CN102134613B

CN102134613B - 重组慢病毒滴度的检测方法

Info

Publication number: CN102134613B
Application number: CN 201010618159
Authority: CN
Inventors: 魏泓; 王勇; 刘宇; 郭科男; 刘昌峨; 江雯; 周晓杨; 刘勤; 王露露
Original assignee: Third Military Medical University TMMU
Current assignee: Third Military Medical University TMMU
Priority date: 2010-12-31
Filing date: 2010-12-31
Publication date: 2013-01-30
Anticipated expiration: 2030-12-31
Also published as: CN102134613A

Abstract

本发明公开了慢病毒载体的滴度检测方法，具体为运用流式细胞分选法检测对照病毒滴度，将待测病毒与对照病毒在相同条件下同时感染相同数量的靶细胞，分别提取待测病毒与对照病毒感染后的靶细胞的总DNA，通过相对定量PCR检测获得待测病毒与对照病毒的基因组在靶细胞基因组中的相对含量的比值R;将所得对照病毒滴度乘以待测病毒与对照病毒相对含量比值R所得的值为待测病毒滴度，即重组慢病毒滴度；本发明适用于无标记基因的重组慢病毒滴度测试，可准确测定重组慢病毒针对数量少、不能在体外大量培养增殖的靶细胞的滴度。

Description

重组慢病毒滴度的检测方法

技术领域

本发明涉及生物基因领域，特别涉及慢病毒载体的滴度检测方法。

背景技术

慢病毒载体是目前应用最广泛的基因运载工具之一，在基因治疗研究和转基因动物的制备中已显示出其广阔的应用前景。慢病毒载体是一种反转录病毒载体，与传统的病毒载体相比，慢病毒载体均匀分布于基因组内，从而降低了其激活宿主内源性基因的几率。

现有测定重组慢病毒滴度的方法有流式细胞分选法（FACS）、酶联免疫（ELISA）法和绝对定量PCR法。

FACS法是最准确的测定慢病毒滴度的方法。该法先用病毒悬液感染靶细胞，之后通过流式细胞仪测定靶细胞中成功被感染的细胞的比例。该方法可准确测定重组慢病毒的实际感染能力，所测滴度数据能准确反应病毒滴度的实际值，但该方法需要重组慢病毒表达标记基因（如绿色荧光蛋白eGFP），不能测定无标记基因重组慢病毒。

ELISA法是通过检测慢病毒颗粒中P24蛋白的含量，以测定慢病毒颗粒数从而推算病毒滴度。由于该方法仅仅测定慢病毒的颗粒数，并没有测定慢病毒对靶细胞的实际感染能力，因此ELISA法测定的是慢病毒的物理滴度而非实际（生物）滴度。此外，由于病毒悬液中含有一定的游离的P24蛋白，因此ELISA法通常过高地估计病毒滴度。

绝对定量PCR法可测定病毒感染的靶细胞中平均每个细胞基因组中病毒基因组的拷贝数，可在一定程度上较准确地反应慢病毒、尤其是无标记基因的慢病毒的实际滴度。但该方法需要进行绝对定量PCR检测，样本需求量大，影响因素多，数据重复性差，对于不能在体外大量增殖培养的靶细胞并不适宜。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种重组慢病毒滴度的检测方法，该方法将FACS检测法与定量PCR法相结合的重组慢病毒滴度的检测方法，本方法既能准确测定无标记基因的慢病毒滴度，又提高了数据的重复性与准确性，同时减少了样本用量，可准确测定重组慢病毒针对数量少、不能在体外大量培养增殖的靶细胞的滴度。

有鉴于此，本发明的技术方案为：

重组慢病毒滴度的检测方法，具体包括以下步骤：

A、对照病毒滴度检测

运用流式细胞分选法检测对照病毒滴度，得对照病毒滴度，所述对照病毒为能表达标记蛋白且与待测病毒具有相同的包膜蛋白和感染嗜性的慢病毒；

B、待测病毒与对照病毒相对含量比值R的确定

将待测病毒与对照病毒在相同条件下同时感染相同数量的靶细胞，分别提取待测病毒与对照病毒感染后的靶细胞的总DNA，通过相对定量PCR检测待测病毒与对照病毒的基因组在细胞基因组中的相对含量，并获得待测病毒与对照病毒相对含量比值R;

