JP2000507089A

JP2000507089A - 組換えバキュロウイルスの生産

Info

Publication number: JP2000507089A
Application number: JP9523840A
Authority: JP
Inventors: マツカチエン，ビリー・エフ
Original assignee: イー・アイ・デユポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー
Priority date: 1995-12-22
Filing date: 1996-12-16
Publication date: 2000-06-13
Also published as: AU1687397A; BR9612268A; KR19990076627A; WO1997023636A1; MX9804689A; US6322781B1; AU727423B2; EP0876497A1; TR199801113T2

Abstract

(57)【要約】本発明は、生物学的防除物質としての使用のために設計されている組換えバキュロウイルスの調製を助長する方法に関する。さらに具体的には、本発明は、昆虫細胞もしくは昆虫宿主での組換えバキュロウイルスによりコードされる遺伝子の発現の調節に関する。

Description

【発明の詳細な説明】組換えバキュロウイルスの生産発明の背景化学的殺虫剤は現代の農業の必要不可欠の成分であり、また、害虫を防除することにより作物の損傷を低下させるための有効な一手段である。しかしながら、化学的作用物質は、環境汚染、作物学的害虫の抵抗性集団の淘汰、ならびに益虫、水生生物体、動物および人のような非目標生物体に対する毒性の可能性のため、継続的精査中である。結果として、有効かつさらに非目標集団および環境にやさしい害虫防除の代替戦略が探し求められている。これらの戦略の一は、目標昆虫集団の天然に存在する病原体である微生物を使用することである。しかしながら、有望な害虫防除剤であるとみられる多くの候補昆虫病原体は、農民および農業関連産業における他者が次第に慣れてきた、宿主特異性および迅速な作用のような古典的化学的殺虫剤の特性を欠く。バキュロウイルス(Baculoviridae)科のウイルスは宿主特異的であり、また、不活性な環境特性を有するが、しかし、重大な作物損傷が起こる前に目標集団を迅速に無効にする能力を欠く。幸運なことに、現代の分子生物学は、生物学的防除物質としての使用のために設計された組換えバキュロウイルスを生産する手段を提供する。バキュロウイルスの魅力的な属性はそれらの狭い宿主特異性である。これらのウイルスは節足動物のみを感染させ、かつ、特定の昆虫目内でさえ比較的狭い宿主範囲を所有する。宿主特異性は、電子顕微鏡、ＤＮＡハイブリダイゼーションおよび組換えＤＮＡ技術により検査されている（参考文献１−３）。これらの研究は、狭い宿主範囲は、少なくとも部分的には、バキュロウイルスのウイルスＤＮＡを哺乳動物細胞核に運ぶことの無能力によることを示す。バキュロウイルスは、非閉塞体バキュロウイルス（ＮＯＶ）、顆粒病ウイルス（ＧＶ）および核多角体病ウイルス（ＮＰＶ）を包含する３個の下位科に分割される。あるＧＶおよびＮＯＶが注意深く研究されているとは言え、ＮＰＶはバキュロウイルスの下位科のうちで最も綿密に特徴づけられたものである。ＮＰＶの例は、アウトグラファカリフォルニカ(Autographa californica)ＮＰＶ、スポドプテラエクシグア(Spodoptera exigua)ＮＰＶ、ヘリオティスアルミゲラ( Heliothis armigera)ＮＰＶ、ヘリコヴェルパゼア(Helicoverpa zea)ＮＰＶ、スポドプテラフルギペルダ(Spodoptera frugiperda)ＮＰＶ、トリコプルシアニ(Trichoplusia ni)ＮＰＶ、マメストラブラッシケ(Mamestra brassicae) ＮＰＶ、マイマイガ(Lymantria dispar)ＮＰＶ、スポドプテラリツラリス(Spo doptera litturalis)ＮＰＶ、シングラファファシフェラ(Syngrapha facifera )ＮＰＶ、コリストネウラフミフェラーナ(Choristoneura fumiferana)ＮＰＶ、アンチカルシアゲンマタリス(Anticarsia gemmatalis)ＮＰＶおよびヘリオティスヴィレセンス(Heliothis virescens)ＮＰＶを包含する。部分的に、効率的な細胞培養系およびたやすく得られるクローニングベクターの入手可能性により、ＮＰＶは望ましい異種タンパク質を合成するための真核細胞発現ベクターとして使用されている（４、５）。とりわけ一種のウイルス、アウトグラファカリフォルニカ(Autographa californica)ＮＰＶ（ＡｃＮＰＶ）は、バキュロウイルス発現系での異種遺伝子の導入および発現のための容認されたモデルウイルスである。このウイルスは、真核細胞発現系で組換えタンパク質の高収量を提供する重要なインビトロの手段として慣例的に使用され、こうして発現されるタンパク質の適切な翻訳後修飾を提供するとは言え、ＡｃＮＰＶは重要な実用上の害虫である鱗翅目昆虫の多くの科を感染させることが可能である。バキュロウイルスに基礎をおいた害虫防除剤の潜在的な実際的利点にもかかわらず、多様な欠点が現代の農業でのそれらの使用を削減してきた。条植え作物の農業でのこれらのウイルスのより普及した使用に対する最も重大な障壁は、それらの適用と宿主昆虫により引き起こされる作物損傷の効果的な防除との間のかなりの時間の遅延である。古典的な化学的殺虫剤の適用に際して観察される迅速な効果と異なり、有意の、野生型バキュロウイルス媒介性の害虫防除は、ウイルスのインビボ集団が宿主の活動性を弱めるのに十分高レベルに到達した後にのみ起こる。これは、２種類のビリオンを伴う周期で感染後数週間程度で起こりうる。昆虫細胞の感染後、出芽されたビリオン（ＢＶもしくは細胞外性ウイルス、ＥＣＶ）が、原形質膜へのヌクレオキャプシドの動きに際して産生される。これらのビリオンはそれらの核由来の外被を細胞質中で脱ぎ捨て、そして細胞質膜を通って昆虫宿主の血体腔に出芽する。この過程は宿主昆虫の全身感染につながる。感染過程のより後で、ビリオンは、本質的にポリヘドリンタンパク質から成るタンパク質マトリックスにより閉塞されるようになり（閉塞ビリオン）、かように多角封入体（ＰＩＢもしくは閉塞体、ＯＢ）を形成する。これらの封入体は当該ウイルスの経口的に感染性の形態であり、そして昆虫宿主間のウイルスの水平伝播を提供する（６、７）。感染されない幼虫はウイルス汚染された基質を餌にしそしてＰＩＢを摂取する。タンパク質性マトリックスは、多くの鱗翅目幼虫で見出される昆虫の中腸の塩基性のｐＨの作用により可溶化される。ウイルスＤＮＡゲノムを含有する遊離されたビリオンのヌクレオキャプシドは、幼虫の中腸の上皮細胞に付着しかつ感染させる。典型的には、感染された昆虫は発達しかつ植物性素材を消費し続けることができる一方で、ウイルスが宿主内で指数関数的に増殖する。ついには、しばしば数週間もしくはより長く経過した後、感染された幼虫は完全に混乱したようになりそして死ぬことができる。組換えＤＮＡ技術の使用により、ＮＰＶは、殺虫性タンパク質の発現を指令する遺伝子の導入もしくはウイルスゲノムからの遺伝子の欠失のいずれかにより、それらの昆虫殺害率を増大させるよう遺伝子的に設計されている（８−10）。双方の戦略が、野生型の設計されないＮＰＶより迅速な害虫防除を表す生物学的殺虫剤を生じる。最も効果的な組換えＮＰＶは、昆虫選択的神経毒を発現するよう設計されている（11−18）。発現された毒素は細胞毒性の発生を早め、より迅速な害虫防除をもたらす。これらの組換えウイルスはそれらの宿主を野生型ＮＰＶより20〜30％少ない時間で殺す。生物学的害虫防除剤としての使用に予定されるバキュロウイルスは大量で調製されなければならない。ウイルスの大量調製は、標準的なインビトロの昆虫細胞培養系で、もしくは感染された昆虫の幼虫でのインビボ調製により達成され得る。おのおのの系でのウイルス粒子の収量は十分なウイルス複製に依存し、それは順に健康な細胞もしくは昆虫の維持に依存する。時期尚早の細胞の細胞毒性もしくは昆虫の死は必然的にウイルス複製を制限することができ、それにより産生される子孫ウイルスの数を減少させる。目標昆虫をより迅速に無効にするよう設計された、遺伝的に改変されたバキュロウイルスはまた、より少ないウイルス複製および感染された細胞（インビトロ）もしくは感染された昆虫（インビボ）あたりのウイルス子孫のより低い収量ももたらしうる。かように、バキュロウイルス媒介性の害虫防除剤を伝統的な化学的殺虫剤に対する実現可能な代替物もしくは付属物にする、それらの有効性を向上させるのに使用される手段は、実際のところ、この害虫防除戦略の経済上の実現可能性を覆すことがある。従って、時期尚早の細胞毒性または宿主細胞もしくは昆虫の時期尚早の殺害の障壁を克服する、殺虫性バキュロウイルスの効率的生産方法が必要とされる。発明の要約本発明は、生物学的防除物質としての使用のため設計されている組換えバキュロウイルスの生産を助長する方法に関する。さらに具体的には、本発明は、昆虫細胞もしくは昆虫宿主での組換えバキュロウイルスによりコードされる遺伝子の発現の調節に関する。一態様において、本発明は、昆虫細胞培養系もしくは生存能力のある昆虫での組換えバキュロウイルスのゲノムによりコードされる遺伝子の発現を制御する方法に関し、前記昆虫細胞もしくは昆虫は、バキュロウイルスゲノムによりコードされる遺伝子の発現を調節するタンパク質を発現するよう遺伝子的に設計されている。より具体的には、組換えバキュロウイルスのゲノム中のキメラ遺伝子によりコードされる殺虫性タンパク質の発現を調節する方法が、昆虫細胞培養系もしくは生存能力のある昆虫での組換え殺虫性バキュロウイルスの効率的な調製のために開発され得、前記方法の段階は、（ａ）遺伝子発現に影響することが可能な調節タンパク質をコードする第二の核酸断片に第一の核酸断片が操作可能に連結される、第一のプロモーターをコードする第一の核酸断片を含んで成る第一のキメラ遺伝子を有する組換え昆虫細胞を構築すること、（ｂ）殺虫性タンパク質をコードする第四の核酸断片に第三の核酸断片が操作可能に連結される、段階（ａ）の調節タンパク質により影響される第二のプロモーターをコードする前記第三の核酸断片を含んで成る第二のキメラ遺伝子を有する組換えバキュロウイルス発現ベクターを構築すること、（ｃ）（ｂ）の組換えバキュロウイルス発現ベクターを（ａ）の組換え昆虫細胞に安定に導入すること、そして、（ｄ）バキュロウイルスの複製を持続させる条件下で（ｂ）の組換えバキュロウイルス発現ベクターを含有する（ａ）の組換え昆虫細胞を維持すること、を含んで成り、段階（ａ）の調節タンパク質の発現が段階（ｂ）の殺虫性タンパク質の発現に影響する。別の態様において、本発明は、（ａ）遺伝子発現に影響することが可能な調節タンパク質をコードする第二の核酸断片に第一の核酸断片が操作可能に連結される、第一のプロモーターをコードする第一の核酸断片を含んで成る第一のキメラ遺伝子を有する組換え昆虫細胞を構築すること、（ｂ）殺虫性タンパク質をコードする第四の核酸断片に第三の核酸断片が操作可能に連結される、段階（ａ）の調節タンパク質により影響される第二のプロモーターをコードする前記第三の核酸断片を含んで成る第二のキメラ遺伝子を有する組換えバキュロウイルス発現ベクターを構築すること、（ｃ）（ｂ）の組換えバキュロウイルス発現ベクターを（ａ）の組換え昆虫細胞に導入すること、そして、（ｄ）段階（ａ）の調節タンパク質の発現が段階（ｂ）の殺虫性タンパク質の発現に影響する、バキュロウイルスの複製を持続させる条件下で（ｂ）の組換えバキュロウイルス発現ベクターを含有する（ａ）の組換え昆虫細胞を維持すること、を含んで成る、組換えバキュロウイルスのゲノムに存在するキメラ遺伝子によりコードされる殺虫性タンパク質の発現を制御する方法に関する。別の態様において、本発明は、（ａ）（１）第一のプロモーターをコードする第一の核酸断片を含んで成る第一のキメラ遺伝子であって、遺伝子発現に影響することが可能な調節タンパク質をコードする第二の核酸断片に第一の核酸断片が操作可能に連結される遺伝子、および、（２）前記調節タンパク質により影響される第二のプロモーターをコードする第三の核酸断片を含んで成る第二のキメラ遺伝子であって、殺虫性タンパク質をコードする第四の核酸断片に前記第三の核酸断片が操作可能に連結される遺伝子、を有する組換えバキュロウイルス発現ベクターを構築すること、（ｂ）（ａ）の組換えバキュロウイルス発現ベクターを昆虫細胞に導入すること、そして、（ｃ）前記調節タンパク質の発現が前記殺虫性タンパク質の発現に影響する、バキュロウイルスの複製を持続させる条件下で（ｂ）の昆虫細胞を維持すること、を含んで成る、組換えバキュロウイルスのゲノムに存在するキメラ遺伝子によりコードされる殺虫性タンパク質の発現を制御する方法に関する。