tat im Verpackungskonstrukt	ohne Tat im Verpackungskonstrukt
pHR'CMV-LacZ	293T	1.056 ± 54^a	152 ± 26^a
pHR2PGK-3GFP	HeLa	5.666^b	384^b
pHR'CMV-Luciferase	HeLa	3.000 ± 152^c	152 ± 26^c
pHR'CMV-Luciferase	HeLa-tat	3.777 ± 348^c	486 ± 59^c
pHR'-Luciferase^d	HeLa	46 ± 1^c	0,3 ± 0,003^c
pHR'-Luciferase^d	HeLa-tat	3.296 ± 276^c	174 ± 75^c

^a: LacZ-Transduktion wurde durch X-Gal-Färbung und durch Expression der Anzahl von blauenzellkolonien als eine Funktion der Menge an p24-Antigen in dem Inoculum bestimmt
^b: Die eGFP-Transduktion wurde durch FACS-Analyse, Multiplikation des Bruchteils an fluoreszenten Zellen durch die Anzahl an infizierten Zellen und Expression des Ergebnisses als Funktion der Menge an p24-Antigen in dem Inoculum bestimmt
^c: Die Luciferase-Transduktion wurde durch die Lumineszenz in relativen Einheiten über dem Rauschen (RLU) von 50 μl Kulturextrakt und Division der Anzahl von RLU × 10^–2 durch die Anzahl von ng p24-Antigen in dem Inoculum gemessen
^d: Ohne internen Promotor

Vektoren wurden durch die Transfektion des angegebenen Transfervektors, ein Verpackungskonstrukt entweder mit (pCMVΔR8.91) oder ohne (pCMVΔR8.93) ein funktionelles tat-Gen und des pMD.G-Plasmid in 293T-Zellen produziert. Serielle Verdünnungen des Transfektionsmittel-konditionierten Mediums wurden mit den angegebenen Zellen inkubiert, und die Kulturen wurden nach 3 Tagen bewertet. Zur Berechnung der Transduktionsaktivität wurden die Proben aus dem linearen Teil der Vektor-Dosis-Antwortkurve selektiert. Der Mittelwert ± Fehler von drei Bestimmungen ist für a, c, d gezeigt; und der Mittelwert für zwei Bestimmungen ist für b gezeigt.
Der tat-defekte Phänotyp wurde getestet, um zu bestimmen, ob der Phänotyp durch Komplementierung in den Zielzellen gerettet werden konnte (Tabelle 3). HeLa-tat-Zellen, eine Zelllinie, die Tat aus der HIV-1-LTR exprimiert (Felker et al., J. Virol. (1990) 64: 3734-3741) wurden durch Vektoren transduziert, die mit oder ohne Tat produziert wurden. Die Expression von Tat in Zielzellen kompensierte nicht den Verlust der Transduktionseffizienz des ohne Tat produzierten Vektors.
Wie aus der Northern-Analyse erwartet, ergab die funktionelle Inaktivierung des tat-Gens eine geringere Abundanz von Vektor-RNA in Producerzellen. Dies wurde durch die Abnahme der Luciferaseaktivität in Zellen angezeigt, die einen Luciferasevektor ohne internen Promotor produzierten. Dort spiegelt die Transgenexpression direkt die Abundanz von Transkripten wider, die aus der LTR stammten. 293T-Zellen, die Luciferasevektoren ohne Tat produzierten, besaßen nur 5 % des Luciferasegehalts von Zellen, die den gleichen Vektor mit Tat produzierten (1,0 ± 0,2 × 10⁹ RLU/Schale ohne Tat; 20,2 ± 0,7 × 10⁹ RLU/Schale mit Tat). Das Verhältnis entsprach sehr genau demjenigen, das in Zellen festgestellt wurde, die mit einem Typ von Vektor im Verlauf des gleichen Experiments transduziert wurden (siehe Tabelle 3), was nahelegt, dass die Abundanz von Vektor-RNA in Producerzellen ein Geschwindigkeits-begrenzender Faktor bei der Transduktion durch lentivirale Vektoren ist.
