CN110669871A - 一种慢病毒转导滴度的测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种慢病毒转导滴度的测定方法。本发明所提供的测定慢病毒转导滴度的方法，包括如下步骤：将待测慢病毒的稀释液加入到K562细胞中进行感染，72小时后测定K562细胞阳性率，进而计算得到所述待测慢病毒的转导滴度。本发明免除了贴壁细胞繁琐的铺板过程，缩短了整个检测的时间，提高了工作效率；一定范围内，K562细胞的阳性率与慢病毒加入量具有较好的相关性；在一定范围内，相同的病毒加入量，K562细胞与T细胞的阳性率具有较高的相关性；K562比293FT细胞对慢病毒更敏感，用K562测定转导滴度的方法灵敏度高，所得转导滴度结果能更直接指导T细胞的病毒使用量。

Description

一种慢病毒转导滴度的测定方法

技术领域

本发明涉及细胞治疗技术领域，特别涉及一种慢病毒转导滴度的测定方法。

背景技术

CAR-T免疫细胞治疗(Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy，嵌合抗原受体T细胞免疫疗法)，是当今最新最有效的治疗肿瘤的“活体药”。从1993年ZeligEshhar与Steven Rosenberg联合发表了第一代CAR-T细胞研究到2012年4月，7岁的Emily成为世界第一例儿童急性淋巴细胞白血病CAR-T受试者，CAR-T技术得到了飞速发展，因此被顶级学术期刊《科学》杂志评为2013年十大科学突破之首。

CAR-T免疫细胞治疗的作用机理是利用基因工程技术手段，特异性改造患者自身的免疫T细胞，使其能够识别肿瘤细胞，从而实现特异性杀伤的作用。其治疗流程主要有：(1)从癌症患者体内分离免疫T细胞；(2)经过基因工程手段对T细胞进行靶向修饰并同时激活T细胞的嵌合抗原，获得CAR-T细胞；(3)体外培养，大量扩增CAR-T细胞(4)将扩增后的CAR-T细胞回输至病人体内，特异性的杀死癌细胞。

自2018年6月中国食品药品检定研究院正式发布了《CAR-T细胞治疗产品质量控制检测研究及非临床研究考虑要点》(以下简称《考虑要点》)，其中对慢病毒的转导滴度做出了明确规定。《考虑要点》指出，将病毒载体转导敏感细胞系(如293T细胞、HT-1080细胞等)或原代细胞(如PBMC)后，检测细胞CAR表达阳性率或CAR基因拷贝数，计算其转导滴度(TU/ml)。但由于不同的细胞对病毒载体的敏感性不同，不同的检测参数对病毒载体转导滴度结果也不同，因此，选择何种细胞、检测何种指标进行病毒载体的转导滴度的测定需要进行充分的验证，同时，鼓励研究者在临床试验过程，探索病毒载体转导滴度测定结果与转导T细胞所用的病毒量、CAR-T细胞阳性率以及临床有效性之间的关系，以建立最适病毒滴度测定方法及病毒载体转导剂量。因此，有必要建立一种慢病毒转导滴度测定方法，其结果与转导T细胞所用的病毒量、CAR-T细胞阳性率之间具有较高的一致性，并且操作流程简单。

生物行业内测定慢病毒的转导滴度主要通过人胚胎肾细胞株293细胞进行，其主要步骤：(1)提前一天将293细胞消化、收集、计数、铺板；(2)在转染当天将病毒样品按照一定比例稀释，转染贴壁的293细胞，空白孔进行消化计数，用于转导滴度的计算；(3)转染后24h，进行补液；(4)转染后68-72h消化收集细胞进行流式检测。293细胞是一种贴壁细胞，不仅细胞处理较悬浮细胞繁琐，而且整个检测周期为5天，一定程度上降低了检测的效率。

K562是一种人类髓性白血病细胞，细胞悬浮生长，培养流程简单，主要应用于研究肿瘤和白血病治疗、药物靶标领域。目前尚未有将其用于慢病毒转导滴度测定的相关报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种慢病毒转导滴度的测定方法。

第一方面，本发明要求保护K562细胞在测定慢病毒转导滴度中的应用。

第二方面，本发明要求保护一种测定慢病毒转导滴度的方法。

本发明所提供的测定慢病毒转导滴度的方法，可包括如下步骤：将待测慢病毒的稀释液加入到K562细胞悬液中进行感染，72小时后测定K562细胞阳性率(即被所述待测慢病毒感染的K562细胞占细胞总数的百分比)，进而计算得到所述待测慢病毒的转导滴度。

