CN114369624A - 一种降低病毒感染导致的昆虫细胞凋亡的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种重组杆状病毒及其制备方法和应用，所述重组杆状病毒共表达三种目标基因，本发明还提供了利用该三种目标基因大幅度降低病毒感染导致的昆虫细胞凋亡的方法。本发明采用制备的重组杆状病毒AcMNPV‑iap1‑iap2‑iap3‑egfp感染sf9细胞，可以显著地降低sf9细胞的凋亡率，延长被感染sf9细胞的生活周期，增加目标蛋白的表达时间，提高基因表达的效率，更大限度地发挥杆状病毒‑昆虫细胞/幼虫生物反应器的应用价值。该方法通过对杆状病毒进行分子修饰，不需要额外人工添加化学合成药，安全性和时效性都得到极大地改善。

Description

一种降低病毒感染导致的昆虫细胞凋亡的方法
技术领域
本发明涉及一种降低病毒感染导致的昆虫细胞凋亡的方法。
背景技术
昆虫杆状病毒多基因表达系统(Baculovirus Expression Vector System，BEVS)是一种优秀的真核生物表达系统，因其具有较高表达效率和完善的蛋白质翻译修饰机制，被广泛的应用于生物、医药等领域。BEVS的主要原理是利用分子生物学技术，通过基因重组等方式构建出可同时携带多个目标基因的重组杆状病毒(如AcMNPV和BmNPV等)。重组杆状病毒再次感染昆虫细胞或昆虫幼虫的过程中，伴随病毒的增殖与复制，目标基因获得高效率表达，该系统兼具安全、高效等优点，目标蛋白生物活性高、易于浓缩纯化，是一种理想的生物反应器。
由于昆虫细胞或幼虫的特殊免疫机制，被感染的细胞会迅速启动细胞自毁程序，即细胞凋亡，以此来阻断子代病毒的增殖与复制。该现象无法最大限度的实现基因表达和细胞存活时间，严重制约了杆状病毒-昆虫细胞生物反应器的有效应用。目前，为解决上述问题，主要通过在细胞培养基中添加某些化学合成药物(如斑蝥素、去甲斑蝥素等等)，尽管该方法可在一定程度上降低昆虫细胞的凋亡率，但对药物添加浓度有着严格的限定，长期使用还存在细胞毒性、蛋白毒性等问题，安全性不高。此外，由于培养基中的药物不断消耗，此类化学合成药物需要不断人工添加，费时费力，无法做到持续的高效率抑制作用。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足而提供一种重组杆状病毒及其制备方法和应用，本发明还提供了一种降低病毒感染导致的昆虫细胞凋亡的方法，该方法采用制备的重组杆状病毒AcMNPV-iap1-iap2-iap3-egfp感染sf9细胞，可以显著地降低sf9细胞的凋亡率，延长被感染sf9细胞的生活周期，增加目标蛋白的表达时间，提高基因表达的效率，更大限度地发挥杆状病毒-昆虫细胞/幼虫生物反应器的应用价值。此外，通过对杆状病毒进行分子修饰，不需要额外人工添加化学合成药，安全性和时效性都得到极大地改善。
为实现上述目的，所采取的技术方案：一种重组杆状病毒，所述重组杆状病毒含有细胞凋亡调控因子iap1、iap2和iap3的编码序列，可同时表达iap1、iap2和iap3。
优选地，所述重组杆状病毒含有如SEQ ID NO:9-SEQ ID NO:11所示的序列。优选地，所述重组杆状病毒还含有如SEQ ID NO:12所示的序列。
本发明提供了一种重组杆状病毒的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
(1)以野生型BsNPV病毒基因组为模板，基因扩增获得细胞凋亡调控因子iap1、iap2和iap3；
(2)将步骤(1)获得的细胞凋亡调控因子iap1、iap2、iap3和egfp共同连接到原始质粒pFBDM上，获得可同时表达iap1、iap2、iap3和egfp的重组质粒pFBDM-iap1-iap2-iap3-egfp；
(3)将步骤(2)获得的重组质粒pFBDM-iap1-iap2-iap3-egfp转至E.coli Sw106菌株，完成Tn7转座和基因重组，构建出E.coli Sw106 Bacmid-iap1-iap2-iap3-egfp；
(4)将步骤(3)获得的E.coli Sw106 Bacmid-iap1-iap2-iap3-egfp侵染昆虫sf9细胞，生产得到重组杆状病毒AcMNPV-iap1-iap2-iap3-egfp。
优选地，所述步骤(1)中扩增iap1的引物包括如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的引物。
优选地，所述步骤(1)中扩增iap2的引物包括如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的引物。
优选地，所述步骤(1)中扩增iap3的引物包括如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的引物。
优选地，所述步骤(2)中重组质粒pFBDM-iap1-iap2-iap3-egfp含有如SEQ ID NO:9-SEQ ID NO:12所示的序列。
优选地，所述步骤(1)中基因扩增获得细胞凋亡调控因子iap1、iap2和iap3：
以野生型BsNPV病毒基因组为模板，使用如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的引物扩增获得基因片段iap1，在基因片段iap1上下游分别引入限制性内切酶位点，其中上游为BamH I，下游为Sal I；
以野生型BsNPV病毒基因组为模板，使用如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的引物扩增获得基因片段iap2，在基因片段iap2上下游分别引入限制性内切酶位点，其中上游为Xma I，下游为Xho I；