別の態様において、本発明は、（ａ）遺伝子発現に影響することが可能な調節タンパク質をコードする第二の核酸断片に第一の核酸断片が操作可能に連結される、第一のプロモーターをコードする第一の核酸断片を含んで成る第一のキメラ遺伝子を有する組換え昆虫細胞を構築すること、（ｂ）殺虫性タンパク質をコードする第四の核酸断片に第三の核酸断片が操作可能に連結される、段階（ａ）の調節タンパク質により影響される第二のプロモーターをコードする前記第三の核酸断片を含んで成る第二のキメラ遺伝子を有する組換えバキュロウイルス発現ベクターを構築すること、（ｃ）（ｂ）の組換えバキュロウイルス発現ベクターを（ａ）の組換え昆虫細胞に導入すること、（ｄ）段階（ａ）の調節タンパク質の発現が段階（ｂ）の殺虫性タンパク質の発現に影響する、バキュロウイルスの複製を持続させる条件下で（ｂ）の組換えバキュロウイルス発現ベクターを含有する（ａ）の組換え昆虫細胞を維持すること、そして（ｅ）子孫ウイルスを収集すること、を含んで成る、殺虫性組換えバキュロウイルスの調製方法に関する。別の態様において、本発明は、（ａ）（１）第一のプロモーターをコードする第一の核酸断片を含んで成る第一のキメラ遺伝子であって、遺伝子発現に影響することが可能な調節タンパク質をコードする第二の核酸断片に第一の核酸断片が操作可能に連結される遺伝子、および、（２）前記調節タンパク質により影響される第二のプロモーターをコードする第三の核酸断片を含んで成る第二のキメラ遺伝子であって、殺虫性タンパク質をコードする第四の核酸断片に前記第三の核酸断片が操作可能に連結される遺伝子、を有する組換えバキュロウイルス発現ベクターを構築すること、（ｂ）（ａ）の組換えバキュロウイルス発現ベクターを昆虫細胞に導入すること、（ｃ）前記調節タンパク質の発現が前記殺虫性タンパク質の発現に影響する、バキュロウイルスの複製を持続させる条件下で（ｂ）の昆虫細胞を維持すること、そして、（ｄ）子孫ウイルスを収集すること、を含んで成る、殺虫性組換えバキュロウイルスの生産方法に関する。別の態様において、本発明は、組換えバキュロウイルス発現ベクターを含有する昆虫細胞がインビトロの細胞培養系で維持される、殺虫性組換えバキュロウイルスの生産方法に関する。別の態様において、本発明は、組換えバキュロウイルス発現ベクターを含有する昆虫細胞が無傷の生存する昆虫内で維持される、殺虫性組換えバキュロウイルスの生産方法に関する。別の態様において、本発明は、（ａ）（１）第一のプロモーターをコードする第一の核酸断片を含んで成る第一のキメラ遺伝子であって、テトラサイクリントランス作用因子タンパク質をコードする第二の核酸断片に第一の核酸断片が操作可能に連結される遺伝子、および、（２）最小プロモーター配列に操作可能に連結される１個もしくはそれ以上のテトラサイクリンオペレーター部位をコードする第三の核酸断片を含んで成る第二のキメラ遺伝子であって、昆虫選択的神経毒をコードする第四の核酸断片に前記第三の核酸断片が操作可能に連結される遺伝子、を有する組換えバキュロウイルス発現ベクターを構築すること、（ｂ）（ａ）の組換えバキュロウイルス発現ベクターを昆虫細胞に導入すること、（ｃ）（ｂ）の昆虫細胞を、テトラサイクリントランス作用因子タンパク質が前記第三の核酸断片に存在するテトラサイクリンオペレーター部位に結合することが不可能でありかつそれによって前記オペレーター部位に操作可能に連結される最小プロモーター配列により指図される遺伝子発現を誘導することが不可能であるように、有効量のテトラサイクリンもしくはテトラサイクリン類似物の存在下に維持すること、そして、（ｄ）子孫ウイルスを収集すること、を含んで成る、殺虫性組換えバキュロウイルスの調製方法に関する。別の態様において、本発明は、第一のプロモーターをコードする第一の核酸断片を含んで成るキメラ遺伝子を含有する組換え昆虫細胞に関し、この第一の核酸断片は、第二のプロモーターにより指図される遺伝子発現に影響することが可能な調節タンパク質をコードする第二の核酸断片に操作可能に連結される。別の態様において、本発明は、第一のプロモーターをコードする第一の核酸断片を含んで成るキメラ遺伝子を含有する１個もしくはそれ以上の組換え昆虫細胞を含んで成るトランスジェニック昆虫に関し、この第一の核酸断片は、第二のプロモーターにより指図される遺伝子発現に影響することが可能な調節タンパク質をコードする第二の核酸断片に操作可能に連結される。別の態様において、本発明は、昆虫細胞または１個もしくはそれ以上の組換え昆虫細胞を含んで成るトランスジェニック昆虫に関し、前記昆虫細胞は第一のプロモーターをコードする第一の核酸断片を含んで成るキメラ遺伝子を含有し、この第一の核酸断片は、第二のプロモーターにより指図される遺伝子発現に影響することが可能な調節タンパク質をコードする第二の核酸断片に操作可能に連結され、この調節タンパク質はテトラサイクリントランス作用因子タンパク質である。別の態様において、本発明は、殺虫性タンパク質をコードする第二の核酸断片に操作可能に連結される第一のプロモーターをコードする第一の核酸断片を含んで成る第一のキメラ遺伝子を有する組換えバキュロウイルス発現ベクターに関し、前記第一のプロモーターは、第二のプロモーターをコードする第三の核酸断片を含んで成る第二のキメラ遺伝子を有する組換え昆虫細胞により発現される調節タンパク質により影響され、この第三の核酸断片は前記調節タンパク質をコードする第四の核酸断片に操作可能に連結される。別の態様において、本発明は、殺虫性タンパク質をコードする第二の核酸断片に操作可能に連結される第一のプロモーターをコードする第一の核酸断片を含んで成る第一のキメラ遺伝子を有する組換えバキュロウイルス発現ベクターに関し、前記第一のプロモーターは、第二のプロモーターをコードする第三の核酸断片を含んで成る第二のキメラ遺伝子を有する組換え昆虫細胞により発現される調節タンパク質により影響され、この第三の核酸断片は前記調節タンパク質をコードする第四の核酸断片に操作可能に連結され、前記第一の核酸断片は、最小プロモーターに操作可能に連結される１個もしくはそれ以上のテトラサイクリンオペレーター部位を含んで成る。別の態様において、本発明は、（１）第一のプロモーターをコードする第一の核酸断片を含んで成る第一のキメラ遺伝子であって、遺伝子発現に影響することが可能な調節タンパク質をコードする第二の核酸断片に第一の核酸断片が操作可能に連結される遺伝子、および、（２）前記調節タンパク質により影響される第二のプロモーターをコードする第三の核酸断片を含んで成る第二のキメラ遺伝子であって、殺虫性タンパク質をコードする第四の核酸断片に前記第三の核酸断片が操作可能に連結される遺伝子、を有する組換えバキュロウイルス発現ベクターに関する。別の態様において、本発明は、（１）第一のプロモーターをコードする第一の核酸断片を含んで成る第一のキメラ遺伝子であって、遺伝子発現に影響することが可能な調節タンパク質をコードする第二の核酸断片に第一の核酸断片が操作可能に連結される遺伝子、および、（２）前記調節タンパク質により影響される第二のプロモーターをコードする第三の核酸断片を含んで成る第二のキメラ遺伝子であって、殺虫性タンパク質をコードする第四の核酸断片に前記第三の核酸断片が操作可能に連結される遺伝子、を有する組換えバキュロウイルス発現ベクターに関し、前記調節タンパク質はテトラサイクリントランス作用因子タンパク質であり、また、前記第三の核酸断片は、最小プロモーターに操作可能に連結される１個もしくはそれ以上のテトラサイクリンオペレーター部位を含んで成る。図面および配列表の簡単な記述図１。Ｈ．ヴィレセンス(H．virescens)幼虫からのポリヘドリン封入体（ＰＩＢ）としての組換えおよび野生型のウイルス子孫の定量。「ＡｃＡａＩＴ／ｐ１０」は、ＡａＩＴ毒素の発現が後期バキュロウイルスｐ１０プロモーターにより制御される組換えバキュロウイルスを表す。「ＡｃＬｑｈＩＴ／ｐ１０」は、ＬｑｈＩＴ２毒素の発現が後後期(very late)バキュロウイルスｐ１０プロモーターにより制御される組換えバキュロウイルスを表す。「ＡｃＬｑｈＩＴ／ＩＥ１」は、ＬｑｈＩＴ２毒素の発現が初期バキュロウイルスＩＥ１プロモーターにより制御される組換えバキュロウイルスを表す。「ＡｃＮＰＶ」は野生型バキュロウイルスを表す。図２。テトラサイクリントランス作用因子で制御可能な系の略図表示。図３。ＴＶ３ｔＴａのプラスミド地図。図４。ＬｑｈＩＴ２遺伝子を構築するのに使用される合成オリゴヌクレオチドの配列。オリゴヌクレオチドＬｑ１（配列番号４）はボンビキシンのシグナルペプチドをコードする。オリゴヌクレオチドＬｑ１（配列番号４）およびＬｑ１０（配列番号13）は合成遺伝子のＰＣＲ増幅のプライマーとして使用された。図５。ＬｑｈＩＴ２遺伝子を調製するのに使用される戦略の概略表示。オリゴヌクレオチドＬｑ１（配列番号４）およびＬｑ１０（配列番号13）（「Ｘ」で印をつけられた）はＰＣＲ反応の増幅プライマーとしてはたらいた。唯一の制限酵素切断部位が示される。図６。ＬｑｈＩＴ２遺伝子のヌクレオチド（配列番号14）および対応するアミノ酸の配列。ヌクレオチド配列中の小文字（アミノ酸１〜19をコードするヌクレオチド１〜57）はボンビキシンのシグナルペプチドをコードするヌクレオチドを示す。図７。バキュロウイルス発現ベクターＴＶ３ｔＴａＴｏ−ＬｑｈＩＴ２の地図。図８。ｔｅｔｒＩＥ１Ａのアミノ酸配列（配列番号21）。トランス作用因子のｔｅｔＲおよびＩＥ１Ａ領域はそれぞれ小文字および大文字により示される。太字で示される２アミノ酸残基（位置208および209）は、ｔｅｔＲおよびＩＥ１Ａのインフレーム挿入を助長するのに使用される配列に存在する余分の制限酵素切断部位の結果として付け加えられている。図９。ＴＡＴＡボックス、ならびに初期（Ｅ）および後期（Ｌ）転写開始部位の位置を同定するＡｃＭＮＰＶの最小ｐ３５遺伝子プロモーターのヌクレオチド配列（配列番号23および24）。外来遺伝子の将来の挿入に使用されることになる制限酵素切断部位もまた示される。図１０。ＴＡＴＡボックス、ならびに初期（Ｅ）および後期（Ｌ）転写開始部位の位置を同定するＡｃＭＮＰＶの改変最小ｐ３５遺伝子プロモーターのヌクレオチド配列（配列番号25および26）。ｐ３５ｍの単一塩基対の突然変異が太字で示される。外来遺伝子の将来の挿入に使用されることになる制限酵素切断部位もまた示される。図１１。伝達ベクターｐＴＶ３（Ｍ）ｌｑ＋およびｐＴＶ３（Ｍ）ｌｑ−中のポリヘドリン遺伝子のすぐ上流の領域の図解。トランス作用因子遺伝子ならびにｐ３５／ｐ３５ｍ最小プロモーターおよびＬｑｈＩＴの上流にｔｅｔオペレーター配列を含有するカセットの相対的位置が示される。図１２。伝達ベクターｐｔＴＡ（Ｍ）ｌｑ＋およびｐｔＴＡ（Ｍ）ｌｑ−中のポリヘドリン遺伝子のすぐ上流の領域の図解。トランス作用因子遺伝子ならびにｐ３５／ｐ３５ｍ最小プロモーターおよびＬｑｈＩＴの上流にｔｅｔオペレータ一配列を含有するカセットの相対的位置が示される。発明者は、37 C.F.R．1.821-1.825ならびに付録ＡおよびＢ（「ヌクレオチドおよび／もしくはアミノ酸配列を含有する出願開示の要件(Requirements for Ap plication Disclosures Containing Nucleotides and /or Amino Acid Sequence s)」）に従い、また、1992年12月のOJ EPOへの補遺No.２で刊行された、「特許出願におけるヌクレオチドおよびアミノ酸配列の標準的表示規則(Rules for the Standard Representation of Nucleotide and Amino Acid Sequences in Paten t Applications)」ならびにEPO会長決定への付属書類ＩおよびIIに従って、26個の配列表を提供した。配列番号１。プラスミドＴＶ３ｔＴａの構築で使用されるBglIIリンカー。配列番号２。７個のテトラサイクリンオペレーター配列にタンデムに融合された最小ｈＧＨプロモーターを含有する、プラスミドｐＦ４３ｈからの407bpのXho IないしBamHIの制限酵素断片のヌクレオチド配列。配列番号３。プラスミドｐｔｅｔｏｐｈＧＨの構築で使用されるNotIリンカー。配列番号４〜13。ＬｑｈＩＴ２遺伝子を構築するのに使用される合成オリゴヌクレオチド。オリゴヌクレオチドＬｑ１はボンビキシンのシグナルペプチドをコードする。オリゴヌクレオチドＬｑ１（配列番号４）およびＬｑ１０（配列番号 13）は合成遺伝子のＰＣＲ増幅のプライマーとして使用された。配列番号14。ＬｑｈＩＴ２毒素のコーディング領域がその後に続くボンビキシンのシグナルペプチドをコードする合成ＤＮＡ断片のヌクレオチド配列。配列番号15および16。ｔＴＡのｔｅｔＲ部分を増幅するのに使用されるＰＣＲプライマーＴＥＴＲ１およびＴＥＴＲ２のヌクレオチド配列。配列番号17。オリゴヌクレオチドＴＥＴＲ１およびＴＥＴＲ２を使用するＰＣＲにより増幅されたテトラサイクリンリプレッサー遺伝子（ｔｅｔＲ）のヌクレオチド配列。