CN105586440A - 一种禽流感病毒效价的测定方法 - Google Patents

一种禽流感病毒效价的测定方法 Download PDF

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王玉玲
黄金妹
韦姜玲
许必钊
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms

Abstract

本发明公开了一种禽流感病毒效价的测定方法，通过细胞传代、稀释样品、洗板、加液、接毒、培养、计算TCID50值等步骤来测定禽流感病毒效价，本发明通过对MDCK细胞进行传代铺细胞板，接种不同稀释度的禽流感病毒，一定温度下培养一定时间，通过观察细胞病变，使用Reed-Muench方法计算TCID50值，测定病毒效价。本发明方法因使用细胞测定，测定结果稳定，同时排除了细胞株的外源性病源污染，使测定结果更准确。

Description

一种禽流感病毒效价的测定方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种禽流感病毒效价的测定方法。
背景技术
禽流感病毒（Avianinfluenzavirus，AIV）是严重危害家禽和野禽的一种烈性传染病原，有可能引起全球的流感大流行，是威胁我国养禽业的最重要的疫病之一。目前疫苗免疫是降低发病率和死亡率的最主要的方法，在常规的禽流感疫苗生产过程中，鸡胚是禽流感病毒最为常用的一种培养基质，但用鸡胚尿囊液制备抗原过程中禽流感病毒易引起抗原性变异；大规模生产时还存在鸡胚数量不足和潜在外源病毒污染的问题，尤其在禽流感爆发时。因此为了克服这些局限和不足，急需要利用哺乳动物细胞为基质制备的疫苗，这样的疫苗具有无外源因子污染、易于规模化生产、可以较好的维持病毒抗原稳定等特点。
目前我国对于禽流感病毒的效价测定方法为利用鸡胚培养后测定血凝效价，计算EID50，该种方法因使用鸡胚而受到一定的限制，如夏季高温对长途运输的鸡胚质量造成一定的影响，鸡胚中可能存在外源性病原污染等，这些都会导致效价测定结果不稳定或不准确。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种提高测定结果的准确性与稳定性的禽流感病毒效价的测定方法。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种禽流感病毒效价的测定方法，包括以下步骤：
1)细胞传代：将处于细胞对数生长期的MDCK细胞进行传代培养，并使细胞密度为1-2×105个/ml，然后将MDCK细胞铺到细胞培养板上，每孔100μL，并将细胞培养板置于温度37℃、CO2浓度为5%的培养箱中培养28-30h；
2)稀释样品：将禽流感病毒液用DMEM培养液进行10倍倍比稀释，得到不同稀释度的禽流感病毒液，备用；
3)洗板：将上述步骤1）长满MDCK细胞的细胞培养板中的细胞培养液弃去，用0.01mol/L的磷酸盐缓冲液洗涤3次；
4)加液：在细胞培养板上设样品组和对照组，样品组每孔加入0.1ml含胰酶的DMEM培养液，对照组每孔加入0.2ml含胰酶的DMEM培养液，所述DMEM培养液中胰酶的质量浓度为50μg/ml；然后将细胞培养板置于35℃环境中孵育15min；
5）接毒：取上述步骤2）适当稀释度的禽流感病毒液接种细胞，每个稀释度接种5孔，每孔0.1ml；
6）培养：将步骤5）得到的细胞培养板置于35℃、CO2浓度为5%的培养箱中培养100-120h；
7）测定病毒效价：观察细胞培养板中的细胞病变情况，使用Reed-Muench方法计算TCID50值，测定病毒效价。
本发明细胞病变的判定方法为：当细胞孔内100%细胞发生病变判定为有病毒感染，计入细胞发生CPE数，根据观察到的细胞培养板中的细胞病变情况（即细胞发生CPE数），使用Reed-Muench方法计算TCID50值。
本发明所述TCID50的计算方法按照《中华人民共和国兽用生物制品规程》中病毒半数致死（感染）量（LD50、EID50、TCID50）的测定方法。
所述细胞培养板为96孔细胞培养板。
所述DMEM培养液为DMEM培养基用超纯水配制而成，并调节pH至7.4。所述DMEM培养基为CIBCO公司生产。
本发明采用以上技术方案，通过对MDCK细胞进行传代铺细胞板，接种不同稀释度的禽流感病毒，一定温度下培养一定时间，通过观察细胞病变计算病毒的含量。本发明方法因使用细胞测定，测定结果稳定，因排除了细胞株的外源性病源污染，使测定结果更准确。
发明专利（CN102703602B）公开了一种重组禽流感细胞源灭活疫苗抗原病毒含量的测定方法相比，本发明与该发明专利相比具有以下优点：
1、本发明的操作步骤中具体限定了接毒前的细胞处理，其中加入含胰酶的DMEM培养液35℃处理15min，该步骤更利于禽流感病毒在MDCK细胞上的增殖，使发生病变的细胞孔可达到100%病变。
2、发明专利（CN102703602B）血凝试验的结果受所使用的1%鸡红血球的质量，温度的影响，结果观察时对血凝情况的判断存在人为主观判断的差异，因此其操作更加繁琐，且存在判定误差；而本发明只需要将100%细胞发生病变的孔计入细胞发生CPE数，而不需要利用血凝实验测定结果，因此对病毒效价的测定更为准确。
3、本发明中所使用的胰酶为1:250的普通胰酶，与TPCK-胰酶相比，产毒效果无显著差异，但成本降低很多。
具体实施方式
一种禽流感病毒效价的测定方法，包括以下步骤：
1)细胞传代：将处于细胞对数生长期的MDCK细胞进行传代培养，并使细胞密度为1-2×105个/ml，然后将MDCK细胞铺到96孔细胞培养板上，每孔100μL，并将细胞培养板置于温度37℃、CO2浓度为5%的培养箱中培养28-30h；
2)稀释样品：将禽流感病毒液用pH7.4的DMEM培养液进行10倍倍比稀释，得到不同稀释度的禽流感病毒液，备用；
3)洗板：将上述步骤1）长满MDCK细胞的细胞培养板中的细胞培养液弃去，用0.01mol/L的磷酸盐缓冲液洗涤3次；
4)加液：在细胞培养板上设样品组和对照组，样品组每孔加入0.1ml含胰酶的pH7.4的DMEM培养液，对照组每孔加入0.2ml含胰酶的pH7.4的DMEM培养液，所述DMEM培养液中胰酶的质量浓度为50μg/ml；然后将细胞培养板置于35℃环境中孵育15min；