以野生型BsNPV病毒基因组为模板，使用如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的引物扩增获得基因片段iap3，在基因片段iap3上下游分别引入限制性内切酶位点，其中上游为BamH I，下游为Sal I；
所述步骤(2)中egfp是以增强型绿色荧光蛋白基因(egfp)基因为模板，使用如SEQID NO:7和SEQ ID NO:8所示的引物扩增获得的，在egfp上下游分别引入限制性内切酶位点，其中上游为Xma I，下游为Xho I。
优选地，所述步骤(2)中重组质粒pFBDM-iap1-iap2-iap3-egfp的构建方法具体包括：
利用BamH I和Sal I酶切位点，将iap1连接到原始质粒pFBDM上，获得pFBDM-iap1；利用Xma I和Xho I酶切位点，将iap2连接到pFBDM-iap1上，获得pFBDM-iap1-iap2；
利用BamH I和Sal I酶切位点，将iap3连接到另一原始质粒pFBDM，获得pFBDM-iap3；利用Xma I和Xho I酶切位点，将egfp连接到pFBDM-iap3上，获得pFBDM-iap3-egfp；
使用Pme I和Avr II内切酶处理pFBDM-iap1-iap2，获得基因片段polh-iap1-polyA-p10-iap2-polyA；同时利用BstZ171和Spe I内切酶处理pFBDM-iap3-egfp，分别利用同尾酶Pme I/BstZ171和Avr II/Spe I，将polh-iap1-polyA-p10-iap2-polyA片段连入质粒pFBDM-iap3-egfp，获得重组质粒pFBDM-iap1-iap2-iap3-egfp。
优选地，所述步骤(3)中E.coli Sw106 Bacmid-iap1-iap2-iap3-egfp的构建方法具体包括：
将E.coli Sw106活化后，接种到液体LB培养基内，加入终浓度为50μg/mL的卡那霉素、终浓度为5μg/mL的壮观霉素、终浓度为5μg/mL的四环素、终浓度为5μg/mL的二氨基庚二酸，32℃，180rpm震荡培养细菌至OD600＝0.5；4℃，3000g离心去上清，加入终浓度为0.1M的CaCl2溶液，4℃静止30分钟；重复上述离心、静置步骤一次，制备100uL的感受态细胞E.coliSw106；加入5ug步骤(2)获得的重组质粒pFBDM-iap1-iap2-iap3-egfp和800uL液体LB培养基，32℃、150rpm震荡培养过夜完成Tn7转座和基因重组；取完成Tn7转座和基因重组的重组菌液50-80uL，均匀涂于含有Kan、Spe、Tet抗生素、DAP、IPTG和X-gal的LB固体培养基平板上，32℃倒置培养36-48h；挑取上述LB固体培养基的蓝色单克隆菌落，使用iap1、iap2、iap3和egfp基因的引物，进行菌落PCR鉴定，获得E.coli Sw106 Bacmid-iap1-iap2-iap3-egfp。
优选地，所述步骤(4)具体包括：
取步骤(3)获得的E.coli Sw106 Bacmid-iap1-iap2-iap3-egfp菌液，4℃、3000g离心弃上清，使用无菌水清洗沉淀3次，彻底除去培养基中DAP，沉淀用1mL的Grace基础培养基重悬，标记为100，并使用Grace基础培养基依次稀释出10-1、10-2、10-3浓度的菌液；将sf9细胞均匀地铺于24孔细胞皿，待细胞密度为90％，用无抗生素和无血清的Grace培养基清洗细胞2次，按照500uL/孔的量，分别加入不同浓度的E.coli Sw106 Bacmid-iap1-iap2-iap3-egfp，28℃静置培养4小时，弃上清，无抗生素和无血清的Grace培养基清洗细胞2次，每孔加入500uL的Grace完全培养基，28℃培养72小时；期间使用荧光显微镜观察细胞内绿色荧光的产生情况；待绿色荧光达到最大值后，收集细胞上清，再次感染正常的sf9细胞。反复完成上述病毒感染2-3次，获得重组杆状病毒AcMNPV-iap1-iap2-iap3-egfp。
本发明提供了一种减少病毒感染导致的昆虫细胞凋亡的组合物，所述组合物包括细胞凋亡调控因子iap1、iap2和iap3。
本发明提供了上述所述的重组杆状病毒或者上述所述的组合物在制备降低病毒感染导致的昆虫细胞凋亡或者降低子代病毒的增殖速率的产品中的应用。
本发明提供了一种降低病毒感染导致的昆虫细胞凋亡的方法，所述方法包括采用上述所述的重组杆状病毒感染昆虫细胞。
有益效果：
1、本发明操作更加简便，通过重组质粒携带目标基因直接对杆状病毒进行分子修饰，无需人工额外添加化学合成药物，持续产生强烈的细胞凋亡抑制效果。
2、相较于传统化学合成药物方式，本发明重组杆状病毒更安全，更高效，同等条件下，优于化合物斑蝥素对sf9细胞的抑制效果。
3、iap的基因修饰作用，在抑制细胞凋亡的同时，降低了子代重组病毒的增殖，避免细胞同时遭受大量病毒感染而引起的快速死亡和衰老，有效地延长了杆状病毒表达系统的生产时间，更充分的发挥真核表达系统的价值。
附图说明
图1：pFBDM-iap1-iap2质粒图谱。
图2：pFBDM-iap3-egfp质粒图谱。
图3：pFBDM-iap1-iap2-iap3-egfp质粒图谱。
图4：重组杆状病毒AcMNPV-iap1-iap2-iap3-egfp的构建过程。A：重组质粒pFBDM-iap1-iap2-iap3-egfp转座至E.coli Sw106菌株，构建E.coli Sw106Bacmid-iap1-iap2-iap3-egfp的过程。B：重组E.coli Sw106 Bacmid-iap1-iap2-iap3-egfp侵染昆虫sf9细胞，生产重组杆状病毒AcMNPV-iap1-iap2-iap3-egfp(Bar＝200um)。
