Die
Kreuzkontamination von Zellkulturen allgemein und insbesondere humaner
Zellkulturen ist ein alltägliches
Problem im Labor. Sie führt
zu einer Entwertung der Forschungsergebnisse, gefährdet die
Vergleichbarkeit der Resultate verschiedener Laboratorien, mindert
die Reproduzierbarkeit, die bei der industriellen Herstellung von
Zellinien notwendig ist und kann zu nicht verwertbaren therapeutischen Produkten
führen
(Markovic, O. und Markovic, N., In Vitro Cell Dev. Biol. Anim, 34:
1-8, 1998).
Neben
der Verunreinigung mit anderen Zellen desselben Ursprungs finden
sich, je nach Art der Zelllinien und -kulturen, auch Verunreinigungen
mit Bakterien, Hefen, Schimmelpilze, Parasiten, Mycoplasmen und
Viren. Vielfach können
die Kontaminationen mit Bakterien, Pilzen oder Viren aufgrund einer morphologischen Änderung
der Zellinie, eines veränderten
Wachstums, der Verfärbung
des Kulturmediums oder ähnlicher
Anhaltspunkte ausgemacht werden. Problematisch ist hingegen die
Kontamination mit anderen Zellinien, die morphologisch der Ursprungskultur
sehr ähnlich
sein können.
Die eingeschleppten Zellen können
beispielsweise schneller proliferieren und somit die Ursprungskultur überwachsen,
ohne daß dies
bemerkt wird.
Das
Phänomen
der Kontamination von Zellkulturen wird in zahlreichen Artikeln
beschrieben (Fogh, J., Holmgren, N.B., und Ludovici, P.P., In Vitro, 7:
26-41, 1971; Halton, D.M., Peterson, Jr. W.D., und Hukku, B., In
Vitro Cell Dev. Biol., 19: 16-24, 1983; Hay, R. J., Dev. Biol. Stand.,
76: 25-37; 1992; Markovic, O. und Markovic, N. In Vitro Cell Dev.
Biol. Anim, 34: 1-8, 1998; Dirks, W., MacLeod, R.A., Jager, K., Milch,
H. und Drexler, H.G., Cell Mol. Bio., 45: 841-853, 1999).
Eine
Unterscheidung einzelner Zellinien voneinander ist beispielsweise
durch eine isoenzymatische Charakterisierung möglich, wird aber auch mit Hilfe
zytogenetischer Analysen und des DNA-Fingerprintings durchgeführt (Stacey,
G.N., Bolton, B.J., und Doyle, A., EXS, 58: 361-370, 1991). Des
weiteren wird als zusätzliches
Verfahren zur Identifizierung die Färbung mit fluoreszierenden
Antikörpern
verwendet.
Bei
Studien, die in den Vereinigten Staaten durchgeführt wurden, sind artübergreifende
Kontaminationen und Kontaminationen mit artgleichen Zellen von 17-36%
gefunden worden (Hay, R. J., Dev. Biol. Stand., 76: 25-37; 1992).
Ein
neueres Verfahren zur Individualisierung einzelner Zellinien wurde
von Tanabe beschrieben (Tanabe, H., Nakagawa, Y., Minegishi, D.,
Kurematsu, M., Masui, T. und Mizusawa, H., Tiss. Cult. Res. Commun.,
18: 329-338, 1999). Dort wird mit Hilfe von „short tandem repeat (STR)"-Regionen, die hoch
polymorphe Mikrosatellitenmarker im humanen Genom darstellen, mit
Hilfe der PCR-Amplifikation eine rasche und genaue Zellinienidentifizierung
zur Qualitätskontrolle
ermöglicht.
Die Veröffentlichung
beschreibt die Verwendung neun verschiedener Loci, die zur Analyse
der STR-Profile humaner Zellinien eingesetzt werden.
Neben
der wichtigen Kontrolle etablierter Zellkulturen, die nicht transgen
sind, ist es für
viele Forschungseinrichtungen ebenso wichtig, ein schnelles und
sicheres Nachweisverfahren für
genetisch veränderte
Zellinien zur Verfügung
gestellt zu bekommen, die sich morphologisch praktisch gar nicht und
genetisch nur im Transgen voneinander unterscheiden.
