CN111004800A - 靶向HPV亚型16/18癌基因E6/E7的CRISPR/Cas9系统 - Google Patents
靶向HPV亚型16/18癌基因E6/E7的CRISPR/Cas9系统 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种用于对人乳头瘤病毒HPV亚型16/18的癌基因E6/E7进行基因编辑的CRISPR/Cas9系统，其包含Cas9和分别靶向癌基因E6/E7的两种sgRNA，所述sgRNA是SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2：或者是选自SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5中的任意两种。本发明的CRISPR/Cas9系统可用于制备宫颈癌治疗药物。
Description
技术领域
本发明属于属于分子生物学领域，具体地说，涉及一种用于对人乳头瘤病毒HPV亚型16/18的癌基因E6/E7进行基因编辑的CRISPR/Cas9系统、及其在制备宫颈癌治疗药物中的用途。
背景技术
宫颈癌的发生与人乳头瘤病毒(HPV)的感染密切相关。已知的HPV亚型16和亚型18两种病毒造成了70％以上的宫颈癌病例。临床治疗宫颈癌是手术切除，放射治疗，化疗。虽然防治人类乳头瘤病毒感染已有疫苗产品市售，但是成年人在已经接触到HPV16/18感染后，疫苗几乎无效。
HPV病毒是一个小的双链环状DNA病毒(7.9kb)。位于早期区的E6、E7基因是HPV病毒的致癌基因。E6表达会使肿瘤抑制蛋白p53降解，而E7基因的表达，抑制pRb活性，使细胞周期调节紊乱。E6/E7两者共同作用，导致细胞的永生化，引发癌症。因此阻断E6/E7癌蛋白表达，可恢复p53和pRbd的正常表达，引起癌细胞凋亡。同时，由于切断了病毒E6/E7基因，阻断病毒增殖，理论上可达到清除机体中病毒的目的。
CRISPR系统(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)是在细菌及古细菌种发现的一种抵御质粒病毒感染的免疫机制，其通过生物工程设计一段作为引导工具的小核酸，引导一种名叫Cas9的特殊核酸酶到特定基因组，对生物的DNA序列进行切割或替换。CRISPR/Cas9技术有许多潜在的应用，可以用于人类基因组编辑以治疗遗传缺陷病或基因突变疾病；删除病原体基因，如细菌的基因组或病毒基因组，消灭病原体，达到消除传染性疾病。CRISPR基因编辑技术是彻底治愈遗传缺陷疾病和传染性疾病的有效方法和希望。
为了能有效治疗宫颈癌，发明人研究了使用CRISPR基因编辑技术的可能性。通过切断人类乳头瘤病毒癌蛋白E6、E7基因，破坏癌蛋白表达，从感染机体中消除病毒。结合子宫颈癌的手术治疗和化疗，清除患者体内的HPV病毒，让患者避免重复感染，达到治愈子宫颈癌目的。
发明内容
在基因编辑技术的研究中，发明人对靶向人乳头瘤病毒癌基因E6/E7基因序列的sgRNA(single guide RNA，单导向RNA)进行了大量的筛选，发现有17种sgRNA能够高效率地靶向E6/E7，其中的5种sgRNA能够以表达载体比如双靶表达质粒形式在细胞内表达，产生的sgRNA分子可高效地引导核酸酶Cas9靶向癌基因E6和E7，切割E6/E7癌基因，导致了癌细胞的死亡。
因此，本发明的第一个目的在于提供一种用于
一种用于对人乳头瘤病毒HPV亚型16/18的癌基因E6/E7进行基因编辑的CRISPR/Cas9系统，其包含核酸内切酶Cas9和分别靶向癌基因E6/E7的两种sgRNA，所述sgRNA是SEQID NO:1和SEQ ID NO:2：
5’-UUUCAAUGGUGUCAAUACGU-3’(SEQ ID NO:1)，
5’-GCGAAGCCAACACGCAUGUUU-3’(SEQ ID NO:2)；或者
所述sgRNA是选自SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5中的任意两种：
5’-GUUCGAUGGACUAGACACGU-3’(SEQ ID NO:3)，
5’-CGUCGACAAAGACUUGUGGG-3’(SEQ ID NO:4)，
5’-CAACUGGAAGAUACAGUGCU-3’(SEQ ID NO:5)。
上述SEQ ID NO:1的sgRNA是针对HPV亚型16的癌基因E6设计的单导向RNA；SEQ IDNO:2的sgRNA是针对HPV亚型16癌基因E7设计的单导向RNA；SEQ ID NO:3的sgRNA是针对HPV亚型18癌基因E6设计的单导向RNA；SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5的sgRNA都是针对HPV亚型18癌基因E7设计的单导向RNA。
优选地，当上述CRISPR/Cas9系统用于对HPV亚型18的癌基因E6/E7进行基因编辑时，优选SEQ ID NO:3作为一种sgRNA，SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5两者之一作为一种sgRNA。
优选地，上述CRISPR/Cas9系统中所用的Cas9是来自金黄色葡萄球菌的SaCas9，识别的PAM为5’-NNGRRT-3’，其中N指A、T、C、G；R指A、G。
上述sgRNA以表达载体(即表达质粒)形式存在，或者以单链RNA分子形式存在。
优选地，当sgRNA以表达载体(即表达质粒)形式存在时，两种sgRNA即SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2被克隆在同一个表达载体上，形成双靶表达载体；或者SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:4和SEQ ID NO:5中的任意两种被克隆在同一个表达载体上，形成双靶表达载体。