图5：重组杆状病毒感染sf9细胞后，胞内多种凋亡基因表达量的测定结果。
图6A ：sf9细胞被感染后24小时，不同组合的细胞凋亡率柱状图，流式细胞仪测定；control：对照组。
图6B：sf9细胞被感染后24小时，不同组合的细胞凋亡率结果，与图6A对应，流式细胞仪测定。
图7：重组杆状病毒感染sf9细胞的36-72小时，子代病毒的滴度变化。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。
本发明从Group II型杆状病毒BsNPV(Buzura SuppressariaNucleoPolyhedroVirus)中筛选获得了3种细胞凋亡调控因子(inhibitor of apoptosisproteins,iap)，分别命名为iap1(SEQ ID NO:9)，iap2(SEQ ID NO:10)和iap3(SEQ ID NO:11)。利用MultiBac多基因表达系统和Bac to Bac技术对AcMNPV病毒进行分子修饰，成功的构建出共表达iap1，iap2和iap3的重组杆状病毒AcMNPV-iap1-iap2-iap3-egfp，egfp的序列如SEQ ID NO:12所示。利用多基因共表达系统实现三种不同iap1、iap2、iap3的同时作用，高效率地抑制被感染sf9细胞的凋亡。通过对重组杆状病毒进行分子修饰，降低病毒感染引起的细胞凋亡，并可延长感染后的细胞存活时间，可广泛应用于蛋白质工程、昆虫杆状病毒生物反应器等领域。
实施例1
1、基因扩增获得细胞凋亡调控因子iap1、iap2和iap3。
1)以野生型BsNPV病毒基因组为模板，使用表1中对应的引物扩增获得基因片段iap1，在基因上下游分别引入了限制性内切酶位点，其中上游为BamH I，下游为Sal I，基因序列全长为561bp。
2)以野生型BsNPV病毒基因组为模板，使用表1中对应的引物扩增获得基因片段iap2，在基因上下游分别引入了限制性内切酶位点，其中上游为Xma I，下游为Xho I，基因序列全长为945bp。
3)以野生型BsNPV病毒基因组为模板，使用表1中对应的引物扩增获得基因片段iap3，在基因上下游分别引入了限制性内切酶位点，其中上游为BamH I，下游为Sal I，基因序列全长为843bp。
4)以增强型绿色荧光蛋白基因为模板，使用表1中对应的引物扩增获得基因片段egfp，在基因上下游分别引入了限制性内切酶位点，其中上游为Xma I，下游为Xho I，基因序列全长为732bp。
基因扩增过程中，参照DNA聚合酶说明书进行；PCR产物回收参照PCR产物回收试剂盒说明书进行。
表1 PCR克隆引物序列表
Figure BDA0003449227660000071
2、构建同时含有iap1、iap2和iap3的重组质粒
利用将上述1中的基因片段，以pFBDM质粒为载体，通过常规的分子生物学技术，构建出重组质粒pFBDM-iap1-iap2-iap3-egfp。具体实施方法如下
1)扩增获得如下基因片段：iap1，iap2，iap3，和egfp。
2)利用BamH I和Sal I酶切位点，将iap1连接到原始质粒pFBDM上，获得pFBDM-iap1；利用Xma I和Xho I酶切位点，将iap2连接到pFBDM-iap1上，获得pFBDM-iap1-iap2(图1)。
3)利用BamH I和Sal I酶切位点，将iap3连接到另一原始质粒pFBDM，获得pFBDM-iap3；利用Xma I和Xho I酶切位点，将egfp连接到pFBDM-iap3上，获得pFBDM-iap3-egfp(图2)。
4)使用Pme I和Avr II内切酶处理pFBDM-iap1-iap2，获得基因片段polh-iap1-polyA-p10-iap2-polyA；同时利用BstZ171和Spe I内切酶处理pFBDM-iap3-egfp，分别利用同尾酶Pme I/BstZ171和Avr II/Spe I，将polh-iap1-polyA-p10-iap2-polyA片段连入质粒pFBDM-iap3-egfp，获得重组质粒pFBDM-iap1-iap2-iap3-egfp(图3)。
3.重组杆状病毒AcMNPV-iap1-iap2-iap3-egfp的构建及滴度测定
1)将E.coli Sw106活化后，接种到液体LB培养基内，加入卡那霉素(Kan，终浓度50μg/mL)、壮观霉素(Spe，终浓度5μg/mL)、四环素(Tet，终浓度5μg/mL)、二氨基庚二酸(DAP，终浓度5μg/mL)，32℃，180rpm震荡培养细菌至OD600＝0.5。4℃，3000g离心去上清，加入终浓度为0.1M的CaCl2溶液，4℃静止30分钟；重复上述离心、静置步骤一次，制备100uL的感受态细胞E.coli Sw106。加入5ug重组质粒pFBDM-iap1-iap2-iap3-egfp和800uL液体LB培养基，32℃、150rpm震荡培养过夜完成Tn7转座和基因重组。取重组菌液50-80uL，均匀涂于含有抗生素(Kan、Spe、Tet)、DAP、IPTG和X-gal的LB固体培养基平板上，32℃倒置培养36-48hrs。挑取上述LB固体培养基的蓝色单克隆菌落，使用表1中iap基因和egfp基因的引物，进行菌落PCR鉴定，获得E.coli Sw106 Bacmid-iap1-iap2-iap3-egfp(图4)。
