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Die Erfindung betrifft ein Verfahren
zur Herstellung lentiviraler Partikel.
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Die zunehmende Identifikation von
Genen und Proteinsequenzen, die in die Schädigung von Zellen und Organen
involviert sind, erlaubt heute neue Therapieansätze vieler traumatischer, degenerativer
und vererbter Erkrankungen. Der Transfer von Genen in den Organismus,
wie z.B. das zentraler Nervensystem, die Leber, Muskulatur oder
Lunge hat sich jedoch als schwierig und ineffizient erwiesen. Auch
die Transplantation von gentechnisch veränderten Zellen hat sich in
der Praxis nicht durchsetzen können,
da diese entweder nur zu geringem Anteil überleben oder so gar zu stark
wachsen und dann Tumoren hervorrufen.
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Viren jedoch sind in der Lage, fremde
DNA in Wirtszellen einzuschleusen und die Wirtszelle und ihre Systeme
für die
eigene Proteinsynthese zu nutzen. Sie vermehren sich in der Zelle,
verbleiben dort oder führen zum
Untergang der Zelle mit Freiwerden der viralen Partikel und erlauben
so eine neue Runde von Infektion. Unterschiedliche Viren sind aber
auch fähig,
die Wirtszelle stabil zu infizieren, das heißt sie integrieren das virale
Genom in die Wirtszelle, die dann bis zu ihrem Ende die viralen
Proteine exprimiert.
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Seit ca. 15 Jahren hat man nun virale
Partikel klonieren können,
die eine einmalige Infektionsrunde erlauben, nach der aber keine
Virusvermehrung mehr eintritt. Diese viralen Partikel, die wie Shuttle
zur Zelle wirken, beruhen auf unterschiedlichen Ursprungsviren,
wie dem Herpes-, Adeno- oder Adeno-assoziierten Virus. Alle Vektoren
hatten jedoch ihre Limitationen. So waren sie entweder nicht in
der Lage, die Wirtszelle stabil zu infizieren, riefen Immunantworten
hervor oder waren nur sehr ineffektiv. Eine der größten Limitationen
lag darin, daß häufig ruhende
Zellen, also z.B. Zellen wie Nerven- oder Leberzellen, die sich
im Organismus nicht mehr teilen, überhaupt nicht infiziert werden
konnten.
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Seit 1994 liegt nun ein Vektor vor,
der den einmaligen Mechanismus des HIV nutzt, um ruhende Zellen stabil
zu infizieren und so fremde Gene in unterschiedlichen Organen zu
exprimieren. Dies stellt zur Zeit den effektivsten Weg dar, direkt
im leben den Tier eine biologisch aktive Menge an fremden Proteinen
zu synthetisieren, ohne die Wirtszelle zu schädigen oder eine Immunantwort
hervorzurufen (Blömer
et al. Science 1996, 207, 263; Blömer et al., Proc. Natl. Acad.
Sci., 1996 [SIC), Blömer
et al., J. Virol., 1997, 71, 6646).
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Die Effizienz dieser Methode hängt jedoch
maßgeblich
von der viralen Partikelzahl, also der Konzentration, ab. Da es
bisher keine Möglichkeit
gibt, die Partikel von Zelllinien stabil zu produzieren, muß jede sog. Virus-Vektorcharge
einzeln hergestellt werden. Das erfolgt durch das Co-Transfizieren
(Versehen einer sog. Produktionszellinie; 293T Zellen) mit den einzelnen
Plasmiden (ringförmige
DNA Sequenzen, die für
bestimmte Funktionen codieren) und dann das Sammeln des Zellüberstandes,
indem sich die Partikel nach Verlassen der Produktionszellen aufhalten.
Anschließend
wird dieser Überstand
durch Filtration und Zentrifugation aufgereinigt und konzentriert.
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Jede individuelle Vektorpräparation
ist abhängig
von biologischen Faktoren, wie dem Zustand der Produktionszellen,
ihrer Dichte, der Reinheit der Plasmid DNA und der Sauberkeit, mit
dem diese Dinge gehandhabt werden. Für die Untersuchung der Effekte
der viralen Vektoren ist aber insbesondere die Bestimmung des Titers
(also der Dichte der Partikel) entscheidend zur Beurteilung.
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Bei der herkömmlichen Titerbestimmung wurden
die Titer mit einer biologischen Methode auf Zellkulturen bestimmt.