Es konnte der Schluss gezogen werden, dass Tat in Producerzellen zur Aktivierung der Transkription aus der HIV-LTR und zur Erzeugung von Vektorpartikeln mit einer hohen transduzierenden Aktivität erforderlich ist.
Die Benötigung von at wird durch Anordnen eines konstitutiven Promotors stromaufwärts von dem Transfervektor aus festgelegt. Wenn die einzige Funktion von Tat die Transaktivierung der Vektor-Transkription aus der LTR ist, sollte der tat-defekte Phänotyp durch Anordnen eines starken konstitutiven Promotors stromaufwärts von dem Vektortranskript gerettet werden. Drei transkriptionale Domänen wurden in dem HIV-Promotor in der U3-Region der LTR identifiziert: die Kern- oder Basisdomäne, der Enhancer und die modulatorische Domäne (Luciw, supra). Die Transkription beginnt an der U3/R-Grenze, wobei das erste Nucleotid von R mit 1 nummeriert wird. Der Kernpromotor enthält Bindungsstellen für das TATA-Bindungsprotein (–28 bis –24) und SP-1 (drei Bindungsstellen zwischen –78 bis –45). Der Enhancer enthält zwei Bindungsstellen für NF-κB, was mit einer Bindungsstelle für NFATc überlappt (–104 bis –81). Die modulatorische Domäne enthält Bildungsstellen für mehrere zelluläre Faktoren, einschließlich AP-1 (–350 bis –293), NFAT-1 (–256 bis –218), USF-1 (–166 bis –161), Ets-1 (–149 bis –141) und LEF (–136 bis –125). Ein Panel von 5'chimären Transferkonstrukten, die Substitutionen von entweder der gesamten oder einem Teil der U3-Region der 5'LTR trugen, wurde erzeugt. Sämtliche Substitutionen wurden vorgenommen, um die Transkriptionsinitiationsstelle von HIV zu konservieren. Partielle Substitutionen verbanden neue Enhancer-Sequenzen mit dem Kernpromotor der HIV-LTR (–78 bis 1), wobei volle Substitutionen auch den Promotor ersetzten. RLL- und RRL-Vektoren trugen den Enhancer bzw. den Promotor des Rous-Sarcoma-Virus (RSV); und CLL- und CCL-Vektoren trugen den Enhancer oder den Enhancer und Promotor des menschlichen CMV.

pHR2- und 5'-chimäre Kontroll-Transferkonstrukte, die eine PGK-eGFP-Expressionskassette trugen, wurden durch Transfektion von 293T-Zellen mit Kontroll- oder tat-defekten Verpackungskonstrukten getestet, und die Expression des eGFT-Transgens wurde durch FACS ausgewertet. Das chimäre RRL-Konstrukt ergab ein höheres eGFP-Expressionsniveau als der pHR2-Vektor, was die konstitutive transkriptionale Aktivität der neuen Sequenz wiedergibt. Interessanterweise zeigte der chimäre Vektor auch eine Aufregulation durch Tat, wie durch die erhöhte eGFP-Expression von Zellen gezeigt wird, die mit dem Kontroll-Verpackungskonstrukt co-transfiziert waren. Die Tat-Aufregulation erwies sich als eine direkte Wirkung der Transfektion eines pRRL-eGFP-Vektors, dem ein interner Promotor fehlt, mit Kontroll- oder tat-defekten Verpackungskonstrukten und Analysieren der GFP-Expression durch FACS. Vergleichbare Ergebnisse wurden mit den anderen chimären LTR-Vektoren erhalten. Vektorpartikel wurden dann aus den transfizierten Producerzellen gesammelt und auf Transduktion von eGFP in HeLa-Zellen und menschlichen primären Lymphozyten (PBL) getestet. Wie in Tabelle 4 gezeigt, wiesen sämtliche Vektoren eine wirksame Transduktionsaktivität auf, wie durch Endpunkt-Titration auf HeLa-Zellen oder eine maximale Transduktionsfrequenz von PBL getestet. Der Vektor, der durch die pRRL-Chimäre produziert wurde, war so wirksam wie derjenige, der von dem pHR2-Konstrukt