配列番号18および19。ＩＥ１の最初の145アミノ酸残基に対応するプラスミドｐＩＥ１Ｈ／Ｃからの454bpの断片を増幅するのに使用されるＰＣＲプライマーＩＥ１Ａ１およびＩＥ１Ａ２のヌクレオチド配列。配列番号20。オリゴヌクレオチドＩＥ１Ａ１およびＩＥ１Ａ２を使用するＰＣＲにより増幅されたＩＥ１の活性化ドメイン（ＩＥ１Ａ）のヌクレオチド配列。配列番号21。ｔｅｔｒＩＥ１Ａのアミノ酸配列。配列番号22。ＳＶ４０ポリアデニル酸化シグナルを含有するBamHI断片のヌクレオチド配列。配列番号23および24。アニーリングされる場合にｐ３５遺伝子の翻訳開始コドンに関して−８から−57bpまでのｐ３５最小プロモーターを表す２個の相補的オリゴヌクレオチドＰ３５ＰＲＯ１（配列番号23）およびＰ３５ＰＲＯ２（配列番号24）のヌクレオチド配列。配列番号25および26。アニーリングされる場合に、単一塩基対の変更が後期ＴＴＡＡＧＲＮＡ開始部位を除外するプロモーター配列に組み込まれている改変ｐ３５最小プロモーターを表す、２個の相補的オリゴヌクレオチドＰ３５ＭＰＲＯ１（配列番号25）およびＰ３５ＭＰＲＯ２（配列番号26）のヌクレオチド配列。発明の詳細インビボおよびインビトロの調製目的のための組換えＮＰＶによる殺虫性タンパク質の発現を抑制する方法が開示される。一態様において、調節タンパク質をコードする遺伝子が、昆虫バキュロウイルスの天然の宿主である昆虫もしくは昆虫細胞のゲノムに安定に組込まれる。順に、その調節タンパク質に感応性である調節配列が、異種タンパク質の発現を指図するプロモーターおよび／もしくはエンハンサー付近の１個もしくはそれ以上の位置でバキュロウイルスのゲノムに安定に導入される。宿主への導入（すなわち、組換えバキュロウイルスでのトランスジェニック昆虫の感染もしくはトランスジェニック昆虫細胞のトランスフェクション）に際し、そのトランスジェニック昆虫もしくは昆虫細胞により発現される調節タンパク質は、バキュロウイルスゲノムに存在する調節配列と相互作用しかつその調節配列により制御される遺伝子（１個もしくは複数）の発現に影響することができる。あるいは、誘導可能な、抑制可能なもしくはウイルスのプロモーターに操作可能に連結される調節タンパク質をコードする遺伝子、および調節タンパク質に感応性である調節配列に操作可能に連結される目的の異種遺伝子をコードする遺伝子の双方が、組換えＮＰＶゲノムに存在する。これらの組換えウイルスは、その後、野生型の昆虫もしくは昆虫細胞で増殖される。調節タンパク質の遺伝子発現の適切なインデューサーもしくはリプレッサーの存在下で、異種遺伝子の発現の制御が影響されることができる。例えば、構成プロモーター（例えばアクチンプロモーター）もしくはウイルスプロモーター（好ましくは核多角体病ウイルス由来のプロモーター）の制御下にあるテトラサイクリン（ｔｅｔ）リプレッサータンパク質をコードする構造遺伝子が鱗翅目昆虫のゲノムに挿入され得る。ｔｅｔリプレッサーに感応性である調節配列が、殺虫性タンパク質の発現を制御するプロモーターおよび／もしくはエンハンサー領域に近接するウイルスゲノムに導入される。ｔｅｔリプレッサーは、調節配列（１個もしくは複数）に結合しそして殺虫性タンパク質をコードする遺伝子の転写を防止する。この殺虫性タンパク質の発現の欠如は、感染された昆虫の麻痺の発生および死を遅らせることができ、そしてＰＩＢの産生の増大をもたらすことができる。類似の様式で、この戦略は、ウイルスを不安定にさせる細胞毒性タンパク質（１種もしくは複数）の発現を制御するのに使用され得、かように昆虫細胞培養系でのウイルス収量を最大にする。本開示の文脈では、多数の用語および略語が使用されるものとする。「ＮＰＶ」は一バキュロウイルス、核多角体病ウイルスを表す。「多角体病」は、組織の分解および結果として生じる液体中の多角体顆粒の蓄積により特徴づけられる昆虫の幼虫のいくつかのウイルス疾患のいずれかを指す。「ＰＩＢ」は多角封入体である。「ＡｃＮＰＶ」は野生型アウトグラファカリフォルニカ(Autographa californica)核多角体病ウイルスを表す。「ＬｑｈＩＴ２」は、レイウルスキンケストリアツスヘブラエウス(Leiurus quinquestriatus hebraeus)由来の昆虫選択的神経毒を表す。「ＡａＩＴ」はアンドロクトヌスアウストラリス(And roctonus australis)由来の昆虫選択的神経毒を表す。「ＡｃＬｑｈＩＴ２」は、バキュロウイルス後後期ｐ１０プロモーターの転写制御下にＬｑｈＩＴ２をコードする遺伝子をもつよう遺伝子的に改変されているＡｃＮＰＶを表す略称で扱われた(short-hand)形態である。「発現」は、コードされたタンパク質を生じる、構造遺伝子の転写および翻訳を指す。当業者により認識されることができるように、構造遺伝子の発現レベルは、使用される調節配列（プロモーター、ポリアデニル酸化部位、エンハンサー、など）および当該構造遺伝子が発現される宿主細胞により影響される。適する「調節配列」は、構造遺伝子の上流（５’）、内、および／もしくは下流（３’）に配置されるヌクレオチド配列を指す。調節配列は、その細胞のタンパク質生合成装置と潜在的に共同してコーディング配列の転写および／もしくは発現を制御する。これらの調節配列は、プロモーター、オペレーター、エンハンサー、転写終止配列およびポリアデニル酸化配列を包含する。「調節タンパク質」は、調節配列を認識しかつそれに結合し、そしてそれによりコーディング配列の転写および／もしくは発現に影響するタンパク質である。調節タンパク質は遺伝子発現に対し負の影響を表す（すなわち転写および／もしくは翻訳を低下させるもしくは排除する）ことがあり、そして従って「リプレッサー」と称されることがある。対照的に、ある調節タンパク質は遺伝子発現に対し正の影響を表す（すなわち転写および／もしくは翻訳を開始もしくは増大させる）ことがあり、そして従って「アクチベーター」、「トランス作用因子」もしくは「インデューサー」として知られることがある。「オペレーター」は、隣接するプロモーターでの転写開始の速度を修飾する調節タンパク質により認識される調節配列を指す。「プロモーター」は、一般には構造遺伝子の５’末端で見出されるヌクレオチド配列を指し、これが転写開始を指図する。プロモーター配列は、下流の遺伝子の発現を活発にするのに必要であるがしかし常に十分ではない。通常は、プロモーターは、優先的に下流の方向で転写を活発にするが、とは言え促進活性は遺伝子がプロモーターの上流に置かれる場合に（低下された発現レベルで）示され得る。かように、異種性プロモーター／構造遺伝子の組み合わせの構築においては、構造遺伝子は、その遺伝子の発現がプロモーター配列により制御されるようにプロモーターの調節制御下に置かれる。プロモーターは、構造遺伝子の上流に、かつ、プロモーターとそれがその本来の環境で制御する遺伝子との間の距離に近似する転写開始部位からの距離に優先的に位置を定められる。当該技術分野で知られるように、この距離の若干の変動はプロモーター機能の喪失なしに耐えられ得る。「最小プロモーター」は、一般にはＲＮＡポリメラーゼを結合するＴＡＴＡボックスとして知られるＤＮＡ配列および付加的なプロモーターもしくはオペレーター要素の非存在下に転写開始を援助することが不可能である周囲のＤＮＡ配列の短い伸長(stretch)から成る、ＲＮＡポリメラーゼのクラスIIプロモーターを指す。「遍在(ubiquitous)プロモーター」は、その生物体の全ての組織および器官で活性（すなわちその隣接する遺伝子の転写を持続させることが可能）であるプロモーターを指す。「誘導可能なプロモーター」は、その機能が特定の細胞内トランス作用因子の結合もしくは遊離により制御されるプロモーターを指す。誘導可能なプロモーターは、調節されずそしてそのため引き続いて活性である構成プロモーターと区別される。「３’非コーディング配列」は、ポリアデニル酸化シグナルおよびｍＲＮＡのプロセシングもしくは遺伝子発現に影響することが可能ないずれかの他の調節シグナルを含有する遺伝子のＤＮＡ配列部分を指す。ポリアデニル酸化シグナルは、通常、ｍＲＮＡ前駆体の３’末端へのポリアデニル酸領域(tract)の付加に影響することにより特徴づけられる。「遺伝子」は、タンパク質合成に関わるＤＮＡ部分全体を指す。遺伝子は、５ ’端の翻訳開始コドン（通常はヌクレオチドＡＴＧ）から始まりそして３’端の終止（ヌクレオチドＴＡＧ、ＴＧＡもしくはＴＡＡ）コドンまで伸長する構造もしくはコーディング部分を具現化する。それはまた、通常は構造遺伝子の５’すなわち上流に配置されるプロモーター領域も含有し、これは構造遺伝子の発現を開始かつ調節する。３’非コーディング配列もまた遺伝子に包含される。「キメラ」遺伝子は、異種の調節およびコーディング配列を含んで成る人工遺伝子を指す。「異種」遺伝子は、常態では宿主生物体に見出されないがしかし遺伝子伝達により導入されている遺伝子もしくは遺伝子の部分を指す。「核酸断片」は遺伝子内の特定の機能と同一視されるヌクレオチド配列を指す。「構造遺伝子」は、タンパク質、ポリペプチドもしくはその一部をコードしかつ遺伝子発現の調節制御に関わる５’および３’配列を除外するＤＮＡ区分を含んで成る遺伝子のその部分である。構造遺伝子は、常態で細胞中に見出されるもの、もしくはそれが導入される細胞の位置で常態で見出されないものであってもよく、導入される場合はそれは異種遺伝子と称される。異種遺伝子は、細菌のゲノムもしくはエピソーム、真核細胞、核もしくはプラスミドのＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ウイルスＤＮＡまたは化学的に合成されたＤＮＡを包含する、当該技術分野に既知のいずれかの起源から全部もしくは一部分生じうる。構造遺伝子は、発現産物の生物学的活性もしくは化学構造、発現速度、または発現制御の様式に影響を与え得るとみられるコーディングもしくは非翻訳領域のいずれかに１個もしくはそれ以上の改変を含有しうる。こうした改変は、１個もしくはそれ以上のヌクレオチドの突然変異、挿入、欠失および置換を包含するがしかしそれらに制限されない。構造遺伝子は、連続したコーディング配列を構成しうるか、もしくは、それは、発現されずそして適切なスプライス部位により結合される１個もしくはそれ以上のイントロンを包含しうる。構造遺伝子は、天然に存在するもしくは合成の起源の複数性状態由来の区分の複合物でありうる。構造遺伝子は、融合タンパク質をコードする融合された遺伝子もまた包含しうる。「合成遺伝子」は、そっくりそのままもしくはコーディング領域のより大きな部分について化学的に合成される構造遺伝子のＤＮＡ配列を指す。本明細書に例証されるように、オリゴヌクレオチドの基礎単位が、当業者に既知の処置を使用して合成されそしてライゲーションかつアニーリングされて、その後に遺伝子全体を構築するよう酵素的に結集される遺伝子区分を形成する。当業者により認識されるように、本明細書に記述される合成遺伝子と機能的におよび構造的に同等な遺伝子は、部位特異的突然変異誘発もしくは当該技術分野で使用される他の関連する方法により調製されうる。「操作可能に連結される」という用語は、一方の機能が他方により影響されるように会合される単一の核酸分子の核酸配列を指す。例えば、プロモーターは、それが構造遺伝子の発現に影響することが可能である場合に（すなわち構造遺伝子がそのプロモーターの転写制御下にある）その構造遺伝子と操作可能に連結される。「トランスフェクション」は、以前にある遺伝子を含有しなかった生物体にその遺伝子をもつＤＮＡ区分を安定に導入することを指す。「コトランスフェクション」は、一生物体への１種以上のＤＮＡ区分の同時の導入を指す。「トランスジェニック昆虫」は、１種もしくはそれ以上の導入遺伝子(transge nes)を含有する細胞から成る昆虫を指す。「導入遺伝子」は、トランスジェニック生物体が発育しかつ成熟生物体に留まる細胞のゲノムに導入され、それにより前記トランスジェニック生物体の１個もしくはそれ以上の細胞種もしくは組織でのそれらのコードされた産物の発現を指図する遺伝子である。ＤＮＡの配列に関連するような「化学的に合成された」は、成分のヌクレオチドがインビトロで結集されたことを意味する。ＤＮＡの手動の化学合成が十分に確立された処置（19）を使用して達成されることができるか、もしくは自動化された化学合成が多数の商業的に入手可能な器械の一を使用して実行され得る。「昆虫細胞」は、インビトロで維持される１個もしくはそれ以上の昆虫細胞ならびに無傷の生存する昆虫で見出される１個もしくはそれ以上の細胞を指すことが理解される。「バキュロウイルス」は、節足動物すなわち鱗翅目の属を包含する門のみを感染させるウイルスの一群を指す。殺虫性バキュロウイルスは、農業の害虫防除のための環境的にやさしい方法を提供する大きな可能性を有する。しかしながら、有効性に対する改善が、これらの作用物質を現在の化学的害虫防除剤と競争できるようにするために必要とされる。こうした改善をなすための一アプローチはウイルスの遺伝子の変更による。