TWI330198B

TWI330198B -

Info

Publication number: TWI330198B
Application number: TW091105663A
Authority: TW
Inventors: Jyh Lyh Juang; Dung Fang Lee
Original assignee: Nat Gealth Reserch Insttutes
Priority date: 2001-03-23
Filing date: 2002-03-22
Publication date: 2010-09-11
Also published as: US20030022377A1; EP1243656A2; US6814963B2; EP1243656A3

Description

九、發明說明：【發明所屬之技術領域】本發明係有關利用桿狀病毒感染非宿主細胞以表現外源蛋白，及利用病毒啟動子之專一性來建構病毒斑挑選之螢光標記。【先前技術】桿狀病毒（baculoviruses)為一種DNA病毒 (baculoviridae)，主要感染昆蟲中的鱗翅目。目前，桿狀病毒係作為在昆蟲細胞内表現外源基因（exogenous genes)的載體，其中一種最常作為基因表現載體的病毒為苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（Autographa californica nuclear polyhedrosis virus 5 AcMNPV) ° 在内源多角體基因（endogenous polyhedrin)和 pl〇啟動子的驅動下，桿狀病毒可表現大量的（非桿狀病毒的）外源蛋白質。多角體基因和plO啟動子在桿狀病毒生命週期的晚期皆具有很強的活性。雖然桿狀病毒的自然宿主範圍通常是依病毒在宿主細胞内的複製能力而定義，但桿狀病毒可以滲透非自然（非允許， non-permissive)宿主之細胞，例如哺乳類細胞（e.g.， Hofmann et al.5 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 10099-10103; Boyce et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 12348-12352; Shoji et al., 1997, J. Gen. Virology 78，2657-2664; and Yap et al.，1997，Virology 231,192-200)和果繩細胞（卩61111〇〇1<；6〖31.,1984，]\4〇1.

Cell Biol. 4, 3 99-406)，並在非自然宿主細胞内表現基因物質。習知桿狀病毒表現系統的優點為：（a)桿狀病毒有專一的寄生宿主，不會使人致病；（b)桿狀病毒可在不含血清的培養基中繁殖，且長至超過1〇8 pfu/ml的病毒滴定量；及（c)桿狀病毒之基因組（長度約80〜230 kb) 可容納大的外源DNA分子。然而，習知桿狀病毒表現系統亦有其限制：（a)蛋白質表現會造成細胞溶解 (cell-lysis);及（b)當宿主細胞被某一桿狀病毒長期感染後，此宿主細胞則不允許其他桿狀病毒進入，而無法進行連續感染（successive infection，或稱追加感染，superinfection);因此，無法在不同時間點，利用習知桿狀病毒於宿主細胞内表現二個以上基因。【發明内容】本發明之目的在於發展一種以重組病毒為主之載體，例如一桿狀病毒為主之載體（baculovirus-based vector)，使得在沒有表現可偵測之選擇標記子 (detectable selection marker)的情況下，仍可於非宿主細胞内表現一外源目標蛋白質（exogenous target protein)。桿狀病毒為主之載體包括：含有一可偵測之標記子（detectable marker)的第一核酸序列，且受到連結之第一啟動子操控，其中，第一啟動子在宿主細胞 (如Sf21，Sf9細胞等）内具有活性，但在非宿主細胞（如果蠅，哺乳類動物細胞等）内則不具活性。載體還包括一外源核酸序列在第二啟動子控制之下編譯一目標蛋白質’其中’第二啟動子在非宿主細胞内具有活性。本發明之系統可使選擇標記基因在病毒斑篩檢時表現，但不使選擇標記基因在產出目標蛋白質時表現。再者，根據本發明之重組病毒可連續感染一非宿主細胞，以在同一個非宿主細胞内表現複數個目標蛋白質。據此，本發明之主要的重組病毒，如重組桿狀病 ’奋包括.一第一核酸序列含有一可彳貞測之標記基因，受連結之第一啟動子操控，其中，第一啟動子在宿主細胞内具有活性，但在非宿主細胞内則不具活 1·生，及一第二核酸序列含有一外源核酸序列，受連結之第二啟動子操控，第二啟動子在非宿主細胞内具有活性。 ^里々法’係選擇一病毒斑（viral Plaque)以感染非宿主細胞。步驟如下·首先，提供一 :可感染非佰主細胞的重組病毒，例如重組桿狀病 :其中’重組病毒包括一第一核酸序列和一第二核 -列而第一核酸序列編譯一可偵測之標記子，受之第啟動子操控，且第一啟動子在一宿主細 ”有H，但對非宿主細胞則沒有活性，第二核掉批m扁譯—外源蛋白f，受連結之一第二啟動子以：：且Λ二啟動子在非宿主細胞内具有活性。接著，記美/狀病毒感染宿主細胞，然後檢測可偵測之標 δ己基因的表達以辨識出病毒斑。

