EP1623043A1 - Verfahren zur identifizierung von zellinien - Google Patents

Verfahren zur identifizierung von zellinien

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Publication number
EP1623043A1
EP1623043A1 EP04732306A EP04732306A EP1623043A1 EP 1623043 A1 EP1623043 A1 EP 1623043A1 EP 04732306 A EP04732306 A EP 04732306A EP 04732306 A EP04732306 A EP 04732306A EP 1623043 A1 EP1623043 A1 EP 1623043A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
dna
marker dna
marker
sequence
random sequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP04732306A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Gerhard P. PÜSCHEL
Frank NEUSCHÄFER-RUBE
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Universitaet Postdam
Original Assignee
Universitaet Postdam
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Universitaet Postdam filed Critical Universitaet Postdam
Publication of EP1623043A1 publication Critical patent/EP1623043A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays

Definitions

  • the present invention relates to a method for identifying cell lines, in particular animal and human cell lines, which enables rapid and targeted identification of the cell lines to be examined.
  • a specific marker DNA which has at least one random sequence, is introduced into the cell line, and this marker DNA is detected using a suitable method via oligonucleotide hybridization.
  • the marker DNA can also contain further sequences or genes.
  • contaminations with bacteria, yeast, mold, parasites, mycoplasma and viruses there are also contaminations with bacteria, yeast, mold, parasites, mycoplasma and viruses.
  • contamination with bacteria, fungi or viruses can be identified due to a morphological change in the cell line, a changed growth, the discoloration of the culture medium or similar indications.
  • Contamination with other cell lines is problematic and can be morphologically very similar to the original culture. The introduced cells can, for example, proliferate faster and thus overgrow the original culture without this being noticed.
  • Tanabe Tanabe, H., Nakagawa, Y., Minegishi, D., Kurematsu, M., Masui, T. and Mizusawa, H., Tiss. Cult. Res. Commun. , 18: 329-338, 1999.
  • STR short tandem repeat
  • GFP green fluorescence protein
  • a specific marker DNA which has at least one random sequence, is introduced into the cell line, and this marker DNA is detected using a suitable method via oligonucleotide hybridization
  • the term "specific marker DNA” refers to its own, distinctive DNA section which is introduced into the corresponding cell line.
  • the marker DNA can also contain further sequences or genes.
  • a “random sequence” in the sense of the invention is to be understood as a sequence whose base sequence in the genome of the cell naturally occurs in a section of approximately 20 kb is not present upstream and downstream of the integration site of the marker DNA. Optimally, the random sequence does not even exist in the genome of the cell.
  • a cell can contain several random sequences that can be inserted into the cell one after the other or simultaneously in a specific combination.
  • the method for detecting the marker DNA preferably comprises the use of labeled probes or PCR.
  • this essentially means the use of specific primers which are complementary to the random sequence and which provide rapid identification using the polymerase chain reaction (PCR).
  • Further detection methods are known in the prior art and include, among other things, the use of differently labeled probes or the use of newer technical methods which are suitable for detecting a random sequence in accordance with the invention.
  • the marker DNA preferably comprises between 10 and 500 nucleotides.
  • the marker DNA particularly preferably comprises between 15 and 60 nucleotides.
  • the random sequence according to the invention can be identical to the marker DNA or can also represent only a part thereof.
  • At least the random sequence of the introduced marker DNA is unique to the cell genome.
  • successive labeling steps of cells should not be excluded.
  • a combination of at least two marker DNA sequences can be used.
  • a marker DNA can contain several random sequences. Different marker DNAs can be combined in order to enable a specific marking of several successively marked cell lines. This enables derived cell lines to be unequivocally assigned to the original line.
  • the marker DNA is flanked by identical restriction enzyme sites.
  • this marker DNA can also be flanked by various restriction enzyme sites.
  • the cell lines to be identified can be selected from virally infected cells, bacterial cells, plant, fungal, animal and in particular human cells. Mixtures of cells can also be used. Examples of cell lines are lines from E. coli; Lactococcus lactis; Bacillus subtilis, Saccharomyces, Hansenula, Drosophila, Arabidopsis, monkey and human cell lines. Other lines are hybridoma lines and the like.
  • the cell lines to be identified carry foreign genes (also referred to here as "gene of interest") which differ only slightly from one another in their sequence.
  • the cell lines to be identified can also express foreign genes whose proteins differ only slightly from one another in their sequence.
  • a slight sequence difference relates to the exchange of individual nucleotides, smaller sequence segments, individual amino acids or smaller amino acid sequences, which conventionally only enable the DNA sequence of the gene to be expressed to be identified with the aid of DNA sequencing after isolation.
  • the oligonucleotides used to detect the marker DNA are preferably both complementary to the marker DNA.
  • at least one of the oligonucleotides used to detect the marker DNA is complementary to the marker DNA and the other oligonucleotide is complementary to a region outside the marker DNA.
  • this enables the establishment of a standard PCR if a second oligonucleotide sequence is used as the primer for the PCR, which originates from a vector region, and on the other hand the establishment of a user-specific PCR by using a primer which is complementary to the target -DNA is that which should be introduced into the cell line with the aid of the transfection.
  • the marker DNA and / or the random sequence is particularly preferably designed as an inverted repeat or palindrome. This means that the entire sequence of the marker DNA or only a part (such as the random sequence) of the marker DNA is repeated in mirror image.
  • Another aspect of the present invention relates to the use of marker DNA sequences which have a random sequence for identifying cell lines.
  • a further embodiment relates to a transfection construct which comprises at least one marker DNA for introduction into a cell line, the marker DNA having at least one random sequence.
  • His gene of interest only has to be introduced into the transfection construct with the aid of suitable restriction interfaces or with the help of homologous recombination, without that additional cloning of the marker DNA is necessary. In the present case, this is already on the transfection construct and thus enables the inventor to make available a whole range of different transfection vectors that can be used directly by the consumer.
  • kits for identifying cell lines which contains at least the following components: a) a marker DNA which has at least one random sequence and b) an oligonucleotide which has a sequence which is at least partially complementary to the random sequence.
  • the kit contains the following components: a) a vector set, the vectors having different marker DNA sequences each having at least one random sequence and b) oligonucleotides each having at least partially sequences complementary to the random sequences.
  • the phrase "at least partially” refers to the fact that the primers on the one hand bind to the random sequence (or several random sequences) present in the marker DNA, but can also be partially complementary to other areas of the marker DNA.
  • the kit can also contain the instructions for use required to carry out the corresponding identification.
  • 1 shows the identification of four different cell lines by PCR with cell line-specific primers.
  • Fig. 2 shows a simplified process diagram for the subsequent incorporation of a marker DNA into an existing plasmid.
