JPH02149599A - 利尿因子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ この発明は昆虫利尿因子の単離および特徴解明に関する
ものである。単離された利尿因子（Ｄ　Ｆ　）は昆虫で
直接または間接的に液体分泌に影響するＣ−末端アミド
ポリペプチドであった。またこの発明は昆虫利尿因子活
性を有するＣ−末端アミドポリペプチドの組替え生産お
よびその利用手段を提供する。

［発明の構成］ 利尿因子（ＤＦ）はスズメガ科のガの幼虫（ｔｏｂａｃ
ｃ。

ｈｏｒｎｗｏｒｔｎ）、マンズカ　セクスタ（Ｍａｎｄ
ｕｅａ　５ｅｘｔａ）の頭部から抽出し、イオン交換カ
ラムクロマトグラフィー、逆層クロマトグラフィーおよ
び液体クロマトグラフィー（半調製用、陽イオン交換、
分析用、および多孔性）を含む多段階方法を用いて精製
した。生産物は実質上均一なポリペプチドであった。

ｆ＃製後、ＤＦポリペプチドを分析し、そのアミノ酸配
列を決定した。天然ペプチドはＣ−末端アミドをイＪす
る４１個のアミノ酸配列を含んでいることが判明した。

理論に結び付けることを望むわけではないが、この発明
のＤＦは利尿ホルモンと同一物質であるかもしれない、
他方、この発明のＤＦペプチドは副腎皮質が１激ホルモ
ン放出因子のようなある種のホルモン放出国Ｙ−と幾つ
かのアミノ酸配列相同性を示すことから、この発明のｌ
）　Ｆペプチドは利尿ホルモンの放出を刺激することに
より作用するのかもしれないと予想される。何れの場合
であっても、同じ生物学的な最終結果、即ち昆虫の体液
平衡の調節が達成される。

合成的生産または単離したＤＦは、昆虫の正常な体液平
衡に直接または間接的に影響することによって殺虫剤お
よび昆虫個体数調節剤として使用し得る。

添付図面中、第１図、第２図、第３図および第４［２Ｉ
はハイブリッドバキュロウィルスを作成する際の中間体
プラスミドを表しなものである。

下記の定義は本明細書および権利請求範囲のすべてを通
じて適用される。

利尿因子活性（利尿因子様活性も含む）−下記および実
施例Ａで報告するマンズカ・セクスタにおける生体内検
定でマンズカ・セクスタから得られた天然の利尿因子に
よって現れる利尿反応と実質上同形式の反応を発現しま
たはそれによく似た反応が観察されるポリペプチドの活
性（以下、利尿因子をＤＦ、利尿因子類似体をＤＦＡで
示す）。

天然の利尿因子−ある種の昆虫で見出され、直接または
間接的に体液平衡の調節に関与するポリペプチド。

関連昆虫ポリペプチド−昆虫で天然に産生されるＤＦ以
外のポリペプチド。

［実施態様Ｊ この発明の−ｉ様は、関連昆虫ポリペプチドを実質上含
んでいない利尿因子様活性を有し、下式％式％ で示されるアミノ酸配列およびアミド化されたＣ末端を
有するポリペプチドを提供する。

アミド化されたＣ末端を有する上記のペプチドは恐らく
その末端がグリシンであるが、またはグリシンを含んで
いるペプチドの酵素加水分解産物である。したがってこ
の発明のもう一つのＲ様は下式（ＩＩ） Ａｒｇ　　Ｍｅｔ、−Ｐｒｏ−３ｅｒ−Ｌｅｕ−５ｅｒ
−１１ｅ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｐｒ。

Ｍｅｔ−３ｅｒ−Ｖａｌ−Ｌ−ｅｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−
Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−３ｅｒ　ＬｅｕＧｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌ
ｕ　　八ｒｇ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−４１ａ−Ｌｅ
ｕ−ＡｒｇＡｌａ−ＡｌａＡｌａ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ａ
ｓｎ　−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ａｓｐｌｌｅ−Ｘ　
　　　　　　　　　　　　　　（１）（式中、Ｘ　４ｉ
　Ｇｌｙ、　Ｇｌｙ−ＬｙｓまなはＧｌｙ−Ｌｙｓ−Ａ
ｒｇ、好ましくはｃｒｙである） で示されるアミノ酸配列を有する前駆体ペプチドを提供
する。