5）接毒：取上述步骤2）适当稀释度的禽流感病毒液接种细胞，每个稀释度接种5孔，每孔0.1ml；
6）培养：将步骤5）得到的细胞培养板置于35℃、CO2浓度为5%的培养箱中培养100-120h；
7）测定病毒效价：观察细胞培养板中的细胞病变情况，使用Reed-Muench方法计算TCID50值，测定病毒效价；
其中细胞病变的判定方法为：当细胞孔内100%细胞发生病变判定为有病毒感染，计入细胞发生CPE数。
实施例1
一种禽流感病毒效价的测定方法，包括以下步骤：
1)细胞传代：将处于细胞对数生长期的MDCK细胞进行传代培养，并使细胞密度为2×105个/ml，然后将MDCK细胞铺到96孔细胞培养板上，每孔100μL，并将细胞培养板置于温度37℃、CO2浓度为5%的培养箱中培养28h；
2)稀释样品：将禽流感病毒液用pH7.4的DMEM培养液进行10倍倍比稀释至10-9，得到不同稀释度的禽流感病毒液，备用；
3)洗板：将上述步骤1）长满MDCK细胞的细胞培养板中的细胞培养液弃去，用0.01mol/L的磷酸盐缓冲液洗涤3次；
4)加液：在细胞培养板上设样品组和对照组，样品组每孔加入0.1ml含胰酶的pH7.4的DMEM培养液，对照组每孔加入0.2ml含胰酶的pH7.4的DMEM培养液，所述DMEM培养液中胰酶的质量浓度为50μg/ml；然后将细胞培养板置于35℃环境中孵育15min；
5）接毒：取上述步骤2）10-6—10-8稀释度的禽流感病毒液接种细胞，每个稀释度接种5孔，每孔0.1ml；
6）培养：将步骤5）得到的细胞培养板置于35℃、CO2浓度为5%的培养箱中培养120h；
7）测定病毒效价：观察细胞培养板中的细胞病变情况，使用Reed-Muench方法计算TCID50值，测定病毒效价；
其中细胞病变的判定方法为：当细胞孔内100%细胞发生病变判定为有病毒感染，计入细胞发生CPE数。
8）同时如发明专利（CN102703602B）方法对测毒板进行血凝实验，计算TCID50。
9）实验结果
培养时间 48h 72h 96h 120h
TCID50/0.1ml（CPE) 7.625 7.625 7.625 7.625
TCID50/0.1ml（测毒板HA) / / / 7.625
从本结果可以看出，观察CPE计算的TCID50与进行血凝测定计算的TCID50相比，无明显差异，并且操作上更为简便，更重要的是，本发明方法避免了不同的实验员因操作熟练度及血凝情况判定所造成的人为误差。
实施例2
一种禽流感病毒效价的测定方法，包括以下步骤：
1)细胞传代：将处于细胞对数生长期的MDCK细胞进行传代培养，并使细胞密度为1×105个/ml，然后将MDCK细胞铺到96孔细胞培养板上，每孔100μL，并将细胞培养板置于温度37℃、CO2浓度为5%的培养箱中培养30h；
2)稀释样品：将禽流感病毒液用pH7.4的DMEM培养液进行10倍倍比稀释稀释至10-8，得到不同稀释度的禽流感病毒液，备用；
3)洗板：将上述步骤1）长满MDCK细胞的细胞培养板中的细胞培养液弃去，用0.01mol/L的磷酸盐缓冲液洗涤3次；
4)加液：在细胞培养板上设样品组和对照组，样品组每孔加入0.1ml含胰酶的pH7.4的DMEM培养液，对照组每孔加入0.2ml含胰酶的pH7.4的DMEM培养液，所述DMEM培养液中胰酶的质量浓度为50μg/ml；然后将细胞培养板置于35℃环境中孵育15min；
5）接毒：取上述步骤2）10-6—10-8稀释度的禽流感病毒液接种细胞，每个稀释度接种5孔，每孔0.1ml；
6）培养：将步骤5）得到的细胞培养板置于35℃、CO2浓度为5%的培养箱中培养100h；
7）测定病毒效价：观察细胞培养板中的细胞病变情况，使用Reed-Muench方法计算TCID50值，测定病毒效价；
其中细胞病变的判定方法为：当细胞孔内100%细胞发生病变判定为有病毒感染，计入细胞发生CPE数。
8）同时如发明专利（CN102703602B）方法对测毒板进行血凝实验，计算TCID50。
9）实验结果
培养时间 48h 72h 96h 120h
TCID50/0.1ml（CPE) 7.375 7.5 7.5 7.5
TCID50/0.1ml（测毒板HA) / / / 7.5
从本结果可以看出，观察CPE计算的TCID50与进行血凝测定计算的TCID50相比，无明显差异，并且操作上更为简便，更重要的是，本发明方法避免了不同的实验员因操作熟练度及血凝情况判定所造成的人为误差。
实施例3
一种禽流感病毒效价的测定方法，包括以下步骤：
1)细胞传代：将处于细胞对数生长期的MDCK细胞进行传代培养，并使细胞密度为1.5×105个/ml，然后将MDCK细胞铺到96孔细胞培养板上，每孔100μL，并将细胞培养板置于温度37℃、CO2浓度为5%的培养箱中培养28h；
2)稀释样品：将禽流感病毒液用pH7.4的DMEM培养液进行10倍倍比稀释至10-8，得到不同稀释度的禽流感病毒液，备用；
3)洗板：将上述步骤1）长满MDCK细胞的细胞培养板中的细胞培养液弃去，用0.01mol/L的磷酸盐缓冲液洗涤3次；
4)加液：在细胞培养板上设样品组和对照组，样品组每孔加入0.1ml含胰酶的pH7.4的DMEM培养液，对照组每孔加入0.2ml含胰酶的pH7.4的DMEM培养液，所述DMEM培养液中胰酶的质量浓度为50μg/ml；然后将细胞培养板置于35℃环境中孵育15min；
5）接毒：取上述步骤2）10-6—10-8稀释度的禽流感病毒液接种细胞，每个稀释度接种5孔，每孔0.1ml；
6）培养：将步骤5）得到的细胞培养板置于35℃、CO2浓度为5%的培养箱中培养120h；
7）测定病毒效价：观察细胞培养板中的细胞病变情况，使用Reed-Muench方法计算TCID50值，测定病毒效价；
其中细胞病变的判定方法为：当细胞孔内100%细胞发生病变判定为有病毒感染，计入细胞发生CPE数。
8）同时如发明专利（CN102703602B）方法对测毒板进行血凝实验，计算TCID50。
9）实验结果
培养时间 48h 72h 96h 120h
TCID50/0.1ml（CPE) 7.625 7.83 7.83 7.83
TCID50/0.1ml（测毒板HA) / / / 7.83
从本结果可以看出，观察CPE计算的TCID50与进行血凝测定计算的TCID50相比，无明显差异，并且操作上更为简便，更重要的是，本发明方法避免了不同的实验员因操作熟练度及血凝情况判定所造成的人为误差。