本發明更接屮s H 另一種方法，以在非宿主細胞内產出蛋白質。步驟如下：首先，提供—種如上所述之重組病毒’例如上述之重組桿狀病毒；接著，以重組病毒感染宿主細胞，然後檢測可偵測之標記子的表現以辨識出病毒斑；接著利用選出的病毒斑將病毒增量；再令增量的病毒感染非宿主細胞，使得非宿主細胞可以產出外源核酸序列所編譯的蛋白質，而不表現可偵測之標記子。在本發明一實施例中，以體外（invitro)方式感染非宿主細胞。另一實施例中，以體内（in vivo)方式感染非宿主細胞。較佳地’本發明之方法更包括以重組病毒，如上述之相同或不同的重組桿狀病毒，再感染 (re-inflect)非宿主細胞如昆蟲細胞之步驟。本發明提供了一追加感染系統以使相同的非宿主細胞可表現多個蛋白質。因此，此系統可用於雙雜合篩選分析 (two-hybrid screening assay) 〇本發明中所述之重組病毒，較佳的是重組桿狀病毒。本發明中，非宿主細胞是一昆蟲細胞，如：果蠅細胞（S2或Kc細胞），蚊子細胞（C6/36細胞）；或是哺乳類動物細胞（較佳的是人類細胞，如人類基礎細胞或初級細胞之細胞株）。在宿主細胞内具有活性，但在非宿主細胞内則不具活性的較佳啟動子有：病毒多角體基因啟動子（viral polyhedrin promoter)或 plO 啟動子。在非宿主細胞（如哺乳類動物細胞）内具有活性的較佳啟動子有：CMV啟動子，RSV啟動子，或sV40 啟動子。其他在非宿主細胞（如昆蟲細胞）内具有活性的較佳啟動子有：熱休克蛋白（Heat Shock Protein)啟動子（如 hsp70)，Orgyia pseudotsugata immediate-early(OPIE)啟動子，metallothionein(MT) 啟動子，或是actin5C啟動子。較佳的可偵測之標記子為一螢光蛋白質，如綠螢光蛋白質（green fluorescent protein，GFP)，進階綠螢光蛋白質（enhanced green fluorescent protein，EGFP)，或紅蝥光蛋白質（red fluorescent protein » DsRed) ° 本發明中，”外源核酸序列”係指非屬自然界中病毒基因組之任何一段核酸序列，此核酸序列可包括通常出現在待感染之非宿主細胞中的一段核酸序列，也可以是通常沒有出現在待感染非宿主細胞中的一段核酸序列（如··其他細胞或其他物種的相關或不相關基因）。”非宿主細胞”係指不允許在此所述之病毒複製’ 和不允許病毒在細胞内進入溶解期（lytic phase)的細胞工具（cell means)。非宿主細胞仍然可以被病毒感染並產出病毒核酸序列所編譯之蛋白質。“操控性連結，’(operably linked)係指第二啟動子和第二核酸序列之間的功能性連結，其中，啟動子之序列可以啟動或調節對應於第二核酸序列之DNA序列的轉錄。操控性連結之序列可以是連續的，並且在必要時係連接連續且位於相同讀碼區（reading frame)的兩個蛋白質譯碼區域。”蛋白質，，或，，目標蛋白質，，係指一任意長度之胜肽（peptide)。【實施方式】較佳實施例中所述之桿狀病毒表現方法，係使目標蛋白質（target protein)可在非宿主細胞内表現，例如：在昆蟲或哺乳類動物細胞内表現目標蛋白質。且在缺少選擇標記子（selection marker)表現的情況下，目標蛋白質仍可被表現。可偵測之選擇標記子僅在病毒斑篩檢步驟（viral plague screening step)表現，且此標記子是經由在表現目標蛋白質之宿主細胞内沒有活性的一啟動子所表現。較佳實施例中所採用的可偵測之標記子 (detectable marker)，可以是任何可债測到，例如具有酶反應（enzymatic)、產色素（chromogenic)、發螢光 (fluorescent)、或發冷光（luminescent)性質之報導分子 (reportor molecule)。