CN103571795A - 用于杆状病毒滴度测定的重组细胞系及其测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种用于杆状病毒滴度测定的重组细胞系及其测定方法。其中，用于杆状病毒滴度测定的重组细胞系的构建方法为：构建报告质粒；利用报告质粒转染Sf9昆虫细胞；将转染后的Sf9昆虫细胞用含有博来霉素以及胎牛血清的培养基筛选，得到单细胞克隆；将单细胞克隆继续用含有博来霉素的培养基筛选，得到重组细胞系。本发明提供的用于杆状病毒滴度测定的重组细胞系及其测定方法，用于杆状病毒滴度测定时更为快速，测定结果更为准确。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种用于杆状病毒滴度测定的重组细胞系及其测定方法。
背景技术
杆状病毒是一类DNA病毒，广泛存在于自然界，主要感染鳞翅目、双翅目和膜翅目昆虫，其感染能够导致昆虫的液化死亡。随着研究的深入，杆状病毒已在生物杀虫剂、真核表达、表面展示以及基因治疗等方面得到越来越广泛的应用。为使杆状病毒能在应用中发挥最大的功效，就必须对杆状病毒进行定量，即进行病毒滴度的测定。
病毒滴度即病毒的毒力或毒价。在相关技术中，杆状病毒滴度普遍采用终点稀释法（endpoint dilution）进行测定，指能使半数细胞出现病变的病毒稀释度。该方法需通过观察细胞病变来确定病毒的滴度。在测定过程中，可以有一些方法是采用Sf9昆虫细胞为被感染细胞的。
但是，由于Sf9昆虫细胞是一种圆形的细胞，当被杆状病毒感染后，其病变主要表现为细胞核膨大；而Sf9昆虫细胞在细胞老化时也容易出现细胞核膨大的现象，因此，通过观察很难判断细胞核膨大的现象是否是由杆状病毒所致，进而造成病毒滴度测定的结果不准确。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于杆状病毒滴度测定的重组细胞系及其测定方法，以解决上述的问题。
本发明的实施例提供了一种用于杆状病毒滴度测定的重组细胞系，该重组细胞系保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为：CCTCC No.C2013133；其保藏命名为：携带P基因的斜纹夜蛾卵巢细胞系Sf9-p，其保藏日期为2013年9月4日。
在本发明的实施例中还提供了一种用于杆状病毒滴度测定的重组细胞系，其构建方法包括以下步骤：
构建报告质粒；所述报告质粒包括其中插入了编码绿色荧光蛋白的报告基因、诱导所述报告基因表达的所述杆状病毒的晚期基因的启动子P基因；
利用所述报告质粒转染Sf9昆虫细胞；
将转染后的所述Sf9昆虫细胞用含有博来霉素以及胎牛血清的培养基筛选，得到单细胞克隆；
将所述单细胞克隆继续用含有博来霉素的培养基筛选，得到重组细胞系。
本发明实施例提供的用于杆状病毒滴度测定的重组细胞系，其整合了能够编码绿色荧光蛋白的报告基因以及诱导所述报告基因表达的所述杆状病毒的晚期基因的启动子P基因。重组细胞系在受到相应启动子来源的病毒（杆状病毒）的感染后，杆状病毒早期基因的表达产物将激活位于报告基因上游的杆状病毒的晚期基因的启动子，从而启动了报告基因的表达得到绿色荧光蛋白。在进行杆状病毒滴度测定时，该重组细胞系通过观察被感染细胞的荧光产生而非细胞病变（如，Sf9昆虫细胞的细 胞核膨大）则可确定杆状病毒的滴度。而感染后的发出荧光的细胞可通过常规的通过流式细胞仪等仪器进行定量，进而使得测定结果更为准确。
本发明的实施例还提供了一种利用该重组细胞系测定杆状病毒的滴度的方法，包括以下步骤：
将重组细胞系制成细胞悬液；
在待测的杆状病毒液中加入所述细胞悬液，恒温培养预定时间后通过观察荧光情况进行病毒滴度计算，得到滴度。
附图说明
图1示出了本发明实施例二提供的重组细胞系的构建方法流程图；
图2示出了本发明实施例二提供的重组细胞系测定杆状病毒的滴度的方法流程图；
图3示出了本发明实施例一和实施例提供的报告质粒的结构示意图。
具体实施方式
下面通过具体的实施例子并结合附图对本发明做进一步的详细描述。
实施例一
在本发明的实施例中提供了一种用于杆状病毒滴度测定的重组细胞系的构建方法，包括以下步骤：