So
werden zur Charakterisierung der Struktur-Funktions-Beziehung von
Proteinen diese in natürlicher
und genetisch veränderter
Form häufig
in Tumorzellinien exprimiert. Die dabei entstehenden neuen Zellklone
unterscheiden sich in der Regel äußerlich
nicht voneinander. Da auf der einen Seite typische Unterschiede
im natürlichen
Genom der Zellinien fehlen und sich auf der anderen Seite die Struktur
der zu untersuchenden, genetisch veränderten Proteine bzw. der für diese
Proteine kodierenden Gene nur minimal unterscheiden, ist es ohne
einen erheblichen Aufwand nicht möglich, diese Zellinien bei
einer Verwechselung zu identifizieren.
Das
bislang verwendete Verfahren, die einzelnen Zellinien zu identifizieren,
bestand darin, ein DNA- oder cDNA-Fragment, das für das zu
untersuchende Protein kodiert, durch (RT)-PCR zu amplifizieren und dann zu sequenzieren.
Nur der genaue Sequenzvergleich ermöglicht es, die geringen Unterschiede
der in die transgene Zellinie eingebrachten Erbinformationen zu
unterscheiden.
In
der Molekularbiologie werden zum Nachweis einer erfolgreichen Transfektion
häufig
neben dem eigentlichen Zielprotein zusätzliche DNA-Sequenzen in die
Zellen integriert. Darunter fallen unter anderem das "green fluorescence
proteine" (GFP), verschiedene
Antibiotika-Resistenzgene
oder Gene, die für
Proteine kodieren, die eine Farbreaktion hervorrufen können.
US 6,153,389 A betrifft
die Markierung von Proben in forensischen Verfahren mittels zusätzlich hinzugefügter DNA;
um die Proben zweifelsfrei nachweisen zu können. Hierbei werden DNA-Moleküle einer
bekannten Sequenz den Proben bei der Entnahme z.B. am Tatort hinzugefügt, entweder
als Plasmid oder als lineare DNA.
Wong
P.C. et al. (Organic data memory using the DNA-approach. Comminications
of the ACM (Januar 2003) 46 (1) 95-98) betrifft eine Verschlüsselung von
Informationen in Form einer DNA, die z.B. in ein Bakterium eingebracht
werden kann. Sinn der Extraktion über PCR ist es, die Information
wieder lesen zu können,
d.h. sie muß sequenziert
werden. Als problematisch können
sich in diesem Zusammenhang natürliche
Mutationen erweisen, da sich der Sinngehalt der Informationen ändern kann.
Auf Seite 98 des Publikation wird von "Wasserzeichen" zum Schutz von Pflanzensorten ebenso
wie für
gefährdete
Arten (anstelle von Mikrochipimplantaten) gesprochen. Auch hierbei
wird von einer Sequenzierung der DNA-Information ausgegangen, um
den Ursprung des Organismus zweifelsfrei klären zu können.
In
der WO 02/21418 A2 wird die Markierung von Organismen und deren
Nachkommen zum Nachweis deren Erzeuger oder zum Nachweis von transgenen
Organismen allgemein beschrieben. Dafür werden DNA-Sequenzen verwendet,
die im Genom des markierten Organismus nicht vorhanden sind. Um
diese nachzuweisen, wird die Polymerasekettenreaktion eingesetzt,
die amplifizierte Sequenz sequenziert und die Sequenzen mit einer
Datenbank verglichen. Weiterhin ist die Hybridisierung mit Microarrays
beschrieben. Vorgesehen ist, daß die
variable, einzigartige DNA-Region von einem Paar Regionen flankiert
wird, an die die PCR-Primer binden. Diese flankierenden Regionen
werden zur Amplifikation benötigt
und aus Sequenzen ausgewählt,
die ebenfalls im Genom des Organismus nicht vorkommen.
DE 199 34 573 C2 beschreibt
allgemein eine Anzahl von Nachweisverfahren von DNA-Markierungen.