  • Figure 3 shows a possible way of synthesizing polylinker flanking marker DNA.
  • Figure 4 shows another possible way of synthesizing polylinker-flanking marker DNA.
  • Fig. 1 shows the photo of an agarose gel, which was taken after gel electrophoresis.
  • the light bands represent the areas in which DNA molecules, separated according to their molecular weight, have accumulated. They are stained with ethidium bromide and are therefore visible under UV radiation.
  • the investigation was carried out according to the method described in Example 1, the four cell lines being numbered 307 to 310 and the primers being numbered accordingly. Under the corresponding stringent PCR conditions, only the primer that has the exactly complementary random sequence binds to the marker DNA. The four transformed cell lines could thus be identified with a high degree of certainty.
  • the standard additionally plotted on the left lane serves to estimate the size of the DNA identified in the PCR.
  • FIG. 2 schematically shows the process shown in Example 2 as a process diagram.
  • FIGS. 3 and 4 represent process sequences which are explained in more detail in example 4 as the first and third possibility.
  • Animal and human cell cultures can be transfected by various methods. There are basically two types of processes. In addition to viral integration of DNA into the genome of the target cell, the second group introduces DNA into the cell in various ways, which is then randomly or specifically integrated into the genome and with the help of a suitable selection pressure for stable integration of the transfected DNA is selected. In addition to the transfection systems with retroviral or adenoviral genes, an introduction of foreign DNA can also be carried out via calcium phosphate precipitation, with the help of DAE dextran, through liposomes or lipid-mediated methods, microinjection, electroporation, receptor-mediated gene transfer or ballistic Transfection can be achieved. Such cell lines genetically modified in this way can often not be distinguished from one another phenotypically.
  • the present invention provides a method by which it is possible to identify cells transfected with different constructs using a simple PCR method. Analogously, suitable methods can be used to identify transfected cell lines of other origin.
  • a marker DNA is introduced into the construct specifically via restriction sites or homologous recombination, or a set of standard transfection vectors into which the target gene can be cloned is made available to the consumer.
  • a marker DNA is provided at the 3 'end, which among other things. includes a random sequence. This random sequence is unique due to its randomly assembled nucleotide sequence and a corresponding length and can be used under very stringent conditions in the target cell with the help of e.g. PCR can be detected.
  • hybridization in the sense of the present invention is to be understood as binding to form a duplex structure of an oligonucleotide to a completely complementary sequence in the sense of the Watson-Crick base pairings in the sample DNA.
  • very stringent hybridization conditions such conditions are to be avoided. stand in which a hybridization at 60 ° C in 2.5 x SSC buffer, followed by several washing steps at 37 ° C in a lower buffer concentration and remains stable.
  • DNA is extracted from the corresponding cell clones by methods known in the prior art, in order to use them in the PCR in a suitable dilution, or to insert cells directly in the PCR, which by the corresponding denaturation step during the PCR reaction are destroyed and the DNA to be examined is released.
  • the method of the present invention also offers the possibility for non-transgenic cell lines to be identified beyond doubt by the introduction of suitable marker DNA sections.
  • the integration of a small segment of marker DNA enables different cell lines from different organs and organisms to be differentiated.
  • the labeling method of the present invention can provide an exceptionally wide variety of different marker DNA segments and is far superior to the conventional marker genes which require expression of the host cell.
  • animal cell lines are marked as examples.
  • the method is basically equally applicable to all cell lines to be identified.
  • HEK293 cells were transfected with the four vectors. Individual cell lines that had stably integrated the vector construct into the genome were isolated by selection with the antibiotic G418 and single cell cloning. The cell lines established in this way were cultivated under standard conditions.
  • genomic DNA was isolated from the four selected cell lines by ethanol precipitation.
  • the DNA obtained in this way was used in a PCR reaction with marker-specific primers and a primer which was identical for all cell lines and corresponded to a sequence section in the transfected DNA. Under the selected conditions, a PCR product could only be detected in the DNAs of the cell lines, which carried the sequence specific for the marker primer (FIG. 1).
  • Example 2 provides an alternative method.
  • the marker DNA is inserted into the already existing plasmid construct.
  • the marker DNA is restricted with an enzyme which cuts the vector polylinker in the 3 'region of the protein-coding cDNA region of the vector and clones behind the protein-coding region.
  • the marker DNA is joined twice directly behind one another in opposite directions (mirror image, inverted repeat) with a polylink notch region in front of it. This DNA fragment is cut with the desired restriction enzyme and ligated into the dephospholated vector cut with the same enzyme. (Fig. 2)
  • the marker sequence as an inverted repeat, it is possible to establish a standard PCR protocol that is independent of the sequence of the protein-coding region that may be transfected.
  • a PCR is carried out with the marker primer on the one hand and the vector-specific primer located in the 3 'thereof on the other hand (see FIG. 2, standard PCR). This enables the use of the strictest possible PCR conditions and thereby minimizes the amplification of false positive bands. If a protein cDNA-specific primer is used, the user can establish a PCR protocol specific for his cDNA (see FIG. 2, user PCR).
  • a set of vectors is provided, which have a unique marker sequence behind the polylinker.
  • Such a vector set can be used to clone protein-coding DNA regions directly into corresponding interfaces and thereby enables the inventive technique to be used quickly and without problems.
  • Vectors containing a unique marker DNA are prepared by inserting a synthetic, double-stranded oligonucleotide with overhanging ends into the most distant from the transcription start site of the polylinker or another suitable interface in the immediate vicinity of the polylinker, which contains the marker DNA sequence in a mirror image arrangement and can therefore serve as a template for both the user PCR and the standard PCR with the same primer.
  • Marker DNA sequence can be displayed in a polylinker.
  • a DNA fragment is amplified by PCR, a vector with a suitable polylinker being selected as the template.
  • One primer binds to one end of the polylinker.
  • This primer is extended 5 'by the desired marker sequence and 5' by this marker sequence by a sequence coding for a restriction interface not present in the polylinker.
  • the second primer starts inside the vector beyond the polylinker.
  • the PCR product is restricted with the non-polylinker cutting enzyme.
  • the large fragments are cleaned and ligated.
  • the ligation product is cut with the outer enzyme located in the polylinker and ligated into a dephosphorylated vector cut with the same enzyme (FIG. 3).
  • the PCR approach is halved, half is cut with the enzyme not cutting in the polylinker and the outermost enzyme in the polylinker.
  • the second half with the enzyme not cutting in the polylinker and the penultimate enzyme in the polylinker.
  • the two restriction approaches are brought into a ligation with the vector cut with the two enzymes located in the outer polylinker region.
