CN108823176A - 一种重组杆状病毒及其构建方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种重组杆状病毒及其构建方法和应用，所述重组病毒为核苷酸序列为SEQ ID No1.的基因通过转座重组整合到杆状病毒的基因组上获得的。本发明还提供了重组杆状病毒构建方法，包括从AcMNPV获得Ac‑pk2基因，将该基因构建到pFastBacDual‑egfp，通过Bac‑to‑Bac系统获得重组杆状病毒AcMNPV‑PK2‑EGFP。本发明重组杆状病毒可以通过营救翻译起始来帮助外源蛋白的表达，提高昆虫杆状病毒表达系统的蛋白产量，在杆状病毒昆虫表达系统作为真核表达系统的应用方面具有较好的应用前景。本发明的重组杆状病毒还可用于制备防治鳞翅目害虫的生物杀虫剂。

Description

一种重组杆状病毒及其构建方法和应用

技术领域

本发明涉及重组病毒，具体属于一种重组杆状病毒及其构建方法，以及该重组病毒在昆虫细胞杆状病毒真核表达系统中和在制备鳞翅目害虫杀虫剂中的应用。

技术背景

体外获得大量目的蛋白有两种基因表达系统，包括原核细胞系统和真核细胞系统。大肠杆菌细胞系统是一种重要的原核细胞系统，操作简便，周期短，收益大，表达产物稳定，但是表达基因的分子量有限，不宜过大，且不能对表达产物进行一些翻译后加工作用。真核细胞系统包括酵母细胞和昆虫细胞等表达系统。昆虫细胞培养及操作较简便，成本低，因此被广泛用于生产基因工程产品，因此昆虫细胞-杆状病毒表达系统凭借其独特的生物学特性，日益受到人们的重视。

用杆状病毒做载体已经使得几百个包括动植物、病毒、细菌、真菌的基因在昆虫细胞或幼虫体内得到高效表达。其主要特点是可以获得大量抗原性、免疫原性较好的，与天然蛋白功能相似的可溶性重组蛋白。这一特点优于细菌、酵母和哺乳动物细胞表达体系。重组杆状病毒感染昆虫细胞后，可以对外源蛋白进行许多真核细胞的转录后加工作用，包括糖基化、磷酸化、酰基化、正确的信号肽切割、蛋白水解以及适当的折叠作用，因此是一种理想载体用来表达有生物活性的蛋白质。

杆状病毒是自然界本来存在的，其对脊椎动物和所有植物均无病原性，并且不能进入哺乳动物的细胞核。其对牡蛎，蚌，蟹无致病性，对鱼类，鸟类，哺乳类也无任何毒性、致病性或异常变态反应。最为一种真核表达系统，其安全性非常可靠。AcMNPV是目前为止研究最多的杆状病毒表达系统，主要在草地贪夜蛾Sf9细胞中繁殖。但是，如何进提高杆状病毒昆虫细胞表达系统外源蛋白表达水平、转录后加工等问题还需进行深入研究。

昆虫杆状病毒作为无公害生物杀虫剂近年来备受关注，并得以广泛应用。杆状病毒是一类昆虫特异性病毒，应用杆状病毒防治害虫有许多明显优点。杆状病毒对脊椎动物和所有植物均无病原性，而且不能进入哺乳动物细胞核内，杆状病毒是自然界本来存在的，特别是杆状病毒对牡蛎、蚌、蟹没有致病性，对两栖类、鱼类、鸟类及哺乳动物也无任何毒性、致病性或异常变态反应。对有益生物及非靶标有机体没有不良影响。应用杆状病毒在环境中不遗留有害残毒，不会污染环境，对人畜安全。使用昆虫病毒后，不仅病虫本身就是病毒生产的“小工厂”，而且有些情况下，病毒还可卵传染，杀灭次代害虫，并在田间存活，杀灭次年生的害虫，这是化学农药所无法相比的。

苜蓿银纹夜蛾核型多角体杆状病毒在害虫防治中特别引人注目。它至少能侵染玉米夜蛾、甜菜夜蛾、小菜蛾、棉铃虫、红铃虫、印度谷螟等39种农业和林业害虫，因而这种杆状病毒在农业和林业生产的应用上有重要意义。

