CN117737301A - 一种基于Fiber1基因的禽安卡拉病毒荧光定量检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于动物医学检测技术领域，具体涉及一种基于Fiber1基因的禽安卡拉病毒荧光定量检测方法。所述方法通过设计的引物和探针，并结合特定反应体系和反应条件对禽安卡拉病毒进行检测。所述方法快速、有效（有效性能达到100%），并且检测敏感性优异，通过该方法可以定期对禽安卡拉病毒进行检测与监测，有助于及时制定有效的防控、净化措施，阻断禽安卡拉病的大面积爆发，可为禽安卡拉病的防控和净化奠定基础。
Description
技术领域
本发明属于动物医学检测技术领域，具体涉及一种基于Fiber1基因的禽安卡拉病毒荧光定量检测方法。
背景技术
禽安卡拉病，又称心包积液综合征或心包积水-肝炎综合征，是由I 群禽腺病毒（Fowl Aviadenovirus，FAdV）血清4型强毒感染引起的以心包积有淡黄色透明或胶冻状渗出液为典型病变并伴有一定程度肝炎病变的急性传染病。
3～10周龄的幼年鸡、鸭、鹅最为易感，死亡率可达10%～80%。在种禽和产蛋禽群中，可引起产蛋下降10%～30%。然而，目前对于禽安卡拉病毒的感染尚无有效的治疗方法，因此，建立能够进行快速、准确检测禽安卡拉病毒的方法，对于防控净化禽安卡拉病具有重要的意义。
禽安卡拉病可通过微生物学和病毒分离的方法进行诊断，但存在检测周期长，步骤复杂，人员要求高的问题。血清学检测方法和PCR检测方法是当前比较普遍的病毒检测方法，其中血清学检测方法相对简单，但交叉反应是血清学检测方法应用过程中比较常见的问题。相较于血清学的诊断方法，PCR检测方法具有灵敏性强，特异性高的特点，因而，更适用于禽安卡拉病毒的检测。在PCR检测方法中，普通PCR开放检测可能会造成环境污染，进而导致假阳性。而荧光定量PCR诊断方法可弥补该缺点，且其操作简单，检测的敏感度和特异性更高，因而，建立一种禽安卡拉病毒的荧光定量PCR检测方法，最为适用于临床禽安卡拉病的诊断。
王国康等建立了一种基于禽安卡拉病毒六邻体基因的荧光定量PCR检测方法，该方法用FAdV-4 HB1510株的鸡胚半数感染量（EID50）作为标准品进行敏感性分析，因而不能实现绝对定量反映方法敏感性和检测样品感染强度的效果[1]。
此外，其他基于六邻体基因的荧光定量PCR检测方法，虽然都对方法的敏感度进行了定量分析，但其敏感度范围为2.03拷贝/μL-7.1×102拷贝/μL不等，无法实现更低的浓度检测[2-7]。
张云丹建立的方法敏感度为2.03拷贝/μL，但其在临床应用性评价试验中，选用的样品为禽安卡拉病毒感染的疑似病例（仅体现临床症状，非确诊病例），且检出率只有80%，因而不能实现精确反应方法检出率的效果[2]。
FAdV-4 的纤突蛋白1(Fiber 1)位于病毒粒子表面，具有特异性的抗原决定簇。且研究表明腺病毒的Fiber蛋白会在病毒感染宿主的早期得到大量表达，是临床诊断的重要靶标。
基于上述问题，亟待建立了一种基于禽安卡拉病毒Fiber 1基因的高灵敏性、高特异性和高准确性的实时荧光定量PCR检测方法，可为预防、净化禽安卡拉病奠定重要基础，同时也可为临床禽安卡拉病的流行病学调查提供保障。
参考文献：[1] 王国康,卢琴,贾妙妙等.禽腺病毒4型荧光定量PCR检测方法的建立与初步评估[J].中国兽医杂志,2022,58(02):22-26.
[2] 张云丹,杨源,王军等.Ⅰ群禽腺病毒血清4型TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用[J].西北农业学报,2019,28(06):868-876.