另外，所採用的可债測之標記子還包括螢光蛋白質（(flurorescent protein)，如：GFP， EGFP j DsRed (Matz et al.5 Nat. Biotechnology, 17: 969-973);螢光素酶（luciferase);氯黴素乙醯轉移酶 (chloramphenicol acetyl transferase，CAT) ; β-半乳糖苷酶（β-galactosidase);内醯胺（β-lactamase);或是由胎盤分泌的驗性填酸酶類（placental alkaline phosphatase)。而藉由適當的產色基質（chromogenic substrate)或產營光基質（fluorogenic substrate)债測功能的其他報導分子和其他酶均為熟知此技藝者所知。此外，較佳實施例所述以桿狀病毒為主之表現方法能對昆蟲細胞造成追加感染。兩個同源桿狀病毒 (homologous baculovirus)的連續感染並不會對蛋白質表現造成影響。因此，利用本發明之方法可成功地在非酵#系統（non-yeast system)中表現多種蛋白質。本發明之病毒特性和方法在進行雙雜合篩選 (two-hybrid screens)時十分有用。桿狀病畚（Baculovirus) 所述重組病毒（recombinant virus)係設計為在一非宿主細胞’如昆蟲或哺乳類細胞内’表現外源目標蛋白質（如：治療性蛋白質）。此重組病毒較佳為部分非溶解系統（non-lytic system)以產生重組蛋白質。在本發明之方法令，較佳的一種病毒為桿狀病毒AcMNPV。其他可使用的桿狀病毒還包括但不限於家蠶核多面體病毒（Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus、Orgyia pesudotsugata 單核多面體病毒、擬尺礎單核多面體病毒（Trichoplusia ni mononuclear polyhedrosis virus)、Helioththis zea 桿狀病毒、無毒蛾桿狀病毒（Lymantriadispar baculovirus)、Cryptophlebia leucotreta 顆粒體病毒、草蝦桿狀病毒（Penaeus monodon-type baculovirus)、印度穀蛾顆粒體病毒（Plodia interpunctella granulosis virus)、Mamestra brassicae 核多面體病毒或 Buzura suppressaria核多面體病毒。。設計具有外來遺傳因子之桿狀病毒的標準程序，如熟習此技藝者所知。而將重組桿狀病毒引入宿主（如昆蟲）細胞的程序，亦如熟習此技藝者所知，請 11 參照文獻 Pfeifer et al_，1997, Gene 188: 183-190 和 Clem et al., 1994，J Virol 68: 6759-6762。桿狀病毒基因組可根據需要設計為帶有人類基因複製起始點（human origin of replication)。此種基因序列已由文獻（Burhans et al_, 1994，Science 263: 639-640)所確定，並可利於桿狀病毒在人類細胞中的複製。其它複製起始點’如Epstein-Barr Virus複製起始點和轉錄因子（trans-acting factor) ’亦可利於在人類細胞中的基因表現。此外，桿狀病毒亦可任意地設計為表現一個以上的外源基因。病毒可根據需要設計為利於使病毒感染特定細胞型態。再者，病毒亦可經由化學方法修飾使病毒可感染一特定受體。另外，桿狀病毒也可根據需要設計為在宿主細胞内具有成長缺陷。此種桿狀病毒可提供額外的安全性。其中一例是將一迅早期基因（immediate early gene)，如IE1，自桿狀病毒的DNA上刪除，以形成有缺陷的桿狀病毒。藉由在酵母内進行特定重組 (target recombination)可完成此刪除過程，此有缺陷的病毒在IE1基因產物的供給下仍可在昆蟲細胞内進行複製。非宿主細胞（N〇n-t)ermissive cell) 本發明之重組桿狀病毒的宿主可能根據系統設計和專一性考量而有不同。為重組桿狀病毒及所述方法選擇與決定適當宿主為熟習此技藝者所了解之知 1330198 識和技術。適合本發明重組桿狀病毒的宿主包括但不限於由昆蟲到脊椎動物範圍内物種所衍生之細胞，較佳的宿主為昆蟲衍生細胞（insect-derived cell)和哺乳類動物細胞。