在长期的进化过程中，杆状病毒为了阻止宿主细胞通过磷酸化翻译起始因子eIF2α降低蛋白翻译水平的抗病毒反应，通过基因水平转移从宿主细胞获得一些相关基因，包括Ac-PK2基因(eIF2α激酶)。为了进一步明确该蛋白的功能，我们进行了一系列的实验研究，发现过表达Ac-PK2蛋白可以抑制宿主细胞中翻译起始因子eIF2α磷酸化，提高宿主细胞中总蛋白和外源蛋白的表达，并且Ac-pk2基因是病毒本身的基因，从安全性方面考虑是安全的，因此可以联合想要表达的目的蛋白基因，构建高表达目的蛋白的重组病毒，从而在昆虫细胞-杆状病毒表达系统中提高目的蛋白的产量。也可以可单独或联合其它抗虫或标记(如增强型绿色荧光蛋白egfp)基因构建高效的重组杆状病毒杀虫剂。基于以上思路，我们构建并验证了重组杆状病毒AcMNPV-PK2-EGFP的功能。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可以提高昆虫细胞-杆状病毒表达系统蛋白产量的重组杆状病毒，该病毒可以通过在病毒侵染后抑制宿主细胞中翻译起始因子eIF2α的磷酸化，从而营救翻译起始，有利于表达系统中外源目的蛋白的表达。

本发明的目的还在于提供一种该重组杆状病毒的构建方法，包括获得重组杆状病毒的中间载体的构建方法；并提供该重组杆状病毒的用途。

为实现本发明的上述目的，可以通过如下技术方案实现：

本发明提供的一种重组杆状病毒，该重组病毒为核苷酸序列为SEQ ID No.1所示序列的基因通过转座重组Bac-to-Bac系统整合到AcMNPV基因组获得。该核苷酸序列为苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒AcMNPV的Ac-pk2基因和水母增强型绿色荧光蛋白egfp基因的串联基因。

该重组杆状病毒可以在被感染的宿主细胞中表达融合蛋白Ac-PK2-EGFP。

本发明提供的一种重组杆状病毒的构建方法，包括如下步骤：

(1)以AcMNPV基因组为模板，通过PCR技术扩增获得Ac-pk2基因的全长，然后通过双酶切和连接反应将该基因构建到重组质粒pFastBacDual-egfp上，获得重组质粒pFastBacDual-pk2-egfp，该重组质粒含有SEQ ID No.1的基因；

(2)将重组质粒pFastBacDual-pk2-egfp转化DH10B感受态细胞，目的基因Ac-pk2-egfp通过Tn7转座重组转座到DH10B感受态细胞中的Bacmid上，之后将转化的DH10B细胞涂LB平板；

(3)通过PCR筛菌的方法筛选包含重组成功Bacmid-pk2-egfp的DH10B单菌落，摇菌，手提杆粒，获得重组杆粒Bacmid-pk2-egfp；

(4)将重组杆粒Bacmid-pk2-egfp和promaga的Fugene6转染试剂混匀，然后转染Sf9细胞，获得重组杆状病毒AcMNPV-PK2-EGFP。

本发明的重组杆状病毒可用于提高杆状病毒昆虫表达系统中外源蛋白的产量。经过Western Blot实验表明，重组杆状病毒AcMNPV-PK2-EGFP可以抑制宿主细胞eIF2α的磷酸化；且重组杆状病毒AcMNPV-PK2-EGFP和AcMNPV-Renilla-RFP共处理组外源蛋白的表达显著高于AcMNPV-EGFP和AcMNPV-Renilla-RFP共处理组。

本发明的重组杆状病毒可在制备鳞翅目害虫杀虫剂中应用。所述鳞翅目害虫如棉铃虫、玉米夜蛾、甜菜夜蛾、菜青虫、小菜蛾、烟青虫、茶毛虫、红铃虫和印度谷螟等。经过抗甜菜夜蛾实验表明，重组病毒AcMNPV-PK2-EGFP处理组相对于AcMNPV-EGFP处理组，致死时间提前到6天后，整体致死率高达83.33％，高于AcMNPV-EGFP处理组的致死率(56.67％)；此外，AcMNPV-PK2-EGFP处理组的化蛹率为26.67％，较AcMNPV-EGFP处理组的化蛹率(35.33％)，低了将近10个百分点。以上结果共同表明，重组病毒AcMNPV-PK2-EGFP的杀虫效率高于AcMNPV-EGFP，可成为农作物和林业害虫防治的有效武器。