2)取E.coli Sw106 Bacmid-iap1-iap2-iap3-egfp菌液，4℃、3000g离心弃上清，使用无菌水清洗沉淀3次，彻底除去培养基中DAP，沉淀用1mL的Grace基础培养基重悬，标记为100，并使用Grace基础培养基依次稀释出10-1、10-2、10-3浓度的菌液。将sf9细胞均匀的铺于24孔细胞皿，待细胞密度约为90％，用双无Grace培养基(无抗生素、无血清)清洗细胞2次，按照500uL/孔的量，分别加入不同浓度的E.coli Sw106 Bacmid-iap1-iap2-iap3-egfp，28℃静置培养4小时，弃上清，双无Grace培养基清洗细胞2次，每孔加入500uL的Grace完全培养基，28℃培养72小时。期间使用荧光显微镜观察细胞内绿色荧光的产生情况。待绿色荧光达到最大值后，收集细胞上清，再次感染正常的sf9细胞。反复完成上述病毒感染2-3次，获得高滴度的重组杆状病毒AcMNPV-iap1-iap2-iap3-egfp(图4)。
3)收集重组杆状病毒AcMNPV-iap1-iap2-iap3-egfp感染正常的sf9细胞72小时，利用TCID50法测定出重组杆状病毒滴度(表2)。
表2重组杆状病毒AcMNPV-iap1-iap2-iap3-egfp的滴度测定
稀释倍数 AcMNPV-iap1-iap2-iap3-egfp AcMNPV-egfp
10<sup>-1</sup> 100％ 100％
10<sup>-2</sup> 100％ 100％
10<sup>-3</sup> 62.5％ 100％
10<sup>-4</sup> 12.5％ 100％
10<sup>-5</sup> 0 75％
10<sup>-6</sup> 0 25％
10<sup>-7</sup> 0 0
10<sup>-8</sup> 0 0
计算得知(表2)：重组杆状病毒AcMNPV-iap1-iap2-iap3-egfp的病毒滴度为2.46×104pfu/mL；对照组AcMNPV-egfp病毒滴度为4.36×106pfu/mL。利用Grace完全培养基稀释调整两组病毒滴度至完全相同，开展如下实验检测。
4.重组杆状病毒感染sf9细胞后胞内凋亡基因表达量测定
利用重组杆状病毒AcMNPV-iap1-iap2-iap3-egfp和野生型杆状病毒AcMNPV-egfp分别感染正常的sf9细胞72小时，常规分子生物学技术(TRIzol LS法)提取胞内总RNA。使用RNA逆转录(Oligo dT引物)和实时荧光定量PCR(Q-PCR)技术，通过特异性引物(表3)完成sf9细胞内多种凋亡基因的表达量测定，其中包括Caspase家族(sf-Cas-1、sf-Cas-2和sf-Cas-9)、sf-Dre、sf-Dro、sf-iap、sf-p53和rBV-p35等。
表3 Q-PCR检测特异性引物序列表
Figure BDA0003449227660000101
相较于对照组，iap1+iap2+iap3对杆状病毒的分子修饰作用显著的降低了sf9细胞内多种细胞凋亡基因的表达量，可延缓细胞凋亡过程(图5)。
5.流式细胞仪测定被感染细胞的凋亡率
利用重组杆状病毒AcMNPV-iap1-iap2-iap3-egfp(实验组)、AcMNPV-iap1-egfp、AcMNPV-iap2-egfp、AcMNPV-iap3-egfp、AcMNPV-iap1-iap2-egfp、AcMNPV-iap1-iap3-egfp、AcMNPV-iap2-iap3-egfp和AcMNPV-egfp(对照组，control)分别感染正常的sf9细胞24小时后，使用1×PBS溶液洗净细胞，4℃、1000g离心收集细胞沉淀，加入100uL的AnnexinV Binding Buffer溶液，充分混合后再加入1.5uL Annexin V-AF647染色剂，置于室温条件下避光静置15-20分钟，最后加入400uL的Annexin V Binding Buffer(1×)混匀样品，冰浴保存。使用FSC-A和FSC-H通道用于筛选样品，采用APC-A通道对两组sf9的细胞凋亡率进行分析和计算。测定结果如图6A和图6B，野生型杆状病毒AcMNPV-egfp感染sf9细胞24小时，sf9细胞的凋亡率约为38.89％，AcMNPV-iap2-iap3-egfp组sf9细胞的凋亡率最高，高达56.11％；相同条件下，重组杆状病毒AcMNPV-iap1-iap2-iap3-egfp组sf9细胞的凋亡率最低，仅为12.01％，说明iap1+iap2+iap3的分子修饰将被感染sf9细胞的凋亡率降低得最多，效果最佳。
AcMNPV-iap1-egfp、AcMNPV-iap2-egfp、AcMNPV-iap3-egfp、AcMNPV-iap1-iap2-egfp、AcMNPV-iap1-iap3-egfp、AcMNPV-iap2-iap3-egfp、AcMNPV-egfp的构建参照AcMNPV-iap1-iap2-iap3-egfp的构建方法。
6.被感染细胞的子代病毒增值速率测定。
利用SF-900II培养基稀释对数期的sf9细胞至106个/mL，取100uL工作体积置于96孔板的不同微孔中。10倍稀释法制备100-10-8浓度的重组杆状病毒AcMNPV-iap1-iap2-iap3-egfp(实验组)和AcMNPV-egfp(对照组)，分别感染孔内正常的sf9细胞。TCID50法连续测定36-72小时的子代病毒滴度。结果显示，相较于对照组，AcMNPV-iap1-iap2-iap3-egfp在感染sf9细胞的不同时间段，子代杆状病毒的病毒滴度均出现不同程度的降低(图7)。该结果同样可避免子代杆状病毒的大量增殖而加剧sf9细胞的凋亡速率，也可为杆状病毒表达系统提供更多的表达时间，提高目标蛋白的表达量。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
序列表
<110> 华南农业大学
<120> 一种降低病毒感染导致的昆虫细胞凋亡的方法