  • a fully synthetic double-stranded DNA fragment containing the inverted repeat as a marker DNA sequence with overhanging ends is cloned into the central interface of a vector to be established, the polylinker of which contains each interface in a mirror image arrangement (FIG. 4 ).
  • the following example relates to a further variant of the method and the method according to the invention.
  • the enzyme X (and / or for example a receptor, such as the prostanoid receptor described, inter alia, in Biochem J. 2003 Apr 15; 371 (Pt 2): 443-9, in which His-81 to Ala mutants in the transmembrane domain 2 and Arg- 291 to Leu mutants in transmembrane domain 7 from the wild type) is of potential interest for a biotechnological process.
  • the enzyme catalyzes an undesirable side reaction that results in a loss of product quality. This side reaction can be suppressed by a single amino acid substitution within or near the active site without affecting the desired main reaction.
  • cDNA constructs were generated by site-directed mutagenesis which code for the same enzyme with only a single amino acid substitution in order to optimize the enzyme for the biotechnological process. All cDNAs were cloned into the same expression vector and cell lines were generated with these cDNAs in an identical cellular background. These cell lines differ in a single or very few known nucleotide exchanges in the transgene.
  • Figure 5 shows the transgene of the wild type and an optimized enzyme. The cell lines can only be identified by SNP analysis or sequencing of the transgene. Switching the cell lines can cause serious damage if you use a cell line that carries the wild-type gene instead of the optimized enzyme.
  • a further palindromic DNA sequence was inserted into the vector together with the cDNA of the enzyme (FIG. 6).
  • This small DNA sequence does not change the properties of the cell line that carries the transgene, nor does it change the properties of the enzyme gene or its expression.
  • the small DNA sequence is specific for each of the cell lines and serves as the target for a specific PCR primer that is in Combination with a vector-specific primer or a transgene-specific primer allows unambiguous identification of the cell line in a single PCR reaction (FIG. 6) of unpurified genomic DNA. This enables the cell line that expresses the optimized enzyme to be identified quickly, conveniently and at low cost in a single PCR reaction at the beginning of each experiment or production cycle. This is an important aspect of quality control, for example.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Identifizierung von Zellinien, insbesondere tierischer und humaner Zellinien, das eine rasche und zielgerichtete Identifizierung der zu untersuchenden Zellinien ermöglicht. Bei dem erfindungsgemässen Verfahren wird eine spezifische Marker-DNA, die mindestens eine Zufallssequenz aufweist, in die Zellinie eingeführt, und diese Marker-DNA mit einem geeigneten Verfahren über Oligonukleotid-Hybridisierung nachgewiesen. Die Marker-DNA kann neben der/den Zufallssequenz/en, von denen mindestens eine vorhanden sein muss, auch weitere Sequenzen oder Gene enthalten.

Description

Verfahren zur Identifizierung von Zellinien
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Identifizierung von Zellinien, insbesondere tierischer und humaner Zellinien, das eine rasche und zielgerichtete Identifizierung der zu untersuchenden Zellinien ermöglicht. Bei dem erfϊndungsgemäßen Verfahren wird eine spezifische Marker-DNA, die mindestens eine Zufallssequenz aufweist, in die Zellinie eingeführt, und diese Marker-DNA mit einem geeigneten Verfahren über Oligonukleotid- Hybridisierung nachgewiesen. Die Marker-DNA kann neben der/den Zufallssequenz/en, von denen mindestens eine vorhanden sein muß, auch weitere Sequenzen oder Gene enthalten.
Die KJreuzkontamination von Zellkulturen allgemein und insbesondere humaner Zellkulturen ist ein alltägliches Problem im Labor. Sie führt zu einer Entwertung der Forschungsergebnisse, gefährdet die Vergleichbarkeit der Resultate verschiedener Laboratorien, mindert die Reproduzierbarkeit, die bei der industriellen Herstellung von Zellinien notwendig ist und kann zu nicht verwertbaren therapeutischen Produkten fuhren (Markovic, O. und Markovic, N., In Vitro Cell Dev. Biol. Anim, 34: 1-8, 1998).
Neben der Verunreinigung mit anderen Zellen desselben Ursprungs finden sich, je nach Art der Zelllinien und -kulturen, auch Verunreinigungen mit Bakterien, Hefen, Schimmelpilze, Parasiten, Mycoplasmen und Viren. Vielfach können die Kontaminationen mit Bakterien, Pilzen oder Viren aufgrund einer morphologischen Änderung der Zellinie, eines veränderten Wachstums, der Verfärbung des Kulturmediums oder ähnlicher Anhaltspunkte ausgemacht werden. Problematisch ist hingegen die Kontamination mit anderen Zellinien, die morphologisch der Ursprungskultur sehr ähnlich sein können. Die eingeschleppten Zellen können beispielsweise schneller proliferieren und somit die Ursprungskultur überwachsen, ohne daß dies bemerkt wird.
Das Phänomen der Kontamination von Zellkulturen wird in zahlreichen Artikeln beschrieben (Fogh, J., Holmgren, N.B., und Ludovici, P.P., In Vitro, 7: 26-41, 1971; Haiton, D.M., Peter- son, Jr. W.D., und Hukku, B.5 In Vitro Cell Dev. Biol., 19: 16-24, 1983; Hay, R. J., Dev. Biol. Stand., 76: 25-37; 1992; Markovic, O. und Markovic, N. In Vitro Cell Dev. Biol. Anim, 34: 1-8, 1998; Dirks, W., MacLeod, R.A., Jager, K., Milch, H. und Drexler, H.G., Cell Mol. Bio., 45: 841-853, 1999).
Eine Unterscheidung einzelner Zellinien voneinander ist beispielsweise durch eine isoenzy- matische Charakterisierung möglich, wird aber auch mit Hilfe zytogenetischer Analysen und des DNA-Fingerprintings durchgeführt (Stacey, G.N., Bolton, B.J., und Doyle, A., EXS, 58: 361-370, 1991). Des weiteren wird als zusätzliches Verfahren zur Identifizierung die Färbung mit fluoreszierenden Antikörpern verwendet.
Bei Studien, die in den Vereinigten Staaten durchgeführt wurden, sind artübergreifende Kontaminationen und Kontaminationen mit artgleichen Zellen von 17-36% gefunden worden (Hay, R. J., Dev. Biol. Stand., 76: 25-37; 1992).
Ein neueres Verfahren zur Individualisierung einzelner Zellinien wurde von Tanabe beschrieben (Tanabe, H., Nakagawa, Y., Minegishi, D., Kurematsu, M., Masui, T. und Mizusawa, H., Tiss. Cult. Res. Commun., 18: 329-338, 1999). Dort wird mit Hilfe von "short tandem repeat (STR)"-Regionen, die hoch polymorphe Mikrosatellitenmarker im humanen Genom darstellen, mit Hilfe der PCR-Amplifikation eine rasche und genaue Zellinienidentifizierung zur Qualitätskontrolle ermöglicht. Die Veröffentlichung beschreibt die Verwendung neun verschiedener Loci, die zur Analyse der STR-Profile humaner Zellinien eingesetzt werden.