如果上述双靶表达载体的骨架质粒是腺相关病毒AAV，则双靶表达载体表示为pAAV-dual-sgRNAs。
在一种优选的实施方式中，上述sgRNA表达基因被克隆在sgRNA表达载体上，该sgRNA表达基因是互补双链DNA序列，其中
SEQ ID NO:1的表达基因由如下正义链和反义链组成：
正义链：5’-TGCATAACTGTGGTAACTTT-3’(SEQ ID NO:6)，实施例中表示为1F或HPV16-gRNAE6-2-F，
反义链：5’-AAAGTTACCACAGTTATGCA-3’(SEQ ID NO:7)，实施例中表示为1R或HPV16-gRNAE6-2-R；
SEQ ID NO:2的表达基因由如下正义链和反义链组成：
正义链：5’-TTTGTACGCACAACCGAAGCG-3’(SEQ ID NO:8)，实施例中表示为2F或HPV16-gRNAE7-6-F，
反义链：5’-CGCTTCGGTTGTGCGTACAAA-3’(SEQ ID NO:9)，实施例中表示为2R或HPV16-gRNAE7-6-R；
SEQ ID NO:3的表达基因由如下正义链和反义链组成：
正义链：5’-TGCACAGATCAGGTAGCTTG-3’(SEQ ID NO:10)，实施例中表示为3F或HPV18-gRNAE6-3-F，
反义链：5’-CAAGCTACCTGATCTGTGCA-3’(SEQ ID NO:11)，实施例中表示为3R或HPV18-gRNAE6-3-R；
SEQ ID NO:4的表达基因由如下正义链和反义链组成：
正义链：5’-GGGTGTTCAGAAACAGCTGC-3’(SEQ ID NO:12)，实施例中表示为4F或HPV18-gRNAE7-8-F，
反义链：5’-GCAGCTGTTTCTGAACACCC-3’(SEQ ID NO:13)，实施例中表示为4R或HPV18-gRNAE7-8-R；
SEQ ID NO:5的表达基因由如下正义链和反义链组成：
正义链：5’-TCGTGACATAGAAGGTCAAC-3’(SEQ ID NO:14)，实施例中表示为5F或HPV18-gRNAE7-9-F，
反义链：5’-GTTGACCTTCTATGTCACGA-3’(SEQ ID NO:15)，实施例中表示为5R或HPV18-gRNAE7-9-R。
可选地，上述互补双链DNA序列中可以在正义链5’端增加碱基序列CACCG，在反义链的5’端增加碱基序列AAAC。这两种序列片段的添加可以方便各个sgRNA表达基因的克隆，比如克隆于表达质粒上。
优选地，上述双靶表达框上第一个sgRNA基因的启动子是人U6启动子；第二个sgRNA基因的启动子是小鼠U6启动子突变体(mU6)，选自SEQ ID NO:16-27。
5’-GAGATTTTTTTGTCGACTCTAGAGATCCGACGCCGCCATCTCTAGGCCCGCGCCGGCCC-3’(SEQID NO:16)，
5’-AACCGGGGCAGGGGAGTAGCCGAGCTTCTCCCACAAGTCTGTGCGAGGGGGCCGGCGCGG-3’(SEQ ID NO:17)，
5’-TCCCCTGCCCCGGTTAATTTGCATATAATATTTCCTAGTAACTATAGAGGCTTAATGTGC-3’(SEQ ID NO:18)，
5’-TAGTATTAAAAAGAACAGATTATCTGTCTTTTATCGCACATTAAGCCTCTATAGTTACTA-3’(SEQ ID NO:19)，
5’-AGACAGATAATCTGTTCTTTTTAATACTAGCTACATTTTACATGATAGGCTTGGATTTCT-3’(SEQ ID NO:20)，
5’-TTTTTTAAAATAATAATTTAGTATTTGTATCTCTTATAGAAATCCAAGCCTATCATGTAAAA-3’(SEQ ID NO:21)，
5’-ATAAGAGATACAAATACTAAATTATTATTTTAAAAAACAGCACAAAAGGAAACTCACCCT-3’(SEQ ID NO:22)，
5’-GCATATTTATAGTCTCAAAACACACAATTACTTTACAGTTAGGGTGAGTTTCCTTTTGTG-3’(SEQ ID NO:23)，
5’-TTGTGTGTTTTGAGACTATAAATATGCATGCGAGAAAAGCCTTGTTTGGTGCATAACTGT-3’(SEQ ID NO:24)，
5’-TAGTAGATTCTGTTTCCAGAGTACTAAAACAAAGTTACCACAGTTATGCACCAAACAAGG-3’(SEQ ID NO:25)，
5’-AGTACTCTGGAAACAGAATCTACTAAAACAAGGCAAAATGCCGTGTTTATCTCGTCAACT-3’(SEQ ID NO:26)，
5’-GGCCAATCCAATCGCTAGCAAAAATCTCGCCAACAAGTTGACGAGATAAACACGGC-3’(SEQ IDNO:27)。
上述双靶表达载体的骨架质粒优选是腺相关病毒AAV，双靶表达框的两端是腺相关病毒(AAV)基因组反向末端重复序列(ITR)。
优选地，上述腺相关病毒基因组反向末端重复序列(ITR)来源于腺相关病毒1、2、5、6、8、9或10型，或来源于修饰过的重组腺相关病毒。
上述CRISPR/Cas9系统中的Cas9可以以酶形式存在、或者以表达载体(即表达质粒)形式存在。
当Cas9以表达载体(即表达质粒)形式存在时，Cas9表达载体的骨架质粒是腺相关病毒AAV。比如Cas9表达载体可以构造成scAAVSaCas9表达载体，其构建方法是：以质粒px602saCas9为模板，分段PCR合成saCas9，克隆于百奥迈科生物技术有限公司的scAAV表达载体。克隆位点是酶切位点EcoR 1，saCas9的表达由CAG启动子驱动。