[3] 吴双,张聪,袁慧莎等.血清4型禽腺病毒TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用[J].江苏农业学报,2023,39(01):134-141.
[4] 卢清侠,金前跃,冯丽丽等.禽腺病毒血清4型SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法的建立与应用[J].河南农业科学,2022,51(12):131-138.
[5] 招丽婵,王占新,罗洋洋等.血清4型禽腺病毒TaqMan荧光定量PCR方法的建立及初步应用[J].广东畜牧兽医科技,2020,45(05):48-52.
[6] 刘琳,何春辉,王赛楠等.血清4型禽腺病毒TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立[J].中国兽医学报,2020,40(05):928-932.
[7] 罗洋洋,李群辉,林丽苗等.禽腺病毒血清4型TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立与应用[J].中国兽医杂志,2020,56(04):39-42+47+143.
发明内容
基于Fiber1基因设计的F1F1/F1R1引物序列及FIP探针序列，具有很高的特异性，仅能对禽安卡拉病毒进行特异性的扩增，而对禽类常感染的细菌：大肠杆菌、沙门氏菌；DNA病毒：禽白血病病毒；和寄生虫：组织滴虫、毒害艾美尔球虫均无特异性扩增；本发明所建立的禽安卡拉病毒荧光定量PCR检测方法敏感度高，对质粒标准品的最低检测限度为1.9拷贝/μL；通过本方法对含有禽安卡拉病毒的商品化样品进行检测，检出率为100%。
本申请提供一种基于Fiber1基因设计的引物，包括引物1；
所述引物1的上游序列编号为SEQ ID NO:7，下游序列编号为SEQ ID NO:8。
在一些优选的实施方案中，所述引物1的探针为F1R；序列编号为SEQ ID NO:25。
本申请还提供一种基于Fiber1基因设计的引物探针，包括探针F1R；序列编号为SEQ ID NO:25。
另外，本申请也提供一种禽安卡拉病毒检测方法，利用所述一种基于Fiber1基因设计的引物和探针，包括如下步骤：
1）配制待测溶液；
2）标准品的制备：利用禽安卡拉病毒Fiber1基因所设计的上下游引物间的核酸序列，通过化学合成法连接至pUC-18T载体作为质粒标准品；
3）标准溶液的配制：稀释合成的质粒标准品，并配置成梯度浓度的系列标准溶液；
4）qPCR检测：将引物和探针加入到系列标准溶液样品以及待测样品的基因组DNA中，进行qPCR检测；
5）利用系列标准溶液得到的系列质粒标准品样品，得到CT值-浓度标准曲线；利用待测样品的CT值，定量检测待测溶液中的Fiber1基因的浓度。
4. 根据权利要求3所述的检测方法，其中，所述步骤4）中qPCR检测方法为：
i）配制qPCR反应体系的溶液；
ii）将溶液进行预变性和循环反应。
在一些优选的实施方案中，所述步骤i）qPCR反应体系溶液中的引物浓度为0.1μM~0.4μM，优选为0.2 μM。
在一些优选的实施方案中，所述步骤i）qPCR反应体系溶液中的探针浓度为0.05μM~0.15μM，优选为0.1 μM。
在一些优选的实施方案中，所述引物1反应体系的退火温度为58~60℃，优选为60℃。
在一些优选的实施方案中，所述退火时间为20~40s，优选为30 s。
在一些优选的实施方案中，所述循环反应的循环次数为40~50次，优选为45次。
在一些优选的实施方案中，所述预变性条件为93~97℃，25~35s；循环次数为1次；优选为95℃ 30 s；循环次数为1次。
在一些优选的实施方案中，所述循环反应的过程为93~97℃ 8~12s, 58~62℃ 25~35s；循环次数为40~50次；优选为95℃ 10s, 60℃ 30s；循环次数为45次。