In drei gleichen Ansätzen
wurden 24 Stunden vor Infektion 293T Zellen in Gelatine-laminierten 24er
Platten (Zellkulturschaten mit 24 einzelnen kleinen Kammern, die
getrennt sind) mit 105 Zellen pro Kammer
gesetzt.
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Der virale Vektor wurde in serieller
Verdünnung
(1:10,:100,:1000,:10000 ...) auf die Zellen verbracht und für 4-6 Stunden
belassen. Das Medium wurde gewechselt und dann wurde nach 48 und
72 Stunden die Anzahl der infizierten Zellen gezählt. Wenn der Vektor dabei
z.B. das Gen für
das Reportergen Grün
Fluoreszierendes Protein (GFP) trägt, kann man die grünen Zellen
zählen,
oder wenn er das Gen für
Tyrosin-Hydroxylase trägt,
kann man mit einem Antikörper
gegen Tyrosin-Hydroxylase diejenigen Zellen immunhistochemisch färben, die
das Gen enthalten und das entsprechende Protein exprimieren. Oder
der Vektor trägt
ein Antibiotika-Resistenzgen, welches bei Applikation des Antibiotikums
auf die Zellen nur die gentechnisch veränderten Zellen überleben
läßt. Aus
der Anzahl der infizierten Zellen läßt sich dann die ungefähre Anzahl
viraler Partikel in der Vektorpräparation
berechnen.
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Diese Bestimmung ist jedoch durch
die biologische Variabilität
(Zellzahl, Verdünnung
etc.) nicht sehr genau. Ein weiterer Nachteil ist die lange Dauer
der Prozedur, die verhindert, daß der Vektor frisch und umgehend
weiter verwertet werden kann, denn vor der Titration ist nicht sichtbar,
ob man überhaupt
Partikel hat. Obwohl das Einfrieren des Vektors ein Verlust an aktiven
Partikeln bedeutet, muß dies
in Kauf genommen werden und verhindert die direkte Anwendung.
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Weiterhin ist die Verwendung von
Antibiotikaresistenzgenen in den biologischen Systemen ungünstig, da
sie ein hohes immunogenes Potential haben, wie in Tier- und klinischen
Versuchen beobachtet werden konnte. Jedes neue virale Konstrukt
erfordert individuelle Titerbestimmungsmethoden und läßt keine
Vergleiche zu.
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Der lentivirale Vektor kann analog
zu allen retroviralen Vektoren – wenn
er eine Zelle erreicht - mit einem oder auch mehreren Partikeln
in unterschiedlichen Bereichen die Zell-DNA Wirtszelle infizieren.
Eine Unterscheidung, ob eine oder mehrere Kopien in der Zelle vorliegen,
ob ein aktiver oder ruhender Bereich der DNA erreicht wurde, kann
zu unterschiedlichen Transgen (Reportergen) Expressionshöhen führen und
durch die biologischen Titerbestimmungsmethoden nicht erfaßt wer den.
Dies stellt einen weiteren signifikanten Nachteil der bisherigen
Verfahren dar.
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Die Erfindung hat die Aufgabe, ein
verbessertes Verfahren zur Herstellung lentiviraler Partikel zu schaffen.
Erfindungsgemäß wird dies
durch das Verfahren nach dem Hauptanspruch gelöst. Die Unteransprüche geben
vorteilhafte Ausführungsformen
wieder.
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Erfindungsgemäß wird dabei eine quantitative
Titersofortbestimmung lentiviraler Vektoren durch eine Echtzeit-"Polymerase Ketten
Reaktion" (PCR)
durchgeführt.
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Die Entwicklung der Echtzeit-PCR,
welche die reguläre
PCR mit der Detektion von Zielregion durch Fluoreszenz kombiniert,
stellt nun eine neue Methode zur Verfügung, eine quantitative PCR
von hoher Genauigkeit anzuwenden.
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Weiterhin läßt sich eine große Anzahl
von Proben gleichzeitig bestimmen. Es kann in Echtzeit ausgelesen
werden, ohne Elektrophorese oder Dot Blots.
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Für
das Verfahren wurden folgende PCR Primer und TagMan® Proben
für die
Echtzeit-PCR generiert. Dabei wurden die TagMan® Proben
der PCR Primer für
den lentiviralen Vektor mit Hilfe einer Primersoftware (Primer Express
software Version 1.0, Perkin Elmer/AB1, Foster City, USA) entwickelt.