本发明的第二个目的在于提供上述CRISPR/Cas9系统在制备抗人乳头瘤病毒HPV感染药物中的用途。
优选地，所述药物是宫颈癌治疗药物。
可选地，上述药物是注射剂型、或者用于皮肤给药的透皮吸收剂型。当采用透皮吸收剂型时，本发明作为一种新型的环境卫生保护产品，可以通过皮肤给药有效地清除HPV病毒。
本发明针对HPV亚型16和亚型18的E6/E7癌基因序列，筛选出5种适合于质粒表达、高效靶向E6/E7的sgRNA。体外实验证明，基于这些sgRNA构建的双靶表达载体pAAV-dual-sgRNAs能够在细胞内表达，引导金黄色葡萄球菌来源的核酸酶SaCas9切割E6/E7基因，取得了基因编辑效果。因此本发明的CRISPR/Cas9系统有潜力被开发成一种新型的宫颈癌基因治疗药物。
附图说明
图1是本发明构建的pAAV-dual-sgRNA双靶表达载体的结构示意图。其中图A是针对HPV亚型16的癌基因E6/E7设计的双靶表达框；图B是针对HPV亚型18的癌基因E6E6/E7设计的双靶表达框。sgRNA16-2是SEQ ID NO:1的sgRNA表达基因，sgRNA16-6是SEQ ID NO:2的sgRNA表达基因，sgRNA18-3是SEQ ID NO:3的sgRNA表达基因，sgRNA18-9是SEQ ID NO:5的sgRNA表达基因。
图2是针对HPV亚型16的癌基因E6/E7的sgRNA靶位点功能验证结果柱形图。其中纵坐标是测定的萤火虫荧光素酶/海肾荧光素酶内参比值((DLR ratio)，比值高代表sgRNA活力高，比值低代表sgRNA活力低。横坐标中，PC：萤火虫荧光素酶阳性对照表达载体+海肾荧光素酶内参表达载体；NC：HPV16E6/HPV16E7模板表达载体+海肾荧光素酶内参表达载体，16E6-1、16E6-2、16E6-3：px602HPV16sgRNA/saCas9表达载体，分别加+HPV16E6模板表达载体+海肾荧光素酶内参表达载体；16E7-4、16E7-5、16E7-6、16E7-7：px602HPV16sgRNA/saCas9表达载体，分别加HPV16E7模板表达载体+海肾荧光素酶内参表达载体。
图3是针对HPV亚型18的癌基因E6/E7的sgRNA靶位点功能验证结果柱形图。其中纵坐标是测定的萤火虫荧光素酶/海肾荧光素酶内参比值((DLR ratio)，比值高代表sgRNA活力高，比值低代表sgRNA活力低。横坐标中，PC：萤火虫荧光素酶阳性对照表达载体+海肾荧光素酶内参表达载体；NC：HPV18E6/HPV18E7模板表达载体+海肾荧光素酶内参表达载体；18E6-1、18E6-2、18E6-3、18E6-4、18E6-5、18E6-6：px602HPV18sgRNA/saCas9表达载体，分别加+HPV18E6模板表达载体+海肾荧光素酶内参表达载体；18E7-7、18E7-8、18E7-9：px602HPV18sgRNA/saCas9表达载体，分别加+HPV18 76模板表达载体+海肾荧光素酶内参表达载体。
图4是本发明的pAAV-dual-sgRNA双靶表达载体有效性验证结果柱形图。其中纵坐标是测定的萤火虫荧光素酶/海肾荧光素酶内参比值((DLR ratio)，比值高代表双靶表达载体有效性高，比值低代表双靶表达载体有效性。横坐标中，PC：萤火虫荧光素酶阳性对照表达载体+海肾荧光素酶内参表达载体；NC-16-E6/NC16-E7：HPV16E6/HPV16E7模板表达载体+海肾荧光素酶内参表达载体；NC-18-E6/NC18-E7：HPV18E6/HPV18E7模板表达载体+海肾荧光素酶内参表达载体；16-2/6-E6-scSaCas9：2/6双靶载体+HPV16E6模板载体+scSaCas9表达载体+海肾荧光素酶内参表达载体；16-2/6-E7-scSaCas9：2/6双靶载体+HPV16E7模板载体+scSaCas9表达载体+海肾荧光素酶内参表达载体；18-3/9-E6-scSaCas9：18-3/9双靶载体+HPV18E6模板载体+scSaCas9表达载体+海肾荧光素酶内参表达载体；18-3/9-E7-scSaCas9：18-3/9双靶载体+HPV18E7模板载体+scSaCas9表达载体+海肾荧光素酶内参表达载体。
图5是体外细胞培养E6/E7癌基因模板底物切割的凝胶电泳照片。各条带是，1.293T细胞裂解液(转染16-sgRNA-2/6+saCas9)与HPV16基因模板底物共孵育；2.293T细胞裂解液(转染18-sgRNA-3/8+saCas9)与HPV18基因模板底物共孵育；3.pUC57-HPV16E6E7基因模板底物底物；4.pUC57-HPV18E6E7基因模板底物底物；5.293T细胞裂解液(未转染)与HPV16基因模板底物共孵育；6.293T细胞裂解液(未转染)与HPV16基因模板底物共孵育；M：DNA marker。
图6是流式细胞术检测SiHa/HeLa细胞凋亡情况的照片。其中，正常组(未转染)SiHa细胞凋亡率：4.06％+1.26％；处理组(转染)SiHa细胞凋亡率：20.65％+1.96％；正常组(未转染)Hela细胞凋亡率：3.48％+2.41％；处理组(转染)HeLa细胞凋亡率:4.09％+17.66％。
图7是显示SiHa和HeLa细胞中p53蛋白表达的凝胶电泳照片。其中，图A显示了SiHa细胞中处理组(转染)较对照组(未转染)的p53蛋白表达差异；图B显示了HeLa细胞中处理组(转染)较对照组(未转染)的p53蛋白表达差异；C显示了对应于图A和图B的p53蛋白表达直方图(*P﹤0.05vs.对照组，n＝3)。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
在本文中，有时为了描述简便，会将sgRNA与其编码基因(DNA)名称混用，本领域技术人员应能理解它们在不同描述场合表示不同的物质。例如，sgRNA基因指的是可转录为sgRNA的基因DNA。