有益效果：本申请提供了一种禽安卡拉病毒特异性的实时荧光定量PCR诊断方法，所述方法快速、有效（有效性能高达到100%），通过该方法对禽群泄殖腔样品进行定期的禽安卡拉病毒检测与监测，有助于及时制定有效的防控、净化措施，阻断禽安卡拉病的大面积爆发，可为禽安卡拉病的防控和净化奠定基础。
1、在禽安卡拉病毒Fiber基因序列中找到保守且特异性好的片段；
2、发明禽安卡拉病毒实时荧光定量PCR诊断方法的最佳反应条件。
3、所述方法的敏感性良好，能实现更低基因拷贝数的准确检测：检出的最低基因拷贝数为1.9拷贝/μL；
4、所述方法检出率高：对目前商品化的含有禽安卡拉病毒的生物样品，均能检出，检出率高达100%。
附图说明
图1 引物扩增效果鉴定；
其中，M：分子量标；1：引物F1F-1/F1R-1对FADV-4基因组的PCR扩增结果；2：引物F1F-2/F1R-2对FADV-4基因组的PCR扩增结果；3：引物F1F-3/F1R-3对FADV-4基因组的PCR扩增结果；4：引物F1F-4/F1R-4对FADV-4基因组的PCR扩增结果；5：引物F1F-5/F1R-5对FADV-4基因组的PCR扩增结果； 6：引物F1F-6/F1R-6对FADV-4基因组的PCR扩增结果。
图2 合成质粒标准品的鉴定；
其中，M：分子量标；1：引物F1F-1/F1R-1对1.9×1010拷贝/μL质粒标准品的PCR扩增结果。
图3 qPCR最适反应条件鉴定；
其中，M：分子量标；1-6：引物F1F-1和F1R-1浓度为0.1μM时，分别和0.05μM（1，2）、0.1μM（3，4）和0.15μM（5，6）浓度的探针，在退火温度为58℃（1，3，5）和60℃（2，4，6）条件下进行qPCR，扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果；7-12：引物F1F-1和F1R-1浓度为0.2μM时，分别和0.05μM（7，8）、0.1μM（9，10）和0.15μM（11，12）浓度的探针，在退火温度为58℃（7，9，11）和60℃（8，10，12）条件下进行qPCR，扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果；13-18：引物F1F-1和F1R-1浓度为0.3μM时，分别和0.05μM（13，14）、0.1μM（15，16）和0.15μM（17，18）浓度的探针，在退火温度为58℃（13，15，17）和60℃（14，16，18）条件下进行qPCR，扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果；19-24：引物F1F-1和F1R-1浓度为0.4μM时，分别和0.05μM（19，20）、0.1μM（21，22）和0.15μM（23，24）浓度的探针，在退火温度为58℃（19，21，23）和60℃（20，22，24）条件下进行qPCR，扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果。
图4 荧光定量PCR敏感性试验结果；
其中，1-8:分别为以1.9×107拷贝/μL ~1.9拷贝/μL的质粒标准品为模板进行qPCR的扩增曲线。
图5 荧光定量PCR的标准曲线；
分别以1.9×107 拷贝/μL ~1.9拷贝/μL的质粒标准品为模板，进行qPCR，以模板浓度为横坐标，Ct值为纵坐标绘制标准曲线。
图6 琼脂糖凝胶电泳验证敏感性试验结果；
其中，M：分子量标；1-8:分别为1.9×107拷贝/μL~1.9拷贝/μL质粒标准品经qPCR扩增后的产物，进行琼脂糖凝胶电泳的结果。
图7 荧光定量PCR特异性试验结果；
其中，1:以1.9×106拷贝/μL质粒标准品为模板进行qPCR的扩增曲线；其他：以艾美尔球虫、组织滴虫、大肠杆菌、沙门氏菌和禽白血病病毒的基因组为模板进行qPCR的扩增曲线。
图8 琼脂糖凝胶电泳验证特异性试验结果；