Neben der wichtigen Kontrolle etablierter Zellkulturen, die nicht transgen sind, ist es für viele Forschungseinrichtungen ebenso wichtig, ein schnelles und sicheres Nachweisverfahren für genetisch veränderte Zellinien zur Verfügung gestellt zu bekommen, die sich morphologisch praktisch gar nicht und genetisch nur im Transgen voneinander unterscheiden.
So werden zur Charakterisierung der Struktur-Funktions-Beziehung von Proteinen diese in natürlicher und genetisch veränderter Form häufig in Tumorzellinien exprimiert. Die dabei entstehenden neuen Zellklone unterscheiden sich in der Regel äußerlich nicht voneinander. Da auf der einen Seite typische Unterschiede im natürlichen Genom der Zellinien fehlen und sich auf der anderen Seite die Struktur der zu untersuchenden, genetisch veränderten Proteine bzw. der für diese Proteine kodierenden Gene nur minimal unterscheiden, ist es ohne einen erheblichen Aufwand nicht möglich, diese Zellinien bei einer Verwechselung zu identifizieren. Das bislang verwendete Verfahren, die einzelnen Zellinien zu identifizieren, bestand darin, ein DNA- oder cDNA-Fragment, das für das zu untersuchende Protein kodiert, durch (RT)- PCR zu amplifizieren und dann zu sequenzieren. Nur der genaue Sequenzvergleich ermöglicht es, die geringen Unterschiede der in die transgene Zellinie eingebrachten Erbinformationen zu unterscheiden.
In der Molekularbiologie werden zum Nachweis einer erfolgreichen Transfektion häufig neben dem eigentlichen Zielprotein zusätzliche DNA-Sequenzen in die Zellen integriert. Darunter fallen unter anderem das "green fluorescence proteine" (GFP), verschiedene Antibiotika- Resistenzgene oder Gene, die für Proteine kodieren, die eine Farbreaktion hervorrufen können.
Die im Stand der Technik beschriebenen Verfahren zur Analyse von Zellkulturen sind zeitaufwendig, kostenintensiv oder im Falle des STR-Multiplex-Systems auf eine bestimmte Gruppe von Zellkulturen beschränkt und stellen somit kein universell einsetzbares Identifikationssystem von tierischen, humanen oder anderen Zellkulturen dar, das schnell, kostensparend und sicher eingesetzt werden kann.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, ein Verfahren zur Identifizierung von Zellinien, insbesondere tierischer und humaner Zellinien zur Verfügung zu stellen, das eine rasche und zielgerichtete Identifizierung der zu untersuchenden Zellinien ermöglicht.
Gelöst werden die Probleme des Standes der Technik durch ein Verfahren zur Identifizierung von Zellinien, wobei eine spezifische Marker-DNA, die mindestens eine Zufallssequenz aufweist, in die Zellinie eingeführt wird, und diese Marker-DNA mit einem geeigneten Verfahren über Oligonukleotid-Hybridisierung nachgewiesen wird. Hierbei bezieht sich der Begriff "spezifische Marker-DNA" auf einen eigenen, kennzeichnenden DNA- Abschnitt, der in die entsprechende Zellinie eingeführt wird. Die Marker-DNA kann neben der/den Zufallsse- quenz/en, von denen mindestens eine vorhanden sein muß, auch weitere Sequenzen oder Gene enthalten.
Unter einer "Zufallssequenz" im Sinne der Erfindung ist eine Sequenz zu verstehen, deren Basenabfolge im Genom der Zelle natürlicherweise in einem Abschnitt von etwa 20 kb stromaufwärts und stromabwärts der Integrationstelle der Marker-DNA nicht vorhanden ist. Optimalerweise ist die Zufallssequenz gar nicht im Genom der Zelle vorhanden. Eine Zelle kann mehrere Zufallssequenzen enthalten, die nacheinander oder gleichzeitig in einer bestimmten Kombination in die Zelle eingeführt werden können.
Bevorzugt umfaßt das Verfahren zum Nachweis der Marker-DNA die Verwendung markierter Sonden oder PCR. Im wesentlichen ist hiermit neben der Verwendung von Sonden der Einsatz von spezifischen, zur Zufallssequenz komplementären Primern gemeint, die eine rasche Identifkation mit Hilfe der Polymerasekettenreaktion (PCR) zur Verfügung stellen. Weitere Nachweisverfahren sind im Stand der Technik bekannt und umfassen unter anderem die Verwendungen verschiedenartig markierter Sonden oder den Einsatz neuerer technischer Verfahren, die dazu geeignet sind, eine Zufallssequenz entsprechend der Erfindung nachzuweisen.
Die Marker-DNA umfaßt bevorzugt zwischen 10 und 500 Nukleotide. Besonders bevorzugt umfaßt die Marker-DNA zwischen 15 und 60 Nukleotide. Die erfindungsgemäße Zufallssequenz kann mit der Marker-DNA identisch sein, oder aber auch nur einen Teil davon darstellen.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist mindestens die Zufallssequenz der eingeführten Marker-DNA gegenüber dem Zellgenom einzigartig. Dabei sollen aber aufeinanderfolgende Markierungsschritte von Zellen nicht ausgeschlossen sein.
Alternativ kann eine Kombination von mindestens zwei Marker-DNA-Sequenzen eingesetzt werden. Nach dem Verständnis der vorliegenden Erfindung kann eine Marker-DNA mehrere Zufallssequenzen enthalten. Um eine konkrete Markierung mehrerer nacheinander markierter Zellinien zu ermöglichen, können unterschiedliche Marker-DNAs kombiniert werden. Dadurch wird es ermöglicht, abgeleitete Zellinien zweifelsfrei der Ursprungslinie zuzuordnen.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Marker-DNA von identischen Restriktionsenzymschnittstellen flankiert. Alternativ kann diese Marker-DNA auch von verschiedenen Restriktionsenzymschnittstellen flankiert sein. Erfindngsgemäß können die zu identifizierenden Zellinien aus viral infizierten Zellen, bakteriellen Zellen, pflanzlichen, Pilz-, tierischen und insbesondere humanen Zellen ausgewählt sein. Es können auch (gewollte) Gemische von Zellen verwendet werden. Beispiele von Zellinien sind Linien von E. coli; Lactococcus lactis; Bacillus subtilis, Saccharomyces, Hansenu- la, Drosophila, Arabidopsis, Affen- und humane Zellinien. Weitere Linien sind Hybridoma- Linien und ähnliche.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform tragen die zu identifizierenden Zellinien Fremdgene (hier auch als "Gen von Interesse" bezeichnet), die sich nur geringfügig in ihrer Sequenz voneinander unterscheiden. Ebenfalls können die zu identifizierenden Zellinien Fremdgene exprimieren, deren Proteine sich nur geringfügig in ihrer Sequenz voneinander unterscheiden. Ein geringer Sequenzunterschied bezieht sich in diesem Zusammenhang auf den Austausch einzelner Nukleotide, kleinerer Sequenzabschnitte, einzelner Aminosäuren oder kleinerer Aminosäuresequenzen, die eine Identifizierung der DNA-Sequenz des zu exprimierenden Gens herkömmlich nur mit Hilfe einer nach der Isolierung anschließenden DNA-Sequenzierung ermöglichen.