以下に説明する方法によって得られた天然のＤＦはトリ
プシンで消化し６個の断片を得た。これらの断片の配列
を決定し、下表に示す。

断片　　位置　　　　　　配列 Ｔ−６２−１５Ｍｅｔ−Ｐｒｏ−３ｅｒ−Ｌｅｕ−３ｅ
ｒｌｌｅ−Ａｓｐしｅｕ−ＰｒＩｏ−Ｍｅｔ−５ｅｒ−
Ｖａｌ−Ｌｅｕ−ＡｒｇＴ−４１８−２２Ｌｅｕ−５ｅ
ｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−ＬｙｓＴ　３　　２５−３０　　
Ｌｙｓ−Ｖａｔ−Ｈｉｓ−ＡＩａ−Ｌｅｕ−ＡｒｇＴ−
２２６−３０Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ
Ｔ−１３１１５Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ａｒ
ｇＴ−５３ｔｒ４１　　Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ａｓ
ｎ−Ａｓｐ−１１ｅＴ−５はそのカルボキシル末端にＡ
ｒｇ　（ＪＬｙｓももっていないから、断片Ｔ−５はポ
リペプチドのカルボキシル末端である。

カルボキシル末端の性質はＴ−５およびアミド化物およ
び遊離カルボン酸の形で作成した２種の合成ペプチド（
Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−１１ｅ）の
逆層液体クロマトグララフイーの保持時間を比較するこ
とによって確かめた。その結果からカルボキシル末端は
アミド化されていることが明確に判明した。

単離したＤＦの生物学的活性をチョウ（ビニリス・ラパ
エ（Ｐｉｅｒｉｓ　ｒａｐａｅ））で試験した。ビニリ
ス・ラパエで検定するため、新たに発生したチョウの成
虫を頚部で結紮して断頭し、通常直腸からの透明な液体
の実質的な喪失を刺激するＤＦを腹部から取り除いた。

頚部結紮したチョウは少量の暗色をしたよう便（さなぎ
の代謝廃棄物）だけを排泄した一結紮したチョウにＤＦ
活性画分を注射すると典型的な正常の尿排泄を起こした
。

マンズカ・セクスタＤＦの効果をマンズカ・セクスタの
幼虫で生体内で検討した。これらの幼虫＜ｔＪｉ期第５
期、体重的９ｇ）は４８時間でその体重のおよそ３分の
１の水を排泄した。４時間の試験期間中に、合成りＦｏ
、１μｇを注射した幼虫はＤＦ投与を受けなかった対象
の２倍以上の液体を喪失した。

この発明はまたＤＦおよびＤＦＡ（利尿因子類似体）を
殺虫剤としてまたは他の殺虫剤の活性を増強する薬剤と
して使用する用途を提供する。そのような目的のための
組成物は、ＤＦまたはＤＦＡの有効量を活性ペプチド有
効成分に逆行する効果を示さず、好ましくはＤＦまたは
ＤＦＡの接触取り込みもしくは吸収を促進するＤＭＳＯ
および水のような不活性担体と組合わせて含有している
。

そのような組成物は原則的に不活性担体１ｒｎｌ　当り
（不活性担体が液体の場合）ＤＦまたはＤＦＡポリペプ
チドを０．１ｍｇ〜１．Ｏｍｇ、例えば３０％水性ＤＭ
ＳＯ１ｍｌ当りＤＦまたはＤ　ＦＡポリペプチドを０．
１ｍｇ〜１．０ｍｇ含有する。

組成物は所望により分散剤１例えばラウリル硫酸ナトリ
ウムまたはシリカ、および展着剤、例えばトキシムル（
Ｔｏｘｉ＋＋＋ｕｌ、商標）３６０Ａ（アニオンおよび
非イオン界面活性剤の混合物）のような好適な補助剤を
含有することができる。原則的に補助剤は組成物重量の
２０％までの量を含有し得る。

この組成物を昆虫またはその環境に適用する０代表的な
投与量は１ヘクタール当り０．５〜５０ｋｇ、好ましく
は１ヘクタール当り２〜２０ｋｇの範囲とし、必要に応
じて反復適用する。

またこの発明はＤＦまたはＤＦＡポリペプチドの生産方
法を提供する。ＤＦおよびＤＦＡポリペプチドは従来の
合成方法、例えば固相合成を用いて提供し得る。別法と
して、ＤＦおよびＤＦＡは以下に説明するように一層都
合よく組換えハイブリッドウィルスで生物工学的な発現
により生産される。