Die
im Stand der Technik beschriebenen Verfahren zur Analyse von Zellkulturen
sind zeitaufwendig, kostenintensiv oder im Falle des STR-Multiplex-Systems
auf eine bestimmte Gruppe von Zellkulturen beschränkt und
stellen somit kein universell einsetzbares Identifikationssystem
von tierischen, humanen oder anderen Zellkulturen dar, das schnell, kostensparend
und sicher eingesetzt werden kann.
Aufgabe
der vorliegenden Erfindung ist es daher, ein Erzeugnis (Konstrukt)
und ein Verfahren zur Identifizierung von Zellinien, insbesondere
tierischer und humaner Zellinien, zur Verfügung zu stellen, das eine rasche
und zielgerichtete Identifizierung der zu untersuchenden Zellinien
ermöglicht.
Gelöst werden
die Probleme des Standes der Technik durch ein Erzeugnis (Konstrukt)
und ein Verfahren zur Identifizierung von Zellinien, wobei eine
spezifische Marker-DNA, die mindestens eine Zufallssequenz aufweist,
in die Zellinie eingeführt wird,
und diese Marker-DNA
mit einem geeigneten Verfahren über
Oligonukleotid-Hybridisierung nachgewiesen wird. Hierbei bezieht
sich der Begriff „spezifische
Marker-DNA" auf
einen eigenen, kennzeichnenden DNA-Abschnitt, der in die entsprechende Zellinie
eingeführt
wird. Die Marker-DNA kann neben der/den Zufallssequenz/en, von denen
mindestens eine vorhanden sein muß, auch weitere Sequenzen oder
Gene enthalten.
Unter
einer „Zufallssequenz" im Sinne der Erfindung
ist eine Sequenz zu verstehen, deren Basenabfolge im Genom der Zelle
natürlicherweise
in einem Abschnitt von etwa 20 kb stromaufwärts und stromabwärts der
Integrationstelle der Marker-DNA nicht vorhanden ist. Optimalerweise
ist die Zufallssequenz gar nicht im Genom der Zelle vorhanden. Eine Zelle
kann mehrere Zufallssequenzen enthalten, die nacheinander oder gleichzeitig
in einer bestimmten Kombination in die Zelle eingeführt werden
können.
Bevorzugt
umfaßt
das Verfahren zum Nachweis der Marker-DNA die Verwendung markierter Sonden
oder PCR. Im wesentlichen ist hiermit neben der Verwendung von Sonden
der Einsatz von spezifischen, zur Zufallssequenz komplementären Primern
gemeint, die eine rasche Identification mit Hilfe der Polymerasekettenreaktion
(PCR) zur Verfügung stellen.
Weitere Nachweisverfahren sind im Stand der Technik bekannt und
umfassen unter anderem die Verwendungen verschiedenartig markierter
Sonden oder den Einsatz neuerer technischer Verfahren, die dazu
geeignet sind, eine Zufallssequenz entsprechend der Erfindung nachzuweisen.
Die
Marker-DNA umfaßt
bevorzugt zwischen 10 und 500 Nukleotide. Besonders bevorzugt umfaßt die Marker-DNA
zwischen 15 und 60 Nukleotide. Die erfindungsgemäße Zufallssequenz kann mit
der Marker-DNA identisch sein, oder aber auch nur einen Teil davon
darstellen.
In
einer bevorzugten Ausführungsform
ist mindestens die Zufallssequenz der eingeführten Marker-DNA gegenüber dem
Zellgenom einzigartig. Dabei sollen aber aufeinanderfolgende Markierungsschritte
von Zellen nicht ausgeschlossen sein.
Alternativ
kann eine Kombination von mindestens zwei Marker-DNA-Sequenzen eingesetzt werden.
Nach dem Verständnis
der vorliegenden Erfindung kann eine Marker-DNA mehrere Zufallssequenzen
enthalten. Um eine konkrete Markierung mehrerer nacheinander markierter
Zellinien zu ermöglichen,
können
unterschiedliche Marker-DNAs kombiniert werden. Dadurch wird es
ermöglicht,
abgeleitete Zellinien zweifelsfrei der Ursprungslinie zuzuordnen.
In
einer bevorzugten Ausführungsform
ist die Marker-DNA von identischen Restriktionsenzymschnittstellen
flankiert. Alternativ kann diese Marker-DNA auch von verschiedenen
Restriktionsenzymschnittstellen flankiert sein.