本發明適合表現目標蛋白質的昆蟲衍生細胞包括由昆蟲類所衍生的細胞，較佳為昆蟲連續細胞株 (insect continuous cell lines)，如 S2 細胞、Kc 細胞、和C6/36細胞。適合本發明重組桿狀病毒的哺乳類動物細胞則包括了：初生細胞（primary cells)，如人類初生細胞，和來自哺乳動物種的細胞株如源自鼠類 (murine or rat)、豬類（porcine)或人類的細胞株。目標蛋白皙之表現（Expression of target proteins)

應用本發明之重組桿狀病毒及其方法可於許多不同的細胞，如前述之所有非宿主細胞内表現目標蛋白質。較佳的目標蛋白質為治療性蛋白質。舉例來說，應用本發明在一對象（比方說：哺乳類動物，如人類）中表現一核酸序列，其核酸序列編譯可修正基因表現缺陷之蛋白質。使用本發明方法所表現的治療性蛋白質包括疫苗（vaccines)、抗體（antibodies)，生物活性胜肽（biological active peptides)、細胞激素 (cytokine)及其受體（receptors)、生長因子（growth factor)及其受體、麟酸二醋（phosophodiesterases)、新陳代謝酵素（metabolic enzymes)、激酵素（kinases)，填酸酵素（phosphatases)、腫瘤抗原（tumor antigens)、 13 1330198 病毒外殼稍（viral envelop)、病毒核心（viral core)、類病毒分子（viral-like particles)以及表面抗原（surface antigens)等。本發明亦可促進在無明顯基因表現缺陷之細胞表現目標蛋白質。例如：在一對象細胞内表現一生理必要因子（physiologically essential factor)(如荷爾蒙或成長因子），為對象提供此必須因子。本發明亦可在一細胞内表現一調節基因（regulatory gene)、或編譯轉錄因子（transcription factor)之基因，以控制另一基因的表現。另外，在治療癌症的方法上，可根據需要在細胞内表現腫瘤抑制基因（如p53,R6)。其他有用的基因產物還包括用於核糖核酸假目標（RNA decoy)、抗原或是以核糖體為主抑制基因表現之方法的RNA分子。本發明亦可根據需要用來表現基因，如cytosine demeans，其基因產物會改變藥物或前驅藥物（prodrug)，如5-fluorocytosin在細胞内的活性。較佳的表現基因包括編譯表現在正常細胞之蛋白質的基因。並且可藉由一般分子生物技術將基因以次選殖方式（subcloning)殖入桿狀病毒内。特別在治療哺乳類動物時，係將桿狀病毒與可藥用無毒賦形劑（excipients)及載體（如生理食鹽水）混合製作成醫藥成分。在哺乳類動物（如人類）内實施本發明時，係製備成溶液或懸浮液，以非經腸道之方式（例如：靜脈内注射，動脈内注射，腹腔内注射，脊髓内注射，局部直接注射如肌肉注射）施行藥物。 14 1.330198 桿狀病毒還可製備成鼻滴劑（nasal drops)或喷霧式 (aerosol)，進行鼻内治療或支氣管内治療。本發明的另一種實施方法，是利用桿狀病毒感染在待治療對象外的細胞，再將感染細胞送入待治療對象内所選用的細胞可以是待治療哺乳類動物的自體（autologous)細胞或異體（heterologous)細胞。培養細胞和以桿狀病毒感染細胞的方法係採用本發明所提供的指示結合習知技術（請參見 Grossman et al,，1994, Nature Genetics 6:335)，然後再以注射法（如腹腔注射或靜脈内注射）將細胞注入對象。施打於待治療對象的桿狀病毒量或感染細胞數目，和施打頻率，係依各種不同因素，例如，外源基因表現之偵測方法的敏感度、啟動子的強度、待治療主體失調的嚴重程度、以及病毒的感染目標細胞而定。一般施打病毒的感染倍率（multiplicity of infection ’ MOI)約為 0.1-800，較佳 MOI 值為 5-200，更佳MOI值為10-100。將桿狀病毒送進細胞内以及外源基因的表現皆可利用分析基因表現之標準技術進行監測。舉例來 s兒’藉由一些常見程序如南方墨點法（southern blotting)、北方墨點法（northern blotting)、點潰法 (slot/dot blotting)或原位雜交技術（ζ>2幻·仏 hybridization)監測一苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒 (AcMNPV)的DNA或RNA(有無聚合酶鏈式反應的核酸增量程序）。另外，熟習分子生物學者可輕易製備 15 適合與AcMNPV核酸進行雜交配對的探針（probe)、啟動子、或外源基因。藉由對具有細胞含基因相關之RNA和蛋白質的對象分析細胞或體液（如血清），可以追蹤外源基因在細胞内的表現。一般分子生物學家常用的偵測技術 (北方墨點法、西方墨點法（Western blotting)、原位雜交技術、點潰法、聚合酶鏈式反應擴增法、不連續膠體電泳方法（SDS-PAGE)、免疫染色法 (immunostaining)、放射免疫分析 (Radioimmunoassay，簡稱RIA)、和酵素結合免疫吸附法（Enzyme-linked immunosobent assay，簡稱 ELISA) 等）可用來量測基因表現。對帶有基因表現細胞的對象監測其機能失調的癥狀和體症，可評估在細胞内表現外源基因的療效。評估醫療方法的各項參數係為熟習醫學者所知。例一：建構和產出在哺乳類動物細胞内表現的重組桿狀病毒設計一個哺乳類動物細胞-桿狀病毒穿梭載體 (shuttle vector)採用EGFP作為可偵測之標記子（病毒斑選定標記子，viral plaque selection marker)與宿主細胞同樣受到多角體基因啟動子（polyhedrin promoter)的控制。此多角體基因啟動子在非宿主細胞内並無活性。為要在非宿主細胞清楚顯示與偵測目標基因的表現，在啟動子CMV-IE的控制之下建溝一個包含取自海葵的紅色螢光基因DsRed的表現卡匣 1.330198 (expression cassette)。在此實施例中，DsRed僅顯示利用本發明之方法所表現的數個目標蛋白質。另外，建構本發明之重組桿狀病毒係使用衍生自 pBacPAK8(Clontech公司）之穿梭載體。

首先，將編譯有可偵測標記子的核甘酸序列 (EGFP的聚合酶鏈式反應產物）殖入載體pBacPAK8 的5am HI和尸沉I位置，以建構載體pBacEGFP，如第1A圖所示。利用引子（primer) 5，-CAGGATCCGCCACCATGGTGAGCAAGGGCG-3’ (SEQ ID ΝΟ:1)，和 5，-AGCAATTAATTAATGAACATGTCGAGCAGGTAC 3’（SEQ ID NO:2)，以 PCR 技術擴增 EGFP 片段。