在本文中，有时为了描述简便，会将核酸内切酶Cas9比如SaCas9蛋白质名称与其编码基因(DNA)名称混用，本领域技术人员应能理解它们在不同描述场合表示不同的物质。例如，对于SaCas9(基因)，用于描述核酸酶功能或类别时，指的是蛋白质；在作为一种基因描述时，指的是编码该SaCas9的基因，以此类推，这是本领域技术人员容易理解的。
为了描述简便起见，实施例及附图中有时将sgRNA表达载体采用简写的形式，比如16E6-n(n是1-17的自然数)是指靶向HPV亚型16癌基因E6的第n个筛选的sgRNA(表达载体)；18E7-n(n是1-17的自然数)是指靶向HPV亚型16癌基因E7的第n个筛选的sgRNA(表达载体)，以此类推。
术语“双靶载体”或“双靶表达载体”可以互换，它们表示的意思和范围相同。为了描述简便起见，实施例及附图中有时将sgRNA双靶表达载体采用简写的形式，比如2/6双靶载体是指包含筛选的第2个和第6个sgRNA的基因表达载体。
类似地，为了描述简便起见，实施例及附图中有时将CRISPR/Cas9系统也采用简写的形式，比如16-2/6-E7-scSaCas9是指包含靶向HPV亚型16癌基因E7的第2个和第7个sgRNA的双靶载体+HPV16E7模板载体+scSaCas9表达载体(必要时加入海肾荧光素酶内参表达载体)的CRISPR/Cas9系统；18-3/9-E6-scSaCas9是指包含靶向HPV亚型18癌基因E6的第3个和第9个sgRNA的双靶载体+HPV18E6模板载体+scSaCas9表达载体(必要时加入海肾荧光素酶内参表达载体)的CRISPR/Cas9系统，以此类推。
本领域技术人员应理解，sgRNA分子的制备可采用多种方法，比如：化学合成法、体外转录、载体表达RNA、PCR合成RNA表达元件等，这些方法的出现为研究者提供了可选择的空间。
针对HPV亚型16和亚型18的E6/E7癌基因序列，本发明筛选了17对表达sgRNA的互补双链多核苷酸，并克隆于市售表达载体px602。表达载体px602包含有金黄色葡萄球菌的核酸酶SaCas9表达框。通过SSAR(Single Strand Annealing Recombination Assay，单链退火复性重组检测)方法，评判表达的sgRNA引导的SaCas9靶向切割作用。从中筛选出5对活性最高的双链多核苷酸分子，并构建了pAAV-dual-sgRNAs双靶表达载体。
SSAR工作原理是设计荧光素酶报吿基因表达载体，以终止密码子和设计的sgRNA靶点切割序列分隔荧光素酶报吿基因成两个部分，每段含约864bp的同源序列。sgRNA引导的Cas9核酸酶切割双链之间的靶点，导致两个同源序列重组，并引起荧光素酶基因表达。荧光素酶活性平行于sgRNA引导的Cas9核酸酶活性。
基于该原理，发明人合成了4个底物模板：HPV16E6、HPV16E7、HPV18E6和HPV18E7，其模板序列可以被表达的sgRNA识别。将合成的模板序列克隆于荧光素酶报吿基因表达载体，以终止密码子和设计的模板序列分隔荧光素酶报吿基因成两个部分，每段含约1000bp的同源序列。表达的sgRNA引导的Cas9核酸酶切割模板序列双链之间的靶点，导致两个同源序列重组，并引起荧光素酶基因表达，检测本研究筛选出的sgRNA所引导的Cas9核酸酶活性。
本发明中构建了一系列pAAV-dual-sgRNAs双靶表达载体。双靶表达框的两端是腺相关病毒(AAV)基因组反向末端重复序列(ITR)，双靶表达框内的第一个启动子是人U6启动子，第一个sgRNA克隆点是Bsa 1；第二个启动子是合成的变异的小鼠U6启动子(mU6)，第二个sgRNA克隆点是Bbs 1，参加图1。双启动子启动的sgRNA表达包括了所有针对HPV亚型E6/E7癌基因筛选的sgRNA，用以引导来自金黄色葡萄球菌的SaCas9切割E6/E7癌基因。
本发明中构建了构造了scAAVSaCas9表达载体。SaCas9基因序列是3.2kb，较SpCas9小了1kb左右，适合用腺相关病毒(AAV)作为传输载体。scAAVSaCas9表达载体的构建步骤包括：以px602saCas9为模板，分段PCR合成saCas9，克隆于百奥迈科生物技术有限公司的scAAV表达载体。克隆位点是EcoR 1，saCas9的表达由CAG启动子驱动。
为使本发明更明显易懂，兹以优选实施例，并配合附图作详细说明如下。本领域技术人员应当理解，下述实施例仅用于阐明本发明，并非是对本发明进行限制。
实施例
本文中的基因、RNA、载体、PCR引物皆由百奥迈科生物技术有限公司提供或合成。
本文中的分子生物学实验包括质粒构建、酶切、连接、感受态细胞制备、转化、培养基配制等等，主要参照《分子克隆实验指南》(第三版)，J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔(美)编著，黄培堂等译，科学出版社，北京，2002)进行。必要时可以通过简单试验确定具体实验条件。
PCR扩增实验根据质粒或DNA模板供应商提供的反应条件或说明书进行。必要时可以通过简单试验予以调整。
实施例1构建双靶表达载体pAAV-dual-sgRNAs
1.1构建双靶载体pAAVHPV16-2/6
pAAVHPV16-2/6的构建程序包括如下步骤：
1.1.1将合成的sgRNA1(SEQ ID NO:1)表达序列的正义链SEQ ID NO:6和反义链SEQ ID NO:7退火，复性得到双链sgRNA表达链；px602载体用Bsa1内切酶切开，去磷酸化。将复性得到的双链sgRNA表达链克隆到px602载体的Bsa1位点。转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，测序鉴定得到正确的p602-sgRNA1表达载体；
1.1.2以p602-sgRNA1质粒为模板，PCR扩增U6-sgRNA序列，PCR引物5’端加Mlu1克隆点，3’端加Sal1-Nhe1克隆点；