进一步地，所述方法可包括如下步骤：用含有病毒助感染试剂的K562细胞所用培养基将所述待测慢病毒的原液进行梯度稀释，得到系列慢病毒的稀释液；将所得慢病毒稀释液分别加入到培养相同数量K562细胞的培养体系中；培养72小时后检测K562细胞阳性率(即被所述待测慢病毒感染的K562细胞占细胞总数的百分比)，进而计算得到所述待测慢病毒的转导滴度。

其中，加入所述慢病毒稀释液后，培养体系中K562细胞的含量为2×10⁶个/mL。

在本发明的具体实施方式中，是24孔板，每孔1×10⁶个K562细胞，加入所述慢病毒稀释液后每孔终体积500μL。

进一步地，所述待测慢病毒的转导滴度可根据所述K562细胞阳性率按照如下公式计算所得：

转导滴度(TU/mL)＝感染时K562细胞数×K562细胞阳性率×稀释倍数×1000/加入的慢病毒样品体积(μL)。

其中，所述稀释倍数为对所述慢病毒样品的稀释倍数。

实际操作中，做线性相关性分析选择相关性最好的一组或几组数据，进而取平均值。

进一步地，所述方法中，在所述“将所得慢病毒稀释液分别加入到培养相同数量K562细胞的培养体系中”后，还可包括将所述培养体系于35℃872g离心2h的步骤。

更进一步地，在将所述培养体系于35℃872g离心2h后，将所述培养体系置于37℃5％CO₂培养箱中培养24h，然后补加等体积的不含有病毒助感染试剂的K562细胞所用培养基，37℃5％CO₂培养箱中继续培养48h后测定所述K562细胞阳性率。

在所述方法中，所述K562细胞所用培养基的基本成分为1640培养基。所述病毒助感染试剂为硫酸鱼精蛋白(Protamine SuLfate，PS)。相应的，所述含有病毒助感染试剂的K562细胞所用培养基具体可为含有10％FBS和8ug/mL PS的1640培养基，％表示体积百分含量。所述不含有病毒助感染试剂的K562细胞所用培养基具体可为含有10％FBS的1640培养基(％表示体积百分含量)。

在本发明的具体实施方式中，所述PS具体为悦康药业集团有限公司产品，货号为H11020246(Protamine SuLfate injection，硫酸鱼精蛋白注射液；级别：药用)。

在所述方法中，所述测定K562细胞阳性率为利用流式细胞术检测K562细胞阳性率。

第三方面，本发明要求保护如下任一应用：

(A1)前文所述方法在指导或估算重组慢病毒在转导T细胞时所用病毒量中的应用；

(A2)前文所述方法在指导或估算利用重组慢病毒制备所得的CAR-T细胞阳性率中的应用；

所述重组慢病毒为前文所述的待测慢病毒或者与所述待测慢病毒具有相同的包膜蛋白和感染嗜性的其他慢病毒。如所述待测慢病毒可为经标记蛋白(如荧光蛋白)标记的慢病毒，而所述重组慢病毒可为未经所述标记蛋白标记的所述待测慢病毒(即所述待测慢病毒去除所述标记蛋白)。

在本发明的具体实施方式中，所述待测慢病毒具体为能够表达胞内区截短的表皮生长因子受体(tEGFR)的重组慢病毒。进一步地，所述胞内区截短的表皮生长因子受体(tEGFR)的氨基酸序列为GenBank：NP_001333870.1的第67-401位。

本发明的优点是：①免除了贴壁细胞繁琐的铺板过程，缩短了整个检测的时间，提高了工作效率；②一定范围内，K562细胞的阳性率与慢病毒加入量具有较好的相关性；③在一定范围内，相同的病毒加入量，K562细胞与T细胞的阳性率具有较高的相关性。④K562比293FT细胞对慢病毒更敏感，用K562测定转导滴度的方法灵敏度高，所得转导滴度结果能更直接指导T细胞的病毒使用量。