例えば、ウイルスゲノムを、ウイルスの宿主範囲を改善させる、ウイルスの環境的安定性および持続性を増大させる、もしくはウイルスの感染性および伝播を改善させるために改変することが可能でありうる。加えて、ウイルスが、感染された昆虫を傷つけるよう作用する速度を改善することは、化学的害虫防除剤の付属物もしくは置換物としての殺虫性バキュロウイルスの魅力のあることを大きく高めるとみられる。ウイルスがその昆虫宿主に影響する速度を増大させる一方法は、当該バキュロウイルスにその昆虫に毒性であるタンパク質をコードする外来遺伝子を導入することであり、ここで昆虫の死もしくは無能力化はもはや単にウイルス感染の経過に依存せず、しかし代わりに外来タンパク質の毒性レベルの蓄積により補助される。その結果が殺虫性組換えバキュロウイルスである。多くの節足動物は毒液と称される殺虫性タンパク質の混合物を産生する。これらの毒性物質は分化した腺組織で合成され、これは、刺すもしくは貫き通す装置により注がれる場合に節足動物の餌食を麻痺させることが可能である。小さな、緩慢に動くもしくは静止した節足動物は、非常に低濃度で毒液の神経毒成分を利用することにより、それらの餌食を即座に麻痺させる戦略を適合させている。これらの成分すなわち神経毒は、あるレセプター部位についての効率的な競合により昆虫の神経組織の機能を妨害する。これらの神経毒の多くはポリペプチドである。これらは、それらの宿主特異性および作用様式に基礎をおき多様な種類に分割されている（20）。例えば、多数の種のサソリから単離される神経毒ペプチドは、節足動物に影響する種類および哺乳動物に影響する種類に分割されている。節足動物特異的毒素のいくつかは昆虫選択的ペプチドと同定されている。例えば、ブチナエ属(Buthinae)のサソリは、目標昆虫に対するそれらの生物学的影響において異なる２種の昆虫選択的神経毒を発現する。クロバエ科のハエ(blowfly )では、興奮性毒素に分類されるものが、運動神経の末端枝(terminal branches) の反復性発射の誘導により即時の急速かつ可逆性の収縮性麻痺を引き起こす（21 −23）。これらの毒素はおよそ70アミノ酸の一本鎖ポリペプチドであり、かつ、４個のジスルフィド橋により架橋される。興奮性効果は、活性化可能な活動電位、ナトリウム伝導性、およびチャンネル閉鎖の電位依存性の遅延の増大に帰される。サソリアンドロクトヌスアウストラリス(Androctonus australis)の毒液から産生される毒素ＡａＩＴ（24）は、この興奮性作用を表したこれらの生物体から単離された最初の昆虫毒素であった。昆虫選択的神経毒の第二の種類は、ＢｊＩＴ２（25）、ＬｑｑＩＴ２（26）およびＬｑｈＩＴ２（27）を包含する抑制性毒素である。これらの毒素は、興奮性毒素とは別個である一次アミノ酸配列を所有する60ないし65アミノ酸のポリペプチドである。これらの毒素は昆虫の筋系の緩慢な進行性麻痺および完全な弛緩を誘発する。この活性は誘発された活動電位の封鎖の結果であり（26、28）、また、活性化可能なナトリウム伝導性の抑制および軸索膜の脱分極に帰される。異種遺伝子を発現する組換えバキュロウイルスの調製に使用される方法および戦略は当該技術分野で十分に既知である（４、５、29）。遺伝子発現のこれらの方法は、真核生物の発現ベクター系での哺乳動物タンパク質の経済的な調製を提供し、多くの例で、それらの適正な三次元コンホメーションを達成しかつ活性に必要な適正なジスルフィド橋を形成しているタンパク質を生じる。一般には、バキュロウイルスゲノムへの異種遺伝子の導入は、ウイルスゲノムＤＮＡと、目的の異種遺伝子を含有する適する「伝達ベクター」との間の相同的組換えにより発生する。これらの伝達ベクターは、一般には、たやすい遺伝子操作を提供する、細菌宿主での自律的複製が可能であるプラスミドＤＮＡである。バキュロウイルス伝達ベクターはまた、以下の特徴すなわち（５’から３’の方向で列挙される）１）非必須ゲノム領域の５’領域を含んで成るウイルスＤＮＡ；２）ウイルスプロモーター；３）異種ＤＮＡ配列の挿入を助長する制限酵素切断部位をコードする１個もしくはそれ以上のＤＮＡ配列；４）転写終止配列；および５）非必須ゲノム領域の３’領域を含んで成るウイルスＤＮＡ、を包含するよう改変されているウイルスゲノムの一領域を含んで成る遺伝子カセットも含有する。目的の異種遺伝子は、ウイルスプロモーターの下流の制限酵素切断部位で伝達ベクターに挿入される。生じるカセットは、伝達ベクターに存在するウイルスプロモーターおよび転写終止配列の転写制御下に異種遺伝子があるキメラ遺伝子を含んで成る。さらに、このキメラ遺伝子は、ウイルスゲノムの非必須領域での相同的組換えを助長するウイルスＤＮＡ配列により側面に配置される(flanked )。組換えウイルスは、ウイルス複製を持続させることが可能である昆虫細胞をウイルスゲノムＤＮＡおよび組換え伝達ベクターでコトランスフェクションすることにより創製される。伝達ベクターに存在する側面に位置するウイルスＤＮＡ配列と、ウイルスゲノムＤＮＡの相同的配列との間の相同的組換えが起こり、そして、不可欠なウイルス機能を混乱させないウイルスゲノムの領域へのキメラ遺伝子の挿入をもたらす。感染性の組換えビリオンは、タンパク質外被により取り巻かれた、バキュロウイルス発現ベクターと称される組換えゲノムＤＮＡから成る。好ましい態様において、伝達ベクターに存在するウイルスゲノムの非必須領域は、ポリヘドリン産生を司るウイルスＤＮＡ領域を含んで成る。相同的組換えに関与する、側面に位置する配列の間にポリヘドリン遺伝子全体を含有する伝達ベクターが最も好ましい。（ポリヘドリン遺伝子のゲノムのコピーでの欠陥により）ポリヘドリン産生の欠けたウイルスからのゲノムＤＮＡでの組換えは、ポリヘドリン陽性の表現型の修復をもたらすことができる。この戦略は組換えウイルスの同定および選択を助長する。別の態様においては、バキュロウイルスのゲノムＤＮＡが、ウイルスゲノムの非必須領域への唯一の制限酵素認識配列の導入により直接改変され得る。組換えウイルスにより発現されかつバキュロウイルスで感染された昆虫細胞での遺伝子発現を指図することが可能な調節配列に操作可能に連結されるべき異種遺伝子を含んで成るキメラ遺伝子が構築され得かつ唯一の制限酵素切断部位でウイルスゲノムに直接挿入され得る。この戦略は、伝達ベクターの構築の必要および組換えウイルスの生成のための相同的組換えへの依存の双方を排除する。この技術はエルンスト(Ernst)ら（30）によりおよびWO94/28114（31）に記述される。遺伝子的にコードされる昆虫特異的神経毒を送達するのに適する組換えバキュロウイルス発現ベクターは、最大の効率に至適な毒素遺伝子発現を必要とする。多数の戦略が、組換えバキュロウイルスを設計しかつ調製するのに同業者により使用され得、ここで、毒素遺伝子の発現が、感染の間の適切な時点で機能的形態で産生されかつ昆虫宿主内の目標細胞に結合するのに利用可能な、十分な量の毒素をもたらす。組換えＮＰＶの至適な大量調製の一秘訣は、遺伝子発現を調節する適切な系の選択である。こうした系は、好ましくは、殺虫活性をコードする遺伝子の転写を抑制するリプレッサー／オペレーター要素を使用する。多様な誘導可能な真核生物のプロモーターを包含する、遺伝子発現に影響するいくつかのリプレッサー系が記述されている（32−33）。加えて、真核生物細胞での遺伝子発現の調節が、大腸菌(Escherichia coli)のｌａｃリプレッサー／オペレーターインデューサー系の使用により達成され得る。３種のアプローチすなわち（ｉ）プロモーター部位に適正に置かれたｌａｃオペレーターによる転写開始の防止（34−38）；（ii）ｌａｃリプレッサー／オペレーター複合体による伸長の間のＲＮＡポリメラーゼIIにより媒介される転写の封鎖（39）；および（iii）ｌａｃリプレッサータンパク質および単純ヘルペスウイルスのビリオンタンパク質１６（ＶＰ１６）の活性化ドメインから成る融合タンパク質に感応性のプロモーターの活性化（40−41）が記述されている。しかしながら、ｌａｃインデューサー、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）による緩やかなかつ不十分な活性化により、この系は中等度の調節のみをもたらしている（42）。本発明は、具体的には、テトラサイクリン（ｔｅｔ）オペレーター−リプレッサー系を採用する調節可能な遺伝子発現のための系の構築に関する。テトラサイクリンリプレッサーは、ｔｅｔオペレーター配列に高親和性をもつＤＮＡ結合タンパク質である。Ｔｎ１０にコードされるｔｅｔリプレッサーは、プロモーター（１種もしくは複数）と部分的に重なり合うオペレーター部位（１個もしくは複数）に結合することにより遺伝子発現を調節する（43、44）。テトラサイクリンもしくはテトラサイクリンの類似物は、リプレッサーがそのオペレーター配列に結合することを防止し、かようにＲＮＡポリメラーゼがプロモーター配列に結合しそしてｍＲＮＡの転写を媒介することを可能にする。ｔｅｔオペレーター−リプレッサー系は、遺伝子発現を効果的に制御するのに植物で成功裡に使用されている。例えば、ガッツ(Gatz)らは、トランスジェニック植物で構成プロモーター（カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター；ＣａＭＶ３５Ｓ）の活性を500倍減少させるのにこの系を使用することが可能であった（45）。とりわけ、彼らは、細胞あたり１×10⁶個のｔｅｔリプレッサー分子を合成したトランスジェニックタバコ植物を生成させた。３個のｔｅｔオペレーターが、ＣａＭＶ３５ＳプロモーターのＴＡＴＡボックス付近に導入された。通常の生理学的条件下で、遺伝子発現が本質的に阻害された。しかしながら、テトラサイクリンの添加は、リプレッサーがオペレーター部位に結合することを防止し、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの完全な抑制解除を引き起こした。より最近、ｔｅｔオペレーター／リプレッサー系が、原生動物門の寄生虫トリパノソーマブルセイ(Trypanosoma brucei)での遺伝子発現を制御するのに使用されている（46）。大腸菌(E．coli)のテトラサイクリンリプレッサーを発現するトランスジェニックトリパノソーマ類は、ｔｅｔオペレーターをもつプロモーターの制御下に、染色体に組込まれたレポーター遺伝子のインデューサー（テトラサイクリン）依存性の発現を表した。レポーターの発現は、テトラサイクリン濃度に応じて４桁の範囲にわたって制御され得た。これは、他の真核生物の抑制に基礎をおく系により表される転写調節をはるかに上回る。本発明は、組換えウイルスゲノムによりコードされる殺虫性タンパク質の発現を制御する。実験の証拠は、殺虫性タンパク質を発現するよう遺伝子的に設計された組換えＮＰＶで感染された昆虫からのＰＩＢ収量における、野生型ウイルスで処理された昆虫からのＰＩＢ収量に関しておよそ10倍より大きな減少を立証する（図１を参照）。ある殺虫性タンパク質は、昆虫細胞に対する悪影響（例えば細胞毒性）を有し得るか、もしくは昆虫宿主の麻痺および死を誘発し得る。これらの影響は、ウイルスの子孫の減少および／もしくは不安定なウイルス構築物をもたらし得る。殺虫性タンパク質の発現を抑制することは、昆虫宿主細胞に、野生型ウイルスの収量にほぼ等しい収量への組換えウイルスの増殖を援助する能力を与えるとみられる。本発明はいくつかの方法により毒素遺伝子発現を調節する。一方法は毒素遺伝子の発現を指図するプロモーターを制御する、テトラサイクリンに制御されるトランス作用因子分子（本明細書で「テトラサイクリントランス作用因子タンパク質」ともまた称される）を使用する。このしっかりと調節可能な発現系の性状は、引用により本明細書に組み込まれる米国特許第5,464,758号に、またゴセン(Go ssen)とブジャード(Bujard)（47、48）により記述され、そして図２に描かれる。遺伝子調節に使用される制御要素は、単純ヘルペスウイルスのビリオンタンパク質１６の活性化ドメインに融合されるｔｅｔリプレッサータンパク質（ｔＴＡ）から成る融合タンパク質である。本発明はまた、リプレッサー（もしくはリプレッサー様）タンパク質を構成的に発現するトランスジェニック昆虫の構築も包含する。キメラ遺伝子（操作可能に連結されたｔｅｔオペレーター（１個もしくは複数）、プロモーターおよび毒素の構造遺伝子から成る）を含有する組換えＮＰＶがトランスジェニック宿主中で複製している場合、リプレッサーがオペレーター（１個もしくは複数）に結合しそして毒素の発現を阻害する。遺伝子転写のためのこの条件付き調節系を構築するため、２個の基本的遺伝子操作が採用される。すなわち、ｉ）ｔｅｔオペレーター（１個もしくは複数）断片が、好ましくは転写開始部位および／もしくはエンハンサー領域と部分的に重なり合う領域で毒素遺伝子の上流に挿入される；そしてii）リプレッサー遺伝子が、真核生物細胞好ましくは昆虫もしくは昆虫細胞系のゲノムに安定に作られる。