与现有技术相比，本发明的有益效果：

1、本发明的重组杆状病毒可以通过在病毒侵染后抑制宿主细胞中翻译起始因子eIF2α的磷酸化，从而营救翻译起始，有利于表达系统中外源目的蛋白的表达。

2、本发明的重组杆状病毒相较于野生型杆状病毒具有更高的杀虫活性。

附图说明

图1重组质粒pFastBacDual-pk2-egfp的构建流程图

图2pFastBacDual-pk2-egfp测序鉴定结果

图3荧光显微镜镜检一、二、三代重组病毒AcMNPV-PK2-EGFP在Sf9细胞内发出的绿色荧光

图4Western blot检测重组病毒AcMNPV-PK2-EGFP对宿主细胞中eIF2α磷酸化的影响

图5重组病毒AcMNPV-Renilla-RFP分别与等量的野生型病毒AcMNPV-EGFP和重组病毒AcMNPV-PK2-EGFP共处理Sf9细胞，通过Renilla活性检测分析重组病毒对外源目的蛋白Renilla的表达的影响。

图6重组病毒AcMNPV-Renilla-RFP分别与等量的野生型病毒AcMNPV-EGFP和重组病毒AcMNPV-PK2-EGFP共处理Sf9细胞，通过Western Blot检测重组病毒对外源目的蛋白Renilla的表达的影响。

图7重组病毒AcMNPV-PK2-EGFP抗甜菜夜蛾活性分析(对甜菜夜蛾幼虫死亡率的影响)

图8重组病毒AcMNPV-PK2-EGFP抗甜菜夜蛾活性分析(对甜菜夜蛾幼虫化蛹率的影响)

具体实施方式

实施例1重组病毒AcMNPV-PK2-EGFP的构建

(1)Ac-pk2基因的克隆及鉴定和中间质粒pFastBacDual-pk2-egfp的构建(见图1)

设计引物：pk2-F：5’-ATACCCGGGATGAAACCCGAACAATT-3’(SEQ ID No.2)；pk2-R：5’-ATCCTCGAGCTAGTTTTTTAGAACACGTTG-3’(SEQ ID No.3)(其中划线部分分别为Sam I和Xho I的酶切位点)。以AcMNPV基因组为模板通过PCR扩增出Ac-pk2基因片段，并使其两端分别带有Sam I和Xho I酶切位点，将PCR产物经酶切后回收；同时对已构建好的中间载体pFastBacDual-egfp进行Xho I和Sam I双酶切，酶切产物回收；将酶切后的PCR产物和载体，按物质的量1:1混合，用T4连接酶16℃过夜连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α，涂布于含有氨苄青霉素的LB固体培养基平板，37℃过夜培养，挑取单菌落在LB液体培养基中大量培养，纯化质粒做PCR鉴定和酶切鉴定，并将鉴定成功的质粒pFastBacDual-pK2-egfp进行测序确定(见图2)。该质粒中包含序列SEQ ID No.1所示的基因。

(2)重组AcMNPV基因组杆粒Bacmid-pk2-egfp的构建

将pFastBacDual-pk2-egfp转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，提取质粒并转化大肠杆菌DH10B使其发生Tn7转座重组，将目的基因pk2-egfp重组于AcMNPV基因组病毒杆粒Bacmid上，然后涂布于含有卡娜、庆大和预先涂有20μl、0.5mol/l的IPTG和50mg/ml的X-Gal的SOC固体培养基平板进行蓝白斑筛选。37℃过夜培养，挑取单个白色较大的菌落于SOC液体培养基中大量培养，提取并纯化杆粒Bacmid-pk2-egfp做PCR鉴定。

(3)重组病毒AcMNPV-PK2-EGFP的获得和增殖(见图3)