1.1.3将PCR产物亚克隆到具有Mlu1和Nhe1位点的pAAVGFP载体中，获得pAAVsgRNA1载体。
1.1.4基因合成mU6p-Bbs1-tracRNA序列，在5’末端添加Sal1克隆点，在3’末端添加Nhe1克隆点；
1.1.5将mU6p-Bbs1-tracRNA克隆于pAAVsgRNA1载体，克隆位点是Sal1和Nhe1，得到pAAVsgRNA1-mU6载体。
1.1.6按照上述步骤1.1.1类似的方法，对正义链SEQ ID NO:8和反义链SEQ IDNO:9进行退火复性处理，得到sgRNA2(SEQ ID NO:2)的双链表达序列，将sgRNA2表达序列克隆于pAAVsgRNA1-mU6载体的Bbs1位点，获得pAAVsgRNA1-sgRNA2载体。
1.2按照与上述步骤1.1类似的方法，构建其他双靶载体pAAVHPV18-3/9、pAAVHPV18-3/8。
实施例2构建scAAVSaCas9表达载体
构建scAAVSaCas9表达载体的过程包括如下步骤：
以px602saCas9为模板、分段PCR合成saCas9：PCR 1：扩增第1-1587位碱基；PCR 2：扩增第1572-3255位碱基；PCR 3：以PCR 1产物和PCR 2产物为模板，重叠PCR合成全长saCas9。在PCR 3的扩增反应中，在saCas9 5’端引物加EcorR 1克隆位点，3’端引物加TGA终止密码子和EcorR 1克隆位点。
PCR反应所用DNA聚合酶：Pfu，购于美国NEB lab。
saCas9PCR引物如下：
Cas9F-1：5’-ATGGCCCCAAAGAAGAAGCGG-3’；
Cas9-R-1：5’-GCCGGTGGTCCGGATGATTTCC-3’；
Cas9-F-2：5’-CATCCGGACCACCGGCAAAG-3’；
Cas9-R2：5’-CTTTTTCTTTTTTGCCTGGCCGGCC-3’；
Cas9-F-3：5’-GAATTCgccaccATGGCCCCAAAGAAG-3’；
Cas9-R-3：5’-GAATTCTTCACTTTTTCTTTTTTGCCTGGCC-3’。
PCR产物用PB buffer纯化，其中PB buffer，Cat No./ID:19066，购于美国Qiagen公司)。将saCas9全长PCR产物3255bp亚克隆到百奥迈科生物技术有限公司提供的scAAV表达载体。saCas9基因的表达由CAG启动子启动。转化大肠杆菌Stab3感受态细胞，提取质粒，测序鉴定得到表达载体克隆。
实施例3合成底物模板
实施例中使用了多种底物模板，其中，
HPV16E6底物模板序列为：
AGATCTTAACTTTCTGGGTCGCTCCTGTGGGTGCATAACTGTGGTAACTTTCTGGGTTCCACCGACCCCTTATATTATGGAATCTCGAG。
HPV16E7底物模板序列为：
ATGCATGGAGATACACCTACATTGCATGAATATATGTTAGATTTGCAACCAGAGACAACTGATCTCTACTGTTATGAGCAATTAAGTGACAGCTCAGAGGAGGAGGATGAAATAGATGGTCCAGCTGGACAAGCAGAACCGGACAGAGCCCATTACAATATTGTAACCTTTTGTTGCAAGTGTGACTCTACGCTTCGGTTGTGCGTACAAAGCACACACGTAGACATTCGTACTTTGGAAGACCTGTTAATGGGCACACTAGGAATTGTGTGCCCCATCTGTTCCCAGAAACCA。
HPV18E6底物模板序列为：
CAAAGATCTAGCTTGTAGGGTCGCCGTGTTGGATCACCGCTGCCACCATGGCGCGCTTTGCACAGATCAGGTAGCTTGTAGGGTGTGTCTCCATACACAGAGTCTGAATTCCAATGTGTCTCCATACACAGAGTCTCGAGGAT。
HPV18E7底物模板序列为：
CAAAGATCTGCCTGCGGTGCCAGAAACCGTTGAATCTTGTGTTTCTCTGCGTCGTTGGAGTCGTGACATAGAAGGTCAACCGGAATCACCGGGTGTTCAGAAACAGCTGCCACCACGGACACACAAAGGACAGGGTCTCGAGGAT。
3.1构建HPV16E6底物模板序列的方法例如包括下述步骤：
设计并合成sgRNA识别序列sgRNA16E6-1、16E6-2、16E6-3，在5’端加克隆位点BglII，在3’端加克隆位点Xho 1。合成正向和反向引物，退火，复性得到模板双链。SSAR荧光素酶报告基因表达载体来源于百奥迈科生物技术有限公司提供的预切割pSG靶克隆试剂盒(Precut pSG-target Cloning Kit)。该载体设计时，在设计的sgRNA靶点识别序列前端加上终止密码子，使得荧光素酶报吿基因分成两个部分，每段含约864bp的同源序列。当sgRNA引导的Cas9核酸酶切割底物模板的识别靶点时，双链断开，荧光素酶报吿基因两部分同源序列重组，并引起荧光素酶基因表达。荧光素酶活性平行于sgRNA引导的Cas9核酸酶活性。
将合成好的退火复性得到的模板双链克隆于SSAR荧光素酶报告表达载体BglII和Xho1内切酶位点。转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，测序鉴定得到正确的HPV16E6底物模板的荧光素酶报告质粒。
3.2按照与上述步骤3.1类似的方法，构建其他底物模板HPV16E6、HPV16E7、HPV18E6、HPV18E7等。
实施例4sgRNA靶位点功能验证