Bevorzugt sind die zum Nachweis der Marker-DNA verwendeten Oligonukleotide beide zu der Marker-DNA komplementär. Alternativ ist mindestens eines der zum Nachweis der Marker-DNA verwendeten Oligonukleotide zu der Marker-DNA und das andere Oligonukleotid zu einem Bereich außerhalb der Marker-DNA komplementär.
Das ermöglicht auf der einen Seite die Etablierung einer Standard-PCR, wenn eine zweite Oligonukleotidsequenz als Primer für die PCR eingesetzt wird, die aus einem Vektorbereich stammt und andererseits die Etablierung einer Anwender-spezifischen PCR durch die Verwendung eines Primers, der komplementär zu der Ziel-DNA ist, die mit Hilfe der Transfekti- on in die Zellinie eingebracht werden sollte.
Besonders bevorzugt ist die Marker-DNA und/oder die Zufallssequenz als Inverted Repeat oder Palindrom ausgebildet. D.h., daß sich die gesamte Sequenz der Marker-DNA oder nur ein Teil (wie z. B. die Zufallssequenz) der Marker-DNA spiegelbildlich wiederholt.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung von Marker-DNA- Sequenzen, die eine Zufallssequenz aufweisen, zur Identifizierung von Zellinien. Eine weitere Ausführungsform betrifft- ein Transfektionskonstrukt, das mindestens eine Marker-DNA zur Einführung in eine Zellinie umfaßt, wobei die Marker-DNA mindestens eine Zufallssequenz aufweist. Die Verwendung eines bereits fertigen Transfektionskonstrukts, das eine schnelle und zweifelsfreie Identifizierung der transfizierten Zellinien ermöglicht, stellt für den Anwender eine enorme Vereinfachung dar. Sein Gen des Interesses muß nur mit Hilfe geeigneter Restriktionsschnittstellen oder mit Hilfe der homologen Rekombination in das Transfektionskonstrukt eingebracht werden, ohne daß eine zusätzliche Klonierung der Marker-DNA notwendig ist. Diese befindet sich in dem vorliegenden Fall bereits auf dem Transfektionskonstrukt und ermöglicht es somit dem Erfinder, eine ganze Palette von verschiedenen Transfektionsvektoren zur Verfügung zu stellen, die direkt vom Verbraucher eingesetzt werden können.
Bevorzugt ist ein Kit zur Identifizierung von Zellinien, der mindestens folgende Bestandteile enthält: a) eine Marker-DNA, die mindestens eine Zufallssequenz aufweist und b) ein Oligo- nukleotid, das eine mindestens teilweise zur Zufallssequenz komplementäre Sequenz aufweist. Alternativ enthält der Kit folgende Bestandteile: a) ein Vektor-Set, wobei die Vektoren unterschiedliche Marker-DNA-Sequenzen aufweisen die mindestens jeweils eine Zufallssequenz aufweisen und b) Oligonukleotide, die jeweils mindestens teilweise zu den Zufallssequenzen komplementäre Sequenzen aufweisen. Die Formulierung "mindestens teilweise" bezieht sich darauf, daß die Primer einerseits an die in der Marker-DNA vorhandene Zufallssequenz (oder mehrere Zufallssequenzen) binden aber auch teilweise komplementär zu anderen Bereichen der Marker-DNA sein können. Weiterhin kann der Kit auch die erforderlichen Gebrauchsanweisungen zur Durchführung der entsprechenden Identifizierung enthalten.
Abbildungen
Fig. 1 zeigt die Identifikation vier verschiedener Zellinien durch PCR mit Zellinien- spezifischen Primern.
Fig. 2 zeigt ein vereinfachtes Verfahrensschema zum nachträglichen Einbau einer Marker- DNA in ein vorhandenes Plasmid.
Fig. 3 zeigt einen möglichen Weg der Synthese Polylinker-flankierender Marker-DNA. Fig. 4 zeigt einen anderen möglichen Weg der Synthese Polylinker-fiankierenden Marker- DNA.
Fig. 5 und 6 zeigen Vektorkonstrukte wie in Beispiel 5 verwendet.
Die Fig. 1 zeigt das Foto eines Agarosegels, das nach erfolgter Gelektrophorese aufgenommen wurde. Die hellen Banden geben die Bereiche wieder, in denen sich DNA-Moleküle, aufgetrennt nach ihrem Molekulargewicht, angesammelt haben. Sie sind mit Hilfe von Ethi- diumbromid angefärbt und daher unter UV-Bestrahlung sichtbar. Die Untersuchung hat nach dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren stattgefunden, wobei die vier Zellinien mit den Zahlen 307 bis 310 und die Primer mit korrespondierenden Zahlen bezeichnet wurden. Unter den entsprechend stringenten PCR-Bedingungen bindet nur der Primer an die Marker-DNA, der die exakt komplementäre Zufallssequenz aufweist. Die vier transformierten Zellinien konnten dadurch mit hoher Sicherheit identifiziert werden. Der auf der linken Spur zusätzlich aufgetragene Standard dient dazu, die Größe der in der PCR identifizierten DNA abzuschätzen.
Die Fig. 2 gibt schematisch als Verfahrensdiagramm das in Beispiel 2 dargestellte Verfahren wieder.
Die beiden Fig. 3 und 4 stellen Verfahrensabläufe dar, die im Beispiel 4 als erste und dritte Möglichkeit näher ausgeführt sind.
