CN105986045A - 一种鉴别检测ii类新城疫病毒强弱毒的焦磷酸测序方法 - Google Patents

一种鉴别检测ii类新城疫病毒强弱毒的焦磷酸测序方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于动物病原检测技术领域，涉及一种鉴别检测II类新城疫病毒强弱毒的焦磷酸测序方法，先设计可区分所有II类新城疫病毒强毒株与弱毒株的特异性RT-PCR扩增引物和焦磷酸测序引物；再提取待测样品RNA，用RT-PCR扩增引物进行扩增；通过琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，若扩增产物长度为218bp，则制备焦磷酸测序单链模板，进行焦磷酸测序反应，最后根据RT-PCR扩增结果和焦磷酸测序结果来判定样品中是否含有II类新城疫病毒强毒株或弱毒株；本发明应用焦磷酸测序技术，通过特定序列测定实现II类新城疫病毒强弱毒鉴定，具有高通量、低成本等特点，且所需样品量小、操作简便、结果判定标准简单，满足进行早期确诊的目的，在疫情监测、快速诊断和出入境检验检疫中具有广阔的应用前景。

Description

一种鉴别检测II类新城疫病毒强弱毒的焦磷酸测序方法
技术领域
本发明属于动物病原检测技术领域，涉及一种鉴别检测II类新城疫病毒强弱毒的焦磷酸测序方法。
背景技术
新城疫（Newcastle disease, ND）是由新城疫病毒（Newcastle disease virus, NDV）强毒感染所引起的一种禽的急性、高度接触性传染病。新城疫强毒感染禽类后，可导致禽类出现典型的新城疫症状和病理变化，死亡率高达100%，给养禽业造成巨大的经济损失。我国农业部将新城疫列为一类动物疫病，世界动物卫生组织（OIE）将其列为法定报告的疫病。在国务院颁布的《国家中长期动物疫病防治规划（2012—2020年）》中，新城疫被确定为国家优先防控的动物疫病之一。
新城疫病毒具有多样性，根据新城疫病毒致病性差异，可分为弱毒株、中等毒力株和强毒株；根据新城疫病毒遗传学特性可分为两大类，即I类和II类。其中I类新城疫病毒包括9个基因型，均为弱毒株；II类新城疫病毒可分为18个基因型，目前我国分离到的II类新城疫病毒包括基因I型、II型、VI型、VII型、型、型等，其中基因I型和II型大多为弱毒株。
目前，对于新城疫病毒的防控主要采用疫苗免疫，临床使用的活疫苗主要包括LaSota株（基因II型）、V4株（基因I型）。OIE对于新城疫的定义是：病毒的ICPI超过0.7，或者病毒在F蛋白裂解位点具有多个碱性氨基酸。由于普遍使用活疫苗以及大量弱毒株的存在，从家禽中分离出新城疫病毒并不一定是发生了新城疫，还必须对病毒进行致病性评价，因此，单纯检测NDV的血清学（血凝抑制试验）、分子生物学（RT-PCR）技术已无法满足临床检测和快速确诊的需求。病毒致病性评价时所用的传统生物学方法，即病毒分离与鉴定，虽然检测特异性强，但检测所需的周期长，且需要一定级别的生物安全实验室；而分子生物学方法，RT-PCR和荧光RT-PCR，可能出现假阳性结果，需要对扩增产物进行序列测定。因此，建立一种快速有效的鉴别新城疫病毒强毒、弱毒的检测方法，对于开展疫病的早期诊断、防止疫情进一步扩散蔓延具有重要意义。
新城疫病毒毒力鉴定方法主要包括传统的生物学试验和病毒基因序列测定两种方法，在传统的生物学试验中，需要依据鸡胚平均致死时间（MDT）、1日龄雏鸡脑内致病指数（ICPI）、6周龄鸡静脉致病指数（IVPI）来进行鉴定，这些传统的毒力鉴定方法费时、费力，还需要一定级别的生物安全实验室才能进行操作，因此不适合大规模推广应用；病毒基因序列测定是在RT-PCR的基础上结合序列测定来评价毒株的致病特征，时间相对较长，不能满足第一时间进行确诊的需要。焦磷酸测序技术是将焦磷酸技术应用于DNA序列分析的新一代技术，国内曾建立了焦磷酸测序技术鉴别新城疫病毒强毒株与弱毒株的方法，如发明专利CN 101921869 B。本方法与该方法相比，主要的优点包括：（1）检测范围更广。作为国家参考实验室，近年来一直在从事国内新城疫病毒的监测研究，近年来证实国内流行的新城疫病毒具有多种基因型和亚型。本方法经大量检测证实，可检出所有的II类新城疫病毒，排除了假阴性的可能；（2）我们建立的方法判断标准更简单、快捷。根据我们的研究证实，F1蛋白的氨基端，即F蛋白裂解位点的第117位即可决定病毒的致病性，所有的强毒株在该位点的组成均为苯丙氨酸（F），而所有的弱毒株则为亮氨酸（L）。本方法通过测定该位点的组成来判断病毒的致病性，因此更为简便、快捷、特异。本研究成果尚未公开发表涉及本发明内容的文章。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的缺点，寻求设计提供一种快速鉴别II类新城疫病毒强弱的焦磷酸测序方法，实现大批量样品的鉴别检测。