接著，將取自pcDNA3(Invitrogen公司）長度為 2.6kb的Wrw I和价w I片段（依序包含了一啟動子 CMV-IE、一多重選殖位置多腺核肝訊號（multiple cloning site polyadenylation signal)以及一複製起點 SV40)插入pBacEGFP的V位置，以形成載體 pBacEGFP/CMV。穿梭載體 pBacEGFP/CMV DsRed 包含取自pDsRed-N 1 (Clontech公司）的目標基因 DsRed插入載體pBacEGFP/CMV的五coi? I位置到W I位置，產生本發明之哺乳類-桿狀病毒之穿梭載體 pBacEGFP/CMV DsRed，如第 1B 圖所示。重組桿狀病毒（BacEGFP/CMV DsRed)係由 BacPAK系統（Clontech公司）所產生，並藉由常規技術在枯虫（<S_ Sf2 1細胞（為允許細胞株）内 17 1,330198 繁殖以使重組桿狀病毒增量。透過螢光顯微鏡技術 (Fluorescence Microscopy )，可觀察到被感染的 Sf21 細胞發出綠色螢光，進而辨識出重組桿狀病毒。由此可見標記子不僅有助於篩檢宿主細胞内的重組桿狀病毒，也避免了以中性紅色染料染色的麻煩及造成重組病毒之突變。例二：將重組桿狀病毒導入哺乳類動物細胞，並偵測目標蛋白質之表現將以傳統細胞培養技術維持之HeLa和Cos-1細胞分散在具6個儲液器（6-well)之組織培養孤内，且每個儲液器含有2xl05個細胞。將培養基以100MOI 的感染倍率置換成如例一所製備之病毒接種體 (inoculum)。以溫度37°C，轉速40rpm的混合搖動 (shaking)方式培養感染細胞1小時。自培養液中移走病毒後，再對細胞加入具有1 mMTricostain (簡稱 TSA，一種組織蛋白乙烯轉化媒抑制劑（histone deacetylase inhibitor))之新培養液，並以溫度37°C再培養24小時。經過24小時的培育後，以共軛焦顯微鏡 (Confocal Microscopy)和西方墨點法檢查細胞培養液，以觀察EGFP和DsRed的表現。在共轆焦螢光顯微鏡下，HeLa和Cos-Ι細胞均顯示廣泛的目標蛋白質DsRed表現，但未彳貞測到任何EGFP訊號（病毒斑檢測選定標記子）。再以西方墨點法分析導入重組桿 18 狀病毒之細胞萃取物的細胞膜部份，帶有針對egfp 或DsRed的抗體。結果證實，藉由GFP及DsRed多株抗體的確偵測到DsRed基因表現，而沒有EGFP 基因表現。實驗結果清楚顯示：EGFP選定標記子在哺乳類動物細胞内並不具活性的表型，並且在啟動子 CMV-IE的控制下只有表現目標基本。本發明之實施例證實了一種在哺乳類動物細胞内表現桿狀病毒媒蛋白質之極為便利的病毒斑檢驗法。而可見的 egfp選定標記子顯著的簡化並加速病毒斑選擇的操作以及病毒滴定量（viral titer)的決定。特別的是，本發明之實施例指出在宿主細胞專一性表現選定標記子可消除與在哺乳類動物細胞内表現之目標基因的可能競爭與干擾。例三：以重組桿狀病毒對哺乳類動物細胞進行追加感染為了評估被一桿狀病毒感染之哺乳類動物細胞是否中止其他桿狀病毒的感染和蛋白質表現，以桿狀病毒 BacEGFP/CMV DsRed 和 BacEGFP/CMV EGFP 同時感染HeLa細胞，或以上述兩病毒依前後次序隔 4小時感染HeLa細胞。利用GFP多株抗體 (Clontech，目錄型號8363-2)偵測EGFP基因表達’ DsRed多株抗體（Cl〇ntech ’目錄型號8370_1)偵測 DsRed基因表達。經過36小時的培養後’以西方墨

點法分析帶有針對EGFP或DsRed抗體的細胞萃取物。不論是單一桿狀病毒感染、兩個桿狀病毒同時感染或以兩桿狀病毒先後感染HeLa細胞，其分析結果均無明顯差異。再者，以兩個桿狀病毒連續感染HeLa 細胞也沒有造成蛋白質表達之間的干擾。另外，以共軛焦顯微鏡觀察S2細胞内螢光目標基因的共同表現 (co-expression)。並令桿狀病毒 BacEGFP/CMV DsRed 和BacEGFP/CMV EGFP同時感染或依先後次序隔4 小時感染HeLa細胞。結果顯示：超過96%以上的細胞共同表現了兩種蛋白質，而此兩種蛋白質係由重組桿狀病毒的共同感染或追加感染所造成。例四：建構和產出在昆蟲細胞内表現的重組桿狀病毒重組病毒帶有以多角體某因啟動子驅動之EGFP基在此實施例中，EGFP基因係受到多角體基因啟動子的控制，其中，此多角體基因啟動子在Sf21細胞中具有活性，但在果蠅（Dri^o/7/H7a)S2細胞中卻無活性。EGFP基因係作為報導基因（reporter gene)，以評估基因轉移感染（transfection)效率和相關蛋白質表現程度。將EGFP之PCR產物次殖入載體 pBacPAK8(Clontech)的 HI 和尸ac I 位置，以建構質體pBacEGFP，並且特定的引子，由 pEGFP-l(Clontech)擴增 EGFP PCR 產物。用於 PCR 的引子為： 20 1330198 5EGFP/Bi/»2 HI ： 5,-CAGGATCCGCCACCATGGTGAGCAAGGGCG-3, (SEQ ID NO: 1) ’ 及 3EGFP/尸ac I : 35 -TCGTTAATTAATTACTTGTACAGCTCGTCCATG-5， (SEQ ID NO: 3)。藉由上述螢光顯微鏡觀察EGFP之表現，以目測篩檢病毒斑點並計算病毒滴定度。