produziert wurde und wurde zum Testen der Transduktion unabhängig von Tat selektiert. Wie in Tabelle 2 gezeigt, ergab das pRRL-Konstrukt den Vektor von nur leicht herabgesetzter Transduktionsaktivität (60 %), wenn das Verpackungskonstrukt tat-defekt war. Die Restwirkung von Tat auf die Transduktion war in Übereinstimmung mit der Fähigkeit von Tat zur Aufregulierung der Transkription aus der chimären LTR. Die Tat-Aufregulierung erwies sich als eine direkte Wirkung der Transfektion eines pRRL-eGFP-Vektors, dem ein interner Promotor fehlt, mit Kontroll- oder tat-defekten Verpackungskonstrukten und Analysieren der GFP-Expression durch FACS. TABELLE 4: GFP-Transduktion durch lentivirale Vektoren, die durch Transferkonstrukte mit Wildtyp- oder einer 5'-chimären LTR hergestellt wurden

TransferKonstrukt	Endpunkt-Titer auf HeLa-Zellen T.U./ml)^a	Transduktionseffizienz auf menschliche Lymphozyten (% positive Zellen)^b
pHR2	2,3 × 10⁷	30%
PCCL	4,6 × 10⁶	14%
PCLL	7,9 × 10⁶	18%
PRRL	1,8 × 10⁷	29%
PRLL	8,9 × 10⁶	18%

^a: Der Endpunkt-Titer wurde durch Multiplizieren des Prozentsatzes an fluoreszierenden Zellen für die Vektorverdünnung und der Anzahl an infizierten Zellen bestimmt. Die Proben wurden aus dem linearen Teil der Vektor-Dosis-Antwortkurve selektiert
^b: Prozentsatz an fluoreszenten menschlichen peripheren Blutlymphozyten nach Infektion von 10⁶ Zellen mit 1 ml Vektor-enthaltendem Medium. Primäre menschliche T-Lymphozyten wurden isoliert und wie bereits beschrieben (Finer et al., supra) transduziert.

Vektoren, die eine PGK-eGFP-Expressionskassette trugen, wurden durch Transfektion des angegebenen Transferkonstrukts, des Verpackungsplasmids pCMVΔR8.91 und des Envelope-Plasmids pMD.G in 293T-Zellen produziert. Fluoreszente Zellen wurden durch FACS-Analyse 6 Tage nach der Transduktion bewertet. Der Durchschnitt von zwei Bestimmungen ist für ein repräsentatives Experiment von drei durchgeführten Experimenten gezeigt.
Die Verwendung des chimären LTR-Konstrukts gestattete die Entfernung von Tat aus dem Verpackungssystem mit einem möglichst geringen Verlust in der Transduktionseffizienz des Vektors in vivo. Um die Vektorleistung in der stärker provokativen Anordnung der in vivo Abgabe an Gehirnneuronen zu testen, wurden Vektorstämme mit hohem Titer aus pHR2- und pRRL-Konstrukt mit und ohne Tat erzeugt. Die vier Stämme von eGFP-Vektor wurden durch p24-Antigen auf den Partikelgehalt abgestimmt und bilateral in das Neostriatum von Gruppen aus drei erwachsenen Ratten injiziert. Die Tiere wurden nach einem Monat getötet und serielle Schnitte des Gehirns wurden auf eGFP-Fluoreszenz analysiert und durch Antikörper gegen eGFP immungefärbt. Die in vivo erhaltenen Ergebnisse stimmten mit den in vitro Messwerten überein. Der durch das pHR2-Konstrukt produzierte Vektor erreichte nur eine signifikante Transduktion der Neuronen bei Verpackung in Gegenwart von Tat. Der durch die pRRL-Chimäre produzierte Vektor war genauso wirksam bei Herstellung mit oder ohne Tat. Die Transduktion erstreckte sich über den größten Teil des Striatums und erreichte eine sehr hohe Dichte von positiven Zellen in den Schnitten, die der Injektionsstelle am nächsten lagen. Es waren mit der Ausnahme eines kleinen linearen Grindes, der die Nadelspur markierte, keine Anzeichen von Pathologie durch Hämatoxylin- und Eosin-Anfärbung der Schnitte in dem injizierten Gewebe nachweisbar.