为了实现上述目的，本发明先从待检样本（接种临床样本72h后，血凝阳性的鸡胚尿囊液）中提取病毒基因组RNA，再以引物Pyro-172F-bio和Pyro-389R对提取的RNA模板进行RT-PCR扩增，然后通过琼脂糖凝胶电泳检测RT-PCR扩增产物，若扩增产物长度为218bp，则制备焦磷酸测序单链模板，进行焦磷酸测序反应，最后根据RT-PCR扩增结果和焦磷酸测序结果判定被检样品是否含有II类新城疫强毒株或弱毒株；其具体过程为：
（1）、RNA提取：采用Roche公司生产的High Pure Viral RNA Kit提取病毒RNA，具体步骤为：取200 µL待检样本加入1.5 mL离心管中，再加入400 µL裂解液（Lysis Buffer），颠倒混匀，室温静置10 min得到混合液；将混合液移入离心柱中，在8000 rpm条件下离心1 min；清空收集管，向离心柱中加入500 µL洗液I（Wash Buffer I），8000 rpm离心1 min；清空收集管，向离心柱中加入450 µL洗液II（Wash BufferII），8000 rpm离心1 min，并再次重复此步骤1次；清空收集管，10000 rpm离心1 min，将离心柱转移至新离心管内，向离心柱中加入100 µLRNA溶解液（Elution Buffer），10000 rpm离心1 min，收集病毒RNA。
（2）、RT-PCR扩增：RT-PCR反应体系（25μL）：Enzyme Mix 1μL，2×buffer 12.5 μL，上游引物（20 pmol/μL）0.5 μL，下游引物（20 pmol/μL）0.5 μL，RNA模板2.5 μL，双蒸水8 μL。反应程序：50℃反转录30 min；94 ℃预变性2 min；94 ℃ 15 s，50 ℃ 30s，68 ℃ 20 s，进行50个循环；68 ℃再延伸5 min；得到PCR产物。
（3）、扩增产物电泳检测：取1 g琼脂糖于100 mL电泳缓冲液中加热，充分熔化，加入核酸染料Gold View至终浓度为0.5 µg/mL，制胶；将5µL RT-PCR产物与适量加样缓冲液混合，点样，5 V/cm恒压电泳，直至溴酚蓝指示剂迁移至凝胶中部；紫外检测仪下观察电泳结果。
（4）、焦磷酸测序单链模板制备：先将RT-PCR产物做8倍稀释，取45 µL稀释后的RT-PCR产物转移至加有2 µL磁珠（Sepharose beads）和43 µL连接缓冲液（Binding Buffer）的96孔PCR板中，室温条件下1400 rpm振荡10 min；打开真空泵，将磁珠抓取臂（Vacuum PrepTool）放于超纯水中清洗30 s，随后移至96孔PCR板中抓取磁珠，并按顺序在重量百分比浓度为70％的乙醇、变性缓冲液（Denaturation Buffer）、冲洗缓冲液（Washing Buffer）中清洗10～15 s；关闭真空泵，将磁珠抓取臂放入含有0.6pmol/μL测序引物和退火缓冲液（Annealing Buffer）(总体积50µL)的PSQ 96孔板中充分摇动，释放磁珠；将样品置于80 ℃烘箱孵育2 min，冷却至室温后进行焦磷酸测序反应。
（5）、焦磷酸测序反应：根据焦磷酸测序仪（PyroMark ID）的软件说明在试剂舱中分别加入底物（APS）、三磷酸碱基脱氧核苷酸（dNTP）和酶混合物( DNA聚合酶、荧光素酶、ATP硫酸化酶和三磷酸腺苷双磷酸酶)；将试剂舱和PSQ 96孔板放入测序仪中，进行测序反应，加样使用600 mbar/8 msec的加样压力和时间，每轮反应时间65 s；引物链随着不同dNTP的加入而延伸，随着核酸的结合，CCD摄像机检测到发出的光信号。
