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Abstract

本发明公开了一种重组杆状病毒和其应用及构建该重组杆状病毒的载体。所述载体包括杆状病毒表达供体质粒和外源蛋白融合表达载体，所述杆状病毒表达供体质粒以pFastBac1杆状病毒表达载体为骨架，在其多克隆位点连接有NEDD8基因；所述外源蛋白融合表达载体包括所述的杆状病毒表达供体质粒以及插入所述杆状病毒表达供体质粒的外源蛋白基因，所述的NEDD8基因与外源蛋白的N端或/和C端相连。所述重组杆状病毒由所述的外源蛋白融合表达载体同源重组到杆状病毒基因组中并转染昆虫细胞得到。本发明利用NEDD8基因能够使杆状病毒外源目的蛋白如GFP表达量增加4倍以上。

Description

重组杆状病毒和其应用及构建该重组杆状病毒的载体
技术领域
本发明属于基因工程领域，尤其涉及一种能够提高外源蛋白表达量的重组杆状病毒及构建所述重组杆状病毒的系列载体。
背景技术
杆状病毒(Baculovirus)是昆虫专一性的病原病毒，是目前为止发现最早、研究最多且实用意义很大的昆虫病毒。杆状病毒表达载体系统(Baculovirusexpressionvectorsystem，BEVS)是一个以杆状病毒为外源基因载体，昆虫和昆虫细胞为受体的表达系统。与其他表达系统相比，它具有能容纳较大的外源基因插入；可同时表达多个基因；表达水平高；表达产物可进行包括糖基化、磷酸化、酰基化、信号肽切除及肽段的切割和分解等在内的翻译后加工修饰；对脊椎动物无感染性等优点。自1983年Smith等首次利用AcNPV表达成功人β-干扰素以来，现估计有近千种外源基因在杆状病毒表达载体中得到表达。而且杆状病毒可以作为一种新型的基因表达载体将外源基因导入哺乳动物细胞内进行表达，因此，该重组杆状病毒已被广泛应用于基因工程、疫苗开发等众多领域中。
但是利用杆状病毒表达外源蛋白时，其表达量与病毒自身表达的多角体蛋白仍有很大的差距，表明对杆状病毒进行改造还有很多发展空间。复旦大学钟江等用染色质调控元件对杆状病毒进行改造能够增加外源蛋白的表达量(专利号：200810038580.8)。JamesE.Strickler等发现将一种类似泛素蛋白的小分子蛋白SUMO连接到外源到白的N端或C端能够显著提高外源蛋白表达率和稳定性，Lifesensor公司据此开发了杆状病毒载体(SUMOstarinsectcellexpressionandpurificationsystem)并已经商品化。NEDD8也是一种类泛素小分子蛋白，在生物过程中具有广泛的作用，比如：调节泛素蛋白酶系统活性、参与DNA损伤修复、调控蛋白转录、调节肿瘤抑制因子P53信号、调节线粒体转换等。众多癌症模型中，发现了NEDD8表达量的的异常，目前尚未有NEDD8能够调控外源蛋白的表达的报道。
发明内容
发明目的：针对现有技术中存在的问题，本发明提供了一种能够提高外源蛋白表达量的重组杆状病毒及构建所述重组杆状病毒的系列载体，本发明的另一个目的是提供所述重组杆状病毒的应用。
技术方案：
本发明所述的杆状病毒表达供体质粒，它以pFastBac1杆状病毒表达载体为基础载体，在其多克隆位点连接有NEDD8基因。
所述NEDD8基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，或与SEQIDNO.1所示序列具有80％以上的同源性。
SEQIDNO.1所示的序列为家蚕NEDD8基因，本研究发现，NEDD8基因能够使杆状病毒表达系统中外源基因的表达量提高3～5倍。NEDD8基因在所有生物中高度保守，研究发现，家蚕NEDD8基因与其他模式生物如人、小鼠、果蝇、酵母、线虫的NEDD8有85％以上的相似性，本发明NEDD8基因还可以源自人小鼠、果蝇、酵母、线虫等。
在杆状病毒表达供体质粒中，所述的NEDD8基因的数量可以为一个或两个。
具体的，所述的NEDD8基因处于所述多克隆位点的EcoRI酶切位点和Xhol酶切位点之间。
所述的杆状病毒表达供体质粒的构建方法包括：(1)合成或PCR扩增所述的NEDD8基因；(2)将所述的NEDD8基因连入pFastBac1杆状病毒表达载体中。在载体构建过程中，基因的扩增、合成以及连接均为常规的实验手段。
一种具体的实施方式，杆状病毒表达供体质粒的构建方法包括：PCR扩增后的NEDD8基因用限制性内切酶切，然后与用同样限制性内切酶酶切后的pFastBac1杆状病毒表达载体相连，所述的限制性内切酶为EcoRI和Xhol。
本发明所述的外源蛋白融合表达载体，包括所述的杆状病毒表达供体质粒以及插入所述杆状病毒表达供体质粒的外源蛋白基因，所述的NEDD8基因与外源蛋白的N端或/和C端相连。
一种具体的实施方式，所述外源蛋白融合表达载体中，所述的NEDD8基因处于EcoRI酶切位点和Xhol酶切位点之间，外源蛋白基因处于BamHI酶切位点和EcoRI酶切位点之间。构建时，将所述的杆状病毒表达供体质粒用EcoRI和Xhol进行酶切，然后将连入NEDD8基因。
本发明所述的重组杆状病毒，由所述的外源蛋白融合表达载体同源重组到杆状病毒基因组中并转染昆虫细胞得到。
所述的杆状病毒包括家蚕杆状病毒或苜蓿银纹夜蛾杆状病毒。
所述的昆虫细胞包括BmN细胞、Bm5细胞、Sf9细胞、Sf21细胞或High5。
本发明还提供了重组杆状病毒在外源蛋白表达中的应用。所述应用包括：用所述的重组杆状病毒感染昆虫细胞，可观察外源蛋白在昆虫细胞中的分布，或进一步分离纯化外源蛋白。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明将NEDD8基因连接到外源蛋白的N端或C端，得到融合表达载体，同源重组到杆状病毒基因组中转染昆虫细胞获得重组杆状病毒。重组杆状病毒感染48-96小时后，目的蛋白表达量与对照相比明显增加，如使GFP的表达量分别提高了4倍以上。