またこの発明は利尿因子および利尿因子活性を有するポ
リペプチドを暗号化したＤＮＡ配列を提供する。より具
体的には、この発明はＣ−末端アミドを有するようなポ
リペプチドを暗号化しているＤＮＡ配列、ことに非相同
的なりＮＡと組合わせて利尿因子様活性（利尿因子その
ものも含む）を有するポリペプチドを発現、生産および
／または放出するための系を構成するようなりＮＡを提
供する。そのようなりＮＡ配列は通常のＤＮＡシンセサ
イザーを用いて遺伝暗号の知識からルーチンに組立て得
る。［非相同的なりＮＡ、の語は、天然に存在する利尿
因子ポリペプチドの生産のためのＤＮＡ　（またはその
類似体のための構造遺伝子）とは関連のないＤＮＡを言
う、非相同的なりＮＡの例としてはプロモーターまたは
オペレーター配列を挙げ得るが、単に発現に機能的に関
与しないプラスミドまたはベクターＤＮＡをも挙げるこ
とができる。

単に説明の目的で、下記の表Ａに発明者らの単離した天
然利尿因子のアミノ酸配列を示し５そのような利尿因子
を暗号化したＤＮＡ配列を提供するため各アミノ酸の上
にそれぞれ対応するＤＮＡコドン（またはその式）を示
した。そのようなりＮＡ配列は、ＤＮＡを好適な系また
は環境、例えば昆虫細胞で発現させる場合、５７位の１
ｉｅ−ＮＬ（アミド）を生成することができるアミノ酸
としてＧｌｙを追加し、これに対するコドンで終わる。

Ｇｌｙに対するコドンをＤＮＡ配列に追加することによ
り、好適な細胞系または環境で、成熟した４１個のアミ
ノ酸活性ペプチドを生じるプロペプチドの発現を生じる
０表Ａの５８位のＧｌｙを伸長させて（必要なりＮＡコ
ドンをヌクレオチド配列に提供して）、利尿因子にＣ−
末端！１ｅ−ＮＨｉの他の代用形を提供し得る０例えば
発明者らの研究でＧｌｙコドン（Ｇ　Ｇ　Ｃ）から下流
にＬｙｓ（Ａ　Ａ　Ｇ　）およびＬｙｓ−Ａｒｇ（Ａ　
Ａ　Ｇ　ＣＧ　Ｇ　）を暗号化したＤＮＡ配列も末端Ｇ
ｌｙ−停止を暗号化したＤＮＡ配列から生産されたポリ
ペプチド活性効果を有するポリペプチドを生じることが
判明した。

容易に理解されるように、表Ａに示したヌクレオチド配
列は、表Ａに示されたＤＦの４１個のアミノ酸配列およ
びその信号および停止配列を暗号化して組立て得る多数
のヌクレオチド配列の一つに過ぎない、したがってその
ようなアミノ酸配列で同一アミノ酸を暗号化している異
なったコドンは遺伝暗号によって許容される範囲で容易
に置換され得る。成熟ＤＦポリペプチドの４１個のアミ
ノ酸を暗号化している配列を保持しながら、そのような
コドンまたはヌクレオチドの変化のすべてはそれにもか
かわら・ず表Ａに示した１２３個のヌクレオチド配列と
高い相同性を示すヌクレオチドまたはＤＮＡ配列を生じ
るはずである。そのような相同性は、特に１２３ｂｐを
有し、表Ａに示した成熟ＤＦを暗号化した１２３個のヌ
クレオチド配列に対応するＤＮＡセグメントが、緊縮ハ
イブリッド形成条件下に表Ａに示した１２３個のヌクレ
オチド配列とは異なった配列を有するにもかかわらず、
そのＤＮＡが成熟ＤＦの表Ａに示されたのと同じ４１個
のアミノ酸を暗号化しているＤＮＡへハイブリッド形成
する能力によって示し得る。

