CN101660006A - 悬浮细胞蚀斑滴定口蹄疫病毒的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了悬浮细胞蚀斑滴定口蹄疫病毒的方法，包括以下步骤：(1)将琼脂糖生理盐水溶液与无血清培养基混匀得到琼脂溶液；(2)将所述琼脂溶液加至细胞培养板中，得底层琼脂培养板；(3)制得细胞悬液；(4)稀释待测定的口蹄疫毒液，得到梯度浓度口蹄疫毒液；(5)得到含有各梯度浓度口蹄疫病毒的上层琼脂溶液和对照用的上层琼脂溶液；(6)分别将所述含有各梯度浓度口蹄疫病毒的上层琼脂溶液和对照用的上层琼脂溶液加入到底层琼脂培养板的各培养孔中，凝固后用封口膜封口，倒置于CO₂培养箱中培养，得到蚀斑计数板；(7)中性红染色，对着灯光观察蚀斑计数板的各培养孔的蚀斑数；(8)计算毒价。该方法的检测条件均一，可控性强，批间误差小。

Description

悬浮细胞蚀斑滴定口蹄疫病毒的方法

技术领域

本发明涉及一种口蹄疫病毒(FMDV)毒价测定方法，具体地讲，涉及一种口蹄疫病毒悬浮细胞蚀斑测毒方法。

背景技术

目前，口蹄疫病毒毒价的测定方法普遍采用细胞半数感染量(TCID50)和乳鼠半数致死量(LD50)这两种方法。LD50方法需要用到活体动物，活体动物的个体差异将会给检测结果带来很大的影响。TCID50方法需要提前制备单层细胞，而且需要在实验过程中添加血清，这使得检测的进程受到细胞生长状态的限制，同时检测结果也会受到所添加血清的影响。

另外，悬浮细胞蚀斑测定也是病毒毒价的一种有效测定方法。病毒感染细胞后，通过固体介质的限制，释放的病毒只能由最初感染的细胞向周边扩展。经过几个增殖周期，便形成一个局限性病变细胞区，此即病毒蚀斑。从理论上讲，一个蚀斑是由最初感染细胞的一个病毒颗粒形成的，因而可通过病毒颗粒计数测定毒价。通常用琼脂等固相介质防止释放的病毒在介质中流动，以便将蚀斑控制在适宜的范围内。为便于肉眼观察，常用中性红等染料染色。因病变细胞不吸收中性红，病变细胞区便呈现无色蚀斑。病毒悬液的滴度可以以每毫升蚀斑形成单位(PFU/ml)来表示。在实际操作中，需要配制合适的介质，有效地控制接种条件和反应条件才能获得可靠的测定结果。目前，还没有准确有效的口蹄疫病毒蚀斑测毒方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种准确的标准化口蹄疫病毒毒价测定方法，以克服现有的口蹄疫病毒毒价测定方法受到活体动物个体差异等因素影响而带来的检测误差较大的问题。

本发明提供的口蹄疫病毒毒价测定方法为口蹄疫病毒悬浮细胞蚀斑测毒方法，包括以下步骤：

(1)将琼脂糖生理盐水溶液与无血清培养基按照0.9～1.1∶1的体积比混匀，得到琼脂溶液，其中，琼脂糖生理盐水溶液含有1.9～2.1重量％的琼脂糖和0.85～0.9重量％的盐；

(2)将所述琼脂溶液加至细胞培养板中，晃动细胞培养板，使所述琼脂溶液铺满细胞培养板底层，得底层琼脂培养板，置于平坦的位置，冷却、凝固；

(3)BHK-21悬浮培养细胞，800～1000rpm离心3～5分钟，得到浓缩细胞，用无血清培养基稀释浓缩细胞得到细胞悬液，细胞密度为0.6×10⁷～1.0×10⁷个/毫升；

(4)10⁶～10⁷倍稀释待测定的口蹄疫毒液，得到梯度浓度口蹄疫毒液；

(5)分别将9～11体积份的各梯度浓度口蹄疫毒液和9～11体积份的对照液都与39～41体积份的所述细胞悬液和48～52体积份的琼脂糖生理盐水混合，得到含有各梯度浓度口蹄疫病毒的上层琼脂溶液和对照用的上层琼脂溶液，其中，琼脂糖生理盐水溶液含有1.9～2.1重量％的琼脂糖和0.85～0.9重量％的盐；

