CN103667348A - 一种双标记重组家蚕杆状病毒及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种双标记重组家蚕杆状病毒及其制备方法和应用，属于基因工程技术领域。该病毒含有杆状病毒囊膜蛋白gp64信号肽SP基因、增强型绿色荧光蛋白EGFP基因和杆状病毒囊膜蛋白gp64跨膜域TM基因形成的串联基因SP-EGFP-TM，以及杆状病毒衣壳蛋白VP39基因和红色荧光蛋白RFP基因形成的串联基因RFP-VP39或VP39-RFP。该病毒的制备方法是将两段串联基因插入到病毒表达载体的多克隆位点，构建成重组杆状病毒转座载体，再转化大肠杆菌感受态细胞，经过蓝白斑筛选和PCR鉴定后，得到该病毒。该病毒可作为模式生物用于研究家蚕脓病。
Description
技术领域
本发明涉及生物学基因工程技术领域，具体涉及一种双标记重组家蚕杆状病毒及其制备方法和应用。
背景技术
杆状病毒是一类在自然界中专一性感染节肢动物的DNA病毒，病毒粒子呈杆状，基因组为双链环状DNA分子，DNA以超螺旋形式压缩包装在杆状衣壳内，大小在90～180kb之间。家蚕核型多角体病毒是家蚕脓病的病原体，对于杆状病毒的研究大多数集中在苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（AcMNPV），而对于家蚕核型多角体病毒（BmNPV，又称家蚕杆状病毒）的研究的报道甚少，所以开展家蚕核型多角体病毒的侵染机制的研究对于防治家蚕脓病具有重要的意义。
杆状病毒表面展示系统是在对病毒基因组结构和功能深刻认识的基础上发展起来的。杆状病毒表面展示系统以杆状病毒为载体，外源基因片段插入到病毒衣壳蛋白的信号肽与成熟蛋白之间，与衣壳蛋白融合表达或与特异性的锚定部位结合表达。融合蛋白经过真核细胞内质网加工后，信号肽被切除，形成N端融合蛋白，借助杆状病毒稳定地表达并展示于感染细胞或病毒粒子的表面，筛选得到表达有特异目的蛋白的杆状病毒粒子。外源蛋白或多肽也可与杆状病毒的囊膜糖蛋白融合，利用杆状病毒作为载体而在感染细胞的表面或病毒粒子的囊膜上获得有效的展示。在杆状病毒表面展示中，用于与外源蛋白发生融合的囊膜糖蛋白gp64是AcMNPV、BmNPV等Ⅰ型出芽病毒特有的结构蛋白，与二硫键相连以同源二聚体、三聚体或四聚体的方式存在于囊膜内及被感染细胞或病毒粒子的表面，介导病毒和昆虫细胞的融合与侵染过程。AcMNPV中gp64基因全长约512bp，是Ⅰ型跨膜糖蛋白，属于磷酸糖基化蛋白，含有2个高度疏水区，N端为带有一个内质网加工的信号肽序列，近C端是一个疏水的跨膜结构域(transmembrane domain,TM)，与TM相连的是亲水性结构域，可以把病毒囊膜内的糖蛋白与细胞膜内的糖蛋白连接在一起。外源蛋白在信号肽的C端与gp64的N端发生融合，融合蛋白经过真核细胞内质网加工后，信号肽被切除，形成的N端融合蛋白可稳定地在杆状病毒表面进行表达，形成杆状病毒“假病毒”。另外，也有将目的蛋白融合于gp64的膜锚定结构域中，即将目的基因插入到gp64基因的ORF中，这种做法虽然破坏了gp64的完整性，但可以实现目的蛋白的表达展示。
发明内容
本发明要解决的技术问题是现有技术中还没有一种模式生物可以用于研究核型多角体病毒对宿主的侵入机制及后续防治该病毒药物的研制。
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种双标记重组家蚕杆状病毒，该病毒含有杆状病毒囊膜蛋白gp64信号肽SP基因、增强型绿色荧光蛋白EGFP基因和杆状病毒囊膜蛋白gp64跨膜域TM基因形成的串联基因SP-EGFP-TM，以及杆状病毒衣壳蛋白VP39基因和红色荧光蛋白RFP基因形成的串联基因RFP-VP39或VP39-RFP。
优选地，所述串联基因SP-EGFP-TM的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述串联基因RFP-VP39的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述VP39-RFP的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
上述双标记重组家蚕杆状病毒的制备方法，步骤如下：
（1）依次串联杆状病毒囊膜蛋白gp64信号肽SP基因、增强型绿色荧光蛋白EGFP基因和杆状病毒囊膜蛋白gp64跨膜域TM基因，形成串联基因SP-EGFP-TM；串联杆状病毒衣壳蛋白VP39基因序列和红色荧光蛋白RFP基因序列，形成串联基因RFP-VP39或VP39-RFP；
（2）将串联基因SP-EGFP-TM和RFP-VP39，或SP-EGFP-TM和VP39-RFP插入到病毒表达载体的多克隆位点，构建成重组杆状病毒转座载体；
（3）重组杆状病毒转座载体转化大肠杆菌感受态细胞，在含有卡那霉素、庆大霉素、四环素、X-gal和IPTG的LB培养基上培养40~48小时，挑取白斑，培养20~24小时后抽提基因组进行PCR鉴定，鉴定正确的为双标记重组家蚕杆状病毒。