重組病毒帶有在昆蟲細胞内具有活性之啟動子驅動的EGFP基因分別將啟動子hsp70和啟動子actin5C插入載體 pBacEGFP，並結合SV40聚腺甘酸化 (polyadenylation，簡稱poly-A)序列，以分別建構載體 pBacEGFP/hsp70 和載體 pBacEGFP/actin5C。其中，啟動子hsp70和actin5C的位置均鄰近桿狀病毒之多角體（PH)啟動子並與PH的定向（orientation)相反。然後，分別將EGFP基因（取自pEGFP-Ι)次殖入於載體 pBacEGFP/hsp70 和載體 pBacEGFP/actin5C 的 RI和I位置，以分別建構載體 pBacEGFP/hsp70 EGFP 和載體 pBacEGFP/actin5C EGFP，如第1C、ID圖所示。如此建構的桿狀病毒傳送載體包含外源啟動子鄰近多角體基因啟動子並與其定向相同、鄰近poly_A並與多角體基因啟動子之定向相反以及鄰近poly-A並與多角體基因啟動子 21 1330198 之定向相同。實驗結果發現鄰近多角體基因啟動子並與其定向相同的lisp70或actin5C呈現高度的EGFP 基因表現。然而，其他啟動子的排列亦可表現EGFP 基因。以BacPAK系統（Clontech)產生重組桿狀病毒 BacEGFP/hsp70 EGFP 和 BacEGFP/actin5C EGFP 〇並且利用在Sf21細胞内繁殖進一步擴增重組桿狀病毒。其中，以具有10%胎牛血清（fetal bovine serum) 的（Grace 培養基（Life Technologies)在溫度 27°C 維持 S f 21細胞。當Sf21細胞被重組桿狀病毒感染後，可用螢光顯微鏡觀察EGFP之表現。利用EGFP作為螢光標記子，可便利的篩選出單一綠色病毒群（clone)並計算出病毒滴定量。例五：藉由重組桿狀病毒轉導昆蟲細胞，並偵測目標蛋白質之表現將S2細胞以每井lxl 06個細胞的數量分散在具 24井的培養皿内，並在溫度23.5°C以modified M3 培養基（Sigma)維持S2細胞，其中，modified]VI3培養基更添加有10%的胎牛血清（Life Technologies)。將 S2細胞與例三所建構之個別病毒一起培養，在室溫下以轉速40rpm搖動混合1小時以所顯示的感染倍率。移除病毒後，置換新培養基並以溫度23.5°C培育 S2細胞。接著，分別以感染倍率為每細胞具有10個 22 1330198 病毒斑形成單位（plaque forming unit)的桿狀病毒 BacEGFP/hsp70 EGFP 和 BacEGFP/actin5C EGFP 感染S2細胞。在感染後（post-infection) 36小時，再以螢光顯微鏡監測EGFP之表現。監測結果顯示被病毒 BacEGFP感染的S2細胞沒有表現EGFP，因為病毒多角體基因啟動子S2細胞内不具活性所致。

以西方墨點法進行分析時，將細胞塊（cell pellets)加入緩衝液（2% SDS，10%甘油，6.25 mM Tris)，煮沸，然後使聚丙烯醯胺凝膠（polyacrylamide gel)變性以進行分析。並且以一半乾燥器 (semidrier)(Bio-Rad)和 immunoblot 標準方法，將蛋白質轉移至Immobilon-P轉移薄膜（Millipore)。以 GFP多株抗體（Clontech，目錄型號8363-2)偵測EGFP 基因的存在，結果顯示在被桿狀病毒BacEGFP/hsp7〇 EGFP和BacEGFP/actin5C EGFP感染的細胞偵測到 EGFP表現，但在被桿狀病毒BacEGFP感染的細胞則沒有偵測EGFP表現。此外，從結果中更發現啟動子 hsp70在此系統具有比啟動子actin5C更高的表現裎度，雖然由轉移感染數據來看，啟動子actin5C比啟動子hsp70具有更高的活性。此結果顯示在啟動子 hsp70或啟動子actin5C的控制下，EGFP的基因表達可藉由桿狀病毒為媒介之基因傳送所達成。桿狀病奏媒介基因表現的感染效率為分析桿狀病毒媒介基因表現的劑量反應，將 23 S2細胞暴露在劑量增加的桿狀病毒BacEGFP/hsp70 EGFP,並在感染後30小時以共軛焦顯微鏡觀察以及流式細胞技術（flow cytometry)進行债測。

在共輛焦顯微鏡的檢視下，收集以感染倍率為 1、10、100 與 200 MOI 之桿狀病毒 BacEGFP/hsp70 EGFP感染，感染的S2細胞，並在塗佈有polylysin 的載玻片上培育30分鐘。以PBS (phosphate buffered saline)溶液清洗細胞兩次，蓋上蓋玻片，並以冷凝液 (mounting medium)(PBS 溶液含有 2% n-propyl gallate 和6%甘油，pH值為8.0)封片。以Leica TCS NT共軛焦顯微鏡觀察EGFP的表現^