Die Primer erkennen die US und R Region der genomischen RNA des
lentiviralen Vektors, die sich beim Klonieren nicht verändert, wie
die Erfindung erkannt hat. Die Primer lauten
U5 vorwärts 5'-AGCTTGCCTTGAGTGCTTCA-3' (Seq ID Nr. 1).
und
U5
rückwärts 5'-TGACTAAAAGGGTCTGAGGGA-3' (Seq ID Nr. 2).
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Die Sondensequenz ist
5'-FAMTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTG-TAMRA-3' (Seq ID Nr. 3).
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Die Normalisierung der genomischen
DNA erfolgt anhand des Vergleiches mit Albumin. Die in diesem Experiment
verwendeten Primer für
das Albumingen sind:
Oberer Primer 5'-GCTGTCATCTCTTGTGGGCTG-3' (Seq ID Nr. 4).
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Die Sondensequenz ist
5'-VIC-CCTGTCATGCCCACACAAATCTCTCC-TAMRA-3' (Seq ID Nr. 5).
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FAM (6-Carboxy-Fluoreszin) und VIC
sind Reporter Marker (dyes) und TAMRA (6-Carboxy-Tetramethylrhodamin) ist der
Quencher Fluoreszenzmarker.
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Weitere Merkmale und Vorteile des
Verfahrens ergeben sich aus der nach folgenden Beschreibung der
Herstellung lentiviraler Vektoren und DNA Isolation lentiviral-infizierter
Zellen. Dabei zeigt
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1A die
Amplifikationskurven zur Titersofortbestimmung von lentiviralen
Vektorpartikeln mittels Echtzeit-PCR, wobei jede Kurve eine 10-fache
Verdünnung
gegenüber
der Nächsten
aufweist, und auf der X-Achse der Amplifikations-Zyklus und auf
der Y-Achse das normalisierte (Reporter Fluoreszenz-) Signal (Rn) abzüglich eines
bereits zuvor vorhandenen (baseline) Signals, das während der
ersten 15 PCR-Zyklen gemessen wurde, als ΔRn aufgetragen ist,
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1B die
Standardkurve zur Titerbestimmung mit dem Titer des Vektors auf
der X-Achse und
einem Grenzwert der Zyklenzahl (Ct) (engl. Threshold Cycle) auf
der Y-Achse, und
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2 die
Kurven zur Titerbestimmung von lentiviralen Vektorpartikeln mittels
Echtzeit-PCR.
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Herstellung
lentiviraler Vektoren und DNA-Isolierung lentiviral-infizierter
Zellen
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Zellen menschlicher Nieren, (2x 107) 293T Zellen, wurden in T175 Flaschen in
Dulbecco-Kulturmedium
(Gibco) mit 10% fötalem
Kälberserum
und Streptomycin (100mg/ml) in 5% CO2 Inkubatoren
vor Transduktion (Einbringen der Plasmide in die Produktionszelle)
für 3 Tage
kultiviert. Die Transfektion wird mit 20 μg des Lentivirustransferkonstrukts
pRRL-CGW-SIN, 13μg des Verpackungsplasmids
pCMVD8.9.3 und 7μg
des VSV.G Expressionsplasmids pMD.G durch Calciumpräzipitation
durchgeführt.
Nach 8 Stunden wurde das Medium ausgewechselt und ein Medium mit
10 mM Natriumbutyrat für
20 Std. hinzugefügt.
Der Überstand
wurde für
3 Tage alle 24 Std. gesammelt, vereinigt, gefiltert und konzentriert.
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Zur lentiviralen Transduktion wurden
293 T Zellen (1 × 106) kultiviert und mit Virus- Vektor-Überstand mit Polybren® (8μg/ml) inkubiert.
TF-1 Zellen wurden in 24er- Kammern durch Zentrifugation (2500 Umdrehungen/min)
mit Virusüberstand
in Gegenwart von Protaminsulfat (4μg/ml) für 90 min gefolgt von 16 Std.
Inkubation transfiziert. CD34+ wurden für 8 Std. mit Virus-Vektorüberstand
der für
GFP kodiert transduziert.
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Die genomische DNA-Isolierung erfolgt
aus 105 293T und TF-1 Zellen mit dem QIAamp
Blood Kit (Qiagen, Germany).
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Erzeugung der PCR-Primer
und TAQman®-Proben
für die
Echtzeit PCR
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Das Primerpaar, das erfindungsgemäß die US
und R Region (minus strong-stop DNA) des genomischen lentiviralen
RNA Vektors erkennt lautet: US vorwärts 5'-AGCTTGCCTTGAGTGCTTCA-3' (Seq ID Nr. 1) und
US reverse 5'-TGACTAAAAGGGTCTGAGGGA-3' (Seq ID Nr. 2) (bezogen
durch MWG, Germany). Die Sondensequenz ist 5'-FAMT-GCCCGTCTGTT-GTGTGACTCTG-TAMRA-3' (Seq ID Nr. 3).