接种Sf9细胞于24孔细胞培养板中，待细胞有90％以上的汇合时，移去培养基并用PBS洗去残余的培养基。将筛选所得的重组杆粒Bacmid-pk2-egfp(μg)与转染试剂FugeneTransfection Reagent(μl)按1μg/3μl的量加入100μl无血清培养基中，剧烈震荡15s后，静置15min，加入Sf9细胞中，27℃孵育4h，然后补加无血清培养基400μl，转染4天以后荧光显微镜下观察，可以看到少数细胞内有绿色荧光，收集上清和细胞并经反复冻融使细胞破碎，离心收集上清,获得一代病毒。然后由一代病毒去侵染新鲜的Sf9细胞，三天后收集细胞和上清液，并反复冻融使细胞破碎，离心收集上清液这是二代病毒。依次类推，我们获得了三代病毒，以及更多的病毒，然后存储于4℃。一般三代病毒量即可用于实验。图3为荧光显微镜镜检一、二、三代重组病毒AcMNPV-PK2-EGFP在Sf9细胞内发出的绿色荧光。

实施例2重组病毒AcMNPV-PK2-EGFP侵染宿主细胞后可以抑制eIF2a的磷酸化，提高杆状病毒昆虫细胞表达系统中外源蛋白的产量。

(1)重组病毒AcMNPV-PK2-EGFP的效价测定

采用蚀斑实验检测重组病毒AcMNPV-PK2-EGFP的效价。接种Sf9细胞于6孔细胞培养板中，待细胞长满后，移去培养基并用PBS洗去残余的培养基。将病毒用无血清培养基进行10倍系列稀释(10^-3-10^-7)，每孔加入1ml稀释病毒液，27℃孵育2h，弃掉剩余的病毒液，将冷却至40℃，浓度为1.8％的低熔点营养琼脂倒于被感染的Sf9细胞上，室温放置(15min)待其凝固后，再返回27℃培养箱倒置培养5天，然后加入第二层含1％中性红染料的1.8％的低熔点营养琼脂，让其在培养箱中过夜。将细胞培养板中的染色培养基移去，再将培养板返回孵育箱1-2h，然后在白色衬底上统计红色背景中不着色或者浅色的斑点。最后计算具有细胞感染性的出芽病毒滴度。

病毒滴度＝最高稀释倍数的蚀斑数×最高稀释倍数×接种病毒量(ml/孔)

(2)重组病毒AcMNPV-PK2-EGFP侵染宿主细胞后，检测eIF2a磷酸化

接种Sf9细胞于6孔细胞培养板中，根据噬斑实验的结果计算后，将AcMNPV-PK2-EGFP用5MOI的感染复数加入到培养孔，感染后12，24，36，48，60，72小时各收集一孔细胞，离心弃上清加细胞裂解液裂解细胞，之后通过Bradford比色法测定蛋白质浓度。取相同质量的细胞裂解液(体积*蛋白质浓度)，并加等体积的2×电泳加样缓冲液，99度金属浴中3分钟，然后通过聚丙烯酰胺凝胶电泳对蛋白样进行分离。根据预染Marker的位置，对目的条带进行切割。然后用电转膜仪转膜(90V，90分钟)。将目的蛋白eIF2a-51S的PVDF膜4度过夜孵育eIF2a-51S抗体(兔源)，PBST震荡洗涤三次，每次10分钟。洗过的PVDF膜室温孵育兔荧光二抗1小时，PBST震荡洗涤三次，每次10分钟，之后用奥德赛红外成像仪观察目的条带。

分析结果表明，相较野生处理组，重组病毒处理组虫体在病毒侵染36小时后，Sf9细胞中eIF2a蛋白51位丝氨酸的磷酸化开始减少，随着PK2蛋白的表达增加，eIF2a蛋白的磷酸化逐渐减少(图4)。以上结果表明，相较于野生AcMNPV-EGFP处理组，重组病毒AcMNPV-PK2-EGFP的可以通过过表达Ac-PK2蛋白抑制eIF2a的磷酸化，营救宿主细胞的翻译起始。