293T细胞分别共转染1.px602sgRNA/cas9表达载体，2.荧光素酶-模板序列表达载体(pSSAR-template底物表达载体)，3.海肾荧光素酶表达载体(海肾荧光素酶表达为内参)。48小时后收集转染组与对照组细胞裂解液进行实验。参照上海碧云天生物技术有限公司双荧光素酶报告基因检测法，以海肾荧光素酶为内参，测定萤火虫荧光素酶活性。根据萤火虫荧光素酶/海肾荧光素酶比值(DLR ratio)，比较不同样品间sgRNA引导的Cas9核酸酶活性。本研究所设计的17对双链多核苷酸所表达的sgRNA分别靶向HPV亚型16和亚型18的E6/E7癌基因序列，活性检测结果如图2和图3所示。其中，编号为sgRNA16-2和sgRNA16-6的sgRNA对于HPV亚型16的E6/E7癌基因序列显示出较高的作用活性；编号为sgRNA18-3、sgRNA18-8和sgRNA18-9显示出较高的作用活性。
sgRNA16-2、sgRNA16-6、sgRNA18-3、sgRNA18-8和sgRNA18-9的序列分别为SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5。它们的编码基因(双链多核苷酸)的序列分别为：
SEQ ID NO:6(命名为HPV16-gRNAE6-2-F或1F)和
SEQ ID NO:7(命名为HPV16-gRNAE6-2-R或1R)；
SEQ ID NO:8(命名为HPV16-gRNAE7-6-F或2F)和
SEQ ID NO:9(命名为HPV16-gRNAE7-6-R或2R)；
SEQ ID NO:10(命名为HPV18-gRNAE6-3-F或3F)和
SEQ ID NO:11(命名为HPV18-gRNAE6-3-R或3R)；
SEQ ID NO:12(命名为HPV18-gRNAE7-8-F或4F)和
SEQ ID NO:13(命名为HPV18-gRNAE7-8-R或4R)；
SEQ ID NO:14(命名为HPV18-gRNAE7-9-F或5F)和
SEQ ID NO:15(命名为HPV18-gRNAE7-9-R或5R)，
其中的F表示正义链、R表示反义链，这是本领域的惯常表示方法。
实施例5双靶载体pAAVHPV16-2/6、pAAVHPV18-3/9有效性验证
293T细胞分别共转染1.pAAV-dual-sgRNA双靶载体，2.pAAV-SaCas9，3.荧光素酶-模板序列表达载体(pSSAR-template底物表达载体)，4.海肾荧光素酶表达载体(海肾荧光素酶表达作为内参)。48小时后收集转染组与对照组细胞裂解液进行实验。参照上海碧云天生物技术有限公司双荧光素酶报告基因检测法，以海肾荧光素酶为内参，测定萤火虫荧光素酶活性。根据萤火虫荧光素酶/海肾荧光素酶比值(DLR ratio)，双靶载体pAAV-HPV16-2/6、pAAV-HPV18-3/9尤其呈现出靶向HPV亚型16和亚型18E6/E7癌基因序列的显著活性，参见图4。
实施例6体外细胞培养试验检测sgRNA/Cas9切割E6/E7癌基因的活性
E6/E7癌基因的模板底物基因序列通过重叠PCR合成，然后克隆到pUC57载体。实验前用EcoR1内切酶线性化基因模板制备底物。将筛选出的靶向E6/E7活性高的sgRNA表达载体pAAV-HPV16-2/6、pAAV-HPV18-3/9和SaCas9表达载体共转染293T细胞。48h后收集转染细胞(收集未染细胞作为对照)，制备细胞裂解液。将细胞裂解液与HPV亚型16和亚型18的E6-E7癌基因模板底物37℃共孵育30min后，凝胶电泳发现双靶载体pAAV-HPV16-2/6、pAAV-HPV18-3/8成功地切割了底物，切除片段约600bp，证实了我们设计并筛选的sgRNA引导的Cas9核酸酶可以有效地切割E6/E7致癌基因，如图5所示。
实施例7流式细胞仪检测细胞凋亡
取对数期生长的SiHa及HeLa细胞进行6孔板培养，生长密度达70％进行双靶质粒px-602-HPV16-sgRNA2/6或px602-HPV18-sgRNA3/8共转染。转染48h后，用不含EDTA的胰酶消化离心收集细胞，PBS洗两次，加入500μl Binding Buffer悬浮细胞，加入5μl AnnexinV-FITC混匀后，加入5μl Propidiumlodide混匀，室温避光反应5～15min，样品在1h内用流式细胞仪检测：激发波长Ex＝488nm，发射波长Em＝530nm。实验结果如图6所示。可以看出，处理组(转染组)SiHa细胞的凋亡率(+20.65％+1.96％)明显高于正常组(未转染组)细胞(4.06％+1.26％)；处理组(转染组)HeLa细胞的凋亡率(17.66％+4.09％)也明显高于正常组(未转染组)细胞(3.48％+2.41％)，证明在sgRNA引导的SaCas9靶向切断了E6、E7基因，加速SiHa和HeLa宫颈癌细胞凋亡。
实施例8Western Blot实验
取对数期生长的SiHa及HeLa细胞进行6孔板培养，生长密度达70％进行进行双靶质粒共转染：px-602-HPV16-sgRNA2/6或px602-HPV18-sgRNA3/8。转染48h后弃培养基，PBS洗涤，加入蛋白裂解液40μl/孔，冰上裂解10min，加入10x蛋白上样loading buffer，煮沸10min。每孔加入10μl目的蛋白样品，SDS-PAGE电泳后湿转法转移到PVDF膜上。5％脱脂奶粉溶液(5g伊利脱脂奶粉溶于100ml TBST)孵育封闭2h，加入一抗孵育过夜，TBST洗涤3次，二抗孵育2h，TBST洗涤后进行显影拍照。实验发现，px602-HPV16-sgRNA2/6或px602-HPV18-sgRNA3/8双靶质粒瞬时转染48h后，相对于内参GAPDH，处理组(转染)SiHa及HeLa细胞,，对比未转染组，p53蛋白表达量显著增高(P<0.05)，参见图7。
由上述实验可见，本发明筛选的5种sgRNA能够靶向HPV亚型16和/或亚型18的E6/E7癌基因，在细胞内高效地引导核酸酶SaCas9切割E6/E7，并且双靶表达载体pAAV-dual-sgRNAs能够在细胞内表达，引导SaCas9对E6/E7基因实施基因编辑，达到清除HPV病毒的效果。因此本发明的CRISPR/Cas9系统有潜力应用于抑制人乳头瘤病毒癌基因E6/E7表达，并被开发成一种新型的宫颈癌基因治疗药物。