(6)分别将所述含有各梯度浓度口蹄疫病毒的上层琼脂溶液和对照用的上层琼脂溶液加入到步骤(2)得到的底层琼脂培养板的各培养孔中，凝固后用封口膜封口，倒置于CO₂培养箱中培养24～48小时，得到蚀斑计数板；

(7)向蚀斑计数板内加入0.02～0.03重量％的中性红染色液，作用10～30分钟后，移去中性红染色液，对着灯光观察蚀斑计数板的各培养孔的蚀斑数；

(8)含有对照用的上层琼脂溶液的培养孔无蚀斑出现的蚀斑计数板为有效板，根据有效板的各培养孔的蚀斑数、接种的待测定的口蹄疫病毒液的用量及稀释倍数计算出待测定的口蹄疫病毒液的毒价。

无血清培养基较佳为BBSM培养基。例如为清大天一公司生产的BBSM培养基，按其说明书配制。

琼脂糖生理盐水溶液中的盐可以为氯化钠。

所述细胞培养板可以为六孔板。

较佳地，CO₂培养箱的CO₂体积含量为4～6％，温度为35～37℃。

较佳地，步骤(8)中，待测定的口蹄疫病毒液的毒

价的计算公式为

所述最适稀释倍数是指蚀斑数清晰可辨的稀释倍数。

较佳地，所述最适稀释倍数为蚀斑数在8～20个范围的稀释倍数。

该方法的检测条件均一，可控性强，批间误差小，能够实现口蹄疫病毒毒价的标准化测定，此方法可与OIE(世界动物卫生组织)的疫苗生产技术接轨，病毒培养时可根据感染比进行接毒，合理使用口蹄疫病毒，稳定生产。

附图说明

图1为蚀斑眼观状态；

图2为显微镜下观察到的一个蚀斑的状态；

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明做进一步说明。

该口蹄疫病毒悬浮细胞蚀斑测毒方法，包括以下步骤：

(1)将琼脂糖生理盐水溶液与无血清培养基按照1∶1体积比混匀，得到琼脂溶液，其中，琼脂糖生理盐水溶液含有2重量％的琼脂糖和0.85重量％的NaCl，在微波炉中加热至彻底溶解(加热时，注意出口的透气性)后40℃保温；无血清培养基为清大天一公司生产的BBSM培养基，按其说明书配制；

(2)将1ml所述琼脂溶液加至六孔细胞培养板中，晃动细胞培养板，使所述琼脂溶液铺满细胞培养板底层，得底层琼脂培养板，置于平坦的位置，冷却、凝固；

(3)BHK-21悬浮培养细胞，900rpm离心5min后，弃上清，加入无血清培养基，将细胞稀释至0.6～1×10⁷个/毫升；

(4)用乳欧液分别以10¹、10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶、5×10⁶、10⁷倍的稀释度稀释待测定的口蹄疫毒液，得到梯度浓度口蹄疫毒液；

(5)分别将10⁶、5×10⁶、10⁷浓度口蹄疫毒液和对照液都与所述细胞悬液和琼脂糖生理盐水混合，得到含有各梯度浓度口蹄疫病毒的上层琼脂溶液和对照用的上层琼脂溶液，其中，琼脂糖生理盐水溶液含有2重量％的琼脂糖和0.85重量％的NaCl；各成分的用量如下：

名称	体积％
		2％琼脂糖生理盐水	50
细胞悬液	40
		毒(对照)液	10

(6)分别将1ml所述含有各梯度浓度口蹄疫病毒的上层琼脂溶液和对照用的上层琼脂溶液加入到步骤(2)得到的底层琼脂培养板的各培养孔中，凝固后用封口膜封口，倒置于CO₂培养箱中培养50小时，CO₂培养箱的CO₂体积含量为5％，温度为36.5℃，得到蚀斑计数板；

(7)向蚀斑计数板内加入0.025重量％的中性红染色液，作用20分钟后，移去中性红染色液，对着灯光观察蚀斑计数板的各培养孔的蚀斑数；图1和图2分别为眼观和显微镜下观察的蚀斑状态，图中用数字标记1代表性地指示了一个蚀斑。