附图说明
图1为本发明外源蛋白融合表达载体的示意图；
图2为经改造的质粒pFBGFP-NEDD8的示意图；
图3为GFP-NEDD8融合蛋白和NEDD8-GFP在细胞内聚集的共聚焦示意图；
图4为eGFP-NEDD8和对照GFP荧光强度比较。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改和替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1GFP-NEDD8供体质粒构建
首先设计合成引物扩增出SEQIDNO：1所示DNA片段(NEDD8)和GFP基因DNA片段；
NEDD8上游引物：CGGAATTCATGTTGATTAAAGTCAAGA
NEDD8下游引物：CCCTCGAGTCATTCGCCTCCCCTTAAA
以家蚕cDNA为模板，PCR扩增体系为：10×Buffer5μl，引物2μM，dNTPs4μl，模板0.1μg，Taq酶(5U)，ddH2O加至50μl。扩增反应条件为94℃预变性3min；94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸30s(循环30次)；72℃保温10min。
根据NCBI中NC_011521.1所示序列设计GFP扩增引物：
GFP上游引物：CCCTCGAGATGTTACTTGTACAG
GFP下游引物：CGGAATTCCTTGTACAGCTCGTCCAT
以克隆载体pEGFP质粒DNA为模板，PCR扩增体系为：10×Buffer5μl，引物2μM，dNTPs4μl，模板0.1μg，Taq酶(5U)，ddH2O加至50μl。扩增反应条件为94℃预变性3min；94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸60s(循环30次)；72℃保温10min。
分别用限制性内切酶BamHI+EcoRI切割扩增的GFP片段、EcoRI+Xhol切割扩增的NEDD8，切割后的DNA片段连接进pFastBac1质粒，分别命名为pFBGFP-NEDD8(图1)和pFBGFP。其中，pFBGFP-NEDD8以pFastBac1为基础质粒，连有外源基因GFP和NEDD8，此时NEDD8处于GFP蛋白的C端；pFBGFP以pFastBac1为基础质粒，连有外源基因GFP，作为对照。同理的，构建质粒pFBNEDD8-GFP，pFBNEDD8-GFP质粒以pFastBac1为基础质粒，NEDD8处于GFP蛋白的N端，构建时，根据酶切位点设计引物，如扩增GFP设计的引物添加有EcoRI和Xhol酶切位点，扩增NEDD8设计的引物添加有BamHI和EcoRI酶切位点。
实施例2重组病毒DNA获取
将鉴定好的重组质粒pFBGFP-NEDD8、pFBNEDD8-GFP和pFBGFP分别转化DH10Bac感受态细胞。37℃培养8小时后，转移载体质粒在DH10Bac中辅助质粒提供的转座酶的作用下发生转座，并使DH10Bac获得庆大霉素抗性，通过涂布含IPTG(20μg/ml)、X-gal(10μg/ml)、卡那霉素(10μg/ml)、庆大霉素(7μg/ml)及四环素(10μg/ml)的LB平板上筛选白色菌落，挑入含有3种同样抗生素的液体LB培养基，37℃振荡培养过夜，碱法小量提取重组病毒DNA(即重组杆状病毒质粒，bacmid)。在bacmid的LacZ基因上下游设有M13引物互补序列，以M13上游引物和基因的下游引物进行PCR扩增，通过PCR片段的大小来确定转座是否成功。
PCR扩增体系为：10×Buffer5μl，M13引物2μM，dNTPs4μl，模板0.1μg，Taq酶(5U)，ddH2O加至50μl。扩增反应条件为94℃预变性3min；94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸5min(循环35次)；72℃保温10min。
实施例3重组病毒粒子获取
取鉴定好的重组病毒DNA，用Lipofectin(脂质体)分别转染细胞。详细步骤如下：(1)先在35mm细胞培养皿中接种1-2×105BmN细胞，加入2ml有血清培养基，轻轻摇动培养皿，使细胞均匀分散，27℃培养18-24h。(2)取两支1.5mleppendorf管配制下列溶液：溶液A：约1-2μg重组杆状病毒DNA溶于100μl无血清培养基中；溶液B：5μlLipofectin稀释于80μl无血清培养基中；合并溶液A和溶液B，轻轻混匀，室温静置15min，得Lipofectin-DNA混合物。(3)弃细胞培养液，并用无血清培养基洗3次，加0.8ml无血清培养基至Lipofectin-DNA混合物中，轻轻混匀后，小心滴加到细胞表面，轻轻混匀。(4)27℃培养8h后，弃转染液，加有血清培养基2ml继续培养。(5)转染4-5天后收集有荧光的细胞上清，再次感染BmN细胞进行病毒扩增。重组病毒分别命名为BmGFP-NEDD8(采用pFBGFP-NEDD8质粒重组转染得到)，BmNEDD8-GFP(采用pFBNEDD8-GFP质粒重组转染得到)和BmGFP(采用pFBGFP质粒重组转染得到)，测定病毒效价。
实施例4蛋白表达与鉴定
BmGFP-NEDD8，BmNEDD8-GFP和BmGFP重组病毒以相同的感染复数(MOI＝10)感染BmN细胞，27℃培养72h后，共聚焦显微镜观察表达蛋白在细胞内的分布(图2)，并测定BmGFP-NEDD8和BmGFP病毒感染细胞的荧光强度，结果如图3所示，BmGFP-NEDD8和BmNEDD8-GFP病毒感染细胞的荧光强度与对照(BmGFP)相比提高了4.6和4.1倍，说明NEDD8的存在使GFP的表达量分别提高了4.6和4.1倍。