附图说明

图1为流式检测最佳时间的选择。

图2为K562细胞最佳接种浓度的选择。

图3为慢病毒加入量与K562细胞阳性率之间的线性关系。

图4为K562和T细胞的相关性。

图5为检测细胞阳性率与T细胞阳性率的比较。

图6为相同病毒量两种检测细胞的阳性率与T细胞的阳性率相关性比较。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所用到的PS具体为悦康药业集团有限公司产品，货号为H11020246。Protamine SuLfate injection(简称PS)，硫酸鱼精蛋白注射液；级别：药用；药品浓度：10mg/mL；感染培养基中PS的使用浓度为8ug/mL，即1mL培养基中加入8uL PS。

下述实施例中所用到的13个慢病毒样品(S1-S13)具体为河北森朗生物利用贴壁四质粒系统生产的不同批次的PLV_M1904(慢病毒能够表达tEGFR蛋白，故可以通过抗tEGFR的荧光抗体与K562阳性细胞中的tEGFR序列特异性结合，从而指示出慢病毒对K562细胞感染率，即阳性率)。制备过程大致如下：

1、细胞铺板：

A.将含有10％胎牛血清的DMEM、PBS及TrypLE^TM EXPRESS放于37℃5％CO₂的细胞培养箱中预热30min。

B.将已长到80％-90％的293FT，用PBS清洗细胞一次，每个T175的细胞培养瓶中加入2mL TrypLE^TM EXPRESS，让其充分平铺于细胞表面，盖好瓶盖，将其放在显微镜下观察，直至细胞变圆，加入4mL含有10％胎牛血清的DMEM培养基终止消化，用移液管将瓶壁细胞吹下，将细胞液转移至15mL无菌离心管中，1500rpm离心5min，弃上清，重悬细胞并计数。

C.293FT细胞以9×10⁶个/145mm平皿接种，每个145mm平皿加20mL DMEM完全培养基，摇晃均匀，放置37℃5％CO₂的细胞培养箱中继续培养。

2、质粒包装：铺板第二天进行质粒包装。

A.将

buffer、

四种质粒pMD2.G、pMDLg/pRRE、pRSV/REV、PLV_M1904恢复室温。其中，pMD2.G、pMDLg/pRRE、pRSV/REV三种辅助质粒从武汉淼灵公司购买。目的质粒PLV_M1904是按照如下方法构建得到的：将集落刺激因子信号肽(GenBank：EAW98673的第1-22位氨基酸序列)、FMC63单链抗体序列(GenBank：ADM64594.1的第23-267位氨基酸序列)、CD8的绞链区与跨膜区序列(GenBank：NP_001139345.1的第138-206位氨基酸序列)、4-1BB共刺激信号域(GenBank：NP_001552.2的第214-255位氨基酸序列)以CD3ζ信号域(GenBank：NP_000725.1的第52-163位氨基酸序列)以及T2A(GenBank：ANG83987.1的第721-744位氨基酸序列)和tEGFR(GenBank：NP_001333870.1的第67-401位氨基酸序列)序列用基因合成的方式依次拼接后，克隆到pLenti的载体(Addgene)的多克隆区，即得所述PLV_M1904质粒。

B.按每个145mm平皿1.25mL

buffer、3.75μg pMD2.G、15μg pMDLg/pRRE、3.75μg pRSV/REV、15μg PLV_M1904的量将以上溶液混合均匀。向混合液中加入

62.5μL/145mm平皿，再次混合均匀，室温静置10min。

C.将用于包装质粒的293FT细胞从37℃5％CO₂的细胞培养箱中取出，将上述混合液平均分配到145mm平皿的培养基中，轻轻摇匀，放入37℃5％CO₂培养箱中。

3、换液

包装4h后，弃旧培养基，加入5mL已预热的PBS清洗细胞，再加入20mL新鲜的已预热的含10％胎牛血清的DMEM培养基，放入37℃5％CO₂培养箱中。

4、收集病毒

质粒包装后48h-72h收取病毒原液。将原液收集到50ml离心管中，872g离心5min。将上清液进行分装，-80℃冰箱保存。

实施例1、建立利用K562细胞测定慢病毒转导滴度的方法

一、流式最佳检测时间的选择

1、配制感染培养基：含有10％FBS和8ug/mL的1640培养基。配制1640完全培养基，为含有10％FBS 1640培养基。％表示体积百分含量。

2、收集生长状态良好的K562细胞并计数。

3、按照3×10⁵个/孔的细胞量，接种24孔细胞培养板。

4、选择4个慢病毒样品(S1、S2、S3、S4)，用步骤1配制的感染培养基将慢病毒样品按照一定梯度(如2倍稀释梯度)进行稀释，混合均匀后，分别加入已铺好的24孔中，每孔终体积为500μL。