其中，M：分子量标；1-6：分别为以1.9×106拷贝/μL质粒标准品、艾美尔球虫、组织滴虫、大肠杆菌、沙门氏菌和禽白血病病毒基因组为模板进行qPCR，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳的结果。
图9 荧光定量PCR重复性试验结果；
其中，1-2: 以1.9×1010拷贝/μL质粒标准品为模板进行qPCR的扩增曲线。
图10 荧光定量PCR对含禽安卡拉病毒生物制品的检测结果；
其中，1-4：分别为以1.9×107拷贝/μL质粒标准品、和易邦新流腺三联灭活苗、沃华新流腺灭活三联苗、哈药集团鸡新流腺三联灭活苗提取的基因组DNA为模板，进行qPCR的扩增曲线。
图11 琼脂糖凝胶电泳验证qPCR对生物制品的检测结果；
其中，M：分子量标；1-4：分别为以1.9×107拷贝/μL质粒标准品、和易邦新流腺三联灭活苗、沃华新流腺灭活三联苗、哈药集团鸡新流腺三联灭活苗提取的基因组DNA为模板进行qPCR，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳的结果。
图12 生物制品验证荧光定量PCR检测敏感度的结果
其中，1-2：分别为以100倍稀释的易邦新流腺三联灭活苗基因组DNA（禽安卡拉病毒Fiber1基因的拷贝数为1.43拷贝/μL）和易邦新流腺三联灭活苗基因组DNA（禽安卡拉病毒Fiber1基因的拷贝数为1.43×102拷贝/μL）为模板，进行qPCR的扩增曲线。
图13 生物制品验证荧光定量PCR检测敏感度的琼脂糖凝胶电泳结果
其中，M：分子量标；1：以100倍稀释的易邦新流腺三联灭活苗基因组DNA（禽安卡拉病毒Fiber1基因的拷贝数为1.43拷贝/μL）为模板，进行qPCR扩增后的产物经琼脂糖凝胶电泳检测的结果；2：以易邦新流腺三联灭活苗基因组DNA（禽安卡拉病毒Fiber1基因的拷贝数为1.43×102拷贝/μL）为模板，进行qPCR扩增后的产物经琼脂糖凝胶电泳检测的结果。
具体实施方式
实施例1 ：1引物、探针的设计和合成
利用DNA Man生物学软件将本实验室分离到的CH/AHMC/2015株FAdV-4病毒的Fiber1基因（MG148335.1:30459-31754；参见表1, SEQ ID NO:1）与从Gen Bank数据库中下载到的多条FAdV-4病毒的核苷酸序列（参见表1, SEQ ID NO:2~6）进行对比分析，从而确定保守的核苷酸区域，利用Primer Premier 5.0软件设计Fiber1基因特异性的引物，经引物扩增效果分析后，选出最佳扩增引物，并在该扩增序列内设计1条特异性的Taq Man探针，5’端标记FAM，3’端标记MGB，引物和探针均委托通用生物(安徽)股份有限公司合成，序列如表2所示。
上文中提到针对禽安卡拉病毒筛选到的保守的核苷酸区域较多，并且位置不同；我们针对上述的保守区域的序列设计了下述6对引物以及探针。
2. 引物扩增效果分析：将安徽科技学院家禽疫病防控监测安徽省重点实验室分离到的禽安卡拉病毒CH/AHMC/2015株经尿囊腔途径接种9日龄SPF鸡胚各5枚，0.1 mL/枚。孵化、观察并收集24 h后死亡鸡胚肝脏，肝组织匀浆后16 000×g离心5 min，取上清液按E.Z.N.A.TM Viral DNA Kit 说明书提取病毒基因组DNA，并测定核酸浓度。分别用第1-6对引物扩增禽安卡拉病毒CH/AHMC/2015株的基因组DNA。
PCR扩增反应程序：
将6对引物对禽安卡拉病毒CH/AHMC/2015株基因组DNA的PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果表明第1对引物：F1F-1和F1R-1对禽安卡拉病毒Fiber1基因的扩增产物条带较其他引物的扩增产物亮（图1）。
对各条带进行灰度分析，结果显示，在相同条件下，引物F1F-1/F1R-1扩增产物的琼脂糖凝胶电泳条带灰度值最高，灰度值为47007.66；其他引物2~6，其灰度值均分布在43000~44000左右；引物1的效果显著优于引物2~6，灰度显著提高，引物特异性和准确性良好。因而确定F1F-1/F1R-1为最佳引物，用于后续试验方法的建立（表5）。