<160> 34
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 1
aggatccatg atgtgttgtt ttttttggc 29
<210> 2
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 2
agtcgactta atttacatac aatttttg 28
<210> 3
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 3
acccgggatg atgaactacg aaagtgct 28
<210> 4
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 4
actcgagtta taaaaacact ttaatc 26
<210> 5
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 5
aggatccatg atgtacatag aagatt 26
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 6
agtcgactta cacttgatac atgc 24
<210> 7
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 7
acccgggatg gtgagcaagg gcgagga 27
<210> 8
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 8
actcgagtta cttgtacagc tcgtccat 28
<210> 9
<211> 549
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 9
atgtgttgtt ttttttggca cgctgacaat ataatggaat attttaattt gctaaaagac 60
gaaaactatc gaattgatac gtttaataaa aattggccac atggctatcc tttgacccca 120
aaattattgg ccagacacgg attttattat aatggmgaaa gcgacacaat caaatgttgc 180
gaatgtaaat taacactcac caacttaaaa cckratcaat ttattgatcg atttcatgaa 240
cgttttaaat gttcatatgc aaacgtgcgc actttcgagt attgtataca aaacaatttg 300
ccttatagca acgaaaacga aaaagatgtc gtgtccaaat tagttgcagt caaatcgtcg 360
tcgacaattc cggaaaagct cgaacaaaac gattcacaaa attgtaacat ttgcatgtcg 420
aatgtratta atgcctgttt ggtgccatgt ggtcacatgc tatgtctcga gtgtgctctt 480
gaattaaaca acacaatttg tccttattgt agaaatgttt caacaattca aaaattgtat 540
gtaaattaa 549
<210> 10
<211> 933
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 10
atgaactacg aaagtgctat aaatcgtgat ttggcaccgc cgtttttcta caaaaatgtg 60
ctcaaccgat ttgcaacttt taacaattcc atcaacctga tggacagcga aaagcgacaa 120
tttgcaaaac acggatttta tttcgacaga acgggttatc gctgcgcgta ttgtgcaaca 180
actttaagca aatttaataa caaaagcttt aaatatcaca cgttttctat ttgcaaacgg 240
tccgttcaat tgttgcgtga aaatgaatcg ttgaggcgag acagtttcaa aaatttcaaa 300
caagcgcgca aaaaattcaa aggggtggcg gaccggctgg ccgcgaacgg attttattat 360
tatggcgctc gaaacgaaat aaaatgctgt gaatgtgaat tggttataat taaatttagc 420
caattcgata cactttatat tgtgcataaa cagtattctc ctttttgcag ttttacgttt 480
ggaacagaca atttaacaac acacgatcgg tcgccttttg cacaaccgag tgcgccgccg 540
atcgaattga taacgccgaa atcattttcg gagcattcgg atttgtctaa tgagtcgaaa 600
attataacat acaaacaagc ggaatcacca gaattaaata caccgaacgc gcacgaatca 660
aacgatgtta acaatctcaa attgtatccc gtgttagcaa cgacaaacgt gtctcattat 720
tttgaaagat caaacgcttt gagacctgca aacgacgcta aaccgttgtc agatgaaaat 780