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Die Quantifizierung der genomischen
DNA des Albumingens wurde als interne Beladungskontrolle (internal
loading control) benutzt. Dabei wurden als Primer für Albumin
oberer Primer 5'-GCTGTCATCTCTTGTGGGCTG-3' (Seq ID Nr. 4) und
als Sonde der Primer 5'-VIC-CCTGTCATGCCCACACAAATCTCTCC-TAMRA-3' (Seq. ID Nr. 5)
benutzt (Bieche et. al., Int. J. Cancer 78, 661-666, 1998). Dabei werden
FAM (6-Carboxy-Fluoreszin) und VIC als Reporter Marker (dyes) und
TAMRA (6-Carboxy-Tetramethylrhodamin) als Quencher-Fluoreszenzmarker
verwendet.
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Alle Zellen wurde auf Transgenexpression
mit dem Fluoreszenz-Mikroskop, Fluß-Cytometrie und Echtzeit-PCR
vier Tage nach Infektion untersucht.
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Ermittlung
der Standardkurven
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Eine Ziel-Kopienzahl (an Lentivirusmolekülen oder
Albumin-Molekülen)
aus unbekannten Proben kann nun durch Bestimmung eines Grenzwertes
der Zyklenzahl (Ct) und unter Benutzung der Standardkurve für Albumin
zur Ermittlung einer Ausgangs-Kopienzahl bestimmt werden. Zur Quantifizierung
wird die Zahl der lentiviralen Moleküle mit der Zahl der Albumin-Moleküle verglichen,
so daß die
Kopienzahl der Target-Gene geteilt durch die Copy-Zahl der Albumingene
dazu benutzt wird, die Menge genomischer DNA zu standardisieren.
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Die Menge von Albumin und Lentivirus
wurde unter Benutzung von Standardlösungen quantifiziert, die wie
folgt hergestellt wurden: Mit serieller Verdünnung eines Albumin-PCR Produkts
wurde eine Standardkurve ermittelt. Hierzu wurde eine Standard PCR
unter Benutzung von 10 ng genomischer DNA und der o.g. Paare von
Albuminprimern zur Amplifikation eines Teils des Albumingens genutzt.
Dieses PCR Produkt wurde elektrophoretisiert, isoliert und quantifizert.
Die DNA wurde dann seriell 10-fach in Heringssperma-DNA (100μg/ml) verdünnt.
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Die Quantifikation erfolgte weiter
anhand der Standard-Verdünnung
des Transgenplasmids pRRL-CGW-SIN (lentivirales Plasmid). Die EZ-PCR
Standard Kurve für
dieses Plasmid in 10er Verdünnungen mit
der Konzentration von 2 × 106 – 2 × 10° in 100μg/ml Heringssperma-DNA in dreifacher
Ausführung.
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Jeder Test zur Bestimmung der Gesamtzahl
viraler Partikel beinhaltete die Standardkurve von 2 × 106 bis 2 × 100 in dreifacher Ausführung und eine Leerkontrolle.
Für die
Albuminbestimmung enthielt jeder Test eine Standardkurve von 1 × 107 bis 1 × 103 Moleküle,
eine Leerkontrolle in dreifacher Ausführung und 20ng, 2ng, und 0.2ng
humaner genomischer DNA in dreifacher Ausführung (Clontech A, Palo Alto,
USA).
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Echtzeit-PCR (EZ-PCR)
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Die Echtzeit-PCR wurde daraufhin
an einem ABI PRISM7700 Sequenzdetektor, mit der entsprechenden Software
1.6.4. (Perkin/Elmer) durchgeführt.