Die Ergebnisse stellen den Beweis bereit, dass Tat für eine wirksame Transduktion durch einen lentiviralen Vektor entbehrlich ist.
Ein konditionales Split-Genom-Verpackungssystem. Die Möglichkeit der Deletion des durch das tat-Gen hervorgebrachten Aufbaus einer anderen Verpackungskomponente des HIV-Vektorsystems, in dem zwei getrennte, nicht-überlappende Expressionsplasmide, eines für das gag-pol-Gen und das andere für das rev-Gen vorhanden waren, wurde verwendet. Die gag- pol-Leseraster wurden innerhalb des Kontextes der MD-Kassette exprimiert, die den CMV-Promotor und eine intervenierende Sequenz und die menschliche β-Globin-poly(A)-Stelle einsetzt (Ory et al., supra). Sämtliche HV-Sequenzen stromaufwärts des gag-Initiationscodons wurden entfernt, und der Leader wurde modifiziert, um optimal auf die Kozak-Konsensussequenz für die Translation zu passen. Das Konstrukt exprimierte allerdings bei alleiniger Transfektion in 293T-Zellen fast kein p24-Antigen. Diese Feststellung stimmt mit der bereits beschriebenen Gegenwart von cis-repressiven oder inhibitorischen Sequenzen in dem gag/pol-Gen (Schneider et al., J. Virol (1997) 71: 4892-4903; und Schwartz et al., J. Virol. (1992) 66: 7176-7182) überein. Das HIV-RRE-Element wurde anschließend stromabwärts von dem pol-Gen inseriert, und das resultierende Plasmid wurde mit einem rev-Expressionsvektor co-transfiziert (Tabelle 5).
Hohe Werte der p24-Antigenproduktion wurden festgestellt, wobei die höchsten Ausbeuten erhalten wurden, wenn rev durch einen RSV-Promotor angetrieben wurde. Wenn das gag/pol- und das rev-Konstrukt mit dem RRL-chimären Transfervektor und dem VSV-G-exprimierenden Plasmid co-transfiziert wurden, wurde ein Vektor mit hohem Titer in dem Kulturmedium erhalten. Sowohl die Ausbeute an Teilchen als auch ihre Transduktionseffizienz waren denjenigen ähnlich, die mit bisherigen Versionen des Systems erhalten wurden.

Die Northern-Analyse von Producerzellen bestätigte, dass ungespleißte genomische Vektor-RNA nur in Gegenwart von Rev akkumulierte. Somit sind sowohl die Expression der gag-pol-Gene als auch die Akkumulation von verpackungsfähigen Vektortranskripten von der trans-Komplementation durch ein getrenntes Rev-Expressionskonstrukt abhängig. Ein solches konditionales Verpackungssystem stellt ein wichtiges Sicherheitsmerkmal bereit, das für onkoretrovirale Vektoren nicht zur Verfügung steht. TABELLE 5: GFP-Transduktion in HeLa-Zellen durch lentivirale Vektoren, hergestellt durch verknüpfte oder gespaltene Verpackungskonstrukte und ein pRRL-Transferkonstrukt

Verpackungs-Konstrukt	Getrenntes rev Plasmid^a	P24 Antigen (ng/ml)	Endpunkt-Titer (T.U./ml)	Transduktions-Effizienz (T.U./ng p24)
pCMVΔR8.74	–	364	1,07 × 10⁷	29.436
pMDLg/pRRE	–	< 0,1	N.D.^b	N.A.