优选地，步骤（1）杆状病毒囊膜蛋白gp64信号肽SP基因的扩增引物为SEQ ID NO:4~5，杆状病毒囊膜蛋白gp64跨膜域TM基因的扩增引物为SEQ IDNO:6~7，增强型绿色荧光蛋白EGFP基因的扩增引物为SEQ ID NO:8~9，红色荧光蛋白RFP基因的扩增引物为SEQ ID NO:10~11或SEQ ID NO:12~13，杆状病毒衣壳蛋白VP39基因的扩增引物为SEQ ID NO:14~15或SEQ IDNO:16~17。
优选地，步骤（2）所述病毒表达载体为pFastBac-Dual。
优选地，步骤（2）所述串联基因SP-EGFP-TM插入到载体pFastBac-Dual的Pp10启动子后的多克隆位点；串联基因RFP-VP39或VP39-RFP插入到载体pFastBac-Dual的PpH启动子后的多克隆位点。
优选地，串联基因SP-EGFP-TM是通过Sma Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切位点插入的；串联基因RFP-VP39或VP39-RFP是通过BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切位点插入的。
优选地，步骤（2）所述大肠杆菌为DH10Bac。
优选地，步骤（3）所述PCR的扩增引物如SEQ ID NO:18~19所示。
本发明所述的双标记重组家蚕杆状病毒作为家蚕核型多角体病毒模式生物的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
GP64是野生型家蚕杆状病毒的囊膜糖蛋白，野生型的病毒将GP64蛋白表面展示在囊膜上，本发明改造的病毒继续用GP64的信号肽（SP）和跨膜区（TM），中间的展示蛋白将原先的GP64改成绿色荧光标记蛋白EGFP，这样就将EGFP表面展示在囊膜上。同理，红色荧光蛋白RFP被表达在核衣壳上。
病毒株Bmgp64EGFP-RFPVP39基因组与野生BmNPV基因组的区别在于两个转座子Tn7L、Tn7R之间的基因序列不同，在本发明的重组载体pFastBac-Dual-gp64-EGFP-RFP-VP39中，转座子Tn7L、Tn7R之间的基因序列与野生BmNPV的转座子Tn7L、Tn7R之间的基因序列发生了同源重组，那么，本发明的目的基因SP-EGFP-TM和RFP-VP39（或VP39-RFP）就交换到了野生BmNPV基因组上，产生的病毒就是带有荧光蛋白标记的重组病毒。
本发明的重组病毒是利用双色荧光蛋白对病毒衣壳及囊膜蛋白进行荧光标记，能够更清楚地观察到杆状病毒侵染复制的全过程，采用全球先进的显微设备（莱卡三通道激光共聚焦显微镜，电子显微镜）对病毒的入侵，表达，组装进行实时监控，更直观的理解病毒的侵染机制。可以通过该病毒研究其他展示蛋白在宿主细胞中的表达、加工展示过程情况。
附图说明
图1是重组转移质粒pFastBac-Dual-gp64-EGFP-RFP-VP39结构示意图。
图2是原始质粒pFastBac-Dual图谱示意图。
图3是串联基因SP-EGFP-TM的重叠及鉴定结果，其中左图M：DNA标准分子量，1：SP-EGFP重叠基因，2：SP-EGFP-TM重叠基因；右图M：DNA标准分子量，1：SP-EGFP-TM的PCR扩增产物，2：pFastBac-Dual-SP-EGFP-TM的双酶切产物。
图4是VP39与RFP的重叠及鉴定结果，M为DNA标准分子量，其中左图1：使用引物对VP39.1扩增所得的VP39产物，2：使用引物对RFP.1扩增所得的RFP产物，3：使用引物对RFP.2产物，4：VP39.2PCR产物；中间图中1：VP39-RFP重叠基因，2：RFP-VP39重叠基因；右图中1:RFP-VP39重叠基因PCR扩增产物，2：RFP-VP39重叠基因双酶切产物。
图5是家蚕重组杆状病毒株Bmgp64EGFP-RFPVP39激光共聚焦显微图，其中红色显示为红色荧光蛋白RFP标记的杆状病毒衣壳蛋白VP39，绿色显示为增强型绿色荧光蛋白EGFP标记的杆状病毒囊膜蛋白gp64跨膜域TM。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
生物材料来源：pFastBac-Dual载体、大肠杆菌TG1感受态细胞和大肠杆菌DH10Bac购自Invitrogen公司；野生家蚕杆状病毒BmNPV、含EGFP的重组载体、含有红色荧光蛋白RFP基因的质粒均由本实验室保存。
因gp64信号肽（SP）基因序列（SEQ ID NO:20）、gp64跨膜区（TM）基因序列（SEQ ID NO:21）、杆状病毒衣壳蛋白VP39基因（SEQ ID NO:22）、EGFP蛋白的基因（SEQ ID NO:23）和RFP的基因（SEQ ID NO:24）均为现有已知基因序列，所以本发明使用的提供上述基因的载体如野生家蚕杆状病毒BmNPV、含EGFP的重组载体何含有红色荧光蛋白RFP基因的质粒可以更换成任何其他含有上述基因的生物材料。