Claims (3)

1.一种禽流感病毒效价的测定方法，其特征在于：其包括以下步骤：
1)细胞传代：将处于细胞对数生长期的MDCK细胞进行传代培养，并使细胞密度为1-2×105个/ml，然后将MDCK细胞铺到细胞培养板上，每孔100μL，并将细胞培养板置于温度37℃、CO2浓度为5%的培养箱中培养28-30h；
2)稀释样品：将禽流感病毒液用DMEM培养液进行10倍倍比稀释，得到不同稀释度的禽流感病毒液，备用；
3)洗板：将上述步骤1）长满MDCK细胞的细胞培养板中的细胞培养液弃去，用0.01mol/L的磷酸盐缓冲液洗涤3-4次；
4)加液：在细胞培养板上设样品组和对照组，样品组每孔加入0.1ml含胰酶的DMEM培养液，对照组每孔加入0.2ml含胰酶的DMEM培养液，所述DMEM培养液中胰酶的质量浓度为40-50μg/ml；然后将细胞培养板置于35℃环境中孵育15min；
5）接毒：取上述步骤2）适当稀释度的禽流感病毒液接种细胞，每个稀释度接种5孔，每孔0.1ml；
6）培养：将步骤5）得到的细胞培养板置于35℃、CO2浓度为5%的培养箱中培养100-120h；
7）测定病毒效价：观察细胞培养板中的细胞病变情况，使用Reed-Muench方法计算TCID50值，测定病毒效价。
2.根据权利要求1所述的一种禽流感病毒效价的测定方法，其特征在于：所述细胞培养板为96孔细胞培养板。
3.根据权利要求1所述的一种禽流感病毒效价的测定方法，其特征在于：所述DMEM培养液为DMEM培养基用超纯水配制而成，并调节pH至7.4。
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