第1对引物：F1F-1和F1R-1的扩增产物序列（SEQ ID NO: 9）为：
GGGGTGCTCAAAGTGCTCGTCGACTCACAGGGACCTCTACAAGCCGACACGGGAGGCATCACTCTCCAGTTCGACACTCAAGACTTCGTTGTCAACAATGGCGTCTTAGCGCTAGCCTCCTCGGTCGGTCCGACCTATCTGAGCCCCTTTGCGACCTACGAAGTCACGCCCGTCTTGGGAATATCGCAGAGGAACGGCAACGTAA
第2对引物：F1F-2和F1R-2的扩增产物序列（SEQ ID NO: 12）为：
GGGTGCTCAAAGTGCTCGTCGACTCACAGGGACCTCTACAAGCCGACACGGGAGGCATCACTCTCCAGTTCGACACTCAAGACTTCGTTGTCAACAATGGCGTCTTAGCGCTAGCCTCCTCGGTCGGTCCGACCTATCTGAGCCCCTTTGCGACCTACGAAGTCACGCCCGTCTTGGGAATATCGCAGAGGAACGGCAA
第3对引物：F1F-3和F1R-3的扩增产物序列（SEQ ID NO: 15）为：
GAGCCCCTTTGCGACCTACGAAGTCACGCCCGTCTTGGGAATATCGCAGAGGAACGGCAACGTAAAAAGCAAGGGCTTGCAAAACTGGTCCATAGGCTATTACATCTACATGGTGAGCTCAGCCGGGCTAGTCAACGGACTCATCACTCTGGAGCTAGCCCATGACCTCACAGGCGCGAGCGGAGAAAAC
第4对引物：F1F-4和F1R-4的扩增产物序列（SEQ ID NO: 18）为：
TCACGCCCGTCTTGGGAATATCGCAGAGGAACGGCAACGTAAAAAGCAAGGGCTTGCAAAACTGGTCCATAGGCTATTACATCTACATGGTGAGCTCAGCCGGGCTAGTCAACGGACTCATCACTCTGGAGCTAGCCCATGACCTCACAGGCGCGAGCGGAGAAAACAGCCTGACTAGCGGTCTCAACTTTACCTTTGTGCTCAGCCCCA
第5对引物：F1F-5和F1R-5的扩增产物序列（SEQ ID NO: 21）为：
TGCCCAATAGCAACCAGAGCGACGTGGGCTATCTCGGGCTGCCGCCTCATACCAGGGACAATTGGTACGTGCCCATCGACTCGCCCGGCCTGCGGCTCGTCTCTTTCATGCCCACCGCCACCGGAAACGAGAAATTCGGACAGGGCACGTTGGGATACTGCGCCGCCACCATCCAGAACACG
第6对引物：F1F-6和F1R-6的扩增产物序列（SEQ ID NO: 24）为：
AGCCCCATGTACCCGATAGAAACAGAGGTGAATTTGTCCCTCATCGTGCCGCCCACGGTCTCGCCGACCAATCAAAACCACGTGTTTGTGCCCAATAGCAACCAGAGCGACGTGGGCTATCTCGGGCTGCCGCCTCATACCAGGGACAATTGGTACGTGCCCATCGACTCGCCCGGCCT
3.重组质粒标准品的制备：将第1对引物：F1F-1和F1R-1之间的Fiber1基因的核酸序列，委托通用生物(安徽)股份有限公司，通过化学合成法连接至pUC-18T载体。
测定质粒浓度，按照公式：
拷贝数=质粒浓度（ng/μL)×10-9×6.02×1023/(660×质粒总长度)，计算质粒拷贝数。
最终算出质粒标准品拷贝数为1.9×1010拷贝/μL。用表3的反应体系，表4的反应程序对1.9×1010拷贝/μL的标准品质粒进行PCR扩增，结果显示，以该质粒标准品为模板，能扩增出与目的片段大小一致的片段（图2），表明成功构建重组质粒标准品。