(3)接种Sf9细胞于6孔细胞培养板中，根据噬斑实验的结果计算后，将AcMNPV-Renilla-RFP用2.5MOI的感染复数加入到培养孔，对照组每孔再加2.5MOI的AcMNPV-EGFP，实验组每孔再加2.5MOI的AcMNPV-PK2-EGFP，感染后12，24，36，48，60，72小时各收集一孔细胞，离心弃上清，之后通过液闪仪和promaga公司的海参荧光素酶试剂盒检测海参荧光素酶的活性。如图5所示,相较野生处理组，重组病毒处理组在病毒侵染48，60小时后，AcMNPV-PK2-EGFP共处理组Renilla蛋白的活性显著或极显著的高于野生病毒AcMNPV-EGFP共处理组。

重复上述实验，将收集的细胞用Renilla蛋白的抗体进行Western blot实验，检测其蛋白水平的变化情况，结果显示病毒侵染60，72小时，AcMNPV-PK2-EGFP共处理组Renilla蛋白的表达量显著或极显著的高于AcMNPV-EGFP共处理组(如图6所示)。

图5个图6的结果，说明eIF2a蛋白磷酸化的减少可以帮助营救翻译起始，提高外源蛋白Renilla的表达。

实施例3重组病毒AcMNPV-PK2-EGFP的抗虫活性鉴定

(1)重组病毒AcMNPV-PK2-EGFP的效价测定

采用蚀斑实验检测重组病毒AcMNPV-PK2-EGFP的效价。接种Sf9细胞于6孔细胞培养板中，待细胞长满后，移去培养基并用PBS洗去残余的培养基。将病毒用无血清培养基进行10倍系列稀释(10^-3-10^-7)，每孔加入1ml稀释病毒液，27℃孵育2h，弃掉剩余的病毒液，将冷却至40℃，浓度为1.8％的低熔点营养琼脂倒于被感染的Sf9细胞上，室温放置(15min)待其凝固后，再返回27℃培养箱倒置培养5天，然后加入第二层含1％中性红染料的1.8％的低熔点营养琼脂，让其在培养箱中过夜。将细胞培养板中的染色培养基移去，再将培养板返回孵育箱1-2h，然后在白色衬底上统计红色背景中不着色或者浅色的斑点。最后计算具有细胞感染性的出芽病毒滴度。

病毒滴度＝最高稀释倍数的蚀斑数×最高稀释倍数×接种病毒量(ml/孔)

(2)重组病毒AcMNPV-PK2-EGFP抗虫活性检测

采用人工饲喂病毒法，检测了重组病毒AcMNPV-PK2-EGFP对甜菜夜蛾的致死作用。人工饲料配方为：黄豆粉50g、玉米粉75g、酵母粉20g、苯甲酸钠2g、琼脂10g、维生素C 7.5g、复合维生素B 0.375g、罗红霉素半片、36％冰乙酸15ml、10％的甲醛2.5ml和水500ml。受试虫为甜菜夜蛾(Spodoptera exigua Hubner)，购自于河南省济源白云实业有限公司。幼虫孵化后移入装有27mm³小块培养基的6、12或24孔板，每孔一头，成长为三龄幼虫即可用于实验。实验设置了一个空白对照组(Contral)和两个病毒处理组(AcMNPV-EGFP和AcMNPV-PK2-EGFP)，每组各36头虫。待虫体成长为三龄幼虫时，每天将20μl，1×10⁷pfu/ml的两种病毒滴加到实验组培养基上，连续处理五天。空白对照组滴加PBS缓冲液，然后逐天记录虫体的死亡率及蛹化率。

分析结果如下，在图7、图8中，我们发现空白对照组，虫体生长良好，85％以上的虫体成功化蛹，只有个别虫体化蛹失败死亡，而病毒处理组的死亡率均达到了50％以上，重组病毒AcMNPV-PK2-EGFP处理组相对于AcMNPV-EGFP处理组，致死时间提前6天后，整体致死率高达83.33％，高于AcMNPV-EGFP处理组的致死率(56.67％)；此外，AcMNPV-PK2-EGFP处理组的化蛹时间也推迟到病毒处理后的第12天，化蛹率为26.67％，较AcMNPV-EGFP处理组的化蛹率(35.33％)，低了将近10个百分点。以上结果共同表明，重组病毒AcMNPV-PK2-EGFP的杀虫效率高于AcMNPV-EGFP，可成为农作物和林业害虫防治的有效武器。

序列表

<110> 山西大学

<120> 一种重组杆状病毒及其构建方法和应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 2

<211> 1374

<212> DNA

<213> 苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californicanucleopolyhedrovirus)