5、提前预热离心机至35℃，将24孔板放入离心机，2000rpm(相当于872g)离心2h，离心结束后，放入37℃5％CO₂培养箱中培养。

6、培养24h后，每孔补加步骤1配制的1640完全培养基500μL，37℃5％CO₂培养箱中继续培养。

7、分别于感染(对应步骤4)后48h、72h、144h进行取样，通过流式细胞术检测K562细胞的阳性率(被慢病毒感染的K562细胞占细胞总数的百分比)(采用抗tEGFR的荧光抗体对感染后的K562细胞进行避光孵育，通过荧光检测阳性K562细胞)(表1)。

表1流式检测取样时间的选择

8、根据K562细胞的阳性率计算出慢病毒的转导滴度，计算公式如下：

转导滴度(TU/mL)＝接种时(感染时)细胞数×阳性率×稀释倍数×1000/加入慢病毒样本体积(μL)。

其中，阳性率为流式细胞检测所得的K562细胞阳性率；稀释倍数为将慢病毒样品进行稀释的倍数。

最终的转导滴度选择线性关系良好的一组结果或者线性关系良好的几组结果，计算均值。下同。

结果如图1所示：四个慢病毒样品(S1、S2、S3、S4)均在感染后第2天、第3天和第6天取样进行流式检测，可见第3天K562细胞阳性率明显高于第二天，且与第6天无明显差异，故感染后第3天为流式检测的最佳时间。

二、K562细胞最佳接种量的选择

1、配制感染培养基：含有10％FBS和8ug/mL PS的1640培养基。配制1640完全培养基，为含有10％FBS 1640培养基。％表示体积百分含量。

2、收集生长状态良好的K562细胞并计数。

3、按照表2所示，将K562细胞接种24孔细胞培养板。

4、按照表2所示，用步骤1配制感染培养基将各供试的慢病毒样品S5按照一定梯度进行稀释，混合均匀后，分别加入已铺好的24孔中，每孔终体积为500μL。

表2 K562细胞最佳接种浓度的选择

5、提前预热离心机至35℃，将24孔板放入离心机，2000rpm(相当于872g)离心2h，离心结束后，放入37℃5％CO₂培养箱中培养。

6、培养24h后，每孔补加步骤1配制的1640完全培养基500μL，37℃5％CO₂培养箱中继续培养。

7、再培养48h，然后取样，通过流式细胞术检测K562细胞的阳性率(被慢病毒感染的K562细胞占细胞总数的百分比)。

8、根据K562细胞的阳性率计算出慢病毒的转导滴度，计算公式如下：

转导滴度(TU/mL)＝接种时(感染时)细胞数×阳性率×稀释倍数×1000/加入慢病毒样品体积(μL)。

其中，阳性率为流式细胞检测所得的K562细胞阳性率；稀释倍数为将慢病毒样品进行稀释的倍数。

结果：考虑K562细胞生长的最适密度为≤1×10⁶个/mL，故本发明细胞接种量设置3×10⁵个/孔、6×10⁵个/孔和1×10⁶个/孔三个梯度，分别加入2.5μL、5μL、10μL的慢病毒样品。转导滴度结果如图2所示，可见，使用24孔板进行转导滴度测定时，K562细胞最佳接种量为1×10⁶个/孔。

实施例2、慢病毒量与K562细胞阳性率之间的线性关系

1、配制感染培养基：含有10％FBS和8ug/mL PS的1640培养基。配制1640完全培养基，为含有10％FBS 1640培养基。％表示体积百分含量。

2、收集生长状态良好的K562细胞并计数。

3、按照1×10⁶个/孔的细胞量，接种24孔细胞培养板。

4、选择3个慢病毒样品(S6、S7、S8)，按照表3用步骤1配制的感染培养基将慢病毒样品按照一定梯度进行稀释，混合均匀后，分别加入已铺好的24孔中，每孔终体积为500μL。