aaaatgtgtg ttgtatgttt tgaaaaagaa cgaactattt gttttttgcc atgtggacat 840
gtttgcgtat gcgaattgtg cgctgacaaa tgtaaaaaaa agtgttgttt atgccgagaa 900
cttatcaaaa ataagattaa agtgttttta taa 933
<210> 11
<211> 831
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 11
atgtacatag aagattattc aaaaatgacg gaagaagcaa acagactggc ttcatttaca 60
aactggcccg tggtgttttt aacgccgcag cagatggcaa aaaacggttt ttactatatt 120
ggtgtgcacg acgaagtgcg ttgcgcattt tgtaaagtag aatttaggaa atggatggaa 180
ggcgacaatc cggccgatca ccatcgaaaa tgggcgccac aatgtccttt tttaaataat 240
aaaatcgacg ccggccaaga tgtatgcggt acgcgagaag ttatttttgc cccttccccg 300
gcgcatccgc aatacgcgac aaaaacggct cggttgcgca cttttgaacg caactggcct 360
tgcgctttga aacaaaaacc tgagcagttg gcggatgccg gtttttttta cacgggccaa 420
ggcgacaaga cgatttgttt cttttgcaac gggggcctta aggattggga agatggcgat 480
gaaccttggg aacaacatgc gcgctggttt gataattgca tctatgttca actagtaaaa 540
ggacgcgatt acgtgcaaaa tgttatttcg aacgcttgcg ttatacccgc agctaaaaag 600
caaatgccca aatcggacgc tacgcttgtg tcgcatgccg ttgttgaggt tgaaaacaag 660
cgcgaacttg aagattctaa agcatgccga atttgtttcg aagaagaacg aaacgtgtgc 720
tttgtgccgt gcgggcacgt ggcaacgtgt ggtaaatgcg cagtggcact acaaaactgt 780
cctacgtgtc gtgtcaaaat caataatgct gttcgcatgt atcaagtgta a 831
<210> 12
<211> 720
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 12
atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60
ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120
ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180
ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240
cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300
ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360
gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaagagg acggcaacat cctggggcac 420
aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480
ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540
gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600
tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660
ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagtaa 720
<210> 13
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 13
agtccagatc ggtaatgc 18
<210> 14
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 14
gctgaagaag gtgttgaag 19
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 15
cccgtaacgg acctcgtact t 21
<210> 16
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 16
ttatcgagat ttatttgcat acaac 25
<210> 17
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 17