序列表
<110> 百奥迈科生物技术有限公司
<120> 靶向HPV亚型16/18癌基因E6/E7的CRISPR/Cas9系统
<130> SHPI1811284
<160> 27
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列()
<400> 1
uuucaauggu gucaauacgu 20
<210> 2
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列()
<400> 2
gcgaagccaa cacgcauguu u 21
<210> 3
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列()
<400> 3
guucgaugga cuagacacgu 20
<210> 4
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列()
<400> 4
cgucgacaaa gacuuguggg 20
<210> 5
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列()
<400> 5
caacuggaag auacagugcu 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 6
tgcataactg tggtaacttt 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 7
aaagttacca cagttatgca 20
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 8
tttgtacgca caaccgaagc g 21
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 9
cgcttcggtt gtgcgtacaa a 21
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 10
tgcacagatc aggtagcttg 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 11
caagctacct gatctgtgca 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 12
gggtgttcag aaacagctgc 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 13
gcagctgttt ctgaacaccc 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 14
tcgtgacata gaaggtcaac 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 15
gttgaccttc tatgtcacga 20
<210> 16
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 16
gagatttttt tgtcgactct agagatccga cgccgccatc tctaggcccg cgccggccc 59
<210> 17
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 17
aaccggggca ggggagtagc cgagcttctc ccacaagtct gtgcgagggg gccggcgcgg 60
<210> 18
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 18
tcccctgccc cggttaattt gcatataata tttcctagta actatagagg cttaatgtgc 60
<210> 19
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 19
tagtattaaa aagaacagat tatctgtctt ttatcgcaca ttaagcctct atagttacta 60
<210> 20
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 20
agacagataa tctgttcttt ttaatactag ctacatttta catgataggc ttggatttct 60
<210> 21
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 21
ttttttaaaa taataattta gtatttgtat ctcttataga aatccaagcc tatcatgtaa 60
aa 62
<210> 22
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 22
ataagagata caaatactaa attattattt taaaaaacag cacaaaagga aactcaccct 60
<210> 23
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 23
gcatatttat agtctcaaaa cacacaatta ctttacagtt agggtgagtt tccttttgtg 60
<210> 24
