CN113699210A - 一种利用悬浮细胞测定病毒的tcid50的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物领域，公开了一种利用悬浮细胞测定病毒的TCID50的方法，步骤1：绘制健康悬浮细胞的标准生长曲线；步骤2：分成若干个揺瓶待接种病毒；步骤3：按照设定倍比稀释得到不同稀释度的接种病毒液，同时设立接种等量新鲜培养基的揺瓶细胞作为阴性对照组；步骤4：定期检测接毒组和阴性对照组的细胞密度和活度，参考已绘制的健康悬浮细胞的标准生长曲线，在健康细胞结束平台期进入衰老期之前结束试验；步骤5：根据步骤4统计的阳性和阴性结果，计算TCID50。该方法克服了悬浮细胞培养无法直接观察细胞病变，以及贴壁细胞感染病毒变圆的病变细胞容易和成团的健康细胞相混淆等问题，操作简单，指标明确，可操作性强。

Description

一种利用悬浮细胞测定病毒的TCID50的方法
技术领域
本发明涉及生物领域，具体涉及一种利用悬浮细胞测定病毒的TCID50的方法。
背景技术
利用悬浮细胞培养的病毒，因细胞不贴壁，无法直接观察细胞病变噬斑，因此，在测定TCID50方面，原有技术只能通过将病毒感染其他贴壁细胞，观察贴壁细胞病变或对病变不明显的样品的培养物抽提核酸进行PCR，看是否出现特异性条带来判定是否存在病原微生物感染。
这种技术存在以下几个缺点：1.有些贴壁细胞本身很容易成团变圆，特别是在病毒含量低的情况下难以将这种状态的健康细胞和因感染病毒出现的病变细胞区分；2.每个样品都要抽提核酸，过程繁琐，耗时耗力，难以在生产中大批量开展运用；3.PCR无法区分特异性条带来自起始感染阶段的活病毒还是死病原微生物核酸，导致结果假阳性；4.某些情况下因为培养物或病料的模板原因，引物出现非特异扩增，或杂带干扰判断；5.即使是属于针对有感染性病毒粒子的特异性扩增，PCR方法仍然比常规的TCID50方法过于敏感，因为仅有若干个活病毒粒子并不一定能导致肉眼可见的细胞病变；6.间接免疫荧光法IFA需要制备病毒特异性的抗体。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用悬浮细胞测定病毒的TCID50的方法，该方法可以方便的观测到阳性结果，避免传统的贴壁细胞所出现假阳性的情况，也避免了采用PCR方法出现的过于敏感、无法分辨真假阳性的情况；本发明的方法可以准确的测量病毒的TCID50。
本发明的具体方案如下：一种利用悬浮细胞测定病毒的TCID50的方法，包括如下步骤：
步骤1：选择合适的起始培养密度，用揺瓶按悬浮细胞要求的常规条件培养健康悬浮细胞，定期测定细胞密度和活度，在此基础上绘制健康悬浮细胞的标准生长曲线；
步骤2：用揺瓶从步骤1所用的起始培养密度开始培养健康悬浮细胞，进入对数生长期后利用新鲜培养基将细胞稀释到步骤1所用的起始培养密度，再按需要等分成若干个揺瓶待接种病毒；
步骤3：取适量待测定TCID50的病毒原液，用新鲜培养基按照设定倍比稀释得到不同稀释度的接种病毒液，取一定剂量的接种病毒液分别将其接种到揺瓶细胞中，同时设立接种等量新鲜培养基的揺瓶细胞作为阴性对照组，按悬浮细胞要求的常规条件培养；
步骤4：定期检测接毒组和阴性对照组的细胞密度和活度，参考已绘制的健康悬浮细胞的标准生长曲线，在健康细胞结束平台期进入衰老期之前结束试验，在此期间，只要出现接毒组的细胞密度和/或活度降至阴性对照组细胞密度和/或活度的95％以下即为阳性；
步骤5：根据步骤4统计的阳性和阴性结果，计算TCID50。
在上述的利用悬浮细胞测定病毒的TCID50的方法中，步骤1中，悬浮细胞为适应悬浮培养的LMH悬浮细胞、DF-1悬浮细胞、ST悬浮细胞、EB66细胞之一。
在上述的利用悬浮细胞测定病毒的TCID50的方法中，所述悬浮细胞为LMH细胞，LMH悬浮细胞的起始培养密度为0.5×106-2×106cells/ml。
DF-1悬浮细胞、ST悬浮细胞、EB66细胞采用的起始培养密度可根据其在所用悬浮培养基中的生长曲线确定。