实施例1家蚕重组杆状病毒株Bmgp64EGFP-RFPVP39的制备
（1）gp64信号肽（SP）基因的扩增
以野生家蚕杆状病毒BmNPV的基因组为模板，分别用引物P1、P2进行PCR，扩增gp64的信号肽（SP）基因序列。PCR反应参数设为：98℃预变性5min，98℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环，72℃总延伸5min。
P1:ACACCCGGGATGGTAGGCGCTATTG（SEQ ID NO:4）；
P2:CCTCGCCCTTGCTCACCGCCGCAAAGGCAGAATG（SEQ ID NO:5）。
反应体系如下：
待反应结束后，电泳鉴定扩增片段，同时切胶回收目的片段。
（2）gp64跨膜区（TM）基因的扩增
以野生家蚕杆状病毒BmNPV的基因组为模板，用引物P3、P4进行PCR，扩增gp64的跨膜区（TM）基因序列。PCR反应参数设为：98℃预变性5min，98℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环，72℃总延伸5min。
P3:CGAGCTGTACAAGATGGCTGAAGGCGAATTGGC（SEQ ID NO:6）；
P4:CTGCTCGAGTTAATATTGTCTACTATTACGG（SEQ ID NO:7）。
待反应结束后，电泳鉴定扩增片段，同时切胶回收目的片段。
（3）EGFP的基因片段扩增
以本实验室构建的含EGFP的重组载体为模板（EGFP蛋白基因序列为已知序列，所以也可以使用其它包含EGFP蛋白基因序列的载体或细胞等，此处为了方便，使用本实验室构建的重组载体），P5和P6为引物进行PCR扩增，PCR反应参数设为：98℃预变性5min，98℃变性30s，63℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环，72℃总延伸5min。
P5:TGCCTTTGCGGCGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC（SEQ ID NO:8）；
P6:ATTCGCCTTCAGCCATCTTGTACAGCTCGTCC（SEQ ID NO:9）。
待反应结束后，电泳鉴定扩增片段，同时切胶回收目的片段。
（4）SP基因与EGFP基因的重叠延伸PCR
取回收的SP基因扩增产物和回收的EGFP基因扩增产物，加入到PCR管，不加引物（由于引物设计时，各自扩增出来的产物有一段序列是重叠的，两产物可以互为引物互为模板），直接进行重叠延伸PCR，PCR反应参数设为：98℃预变性5min，98℃变性30s，63℃退火30s，72℃延伸30s，25个循环，72℃总延伸5min。
待反应结束后，走电泳鉴定，同时切胶回收重叠片段SP-EGFP（少量），再以重叠片段SP-EGFP为模板，以P1为上游引物，P6为下游引物，扩增重叠片段SP-EGFP，PCR反应参数设为：98℃预变性5min，98℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环，72℃总延伸5min。
待反应结束后，电泳鉴定扩增片段，同时切胶回收目的片段SP-EGFP。
（5）串联片段SP-EGFP与TM的重叠延伸PCR
取串联片段SP-EGFP的回收产物和TM基因的回收产物加入PCR管，不加引物（理由同上），进行重叠延伸PCR，PCR参数设为：98℃预变性5min，98℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸30s，25个循环，72℃总延伸5min。
待反应结束后，走电泳鉴定，同时切胶回收重叠片段SP-EGFP-TM（少量），再以重叠片段SP-EGFP-TM为模板，以P1为上游引物，P4为下游引物，扩增重叠片段SP-EGFP-TM，PCR反应参数设为：98℃预变性5min，98℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环，72℃总延伸5min。
待反应结束后，走电泳鉴定，同时切胶回收重叠片段SP-EGFP-TM。
（6）重组转移质粒pFastBac-Dual-gp64-EGFP构建
将上述PCR扩增获得的重叠片段SP-EGFP-TM通过限制性内切酶Sma Ⅰ/Xho Ⅰ（购自Fermentas公司）双酶切插入pFastBac-Dual载体（购自Invitrogen公司）的Pp10启动子后的多克隆位点的上下游两端，构建成重组的杆状病毒表面展示载体pFastBac-Dual-gp64-EGFP。
反应体系如下：
水浴锅37℃酶切30min，酶切产物用电泳鉴定，载体质粒和目的片段各自切胶回收，连接，转化大肠杆菌TG1感受态细胞，在含有氨苄霉素，庆大霉素的LB培养板上培养，37℃倒置培养12小时，挑斑，摇菌8小时，抽提质粒鉴定。
（7）RFP基因的扩增