リプレッサーは、組換えウイルスによる宿主の感染の間のリプレッサーの発現を活発にするために、構成プロモーター（すなわちアクチン）もしくはバキュロウイルスプロモーター（すなわちＩＥ１、ｐ１０もしくはハイブリッドプロモーター）の制御下に置かれてもよい。ＩＥ１、ｐ１０もしくはポリヘドリンのようなバキュロウイルスプロモーターを使用して、リプレッサーはウイルス感染の時点でのみ発現される。この設計はリプレッサータンパク質の十分な発現を準備する。なぜなら、このウイルスはウイルス複製に必要とされる転写機械装置を提供するからである。ｔｅｔオペレーター部位（１個もしくは複数）は、ウイルスプロモーターにより活発にされる異種タンパク質（好ましくは殺虫性タンパク質）の転写を妨げるために、転写開始部位および／もしくはエンハンサー領域に近接するウイルスゲノム中に置かれる。昆虫ゲノム中への外来遺伝子の挿入のための高効率ベクターがこの戦略に必要とされる。多様な種類の可動性の核酸の存在が多様な昆虫で同定されている（49 ）。ＤＮＡ配列への可動因子の挿入は、突然変異表現型と同定され得る変更されたもしくは混乱された遺伝子発現をもたらし得る。現在のところ、昆虫の高効率の形質転換はキイロショウジョウバエ属(Drosophila)でのＰ因子に基礎をおく形質転換ベクター系を使用して達成される（50）。しかしながら、これらの形質転換ベクターは他の昆虫の形質転換に使用され得ない（51）。従って、鱗翅目昆虫の高効率の形質転換を包含する、他の昆虫での利用性を有する代替の可動遺伝子因子が必要とされる。加えて、他の形質転換法は代替の送達系に焦点をあてている。１個のそうした技術は、妊娠中の雌性内の卵もしくは卵巣へのＤＮＡの注入を必要とする「母性微小注入(maternal microinjection)」である。この技術は、捕食性ダニ、メタセイウルスオクシデンタリス(Metaseiulus occidentalis)（52）およびアンブリセイウスフィンランディクス(Amblyseius finlandicus)（53）へプラスミドＤＮＡ配列を導入するのに成功裡に使用されている。最近、電気穿孔法が、昆虫胚にプラスミドＤＮＡを成功裡に送達させることもまた報告されている（キース・ヒューズ(Kieth Hughes)、ＵＳＤＡ、ノースダコタ州ファーゴ、私信）。トランスジェニック昆虫を調製する一方法は、鱗翅目昆虫のゲノムに異種遺伝子を導入するのに有用な転移様因子(transposable-like element)（ＴＥ）を使用することである。これらの遺伝子要素は、順にバキュロウイルス遺伝子の発現を制御する調節タンパク質を発現することが可能なトランスジェニック昆虫の構築を助長する。１個のこうしたＴＥは、節足動物ゲノムに広く行き渡りかつ鱗翅目昆虫にほぼ遍在するマリナー(mariner )因子である（55）。マリナー因子は、マリナートランスポザーゼの読み取り枠の２個の保存領域由来の縮重プライマーを使用して同定かつ調製され得る。最近、マリナー転移因子が、捕食性ダニ、メタセイウルスオクシデンタリス(Metas eiulus occidentalis)から単離された（55）。２個の逆プライマー(inverse pri mer)を使用して、完全なマリナー因子（Ｍｏｃ１）が配列決定され、そして28bp の逆方向末端反復塩基配列(inverted terminal repeat sequences)を包含する長さ1284bpであることが見出された。しかしながら、Ｍｏｃ１マリナー因子は、フレームシフトを包含する多数の突然変異を含有し、また、トランスポザーゼ活性は検出され得ない。これらの観察結果に基づけば、Ｍｏｃ１は不活性の転移因子であるとみなされる。しかしながら、不活性のマリナー因子は相同的組換えによる外因性ＤＮＡの導入のための魅力的な手段である。なぜなら、それは、欠失、挿入および終止コドンを包含する多数の突然変異を蓄積しているからである。こうしたマリナー座への外因性ＤＮＡの挿入は有利であるはずである。なぜなら、トランスポザーゼ遺伝子はもはや存立できず、そしてこうした外因性ＤＮＡは安定なままであることができるからである。ｔｅｔリプレッサー遺伝子、およびマリナー断片を含有する選択可能なマーカー（例えばシクロジエン抵抗性遺伝子Ｒｄｌ；56、57）の鱗翅目昆虫のマリナー座への挿入が、相同的組換えにより起こる。形質転換は、以前に記述された微小注入技術もしくは新たに開発された電気穿孔法プロトコールにより実施される。実施例本発明は以下の実施例でさらに定義される。実施例は例解のみのために与えられることが理解されることができ、また、本発明は実施例で記述される使用に制限されない。上の論考および以下の実施例から、当業者は、それを多様な使用法および条件に適合させるための本発明の多様な変更および改変を確認し得かつその精神および範囲から離れることなくなし得る。全てのこうした改変は、意図される請求の範囲内にあることが意図される。実施例１殺虫性タンパク質の調節する発現は、ウイルスゲノムそれ自身にｔＴＡおよびオペレーター部位を組み込むことによってもまた達成され得る。この方法では、大腸菌(E．coli)のＴｎ１０にコードされるテトラサイクリン抵抗性オペロンの制御要素を、殺虫性タンパク質（１種もしくは複数）の発現を調節するためにＡｃＮＰＶゲノムに挿入した。ｔＴＡを、ＮＰＶによる感染直後に、外来遺伝子を発現する前初期プロモーターＩＥ１の制御下に置いた。バキュロウイルス伝達ベクターｐＡｃＰ＋ＩＥ１ＴＶ３（テキサス州カレッジステーション、テキサスＡ＆Ｍ大学テキサス農業実験ステーションのドナルド・ジャーヴィス(Donald Jarv is)博士より提供された）をこの構築に使用し、またこれは米国特許第5,162,222 号に記述されるバキュロウイルス初期プロモーター伝達ベクターの誘導体である。最初に、ｔＴＡを、酵素EcoRIおよびBamHIによりプラスミドｐＵＨＤ１５−１（デラウェア州ウィルミントン、デュポン・メルクファーマシューティカルズカンパニー(Du Pont-Merck Pharmaceuticals Co.)のロバート・ホーリック(Ro bert Horlick)博士から得られたら得られた）から削り取り、そしてEcoRIおよび BamHIで切断されたプラスミドＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ±（商標）（ストラタジーン(Str atagene)、ウィスコンシン州メナシャ）に挿入した。ライゲーション後、プラスミドＤＮＡを大腸菌(E．coli)ＤＨ５α（ギブコ(Gibco)／ＢＲＬ、メリーランド州ゲイタースバーグ）に形質転換し、そして挿入物の存在を制限酵素分析により確認した。ｔＴＡ挿入物の確認後、５’および３’末端にBamHI制限酵素切断部位をもつＳＶ４０ポリアデニル酸化断片（配列番号22）（Ｅ．Ｉ．デュポンドネムールアンドカンパニー(E.I．Du Pont de Nemours and Company)のゲイリー・チュン(Gary Chun)により提供された）を、ｔＴＡの下流のＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ±（商標）中のBamHI制限酵素切断部位に直接挿入した。この挿入物を、内部HpaI切断部位（ポリＡ）およびＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ±（商標）のマルチクローニング部位の３’末端に見出されるXhoI切断部位を使用して、正しい向きについて確認した。ｔＴＡおよびポリＡ断片を含有する新規プラスミドをEcoR Iで切断し、そしてクレノウポリメラーゼで埋め、そしてBglII制限酵素切断部位を、BglIIリンカー（配列番号１）の組み込みにより付加した。ライゲーション後、プラスミドＤＮＡを大腸菌(E．coli)ＤＨ５αに形質転換した。ｔＴＡおよびＳＶ４０を含有する断片を、その後、この改変されたＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ±（商標）プラスミドから制限酵素BglIIおよびNotIで削り取った。この断片を、BglIIおよびNotIで切断された伝達ベクターｐＡｃＰ＋ＩＥ１ＴＶ３にライゲーションした。この構築物は、バキュロウイルスＩＥ１プロモーターおよびｈｒ５エンハンサー領域の下流への、ｔＴＡおよびポリアデニル酸化断片をコードする合成構造遺伝子の挿入をもたらした。ライゲーション後、プラスミドＤＮＡを大腸菌(E．coli)ＤＨ５αに形質転換し、そして結果として生じた形質転換体を、ｔＴＡ遺伝子の３’末端に配置された唯一の非対称部位を含有したプラスミドの所有についてスクリーニングした。新規プラスミドをＴＶ３ｔＴａと名づけた（図３）。組換えバキュロウイルス殺虫剤のための調節系を構築するための次段階は、ウイルスゲノムに最小プロモーター配列およびテトラサイクリンオペレーター配列を組み込むことを必要とした。制限酵素XhoIおよびBamHIを使用して、プラスミドｐＦ４３ｈからタンデムのテトラサイクリンオペレーター配列（７個のｔｅｔオペレーター）に融合された最小プロモーター（ｈＧＨ）（配列番号２；デュポン・メルクファーマシューティカルズカンパニーのＲ．ホーリック(R．Horl ick)博士から得られた）を削り取った。この断片を、XhoIおよびBamHIで以前に切断されたＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ±（商標）にクローニングした。ライゲーション後、プラスミドＤＮＡを大腸菌(E．coli)ＤＨ５αに形質転換し、そして陽性クローンを制限酵素分析により同定した。このプラスミドをその後、制限酵素XhoIで（マルチクローニング部位の３’で）切断し、クレノウポリメラーゼで埋め、そしてNotIリンカー（配列番号３）の存在下に再ライゲーションした。ライゲーション後、プラスミドＤＮＡを大腸菌(E．coli)ＤＨ５αに形質転換し、そして結果として生じる形質転換体を制限酵素NotIでの切断によりスクリーニングした。２％アガロースゲルによる電気泳動後のおよそ450bpの断片の存在は、適正な構築物の存在を確認する。このプラスミドはｐｔｅｔｏｐｈＧＨとして知られる。最後に、昆虫選択的神経毒ＬｑｈＩＴ２をコードする構造遺伝子を、BamHIクローニング部位に最小プロモーターの下流に置く。ＬｑｈＩＴ２遺伝子を調製するため、10個のオリゴヌクレチドを設計し（図４；配列番号４〜13の複合物）、そして標準的ホスホルアミダイトの化学により合成した。これらのオリゴヌクレオチドを、ギブコ／ＢＲＬ（メリーランド州ゲイタースバーグ）のキナーゼを使用してホスホリル化し、アニーリングし、そして図５に描かれたスキームに従いかつ製造元の推奨されるプロトコールを採用して、ギブコ／ＢＲＬのリガーゼを使用してライゲーションした。ライゲーションされた断片を、その後、製造元のプロトコールおよび下述される改変に従い、パーキン・エルマーシータス(Perkin-Elmer Cetus)のアンプリタック［AmpliTaq］（商標）ポリメラーゼ（コネティカット州ノーウォーク）を使用するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を採用することにより増幅した。オリゴヌクレオチドＬｑ１（配列番号４）を前進プライマー(forward primer)として使用し、また、オリゴヌクレオチドＬｑ１０（配列番号13）は逆プライマー(reverse primer)としてはたらいた。これらのプロトコールの記述は下にさらに詳細に述べられる。 10個の別個のホスホリル化反応（各オリゴヌクレオチドについて１個）を実施した。各オリゴヌクレオチド（配列番号４〜13）250pmolを1.5mLの微小遠心分離チューブに入れた。５μLの10×キナーゼ緩衝液、１μLの１mMＡＴＰ、６μLのキナーゼ（ギブコ／ＢＲＬ、10単位/μL）および十分量の水を、総反応体積を50 μLにするために各チューブに添加した。10本のチューブを37℃で１時間インキュベーションした。インキュベーション後、それぞれのホスホリル化されたオリゴヌクレオチド５μL(25pmol)を１本の微小遠心分離チューブに入れ、そしてこのチューブを95℃に設定されたドライヒートブロックに入れた。ヒートブロックをその後で止め、そして室温に冷却させて、ホスホリル化されたオリゴヌクレオチドのアニーリングを助長した。ホスホリル化された、アニーリングされたオリゴヌクレオチドの混合物50μLを、15μLの５×リガーゼ緩衝液、３μLの10mMＡＴＰ、４μLのリガーゼ酵素（ギブコ／ＢＲＬ、５単位/μL）および３μLの脱イオン水と一緒に別個の微小遠心分離チューブに入れた。このチューブを37℃で30 分間インキュベーションし、そしてその後室温で一夜保存した。アニーリングされかつライゲーションされたオリゴヌクレオチドを含んで成る合成核酸断片をＰＣＲにより増幅した。３個のＰＣＲ反応を、鋳型ＤＮＡ（ホスホリル化され、アニーリングされそしてライゲーションされたオリゴヌクレオチドを含んで成る）の変動する希釈で実施した。