また容易に理解され、予測されるように表Ａおよび式（
りによって示された成熟ＤＦの４１個のアミノ酸配列に
さまざまな変化を起こし得るが、それでもなお表Ａに示
した成熟ＤＦ配列の生物活性の形を有するポリペプチド
を提供し得る。そのような修飾されたポリペプチドは本
明細書で利尿因子類似体（ＤＦＡ）と呼ばれ、これらは
生体内マンズカ・セクスタ検定で表Ａに示した天然成熟
ＤＦ配列と実質上同じ形の利尿反応を現わす０表Ａ（お
よび式（■））に示した天然成熟ＤＦのアミノ酸配列の
そのような修飾として、１またはそれ以上のアミノ酸の
欠失（例えばＮ−末端またはその近くにおける欠失のよ
うな）、１またはそれ以上のアミノ酸の他のアミノ酸と
のｒ換（例えば相同的な天然アミノ酸の交換またはＤＦ
活性に不可欠ではないアミノ酸の置換等）、天然４１個
のアミノ酸配列の１またはそれ以上のアミノ酸による追
加または伸長（例えばＮ−末端における伸長のような）
等が挙げられる。そのようなりＦＡポリペプチドを暗号
化した暗号鎖またはセンス鎖を有するＤＮＡ配列は表Ａ
に示したＤＦのためのＤＮＡをここで説明したように組
立てた態様と類似的に組立て得る。ＤＦＡポリペプチド
を暗号化したそのようなりＮＡ配列は好ましくは、そし
て特に緊縮ハイブリッド形成条件下に表Ａに示された天
然成熟ＤＦの４１個のアミノ酸を暗号化したような表Ａ
に示した同一の１２３個のヌクレオチド配列を有し、ま
たはその２本鎖の１つに挿入された１、　２３　ｂ　ｐ
のＤＮＡセグメントへハイブリッド形成する配列である
。ここで予測される緊縮ハイブリッド形成条件は、６．
０×食塩クエン酸緩衝液（ＳＳＣＭ衝液）中、６８℃で
標醜的な態様で実施され、ついで希釈した緩衝液濃度で
３７℃で準に洗浄することにより行われる（起こったハ
イブリッド形成には影響しない）、ハイプリント形成に
使用する１２３ｂｐのＤＮＡは、例えばここに説明する
ＤＦｉ造遺伝子配列の生産方法と類似的な方法によって
通常的に作成され、当技術周知の方法により標識化して
識別し得るハイブリ・ンド形成プローブを作成し得る。

そのようなプローブはまたマンズカ・セクスタのＤＦの
対立遺伝子（ヌクレオチドおよびアミノ酸対立遺伝子の
双方とも）の位置をつきとめこれを単離し、または他の
または関連昆虫種のＤＦを暗号化している遺伝子をつき
とめこれを単離するクローン・バンクを通例のように調
製するのに好適なプローブに使用し得る。

固有のアミノ酸に対する固有のコドンの選択は発現を所
望する細胞の自然の選択にしたがう。

したがってこの発明はさらに（ａ１表Ａにおいてヌクレ
オチド位置番号５４からヌクレオチド位置番号１７７に
またがる１２３個のヌクレオチドを含んだＤＮＡ配列、
または（ｂ）緊縮条件下にそのような１２３個のヌクレ
オチド配列ヘハイブリッド形成するヌクレオチド配列に
より暗号化されている昆虫利尿活性を有するポリペプチ
ドを提供する。

ＤＦまたはＤＦＡを殺虫剤として使用する特殊方法では
昆虫特異性ウィルス（バキュロウィルス）をベクターと
して使用する。ＤＦまたはＤＦＡｔ暗号化している遺伝
子をバキュロウィルスＤＮＡへ挿入し、バキュロウィル
ス・プロモーターのＩ＋御下にお・く、昆虫が組換えハ
イブリッドバキュロウィルスＤＮＡを摂取した後、ウィ
ルスＤＮＡは昆虫体内で増殖し、ウィルスＤＮＡの殺虫
効果を増強するのに充分な量のＤＦまたはＤＦＡが発現
（生産）される、またそのような組換え修飾されたバキ
ュロウィルスＤＮＡは細胞、特に昆虫細胞を形質転換も
しくはトランスフェクトするベクターとして使用され、
ＤＦまたはＤＦＡを生産するための系を提供し得る。

オートグラファ・カリフォリニカ核多角体ウィルスおよ
びボンビクス・モリ核多角体ウィルス等をはじめベクタ
ーとして使用するのに好ましい多数のバキュロウィルス
が当技術上知られており、オートグラファ・カリフオル
ニカが好ましいバキュロウィルスである。特定ウィルス
を選択するコドンの好みは既知のバキュロウィルス配列
におけるコドンの使用法を比較することにより決定でき
る。ついでＣ−末端グリシンのためのコドン、または翻
訳後Ｎ１］２へ修飾し得るこれと等価な配列を追加し、
さらに停止コドンを追加してＤＦまたはＤＦＡのための
構造遺伝子を合成し、好ましくはこれらのコドンの好み
を利用する。好ましくは細胞膜を通過して発現タンパク
質の輸送を提供し得る形の信号または分泌配列へ構造遺
伝子をライゲーションする。そのような配列は分泌に際
して代用形から配列を切り放して成熟生産物を提供する
ように加工し得る。スナイダーらによって報告されたシ
ョウジヨウバエ、ドロソフィラ・メラノガスタ−（Ｄｒ
ｏｓｏｐｈｉｌａ　ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）の幼虫
の表皮タンパク質２に関連した信号配列等をはじめ多数
の信号配列が技術上知られている［スナイダーら、１９
８２年、セル（Ｃｅ　Ｉ　ｌ　）、２９巻、１０２７〜
１０４０頁］、この配列は天然の形で使用できるが、好
ましくはそのコドンをバキュロウィルスに好まれる形に
適合させるよう変えることができる。