Erfindngsgemäß können die
zu identifizierenden Zellinien aus viral infizierten Zellen, bakteriellen
Zellen, pflanzlichen, Pilz-, tierischen und insbesondere humanen
Zellen ausgewählt
sein. Es können
auch (gewollte) Gemische von Zellen verwendet werden. Beispiele
von Zellinien sind Linien von E. coli; Lactococcus lactis; Bacillus
subtilis, Saccharomyces, Hansenula, Drosophila, Arabidopsis, Affen-
und humane Zellinien. Weitere Linien sind Hybridoma-Linien und ähnliche.
In
einer besonders bevorzugten Ausführungsform
tragen die zu identifizierenden Zellinien Fremdgene, die sich nur
geringfügig
in ihrer Sequenz voneinander unterscheiden. Ebenfalls können die
zu identifizierenden Zellinien Fremdgene exprimieren, deren Proteine
sich nur geringfügig
in ihrer Sequenz voneinander unterscheiden. Ein geringer Sequenzunterschied
bezieht sich in diesem Zusammenhang auf den Austausch einzelner
Nukleotide, kleinerer Sequenzabschnitte, einzelner Aminosäuren oder kleinerer
Aminosäuresequenzen,
die eine Identifizierung der DNA-Sequenz des zu exprimierenden Gens herkömmlich nur
mit Hilfe einer nach der Isolierung anschließenden DNA-Sequenzierung ermöglichen.
Bevorzugt
sind die zum Nachweis der Marker-DNA verwendeten Oligonukleotide
beide zu der Marker-DNA komplementär. Alternativ ist mindestens eines
der zum Nachweis der Marker-DNA verwendeten Oligonukleotide zu der
Marker-DNA und das andere Oligonukleotid zu einem Bereich außerhalb
der Marker-DNA komplementär.
Das
ermöglicht
auf der einen Seite die Etablierung einer Standard-PCR, wenn eine
zweite Oligonukleotidsequenz als Primer für die PCR eingesetzt wird,
die aus einem Vektorbereich stammt und andererseits die Etablierung
einer Anwender-spezifischen PCR durch die Verwendung eines Primers,
der komplementär
zu der Ziel-DNA ist, die mit Hilfe der Transfektion in die Zellinie
eingebracht werden sollte.
Besonders
bevorzugt ist die Marker-DNA und/oder die Zufallssequenz als Inverted
Repeat ausgebildet. D.h., daß sich
die gesamte Sequenz der Marker-DNA oder nur ein Teil (wie z. B.
die Zufallssequenz) der Marker-DNA spiegelbildlich wiederholt.
Ein
weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung
von Marker-DNA-Sequenzen,
die eine Zufallssequenz aufweisen, zur Identifizierung von Zellinien.
Eine
weitere Ausführungsform
betrifft ein Transfektionskonstrukt, das mindestens eine Marker-DNA
zur Einführung
in eine Zellinie umfaßt,
wobei die Marker-DNA mindestens eine Zufallssequenz aufweist. Die
Verwendung eines bereits fertigen Transfektionskonstrukts, das eine
schnelle und zweifelsfreie Identifizierung der transfizierten Zellinien
ermöglicht,
stellt für
den Anwender eine enorme Vereinfachung dar. Sein Gen des Interesses
muß nur
mit Hilfe geeigneter Restriktionsschnittstellen oder mit Hilfe der
homologen Rekombination in das Transfektionskonstrukt eingebracht
werden, ohne daß eine zusätzliche
Klonierung der Marker-DNA notwendig ist. Diese befindet sich in
dem vorliegenden Fall bereits auf dem Transfektionskonstrukt und
ermöglicht es
somit dem Erfinder, eine ganze Palette von verschiedenen Transfektionsvektoren
zur Verfügung
zu stellen, die direkt vom Verbraucher eingesetzt werden können.