用ddH2O对质粒标准品进行10倍梯度稀释，分别获得1.9×109拷贝/μL、1.9×108拷贝/μL、1.9×107拷贝/μL、1.9×106拷贝/μL、1.9×105拷贝/μL、1.9×104拷贝/μL、1.9×103拷贝/μL、1.9×102拷贝/μL、1.9×101拷贝/μL和1.9拷贝/μL的质粒。
4.荧光定量PCR（即，qPCR）的条件优化：采用表6的引物浓度和探针浓度，配制qPCR反应体系，不足20μL的用ddH2O补齐，在表7所示的反应条件下进行qPCR反应。
qPCR扩增反应程序：
4.1 上下游引物的浓度：在表6的基础上，改变引物在反应体系中的终浓度如下表，其他过程与上述保持一致。
4.2 探针的浓度：在表6的基础上，改变探针在反应体系中的终浓度如下表，其他过程与上述保持一致。
4.3 qPCR反应条件：将表8和表9的各反应体系分别在表10的条件下进行qPCR反应。
将qPCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，图3和表11表明当qPCR反应体系中引物浓度为0.2μmol/L，探针浓度为0.1μmol/L时，在60℃的退火温度下，qPCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳条带最亮且灰度值最高，扩增效果最好。
当引物浓度为0.2μmol/L，电泳结果的灰度值分布在9400~12000左右，灰度值最明显，产物的电泳条带最优，扩增效果良好且显著。
在此基础上，改变探针的浓度为0.05~0.15μmol/L，灰度值分布在9400~12000左右，其中，当探针的浓度为0.1μmol/L时，效果最优；探针的浓度为0.15μmol/L次优，最后为0.05μmol/L。
当引物浓度为0.4μmol/L，电泳结果的灰度值分布在7400~8400左右，灰度值呈现降低趋势，
当引物浓度为0.1或0.3μmol/L，电泳结果的灰度值分布在3000~8000左右；较上述引物浓度为0.2μmol/L的灰度值降低显著。并且，当引物浓度为0.3μmol/L，改变探针浓度分别为0.1μmol/L、0.15μmol/L和0.05μmol/L时，其效果顺序为0.15μmol/L＞0.1μmol/L＞0.05μmol/L。上述结果进一步证明，其引物浓度和探针浓度的最优条件具有不确定性。
因而确定最优的荧光定量PCR反应体系条件为：
实施例2：荧光定量PCR（即，qPCR）标准曲线的建立
分别以10倍比例稀释的Fiber1基因质粒标准品(1.9×107拷贝/μL~1.9拷贝/μL)为模板，以优化后的条件进行荧光定量PCR扩增，获得扩增曲线(图4)，以质粒浓度为横坐标，qPCR的Ct值为纵坐标，建立标准曲线(图5)。
标准曲线方程Y = -(1.414)ln(x) + 36.252 ，相关系数为R2=0.991，表明本标准品质粒在1.9×107拷贝/μL~1.9拷贝/μL的浓度范围内具有良好的线性关系。
实施例3：1.敏感性实验：分别以1.9×107拷贝/μL~1.9拷贝/μL的质粒标准品为模板，利用优化后的条件进行荧光定量 PCR扩增（图4和图6），
图4中1-8号曲线显示1.9×107拷贝/μL ~1.9拷贝/μL浓度范围内的质粒标准品均能被检测；并且图6的琼脂糖凝胶电泳结果显示扩增片段大小与目的片段一致，表明该方法检测低至1.9拷贝/μL的质粒标准品，具有较好的敏感性。
2.特异性实验：用实施例1的最优荧光定量PCR反应条件和反应体系对禽感染的主要寄生虫：毒害艾美尔球虫和组织滴虫；细菌：大肠杆菌和沙门氏菌，和DNA病毒：禽白血病病毒的基因组DNA和1.9×106拷贝/μL的质粒标准品进行检测，验证该方法的特异性。
图7和图8结果表明，该方法仅能扩增出重组标准品质粒，其他禽感染的常见寄生虫、病毒、细菌均无扩增曲线，方法特异性良好且显著。