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 24
ttgtgtgttt tgagactata aatatgcatg cgagaaaagc cttgtttggt gcataactgt 60
<210> 25
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 25
tagtagattc tgtttccaga gtactaaaac aaagttacca cagttatgca ccaaacaagg 60
<210> 26
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 26
agtactctgg aaacagaatc tactaaaaca aggcaaaatg ccgtgtttat ctcgtcaact 60
<210> 27
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 27
ggccaatcca atcgctagca aaaatctcgc caacaagttg acgagataaa cacggc 56
Claims (10)
1.一种用于对人乳头瘤病毒HPV亚型16/18的癌基因E6/E7进行基因编辑的CRISPR/Cas9系统，其包含核酸内切酶Cas9和分别靶向癌基因E6/E7的两种sgRNA，所述sgRNA是SEQID NO:1和SEQ ID NO:2：
5’-UUUCAAUGGUGUCAAUACGU-3’(SEQ ID NO:1)，
5’-GCGAAGCCAACACGCAUGUUU-3’(SEQ ID NO:2)；或者
所述sgRNA是选自SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5中的任意两种：
5’-GUUCGAUGGACUAGACACGU-3’(SEQ ID NO:3)，
5’-CGUCGACAAAGACUUGUGGG-3’(SEQ ID NO:4)，
5’-CAACUGGAAGAUACAGUGCU-3’(SEQ ID NO:5)。
2.如权利要求1所述的CRISPR/Cas9系统，其特征在于，所述Cas9是来自金黄色葡萄球菌的SaCas9，识别的PAM为5’-NNGRRT-3’，其中N指A、T、C、G；R指A、G。
3.如权利要求1所述的CRISPR/Cas9系统，其特征在于，所述sgRNA以单链RNA分子形式存在、或者以表达载体形式存在。
4.如权利要求3所述的CRISPR/Cas9系统，其特征在于，当sgRNA以表达载体形式存在时，两种sgRNA即SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2被克隆在同一个表达载体上，形成双靶表达载体；或者
SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5中的任意两种被克隆在同一个表达载体上，形成双靶表达载体。
5.如权利要求4所述的CRISPR/Cas9系统，其特征在于，sgRNA表达载体上的sgRNA表达基因是互补双链DNA序列，其中
SEQ ID NO:1的表达基因由如下正义链和反义链组成：
正义链：5’-TGCATAACTGTGGTAACTTT-3’(SEQ ID NO:6)，
反义链：5’-AAAGTTACCACAGTTATGCA-3’(SEQ ID NO:7)；
SEQ ID NO:2的表达基因由如下正义链和反义链组成：
正义链：5’-TTTGTACGCACAACCGAAGCG-3’(SEQ ID NO:8)，
反义链：5’-CGCTTCGGTTGTGCGTACAAA-3’(SEQ ID NO:9)；
SEQ ID NO:3的表达基因由如下正义链和反义链组成：
正义链：5’-TGCACAGATCAGGTAGCTTG-3’(SEQ ID NO:10)，
反义链：5’-CAAGCTACCTGATCTGTGCA-3’(SEQ ID NO:11)；
SEQ ID NO:4的表达基因由如下正义链和反义链组成：
正义链：5’-GGGTGTTCAGAAACAGCTGC-3’(SEQ ID NO:12)，
反义链：5’-GCAGCTGTTTCTGAACACCC-3’(SEQ ID NO:13)；
SEQ ID NO:5的表达基因由如下正义链和反义链组成：
正义链：5’-TCGTGACATAGAAGGTCAAC-3’(SEQ ID NO:14)，
反义链：5’-GTTGACCTTCTATGTCACGA-3’(SEQ ID NO:15)。
6.如权利要求5所述的CRISPR/Cas9系统，其特征在于，所述双靶表达框上第一个sgRNA基因的启动子是人U6启动子；第二个sgRNA基因的启动子是小鼠U6启动子突变体mU6，选自SEQ ID NO:16-27。
7.如权利要求4所述的CRISPR/Cas9系统，其特征在于，所述双靶表达载体的骨架质粒是腺相关病毒AAV，双靶表达框的两端是腺相关病毒基因组反向末端重复序列ITR。
8.如权利要求1所述的CRISPR/Cas9系统，其特征在于，所述Cas9以酶形式存在、或者以表达载体形式存在。
9.如权利要求8所述的CRISPR/Cas9系统，其特征在于，当Cas9以表达载体形式存在时，Cas9表达载体的骨架质粒是腺相关病毒AAV。
10.如权利要求1-9中任一项所述的CRISPR/Cas9系统在制备宫颈癌治疗药物中的用途。
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| CN107828874A (zh) * | 2017-11-20 | 2018-03-23 | 东南大学 | 一种基于crispr的dna检测和分型方法及其应用 |
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