進行流式細胞技術分析時，係將S 2細胞重新懸浮在 PBS 中，並以 BectonDickinsonFACSCalibar 流式細胞儀進行數據收集。使用LinearFlow™綠流式細胞儀強度校正套件（Molecular Probe’s L-14882)，作為流式細胞儀實驗中之校正強度標準。S2細胞内的 EGFP表現作為一參考標準值，可量化為相對的螢光強度。共軛焦顯微鏡分析與流式細胞技術分析（取三次獨立感染之平均值），其結果顯示：桿狀病毒的感染能力（infection efficiency)在感染倍率為100 MOI 達到最大值（95%〜96%)，超過此感染倍率其感染能力並不會提高。因此，以感染倍率為100 MOI進行感染足以使S2細胞内桿狀病毒的蛋白質表達達到最大值。 24 1330198 桿狀病毒媒介基因表現的時程研究（time course study) 為分析桿狀病毒媒介基因表現的時程，將S2細胞暴露於桿狀病毒BacEGFP/hsp70 EGFP接觸，隨著時間增加而在不同時間進行偵測。將S2細胞在溫度 25°C暴露於桿狀病毒BacEGFP/hsp70 EGFP 1小時，並以轉速40rpm混合搖動。接著，在不同時間點收集細胞並以流式細胞技術量化收集的細胞。EGFP表現的平均值和感染能力在感染後24-36小時達到高峰，並在感染後60小時後開始下降。EGFP表現之平均值和感染效率隨著時間下降，可由細胞分裂時缺乏病毒DNA複製所解釋（相關參考文獻Carbonell et al., 1985, J. Virol. 56, 153-160)。因此，表現 EGFP 的細胞百分比係隨時間而減少。根據流式細胞技術所測得之EGFP表現的平均值，和錐藍（trypan blue)染色法所計算之細胞成長結果，所做出的結論為EGFP表現程度在36小時可達到最大值。桿狀病毒媒介基因傳送至S2細胞不會引起細胞溶解 Ovtic) 以溫度27°C，具有10%的胎牛血清（Life Technologies)的Grace’s培養基維持枯蟲（S_ /rwgz'/?eri/<3)Sf9 細胞。以溫度 27°C，High FiveTM 細胞培養基（Invitrogen)維持 High Five™ 細胞。將 Sf21， 25 SF9 和 High Five™ 細胞與桿狀病毒 BacEGFPMisp70 EGFP以感染倍率為ΙΟΟΜΟΙ —起培育。實驗結果發現，受桿狀病毒感染的Sf21，SF9和High F1VeT'_ 胞會行進溶解路徑（lytic pathway)。為偵測受桿狀病毒感染的S2細胞是否也行進溶解路徑，將S2細胞暴露於感染倍率為100 MOI的桿狀病毒BacEGFP/hsp70 EGFP，並以錐藍染色法測量細胞存活率。實驗結果發現受桿狀病毒感染的S2 細胞的存活率和細胞成長甚至超過3 0天仍不受影響。雖然帶有桿狀病毒的Sf21，SF9和High FiveTM 細胞會溶解，但帶有桿狀病毒的S2細胞卻不會溶解。例六：以重組桿狀病毒對果绳S2細胞進行追加感染為了評估被一桿狀病毒感染之果蠅S2細胞是否會中止其他桿狀病毒感染和蛋白質表現，以感染倍率為 100 MOI 的桿狀病毒 BacEGFP/hsp70 dCdc2(HA tagged)、BacEGFP/hsp70 ena 以及 BacEGFP/hsp70 EGFP同時感染果繩S2細胞，或以上述三病毒依序間隔4小時感染果蠅S2細胞。利用GFP多株抗體 (Clontech ’目錄型號8363-2)偵測EGFP表現；HA多株抗體（BAbCO，目錄型號MMS-101R)偵測HA抗原決定基（epitope); ena多株抗體（參考文獻Juang JL and FM Hoffmann 1999, Oncogene 37: 5138-5147)债測 ena 基因表達。經過36小時的培養後，以西方墨點法分析針對帶有EGFP、HA或ena抗體之細胞萃取物。 26 1330198 不論是單一桿狀病毒感染、三個桿狀病毒同時或先後感染果繩S2細胞，其分析結果均無明顯差異。再者，以桿狀病毒連續感染果蠅S2細胞也沒有對蛋白質表現造成干擾。另外，以桿狀病毒BacEGFP/hsp70

DsRed 和 BacEGFP/hsp70 EGFP 同時感染 S2 細胞，或依序間隔4小時感染S2細胞，並以共耗焦顯微鏡觀察S2細胞内螢光目標基因的共同表現 (co_expressi〇n)。結果顯示無論是被桿狀病毒同時感染或追加感染的S2細胞，超過96%的細胞均表現了兩種蛋白質。比較實施例之表現系統（eXpreSSi〇n System)與傳統的表現系統，概述如下：表現系統傳統lepidoptran宿主細胞内的桿狀病毒實例一至三的哺乳類動物細胞内的桿狀病毒實例四至讀内的桿狀病毒 —病毒斑分析 Anti-gp64選擇/中性紅 EGFP選擇 ----- EGFP選擇 _表達之啟動早多角體(polyhedrin) CMV Drosophila hsp70 細胞溶解會不會不會蛋白質產車高 N.D. 高 __追加感染不可可可例七：比較S2 ’ Sf9，Sf21，和High卩^顶細胞之蛋白質表現以本發明之方法與一般桿狀病毒表達系統比較下所表現的蛋白質數量可進行量化。以感染倍率為 100 M0I 的 BacEGFP/hsp70 EGFP 感染 1〇6 個 S2 細胞，且培育30小時。收集半數S2細胞以藉由DC蛋 27 1330198

白質分析技術（BIO-RAD)測量蛋白質總量。另外半數的S2細胞則以西方墨點法偵測細胞内EGFP之表現。在夥體内載入333ng、100ng、33.3ng以及10ng的 GFP(Clontech)作為量化蛋白標準。利用磷光螢光分析儀（FUJIFILM Phosphoimage FLA-2000)進行西方墨點法之分析。EGFP表現效率為EGFP量除以細胞蛋白質總量。同樣地，將Sf9，Sf21，和High Five™細胞以相同方式處理，但培養時間延長為3天以估計蛋白質表達量的最大值。所有實驗均進行三次，以取得數據平均值。