C、重组慢病毒滴度的确定：

将步骤A所得对照病毒滴度乘以待测病毒与对照病毒相对含量比值R，得待测病毒滴度，即重组慢病毒滴度。

进一步，步骤A中，所述标记蛋白为绿色荧光蛋白；

进一步，步骤A中，将对照病毒的悬液先作10⁴～10⁶倍稀释，在含相同细胞数量的不同培养孔中分别加入不同体积（2uL、5uL、10uL、20uL、50uL）的病毒稀释液；用对照病毒稀释液分别感染靶细胞后，运用流式细胞分选法分别检测每孔感染的靶细胞的荧光细胞比例，计算对照病毒滴度。对照病毒滴度计算公式如下：TU/mL = (P × N / 100 × V) ×1000/DF, 其中TU/mL 为病毒滴度，P =荧光阳性细胞比例，N =感染时的细胞数量；V = 每孔加入的病毒稀释液的体积；DF = 稀释梯度；

进一步，步骤A中，将对照病毒的悬液先作10⁴～10⁶倍稀释，利用2μL、5μL、10μL、20μL、50μL的病毒稀释液分别感染数量相同的靶细胞。

进一步，步骤B中，将对照病毒的悬液和待测病毒的悬液按照10^-1～10^-6分别进行10倍梯度稀释，得对照病毒梯度稀释液和待测病毒梯度稀释液；

进一步，步骤B中，用对照病毒梯度稀释液和待测病毒梯度稀释液分别感染靶细胞后，分别提取待测病毒与对照病毒感染后的靶细胞的基因组DNA，并进一步通过相对定量PCR测定靶细胞基因组DNA中病毒基因组DNA的相对含量；

相对定量PCR测定中针对病毒基因组的上游引物如SEQ ID No.1所示，下游引物如SEQ ID No.2所示；针对内参基因的上游引物如SEQ ID No.3所示、下游引物如SEQ ID No.4所示；

相对定量PCR检测的体系为：SYBR Green Real-time PCR Master Mix 10 μL、引物各 0.2μL;靶细胞基因组DNA或标准品1μL、加入去离子水至20μL；

相对定量PCR检测的反应程序为：95℃条件下 3分钟，进入循环：94℃ 条件下30 秒，50℃ 条件下30秒，56℃条件下30秒，终点读板，共40个循环；之后72℃条件下3分钟，95℃条件下1分钟，55℃条件下1分钟。

本发明的有益效果在于：本发明适用于无标记基因的重组慢病毒滴度测试，尤其是用于基因治疗或转基因动物研制等需要准确测定滴度的重组慢病毒；本发明既能准确测定无标记基因的慢病毒滴度，又提高了数据的重复性与准确性，同时减少了样本用量，可准确测定重组慢病毒针对数量少、不能在体外大量培养增殖的靶细胞的滴度。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述，其中：

图1为荧光细胞比例与对照病毒稀释液添加体积之间的相关曲线；

图2为荧光定量PCR产物溶解曲线与标准曲线；A、C分别为病毒基因组定量PCR产物和内参基因定量PCR产物的溶解曲线；纵坐标为PCR反应体系中荧光强度，横坐标为溶解温度；不同颜色的曲线表示不同样本（每个培养孔的细胞基因组DNA）的PCR产物的溶解曲线；曲线2为曲线1的对数值，曲线2为单一波峰表明PCR体系中无非特异性扩增。B、D分别为病毒基因组和内参基因的定量PCR产物的标准曲线；纵坐标为荧光定量PCR体系中模板量的对数值（log值），与10倍稀释梯度呈线性相关；横坐标为PCR反应的Ct值，即PCR体系中荧光强度达到设定阈值时的PCR反应循环数；

图3为定量PCR的Ct值与病毒稀释梯度的相关曲线；纵坐标为针对病毒基因组的定量PCR的Ct值，横坐标为所加病毒液的10倍稀释梯度（10^-1～10^-6）。图A：待测病毒曲线；图B：对照病毒曲线。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对本发明的优选实施例进行详细的描述。