构建报告质粒；
其中，所述报告质粒包括其中插入了编码绿色荧光蛋白的报告基因、诱导所述报告基因表达的所述杆状病毒的晚期基因的启动子P基因；
利用所述报告质粒转染Sf9昆虫细胞；
将转染后的所述Sf9昆虫细胞用含有博来霉素以及胎牛血清的培养基筛选，得到单细胞克隆；
将所述单细胞克隆继续用含有博来霉素的培养基筛选，得到重组细胞系。
本发明实施例提供的用于杆状病毒滴度测定的重组细胞系，其整合了能够编码绿色荧光蛋白的报告基因以及诱导所述报告基因表达的所述杆状病毒的晚期基因的启动子P基因，重组细胞系在受到相应启动子来源的病毒（杆状病毒）的感染下，杆状病毒早期基因的表达产物将激活位于报告基因上游的杆状病毒的晚期基因启动子，从而启动了报告基因的表达得到绿色荧光蛋白。在进行杆状病毒滴度测定时，该重组细胞系通过观察被感染细胞的荧光产生而非细胞病变（如，Sf9昆虫细胞的细胞核膨大）则可确定杆状病毒的滴度。而感染后的发出荧光的细胞可通过常规的通过流式细胞仪等仪器进行定量，进而使得测定结果更为准确。
此外，在本发明的上述实施例中，由于该重组细胞系的报告基因是受到杆状病毒晚期基因的启动子的调控，其所调控的基因一般在被杆状病毒感染18-24小时后就开始表达，到3-5天时表达的绿色荧光蛋白的量已经非常大；因此，在荧光显微镜下能很清楚的观察到；相比之下，传统的细胞病变观察却需要被感染7-9天才可能通过肉眼在显微镜下得以辨别，因此该细胞系用于杆状病毒滴度测定时更为快速。
由于该细胞系的报告基因的表达需要受到相应启动子来源的杆状病毒基因的诱导，即重组细胞系只有被杆状病毒感染后才会表达，并且使得细胞显现出荧光，相比于通过观察细胞病变的操作，可避 免因细胞老化出现类似的病变形态从而导致判断结果不准确的缺陷。
为了使得本发明实施例一的用于杆状病毒滴度测定的重组细胞系得到更好的应用，更加有效应用到各领域中，本发明还在上述实施例一的基础之上提供了实施例二，实施例二是对实施例一的构架方法做出的进一步的增加和限定，现做详细的阐述和解释：
实施例二
请参考图1，本实施例的构建方法包括以下步骤：
步骤101：构建报告质粒；
由于杆状病毒基因表达是一个时序性的过程，按照表达时间的先后，可以将杆状病毒基因分为早期基因和晚期基因。考虑到启动子对报告基因表达的时序性及表达量的要求，在设计报告质粒的过程中优选利用包含多角体蛋白基因启动子P基因的杆状病毒极晚期基因来调控报告基因的表达。
具体的，报告质粒的构建可以通过以下方法得到：
1.以瞬时表达载体质粒pIZ/V5-His（Invitrogen，Life Science）为出发，用限制性内切酶BsmⅠ和SpeⅠ酶切回收大小为2248bp的条带，获得载体框架pIZ/V5。
2.以Pph-f/r为引物（序列如下），pFastBacDual为模板（含有多角体蛋白基因启动子Pph序列），进行PCR扩增获得Pph序列；
该步骤2中PCR的反应过程为：
94℃预变性5min；
94℃变性15s；
58℃退火30s；
68℃延伸25s。
上述过程为一个循环，总共进行37个循环，最后68℃延伸10min，回收PCR产物Pph（P基因）后利用BsmⅠ和SpeⅠ进行酶切并回收。
Pph-f：5’-CGCTGCATTCCTCCGGAATATTAATAGATCATG
Pph-r：5’-GGACTAGTGGATCCGCGCCCGATGGTG
3.利用T4DNA连接酶连接载体pIZ/V5和片段Pph（P基因），将连接产物转化感受态细胞DH5α，涂平板，挑取单克隆培养后提质粒进行鉴定。
将阳性克隆即插入了片段Pph（P基因）的克隆命名为pIZPph。
4.以EGFP primer-f/r为引物（序列见下），pEGFP-N3为模板，进行PCR扩增获得EGFP片段。
该步骤4中PCR反应过程为：
94℃预变性5min；
94℃变性15s；
58℃退火30s；
68℃延伸30s。
上述过程为一个循环，总共进行37个循环，最后68℃延伸10min，回收PCR产物EGFP后利用SpeⅠ和EcoRⅠ进行双酶切并回收。
EGFPprimer-f：
5’-GGACTAGTATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG
EGFPprimer-r：
5’-CGGAATTCTTACTTGTACAGCTCGTCCATGCC
其中，EGFP为增强型绿色荧光蛋白。
5.用限制性内切酶SpeⅠ和EcoRⅠ酶切载体pIZPph并回收相应片段DNA。
6.利用T4DNA连接酶连接载体pIZPph和片段EGFP，将连接产物转化感受态细胞DH5α，涂平板，挑取单克隆培养后提质粒进行鉴定。
将阳性克隆即插入了绿色荧光蛋白基因片段的克隆命名为pIZPphE；质粒图谱详见图3。
步骤102：利用报告质粒转染Sf9昆虫细胞；
转染(transfection)指真核细胞（如Sf9昆虫细胞）由于外源DNA掺入而获得新的遗传标志的过程，在本实施例中，报告质粒作为外源DNA进而使得其遗传信息整合到了Sf9昆虫细胞，一般而言，由于质粒的转染效率较高，因此，转染时间不宜太长。优选的，在本实施例中，转染时间46-50小时，更优选的，为48小时。
步骤103：将转染后的Sf9昆虫细胞用含有博来霉素以及胎牛血清的培养基筛选，得到单细胞克隆；
具体的，在步骤103中，转染之后，由于可能受到外界因子的干扰，有些细胞的基因则不会表达，细胞本身则不会发生分裂，因此，需要将不分裂的细胞筛选掉。在本实施例中，可采用含有400ng/ml的博来霉素以及体积分数为10%的胎牛血清的Grace培养基对转染后的Sf9昆虫细胞进行筛选；经过分裂的细胞其基因表达后具有抗博来霉素的特性，因此，将其加入至含有博来霉素的培养基之后仍然可以存活，而不能分裂的细胞（抗博来霉素基因没有表达），进而会被博来霉素杀死，细胞发生破碎，进而被筛选掉。
具体的，可以通过以下操作方法实现：将转染后的Sf9昆虫细胞用含博来霉素的血清培养基（Grace培养基）吹起并稀释至约为 1×104cell/ml，然后将细胞悬液以100μl/孔加入到96孔板（12×8）的前四排孔中，然后再将细胞悬液依次稀释为5×103cell/ml和1×103cell/ml并分别加入到中间四排和最后四排孔中，约一周后即可得到单细胞克隆。
步骤104：将单细胞克隆继续用含有博来霉素的培养基筛选，得到重组细胞系；
得到单细胞克隆之后，可将单细胞克隆挑出并传至24孔板，继续用含有浓度为200ng/ml-800ng/ml博来霉素体积分数为10%的胎牛血清的Grace培养基筛选，待24孔板中的Sf9昆虫细胞长满后再传至6孔板，然后再将存活的细胞系传至T25方瓶，检测后液氮冻存长期保藏。
请参考图2，本发明的实施例还提供了一种用上述重组细胞系测定杆状病毒的滴度的方法，包括：
步骤201：将重组细胞系制成细胞悬液；
步骤202：在待测的杆状病毒液中加入细胞悬液，恒温培养预定时间后通过观察荧光情况进行病毒滴度计算，得到滴度。
在进行测定的过程中，由于重组细胞系的浓度较大，因此，可选的，需要将重组细胞系制成细胞悬液以方便测定病毒的滴度。
具体的，可以按照以下操作实现：用Grace培养液将所述重组细胞系稀释，得到浓度为2×104个/ml到5×104个/ml的所述细胞悬液。
此外，在得到细胞悬液的过程中，为了防止其受到细菌感染，优选的，需要在所述细胞悬液中加入有卡那霉素和/或链霉素；卡那霉素和链霉素均具有很好的抗菌性能，其具体的加入量依照细菌悬液的数量而定。
同样，在测定的过程中，也需要将杆状病毒原液进行稀释，使其成为达到测定浓度的杆状病毒液，具体的，可按照以下操作进行：取无菌1.5mlEp管，按编号-1至-8依次做好标记，在各管中加入360μl的Grace培养基，取40μl的待测杆状病毒原液加入到标号为-1的管中，涡旋振荡仪上混匀后从-1管中取40μl到标号为-2的管中，混匀后从-2管中取40μl到标号为-3的管中，依此梯度做倍比稀释，到-8号管取40μl，即可得到杆状病毒液，优选的，为了实现较好的感染效果，杆状病毒液可以为苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒液。
在步骤302中，为了使得杆状病毒有效的感染重组细胞系，优选的，在所述待测的杆状病毒液中加入等量的细胞悬液，在27℃-28℃培养3-5天之后观察荧光情况并进行病毒滴度计算，得到滴度。
具体的病毒滴度可以通过荧光显微镜观察以及流式细胞仪操作得到。