<400> 2

atgaaacccg aacaattggt ttatttgaat ccgcggcagc accgcatata tattgcgtcg 60

cctctaaacg agtacatgtt gagcgactat ttgaaacaac gcaatttgca aacttttgca 120

aagaccaaca ttaaagttcc ggcggatttt ggcttttata ttagcaagtt tgttgatttg 180

gtgagcgccg tgaaagcgat tcattccgta aatatcgtgc accacaatat taatcccgaa 240

gatattttca tgactgggcc cgactttgat ttgtatgtgg gcggcatgtt tggcagtcta 300

tacaaaacgt ttatcaaaaa caaccctcaa aatataactt tgtacgctgc accagaacaa 360

atcaaaaaag tgtacacccc caaaaatgac atgtatagtt tgggcattgt tttattcgaa 420

ttgataatgc ccttcaagac tgctttggaa cgcgaaacta cgctaactaa ctttagaaac 480

aatgtacagc aaatgccggc aagtttatcc caaggccatc ctaaattgac cgaaattgtt 540

tgtaaattaa ttcagcatga ttacagtcaa cgaccggatg ctgaatggct gttgaaagag 600

atggaacaat tactgttgga atacacaacg tgttctaaaa aactagctcg agccatggtg 660

agcaagggcg aggagctgtt caccggggtg gtgcccatcc tggtcgagct ggacggcgac 720

gtaaacggcc acaagttcag cgtgtccggc gagggcgagg gcgatgccac ctacggcaag 780

ctgaccctga agttcatctg caccaccggc aagctgcccg tgccctggcc caccctcgtg 840

accaccctga cctacggcgt gcagtgcttc agccgctacc ccgaccacat gaagcagcac 900

gacttcttca agtccgccat gcccgaaggc tacgtccagg agcgcaccat cttcttcaag 960

gacgacggca actacaagac ccgcgccgag gtgaagttcg agggcgacac cctggtgaac 1020

cgcatcgagc tgaagggcat cgacttcaag gaggacggca acatcctggg gcacaagctg 1080

gagtacaact acaacagcca caacgtctat atcatggccg acaagcagaa gaacggcatc 1140

aaggtgaact tcaagatccg ccacaacatc gaggacggca gcgtgcagct cgccgaccac 1200

taccagcaga acacccccat cggcgacggc cccgtgctgc tgcccgacaa ccactacctg 1260

agcacccagt ccgccctgag caaagacccc aacgagaagc gcgatcacat ggtcctgctg 1320

gagttcgtga ccgccgccgg gatcactctc ggcatggacg agctgtacaa gtaa 1374

<210> 2

<211> 26

<212> DNA

<213> 苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californicanucleopolyhedrovirus)

<400> 2

atacccggga tgaaacccga acaatt 26

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californicanucleopolyhedrovirus)

<400> 3

atcctcgagc tagtttttta gaacacgttg 30

Claims (5)

1.一种重组杆状病毒，通过转座重组Bac-to-Bac系统将核苷酸序列为SEQ ID No.1的基因整合到AcMNPV基因组获得。

2.如权利要求1所述的重组杆状病毒的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

a)以AcMNPV基因组为模板，扩增Ac-pk2基因；

b)构建含有Ac-pk2基因和增强型绿色荧光蛋白egfp基因的重组质粒pFastBacDual-pk2-egfp，该重组质粒含有SEQ ID No.1的基因；

c)将重组质粒转化到DH10B感受态细胞，获得重组杆粒Bacmid-pk2-egfp；

d)将重组杆粒Bacmid-pk2-egfp转染草地贪夜蛾卵母细胞Sf9细胞，获得重组杆状病毒AcMNPV-PK2-EGFP。

3.如权利要求1所述的重组杆状病毒用于提高杆状病毒昆虫表达系统中外源蛋白的产量。

4.如权利要求1所述的重组杆状病毒在制备鳞翅目害虫杀虫剂中的应用。

5.权利要求4所述的应用，所述的鳞翅目害虫是棉铃虫、玉米夜蛾、甜菜夜蛾、菜青虫、小菜蛾、烟青虫、茶毛虫、红铃虫和印度谷螟中的一种或几种。