pMDLg/pRRE	TK-Rev 5 μg	29	6,9 × 10⁵	23.793
pMDLg/pRRE	TK-Rev 12 μg	94	2,02 × 10⁶	21.489
pMDLg/pRRE	RSV-Rev 2,5 μg	774	1,0 × 10⁷	13.495
pMDLg/pRRE	RSV-Rev 5 μg	776	7,6 × 10⁶	9.761
pMDLg/pRRE	RSV-Rev 12 μg	565	4,8 × 10⁶	8.495

^a: Der Promotor, der die Expression einer synthetischen rev-cDNA antreibt und die Menge an transfiziertem Plasmid sind angegeben Vektoren, die eine PGK-eGFP-Expressionskassette trugen, wurden durch die Transfektion eines selbst-inaktivierenden pRRL-Transferkonstrukts (mit einer Deletion in der 3'LTR 53) der angegebenen Verpackungs- und rev-Plasmide und des pMD.G-Plasmids in 293T-Zellen produziert. Serielle Verdünnungen des mit Transfektionsmittel konditionierten Mediums wurden mit HeLa-Zellen inkubiert, und die Kulturen wurden nach 6 Tagen bewertet. Zur Berechnung des Endpunkt-Titers wurden Proben selektiert aus dem linearen Teil der Vektor-Dosis-Antwortkurve. Der Durchschnitt von zwei Bestimmungen ist für ein repräsentatives Experiment von drei durchgeführten Bestimmungen gezeigt.
^b: N.D.: nicht nachgewiesen. Die Nachweisgrenze des Tests betrug 10² T.U./ml.

BEISPIEL 11
Bei einer anderen Ausführungsform der Erfindung ist pRRLsin36PGKGFPtet°3' ein Lentivirus-Vektor, in dem die 3'LTR ein Hybrid tet°/HiV-U3 enthält. Das 3'-U3 besteht aus sieben Kopien des tet-Operators (teto7), verknüpft mit den 36 3'-Nucleotiden des HIV-U3, einschließlich der „TATA"-Box. pRRLsin36PGKGFPtet°3' ist ein konditionaler selbstinaktivierender (SIN) Vektor, der, nach Transduktion, nur in Gegenwart des tat-Transaktivators (tta) zur Expression von verpackungsfähigen Volllängen-Vektortranskripten aktiviert werden kann – beispielsweise nach Transduktion einer geeigneten tta-exprimierenden Verpackungszelllinie. Nach Transduktion einer Zelle, die tta nicht exprimiert, ist das resultierende 5'teto7/HIV-U3 im Wesentlichen nicht funktionell, auch in Gegenwart von HIV-tat, was die Möglichkeit der Mobilisierung des Vektor-Genoms signifikant herabsetzt. pRRLsin36PGKGFPtet°3' lässt einen SIN-Vektor zu, der seriell in eine tta-exprimierende Verpackungszelllinie transduziert („gepingt") werden kann, um einen Producer-Klon mit hohem Titer zu erhalten, während der SIN-Phänotyp in nicht-tta-exprimierenden Zielzellen beibehalten wird. Zur Erzeugung von pRRLsin36PGKGFPtet°3' wurde ein erstes 5,6-kb-Asp719-BamHI-Fragment aus pRRL5sin18PGKGFP mit einem 303-Bp-XhoI-Asp718-Fragment von ptetsplice zusammen mit einem DNA-Linker, bestehend aus den synthetischen Nucleotiden 5'GATCCCGGGC-3' und 5'TCGAGCCCGG-3'ligiert, um ptetINT zu erzeugen. (pRRL5sin18PGKGFP ist ein Vektor, in dem die untranslatierte Region von pRRLsin18PGKGFP (Zufferey et al., J. Virol. (1998) 72: 9873-9880) mit der entsprechenden Region aus pHR5 ersetzt wurde). Als Nächstes wurde ein 2,7-kp-AflII-Asp718-Fragment aus ptetINT mit einem 3,1-kb-BclI-AflII-Fragment aus pRRLsin36PGKGFP (Zufferey et al. (1998) supra) zusammen mit einem DNA-Linker, bestehend aus den synthetischen Oligonucleotiden 5'-GTACCCGGGTCGAGTAGGCTT-3' und 5'-GATCAAGCCTACTCGACCCGG-3' ligiert, um ptet36INT zu erzeugen. Schließlich wurde ein 3,4-kb-BamHI-AflII-Fragment aus ptet36INT mit einem 3,6-kb-AflII-BclI-Fragment aus pRRLsin36PGKGFP ligiert, um pRRLsin36PGKGFPtet°3' zu ergeben.