表3三个样品加入的病毒量

5、提前预热离心机至35℃，将24孔板放入离心机，2000rpm(相当于872g)离心2h，离心结束后，放入37℃5％CO₂培养箱中培养。

6、培养24h后，每孔补加步骤1配制的1640完全培养基500μL，37℃5％CO₂培养箱中继续培养。

7、再培养48h，然后取样，通过流式细胞术检测K562细胞的阳性率(被慢病毒感染的K562细胞占细胞总数的百分比)。

8、根据K562细胞的阳性率计算出慢病毒的转导滴度，计算公式如下：

转导滴度(TU/mL)＝接种时(感染时)细胞数×阳性率×稀释倍数×1000/加入慢病毒样品体积(μL)。

其中，阳性率为流式细胞检测所得的K562细胞阳性率；稀释倍数为将慢病毒样品进行稀释的倍数。

结果如图3所示，在一定体积范围内，K562细胞的阳性率随慢病毒的加入量的增加而线性增加，且两者之间的线性相关性良好，故K562细胞可以作为评估慢病毒转导滴度的工具细胞。

实施例3、加入相同病毒量，T细胞阳性率与K562阳性率之间的相关性

1、感染前两天，激活T细胞：将新鲜的PBMC进行CD3分选，所得T细胞按照3×10⁵个/孔接种于24孔板中，加入磁珠激活T细胞。

2、配制感染培养基：

K562细胞：含有10％FBS和8ug/mL PS的1640培养基。％表示体积百分含量。

T细胞：TEXMACS+200IU/mL IL-2+8ug/mL PS。

配制完全培养基：

K562细胞：1640完全培养基，含有10％FBS的1640培养基，％表示体积百分含量。

T细胞：TEXMACS+200IU/mL IL-2。

3、收集生长状态良好的K562细胞和T细胞并计数。

4、K562细胞按照1×10⁶个/孔的细胞量，接种24孔细胞培养板。T细胞按照3×10⁵个/孔的细胞量，接种24孔细胞培养板。

5、选择2个慢病毒样品(S9、S10)，按照表4用步骤1配制的感染培养基将慢病毒样品按照一定梯度进行稀释，混合均匀后，分别加入已铺好的24孔中，每孔终体积为500μL。

表4 K562/T病毒量列表

5、提前预热离心机至35℃，将24孔板放入离心机，2000rpm(相当于872g)离心2h，离心结束后，放入37℃5％CO₂培养箱中培养。

6、培养24h后，每孔补加步骤1配制的完全培养基500μL，37℃5％CO₂培养箱中继续培养。

7、再培养48h，然后取样，通过流式细胞术分别检测K562细胞和T细胞的阳性率(被慢病毒感染的K562细胞和T细胞占细胞总数的百分比)。

8、根据K562细胞和T细胞的阳性率计算出慢病毒的转导滴度，计算公式如下：

转导滴度(TU/mL)＝感染时细胞数×阳性率×稀释倍数×1000/加入病毒原液体积(μL)。

其中，阳性率为流式细胞检测所得的K562细胞和T细胞阳性率；稀释倍数为将慢病毒样品进行稀释的倍数。

结果如图4所示，由图可知，选择两个不同批次的慢病毒样品S9和S10，当按照一定梯度加入慢病毒时，K562细胞和T细胞的阳性率都随慢病毒加入量的增加而增加，且两种细胞的阳性率之间的线性相关性良好，故K562细胞所得慢病毒转导滴度的结果可以对T细胞所用病毒量进行评估。

实施例4、K562与293FT对比试验

1、D-2(感染前两天)激活T细胞：将新鲜的PBMC进行CD3分选，所得T细胞按照3×10⁵个/孔接种于24孔板中，加入磁珠激活T细胞。

2、D-1(感染前一天)接种293FT细胞：收集生长状态良好的293FT细胞，用含有10％(体积百分含量)FBS的DMEM培养基重悬，24孔板每孔1×10⁵个细胞，培养基体积为500μL。

3、D0(感染当天)配制感染培养基：

K562细胞：含有10％FBS和8ug/mL PS的1640培养基。％表示体积百分含量。

T细胞：TEXMACS+200IU/mL IL-2+8ug/mL PS。

293FT细胞：含有10％FBS和8ug/mL PS的DMEM培养基，％表示体积百分含量。

配制完全培养基：

K562细胞：1640完全培养基，含有10％FBS的1640培养基，％表示体积百分含量。

T细胞：TEXMACS+200IU/mL IL-2。

293FT细胞：含有10％FBS的DMEM培养基，％表示体积百分含量。

4、D0(感染当天)接种：收集生长状态良好的K562和激活的T细胞并计数；K562细胞按照1×10⁶个/孔的细胞量，接种24孔细胞培养板；T细胞按照3×10⁵个/孔的细胞量，接种24孔细胞培养板。