Bevorzugt
ist ein Kit zur Identifizierung von Zellinien, der mindestens folgende
Bestandteile enthält:
a) eine Marker-DNA, die mindestens eine Zufallssequenz aufweist
und b) ein Oligonukleotid, das eine mindestens teilweise zur Zufallssequenz
komplementäre
Sequenz aufweist. Alternativ enthält der Kit folgende Bestandteile:
a) ein Vektor-Set, wobei die Vektoren unterschiedliche Marker-DNA-Sequenzen
aufweisen die mindestens jeweils eine Zufallssequenz aufweisen und
b) Oligonukleotide, die jeweils mindestens teilweise zu den Zufallssequenzen
komplementäre
Sequenzen aufweisen. Die Formulierung „mindestens teilweise" bezieht sich darauf,
daß die Primer
einerseits an die in der Marker-DNA vorhandene Zufallssequenz (oder
mehrere Zufallssequenzen) binden aber auch teilweise komplementär zu anderen
Bereichen der Marker-DNA sein können.
Weiterhin kann der Kit auch die erforderlichen Gebrauchsanweisungen
zur Durchführung
der entsprechenden Identifizierung enthalten.
Abbildungen
1 zeigt
die Identifikation vier verschiedener Zellinien durch PCR mit Zellinienspezifischen
Primern.
2 zeigt
ein vereinfachtes Verfahrensschema zum nachträglichen Einbau einer Marker-DNA in ein vorhandenes
Plasmid.
3 zeigt
einen möglichen
Weg der Synthese Polylinker-flankierter Marker-DNA.
4 zeigt
einen anderen möglichen
Weg der Synthese Polylinker-flankierter Marker-DNA.
Die 1 zeigt
das Foto eines Agarosegels, das nach erfolgter Gelektrophorese aufgenommen wurde.
Die hellen Banden geben die Bereiche wieder, in denen sich DNA-Moleküle, aufgetrennt
nach ihrem Molekulargewicht, angesammelt haben. Sie sind mit Hilfe
von Ethidiumbromid angefärbt
und daher unter UV-Bestrahlung sichtbar. Die Untersuchung hat nach
dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren stattgefunden, wobei die
vier Zellinien mit den Zahlen 307 bis 310 und die Primer mit korrespondierenden Zahlen
bezeichnet wurden. Unter den entsprechend stringenten PCR-Bedingungen
bindet nur der Primer an die Marker-DNA, der die exakt komplementäre Zufallssequenz
aufweist. Die vier transformierten Zellinien konnten dadurch mit
hoher Sicherheit identifiziert werden. Der auf der linken Spur zusätzlich aufgetragene
Standard dient dazu, die Größe der in der
PCR identifizierten DNA abzuschätzen.
Die 2 gibt
schematisch als Verfahrensdiagramm das in Beispiel 2 dargestellte
Verfahren wieder.
Die
beiden 3 und 4 stellen Verfahrensabläufe dar,
die im Beispiel 4 als erste und dritte Möglichkeit näher ausgeführt sind.
Tierische
und humane Zellkulturen können durch
verschiedene Verfahren transfiziert werden. Grundsätzlich lassen
sich zwei Verfahrenstypen unterscheiden. Neben einer viralen Integration
von DNA in das Genom der Zielzelle wird bei der zweiten Gruppe DNA
auf verschiedenen Wegen in die Zelle eingebracht, die dann zufällig oder
zielgerichtet in das Genom inte griert und mit Hilfe eines geeigneten Selektionsdrucks
auf eine stabile Integration der transfizierten DNA hin selektioniert
wird. Neben den Transfektionssytemen mit retroviralen oder adenoviralen
Genen kann eine Einführung
von Fremd-DNA auch über
eine Calcium-Phosphat-Präzipitation,
mit Hilfe von DAE-Dextran, durch Liposome bzw. Lipid-vermittelte
Verfahren, Mikroinjektion, Elektroporation, Rezeptor-vermittelten
Gentransfer oder ballistische Transfektion erreicht werden. Solche
auf diesem Wege genetisch veränderten
Zellinien lassen sich häufig
phänotypisch
nicht voneinander unterscheiden.
Die
vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Verfügung, durch
das es ermöglicht
wird, mit unterschiedlichen Konstrukten transfizierte Zellen über ein
einfaches PCR-Verfahren zu identifizieren. Analog können mit
geeigneten Verfahren transfizierte Zellinien anderen Ursprungs identifiziert
werden.
