CN106520707A - 一种重组杆状病毒 - Google Patents

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    • C12N2710/14122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Abstract

本发明提供了一种重组杆状病毒，该重组病毒为核苷酸序列为SEQ ID No1.的基因通过转座重组整合到杆状病毒AcMNPV基因组上获得。本发明进一步提供了其构建方法，包括分别从AcMNPV和pEGFP‑N1载体中获得iap2和egfp基因，通过Bac‑to‑Bac系统构建重组杆状病毒AcMNPV‑iap2‑egfp。本发明重组杆状病毒可用于制备防治鳞翅目害虫的组合物。因此该重组杆状病毒在新型生物杀虫剂的开发利用方面有良好的应用前景。

Description

一种重组杆状病毒
技术领域
本发明涉及重组杆状病毒，具体是一种含有苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒AcMNPV的凋亡抑制因子2(inhibitor of apoptosis protein 2,简称iap2)基因和来源于水母的增强型绿色荧光蛋白(简称egfp)基因的重组杆状病毒。该病毒的构建方法，以及含有该病毒的杀虫剂在农业害虫防治中的应用。
技术背景
昆虫杆状病毒作为无公害生物杀虫剂近年来备受关注，并得以广泛应用。杆状病毒是一类昆虫特异性病毒，应用杆状病毒防治害虫有许多明显优点。杆状病毒对脊椎动物和所有植物均无病原性，而且不能进入哺乳动物细胞核内，杆状病毒是自然界本来存在的，特别是杆状病毒对牡蛎、蚌、蟹没有致病性，对两栖类、鱼类、鸟类及哺乳动物也无任何毒性、致病性或异常变态反应。对有益生物及非靶标有机体没有不良影响。应用杆状病毒在环境中不遗留有害残毒，不会污染环境，对人畜安全。使用昆虫病毒后，不仅病虫本身就是病毒生产的“小工厂”，而且有些情况下，病毒还可卵传染，杀灭次代害虫，并在田间存活，杀灭次年生的害虫，这是化学农药所无法相比的。
苜蓿银纹夜蛾核型多角体杆状病毒在害虫防治中特别引人注目。它至少能侵染玉米夜蛾、甜菜夜蛾、小菜蛾、棉铃虫、红铃虫、印度谷螟等39种农业和林业害虫，因而这种杆状病毒在农业和林业生产的应用上有重要意义。
但是如何能进一步提高杆状病毒毒力、缩短杀虫时间是应用杆状病毒防治害虫所面临的重要问题，提高病毒入侵宿主细胞的凋亡速率是解决该问题的有效途径之一。
在长期进化过程中，杆状病毒为了阻止宿主细胞凋亡并使其自身能够继续复制和增殖，在侵染过程中获得了昆虫宿主的相关基因，包括凋亡抑制因子基因iap。AcMNPV包含两个iap基因：iap1和iap2，它们编码的蛋白都包含两个保守的BIR结构域(BIR1和BIR2)和一个RING结构域。为了确定AcMNPV的iap基因的功能，我们的实验结果证实了Ac-IAP2可以加速细胞增殖。因此，理论上过表达iap2基因的杆状病毒可提高病毒在宿主细胞的增殖率，并且iap2是病毒自身基因，从生物安全性方面考虑是安全的，因此可单独或联合其它抗虫或标记(如增强型绿色荧光蛋白egfp)基因构建高效的重组杆状病毒杀虫剂。基于以上思路，我们构建并验证了重组杆状病毒AcMNPV-iap2-egfp的抗虫活性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高抗虫活性的重组杆状病毒，该杆状病毒可通过抑制虫体生长和化蛹率达到防治鳞翅目害虫的效果。
本发明的目的还在于提供一种该重组杆状病毒的构建方法；提供一种构建用于重组杆状病毒的中间载体的方法；提供该重组杆状病毒的用途。
本发明的目的可通过下述方案实现：
本发明提供的一种重组杆状病毒，该重组病毒为核苷酸序列为SEQ ID No1.的基因通过转座重组整合到杆状病毒AcMNPV基因组上获得；所述SEQ ID No.1的基因为一种AcMNPV凋亡抑制因子2(inhibitor of apoptosis protein 2，简称iap2)和水母增强型绿色荧光蛋白(enchanced green fluorescent protein，简称egfp)基因串连基因。
该重组杆状病毒可以在被感染的宿主细胞内表达IAP2-EGFP融合蛋白。
本发明提供的所述重组杆状病毒的构建方法，所述方法产生一种会在其P10启动子下过量表达融合蛋白IAP2-EGFP，包括如下步骤：