（6）、结果判定：根据RT-PCR扩增结果和焦磷酸测序结果判定样品中是否含有II类新城疫病毒强毒株或弱毒株：若RT-PCR产物经电泳检测未见218 bp扩增片段，则样品中不含II类新城疫病毒，若RT-PCR产物经电泳检测出现218 bp扩增片段，则进行焦磷酸测序分析；若测得序列21-23位核苷酸为AAA或GAA，则被检样品中含有II类新城疫强毒株；若测得序列21-23位核苷酸为AAG，则被检样品中含有II类新城疫弱毒株。
本发明所述RT-PCR扩增引物：
Pyro-172F-bio：5’-ACAGGRTCRATCATAGT-3’，5’进行生物素标记；
Pyro-389R：5’-GCAACCCCRAGAGCBACA-3’；
焦磷酸测序引物为Pyro-389R：5’-GCAACCCCRAGAGCBACA-3’；
引物序列中R、B为简并碱基，R表示碱基A和碱基G的混合物，B表示碱基G、碱基T和碱基C的混合物。
本发明与传统的生物学方法相比，无需进行电泳，DNA片段也无需荧光标记，只需要5~6小时即可鉴别目前我国流行的II类新城疫病毒强弱毒，具有很好的覆盖性和通用性，其方法简单，操作方便，成本低，判断标准简单，检测所需时间短，检测范围广，能检出所有的新城疫病毒强毒株，适合大批量样本检测，而且本方法特异灵敏，对临床样本的检测结果与常规分子生物学方法一致，能及时对禽类染病情况以及周边环境的病毒污染情况进行确诊，以便在最短时间内做出正确的处置，对及时诊断、扑灭疫情以及开展大规模的新城疫疫情监测有着积极意义。
附图说明：
图1为本发明实施例2的特异性检测结果，其中M、1、2、3、4、5、6、7分别代表DNA MarkerDL2000 (2000 bp，1000 bp，750 bp，500 bp，250 bp，100 bp)、II类新城疫弱毒（Chicken/Hunan/2188/2013）、II类新城疫强毒（Pigeon/Yunnan/1111/2013）、I类新城疫病毒（Duck/Fujian/2123/2014）、禽副黏病毒4型（Duck/China/G302/2012）、H5亚型禽流感病毒（Chicken/Shandong/200/2014）、H9亚型禽流感病毒（Chicken/Hunan/292/2014）和双蒸水。
图2为本发明实施例3的敏感性检测结果，其中1、2、3、4、5、6、7、8分别为毒株Pigeon/Chongqing/2128/2013（基因I型弱毒）、Chicken/Jiangxi/2165/2013（基因I型弱毒）、Chicken/Yunnan/1012/2013（基因II型弱毒）、Chicken/Hunan/2188/2013（基因II型弱毒）、Pigeon/Guangxi/1015/2013（基因VI型强毒）、Pigeon/Yunnan/1111/2013（基因VI型强毒）、Chicken/Ningxia/S020/2013（基因VII型强毒）和Chicken/Sichuan/1124/2013（基因VII型强毒）的测序结果。
具体实施方式
下面通过实施例并结合附图对本发明作进一步说明。
实施例1：临床样品检测
本实施例对临床样品检测的具体过程为：
（1）、样品的采集：分别采集组织样品和棉拭子在2～8℃保存备用，其中组织样品为病死或发病禽类的脑、肺、肝等组织；棉拭子为口咽、泄殖腔拭子；
（2）、样品处理：每份样品分别处理
1）组织样品处理：称取待检组织样品100mg置研磨器中，加入0.8 mL含青霉素（2000 U/mL）和链霉素（2 mg/mL）的磷酸盐缓冲液（PBS；pH 7.0～7.4），室温静置1～2 h或置于37 ℃反应30～60 min后，再在4℃、1000rpm条件下离心10 min取上清液备用；
2）棉拭子处理：将棉拭子置0.8 mL含青霉素（2000 U/mL）和链霉素（2 mg/mL）的PBS中充分捻动，拧干后弃去拭子，室温静置1～2 h或置于37℃反应30～60 min，再在4℃、1000rpm条件下离心10 min取上清液备用；
（3）、病毒繁殖：取组织样品上清液或棉拭子上清液0.2 mL经尿囊腔接种9～11日龄无特定病原（SPF）鸡胚，接种后，在37℃温度条件下孵育3～4天，收集孵育24 h后的死胚、以及培养结束时存活的鸡胚尿囊液，并测定血凝（HA）效价，保存HA阳性鸡胚尿囊液样品；