為在上述細胞株内量心EGFP表現，自5xl05個 S2細胞中獲取53ng的所需蛋白質，其中以感染倍率為 100 MOI 的 BacEGFP/hsp70 EGFP 感染 S2 細胞 36 小時。同時自105個Sf9、Sf21、以及High FiveTM細胞中分別獲取17ng、30ng以及71ng蛋白質，其中以感染倍率為100 MOI的BacEGFP/hsp70 EGFP感染 Sf9、Sf21和High Five™細胞72小時。在比較S2、 Sf9、Sf21以及High Five™細胞内蛋白質的產率發現 EGFP基因在S2細胞内表現的蛋白質比在Sf9和Sf21 細胞内表現的蛋白質較多，但比在High FiveTM細胞内表現的蛋白質較少。總之，S2細胞内的蛋白質表現程度可與Sf9、Sf21以及High FiveTM細胞内的蛋白質表現程度相比。綜上所述，雖然本發明已以較佳實施例揭露如上，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者， 28 1330198 在不脫離本發明之精神和範圍内，當可作各種之更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。【圖式簡單說明】為讓本發明之上述目的和特徵能更明顯易懂，下文特舉實施例，並配合所附圖式，作詳細說明如下：第1A圖繪示桿狀病毒載體pBacEGFP之圖解；第1B圖繪示桿狀病毒載體pBacEGFP/CMV DsRed之圖解；第1C圖繪示桿狀病毒載體pBacEGFP/hsp70 EGFP之圖解；及第1D圖繪示桿狀病毒載體pBacEGFP/actin5C EGFP之圖解。【主要元件符號說明】 29 1330198 【補充序列表】 <11 〇>國家衛生研究院 <120> 重組桿狀病毒感染非宿主細胞的方法 <130> N007-0005TW <140> 91105663 <141〉 91 年 3 月 22 日 <160> 3 < 17 0> Patentln version 3.3 <210> 1 <211> 30 <212>去氧核醣核酸 <213〉人造 <220> <223〉5'to 3’ 引子 <400> 1 caggatccgc caccatggtg agcaagggcg 30 <210> <211〉 2 33 <212> 去氧核醣核酸 <213> 人造 <220> <223> 5’to 3’引子 <400> 2 1330198 agcaattaat taatgaacat gtcgagcagg tac 33

<210> 3 <211> 33 <212> DNA <213> 人造 <220> <223〉3’to 5'引子 <400> 3 tcgttaatta attacttgta cagctcgtcc atg 33 2

Claims

申請專利範圍： 1. 一種選擇一病毒斑（viral plaque)以感染哺乳類動物細胞的方法，包括以下步驟；提供一種重組桿狀病毒包括一第一核酸序列和一第二核酸序列’其中，該第一核酸序列編譯一可偵測之標記子，受連結之一第一啟動子操控，且該第一啟動子在一宿主細胞内具有活性，而在該哺乳類動物細胞内則不具活性，該第二核酸序列則含有一外源核酸序列，受連結之一第二啟動子操控，且該第二啟動子在該哺乳類動物細胞内具有活性，而在該宿主細胞内則不具活性；以該重組桿狀病毒感染該宿主細胞；及檢測可偵測之標記子的表現以辨識該病毒斑，因而選出一病毒斑感染該哺乳類動物細胞。 2_如申請專利範圍第1項所述之方法，其中，該重組桿狀病毒的該第一啟動子在一人類細胞内不具活性，而 a亥第二啟動子在該人類細胞内則具有活性。 3 ·如申請專利範圍第1項所述之方法，其中，該重組桿狀病毒的該第一啟動子是一病毒多角體基因啟動子，或一 pio啟動子。 4_如申請專利範圍第1項所述之方法，其中，重組桿狀病毒的該第二啟動子是一 CMV啟動子，一 RSV啟動子’或是一 SV40啟動子。 1330198 5_如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該可偵測之標記子是一螢光蛋白質。 6. 如申請專利範圍第5項所述之方法，其中該螢光蛋白質是 GFP，EGFP，EYFP，ECFP，EBFP，或 DsRed。 7. —種在哺乳類動物細胞内產出蛋白質產物的方法，包括以下步驟：提供可感染一哺乳類動物細胞的一種重組桿狀病 f »亥重組杯狀病毒包括一第一核酸序列和一第二核酸序列，其中，該第一核酸序列編譯一可偵測之標記子，受連結之一第一啟動子操控，且該第一啟動子在一宿主細胞内具有活性，而在該哺乳類動物細胞内則不具活性該第二核酸序列則含有一外源核酸序列，受連結之一第二啟動子操控，且該第二啟動子在該哺乳類動物細胞内具有活性，而在該宿主細胞内則不具活性；以該重組桿狀病毒感染該宿主細胞；辨識該可偵測之標記子的表現，以選擇干涡母斑；藉由從選出的該病毒斑長出該桿狀病毒而將該病毒增量；及 Λ f狀以增量的該桿狀病毒感染該哺乳類動物細胞，該哺乳類動物細胞產出該外核酸序列譯碼的該蛋白質件物，而不表現該可偵測之標記子。產 2 8_如中請專利範圍第7項所述之方法，更包括以一組桿狀病毒再度感染該哺乳類動物細胞之步驟。 9·如申μ專利範圍第7項所述之方法，其十，該嗔乳類動物細胞係以體外（in ν/·π〇)方式感染。八 10·如中請專利範圍第7項所述之方法，其中該重組桿狀病毒的該第—啟動子是—病毒多_基因啟動子，或一 plO啟動子。 11. 如申明專利範圍第7項所述之方法，其中該重組桿狀病毋的該第二啟動子是一 CMV啟動子，一 RSV啟動子，或是一 SV40啟動子。 12. 如申請專利範圍第7項所述之方法，其中該可偵測之標記子是一螢光蛋白質。 13_如申請專利範圍第12項所述之方法，其中該螢光蛋白質是 GFP，EGFP ’ EYFP，ECFP，EBFP，或 DsRed。