3.重复性实验：利用实施例1的最优荧光定量PCR方法对1.9×1010拷贝/μL的重组质粒标准品进行重复性试验，进而对该方法的重复性进行评估。结果表明本荧光定量PCR方法在重复操作的过程中，扩增曲线基本一致，重复性良好（图9）。
实施例4：临床样品检测：参照E.Z.N.A.TM Viral DNA Kit 说明书提取三种商品化鸡新流腺三联灭活苗(易邦新流腺三联灭活苗、沃华新流腺灭活三联苗、哈药集团鸡新流腺三联灭活苗)的基因组；
定性结果：利用实施例1得到的实时荧光定量PCR检测方法对三种商品化疫苗的基因组进行检测，验证该方法检测效果，重复验证分析三次。结果显示本研究建立的禽安卡拉荧光定量PCR检测方法，能检测出商品化的含有禽安卡拉病毒的生物制品，检出率为100%（图10和图11）。
定量结果：根据实施例2得到的标准品曲线，可计算出提取的易邦新流腺三联灭活苗、沃华新流腺灭活三联苗、哈药集团鸡新流腺三联灭活苗的基因组中，禽安卡拉病毒Fiber1基因的拷贝数分别为1.43×102拷贝/μL、2.21×102拷贝/μL和3.27×106拷贝/μL。
敏感性验证：将易邦新流腺三联灭活苗基因组DNA进行倍比稀释，分别获得Fiber1基因拷贝数浓度为1.43×101拷贝/μL和1.43拷贝/μL的生物样品，利用实施例1得到的实时荧光定量PCR检测方法分别对易邦新流腺三联灭活苗基因组DNA和Fiber1基因拷贝数浓度为1.43拷贝/μL的生物样品进行检测。结果显示本研究建立的禽安卡拉荧光定量PCR检测方法能检测出含有Fiber1基因拷贝数浓度为1.43拷贝/μL的生物样品（图12和图13），与实施例3的结果一致，进一步表明该方法的敏感性较高。
Claims (11)
1.一种基于Fiber1基因设计的引物，包括引物1；
所述引物1的上游序列编号为SEQ ID NO:7，下游序列编号为SEQ ID NO:8。
2. 一种基于Fiber1基因设计的探针，包括探针F1R；序列编号为SEQ ID NO:25。
3.一种禽安卡拉病毒检测方法，利用权利要求1所述一种基于Fiber1基因设计的引物和权利要求2所述一种基于Fiber1基因设计的探针，包括如下步骤：
1）配制待测溶液；
2）标准品的制备：利用禽安卡拉病毒Fiber1基因所设计的上下游引物间的核酸序列，通过化学合成法连接至pUC-18T载体作为质粒标准品；
3）标准溶液的配制：稀释合成的质粒标准品，并配置成梯度浓度的系列标准溶液；
4）qPCR检测：将引物和探针加入到系列标准溶液样品以及待测样品的基因组DNA中，进行qPCR检测；
5）利用系列标准溶液得到的系列质粒标准品样品，得到CT值-浓度标准曲线；利用待测样品的CT值，定量检测待测溶液中的Fiber1基因的浓度。
4.根据权利要求3所述的检测方法，其中，所述步骤4）中qPCR检测方法为：
i）配制qPCR反应体系的溶液；
ii）将溶液进行预变性和循环反应。
5. 根据权利要求3所述的检测方法，其中，所述步骤i）qPCR反应体系溶液中的引物浓度为0.1μM~0.4μM，优选为0.2 μM。
6. 根据权利要求3所述的检测方法，其中，所述步骤i）qPCR反应体系溶液中的探针浓度为0.05μM~0.15μM，优选为0.1 μM。
7.根据权利要求3所述的检测方法，其中，
所述引物1反应体系的退火温度为58~60℃，优选为60℃。
8. 根据权利要求3所述的检测方法，其中，所述退火时间为20~40s，优选为30 s。
9.根据权利要求3所述的检测方法，其中，所述循环反应的循环次数为40~50次，优选为45次。
10. 根据权利要求3所述的检测方法，其中，所述预变性条件为93~97℃，25~35s；循环次数为1次；优选为95℃ 30 s；循环次数为1次。
11. 根据权利要求3所述的检测方法，其中，所述循环反应的过程为93~97℃ 8~12s,58~62℃ 25~35s；循环次数为40~50次；优选为95℃ 10s, 60℃ 30s；循环次数为45次。
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