实施例重组慢病毒滴度的检测方法

一、所用材料

1、试剂

DMEM细胞培养基（高糖） Gibcol公司；

胎牛血清 Gibcol公司；

人293FT细胞 Invitrogen公司；

细胞基因组DNA提取试剂盒 Tiangen公司；

Real-time PCR Master Mix TOYOBO；

rTaq酶 Takara；

HBSS缓冲液 Sigma公司；

PBS缓冲液 Gibcol公司；

两种表达标记基因（eGFP）的重组慢病毒悬液自备。

2、所用耗材

24孔细胞培养板 Corning；

各种规格移液器枪头 Axygen；

离心管 Axygen；

3、所用主要设备

流式细胞器检测仪美国贝克曼库尔特公司；

Real-time PCR仪 Bio-rad；

CO2培养箱 Thermo；

二、实验方法

1、FACS测定对照病毒滴度

用HBSS缓冲液将两种表达eGFP标记基因的重组慢病毒充分悬浮并作10⁶倍稀释。在24孔培养板中，每孔加入1×10⁶个293FT细胞，共12孔，每种病毒用6个孔。之后放置于CO2孵箱中培养1天以后，每孔分别加入病毒稀释液2uL、5uL、10uL、20uL、50uL，充分混合均匀。剩下一个孔不加病毒液以作为空白对照。细胞感染后，继续培养48小时，吸出细胞培养液，并用PBS洗细胞3次，充分去除残留在上清的病毒。之后每孔加入500μL含质量分数为0.02% EDTA的PBS，用移液器充分吹吸细胞，以使细胞充分悬浮。通过流式细胞分选（FACS）检测每孔荧光细胞比例。选取所加病毒稀释液的体积与荧光细胞比例呈正比关系的样本的数据计算病毒滴度，求出平均值，即为两种病毒的实际（生物）滴度。病毒滴度计算公式如下：TU/mL = (P × N / 100 × V) ×1000/DF, TU/mL为病毒滴度；P =荧光阳性细胞比例（%），N =感染时的细胞数量；V = 每孔加入的病毒稀释液的体积（μL）；DF = 稀释系数（10-⁶）。由图1可知，病毒稀释液添加了5uL与添加10uL的孔其荧光细胞比例与所添加的病毒稀释液体积呈正比例关系，表明这两个孔的数据均可用于计算病毒滴度，而所测病毒滴度值则可取两个孔的平均值。

2、通过相对定量PCR测定待测病毒滴度

在24孔培养板中，按照第1部分所述方法接种293FT细胞共24孔，其中12孔用于对照病毒的感染、12孔用于待测病毒的感染。用HBSS缓冲液将两种表达eGFP标记基因的重组慢病毒悬液按照10^-1～10^-6进行10倍梯度稀释。任选其中一个作为对照病毒，另外一个作为待测病毒。每个梯度稀释液分别加入两孔细胞，每孔10μL，充分混匀。培养48小时后，按照FACS法所描述的方法悬浮靶细胞。利用细胞基因组DNA提取试剂盒（Tiangen），提取每孔细胞的总DNA，此时细胞基因组DNA中已包含了病毒基因组。以每孔细胞的总DNA样本为模板，分别针对病毒基因组和靶细胞内参基因进行定量PCR分析。针对慢病毒基因组保守序列的定量PCR引物序列为：上游引物5'-tgccacggcggaactca-3’；下游引物5' -cagccaaggaaaggacgatg -3'；针对内参基因RnaseP的引物序列分别为：上游引物5' -tgagtcagtgagaaggcaagg -3'；下游引物5' -gctgggagggtacacgaga-3'。

定量PCR体系为：SYBR Green Real-time PCR Master Mix 10μL、引物 0.2μL each; 模板（细胞基因组DNA或标准品）1μL、加入去离子水至20uμL；定量PCR反应程序为：95℃ 3min，进入循环：94℃ 30 s，50℃ 30 s，56℃ 30 s，reald plate，共40个循环；之后72℃ 3min，95℃ 1min，55℃ 1min。

以病毒样本的10倍稀释梯度为横坐标、以每个稀释梯度所对应的病毒基因组的Ct值为纵坐标做一相关曲线，选取Ct值与稀释梯度呈线性相关、且稀释梯度相同的对照病毒与待测病毒样本的数据计算待测病毒滴度。图2中，如果Ct值与模板量的对数值呈线性相关，表明定量PCR数据成立；由图2可知，针对病毒基因组和内参基因的定量PCR反应的Ct值与模板量对数值均呈高度线性相关（图例中相关系数r²均为0.998，大于相关系数最低要求值0.98）；根据定量PCR产物扩增效率计算公式E（扩增效率）=10^{-标准曲线斜率}-1，利用相同的样本进行5次重复实验并求取平均值，分别获得病毒基因组的定量PCR扩增效率为1.045、内参基因的定量PCR扩增效率为1.041。由图3可知，两个病毒的后三个稀释梯度的Ct值均与稀释梯度呈线性相关，表明这三个梯度的样本数据均可用于计算R值；为了更准确的测算待测病毒与对照病毒相对含量的比值，在计算待测病毒滴度时，可取三个稀释梯度R值的平均值。