以下の反応混合物すなわち 61.5μLの脱イオン水 10μLの10×ＰＣＲ緩衝液（パーキン・エルマーシータス）各２μLのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ（各200μM） 0.5μLのアンプリタック［AmpliTaq］（商標）ポリメラーゼ（2.5単位/100μL）をＰＣＲ反応に採用した。鋳型ＤＮＡを脱イオン水で100倍、1,000および10,000倍（ｖ／ｖ）に希釈した。反応混合物80μLを３本の0.5mL微小遠心分離チューブのそれぞれに入れた。５μ L（100pmol）のオリゴヌクレオチドＬｑ１（配列番号４）および５μL（100pmol ）のオリゴヌクレオチドＬｑ１０（配列番号13）（それぞれ、前進および逆ＰＣＲプライマーとしてはたらく）を各チューブに添加した。適切に希釈された鋳型 10μLを各チューブに添加した。ＰＣＲ反応は、以下の増幅プロトコールすなわち段階１（１サイクル）： 96℃ ３分 75℃ ３分段階２（25サイクル）： 95℃ 30秒 75℃ ２分段階３（１サイクル）： 95℃ 30秒 75℃ ５分を実施するようプログラムされたパーキン・エルマーＤＮＡサーモサイクラー［ Thermocycler］（商標）を使用して実施した。増幅から生じる生成物を、２％アガロースゲルによる電気泳動により分析した。およそ300塩基対の増幅された断片が各反応について観察された。ＬｑｈＩＴ２遺伝子および側面に位置する領域のＰＣＲ増幅後、300bpのバンドを2.0％アガロースゲルから単離し、そして、製造元のプロトコールに従ってスピンバインド［SpinBind］（商標）ＤＮＡ回収システム（ＦＭＣ、メーン州ロックランド）を使用して精製した。単離された断片を、ＬｑｈＩＴ２遺伝子およびシグナル配列を含有する合成オリゴヌクレオチド（図６、配列番号14）の付着５’および３’末端を創製するため、BamHIで切断した。切断された断片をその後、標準的分子クローニング技術を使用して、BamHIクローニング部位でｐＴＺ −１８Ｒプラスミド（ファルマシア(Pharmacia)、ニュージャージー州ピスカタウェイ）に挿入した。大腸菌(E．coli)ＤＨ５αＭＣＲの形質転換後、単離されたコロニーを選び、そしてプラスミドＤＮＡを調製した。８個の陽性のクローンを同定し、そしてｐＴＺ−１８Ｒの商業的に入手可能な前進および逆プライマーで配列決定した。１個のクローン（No.16）が、合成遺伝子およびシグナル配列をコードする正しい配列を含有することが見出された。生じるプラスミド（ｐＴＺ−１８ＲＬｑ）は、２個のBamHI制限酵素切断部位、すなわち毒素遺伝子の５’末端付近の一部位および終止コドン後の他部位を含有した。ｐＴＺ−１８ＲＬｑプラスミドＤＮＡを標準的プロトコールに従って調製し、そしてBamHIで切断して、ＬｑｈＩＴ２遺伝子およびシグナル配列を含有する挿入された300塩基対の断片を遊離させた。この断片を、1.2％アガロースゲルによる電気泳動によりベクター配列から分離し、そしてスピンバインド［SpinBind］（商標）ＤＮＡ回収システムを使用して精製した。単離された断片をその後、標準的分子クローニング技術を使用してｐｔｅｔｏｐｈＧＨのBamHIクローニング部位に挿入した。大腸菌(E．coli)ＤＨ５αＭＣＲへの形質転換後、単離されたコロニーを選び、そしてプラスミドＤＮＡを調製した。このプラスミドを、その後、制限酵素NotIで切断し、750bpの断片を遊離させ、これを2.0％アガロースゲルから単離しそしてスピンバインド［SpinBind］（商標）ＤＮＡ回収システムを使用して精製した。この断片は、ｔｅｔオペレーター部位、最小ｈＧＨプロモーターおよびＬｑｈＩＴ２遺伝子／リーダー配列を含有する。単離されかつ切断された断片を、その後、標準的分子クローニング技術を使用して、新たなバキュロウイルス伝達ベクターＴＶ３ｔＴａ（上）にNotIクローニング部位で挿入した。大腸菌(E．coli)ＤＨ５αＭＣＲへの形質転換後、単離されたコロニーを選び、そしてプラスミドＤＮＡを制限酵素分析により分析した。NotI断片を含有するいくつかのコロニーを単離し、増殖させ、そしてプラスミドＤＮＡをコトランスフェクションのため調製した。新規伝達ベクターはＴＶ３ｔＴａＴｏ−ＬｑｈＩＴ２と命名される（図７を参照）。スポドプテラフルギペルダ(Spodoptera frugiperda)細胞（Ｓｆ−９）を、3 .0％ウシ胎児血清で補充されたエクセル［ExCell］（商標）４０１培地（ＪＲＨバイオサイエンシズ(JRH Biosciences)、カンサス州レネクサ）中で増殖させた。リポフェクチン［Lipofectin］（商標）（0.1mg/mLで50μL、ギブコ／ＢＲＬ）を、ＴＶ３ｔＴａＴｏ−ＬｑｈＩＴ２の50μLアリコート（500ng）および直鎖状にされたポリヘドリン陰性のＡｃＮＰＶ（2.5μg）バキュロゴールド［Baculo gold］（商標）ウイルスＤＮＡ、ファーミンゲン(Pharmingen)、カリフォルニア州サンディエゴ）に添加した。Ｓｆ−９細胞（およそ50％単層）を、ウイルスＤＮＡ／伝達ベクター溶液でコトランスフェクションした。コトランスフェクション実験からの上清液をトランスフェクション後５日に収集し、そして、組換えウイルスを、標準的プラーク精製プロトコールを採用して単離した。ここで、ポリヘドリン陽性プラークのみが選択される（６）。単離されたプラークを採集し、そして2.5％ウシ胎児血清で補充されたエクセル［ExCell］（商標）培地500μLに懸濁した。35mmペトリ皿中のＳｆ−９細胞（ 50％単層）に、ウイルス懸濁液100μLを接種し、そして上清液をトランスフェクション後５日に収集した。これらの上清液を、組換えウイルスの大スケール増殖のための培養系に接種するのに使用した。組換えバキュロウイルスＡｃＴＶ３ｔＴａＴｏ−ＬｑｈＩＴ２によりコードされるＬｑｈＩＴ２の発現を、イムノブロット分析およびバイオアッセイにより確認する。Ｓｆ−９細胞（50mL）を、野生型ＡｃＮＰＶ（陰性対照）、ＡｃＬｑｈＩＴ２（陽性対照）もしくはＡｃＴＶ３ｔＴａＴｏ−ＬｑｈＩＴ２で感染させる。テトラサイクリンもしくは類似物の非存在下で、異種タンパク質が、ＡｃＴＶ３ｔＴａＴｏ−ＬｑｈＩＴ２で感染された細胞で効率的に発現される。しかしながら、テトラサイクリンもしくは類似物の存在下では、当該毒素の発現は抑制される。その後の追加の研究が、異種タンパク質の発現を効果的に制御する基質の能力を決定するために、培地に添加された多様な濃度のテトラサイクリンを使用して行われる。感染後のいくつかの間隔において、感染された細胞を収集しそして増殖培地を細胞懸濁液の遠心分離により除去する。消費された培養培地をデカンテーションし、そして残存する細胞をブランソン(Branson)ソニファイヤー［Sonifier］（商標）（モデル４５０）で設定２で30秒間溶解する。細胞破片を、その後、冷却微小遠心器（４℃）での15,000rpmで10分間の遠心分離により除去する。感染された細胞の超音波処理物(sonicates)のタンパク質濃度を、製造元の説明書に従ってＢＣＡタンパク質アッセイ（ピアース(Pierce)、イリノイ州ロックフォード）を使用して定量する。標準曲線は既知濃度のウシ血清アルブミンを基礎として調製する。サンプルおよび標準品を37℃で30分間インキュベーションし、そして562での吸光度を分光光度計で測定する。タンパク質濃度を直線回帰分析により各サンプルについて決定する。定量されたサンプル中の個々のタンパク質をタンパク質電気泳動により分離する。サンプルを、脱イオン水で３〜４mg/mLタンパク質に希釈する。各サンプル25μLを、75μLの電気泳動サンプル緩衝液（3.8mLの脱イオン水、1.0mLの0.5Mトリス−塩酸、ｐＨ6.8、0.8mLのグリセロール、1.6mLの10％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、0.4mLのβ−メルカプトエタノール、0.4mLの0.5％ブロモフェノールブルー）に添加する。分子量標準品を、ビオチニル化タンパク質分子量標準品（ギブコ）１μLをサンプル緩衝液100μL中で希釈することにより調製する。サンプルおよび標準品を95℃で２分間加熱する。サンプルを15％ミニプロテアン(Mini-Protean)IIトリス−塩酸レディゲル［Ready Gel］（商標）（バイオラッド(Bio-Rad、ニューヨーク州メルヴィル）に負荷する（20μL/ウェル）。電気泳動の泳動(running)緩衝液（１Lの脱イオン水中３gのトリス塩基、14.4gのグリシン、1.0gのＳＤＳ）を、組み立てられた電気泳動ゲル装置に添加し、そしてサンプルを40mAでおよそ1.5時間電気泳動する。電気泳動後、分離されたタンパク質を、ウェスタンブロッティングにより電気泳動ゲルからニトロセルロースフィルターに転写する。ブロッター紙（３ＭＭ、シュライヒャーアンドシュエル(Schleicher and Schuell)、ニューハンプシャー州キーン）およびニトロセルロース（ＢＡ−ＳＮＣ、シュライヒャーアンドシュエル）をゲルの近似の寸法に切断し、そして、ウェスタン転写緩衝液（11.6gのトリス塩基、ｐＨ8.3、5.8gのグリシン、0.74gのＳＤＳ、400mLのメタノール、1.6Lの脱イオン水）中に浸す。ブロッター紙、ニトロセルロースおよびゲルを、以下の順序、すなわち３枚のブロッター紙、ゲル、ニトロセルロースそして３枚のブロッター紙に集合させる。この「サンドイッチ」を、ゲルが陽極にかつニトロセルロース膜が陰極に向けられるように転写装置中に置く。タンパク質を、転写装置に60mAで４時間電流を流すことにより転写する。転写後、装置を分解し、そしてニトロセルロースフィルターを風乾させる。転写されたタンパク質のイムノブロット分析を以下の段階により進め、この全ては室温で回転振とう器上で実行する。転写されたタンパク質により占有されないニトロセルロース膜上の部位を、30分間のインキュベーションによりＴＴＢＳ（20mMトリス、500mM塩化ナトリウム、ｐＨ7.5、0.05％トゥイーン(Tween)−20 ）中に溶解された３％（ｗ／ｖ）ゼラチンでブロッキングする。ブロッキング溶液を除去し、そして膜を100mLのＴＴＢＳ中で５分間すすぐ。ＬｑｈＩＴ２特異的ウサギポリクローナル抗体（カリフォルニア州デイヴィス、カリフォルニア大学のブルース・ハモック(Bruce Hammock)博士から得られた）を、10mLのＴＴＢＳに10μLのウサギ抗体を添加することにより調製する。この一次抗体溶液を、ブロッキングされたニトロセルロースフィルターに適用し、そして１時間インキュベーションする。このインキュベーションの後、ニトロセルロースフィルターを100mLのＴＴＢＳの３回の交換で洗浄し、各洗浄は10分間続く。二次抗体を、2 0mLのＴＴＢＳに10μLのペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ（シグマ(Sig ma)、ミズーリ州セントルイス）および10μLのペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジンを添加することにより調製する。ニトロセルロースフィルターを、この溶液と１時間インキュベーションする。このインキュベーションの後、フィルターを100mLのＴＴＢＳの３回の交換で洗浄し、各洗浄は10分間続く。検出試薬（ＥＣＬ検出キット、アマーシャム(Amersham)、イリノイ州アーリングハイツ）をニトロセルロースに適用し、そして60秒間インキュベーションする。検出試薬をフィルターから排出させ、そしてフィルターをサランラップで覆う。ニトロセルロースフィルターからのシグナルを、処理された膜を２〜10秒間Ｘ線フィルム（コダック(Kodak)Ｘ−ＯＭＡＴＡＲ、ニューヨーク州ロチェスター）に曝すことにより検出する。7,000Ｍｒ付近の陽性のイムノブロット応答を提供する単離物を毒素遺伝子について陽性とみなす。イムノブロット処置を実施するための上述された条件は天然のＬｑｈＩＴ２毒素を使用して開発され、ここで検出限界は毒素15ngであることが決定された。感染された細胞の超音波処理物を使用する実験では、組換えバキュロウイルスＡｃＴＶ３ｔＴａＴｏ−ＬｑｈＩＴ２によりコードされるＬｑｈＩＴ２毒素は検出されず、感染された細胞で発現されそして試験されたサンプルに存在する毒素の量はこのアッセイの検出限界より下であったことを示唆した。実施例２ＡｃＭＮＰＶのＩＥ−１遺伝子の活性化ドメインとインフレームで融合されたｔｅｔＲ遺伝子を含有した新規トランス作用因子遺伝子ハイブリッドを構築した。ｔＴＡのｔｅｔＲ遺伝子部分を、以下のオリゴヌクレオチドプライマーすなわちＴＥＴＲＩ５’−ＡＴＧＴＣＴＡＧＡＴＴＡＧＡＴＡＡＡＡＧ−３’（配列番号15）ＴＥＴＲ２５’−ＡＧＡＴＣＴＧＧＡＣＣＣＡＣＴＴＴＡＣＡＴＴＴＡＡＧ− ３’（配列番号16）を使用してＰＣＲ増幅した。この反応のためのＤＮＡ鋳型はプラスミドＴＶ３ｔＴａであった。