Dazu
wird entweder bei der Konstruktion des zu transfizierenden Vektors
(Konstrukts) eine Marker-DNA gezielt über Restriktionsschnittstellen
oder homologe Rekombination in das Konstrukt eingebracht oder es
wird ein Set von Standard-Transfektionsvektoren dem Verbraucher
zur Verfügung
gestellt, in die das Zielgen kloniert werden kann. Neben dem Gen
des Interesses, das in der Regel in der transfizierten Zellinie
exprimiert werden soll, ist am 3'-Ende eine Marker-DNA
vorgesehen, die u.a. eine Zufallssequenz umfaßt. Diese Zufallssequenz ist
aufgrund ihrer zufällig
zusammengestellten Nukleotidabfolge und einer entsprechenden Länge einzigartig und
kann unter sehr stringenten Bedingungen in der Zielzelle mit Hilfe
von z.B. PCR nachgewiesen werden. Wird zur Integration der Marker-DNA
in den Transfektionsvektor nur eine Restriktionsenzymschnittstelle
oder nur eine Sequenzabfolge zur homologen Rekombination eingesetzt,
ist es sinnvoll, die Marker-DNA in Form von Inverted Repeats zu
gestalten, damit einerseits in beiden möglichen Integrationsorientierungen
eine Amplifikation des gewünschten
DNA-Abschnitts mit korrespondierenden Primern außerhalb der Marker-DNA als
auch andererseits eine Amplifikation eines DNA-Abschnitts der Marker-DNA durch die Verwendung
nur eines Primers (komplementär
zu mindestens einem Teil der Zufallssequenz) möglicht ist. Da die Größe des zu amplifizierenden
DNA-Stücks
konkret bestimmt werden kann, findet eine zweifelsfreie Identifizierung
des entsprechenden Zellklons dadurch statt, daß zunächst die PCR nach Verfahren,
wie sie im Stand der Technik bekannt sind, durchgeführt wird
und anschließend
mit Hilfe einer herkömmlichen
Gelelektrophorese ein DNA-Stück
in der entsprechenden Größe rasch
nachgewiesen werden kann. Das in der vorliegenden Erfindung beschriebene
Verfahren bietet somit eine rasche Durchführbarkeit, die nur geringe Kosten
verursacht.
Unter
dem Begriff "Hybridisierung" im Sinne der vorliegenden
Erfindung ist eine Bindung unter Ausbildung einer Duplex-Struktur
eines Oligonukleotids an eine vollständig komplementäre Sequenz
im Sinne der Watson-Crick Basenpaarungen in der Proben DNA zu verstehen.
Unter "sehr stringenten" Hybridisierungsbedingungen
sind solche Bedingungen zu verstehen, bei denen eine Hybridisierung
bei 60°C in
2,5 × SSC-Puffer,
gefolgt von mehreren Waschschritten bei 37°C in einer geringeren Pufferkonzentration
erfolgt und stabil bleibt.
Zur
Durchführung
der PCR ist es denkbar, daß aus
den entsprechenden Zellklonen DNA durch im Stand der Technik bekannte
Verfahren extrahiert wird, um sie in einer geeigneten Verdünnung in
die PCR einzusetzen oder Zellen direkt in die PCR eingesetzt werden,
die durch den enstprechenden Denaturierungsschritt während der
PCR-Reaktion zerstört
werden und die DNA, die untersucht werden soll, freisetzen.
Neben
der Identifizierung transgener Zellinien bietet das Verfahren der
vorliegenden Erfindung auch für
nicht-transgene Zellinien die Möglichkeit, durch
das Einführen
geeigneter Marker-DNA-Abschnitte zweifelsfrei identifiziert zu werden.
Die Integration eines kleinen Marker-DNA-Abschnitts ermöglicht es,
verschiedene Zellinien aus unterschiedlichen Organen und Organismen
zu differenzieren.
Im
Gegensatz zu den im Stand der Technik bereits bekannten Verfahren
kann das Markierungsverfahren der vorliegenden Erfindung eine außergewöhnlich breite
Vielfalt an verschiedenen Marker-DNA-Abschnitten zur Verfügung stellen
und ist den herkömmlichen
Markergenen, die eine Expression der Wirtszelle erfordern, weit überlegen.