3、待测病毒滴度的计算：

跟据Pfaffl方程计算待测病毒基因组与对照病毒基因组在感染细胞中的相对含量之比，计算公式为R=E1^{（Ct1-Ct2）}/E2^{（Ct3- Ct4）}。其中：R为待测病毒基因组与对照病毒基因组的相对含量之比；E1为病毒基因组定量PCR引物的扩增效率（1.045）；E2为内参基因定量PCR引物的扩增效率（1.041）；Ct1为对照病毒基因组的Ct值、Ct2为待测病毒基因组的Ct值、Ct3为对照病毒样本中内参基因的Ct值、Ct4为待测病毒样本中内参基因Ct值。待测病毒滴度=R×（对照病毒滴度）。

三、实验结果

利用5个滴度已知（被FACS法准确测定）的重组慢病毒，选取其中1个为对照病毒、其余4个为待测病毒。以293FT细胞为感染靶细胞，通过上述方案检测4个待测病毒滴度。结果如下：

通过配对T检测（Paired T-Test），上述两组数据无显著性差异（P=0.476），说明本方法所测定的重组慢病毒滴度与其实际滴度（生物滴度，即FACS检测值）无显著性差异。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。

<110> 中国人民解放军第三军医大学

<120> 重组慢病毒滴度的检测方法

<160> 4

<210> 1

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 慢病毒引物 F

<400> 1

tgccacggcg gaactca 17

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 慢病毒引物 R

<400> 2

cagccaagga aaggacgatg 20

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> RnaseP基因引物 F

<400> 3

tgagtcagtg agaaggcaagg 21

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> RnaseP基因引物R

<400> 4

gctgggaggg tacacgaga 19

Claims

1.重组慢病毒滴度的检测方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

A、对照病毒滴度检测

运用流式细胞分选法检测靶细胞中对照病毒滴度，得对照病毒滴度，所述对照病毒为能表达标记蛋白且与待测病毒具有相同的包膜蛋白和感染嗜性的慢病毒；

B、待测病毒与对照病毒相对含量比值R的确定

将待测病毒梯度稀释液与对照病毒梯度稀释液在相同条件下同时感染相同数量的靶细胞，分别提取待测病毒与对照病毒感染后的靶细胞的总DNA，通过相对定量PCR检测待测病毒与对照病毒的基因组在靶细胞基因组中的相对含量，并获得待测病毒与对照病毒相对含量比值R;

所述相对定量PCR测定中针对病毒基因组的上游引物如SEQ ID No.1所示，下游引物如SEQ ID No.2所示；针对内参基因的上游引物如SEQ ID No.3所示、下游引物如SEQ ID No.4所示；

相对定量PCR检测的反应程序为：95℃条件下 3分钟，进入循环：94℃ 条件下30 秒，50℃ 条件下30秒，56℃条件下30秒，终点读板，共40个循环；之后72℃条件下3分钟，95℃条件下1分钟，55℃条件下1分钟；

C、重组慢病毒滴度的确定

将步骤A所得对照病毒滴度乘以步骤B所得的待测病毒与对照病毒相对含量比值R所得的值为待测病毒滴度，即重组慢病毒滴度。

2. 根据权利要求1所述的重组慢病毒滴度的检测方法，其特征在于：步骤A中，所述标记蛋白为绿色荧光蛋白。

3、根据权利要求1所述的重组慢病毒滴度的检测方法，其特征在于：步骤A中，将对照病毒的悬液先作10⁴～10⁶倍稀释，利用不同体积的病毒稀释液分别感染数量相同的靶细胞；用对照病毒稀释液分别感染靶细胞后，运用流式细胞分选法分别检测每孔感染的靶细胞的荧光细胞比例，计算对照病毒滴度；对照病毒滴度计算公式如下：

TU/mL = (P × N / 100 × V) ×1000/DF, 其中TU/mL 为病毒滴度，P 代表荧光阳性细胞比例，N 代表感染时的细胞数量，V代表每孔加入的病毒稀释液的体积，DF 代表稀释梯度。

4、根据权利要求3所述的重组慢病毒滴度的检测方法，其特征在于：步骤A中，将对照病毒的悬液先作10⁴～10⁶倍稀释，利用2μL、5μL、10μL、20μL、50μL的病毒稀释液分别感染数量相同的靶细胞。

5、根据权利要求1所述的重组慢病毒滴度的检测方法，其特征在于：步骤B中，将对照病毒的悬液和待测病毒的悬液按照10^-1～10^-6分别进行10倍梯度稀释，得对照病毒梯度稀释液和待测病毒梯度稀释液。