在上述的利用悬浮细胞测定病毒的TCID50的方法中，步骤2中，每个稀释度的病毒液均至少接种4个揺瓶细胞作为4个重复。
当然，在不考虑经费和人力损耗的情况下，每个稀释度的病毒液接种揺瓶细胞的重复数越多越好。
在上述的利用悬浮细胞测定病毒的TCID50的方法中，所述步骤4的计算方法为Reed-Muench两氏法或Karber法。
在上述的利用悬浮细胞测定病毒的TCID50的方法中，所述接种病毒液按照10倍倍比稀释。
在实际应用中，倍比稀释梯度并不限于10倍，其他倍率也是可以的。
在上述的利用悬浮细胞测定病毒的TCID50的方法中，若出现接毒组的细胞密度和/或活度降至阴性对照组细胞密度和/或活度的90％以下，则判断该接毒组为阳性。
在上述的利用悬浮细胞测定病毒的TCID50的方法中，所述病毒为禽腺病毒、鸡传染性法氏囊病病毒、鸡传染性支气管炎病毒、猪瘟病毒之一。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
该方法可以方便的观测到阳性结果，避免传统的贴壁细胞所出现假阳性的情况，也避免了采用PCR方法出现的过于敏感、无法分辨真假阳性的情况。
本方法利用观察揺瓶培养的悬浮细胞感染病毒后的细胞密度和活度变化判定细胞发生病变，代替传统的贴壁细胞铺板观察病变，克服了悬浮细胞无法观察细胞噬斑，而贴壁细胞在病毒量低的情况下病变不容易和成团的健康细胞辨别等问题，操作简单，指标明确，可操作性强。
本方法根据阳性结果，可以准确的测量病毒的TCID50。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明作进一步的描述，但不构成对本发明的任何限制，任何在本发明权利要求范围所做的有限次的修改，仍在本发明的权利要求范围内。
实施例1
悬浮LMH细胞培养禽腺病毒的病毒含量测定
1.利用新鲜培养基取适量悬浮LMH细胞按1.0×106cells/ml密度接种起始培养，连续观察8天，每隔24小时取样，利用细胞自动分析仪测定细胞密度和活度，并记录结果，绘制健康悬浮LMH细胞的生长标准曲线。结果见表1，说明健康悬浮LMH细胞按1.0×106cells/ml密度接种起始培养后3～5天处于对数生长期，培养后6～8天处于平台期。
表1健康悬浮LMH细胞生长标准曲线
培养时间 1天 2天 3天 4天 5天 6天 7天 8天
细胞密度(10<sup>6</sup>cells/ml) 1.78 2.66 4.13 7.86 13.53 19.88 20.87 20.55
细胞活度(％) 99.8 99.8 99.7 99.5 99.4 99.4 99.3 99.2
2.利用新鲜培养基取适量悬浮LMH细胞按1.0×106cells/ml密度接种起始培养。培养至第3天进入对数生长期，密度达到4～5×106cells/ml，再利用新鲜培养基将悬浮LMH细胞按1.0×106cells/ml密度稀释后，将得到的细胞悬液等量分装到35个125ml规格揺瓶中，每个揺瓶培养约30ml细胞悬液，放入摇床培养箱中按悬浮细胞要求的常规条件培养。
3.根据经验以及已有数据等，估算待测的禽腺病毒的病毒含量为108～9TCID50/ml，使用新鲜培养基将禽腺病毒按10倍递次稀释法释成10-6、10-7、10-8、10-9、10-10、10-11不同稀释度，分别将不同稀释度病毒接种到5个步骤1中准备好的揺瓶细胞中，每个揺瓶细胞加入1ml的病毒稀释液，每个稀释度接种组揺瓶分别标记1～5号，同时设立5个接种1ml的新鲜培养基的揺瓶细胞作为阴性对照组。放入摇床培养箱中按悬浮细胞要求的常规条件培养。
4.接种病毒培养后第8天取每个揺瓶中的细胞悬液，利用细胞自动分析仪测定细胞密度和活度，并记录结果，此时阴性对照组的健康细胞进入平台期，只要出现接毒组细胞密度或活度比对照组细胞出现下降即证明细胞感染病毒导致细胞病变(CPE)，记为阳性；若与阴性对照组相当，则记为阴性。记录结果及CPE判定见表2，统计结果见表3。