(1)从pEGFP-N1-BmK IT载体中通过PCR技术扩增出egfp基因，并将该基因连接到pFastBac Dual载体中的Pp10启动子下，获得重组质粒pFastBac Dual-egfp；
(2)以AcMNPV基因组为模板，通过PCR技术克隆获得iap2的基因全长片段，然后经双酶切和连接反应插入上述重组质粒pFastBac Dual-egfp中，得到重组质粒pFastBacDual-iap2-egfp；
(3)将pFastBac Dual-iap2-egfp转化DH10Bac感受态菌株，目的基因iap2-egfp会通过转座重组插入DH10Bac感受态菌株内的Bacmid杆粒中，得到重组杆粒Bacmid-iap2-egfp；
(4)将重组杆粒Bacmid-iap2-egfp和脂质体转染试剂Liposome TransFast TMTransfection Reagent(美国Promega公司生产)混匀后，转染Sf9细胞。筛选出重组杆状病毒AcMNPV-iap2-egfp。
本发明提供的一种杀虫组合物，包含所述的重组杆状病毒并进一步包含农药可用的载体。
本发明提供重组杆状病毒的用途，用于制备防治鳞翅目害虫的组合物。所述的鳞翅目害虫指棉铃虫、玉米夜蛾、甜菜夜蛾、菜青虫、小菜蛾、烟青虫、茶毛虫、红铃虫和印度谷螟中的一种或几种。
经过抗棉铃虫实验表明，重组杆状病毒AcMNPV-iap2-egfp的杀虫效率明显提高，重组杆状病毒处理组致死率高达61.11％，高于AcMNPV-egfp处理组的致死率(52.78％)；且重组杆状病毒处理组化蛹率为38.99％，较AcMNPV-egfp处理组的化蛹率(47.22％)，低了将近10个百分点。该重组杆状病毒可在防治农作物和林业害虫中应用。
附图说明
图1重组质粒pFastBacDual-egfp的构建流程图
图2重组病毒AcMNPV-iap2-egfp构建流程图
图3 pFastBac Dual-iap2-egfp测序鉴定结果
图4荧光显微镜镜检一、二、三代重组病毒AcMNPV-iap2-egfp在Sf9细胞内发出的绿色荧光
图5重组病毒AcMNPV-iap2-egfp抗棉铃虫活性分析(对棉铃虫幼虫体长的影响)
图6重组病毒AcMNPV-iap2-egfp抗棉铃虫活性分析(对棉铃虫幼虫死亡率的影响)
图7重组病毒AcMNPV-iap2-egfp抗棉铃虫活性分析(对棉铃虫幼虫蛹化率的影响)
具体实施方式
实施例1重组病毒AcMNPV-iap2-egfp的构建
(1)egfp基因的克隆及鉴定和中间质粒pFastBac Dual-egfp的构建(流程见图1)
设计引物：egfp-F primer：3’-AACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG CTG-5’(SEQ IDNo.2)；egfp-R primer：3’-AAGCATGCTTACTTGTACAGCTCGTCCATG-5’(SEQ ID No.3)(划线部分分别为Nco I和Sph I的酶切位点)。利用PCR方法从pEGFP-N1-BmK IT质粒中扩增出egfp基因，并使其两端分别带有Nco I和Sph I酶切位点，将PCR产物经酶切后回收；同时对中间载体pFastBac Dual进行Nco I和Sph I双酶切，酶切产物回收；将酶切后的上述PCR产物和载体，按物质的量1:1混合，用T4连接酶16℃过夜连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α，涂布于含有氨苄青霉素的LB固体培养基平板，37℃过夜培养，挑取单菌落在LB液体培养基中大量培养，纯化质粒做PCR鉴定和酶切鉴定，并将鉴定成功的质粒进一步pFastBac Dual-egfp作测序确定。
(2)iap2基因的克隆及鉴定和中间质粒pFastBac Dual-iap2-egfp的构建(流程见图2)
设计引物：iap2-F primer：5’-ATCCCGGGTATGAATTTGATGCAATTT-3’(SEQ IDNo.4)；iap2-R primer：5’-GGCTCGAGACTGAGGTAATGTTTCGAT-3’(SEQ ID No.5)(其中划线部分分别为Sam I和Xho I的酶切位点)。以AcMNPV基因组为模板通过PCR扩增出iap2基因片段，并使其两端分别带有Sam I和Xho I酶切位点，将PCR产物经酶切后回收；同时对已构建好的中间载体pFastBac Dual-egfp进行Xho I和Sam I双酶切，酶切产物回收；将酶切后的PCR产物和载体，按物质的量1:1混合，用T4连接酶16℃过夜连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α，涂布于含有氨苄青霉素的LB固体培养基平板，37℃过夜培养，挑取单菌落在LB液体培养基中大量培养，纯化质粒做PCR鉴定和酶切鉴定，并将鉴定成功的质粒pFastBac Dual-iap2-egfp进行测序确定(见图3)。