以本实验室构建的含有红色荧光蛋白RFP基因的质粒为模板（RFP基因为已知，可以选用任何含有该基因的生物材料例如载体或细胞作为模板），P7和P8为引物进行PCR扩增，PCR反应参数设为：98℃预变性5min，98℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环，72℃总延伸5min。
P7:ACTCGGATCCATGGTGCGCTCCTC(SEQ ID NO:10)；
P8:CTAGCGCCATCGATCCTCCTCCTCCCAGGAACAGGTGG(SEQ IDNO:11)。
待反应结束后，走电泳鉴定，结果见图4左图泳道3，同时切胶回收目的片段RFP。
该步骤RFP基因的扩增还可以使用以下引物对RFP.1（P9和P10）：
P9：TGTAGCCGCCGGAGGAGGAGGAGGATCGATGGTGCGCTCC（SEQID NO:12）；
P10：GTGGACAAGGACATCCTTAAGACGC（SEQ ID NO:13）。
所得扩增产物的电泳结果如图4左图的泳道2。
（10）VP39基因的扩增
以野生家蚕杆状病毒BmNPV的基因组为模板，P11和P12为引物，扩增杆状病毒衣壳蛋白VP39基因序列。PCR反应参数设为：98℃预变性5min，98℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环，72℃总延伸5min。
P11:TGTTCCTGGGAGGAGGAGGATCGATGGCGCTAGTGC(SEQ ID NO:14)；
P12:CCTGAATTCTTAGGCGGCTACACTT(SEQ ID NO:15)。
待反应结束后，走电泳鉴定，结果见图4左图泳道4，同时切胶回收目的片段VP39。
该步骤VP39基因的扩增还可以使用以下引物对VP39.1(P13和P14)：
P13：ATCAGGATCC ATGGCGCTAGTGC（SEQ ID NO:16）；
P14：GAGCGCACCATCGATCCTCCTCCTCCGGCGGCTACACTTCCA CTTG（SEQ ID NO:17）。
所得扩增产物的电泳结果如图4左图的泳道1。
（11）RFP基因与VP39基因重叠延伸PCR
取回收片段RFP和VP39加入PCR管，不加引物（由于引物设计时，各自扩增出来的产物有一段序列是重叠的，两产物可以互为引物互为模板），进行重叠延伸PCR，PCR反应参数设为：98℃预变性5min，98℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸30s，25个循环，72℃总延伸5min。
待反应结束后，走电泳鉴定，同时切胶回收重叠片段RFP-VP39（少量），再以重叠片段RFP-VP39为模板，以P7为上游引物，P12为下游引物，扩增重叠片段RFP-VP39。PCR反应参数设为：98℃预变性5min，98℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环，72℃总延伸5min。
待反应结束后，走电泳鉴定，同时切胶回收重叠片段RFP-VP39。
使用引物对RFP.1和VP39.1所得的产物RFP和VP39，因为引物设计时已经添加了重叠部分，因此可以在不添加引物的情况下进行重叠延伸PCR，所得产物为VP39-RFP，扩增重叠片段VP39-RFP可以使用P13为上游引物，P10为下游引物。
（12）重组转移质粒pFastBac-Dual-gp64-EGFP-RFP-VP39的构建
将上述PCR扩增获得的重叠片段RFP-VP39通过酶切位点BamH Ⅰ/EcoRⅠ双酶切插入重组载体pFastBac-Dual-gp64-EGFP的PPH启动子后的多克隆位点上下游两端，构建成重组的杆状病毒转座载体pFastBac-Dual-gp64-EGFP-RFP-VP39。
反应体系：
水浴锅37℃酶切30min，电泳鉴定，载体和目的片段各自切胶回收，连接，转化大肠杆菌TG1感受态细胞，在含有氨苄霉素，庆大霉素的LB培养板上培养，37℃倒置培养12小时，挑斑，摇菌8小时，抽提质粒鉴定。
重叠片段VP39-RFP也以酶切位点BamH Ⅰ/EcoR Ⅰ双酶切插入重组载体pFastBac-Dual-gp64-EGFP的PPH启动子后的多克隆位点上下游两端，构建方式同RFP-VP39，此处不再重复说明，构建成的质粒命名为pFastBac-Dual-gp64-EGFP-VP39-RFP。
（13）家蚕重组杆状病毒Bmgp64EGFP-RFPVP39的获得