Tierische und humane Zellkulturen können durch verschiedene Verfahren transfiziert werden. Grundsätzlich lassen sich zwei Verfahrenstypen unterscheiden. Neben einer viralen Integration von DNA in das Genom der Zielzelle wird bei der zweiten Gruppe DNA auf verschiedenen Wegen in die Zelle eingebracht, die dann zufällig oder zielgerichtet in das Genom integriert und mit Hilfe eines geeigneten Selektionsdrucks auf eine stabile Integration der transfi- zierten DNA hin selektioniert wird. Neben den Transfektionssytemen mit retroviralen oder adenoviralen Genen kann eine Einführung von Fremd-DNA auch über eine Calcium- Phosphat-Präzipitation, mit Hilfe von DAE-Dextran, durch Liposome bzw. Lipid-vermittelte Verfahren, Mikroinjektion, Elektroporation, Rezeptor- vermittelten Gentransfer oder ballistische Transfektion erreicht werden. Solche auf diesem Wege genetisch veränderten Zellinien lassen sich häufig phänotypisch nicht voneinander unterscheiden. Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Verfügung, durch das es ermöglicht wird, mit unterschiedlichen Konstrukten transfizierte Zellen über ein einfaches PCR- Verfahren zu identifizieren. Analog können mit geeigneten Verfahren transfizierte Zellinien anderen Ursprungs identifiziert werden.
Dazu wird entweder bei der Konstruktion des zu transfizierenden Vektors (Konstrukts) eine Marker-DNA gezielt über Restriktionsschnittstellen oder homologe Rekombination in das Konstrukt eingebracht oder es wird ein Set von Standard-Transfektionsvektoren dem Verbraucher zur Verfügung gestellt, in die das Zielgen kloniert werden kann. Neben dem Gen des Interesses, das in der Regel in der transfizierten Zellinie exprimiert werden soll, ist am 3'- Ende eine Marker-DNA vorgesehen, die u.a. eine Zufallssequenz umfaßt. Diese Zufallssequenz ist aufgrund ihrer zufällig zusammengestellten Nukleotidabfolge und einer entsprechenden Länge einzigartig und kann unter sehr stringenten Bedingungen in der Zielzelle mit Hilfe von z.B. PCR nachgewiesen werden. Wird zur Integration der Marker-DNA in den Transfektionsvektor nur eine RestriMonsenzymschnittstelle oder nur eine Sequenzabfolge zur homologen Rekombination eingesetzt, ist es sinnvoll, die Marker-DNA in Form von Inverted Repeats zu gestalten, damit einerseits in beiden möglichen Integrationsorientierungen eine Amplifikation des gewünschten DNA-Abschnitts mit korrespondierenden Primern außerhalb der Marker-DNA als auch andererseits eine Amplifikation eines DNA- Abschnitts der Marker- DNA durch die Verwendung nur eines Primers (komplementär zu mindestens einem Teil der Zufallssequenz) möglicht ist. Da die Größe des zu amplifizierenden DNA-Stücks konkret bestimmt werden kann, findet eine zweifelsfreie Identifizierung des entsprechenden Zellklons dadurch statt, daß zunächst die PCR nach Verfahren, wie sie im Stand der Technik bekannt sind, durchgeführt wird und anschließend mit Hilfe einer herkömmlichen Gelelektrophorese ein DNA-Stück in der entsprechenden Größe rasch nachgewiesen werden kann. Das in der vorliegenden Erfindung beschriebene Verfahren bietet somit eine rasche Durchführbarkeit, die nur geringe Kosten verursacht.
Unter dem Begriff "Hybridisierung" im Sinne der vorliegenden Erfindung ist eine Bindung unter Ausbildung einer Duplex-Struktur eines Oligonukleotids an eine vollständig komplementäre Sequenz im Sinne der Watson-Crick Basenpaarungen in der Proben DNA zu verstehen. Unter "sehr stringenten" Hybridisierungsbedingungen sind solche Bedingungen zu ver- stehen, bei denen eine Hybridisierung bei 60°C in 2,5 x SSC-Puffer, gefolgt von mehreren Waschschritten bei 37°C in einer geringeren Pufferkonzentration erfolgt und stabil bleibt.
Zur Durchführung der PCR ist es denkbar, daß aus den entsprechenden Zellklonen DNA durch im Stand der Technik bekannte Verfahren extrahiert wird, um sie in einer geeigneten Verdünnung in die PCR einzusetzen oder Zellen direkt in die PCR eingesetzt werden, die durch den enstprechenden Denaturierungsschritt während der PCR-Reaktion zerstört werden und die DNA, die untersucht werden soll, freisetzen.
Neben der Identifizierung transgener Zellinien bietet das Verfahren der vorliegenden Erfindung auch für nicht-transgene Zellinien die Möglichkeit, durch das Einführen geeigneter Marker-DNA-Abschnitte zweifelsfrei identifiziert zu werden. Die Integration eines kleinen Marker-DNA-Abschnitts ermöglicht es, verschiedene Zellinien aus unterschiedlichen Organen und Organismen zu differenzieren.
Im Gegensatz zu den im Stand der Technik bereits bekannten Verfahren kann das Markierungsverfahren der vorliegenden Erfindung eine außergewöhnlich breite Vielfalt an verschiedenen Marker-DNA-Abschnitten zur Verfügung stellen und ist den herkömmlichen Markergenen, die eine Expression der Wirtszelle erfordern, weit überlegen.
Zur Verdeutlichung der vorliegenden Erfindung werden vier Beispiele näher ausgeführt, die allerdings nicht zu einer Einschränkung des Schutzumfangs führen sollen. In den Beispielen werden exemplarisch tierische Zellinien markiert. Jedoch ist das Verfahren grundsätzlich auf alle zu identifizierenden Zellinien gleichermaßen anwendbar.
Beispiel 1
Über ein PCR- Verfahren mit 5 '-überhängenden Primern wurde 3' des translatierten Bereichs in vier Plasmiden, die cDNA-Sequenzen für Proteine enthielten, die sich nur in wenigen A- minosäuren unterschieden, eine jeweils variierende 21 -Basenpaar-lange Sequenz eingefügt, die zufällig generiert worden war. Die so um 21 Basenpaare verlängerten PCR-Produkte wurden in den Ursprungsvektor kloniert. Die Sequenz wurde anschließend durch DNA- Sequenzierung verifiziert, um Mutationen im Rahmen des PCR- Verfahrens auszuschließen. HEK293 -Zellen wurden mit den vier Vektoren transfiziert. Einzelne Zellinien, die das Vek- torkonstrukt stabil in das Genom integriert hatten, wurden durch Selektion mit dem Antibiotikum G418 und Einzelzellklonierung isoliert. Die so etablierten Zellinien wurden unter Standardbedingungen kultiviert.