以下の反応混合物すなわち 33μLの滅菌脱イオン水 10μLの５×Ｔａｑ緩衝液Ｄ（インヴィトロジェン(InVitrogen)）５μLの10×ｄＮＴＰストック（各ｄＮＴＰ2.5mM）１μLのオリゴヌクレオチドＴＥＴＲ１（配列番号15）（100pmol）１μLのオリゴヌクレオチドＴＥＴＲ２（配列番号16）（100pmol）１μLのプラスミドＤＮＡＴＶ３ｔＴａ（10ng） 0.2μLのアンプリタック(AmpliTaq)ポリメラーゼ（５単位/μL）を、このＰＣＲ反応に採用した。ＰＣＲ反応を、以下の増幅プロトコールすなわち段階１（１サイクル）： 95℃ １分 72℃ ４分段階２（30サイクル）： 95℃ 30秒 45℃ 30秒 72℃ 30秒段階３（１サイクル）： 95℃ 30秒 45℃ 30秒 75℃ ５分に従って実施した。生じる622塩基対の生成物（配列番号17）は、ｔＴＡの翻訳開始コドン（ＡＴＧ）に関して＋１から＋616塩基対までｔｅｔＲ遺伝子を含有する。余分のBglII 制限酵素切断部位を、この部位へのＩＥ−１活性化ドメインの将来の挿入のため、オリゴヌクレオチドＴＥＴＲ２の５’末端に組み込んだ。２種のオリゴヌクレオチドプライマー、を使用して、ＩＥ−１の最初の145アミノ酸残基（ＩＥ１Ａ）に対応する、プラスミドｐＩＥ１Ｈ／Ｃ（58）からの454塩基対の断片（配列番号20）を増幅した。この領域はＩＥ−１の活性化ドメインに相当することが報告されている（59）。１個のBamHIもしくはBglII切断部位（それぞれＩＥ１Ａ１およびＩＥ１Ａ２の５’末端に組み込まれる）を、ｔｅｔＲをもつＩＥ１Ａのインフレーム挿入を助長する増幅の間にＩＥ１Ａの末端に付加した（下を参照）。ＩＥ−１活性化ドメインのＰＣＲ増幅の条件は、ｔｅｔＲ遺伝子について上述されたものと同一であった。双方のＰＣＲ増幅産物すなわちｔｅｔＲおよびＩＥ１Ａを、それぞれプラスミドｐｔｅｔＲおよびｐＩＥ１ＡをもたらすＴＡクローニングキット（インヴィトロジェン）を使用してプラスミドベクターＰＣＲII（インヴィトロジェン、カリフォルニア州サンディエゴ）に直接クローニングした。ｐｔｅｔＲのいくつかの潜在的クローンをBamHIおよびBglIIで切断して、ｔｅｔＲが上流でBamHIによりかつ下流でBglIIにより側面に配置されたクローンを同定した。ｔｅｔＲおよびＩＥ１Ａ双方の厳密さ(fidelity)を配列分析により確認した。最終的なハイブリッドのトランス作用因子遺伝子を、ｐＩＥ１ＡをBamHIおよびBglIIで切断しそしてＩＥ１Ａを含有する454bpの断片をBglIIでの部分的切断により直鎖状にされたｐｔｅｔＲに挿入することにより構築した。ＩＥ１ＡがｔｅｔＲと同じ向きで挿入された正しいクローンをBamHIおよびBglIIを使用する切断に基礎をおいて同定した。ＩＥ１Ａとインフレームで挿入されたｔｅｔＲを含有するクローンのみが1080塩基対の断片を生成した。生じるプラスミドｐｔｅｔＲＩＥ１Ａは、ＩＥ１Ａとインフレームで融合されたｔｅｔＲ遺伝子から成るハイブリッド遺伝子を含有する（配列番号21、図８）。ｔｅｔＲとＩＥ１Ａとの間の接合点を配列分析により確認した。また、ＳＶ４０ポリアデニル酸化配列を含有するBamHI断片（配列番号22）を、ｔｅｔＲＩＥ１Ａ遺伝子のすぐ下流のBglII切断部位にクローニングした。ＶＰ１６活性化ドメインをＩＥ１からの類似のドメインで交換することに加え、この系に対する別の改変は、ＡｃＭＮＰＶのｐ３５最小プロモーターによるヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）最小プロモーターの置換を包含した。このプロモーターは、初期および後期双方の転写要素を含有するが、しかし主として初期プロモーターである（60）。２個の相補的オリゴヌクレオチド（200pmol）すなわちＰ３５ＰＲＯ１（配列番号23）およびＰ３５ＰＲＯ２（配列番号24）を、100℃に５分間加熱しそして１時間の期間にわたって室温に徐々に冷却させることにより、10×リガーゼ緩衝液（ニューイングランドバイオラブスインク(New Eng land Biolabs Inc.)）中でアニーリングした。生じるアニーリングされた生成物は、ｐ３５遺伝子の転写開始コドンに関して−８から−57bpまでのｐ３５最小プロモーターに相当する（図９）。このオリゴヌクレオチドは、相互とのアニーリング後に末端がSstIと適合するように設計された。しかしながら、このプロモーターの３’末端のみが、SstI切断部位へのクローニング後にSstI切断部位を実際に再生した。ｐ３５最小プロモーターを、ｈＧＨプロモーターとのｐ３５プロモーターの置き換えをもたらしそしてｐ３５最小プロモーターをｔｅｔｏｐ配列の転写調節下に置く、プラスミドｐｔｅｔｏｐｈＧＨのSstI切断部位にクローニングした。ｔｅｔｏｐ配列に関してのｐ３５プロモーターの正しい向きを、SstIでの切断および配列分析により確認した。生じるプラスミドをｐｔｅｔｏｐｐ３５と命名した。同様に、改変ｐ３５最小プロモーターを、上と同一の条件下に別の組のオリゴヌクレオチドすなわちＰ３５ＭＰＲＯ１（配列番号25）およびＰ３５ＭＰＲＯ２（配列番号26）を一緒にアニーリングすることにより構築して、単一塩基対の変更が後期ＴＴＡＡＧＲＮＡ開始部位を排除するプロモーター配列に組み込まれているｐ３５プロモーターを生成させた（図１０）。後期開始部位の除去は、ｔｅｔＲＩＥ１Ａの全体の転写制御下のＬｑｈＩＴ２もしくは他の異種遺伝子の発現をもたらし、そして感染の間の後期の時点での後期開始部位からの転写から生じうる系の漏れやすさ(leakiness)を低下させるはずである。改変ｐ３５最小プロモーターを、プラスミドｐｔｅｔｏｐｐ３５ｍをもたらすｐｔｅｔｏｐｈＧＨのSstI切断部位にクローニングした。ｐｔｅｔｏｐｐ３５およびｐｔｅｔｏｐｐ３５ｍの双方が、ｐ３５／ｐ３５ｍ最小プロモーターの下流にＤＮＡの挿入のための唯一のBamHIおよびNotI切断部位を含有する。ＬｑｈＩＴ２遺伝子およびリーダー配列を、BamHIでの切断によりｐＴＶ３ｔＴａＴｏ−ＬｑｈＩＴ２から単離し、そしてＬｑｈＩＴ２遺伝子およびリーダー配列を含有する300塩基対の断片を、ｐｔｅｔｏｐｐ３５およびｐｔｅｔｏｐｐ３５ｍ双方の唯一のBglII切断部位にサブクローニングした。生じるプラスミドｐｔｅｔｏｐｐ３５Ｌｑおよびｐｔｅｔｏｐｐ３５ｍＬｑは、今や、ｐ３５／ｐ３５ｍプロモーターのすぐ下流にＬｑｈＩＴ２遺伝子／リーダー配列を含有する。ｐ３５／ｐ３５ｍプロモーターに関して正しい向きにＬｑｈＩＴ２を含有するクローンを、SstIでの切断により同定した。ｔｅｔｏｐｐ３５／ｐ３５ｍＬｑカセットを、ＳＶ４０ポリアデニル酸化シグナル配列を含有する204塩基対のBamHI断片（配列番号22）を挿入することにより完成した。内部HpaI切断部位を使用して、ＬｑｈＩＴ２に関して正しい向きにポリＡシグナル配列をもつクローンを同定した。最終のプラスミドｐｔｅｔｏｐｐ３５／ｐ３５ｍＬｑＡを、最終の伝達ベクターへの挿入のためのｔｅｔｏｐカセットを供給するのに使用した。ＡｃＭＮＰＶゲノムにｔｅｔＲＩＥ１Ａおよびｐｔｅｔｏｐｐ３５／ｐ３５ｍＬｑＡを組み込むよう設計された伝達ベクターを２段階で構築した。第一に、伝達ベクターｐＡｃＰ＋ＩＥ１ＴＶ３（テキサス州カレッジステーション、テキサスＡ＆Ｍ大学のドナルド・ジャーヴィス(Donald Jarvis)博士により提供された）を、BglIIおよびNotIで（マルチクローニング部位中で）切断して、このベクターを直鎖状にした。ｐｔｅｔＲＩＥ１Ａ由来の1.3キロ塩基対のBamHI/NotI断片を、トランス作用因子遺伝子をｈｒ５／ｉｅ−１プロモーターの転写制御下に置くｐＡｃＰ＋ＩＥ１ＴＶ３のこれらの切断部位に指向的に(directionally)クローニングした。第二に、ｔｅｔｏｐｐ３５ＬｑＡもしくはｔｅｔｏｐｐ３５ｍＬｑＡカセットを、ｐＡｃＰ＋ＩＥ１ＴＶ３へのｔｅｔＲＩＥ１Ａの挿入の間に再生された唯一のNotI切断部位に挿入した。これを、このベクターをNotIで切断し、そしてＤＮＡポリメラーゼＩの大断片（クレノウ）を使用して５’突出末端を埋めて平滑端を生成させることにより達成した。同様に、ｐｔｅｔｏｐｐ３５／ｐ３５ｍＬｑＡをXhoIおよびSstIIで切断し、そしてｔｅｔｏｐｐ３５／ｐ３５ｍＬｑＡカセットを含有する0.8kbpの断片をＴ４ＤＮＡポリメラーゼを使用して平滑端にした。この断片をその後、平滑端にされたNotI 切断部位に挿入した。ｔｅｔＲＩＥ１Ａ遺伝子に関して双方の向きで各カセットを含有するクローンを選んで組換えウイルスを生成させ、毒素遺伝子発現に対する向きの影響を決定した。これらのクローンを、毒素遺伝子がトランス作用因子と同じもしくは反対の向きにあるかどうかに依存して、それぞれＬｑ＋もしくはＬｑ−のいずれかと称した（図１１）。結果として、４種の異なる伝達プラスミド（ｐＴＶ３ｌｑ＋、ｐＴＶ３ｌｑ−、ｐＴＶ３Ｍｌｑ＋およびｐＴＶ３Ｍｌｑ −）が構築された。加えて、ｔｅｔｏｐｐ３５／ｐ３５ｍＬｑＡカセットが、以前のカセットが今や最初のｔｅｔＲ−ＶＰ１６（ｔＴＡ）トランス作用因子系の転写制御下にあるようにｐＴＶ３ｔＴａＴｏ−ＬｑｈＩＴ２中のｔｅｔｏｐ−ｈＧＨ−Ｌｑカセットに取って代わった伝達プラスミドもまた構築した（図１２）。これらのプラスミドをｐＴＶ３Ｌｑ＋およびｐＴＶ３Ｌｑ−について記述されたものと類似の様式で構築し、そしてテトラサイクリンによりダウンレギュレーションされるそれらの能力での代用のトランス作用因子の効力を最終的に比較するのに使用した。とりわけ、0.8kbpの平滑端にされたXhoI/SstII断片（上を参照）を、ｐＴＶ３ｔＴａＴｏ−ＬｑｈＩＴ２を（ｔｅｔｏｐ−ｈＧＨ−ＬｑｈＩＴ２カセットを遊離した）NotIで切断しそしてクレノウで平滑端にした後に、このベクターに双方の向きでクローニングした。生じる４種の伝達プラスミドは、ｔＴＡに関して双方の向きでｔｅｔｏｐｐ３５ＬｑＡもしくはｔｅｔｏｐｐ３５ｍＬｑＡを含有する。これらの伝達プラスミドをｐｔＴＡｌｑ＋、ｐｔＴＡｌｑ−、ｐｔＴＡＭｌｑ＋およびｐｔＴＡＭｌｑ−と称した。組換えウイルスを、リポフェクチン（ギブコ／ＢＲＬ、メリーランド州ゲイタースバーグ）を使用して、およそ1.0×10⁶個のＳｆ−９細胞に１μgの特異的伝達プラスミドおよび0.5μgのバキュロゴールド［BaculoGo1d］（商標）ウイルスＤＮＡ（ファーミンゲン、カリフォルニア州サンディエゴ）をコトランスフェクションすることにより生成させた。トランスフェクション上清をトランスフェクション後５〜７日後に収集し、そして標準的プラーク精製プロトコールで使用した。５ないし６個の異なるプラーク単離物を最初のプラークアッセイから選択し、各プラークを追加の時間精製し、そしてウイルスを35mmの組織培養皿中の約1. 0×10⁶個のＳｆ−９細胞の感染により初めに増幅させた。生じるウイルスストックを、75cm²の組織培養フラスコで作業ストックを生成させるのに使用した。この様式で調製された８種の異なる組換えウイルスが表１に見出される。表１様々なトランス作用因子にLqhIT2を発現する組換えウィルスこれらの組換えウイルスのいくつかからの選択された単離物のインビボ活性を、３齢のヘリオティスヴィレセンス(Heliothis virescens)幼虫を使用する飼養(feeding)アッセイで評価して、活性の毒素が感染の間に発現されたかどうか、また、その場合はテトラサイクリンもしくは（ドキシサイクリンもしくはオーレオマイシンのような）類似物の存在が未処理の対照に関してウイルスのＬＴ₅₀ を増大させることができたかどうかを決定した。予備研究で、いくつかの異なる処理を評価して、抗生物質が昆虫の中腸に効率的に吸収されたかどうか、また、されない場合は食餌中の成分が吸収に影響したかどうか、そして、吸収が抗生物質の昆虫への直接注入もしくは抗生物質の局所適用により改善され得たかどうかを決定した。３齢のＨ．ヴィレセンス(H．virescens)幼虫を、0.3％ドキシサイクリン（「Ｄｃ」、シグマケミカルカンパニー(Sigma Chemical Co.)、カタログ番号D9891）の存在もしくは非存在下のいずれかで、2000ＰＩＢのｖＴＶ３Ｍｌｑ＋で汚染された食餌プラグ(diet plug) を24時間消費させた。24時間後、個々の幼虫を、感染後40時間まで、対応する汚染されない食餌に移し、この際に幼虫を以下の様式すなわちＡ．食餌で維持される（０％もしくは0.3％のいずれかのＤｃ）Ｂ．水中のＤｃの0.3％溶液４μlを注入されるＣ．0.3％Ｄｃを含むもしくは含まない２％（ｗ／ｖ）アガーで維持される、またはＤ．アセトン中0.3％Ｄｃ４μLの局所適用で処理した。処理Ａ、ＢおよびＤでは、幼虫を処理後にそれらの対応する食餌に戻した。昆虫を、感染後多様な時点で麻痺の症状について評価した。このアッセイの結果は表２に要約され、そして、試験ウイルスのＬＴ₅₀がＤｃにより影響されること、およびこの影響はＤｃが昆虫中に導入される経路に依存することを示唆する証拠を提供する。