Claims (9)

1.一种杆状病毒表达供体质粒，其特征在于，它以pFastBac1杆状病毒表达载体为基础载体，在其多克隆位点连接有NEDD8基因。
2.根据权利要求1所述的杆状病毒表达供体质粒，其特征在于，所述NEDD8基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，或与SEQIDNO.1所示序列具有80％以上的同源性。
3.根据权利要求1所述的杆状病毒表达供体质粒，其特征在于，所述的NEDD8基因为一个或两个。
4.根据权利要求1所述的杆状病毒表达供体质粒，其特征在于，所述的NEDD8基因处于所述多克隆位点的EcoRI酶切位点和Xhol酶切位点之间。
5.一种外源蛋白融合表达载体，其特征在于，包括如权利要求1～4任一项所述的杆状病毒表达供体质粒以及插入所述杆状病毒表达供体质粒的外源蛋白基因，所述的NEDD8基因与外源蛋白的N端或/和C端相连。
6.一种重组杆状病毒，其特征在于，由如权利要求5所述的外源蛋白融合表达载体同源重组到杆状病毒基因组中并转染昆虫细胞得到。
7.如权利要求6所述的重组杆状病毒，其特征在于，杆状病毒包括家蚕杆状病毒和苜蓿银纹夜蛾杆状病毒中的一种。
8.如权利要求6所述的重组杆状病毒，其特征在于，所述的昆虫细胞包括BmN细胞、Bm5细胞、Sf9细胞，Sf21细胞和High5细胞中的一种。
9.如权利要求6～8任一项所述的重组杆状病毒在外源蛋白表达中的应用。
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