gattcaaagt tacggtgttc ccta 24
<210> 18
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 18
ggttgtctgg cttgtaatga gtat 24
<210> 19
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 19
gtaaggttct gattggcaat tagc 24
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 20
cggtacttgt ggttggtgtt 20
<210> 21
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 21
acacagagtt tgacaacaat atcg 24
<210> 22
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 22
ggtctcatag tccaccaaca c 21
<210> 23
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 23
ctggtagata cgcttggaga acta 24
<210> 24
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 24
gcctgtttga tgtgctaaga ct 22
<210> 25
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 25
aacaccacaa ggaatggaag t 21
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 26
agttacaggc atcgttggaa 20
<210> 27
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 27
gttggagagt tgtgttgttt gttt 24
<210> 28
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 28
aatagcgtta atgttgagga ggag 24
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 29
acccgataag aagcagtgac 20
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 30
cccagagtag cgttaggatt 20
<210> 31
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 31
cgaacgcaac gactactac 19
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 32
tgagcaaacg gcacaataac 20
<210> 33
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 33
caccgtctca accgtatc 18
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 34
gaggacattc ttcgctattt 20

Claims (10)

1.一种重组杆状病毒，其特征在于，所述重组杆状病毒含有细胞凋亡调控因子iap1、iap2和iap3的编码序列，可同时表达iap1、iap2和iap3；优选地，所述重组杆状病毒含有如SEQ ID NO:9-SEQ ID NO:11所示的序列。
2.一种如权利要求1所述重组杆状病毒的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
(1)以野生型BsNPV病毒基因组为模板，基因扩增获得细胞凋亡调控因子iap1、iap2和iap3；
(2)将步骤(1)获得的细胞凋亡调控因子iap1、iap2、iap3和egfp共同连接到原始质粒pFBDM上，获得可同时表达iap1、iap2、iap3和egfp的重组质粒pFBDM-iap1-iap2-iap3-egfp；
(3)将步骤(2)获得的重组质粒pFBDM-iap1-iap2-iap3-egfp转至E.coli Sw106菌株，完成Tn7转座和基因重组，构建出E.coli Sw106 Bacmid-iap1-iap2-iap3-egfp；
(4)将步骤(3)获得的E.coli Sw106 Bacmid-iap1-iap2-iap3-egfp侵染昆虫sf9细胞，生产得到重组杆状病毒AcMNPV-iap1-iap2-iap3-egfp。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中扩增iap1的引物包括如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的引物；所述步骤(1)中扩增iap2的引物包括如SEQ IDNO:3和SEQ ID NO:4所示的引物；所述步骤(1)中扩增iap3的引物包括如SEQ ID NO:5和SEQID NO:6所示的引物。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中重组质粒pFBDM-iap1-iap2-iap3-egfp含有如SEQ ID NO:9-SEQ ID NO:12所示的序列。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中基因扩增获得细胞凋亡调控因子iap1、iap2和iap3：