Ein weiterer derartiger Vektor ist in der 5'-untranslatierten Region maximal deletiert. Die 3'LTR von pCCL7sinCMVGFPpre wurde mit einer tet-responsiven 3'LTR aus pRRLsin36PGKGFPtet°3' ersetzt. PCCL7sinCMVGFPpreTet°3' wurde durch Ligation eines 3,44-kb-AFLIII-EcoRI-Fragments aus pCCL7sinCMVGFPpre mit einem 3,5-kb-EcoRI-AflIII-Fragment aus pRRLsin36PGKGFPtet°3' erzeugt.
BEISPIEL 12
Um Vektorstämme zu erzeugen, die eine Tetracyclin-induzierbare Promotorsequenz in der U3-Region der mRNA enthielten, wurden die folgenden Plasmide transfiziert: 10 μg pRRLsin36PGKGFP, pRRLhPGKGFP oder pRRLsin36PGKGFPtet; 6,5 μg pMDLg/pRRE; und 3 μg von pMD.G in 293T-Zellen. Die Vektorstämme, die mRNA enthielten, die sich von dem pRRLhPGKGFP-Konstrukt ableitete, dienten als positive (nicht-regulierbare) Kontrolle. Die Vektorstämme, die mRNA enthielten, die sich von dem pRRLsin36PGKGFP-Konstrukt ableiteten, dienten als negative Kontrolle (da bei Transduktion das Kopieren durch Reverse Transkriptase (RT) einer deletierten U3-Region auf die 5'-Region der integrierten Vektor-DNA die resultierende LTR transkriptional nicht-funktionell machen würde).
Überstände der transfizierten Zellen wurden gesammelt, über eine Porengröße von 0,22 Micron filtriert und für Pinging-Runden einer zweiten Generation von Verpackungszelllinien bei MOI = 5 TU/Zelle (Infektionsmultiplizität) pro Ping verwendet. Die Zellen wurden zusätzliche 2 Wochen kultiviert, bei 50 bis 70 % Konfluenz in 10-cm-Schalen aufgeteilt und durch Entfernung des Tetracyclins aus dem Medium auf die Vektorproduktion induziert. Die Überstände der induzierten Promotorzellen wurden wie in 10 angegeben gesammelt und auf p24 und auf Titer getestet. Die Titer-Bestimmung erfolgte durch Infektion von Indikator-HeLa-Zellen mit begrenzten Verdünnungen der getesteten Vektorpräparationen. Der prozentuale Gehalt an transduzierten Zellen wurde durch FACS bewertet.
Wie aus 10 gesehen werden kann, waren Vektorproduktion und Titer von Vektorpartikeln für Tetracyclin-regulierbare Transfervektoren vergleichbar mit denjenigen der Positivkontrolle.
Im Gegensatz zu einer von HIV-1 abgeleiteten LTR wurde transkriptionale Aktivität der LTR eines solchen Vektors in den Zellen, denen tTA fehlte, durch Northern-Analyse von transduzierten Zellen (11) oder, wenn GFP-Expressionsniveaus durch FACS analysiert wurden (12), auch bei Infektion von transduzierten Zellen durch das Wildtyp-HIV nicht nachgewiesen. Gesamt-RNA wurde aus transduzierten Zellen (durch Standardtechniken) extrahiert und mit einer ³²P-markierten DNA-Sonde getestet. Die Sonde wurde durch einen Random Priming Kit (HighPrime^TM, Boehringer Mannheim) unter Verwendung eines BamHI-NotI-Fragments der GFP-codierenden Sequenz des Plasmids pRRLsinPGKGFP als Matrize erzeugt.