鉴定成功的重组转移质粒pFastBac-Dual-gp64-EGFP-RFP-VP39转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞，在含有卡那霉素、庆大霉素、四环素、X-gal和IPTG的LB培养板上进行蓝白斑筛选，避光培养40~48小时后挑取白斑，培养20~24小时后用异丙醇抽提重组杆状病毒基因组，并用M13通用引物（M13上游引物序列：CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC<SEQ ID NO:18>；M13下游引物序列：CAGGAAACAGCTATGACC<SEQ ID NO:19>）进行PCR鉴定。鉴定成功的重组杆状病毒基因组通过脂质体介导法转染家蚕BmN细胞（购自Invitrogen公司），发病后（显微镜观察）获得一代病毒悬液，4℃保存，提取病毒基因组用M13通用引物鉴定，获得所述家蚕重组杆状病毒株Bmgp64EGFP-RFPVP39。
重组转移质粒pFastBac-Dual-gp64-EGFP-VP39-RFP经过上述转化、筛选、转染步骤也可以得到重组家蚕病毒，方法同上。所得病毒命名为Bmgp64EGFP-VP39RFP。
实施例2家蚕重组杆状病毒株Bmgp64EGFP-RFPVP39作为模式生物的应用
家蚕重组杆状病毒株Bmgp64EGFP-RFPVP39侵染细胞前，由于其囊膜表面展示绿色荧光蛋白，衣壳上展示了红色荧光蛋白在激光共聚焦显微镜下可以同时观察到红、绿色荧光，侵入细胞时，其囊膜与细胞膜发生融合，核衣壳进入细胞，可以继续观察红色荧光从而观察病毒核衣壳走向，直至进入细胞核内的整个侵染途径和过程。（参见图5）。
病毒Bmgp64EGFP-VP39RFP与Bmgp64EGFP-RFPVP39具有同样的功能，此处不再重复说明具体实验过程。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 天津耀宇生物技术有限公司
<120> 一种双标记重组家蚕杆状病毒及其制备方法和应用
<130>
<160> 24
<170> PatentIn version 3.3
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gacgtaaacg gccacaagtt cagcgtgtcc ggcgagggcg agggcgatgc cacctacggc 180
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gtgaccaccc tgacctacgg cgtgcagtgc ttcagccgct accccgacca catgaagcag 300
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aaggacgacg gcaactacaa gacccgcgcc gaggtgaagt tcgagggcga caccctggtg 420
aaccgcatcg agctgaaggg catcgacttc aaggaggacg gcaacatcct ggggcacaag 480
ctggagtaca actacaacag ccacaacgtc tatatcatgg ccgacaagca gaagaacggc 540
atcaaggtga acttcaagat ccgccacaac atcgaggacg gcagcgtgca gctcgccgac 600
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tattaa 906
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<213> 人工序列
<400> 7
ctgctcgagt taatattgtc tactattacg g 31
<210> 8
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
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<210> 9
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
attcgccttc agccatcttg tacagctcgt cc 32
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
actcggatcc atggtgcgct cctc 24
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<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
ctagcgccat cgatcctcct cctcccagga acaggtgg 38
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
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tgttcctggg aggaggagga tcgatggcgc tagtgc 36
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<213> 人工序列