以野生型BsNPV病毒基因组为模板，使用如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的引物扩增获得基因片段iap1，在基因片段iap1上下游分别引入了限制性内切酶位点，其中上游为BamH I，下游为Sal I；
以野生型BsNPV病毒基因组为模板，使用如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的引物扩增获得基因片段iap2，在基因片段iap2上下游分别引入了限制性内切酶位点，其中上游为Xma I，下游为Xho I；
以野生型BsNPV病毒基因组为模板，使用如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的引物扩增获得基因片段iap3，在基因片段iap3上下游分别引入了限制性内切酶位点，其中上游为BamH I，下游为Sal I；
所述步骤(2)中egfp是以增强型绿色荧光蛋白基因(egfp)基因为模板，使用如SEQ IDNO:7和SEQ ID NO:8所示的引物扩增获得的，在egfp上下游分别引入了限制性内切酶位点，其中上游为Xma I，下游为Xho I。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中重组质粒pFBDM-iap1-iap2-iap3-egfp的构建方法具体包括：
利用BamH I和Sal I酶切位点，将iap1连接到原始质粒pFBDM上，获得pFBDM-iap1；利用Xma I和Xho I酶切位点，将iap2连接到pFBDM-iap1上，获得pFBDM-iap1-iap2；
利用BamH I和Sal I酶切位点，将iap3连接到另一原始质粒pFBDM，获得pFBDM-iap3；利用Xma I和Xho I酶切位点，将egfp连接到pFBDM-iap3上，获得pFBDM-iap3-egfp；
使用Pme I和Avr II内切酶处理pFBDM-iap1-iap2，获得基因片段polh-iap1-polyA-p10-iap2-polyA；同时利用BstZ171和Spe I内切酶处理pFBDM-iap3-egfp，分别利用同尾酶Pme I/BstZ171和Avr II/Spe I，将polh-iap1-polyA-p10-iap2-polyA片段连入质粒pFBDM-iap3-egfp，获得重组质粒pFBDM-iap1-iap2-iap3-egfp。
7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中E.coli Sw106Bacmid-iap1-iap2-iap3-egfp的构建方法具体包括：
将E.coli Sw106活化后，接种到液体LB培养基内，加入终浓度为50μg/mL的卡那霉素、终浓度为5μg/mL的壮观霉素、终浓度为5μg/mL的四环素、终浓度为5μg/mL的二氨基庚二酸，32℃，180rpm震荡培养细菌至OD600＝0.5；4℃，3000g离心去上清，加入终浓度为0.1M的CaCl2溶液，4℃静止30分钟；重复上述离心、静置步骤一次，制备100uL的感受态细胞E.coliSw106；加入5ug步骤(2)获得的重组质粒pFBDM-iap1-iap2-iap3-egfp和800uL液体LB培养基，32℃、150rpm震荡培养过夜完成Tn7转座和基因重组；取完成Tn7转座和基因重组的重组菌液50-80uL，均匀涂于含有Kan、Spe、Tet抗生素、DAP、IPTG和X-gal的LB固体培养基平板上，32℃倒置培养36-48h；挑取上述LB固体培养基的蓝色单克隆菌落，使用iap1、iap2、iap3和egfp基因的引物，进行菌落PCR鉴定，获得E.coli Sw106 Bacmid-iap1-iap2-iap3-egfp。
所述步骤(4)具体包括：取步骤(3)获得的E.coli Sw106 Bacmid-iap1-iap2-iap3-egfp菌液，4℃、3000g离心弃上清，使用无菌水清洗沉淀3次，彻底除去培养基中DAP，沉淀用1mL的Grace基础培养基重悬，标记为100，并使用Grace基础培养基依次稀释出10-1、10-2、10-3浓度的菌液；将sf9细胞均匀地铺于24孔细胞皿，待细胞密度为90％，用无抗生素和无血清的Grace培养基清洗细胞2次，按照500uL/孔的量，分别加入不同浓度的E.coli Sw106Bacmid-iap1-iap2-iap3-egfp，28℃静置培养4小时，弃上清，无抗生素和无血清的Grace培养基清洗细胞2次，每孔加入500uL的Grace完全培养基，28℃培养72小时；期间使用荧光显微镜观察细胞内绿色荧光的产生情况；待绿色荧光达到最大值后，收集细胞上清，再次感染正常的sf9细胞。反复完成上述病毒感染2-3次，获得重组杆状病毒AcMNPV-iap1-iap2-iap3-egfp。
8.一种降低病毒感染导致的昆虫细胞凋亡的组合物，其特征在于，所述组合物包括细胞凋亡调控因子iap1、iap2和iap3。
9.如权利要求1所述的重组杆状病毒或者如权利要求8所述的组合物在制备降低病毒感染导致的昆虫细胞凋亡或者降低子代病毒的增殖速率的产品中的应用。
10.一种降低病毒感染导致的昆虫细胞凋亡的方法，其特征在于，所述方法包括采用如权利求1所述的重组杆状病毒感染昆虫细胞。
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