（4）、引物设计：比对近年的II类新城疫强毒（基因III型、VI型、VII型、型和XII型）和弱毒（基因I型、II型）F基因序列，寻找出强毒、弱毒基因差异区域，并在该区域附近寻找II类新城疫病毒的基因保守区，设计II类新城疫病毒RT-PCR扩增引物及焦磷酸测序引物，RT-PCR扩增引物的工作浓度为20pmol/μL，测序引物的工作浓度为30pmol/μL，引物序列见表1；
表1：
（5）、病毒RNA提取：取HA阳性鸡胚尿囊液，采用Roche公司生产的High Pure Viral RNAKit提取病毒RNA，具体步骤如下：取200 µLHA阳性鸡胚尿囊液加入1.5 mL离心管中，再加入400 µL裂解液（Lysis Buffer），颠倒混匀，室温静置10 min得到混合液；将混合液移入离心柱中，在8000 rpm条件下离心1 min；清空收集管，向离心柱中加入500 µL洗液I（WashBufferI），8000 rpm离心1 min；清空收集管，向离心柱中加入450 µL洗液II（Wash BufferII），8000 rpm离心1 min，并再次重复此步骤一次；清空收集管，10000 rpm离心1 min，将离心柱转移至新离心管内；向离心柱中加入100 µLRNA溶解液（Elution Buffer），10000 rpm离心1 min，收集病毒RNA；
（6）、RT-PCR反应：采用的反应体系（25 µL）如下表所示：
Enzyme Mix 1μL
2×buffer 12.5 μL
Pyro-172F-bio 0.5 μL
Pyro-389R 0.5 μL
RNA模板 2.5 μL
ddH2O 8 μL
总体积 25 μL
设定反应程序为50℃反转录30 min；94 ℃预变性2 min；94 ℃ 15 s，50 ℃ 30s，68℃ 20 s，进行50个循环；68 ℃延伸5 min；得到PCR产物；
（7）、电泳：配制1%琼脂糖凝胶，加入终浓度为0.5μg/mL的核酸染料（Gold View）；取5μLRT-PCR产物与适量加样缓冲液混合，点样，5 V/cm恒压电泳，直至溴酚蓝指示剂迁移至凝胶中部，用紫外检测仪观察结果；阳性对照出现218 bp扩增带，阴性对照无条带出现（引物带除外），被检样品中出现218 bp扩增带，表明样品中含有II类新城疫病毒；
（8）、焦磷酸测序：
1）单链模板制备：先将RT-PCR产物做8倍稀释，取45µL稀释后的RT-PCR产物转移至加有2 µL磁珠（Sepharose beads）和43µL连接缓冲液（Binding Buffer）的96孔PCR板中，室温条件下1400 rpm振荡10 min；打开真空泵，将磁珠抓取臂（Vacuum Prep Tool）放于超纯水中清洗30 s，随后移至96孔PCR板中抓取磁珠，并按顺序在重量百分比浓度为70％的乙醇、变性缓冲液（Denaturation Buffer）、冲洗缓冲液（Washing Buffer）中清洗10～15 s；关闭真空泵，将磁珠抓取臂放入含有0.6pmol/μL测序引物和退火缓冲液（Annealing Buffer）(总体积50µL)的PSQ 96孔板中充分摇动，释放磁珠；将样品置于80 ℃烘箱孵育2 min，冷却至室温后进行焦磷酸测序反应；
2）焦磷酸测序反应：根据焦磷酸测序仪（PyroMark ID）的软件说明在试剂舱中分别加入底物（APS）、三磷酸碱基脱氧核苷酸（dNTP）和酶混合物( DNA聚合酶、荧光素酶、ATP硫酸化酶和三磷酸腺苷双磷酸酶)；将试剂舱和PSQ 96孔板放入测序仪中，进行测序反应，加样使用600 mbar/8 msec的加样压力和时间，每轮反应时间65 s；引物链随着不同dNTP的加入而延伸，随着核酸的结合，CCD摄像机检测到发出的光信号；
（9）、焦磷酸测序结果判定：根据测序结果判定样品中所含II类新城疫病毒毒力，若测得序列21-23位核苷酸为AAA或GAA，则被检样品中含有II类新城疫强毒；若测得序列21-23位核苷酸为AAG，则被检样品中含有II类新城疫弱毒。
实施例2：扩增引物的特异性检测
本实施例对扩增引物的特异性检测的具体过程为：