Die Amplifikationsproben (50μl)
enthielten unterschiedliche Verdünnungen
von viralem Vektorüberstand
oder genomischer DNA, weiterhin 10x TagMan® Puffer,
200μmol dNTP's, 5.5mmol MgCl2, 0.9μmol
eines jeden Primers, 200nmol TagMan® Probe
und 200nmol AmpliTaq® Gold (0.025 E/μ1). Der Thermocycler
war folgendermaßen
eingestellt: 2 min bei 50°C,
initiale Denaturierung bei 95°C
für 10
Minuten, gefolgt von 40 Zyklen mit Zwei-Schritt-PCR (95°C, 15s und
60°C, 60s)
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Die Echtzeit-PCR basiert auf der
Messung der Fluoreszenz in Echtzeit. Hierbei wird die Fähigkeit
der Taq-Ploymerase zur 5'-Nukleaseaktivität, genutzt,
eine Fluoreszenz-markierte Oligonukleotidsonde, die an die Zeil-Sequenz
hybridiziert ist, während
eines Zyklus der PCR zu hydrolisieren. Die Trennung der sog. Reporter-dye
von der Quencher-dye erzeugt ein verstärktes Fluoreszenzsignal des
Reportermarkers, das in Echtzeit gemessen werden kann. Hier wird
die Probe sowohl mit einem 5'-Reporter
Marker (dye) und einer 3' Quencher dye
markiert, ohne daß wie
im bisher üblichen
Verfahren Markergene benötigt
werden, die in der biologischen herkömmlichen Titerbestimmung zeitaufwendig
(mind. 72 Stunden) gezählt
werden müssen.
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Die Ergebnisse zeigen den Vergleich
der biologischen und der TagMan® PCR-Titerbestimmung.
Es finden sich eine enge Parallelen innerhalb der untersuchten Gruppen
und ihrer Verdünnungen
sowie der Standardkurve. Die von uns entwickelte Methode ließ sich bei
allen untersuchten Zellen und lentiviralen Vektorpreparationen erfolgreich
durchführen.
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Unterschiedliche Vektorpräparationen
wurden gesammelt und untersucht. Der höchste Titer fand sich in den
ersten 24 Std. nach Transfektion von 293T Zellen im Virusüberstand
der Zellen in der isolierten genomischen DNA und in der Bestimmung
des biologischen Titers auf 293T Zellen.
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Es besteht, wie erwartet, ein 100facher
Unterschied zwischen dem Titer aus dem Zellüberstand und der genomischen
DNA. Dies beruht auf der Möglichkeit
der Doppel- und Dreifachintegration der Vektoren in die DNA, welche
die biologische Titerbestimmung nicht beeinflußt, da nur die positiven Zellengezählt werden.
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Die EZ-PCR bestimmt den Titer schnell
und zuverlässig.
Die Amplifikation von viralen Vektorpräparationen unterschiedlicher
Verdünnungen
(2 × 106, 2 × 105, 2 × 104, 2 × 103,
2 × 102, 2 × 101 per PCR Reaktion) und der Verdünnungsreihe
des Überstand
aus koloniebildenden Zellkulturen (cfu, für engl. "colony forming units") (2 × 108,
2 × 107, 2 × 106, 2 × 105, 2 × 104, 2 × 103 Vektorpartikel pro Milliliter) zeigt einen
streng linearen Zusammenhang.
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Eine lineare Relation mit dem Korrelationskoeffizienten
von 1,000 zwischen den Ergebnissen ist über den gesamten Bereich festzustellen.
Die Ergebnisse zeigen, daß die
Sensitivität
der Echtzeit-PCR die Detektion von weniger als 20 Vektorpartikeln
pro PCR-Reaktion ermöglicht
und daher sehr genau ist.
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Die Reproduzierbarkeit der Titerbestimmung
mit dieser Methode wurde durch die dreifache Ausführung der
einzelnen Experimente bestätigt.
Weiterhin wurden für
die Darstellung der Reproduzierbarkeit der Titerbestimmung unterschiedliche
Plasmide für
die Vektorproduktion verwendet. So wurde das herkömmliche lentivirale
Dreier-Plasmidsystem und das neue lentivirale Vierer-Plasmidsystem
zur Herstellung lentiviraler Vektoren untersucht. Vektortiter aus
dem Zellkulturüberstand
und der genomischen DNA infizierter Zellen wurden bestimmt. Diese
wurden mit den auf 293T Zellen in herkömmlicherweise biologisch bestimmten
Titern ver glichen. Alle untersuchten Vektorpräparationen und genomischen
DNA Präparationen
wiesen eine strenge Korrelation von EZ-PCR und biologischer Titerbestimmung
auf.
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Die Echtzeit-PCR wurde ebenfalls
anhand eines lentiviralen Vektors ohne Selektionsmarker durchgeführt. Wir
nutzten ein lentivirales Plasmid, welches das Gen für den Wachstumsfaktor
NT3 (Neurotrophin 3) enthält.