另外，在本实施例中，还提供了常规的病毒滴度测定与本实施例的测试方法对比试验数据，请参考表1：
表1.正常细胞系Sf9和重组细胞系Sf9-P进行病毒滴度测定的比较
| 病毒样品 | Sf9-P（5d.p.i） | Sf9（8d.p.i） |
| 1 | 6.32×107／ml | 5.02×107／ml |
| 2 | 2×107／ml | 2×107／ml |
| 3 | 6.32×107／ml | 5.02×107／ml |
| 4 | 7.96×107／ml | 7.96×107／ml |
由表1可知：构建的重组细胞系Sf9-P能够很好的用来进行杆状病毒滴度的测定，并且其计算结果与传统的利用Sf9进行细胞病 变观察的滴度测定法相比具有很好的相关性。其次，利用重组细胞系Sf9-P进行病毒滴度测定在病毒感染后5天内即可完成，而传统的方法需要7-9天，因此具有更高的时效性。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.用于杆状病毒滴度测定的重组细胞系，其特征在于，该重组细胞系保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为：CCTCCNo.C2013133；其保藏命名为：携带P基因的斜纹夜蛾卵巢细胞系Sf9-p。
2.权利要求1所述的用于杆状病毒滴度测定的重组细胞系的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
构建报告质粒；所述报告质粒包括其中插入了编码绿色荧光蛋白的报告基因、诱导所述报告基因表达的所述杆状病毒的晚期基因的启动子P基因；
利用所述报告质粒转染Sf9昆虫细胞；
将转染后的所述Sf9昆虫细胞用含有博来霉素以及胎牛血清的培养基筛选，得到单细胞克隆；
将所述单细胞克隆继续用含有博来霉素的培养基筛选，得到重组细胞系。
3.根据权利要求2所述的用于杆状病毒滴度测定的重组细胞系的构建方法，其特征在于，在所述利用所述报告质粒转染Sf9昆虫细胞的步骤中，
所述转染的时间为46-50小时。
4.根据权利要求2所述的用于杆状病毒滴度测定的重组细胞系的构建方法，其特征在于，在所述将转染后的所述Sf9昆虫细胞用含有博来霉素以及胎牛血清的培养基筛选，得到单细胞克隆的步骤中，
所述培养基为：含有200ng/ml-800ng/ml的博来霉素以及体积分数为10%的胎牛血清的Grace培养基。
5.根据权利要求1所述的用于杆状病毒滴度测定的重组细胞系，其特征在于，在所述将所述单细胞克隆继续用含有博来霉素的培养基筛选，得到重组细胞系的步骤中，
所述博来霉素的浓度为200ng/ml-800ng/ml。
6.一种根据权利要求1所述的重组细胞系测定杆状病毒的滴度的方法，其特征在于，包括以下步骤：
将重组细胞系制成细胞悬液；
在待测的杆状病毒液中加入所述细胞悬液，恒温培养预定时间后通过观察荧光情况进行病毒滴度计算，得到滴度。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，在所述将重组细胞系制成细胞悬液的步骤中，具体包括：
用Grace培养液将所述重组细胞系稀释，得到浓度为2×104个/ml到5×104个/ml的所述细胞悬液。
8.权利要求6所述的方法，其特征在于，在所述将重组细胞系制成细胞悬液的步骤中，
所述细胞悬液中加入有卡那霉素和/或链霉素。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述在待测的杆状病毒液中加入所述细胞悬液，恒温培养预定时间后通过观察荧光情况进行病毒滴度计算，得到滴度的步骤中，具体包括：
在所述待测的杆状病毒液中加入等量的细胞悬液，在27℃至28℃培养3-5天之后观察荧光情况进行病毒滴度计算，得到滴度。
10.根据权利要求6-9任一项所述的方法，其特征在于，所述杆状病毒液包括：
苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒液。
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