5.根据表2的结果，可见阴性对照组5个揺瓶的细胞的密度和活率均符合健康LMH细胞生长标准曲线，判定无细胞病变，说明阴性对照成立，根据表3的统计结果按Reed-Muench两氏法计算TCID50＝10E-8.5，即所测定的禽腺病毒的病毒含量为108.5TCID50/ml。
表2接种不同稀释度病毒培养后第8天揺瓶中细胞悬液的细胞密度和细胞活度以及细胞病变的阴性和阳性判断结果
Figure BDA0002656573950000041
Figure BDA0002656573950000051
注：“-”表示细胞病变阴性、“+”表示细胞病变阳性
表3接种不同稀释度病毒培养后第8天有细胞病变(CPE)的揺瓶数量统计结果
Figure BDA0002656573950000052
TCID50测定方法见中华人民共和国兽药典(2015版三部)第207页《半数致死(感染)量(LD50、ELD50、ID50、EID50、TCID50)测定法》。
总结：本法利用观察揺瓶培养的悬浮细胞感染病毒后的细胞密度和活度变化判定细胞发生病变，代替传统的贴壁细胞铺板观察病变，该方法克服了悬浮细胞培养无法直接观察细胞病变，以及贴壁细胞感染病毒变圆的病变细胞容易和成团的健康细胞相混淆等问题，操作简单，指标明确，可操作性强。

Claims (8)

1.一种利用悬浮细胞测定病毒的TCID50的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1：选择合适的起始培养密度，用揺瓶按悬浮细胞要求的常规条件培养健康悬浮细胞，定期测定细胞密度和活度，在此基础上绘制健康悬浮细胞的标准生长曲线；
步骤2：用揺瓶从步骤1所用的起始培养密度开始培养健康悬浮细胞，进入对数生长期后利用新鲜培养基将细胞稀释到步骤1所用的起始培养密度，再按需要等分成若干个揺瓶待接种病毒；
步骤3：取适量待测定TCID50的病毒原液，用新鲜培养基按照设定倍比稀释得到不同稀释度的接种病毒液，取一定剂量的接种病毒液分别将其接种到揺瓶细胞中，同时设立接种等量新鲜培养基的揺瓶细胞作为阴性对照组，按悬浮细胞要求的常规条件培养；
步骤4：定期检测接毒组和阴性对照组的细胞密度和活度，参考已绘制的健康悬浮细胞的标准生长曲线，在健康细胞结束平台期进入衰老期之前结束试验，在此期间，只要出现接毒组的细胞密度和/或活度降至阴性对照组细胞密度和/或活度的95％以下即为阳性；
步骤5：根据步骤4统计的阳性和阴性结果，计算TCID50。
2.根据权利要求1所述的利用悬浮细胞测定病毒的TCID50的方法，其特征在于，步骤1中，悬浮细胞为适应悬浮培养的LMH悬浮细胞、DF-1悬浮细胞、ST悬浮细胞、EB66细胞之一。
3.根据权利要求2所述的利用悬浮细胞测定病毒的TCID50的方法，其特征在于，所述悬浮细胞为LMH悬浮细胞，LMH悬浮细胞的起始培养密度为0.5×106-2×106cells/ml。
4.根据权利要求1所述的利用悬浮细胞测定病毒的TCID50的方法，其特征在于，步骤2中，每个稀释度的病毒液均至少接种4个揺瓶细胞。
5.根据权利要求1所述的利用悬浮细胞测定病毒的TCID50的方法，其特征在于，所述步骤4的计算方法为Reed-Muench两氏法或Karber法。
6.根据权利要求1所述的利用悬浮细胞测定病毒的TCID50的方法，其特征在于，所述接种病毒液按照10倍倍比稀释。
7.根据权利要求1-6任一所述的利用悬浮细胞测定病毒的TCID50的方法，其特征在于，若出现接毒组的细胞密度和/或活度降至阴性对照组细胞密度和/或活度的90％以下，则判断该接毒组为阳性。
8.根据权利要求1-6任一所述的利用悬浮细胞测定病毒的TCID50的方法，其特征在于，所述病毒为禽腺病毒、鸡传染性法氏囊病病毒、鸡传染性支气管炎病毒、猪瘟病毒之一。
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