表２ vTV3Mlq+で感染されたヘリオティスヴィレセンス(Heliothis virescens)幼虫のLT₅₀に対するドキシサイクリンの影響 ¹昆虫を感染させそして０％Ｄｃ飼料で維持した。 ²昆虫を感染させそして０.３％Ｄｃ飼料で維持した。ｖＴＶ３Ｍｌｑ＋で感染されそして注入もしくはアガー上で飼養することのいずれかによりＤｃの存在下に維持された昆虫は、Ｄｃに曝されない対照昆虫よりゆっくり死亡した。この影響はアガー処理でとりわけ強く、ＬＴ₅₀は45ないし60％増大した。選択されたｖｔＴＡｌｑ＋、ｖｔＴＡＭｌｑ−およびｖＴＶ３Ｍｌｑ＋ウイルスのインビボ活性もまた、食餌ピル(diet pill)バイオアッセイを使用して測定した。３齢のＨ．ヴィレセンス(H．virescens)幼虫に、それらの食餌を完全に消費した昆虫が0.3％（ｗ／ｖ）テトラサイクリン（シグマ、カタログ番号T3258）、0.3％（ｗ／ｖ）ドキシサイクリン（シグマ、カタログ番号D9891）もしくは１％（ｗ／ｖ）オーレオマイシン（バイオサーヴ(Bioserve)）を含有する未処理の食餌（大豆粉末／小麦胚芽昆虫培地（バイオサーヴ、カタログ番号9967））に移される前に、ｖｔＴＡｌｑ＋、ｖｔＴＡＭｌｑ−、ｖＴＶ３Ｍｌｑ＋、ＣＧ２０１もしくはＡｃＭＮＰＶ（Ｃ６）からの2000ＰＩＢ（ＬＣ₅₀の約20倍に相当する）で汚染された食餌ピル（50μLの体積）を24時間摂食させた。抗生物質を、食餌の温度が50℃より下になったら溶融された食餌に添加した。食餌中で使用される抗生物質の量は、昆虫に対する悪影響を有する（すなわち発育を阻害する）ことなく抗生物質に曝すことを最大限にするよう選択した。昆虫を28℃でインキュベーションし、そして感染後の多様な時点で中毒／ウイルス感染の症状について評価し、また、各ウイルスのＬＴ₅₀を、時間応答データプログラム(Time Respon se Data Program)（コーネル大学ボイス・トンプソン研究所(Boyce Thompson In stitute at Cornell University)、1990）の分析用ＶＩＳＴＡＴ／ＴＩＭＥ(VIS TAT/TIME-for Ana1ysis)を使用して各抗生物質処理（表３）について決定した。ＣＧ２０１は、テトラサイクリントランス作用因子系なしでｈｒ５／ｉｅ−１プロモーター制御下にＬｑｈＩＴ２を発現する組換えウイルスである。一般に、抗生物質処理は全てのウイルスのＬＴ₅₀を増加させた。しかしながら、これらの杭生物質のｖｔＴＡｌｑ＋６およびｖｔＴＡＭｌｑ−２に対する影響は、ＣＧ２０１およびＡｃＭＮＰＶより有意に劇的であった。とりわけ、これら２種のウイルスは、未処理の対照昆虫に関してテトラサイクリンもしくはドキシサイクリンの存在下に殺虫時間の約30ないし40％の増加を表した。この差異は、ＣＧ２０１で感染された昆虫で観察された差異を越える２ないし３倍の増大に相当した。ｖｔＴＡｌｑ＋の他のウイルス単離物は、ＣＧ２０１に関してＬＴ₅₀値でより小さく劇的な増大を表した。同じ組換えウイルスの単離物間のこの変動性は、おそらく、それぞれの単離物によるトランス作用因子および毒素の双方の発現でのわずかな差異の結果であり、また、バキュロウイルス発現ベクター系を使用する人々により観察される標準的現象である。この理由のため、それぞれの組換え体についていくつかの異なるプラーク単離物を試験した。最も乏しく機能する組換え体は、改変トランス作用因子ｔｅｔＲＩＥ１Ａの転写制御下にＬｑｈＩＴ２を含有するもの（ｖＴＶ３Ｍｌｑ＋）であった。野生型ＡｃＭＮＰＶに関してのこれらの組換え体のＬＴ₅₀での大きな減少は、ｔｅｔＲＩＥ１ＡはＬｑｈＩＴ２発現にトランス作用する(transactivate)ことが可能であった一方、発現が抗生物質の存在下で抑制されなかったことを示唆する。これは、ＶＰ１６活性化ドメインが、テトラサイクリンもしくは類似物と相互作用するトランス作用因子の能力を傷つけるＩＥ１活性化ドメインで置き換えられた場合には、トランス作用因子タンパク質のｔｅｔＲ部分への予期されないコンホメーション変化によるとみられる。要約すると、テトラサイクリン感受性のトランス作用因子の制御下にＬｑｈＩＴ２を発現する選択されたＡｃＭＮＰＶ組換え体でのバイオアッセイの結果は、組換えウィルスのＬＴ₅₀が、昆虫選択的毒素の発現を低下／遅延させるようトランス作用因子と相互作用し得る抗生物質の存在下に感染が起こる場合に、かなり拡大され得ることを示す。参考文献

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】１９９８年２月２０日（１９９８．２．２０）【補正内容】（ｉ）第二の核酸断片によりコードされる調節タンパク質がテトラサイクリントランス作用因子タンパク質である；（ii）第三の核酸断片によりコードされる第二のプロモーターが、最小プロモーター配列に操作可能に連結される１個もしくはそれ以上のテトラサイクリンオペレーター部位を含んで成る；（iii）第四の核酸断片によりコードされる殺虫性タンパク質が昆虫選択的神経毒であり、また、段階（ｃ）でバキュロウイルスの複製を持続させる条件が、テトラサイクリントランス作用因子タンパク質が第三の核酸断片を含んで成るテトラサイクリンオペレーター部位に結合することが不可能でありかつそれによりテトラサイクリンオペレーター部位に操作可能に連結される最小プロモーター配列により指図される遺伝子発現を誘導することが不可能であるように有効量のテトラサイクリンもしくはテトラサイクリンの類似物の存在を含んで成る；７．第二のプロモーターにより指図される遺伝子発現に影響することが可能な調節タンパク質をコードする第二の核酸断片に第一の核酸断片が操作可能に連結される、第一のプロモーターをコードする第一の核酸断片を含んで成るキメラ遺伝子を含有する１個もしくはそれ以上の組換え昆虫細胞を含んで成るトランスジェニック昆虫。９．殺虫性タンパク質をコードする第二の核酸断片に第一の核酸断片が操作可能に連結される、組換え昆虫細胞により発現される調節タンパク質により影響されるプロモーターをコードする第一の核酸断片を含んで成るキメラ遺伝子を有する組換えバキュロウイルス発現ベクター。１０．第一の核酸断片が、最小プロモーターに操作可能に連結される１個もしくはそれ以上のテトラサイクリンオペレーター部位を含んで成る、請求の範囲９の組換えバキュロウイルス発現ベクター。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．（ａ）第一のプロモーターをコードする第一の核酸断片であって、遺伝子発現に影響することが可能な調節タンパク質をコードする第二の核酸断片に操作可能に連結されている第一の核酸断片を含んで成る第一のキメラ遺伝子を有する組換え昆虫細胞を構築すること、（ｂ）第二の核酸断片によりコードされる調節タンパク質により影響される第二のプロモーターをコードする第三の核酸断片であって、殺虫性タンパク質をコードする第四の核酸断片に操作可能に連結されている第三の核酸断片を含んで成る第二のキメラ遺伝子を有する組換えバキュロウイルス発現ベクターを構築すること、（ｃ）段階（ｂ）で構築された組換えバキュロウイルス発現ベクターを段階（ａ）で構築された組換え昆虫細胞に安定に導入すること、そして、（ｄ）第二の核酸断片によりコードされる調節タンパク質の発現が殺虫性タンパク質の発現に影響する、バキュロウイルスの複製を持続させる条件下で段階（ｃ）で創製された組換え昆虫細胞を維持すること、を含んで成る、組換えバキュロウイルスのゲノムに存在するキメラ遺伝子によりコードされる殺虫性タンパク質の発現を制御する方法。２．（ａ）（１）第一のプロモーターをコードする第一の核酸断片を含んで成る第一のキメラ遺伝子であって、遺伝子発現に影響することが可能な調節タンパク質をコードする第二の核酸断片に第一の核酸断片が操作可能に連結される遺伝子、および、（２）調節タンパク質により影響される第二のプロモーターをコードする第三の核酸断片を含んで成る第二のキメラ遺伝子であって、殺虫性タンパク質をコードする第四の核酸断片に第三の核酸断片が操作可能に連結される遺伝子、を有する組換えバキュロウイルス発現ベクターを構築すること、（ｂ）段階（ａ）の組換えバキュロウイルス発現ベクターを昆虫細胞に安定に導入すること、そして、（ｃ）調節タンパク質の発現が殺虫性タンパク質の発現に影響する、バキュロウイルスの複製を持続させる条件下で段階（ｂ）で創製された昆虫細胞を維持すること、を含んで成る、組換えバキュロウイルスのゲノムに存在するキメラ遺伝子によりコードされる殺虫性タンパク質の発現を制御する方法。３．（ａ）遺伝子発現に影響することが可能な調節タンパク質をコードする第二の核酸断片に第一の核酸断片が操作可能に連結される、第一のプロモーターをコードする第一の核酸断片を含んで成る第一のキメラ遺伝子を有する組換え昆虫細胞を構築すること、（ｂ）殺虫性タンパク質をコードする第四の核酸断片に第三の核酸断片が操作可能に連結される、第二の核酸によりコードされる調節タンパク質により影響される第二のプロモーターをコードする第三の核酸断片を含んで成る第二のキメラ遺伝子を有する組換えバキュロウイルス発現ベクターを構築すること、（ｃ）段階（ｂ）の組換えバキュロウイルス発現ベクターを段階（ａ）の組換え昆虫細胞に導入すること、（ｄ）第二の核酸断片によりコードされる調節タンパク質の発現が殺虫性タンパク質の発現に影響する、バキュロウイルスの複製を持続させる条件下でインビトロ細胞培養系もしくは無傷の生存する昆虫内のいずれか中の段階（ｃ）で創製された組換え昆虫細胞を維持すること、そして（ｅ）子孫ウイルスを収集すること、を含んで成る、殺虫性組換えバキュロウイルスの調製方法。４．（ａ）（１）第一のプロモーターをコードする第一の核酸断片を含んで成る第一のキメラ遺伝子であって、遺伝子発現に影響することが可能な調節タンパク質をコードする第二の核酸断片に第一の核酸断片が操作可能に連結される遺伝子、および、（２）第二の核酸断片によりコードされる調節タンパク質により影響される第二のプロモーターをコードする第三の核酸断片を含んで成る第二のキメラ遺伝子であって、殺虫性タンパク質をコードする第四の核酸断片に第三の核酸断片が操作可能に連結される遺伝子、を有する組換えバキュロウイルス発現ベクターを構築すること、（ｂ）段階（ａ）の組換えバキュロウイルス発現ベクターを昆虫細胞に導入すること、（ｃ）第二の核酸断片によりコードされる調節タンパク質の発現が第四の核酸断片によりコードされる殺虫性タンパク質の発現に影響する、バキュロウイルスの複製を持続させる条件下でインビトロ細胞培養系もしくは無傷の生存する昆虫内のいずれか中の段階（ｂ）により調製された昆虫細胞を維持すること、そして、（ｄ）子孫ウイルスを収集すること、を含んで成る、殺虫性組換えバキュロウイルスの調製方法。５．段階（ａ）で、（ｉ）調節タンパク質をコードする第二の核酸断片に操作可能に連結される第一の核酸断片がテトラサイクリントランス作用因子タンパク質である；（ii）第三の核酸断片によりコードされる第二のプロモーターが、最小プロモーター配列に操作可能に連結される１個もしくはそれ以上のテトラサイクリンオペレーター部位を含んで成る；（iii）第四の核酸断片によりコードされる殺虫性タンパク質が昆虫選択的神経毒であり、また、段階（ｃ）でバキュロウイルスの複製を持続させる条件が、テトラサイクリントランス作用因子タンパク質が第三の核酸断片を含んで成るテトラサイクリンオペレーター部位に結合することが不可能でありかつそれによりテトラサイクリンオペレーター部位に操作可能に連結される最小プロモーター配列により指図される遺伝子発現を誘導することが不可能であるように有効量のテトラサイクリンもしくはテトラサイクリンの類似物の存在を含んで成る；請求の範囲４の方法。６．第二のプロモーターにより指図される遺伝子発現に影響することが可能な調節タンパク質をコードする第二の核酸断片に第一の核酸断片が操作可能に連結される、第一のプロモーターをコードする第一の核酸断片を含んで成るキメラ遺伝子を含有する組換え昆虫細胞。７．第二のプロモーターにより指図される遺伝子発現に影響することが可能な調節タンパク質をコードする第二の核酸断片に第一の核酸断片が操作可能に連結される、第一のプロモーターをコードする第一の核酸断片を含んで成るキメラ遺伝子を含有する１個もしくはそれ以上の組換え昆虫細胞を含んで成るトランスジェニック昆虫。８．調節タンパク質がテトラサイクリントランス作用因子タンパク質である、請求の範囲６の組換え昆虫細胞もしくは請求の範囲７のトランスジェニック昆虫。９．殺虫性タンパク質をコードする第二の核酸断片に第一の核酸断片が操作可能に連結される、請求の範囲６の組換え昆虫細胞により発現される調節タンパク質により影響されるプロモーターをコードする第一の核酸断片を含んで成るキメラ遺伝子を有する組換えバキュロウイルス発現ベクター。１０．第一の核酸断片が、最小プロモーターに操作可能に連結される１個もしくはそれ以上のテトラサイクリンオペレーター部位を含んで成る、請求の範囲９の組換えバキュロウイルス発現ベクター。