Aus den vier ausgewählten Zellinien wurde nach Proteinase-K-Verdau genomische DNA durch Ethanol-Fällung isoliert. Die so gewonnene DNA wurde in eine PCR-Reaktion mit markerspezifischen Primern und einem für alle Zellinien identischen Primer, der einem Sequenzabschnitt in der transfizierten DNA entsprach, eingesetzt. Unter den gewählten Bedingungen, konnte nur jeweils in den DNAs der Zellinien ein PCR-Produkt nachgewiesen werden, welches die für den Markerprimer spezifische Sequenz trug (Fig. 1).
Beispiel 2
Um das Auftreten von Mutationen durch das PCR- Verfahren zu vermeiden und das amplifi- zierte Produkt nicht sequenzieren zu müssen, bevor es kloniert wird, stellt das Beispiel 2 ein alternatives Verfahren zur Verfügung. Hierbei wird die Marker-DNA in das bereits vorhandene Plasmidkonstrukt eingebracht. Dazu wird die Marker-DNA mit einem Enzym restringiert, das den Vektorpolylinker im 3 '-Bereich des proteinkodierenden cDNA-Bereichs des Vektors schneidet und hinter den proteinkodierenden Bereich kloniert. Um sicherzustellen, daß unabhängig von der Insert-Orientierungsrichtung der Marker-DNA die nachfolgende PCR einfach durchgeführt werden kann, wird die Marker-DNA mit einem davorliegenden Polylinkerbe- reich zweimal unmittelbar hintereinander in entgegengesetzter Richtung (spiegelbildlich, Inverted Repeat) zusammengefügt. Dieses DNA-Fragment wird mit dem gewünschten Restriktionsenzym geschnitten und in den mit demselben Enzym geschnittenen, dephospholierten Vektor ligiert. (Fig. 2)
Durch die Einführung der Markersequenz als Inverted Repeat, ist es möglich, ein Standard- PCR-Protokoll zu etablieren, das unabhängig von der Sequenz des eventuell transfizierten proteinkodierenden Bereichs ist. Für dieses Standardprotokoll wird eine PCR mit dem Markerprimer einerseits und dem im 3' davon gelegenen vektorspezifischen Primer andererseits durchgeführt (siehe Fig. 2, Standard-PCR). Dies ermöglicht die Anwendung möglichst strin- genter PCR-Bedingungen und minimiert dadurch die Amplifizierung falschpositiver Banden. Wird ein Protein-cDNA-spezifischer Primer verwendet, kann der Anwender ein für seine cDNA spezifisches PCR-Protokoll etablieren (siehe Fig. 2, Anwender-PCR). Beispiel 3
Es wird ein Set von Vektoren zur Verfügung gestellt, die hinter dem Polylinker eine eindeutige Markersequenz tragen. Ein solches Vektor-Set kann dazu verwendet werden, proteinkodierende DNA-Bereiche direkt in entsprechende Schnittstellen hineinzuklonieren und ermöglicht dadurch einen schnellen und problemlosen Einsatz der erfinderischen Technik. Vektoren, die eine eindeutige Marker-DNA enthalten, werden dadurch hergestellt, daß in die am weitesten von der Transkriptionsstartstelle entfernten Schnittstelle des Polylinkers oder einer anderen geeigneten Schnittstelle in der unmittelbaren Nähe des Polylinkers ein synthetisches, dop- pelsträngiges Oligonukleotid mit überhängenden Enden eingeführt wird, das die Marker- DNA-Sequenz spiegelbildlich angeordnet doppelt enthält und somit als eine Matrize sowohl für die Anwender-PCR wie für die Standard-PCR mit demselben Primer dienen kann.
Beispiel 4
Beispielhaft sollen drei verschiedene Möglichkeiten zur Herstellung der Inverted Repeat-
Marker-DNA-Sequenz in einem Polylinker dargestellt werden.
a) Erste Möglichkeit
Ein DNA-Fragment wird durch PCR amplifiziert, wobei als Matrize ein Vektor mit einem geeigneten Polylinker gewählt wird. Der eine Primer bindet an einem Ende des Polylinkers. Dieser Primer ist 5' um die gewünschte Markersequenz und 5' dieser Markersequenz um eine für eine nicht in dem Polylinker vorhandene Restriktionssehnittstelle kodierende Sequenz verlängert. Der zweite Primer setzt innerhalb des Vektors jenseits des Polylinkers an. Das PCR-Produkt wird mit dem nicht-Polylinker-schneidenden Enzym restringiert. Die großen Fragmente werden gereinigt und ligiert. Das Ligationsprodukt wird mit dem äußeren im Polylinker gelegenen Enzym geschnitten und in einen mit demselben Enzym geschnittenen, dephosphorylierten Vektor ligiert (Fig.3).
b) Zweite Möglichkeit
Der PCR-Ansatz wird halbiert, eine Hälfte wird mit dem nicht im Polylinker schneidenden Enzym und dem äußersten im Polylinker gelegenen Enzym geschnitten. Die zweite Hälfte mit dem nicht im Polylinker schneidenden Enzym und dem vorletzten im Polylinker gelegenen Enzym. Die beiden Restriktionsansätze werden in eine Ligation mit dem, mit den beiden im äußeren Polylinkerbereich gelegenen Enzymen geschnittenen Vektor gebracht. c) Dritte Möglichkeit
Ein voll synthetisches, den Inverted Repeat als Marker-DNA-Sequenz enthaltendes dop- pelsträngiges DNA-Fragment mit überhängenden Enden wird in die in der Mitte liegenden Schnittstelle eines neu zu etablierenden Vektors kloniert, dessen Polylinker jede Schnittstelle spiegelbildlich angeordnet doppelt enthält (Fig. 4).
Beispiel 5
Das folgende Beispiel betrifft eine weitere Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens und des Verfahrens. Das Enzym X (und/oder zum Beispiel ein Rezeptor, wie der u.a. in Biochem J. 2003 Apr 15;371(Pt 2):443-9 beschriebene Prostanoidrezeptor, in dem His-81 zu Ala Mutanten in der Transmembrandomäne 2 und Arg-291 zu Leu Mutanten in der Transmembrandomäne 7 vom Wildtyp unterschieden wurden) ist für ein biotechnologisches Verfahren von potentiellem Interesse. Unglücklicher weise katalysiert das Enzym eine unerwünschte Nebenreaktion, die zu einem Verlust an Qualität des Produkts führt. Diese Nebenreaktion kann durch eine einzelne Aminosäuresubstitution innerhalb oder nahe des aktiven Zentrums unterdrückt werden, ohne die erwünschte hauptsächliche Reaktion zu beeinträchtigen. Eine Reihe von cDNA Konstrukten wurden durch stellengerichtete Mutagenese erzeugt, die für dasselbe Enzym mit nur einer einzelnen Aminosäuresubstitution kodieren, um das Enzym für das biotechnologische Verfahren zu optimieren. Alle cDNAs wurden in den selben Expressionsvektor kloniert und Zellinien wurden mit diesen cDNAs in einem identischen zellulären Hintergrund erzeugt. Diese Zellinien unterscheiden sich in einer einzelnen oder sehr wenigen bekannten Nukleotidaustauschen im Transgen. Figur 5 zeigt das Transgen des Wildtyps und ein optimiertes Enzym. Die Identifikation der Zellinien ist nur durch eine SNP Analyse oder Sequenzierung des Transgens möglich. Eine Vertauschung der Zellinien kann schweren Schaden verursachen, falls eine Zelllinie verwendet wird, die das Wildtypgen anstelle des optimierten Enzyms trägt.