（1）、RNA提取：分别对II类新城疫弱毒（Chicken/Hunan/2188/2013）、II类新城疫强毒（Pigeon/Yunnan/1111/2013）、I类新城疫病毒（Duck/Fujian/2123/2014）、禽副黏病毒4型（Duck/China/G302/2012）、H5亚型禽流感病毒（Chicken/Shandong/200/2014）和H9亚型禽流感病毒（Chicken/Hunan/292/2014）提取病毒RNA，提取方法同实施例1步骤（5）；
（2）、RT-PCR反应：对步骤（1）中提取的病毒RNA模板进行RT-PCR扩增得到RT-PCR产物，同时设置一组双蒸水的阴性对照，方法同实施例1步骤（6）；
（3）、电泳：取RT-PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，结果如图1所示，II类新城疫弱毒（Chicken/Hunan/2188/2013）、II类新城疫强毒（Pigeon/Yunnan/1111/2013）经上述检测可见218 bp扩增带，I类新城疫病毒（Duck/Fujian/2123/2014）、禽副黏病毒4型（Duck/China/G302/2012）、H5亚型禽流感病毒（Chicken/Shandong/200/2014）、H9亚型禽流感病毒（Chicken/Hunan/292/2014）、阴性对照无目的条带，结果表明，扩增引物的特异性很好。
实施例3：扩增引物和测序引物的敏感性检测
本实施例对扩增引物和测序引物的敏感性检测具体过程为：
（1）、样品准备和RNA提取：选取8株分离自不同地区、不同基因型（基因I、II、VI、VII型病毒各2株）的II类新城疫病毒的尿囊液进行敏感性检测，并分别提取RNA，RNA提取方法同实施例1步骤（5）；
（2）、RT-PCR反应：采用实施例1步骤（6）所述方法进行RT-PCR反应得到RT-PCR产物；
（3）、电泳：取RT-PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，方法同实施例1步骤（7），所有8株病毒均可见218 bp扩增带；
（4）、焦磷酸测序：方法同实施例1步骤（8）；
（5）、结果判定：根据测序结果判定病毒毒力，测序结果如图2所示，1-4号毒株（基因I、II型）测得序列21-23位核苷酸为AAG，表明其为II类新城疫弱毒，5-8号毒株（基因VI、VII型）测得序列21-23位核苷酸为AAA或GAA，表明其为II类新城疫强毒，鉴定结果与预期相符，说明所用扩增引物和测序引物敏感性很好。
<110> 中国动物卫生与流行病学中心
<120> 一种鉴别检测II类新城疫病毒强弱毒的焦磷酸测序方法
<160> 3
<210> 1
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> primer_bind
<222> （1）．．（17）
<223> 用于扩增II类新城疫病毒F基因的上游引物，其中r为简并碱基，表示碱基a和g的混合物
<400> 1
acaggrtcratcatagt 17
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> primer_bind
<222> （1）．．（18）
<223> 用于扩增II类新城疫病毒F基因的下游引物，其中r和b为简并碱基，分别表示碱基a和g的混合物，以及碱基g、t、c的混合物
<400> 2
gcaaccccragagcbaca 18
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> primer_bind
<222> （1）．．（18）
<223> 用于II类新城疫病毒F基因焦磷酸测序的引物，其中r和b为简并碱基，分别表示碱基a和g的混合物，以及碱基g、t、c的混合物
<400> 3
gcaaccccragagcbaca 18

Claims (8)