信号配列および構造遺伝子は所望のバキュロウィルスプ
ロモーターから下流へ配置する。好適な１０モーターの
例はＮＰＶ多角体遺伝子プロモーターである。ＤＦ組立
て体を挿入する一方法は少なくともその一側、好ましく
は両側をバキュロウィルスＤＮＡ領域ではさまれたＤＦ
またはＤＦＡ遺伝子配列を含んでいる転移ベクターまた
はシャトルベクターを使用することによって行う、ウィ
ルスＤＮＡとシャトルベクターを同時トランスフェクシ
ョン条件下に結合させると二重交差または同時トランス
フェクションが起こる。その結果、発現可能なりＦまた
はＤＦＡ遺伝子を含んだ組換えハイブリッドバキュロウ
ィルスが得られる。

より具体的に説明の目的のため、利尿因子を暗号化して
おり、そのようなバキュロウィルス系の組立てに有用で
、信号配列、Ｇｌｙコドンおよび停正信号を有するＤＦ
ｉｇ造遺伝子を含んでいる全鎖長のＤＮＡ配列を下記の
表Ａに示し、併せてそのような配列に暗号化されている
関連アミノ酸を示す。

［表Ａ］ Ｓａｒｌ１ｍＡｓｐＬａｕＰｒｏＫＥＴ！ｅｒＶａＪＬ
ａｕＡｒｇＧ１ｎＬｙｓＬａｕＳａｒＬｅｕＧ１ｕＬｙ
ｓＧ１ｕＡｒｑＬｙｓＶａＡＨＡｓＡ３（２７ン から明らかなようにアミノ酸位置１位〜１６位までは信
号配列を表し、１７位〜５７位までは天然利尿因子のア
ミノ酸配列を表し、５８位のＧｌｙは最終発現させた成
熟生産物でＩ　Ｉｅ−ＮＨ，の生成を提供する。

表Ａで表されたＤＮＡ配列は、下記の表Ｂで示される８
個の合成オリゴヌクレオチド（ＱＣおよびＯＮ、ＩＣお
よびＩＮ、２Ｃおよび２Ｎ、および３Ｃおよび３Ｎ）か
ら４個のＤＮＡを作成することによって都合よく組立て
られ、通常の方法で提供され得る。

［表Ｂ］ オリゴ　工ニ 表Ａにおいてヌクレオチドはヌクレオチドを表した列の
上方に番号を付け、またアミノ酸の番号はアミノ酸配列
を示した列の下方に括弧して示した。またある制限酵素
部位は、はぼその切断が起こる箇所のヌクレオチド配列
の上方に示した１表オリゴＯＮ： 才リゴ１Ｃ： ５、　ＣＧＣｋＴＧＣＧ入入丁ＧＣＣＧ？ＣＴＣτ入τ
ＣＧＡ？ＡＧＡＴＣＴＧＣＣＣＡ丁ＧＡＧＣＧＴＣＣＴ
ＣＡＧＡＣＡＧＡＡＡＣｉＹＡＧＴ　　３’Ｉ ＣＴτＴＴＴ入Ａ＾ＣＧＡ？八丁ＣＴ＾へ３１オリゴ３
Ｃ： ５’　　Ａ’ｒＣＧＧＣＴＡ　　！’ オリゴ３Ｎ： ５’　　ＡＧＣ？ＴＡＧＣＣＧＡ丁　コ苧表Ｂから明ら
かなようにオリゴヌクレオチド配列ＱＣ（７２ヌクレオ
チド）およびＯＮ　（６４ヌクレオチド）はハイブリッ
ド形成（アニーリング）して、ライゲーションのために
各末端を突出させた４個のヌクレオチドを有するＤＮＡ
　（ＤＮＡＯ）を生成する。同様に配列ＩＣ（４６ヌク
レオ千ド）および１Ｎ（７１ヌクレオチド）はアニリン
グして、各末端を突出させた４個のヌクレオチドを有す
るＤＮＡ　（ＤＮＡ−１）を生成する。