(3)重组AcMNPV基因组杆粒Bacmid-iap2-egfp的构建(流程见图2)
将pFastBac Dual-iap2-egfp转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，提取质粒并转化大肠杆菌DH10β使其发生Tn7转座重组，将目的基因iap2-egfp重组于AcMNPV基因组病毒杆粒Bacmid上，然后涂布于含有卡娜、庆大和预先涂有20μl、0.5mol/l的IPTG和50mg/ml的X-Gal的SOC固体培养基平板进行蓝白斑筛选。37℃过夜培养，挑取单个白色较大的菌落于SOC液体培养基中大量培养，提取并纯化杆粒Bacmid-iap2-egfp做PCR鉴定。
(4)重组病毒AcMNPV-iap2-egfp的获得和增殖
接种Sf9细胞于24孔细胞培养板中，待细胞有90％以上的汇合时，移去培养基并用PBS洗去残余的培养基。将筛选所得的重组杆粒Bacmid-iap2-egfp(μg)与转染试剂TransFastTM Transfection Reagent(μl)按1μg/3μl的量加入100μl无血清培养基中，剧烈震荡15s后，静置15min，加入Sf9细胞中，27℃孵育4h，然后补加无血清培养基400μl，转染4天以后荧光显微镜下观察，可以看到少数细胞内有绿色荧光，收集上清和细胞并经反复冻融使细胞破碎，离心收集上清,获得一代病毒。然后由一代病毒去侵染新鲜的Sf9细胞，三天后收集细胞和上清液，并反复冻融使细胞破碎，离心收集上清液这是二代病毒。依次类推，我们获得了三代病毒，以及更多的病毒，然后存储于4℃。一般三代病毒量即可用于实验。图4为荧光显微镜镜检一、二、三代重组病毒AcMNPV-iap2-egfp在Sf9细胞内发出的绿色荧光。
实施例2重组病毒AcMNPV-iap2-egfp的抗虫活性鉴定
(1)重组病毒AcMNPV-iap2-egfp的效价测定
采用蚀斑实验检测重组病毒AcMNPV-iap2-egfp的效价。接种Sf9细胞于6孔细胞培养板中，待细胞长满后，移去培养基并用PBS洗去残余的培养基。将病毒用无血清培养基进行10倍系列稀释(10-3-10-7)，每孔加入1ml稀释病毒液，27℃孵育2h，弃掉剩余的病毒液，将冷却至40℃，浓度为1.8％的低熔点营养琼脂倒于被感染的Sf9细胞上，室温放置(15min)待其凝固后，再返回27℃培养箱倒置培养5天，然后加入第二层含1％中性红染料的1.8％的低熔点营养琼脂，让其在培养箱中过夜。将细胞培养板中的染色培养基移去，再将培养板返回孵育箱1-2h，然后在白色衬底上统计红色背景中不着色或者浅色的斑点。最后计算具有细胞感染性的出芽病毒滴度。
病毒滴度＝最高稀释倍数的蚀斑数×最高稀释倍数×接种病毒量(ml/孔)
(2)重组病毒AcMNPV-iap2-egfp抗虫活性检测
采用人工饲喂病毒法，检测了重组病毒AcMNPV-iap2-egfp对中国棉铃虫的致死作用。人工饲料配方为：黄豆粉50g、玉米粉75g、酵母粉20g、苯甲酸钠2g、琼脂10g、维生素C7.5g、复合维生素B 0.375g、罗红霉素半片、36％冰乙酸15ml、10％的甲醛2.5ml和水500ml。受试虫为中国棉铃虫(Helicoverpa armigera)，购自于河南省济源白云实业有限公司。幼虫孵化后移入装有27mm3小块培养基的6、12或24孔板，每孔一头，成长为三龄幼虫即可用于实验。实验设置了一个空白对照组(Contral)和两个病毒处理组(AcMNPV-egfp和AcMNPV-iap2-egfp)，每组各36头虫。待虫体成长为三龄幼虫时，每天将20μl，1×107pfu/ml的两种病毒滴加到实验组培养基上，连续处理五天。空白对照组滴加PBS缓冲液，然后逐天记录虫体的成长情况，死亡率及蛹化率。