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cctgaattct taggcggcta cactt 25
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
cgccagggtt ttcccagtca cgac 24
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<212> DNA
<213> 家蚕杆状病毒
<400> 20
atggtaggcg ctattgtttt atacgtgctt ttggcggcgg cgcattctgc ctttgcggcg 60
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<212> DNA
<213> 家蚕杆状病毒
<400> 21
atggctgaag gcgaattggc cgccaaattg acttcgttca tgtttggtca tgtagccact 60
tttgtaattg tatttattgt aattttattt ttgtactgta tggttagaaa ccgtaatagt 120
agacaatatt aa 132
<210> 22
<211> 1053
<212> DNA
<213> 家蚕杆状病毒
<400> 22
atggcgctag tgcccgtggg tatggcgccg cgacaaatga gagttaaccg ctgcattttc 60
tcgtccatcg tgtcgttcga cgcgtgcata acatacaagt caccgtgttc gcccgacgcg 120
tatcatgacg atggatggtt tatctgcaac agccacctca taaaacgttt taaaatgtca 180
aaaatggttt tgcccatttt cgacgaagac gacaatcaat tcaaaatgac gatcgctagg 240
catttagttg gaaataaaga aaggggtatc aagcgaattt taattccaag cgcagccaat 300
taccaagagg tgtttaatct aaacagtatg atgcaagccg aacagctaat ctttcatttg 360
atatataaca acgaagcggc ggttaacgtt atatgcgaca atctaaaata taccgaaggt 420
ttcacaagcg gcacgcaacg cgttatacac agcgtttacg caactacaag aagcatccta 480
gacaccacaa acccgaacac gttttgttcg cgggtgtcgc gcgacgaatt gcgttttttt 540
gacgtgacca acgcccgaac gggtcgaggt ggtgttggcg atcaattatt taacaattac 600
agtggatttt tgcaaaattt gattcgacgc gcagtagcgc ccgagtactt gcaaatcgac 660
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agtcaaccca atcgtttgca aattagaaac gttttgaaat ttgaaggcga cacacgtgag 840
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taccaaataa ttaattcaga aaacaacttt ttgcgaaacg actttatatc aagagcaaat 960
ccgaacgcta ctttgggcgg cggcgtcggc gcactggcag gtcctgcgcc tggtgttgtt 1020
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60
ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120
ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180
ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240
cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300
ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360
gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420
aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480
ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540
gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600
tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
atggtgcgct cctccaagaa cgtcatcaag gagttcatgc gcttcaaggt gcgcatggag 60
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ggccacaaca ccgtgaagct gaaggtgacc aagggcggcc ccctgccctt cgcctgggac 180
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gacatcacct cccacaacga ggactacacc atcgtggagc agtacgagcg caccgagggc 660
cgccaccacc tgttcctgta g 681
Claims (10)
1.一种双标记重组家蚕杆状病毒，其特征在于，该病毒含有杆状病毒囊膜蛋白gp64信号肽SP基因、增强型绿色荧光蛋白EGFP基因和杆状病毒囊膜蛋白gp64跨膜域TM基因形成的串联基因SP-EGFP-TM，以及杆状病毒衣壳蛋白VP39基因和红色荧光蛋白RFP基因形成的串联基因RFP-VP39或VP39-RFP。
2.根据权利要求1所述的双标记重组家蚕杆状病毒，其特征在于，所述串联基因SP-EGFP-TM的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述串联基因RFP-VP39的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述VP39-RFP的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
3.权利要求1或2所述的双标记重组家蚕杆状病毒的制备方法，其特征在于，步骤如下：
（1）依次串联杆状病毒囊膜蛋白gp64信号肽SP基因、增强型绿色荧光蛋白EGFP基因和杆状病毒囊膜蛋白gp64跨膜域TM基因，形成串联基因SP-EGFP-TM；串联杆状病毒衣壳蛋白VP39基因序列和红色荧光蛋白RFP基因序列，形成串联基因RFP-VP39或VP39-RFP；
（2）将串联基因SP-EGFP-TM和RFP-VP39，或SP-EGFP-TM和VP39-RFP插入到病毒表达载体的多克隆位点，构建成重组杆状病毒转座载体；
（3）重组杆状病毒转座载体转化大肠杆菌感受态细胞，在含有卡那霉素、庆大霉素、四环素、X-gal和IPTG的LB培养基上培养40~48小时，挑取白斑，培养20~24小时后抽提基因组进行PCR鉴定，鉴定正确的为双标记重组家蚕杆状病毒。
4.根据权利要求3所述的双标记重组家蚕杆状病毒的制备方法，其特征在于步骤（1）杆状病毒囊膜蛋白gp64信号肽SP基因的扩增引物为SEQ ID NO:4~5，杆状病毒囊膜蛋白gp64跨膜域TM基因的扩增引物为SEQ ID NO: 6~7，增强型绿色荧光蛋白EGFP基因的扩增引物为SEQ ID NO: 8~9，红色荧光蛋白RFP基因的扩增引物为SEQ ID NO: 10~11或SEQ ID NO:12~13，杆状病毒衣壳蛋白VP39基因的扩增引物为SEQ ID NO: 14~15或SEQ ID NO:16~17。
5.根据权利要求3所述的双标记重组家蚕杆状病毒的制备方法，其特征在于步骤（2）所述病毒表达载体为pFastBac-Dual。
6.根据权利要求5所述的双标记重组家蚕杆状病毒的制备方法，其特征在于步骤（2）所述串联基因SP-EGFP-TM插入到载体pFastBac-Dual的Pp10启动子后的多克隆位点；串联基因RFP-VP39或VP39-RFP插入到载体pFastBac-Dual的PpH启动子后的多克隆位点。
7.根据权利要求6所述的双标记重组家蚕杆状病毒的制备方法，其特征在于串联基因SP-EGFP-TM是通过SmaⅠ和XhoⅠ双酶切位点插入的；串联基因RFP-VP39或VP39-RFP是通过BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切位点插入的。
8.根据权利要求3所述的双标记重组家蚕杆状病毒的制备方法，其特征在于步骤（2）所述大肠杆菌为DH10Bac。
9.根据权利要求3所述的双标记重组家蚕杆状病毒的制备方法，其特征在于步骤（3）所述PCR的扩增引物如SEQ ID NO:18~19所示。
10.权利要求1或2所述的双标记重组家蚕杆状病毒作为家蚕核型多角体病毒模式生物的应用。
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