Um die teure und zeitaufwendige Identifikation durch die SNP Analyse oder Sequenzierung zu vermeiden, wurde erfindungsgemäß eine weitere palindromische DNA Sequenz in den Vektor zusammen mit der cDNA des Enzyms inseriert (Fig. 6). Diese kleine DNA Sequenz verändert weder die Eigenschaften der Zellinie, die das Transgen trägt, noch verändert sie die Eigenschaften des Enzymgens oder dessen Expression. Die kleine DNA Sequenz ist für jede der Zellinien spezifisch und dient als Zielstelle für einen spezifischen PCR Primer, der in Kombination mit einem Vektor-spezifischen Primer oder einem Transgen-spezifischen Primer eine eindeutige Identifikation der Zellinie in einer einzelnen PCR Reaktion (Fig. 6) von ungereinigter genomischer DNA erlaubt. Dadurch kann die Zellinie, die das optimierte Enzym exprimiert schnell, bequem und mit geringen Kosten in einer einzigen PCR-Reaktion am Anfang jeden Experiments oder Produktionszyklus identifiziert werden. Dies ist ein wichtiger Aspekt z.B. der Qualitätskontrolle.
Die in der vorangehenden Beschreibung sowie den Ansprüchen und Zeichnungen offenbarten Merkmale der Erfindung können sowohl einzeln als auch in beliebiger Kombination für die Verwirklichung der Erfindung in den verschiedenen Ausführungsformen wesentlich sein.

Claims

Patentansprüche
1. DNA-Konstrukt zur Transfektion von Zellen, umfassend ein mutiertes Fremdgen, das sich nur geringfügig in seiner Sequenz von anderen zu untersuchenden Fremdgenen unterscheidet, und eine außerhalb des Fremdgens liegende spezifische Marker-DNA, wobei diese Marker-DNA mindestens eine Zufallssequenz aufweist und diese Marker-DNA zwischen 10 und 500 Nukleotide umfaßt.
2. DNA-Konstrukt nach Anspruch 1, wobei die Marker-DNA zwischen 15 und 60 Nukleotide umfaßt.
3. DNA-Konstrukt nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Zufallssequenz gegenüber dem Zellgenom einzigartig ist.
4. DNA-Konstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Marker-DNA von identischen oder verschiedenen Restriktionsenzymschnittstellen flankiert wird
5. DNA-Konstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Marker-DNA als Inverted Repeat oder Palindrom ausgebildet ist.
6. DNA-Konstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Zufallssequenz der Marker-DNA als Inverted Repeat oder Palindrom ausgebildet ist.
7. DNA-Konstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Marker-DNA von identischen oder verschiedenen Restriktionsenzymschnittstellen flankiert wird
8. DNA-Konstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei sich die Sequenz des zu untersuchenden Fremdgens durch den Austausch einzelner Nukleotide, kleinerer Sequenzabschnitte, oder für einzelnem Aminosäuren oder kleinerer Aminosäuresequenzen kodierende Sequenzen von anderen zu untersuchenden Fremdgenen unterscheidet.
9. Verfahren zur Identifizierung tierischer Zellinien, wobei a) ein DNA-Konstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 8 in die Zellinie eingeführt wird, und b) die Marker-DNA mit einem geeigneten Verfahren über PCR nachgewiesen wird.
10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei das geeignete Verfahren des Nachweises der Marker-DNA die Verwendung markierter Sonden umfaßt.
11. Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, wobei die Marker-DNA zwischen 10 und 500 Nukleotide umfaßt.
12. Verfahren nach Anspruch 11, wobei die Marker-DNA zwischen 15 und 60 Nukleotide umfaßt.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 12, wobei mindestens die Zufallssequenz gegenüber dem Zellgenom einzigartig ist.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 13, wobei Kombinationen von mindestens zwei Marker-DNA-Sequenzen eingesetzt werden.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 14, wobei die Marker-DNA von identischen oder verschiedenen Restriktionsenzymschnittstellen flankiert wird.
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 15, wobei von denen zum Nachweis der Marker-DNA verwendeten Oligonukleotiden mindestens eines komplementär zu der Marker-DNA und ein anderes Oligonukleotid komplementär zu einem Bereich außerhalb der Marker-DNA ist.
17. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 16, wobei die Marker-DNA als Inverted Repeat oder Palindrom ausgebildet ist.
18. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 17, wobei die Zufallssequenz der Marker- DNA als Inverted Repeat oder Palindrom ausgebildet ist.
19. Verfahren zur Mutagenese und Nachweis von Fremdgenen, umfassend geeignete Mutagenese eines Fremdgens auf solche Art, daß sich die Sequenz des mutierten Fremdgens durch den Austausch einzelner Nukleotide, kleinerer Sequenzabschnitte, einzelner Aminosäuren oder kleinerer Aminosäuresequenzen von anderen zu selektierenden Fremdgenen unterscheidet,
Klonieren des mutierten Fremdgens in ein DNA-Konstrukt, das eine außerhalb des Fremdgens liegende spezifische Marker-DNA umfaßt, wobei diese Marker-DNA mindestens eine Zufallssequenz aufweist und diese Marker-DNA zwischen 10 und 500 Nukleotide umfaßt,
Transfektion des so entstandenen DNA-Konstrukts in eine Zelle, und Nachweis des mutierten Fremdgens über PCR mittels der Marker-DNA.
20. Kit zur Durchführung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 9 bis 19, der mindestens folgende Bestandteile enthält, a) eine Marker-DNA, die mindestens eine Zufallssequenz aufweist, b) ein Oligonukleotid, das eine mindestens teilweise zur Zufallssequenz komplementäre Sequenz aufweist.
21. Kit zur Durchführung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 9 bis 19, der mindestens folgende Bestandteile enthält, a) ein Vektor-Set, wobei die Vektoren unterschiedliche Marker-DNA-Sequenzen aufweisen, die mindestens jeweils eine Zufallssequenz aufweisen, b) Oligonukleotide, die jeweils mindestens teilweise zu den Zufallssequenzen komplementäre Sequenzen aufweist.
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