分析结果表明，相较空白处理组，病毒处理组虫体在病毒处理2天后，生长速度明显减慢，发育延迟。而重组病毒AcMNPV-iap2-egfp处理组相对于AcMNPV–egfp处理组，病毒处理第七天后，虫体发育也相对延迟了(图5)。在图6、图7中，我们发现空白对照组，虫体生长良好，94％以上的虫体成功化蛹，只有个别虫体化蛹失败死亡，而病毒处理组的死亡率均达到了50％以上，重组病毒AcMNPV-iap2-egfp处理组相对于AcMNPV–egfp处理组，致死时间虽然延迟到九天后，但整体致死率高达61.11％，高于AcMNPV-egfp处理组的致死率(52.78％)；此外，AcMNPV-iap2-egfp处理组的化蛹时间也推迟到病毒处理后的第14天，化蛹率为38.99％，较AcMNPV-egfp处理组的化蛹率(47.22％)，低了将近10个百分点。以上结果共同表明，重组病毒AcMNPV-iap2-egfp的杀虫效率高于AcMNPV-egfp，可成为农作物和林业害虫防治的有效武器。
SEQUENCE LISTING
<110> 山西大学
<120> 一种重组杆状病毒
<130> .
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<170> PatentIn version 3.5
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<213> Artificial Sequence
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<223> 山西大学生物技术研究所
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gcaaacatgt cgctagacaa tgagtacaaa cttgaattgg ccaaaacggg gctgttttct 120
cacaataacc tgattaaatg tataggctgt cgcacgattt tggacaagat taacgccaag 180
caaattaaac gacacacgta ttcgaattat tgcatatcgt caaccaacgc gttgatgttc 240
aatgaatcga tgagaaaaaa atcatttacg agttttaaaa gctctcggcg tcagtttgca 300
tcacaatccg tggtcgttga catgttggct cgtcgcggct tctattattt tggcaaagcc 360
ggccatttgc gttgttccgg atgccatata gtttttaaat ataaaagcgt agacgacgcc 420
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gaacaatttg gcaaactcga tgttgcggaa aaagaaatac tggctgccga tttgattcct 540
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gctgtgtgca cggaatgttc gcgtcggtgc aagcgttgtt gtgtgtgcaa cgcaaaaatt 720
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Claims (5)

1.一种重组杆状病毒，该重组病毒为核苷酸序列为SEQ ID No1.的基因通过转座重组整合到杆状病毒AcMNPV基因组上获得；所述SEQ ID No.1的基因为一种AcMNPV凋亡抑制因子2(简称iap2)和水母增强型绿色荧光蛋白(简称egfp)基因串连基因。
2.如权利要求1所述的重组杆状病毒的构建方法，其特征在于，所述方法产生一种会在其P10启动子下过量表达融合蛋白IAP2-EGFP，包括如下步骤：
a)构建含有AcMNPV凋亡抑制因子iap2和增强型绿色荧光蛋白egfp基因的重组质粒pFastBac Dual-iap2-egfp；
b)将上述重组质粒转化到含有AcMNPV基因组杆粒Bacmid的DH10Bac感受态菌中，获得重组杆粒Bacmid-iap2-egfp；
c)将上述重组杆粒转染到草地贪蛾卵母细胞株Sf9中；
d)筛选出重组杆状病毒AcMNPV-iap2-egfp。
3.一种杀虫组合物，其特征在于，所述组合物包含权利要求1所述的重组杆状病毒并进一步包含农药可用的载体。
4.权利要求1所述的重组杆状病毒的用途，用于制备防治鳞翅目害虫的组合物。
5.权利要求4所述的重组杆状病毒的用途，所述的鳞翅目害虫指棉铃虫、玉米夜蛾、甜菜夜蛾、菜青虫、小菜蛾、烟青虫、茶毛虫、红铃虫和印度谷螟中的一种或几种。
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