Wie in 11 gesehen werden kann, konnte im Gegensatz zu einem Vektor mit einer HIV-1-LTR, sowohl für den Kontroll- als auch den Tetracyclin-responsiven Vektor keine LTR-angetriebene mRNA nachgewiesen werden. Im Einklang mit diesen Ergebnissen zeigte die FACS-Analyse (12) auch, dass die GFP-Expression durch HIV-1-Infektion nur in Zellen aufreguliert war, die durch den Vektor mit einer Volllängen-HIV-1-LTR transduziert waren. Somit behalten solche regulierbaren Vektoren den SIN-Phänotyp bei. Sequenzprotokoll

Claims

Lentivirales Vektorsystem, das ein lentivirales Packungssystem und einen lentiviralen Transfervektor umfasst, wobei das lentivirale Packungssystem (a) einen Vektor, der Gag oder Gag und Pol exprimiert, und (b) einen Vektor, der Rev exprimiert, einschließt; und der lentivirale Transfervektor eine 5'LTR und eine 3'LTR einschließt, die jeweils eine U3-Region einschließen, wobei das gesamte oder ein Teil des regulatorischen Elements der U3-Region des 5'LTR durch ein anderes regulatorisches Element ersetzt ist, das in einer Sängerzelle operabel und für das Lentivirus nicht endogen ist, wobei ein heterologes Gen mit dem regulatorischen Element operabel verknüpft ist, und wobei ein Promotor, der durch tet-Operatorsequenzen kontrolliert wird, anstelle der U3-Region der 3'LTR inseriert ist.
Lentivirales Vektorsystem nach Anspruch 1, wobei der Promotor 7 Kopien der tet-Operatorsequenz (tet°7) umfasst.
Lentiviraler Vektor nach Anspruch 2, wobei die tet°7 mit einem Teil der 3'U3-Region verknüpft ist, die eine TATA-Box-Sequenz einschließt.
Lentivirales Vektorsystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Gen, das Rev codiert, HIV-I-Rev codiert und unter der Kontrolle eines hybriden tet°7/CMV-Promotors steht.
Lentivirales Vektorsystem nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Gen, das Rev codiert, das zweite und dritte Exon von HIV-I-Rev unter der transcriptionalen Kontrolle von einem des RSV U3-Promotors oder des Herpes Simplex Virus 1-Thymidinkinase(HSVtk)-Promotors umfasst.
Lentivirales Vektorsystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Vektor, der Gag oder Gag und Pol exprimiert, ein regulatorisches Responseelement (RRE) umfasst, so dass die Sequenz von RRE Teil der resultierenden mRNA ist.
Lentivirales Vektorsystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei dem Vektor (a) Sequenzen stromaufwärts von Gag, die für den Lentivirus endogen sind, und Sequenzen stromabwärts von env, die für den Lentivirus endogen sind, fehlen und wobei die Gag-Sequenz mit einem konditionalen oder induzierbaren Promotor operabel verknüpft ist.
Lentivirales Vektorsystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei dem Vektor (a) Sequenzen stromaufwärts von Gag, die zu dem Lentivirus endogen sind, und Sequenzen stromabwärts von env, die zu dem Lentivirus endogen sind, fehlen und wobei die pol-Sequenz mit einem konditionalen oder induzierbaren Promotor operabel verknüpft ist.
Lentivirales Vektorsystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dem ein funktionelles tat-Gen fehlt.
Lentivirales Vektorsystem nach Anspruch 9, wobei das tat-Gen deletiert ist.
Lentivirales Vektorsystem nach Anspruch 9, wobei das tat-Gen mutiert ist.
Lentivirales Vektorsystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, welches ein env-Gen aus einem Virus, der anders ist als HIV, umfasst.
Lentivirales Vektorsystem nach Anspruch 12, wobei das env-Gen ein amphotropes Hüllprotein codiert, das die Transduction von menschlichen Zellen erlaubt.
Lentivirales Vektorsystem nach Anspruch 12 oder 13, wobei das env-Gen auf einem Vektor, der anders ist als der Vektor, der Gag oder Gag und Pol exprimiert, vorgesehen ist.
Lentivirales Vektorsystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die HIV-Gene vif, vpr, vpu und nef deletiert sind.
Lentivirales Vektorsystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Lentivirus HIV ist.
Lentivirales Vektorsystem nach Anspruch 16, wobei das HIV HIV-1 ist.
Verwendung des lentiviralen Vektorsystems nach einem der vorhergehenden Ansprüche zur Produktion eines rekombinanten Lentivirus in einer Säugerzelle.