(8)含有对照用的上层琼脂溶液的培养孔无蚀斑出现，实验成立，根据各培养孔的蚀斑数、接种的待测定的口蹄疫病毒液的用量及稀释倍数计算出待测定的口蹄疫病毒液的毒价。

注：最适稀释倍数为蚀斑数在8～20个范围的稀释倍数。

实例：图1中A、B、C、D、E 5个孔为1×10⁶稀释倍数所做的5个孔，5个孔的蚀斑数分别是：16、11、11、11、10，5个孔的蚀斑数在8～20个范围内，因此1×10⁶为最适稀释倍数，如前所述，每孔的毒液量为0.1ml，根据公式计算得到

$\mathrm{PFU}=\frac{(16+11+11+11+10)/5\×{10}^6}{0.1}=1.18\×{10}^8$ (个/毫升)

该方法的检测条件均一，可控性强，根据实验结果来看批间误差小于log10^0.3[^*]，能够实现口蹄疫病毒毒价的标准化测定，此方法可与OIE(世界动物卫生组织)的疫苗生产技术接轨，病毒培养时可根据感染比进行接毒，合理使用口蹄疫病毒，稳定生产。

[^*]：批间误差的计算方法是将同一待检毒液分装为1ml/支的小剂量，超低温冰箱保存，分8次检测这一待检毒液，8次检测的结果取对数，并计算平均值和标准偏差后得到的数值。

同一病毒液重复检测8次，检测结果用对数表示分别为：8.523、8.3013、8.426、8.15、8.21、8.15、8.31、8.18，计算标准偏差为：0.13，即为log10^0.13。

Claims (7)

1、悬浮细胞蚀斑滴定口蹄疫病毒的方法，包括以下步骤：

(1)将琼脂糖生理盐水溶液与无血清培养基按照0.9～1.1∶1的体积比混匀，得到琼脂溶液，其中，琼脂糖生理盐水溶液含有1.9～2.1重量％的琼脂糖和0.85～0.9重量％的盐；

(2)将所述琼脂溶液加至细胞培养板中，晃动细胞培养板，使所述琼脂溶液铺满细胞培养板底层，得底层琼脂培养板，置于平坦的位置，冷却、凝固；

(3)BHK-21悬浮培养细胞，800～1000rpm离心5～8分钟，得到浓缩细胞，用无血清培养基稀释浓缩细胞得到细胞悬液，细胞密度为0.6×10⁷～1.0×10⁷个/毫升；

(4)10⁶～10⁷倍稀释待测定的口蹄疫毒液，得到梯度浓度口蹄疫毒液；

(5)分别将9～11体积份的各梯度浓度口蹄疫毒液和9～11体积份的对照液都与39～41体积份的所述细胞悬液和48～52体积份的琼脂糖生理盐水混合，得到含有各梯度浓度口蹄疫病毒的上层琼脂溶液和对照用的上层琼脂溶液，其中，琼脂糖生理盐水溶液含有1.9～2.1重量％的琼脂糖和0.85～0.9重量％的盐；

(6)分别将所述含有各梯度浓度口蹄疫病毒的上层琼脂溶液和对照用的上层琼脂溶液加入到步骤(2)得到的底层琼脂培养板的各培养孔中，凝固后用封口膜封口，倒置于CO₂培养箱中培养24～48小时，得到蚀斑计数板；

(7)向蚀斑计数板内加入0.02～0.03重量％的中性红染色液，作用10～30分钟后，移去中性红染色液，对着灯光观察蚀斑计数板的各培养孔的蚀斑数；

(8)含有对照用的上层琼脂溶液的培养孔无蚀斑出现的蚀斑计数板为有效板，根据有效板的各培养孔的蚀斑数、接种的待测定的口蹄疫病毒液的用量及稀释倍数计算出待测定的口蹄疫病毒液的毒价。

2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于，无血清培养基为BBSM培养基。

3、根据权利要求1所述的方法，其特征在于，琼脂糖生理盐水溶液中的盐为氯化钠。

4、根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞培养板为六孔板。

5、根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(6)中，CO₂培养箱的CO₂体积含量为4～6％，温度为36～37℃。

6、根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(8)中，待测定的口蹄疫病毒液的毒

所述最适稀释倍数是指蚀斑数清晰可辨的稀释倍数。

7、根据权利要求1所述的方法，具特征在于，所述最适稀释倍数为蚀斑数在8～20个范围的稀释倍数。

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