1.一种鉴别检测II类新城疫病毒强弱毒的焦磷酸测序方法，其特征在于先进行引物设计，设计区分II类新城疫病毒强毒株与弱毒株的特异性引物及焦磷酸测序引物，再提取待测样品核糖核酸（RNA），用特异性引物进行逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR），通过琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，若特异性引物扩增片段长度为218bp，则制备焦磷酸测序单链模板，进行焦磷酸测序反应，最后根据RT-PCR扩增结果和焦磷酸测序结果判定样品中是否含有II类新城疫病毒强毒株或弱毒株。
2.根据权利要求1所述的一种鉴别检测II类新城疫病毒强弱毒的焦磷酸测序方法，其特征在于所述的引物设计：选取II类新城疫病毒强毒株与弱毒株F基因序列，根据MEGA软件的核苷酸序列比对结果，通过Primer Premier软件设计上游引物、下游引物和测序引物，上游引物、下游引物扩增片段长度为218 bp，引物序列分别为：
上游引物（Pyro-172F-bio）：5’-ACAGGRTCRATCATAGT-3’， 5’进行生物素标记；
下游引物（Pyro-389R）：5’-GCAACCCCRAGAGCBACA-3’；
测序引物（Pyro-389R）：5’-GCAACCCCRAGAGCBACA-3’。
3.根据权利要求1所述的一种鉴别检测II类新城疫病毒强弱毒的焦磷酸测序方法，其特征在于所述的提取待测样品RNA是使用商业化RNA提取试剂盒，或用TRIZOL裂解液处理待测样品，三氯甲烷抽提蛋白质，异丙醇沉淀得到RNA。
4.根据权利要求1所述的一种鉴别检测II类新城疫病毒强弱毒的焦磷酸测序方法，其特征在于所述的用特异性引物进行一步法RT-PCR反应：反应体系包含Enzyme Mix 1μL，2×buffer 12.5 μL，上游引物（20 pmol/μL）0.5 μL，下游引物（20 pmol/μL）0.5 μL，RNA模板2.5 μL，双蒸水8 μL，总体积25μL；反应程序：50℃反转录30 min，94 ℃预变性2 min后，进入94 ℃15 s，50 ℃ 30s，68 ℃ 20 s，共循环50次，然后68 ℃再延伸5 min。
5.根据权利要求1所述的一种鉴别检测II类新城疫病毒强弱毒的焦磷酸测序方法，其特征在于所述的RT-PCR扩增产物电泳检测：取1 g琼脂糖于100 ml电泳缓冲液中加热，充分熔化，加入核酸染料Gold View至终浓度为0.5μg/ml，制胶；将5 μL RT-PCR产物与适量加样缓冲液混合，点样，5V/cm恒压电泳，直至溴酚蓝指示剂迁移至凝胶中部；紫外检测仪下观察电泳结果。
6.根据权利要求1所述的一种鉴别检测II类新城疫病毒强弱毒的焦磷酸测序方法，其特征在于所述的制备焦磷酸测序单链模板是使用45 µL 8倍稀释的带生物素标记的RT-PCR产物、2 µL链霉亲和素包被的磁珠和43 µL连接缓冲液混合，在室温条件下1400 rpm振荡10min；用磁珠抓取臂（Vacuum Prep Tool）将与磁珠结合后的RT-PCR产物吸起，并按顺序在70％乙醇、变性缓冲液、冲洗缓冲液中分别清洗10～15 s；将Vacuum Prep Tool放入含有0.6pmol/μL测序引物和退火缓冲液（总体积50µL）的PSQ 96孔板中充分摇动，释放磁珠；将样品置于80 ℃烘箱2 min，再冷却至室温。
7.根据权利要求1所述的一种鉴别检测II类新城疫病毒强弱毒的焦磷酸测序方法，其特征在于所述的焦磷酸测序反应是在28℃下于焦磷酸测序仪PyroMark ID上检测，加样使用600mbar/8msec的加样压力和时间，每轮反应时间65s；引物链随着不同三磷酸碱基脱氧核苷酸（dNTP）的加入而延伸，随着核酸的结合，CCD摄像机检测到发出的光信号。
8.根据权利要求1所述的一种鉴别检测II类新城疫病毒强弱毒的焦磷酸测序方法，其特征在于所述的根据RT-PCR扩增结果和焦磷酸测序结果判定样品中是否含有II类新城疫病毒强毒株或弱毒株：若RT-PCR产物经电泳检测未见218 bp扩增片段，则样品中不含II类新城疫病毒，若RT-PCR产物经电泳检测出现218 bp扩增片段，则进行焦磷酸测序分析；若测序结果21-23位核苷酸为AAA或GAA，则被检样品中含有II类新城疫强毒株，若测序结果21-23位核苷酸为AAG，则被检样品中含有II类新城疫弱毒株。
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