Zellkulturüberstand
wurde für
drei Tage nach Transfektion der Produktionszellen gesammelt und
die Titer bestimmt. Wie für
die anderen beschriebenen Titer wurden in den Medien nach 24 Std.
1 × 109 cfu/ml, nach 48 Std. 6 × 108 cfu/ml
und nach 72 Std. 1 × 108 cfu/ml Titer bestimmt. In diesem Fall stellt
die Bestimmung der Titer mittels der erfindungsgemäßen EZ-PCR
die einzige Möglichkeit
dar. Da Markergene in der klinischen Verwendung aufgrund möglicher
Immunreaktionen gegen die Proteine des Markergens obsolet sind,
ist dies die einzige Möglichkeit,
lentivirale Titerbestimmungen für
klinische Applikationen durchzuführen.
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In der Tabelle 1 ist ein Vergleich
der mittels Echtzeit-PCR bestimmten Titer mit den durch das biologische
Verfahren bestimmten Titern (3. Spalte) gegeben. Der Eintrag 'nd' steht für 'nicht bestimmt'. In der ersten Spalte
ist dabei für
unterschiedliche Vektorverdünnungen
(2 × 108, 2 × 106, 2 × 106, 2 × 105, 2 × 104, 2 × 103 Vektorpartikel pro ml Überstand in cfu/ml, wobei cfu
für "colony forming unit" steht, bzw. ein
Titer eines (in der zweiten Spalte) genomischer DNA mit den Vektorverdünnungen
2 × 106, 2 × 105, 2 × 104, 2 × 103, 2 × 102, 2 × 101 pro PCR-Reaktion. Eine lineare Relation
zwischen den Ergebnissen ist zu sehen. Die Quantifizierung erfolgte
anhand der Standardverdünnung
des Transgenplasmides pRRL-CGW-SIN. 1B zeigt
diese Echtzeit-PCR Standard-Kurve für dieses Plasmid.
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In Tabelle 2 findet sich ein Vergleich
von Titern für
Vektoren, wobei die Titer durch Benutzung verschiedener Plasmid-Kombinationen
durch Echtzeit-PCR und durch biologische Bestimmung ermittelt wurden.
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Die in den 1A und 1B dargestellten
Amplifikationskurven zur Titersofortbestimmung von lentiviralen
Vektorpartikelns mittels Echtzeit-PCR eigen Plots für Reaktionen,
die die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse bei der Quantifizierung
anhand der Standardverdünnung
des Transgenplasmides pRRL-CGW-SIN sehr schön bestätigen. 1B zeigt die Echtzeit-Standardkurven für das Plasmid pRRL-CGW-SIN.
Die Ergebnisse zeigen, daß die
Sensitivität der
Echtzeit-PCR die Detektion von weniger als 20 Vektorpartikeln pro
PCR-Reaktion ermöglicht
und daher sehr genau ist.
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2 zeigt
die Kurven der Titerbestimmungen von lentiviralen Vektorpartikeln
bei Echtzeit-PCR
nach jeweils 10-facher Konzentration des Vektorüberstandes zwischen den Kurven,
wobei die drei sich ergebenden Kurven für verschiedene Konzentrationsschritte
gelten und auf der x-Achse die Zyklen der PCR und auf der Y-Achse
die Veränderung
der Fluoreszenz, wie in 1A,
als (ΔRn)
dargestellt sind (von rechts nach links: unkonzentrierter, vereinigter
Virusüberstand;
10-fach aufkonzentriert durch Anion-Austausch-Chromatographie und
ganz links nochmals 10-fach konzentriert durch Filtration).
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Die Daten zeigen, daß die beschriebenen
Primer für
unterschiedliche lentivirale Vektoren, (mit unterschiedlichen Transgenen,
wie GFP, NT3 usw.) anwendbar sind, da Regionen ausgewählt wurden,
die in allen lentiviralen Vektorkonstrukten erhalten bleiben. So
läßt sich
innerhalb von 3 Stunden verläßlich der
Titer von Vektorpräparationen
bestimmen, aber auch innerhalb der angegebenen Zeit die Infektionseffizienz
in der Zielzelle bestimmen. Dies stellt außerdem die erste quantitative
Methode zur Bestimmung lentiviraler Partikel dar. So erlaubt sie
die Bestimmung von Zellen, die eine hohe Produktiosleistung aufweisen
und stellt eine schnelle Methode dar, eine Selektion bei der Klonierung
lentiviral infizierter Zellen durchzuführen, so daß in experimentellen und klinischen
Studien nur effektive Zellinien zum Einsatz kommen.
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