5、D0(感染当天)计数：收集D-1(对应步骤2)所铺24孔板中293FT细胞1孔，进行计数。

6、D0(感染当天)加入样品：选择3个慢病毒样品(S11、S12、S13)，按照表5加入相同体积的慢病毒，混合均匀后，加入已铺好的24孔中，每孔终体积为500μL。

表5三种细胞加慢病毒体积列表

7、D0(感染当天)感染：提前预热离心机至35℃，将感染有慢病毒的K562和T细胞24孔板放入离心机，2000rpm(相当于872g)离心2h，离心结束后，放入37℃5％CO₂培养箱中培养；将感染有慢病毒的293FT细胞的24孔板直接放入37℃5％CO₂培养箱中培养；

8、培养24h后，每孔补加步骤3配制的完全培养基500μL，37℃5％CO₂培养箱中继续培养；

9、再培养48h，然后取样，通过流式细胞术分别检测K562细胞、T细胞和293FT细胞的阳性率(被慢病毒感染的K562细胞、T细胞、293FT细胞占细胞总数的百分比)。

结果如图5、图6所示。由图可知，加入相同病毒量时，相对于293FT细胞，K562细胞的阳性率明显与T细胞的阳性率更为接近，可见K562细胞较293FT对慢病毒更为敏感；同时，加入相同病毒量时，K562细胞与行业内常用的293FT细胞所得阳性率与T细胞的阳性率之间的相关性无明显差异，故K562细胞更合适于指导T转导细胞所用的病毒量。

Claims (10)

1.K562细胞在测定慢病毒转导滴度中的应用。

2.一种测定慢病毒转导滴度的方法，包括如下步骤：将待测慢病毒的稀释液加入到K562细胞悬液中进行感染，72小时后测定K562细胞阳性率，进而计算得到所述待测慢病毒的转导滴度。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：用含有病毒助感染试剂的K562细胞所用培养基将所述待测慢病毒的原液进行梯度稀释，得到系列慢病毒的稀释液；将所得慢病毒稀释液分别加入到培养相同数量K562细胞的培养体系中；培养72小时后检测K562细胞阳性率，进而计算得到所述待测慢病毒的转导滴度。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：加入所述慢病毒稀释液后，培养体系中K562细胞的含量为2×10⁶个/mL。

5.根据权利要求2-4中任一所述的方法，其特征在于：所述待测慢病毒的转导滴度是根据所述K562细胞阳性率按照如下公式计算所得的：

转导滴度(TU/mL)＝感染时K562细胞数×K562细胞阳性率×稀释倍数×1000/加入的慢病毒样品体积(μL)。

6.根据权利要求3-5中任一所述的方法，其特征在于：在所述“将所得慢病毒稀释液分别加入到培养相同数量K562细胞的培养体系中”后，还包括将所述培养体系于35℃872g离心2h的步骤。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：在将所述培养体系于35℃872g离心2h后，将所述培养体系置于37℃5％CO₂培养箱中培养24h，然后补加等体积的不含有病毒助感染试剂的K562细胞所用培养基，37℃5％CO₂培养箱中继续培养48h后测定所述K562细胞阳性率。

8.根据权利要求2-7中任一所述的方法，其特征在于：所述K562细胞培养基的基本成分为1640培养基；和/或

所述病毒助感染试剂为硫酸鱼精蛋白。

9.根据权利要求2-8中任一所述的方法，其特征在于：所述测定K562细胞阳性率为利用流式细胞术检测K562细胞阳性率。

10.如下任一应用：

(A1)权利要求2-9中任一所述方法在指导或估算重组慢病毒在转导T细胞时所用病毒量中的应用；

(A2)权利要求2-9中任一所述方法在指导或估算利用重组慢病毒制备所得的CAR-T细胞阳性率中的应用；

所述重组慢病毒为权利要求2-9任一中所述的待测慢病毒或者与所述待测慢病毒具有相同的包膜蛋白和感染嗜性的其他慢病毒。

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