同様に配列２Ｃ（６８７クレオチド）および配列２Ｎ　
（６８ヌクレオチド）はアニーリングして、各末端を突
出させた４個のヌクレオチドを有するＤＮＡ　（ＤＮＡ
−２）を生成する。最後に配列３Ｃ（８ヌクレオチド）
および３Ｎ（１２ヌクレオチド）はアニーリングして、
１末端を突出させた４個のヌクレオチドを有するＤＮＡ
　（ＤＮＡ−３１を生成する。ＤＮＡ−０は表Ａの利尿
ホルモン遺伝子配列の上流部分（＋１ヌクレオチド）を
暗号化しており、ＤＮＡ−１，ＤＮＡ−２およびＤＮＡ
３は順次その下流切片（ＤＮＡ−３の場合は＋１ヌクレ
オチドを追加）を暗号化している。ＤＮＡ０１ＤＮＡ−
１、ＤＮＡ−２およびＤ　Ｎ　Ａ−３は簡単なライゲー
ションの手法で結合させて表Ａに示された完全なりＮＡ
を生成するため、それぞれ相補的な突出末端を有する。

各末端の突出部は「付着」末端を表すように設計され、
さもなければ制限エンドヌクレアーゼ消化（ＥｃｏＲＩ
および）Ｉｉｎｄｌｆｉにより）によって生成され、そ
れによってＤＮＡセグメントを含んだ組立て遺伝子とそ
のようなエンドヌクレアーゼで切断され相補的なライゲ
ーションの相手となる突出部を生成した別のＤＮＡとの
簡単なライゲーションを可能とする。

所望の中間体プラスミドｐＤＨＣを得るため。

既知のプラスミドｐＴＺ１９Ｒ（ファーマシア・インコ
ーホレーテッド（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｉｎｃ、））を
制限エンドヌクレアーゼＸｂａ　Ｉおよび旧ｎｄｌで消
化して得られた巨大断片とＤ　Ｎ　Ａ−２をライゲーシ
ョンしてプラスミドｐＤＨ−１を作成し、これを使用し
てｌｌ１ｌｌ菌細胞を形質転換してコピーを得、構造を
確かめた。制限エンドヌクレアーゼＳａｃ　ＩおよびＸ
ｂａ　Ｉでプラスミドｐ　Ｄ　Ｈ−１を消化して得られ
た巨大断片とＤ　Ｎ　Ａ−１をライゲーションしてプラ
スミドｐＤＨ−２を得、これを使用して同様に細＠細胞
を形質転換した。ついで既知の１ラスミドｐＴＺ１８Ｒ
（ファーマシア・インコーホレーテッド）をＥｃｏＲＩ
およびＳａｃ　Ｉで切断した巨大断片とライゲーション
してプラスミドｐＤＨ−３を作成し、さらにこのプラス
ミドをＳａｃ　Ｉおよび５ｃａＩで切断して１．８Ｋｂ
の断片を貼離し、これをｐＤＨ−２をＳａｃ　Ｉおよび
５ｃａｌで切断して生じた１、２Ｋｂの断片とライゲー
ションし、およそＥａｇｌと５ｐｈＪの位置の間にある
スペーサー領域を含んだプラスミドｐＤＨ−４を作成し
た。したがってｐＤＨ−５はｐＤＨ−４をＥａｇｌおよ
びｓｐｈ　Ｉで切断し、クレノー断片で処理して５°突
出部を埋め、再循環（巨大断片ＤＮＡをライゲーション
）することによって作成した。ついでｐＤＨ−５をＥｃ
ｏＲ■および旧ｎｄｌで切断（消化）して得た巨大断片
をＤＮＡ−３Ｉｆｆ片とライゲーションするとによって
プラスミドｐＤＨＣをを組立てて、再度細菌を形質転換
してコピーを得ることにより構造を確かめた。

プラスミドｐＤＨＣで入手し得る分泌（信号）配列を含
んだ利尾因子遺伝子をついでｐＤＨＣがら切り出し、バ
キュロウィルスＤＮＡから得られた多角体遺伝子配列の
転写制御下に配置する。生じた組換え体遺伝子を含Ｘ、
だシャトルベクターをバキュロウィルスＤＮＡと接触さ
せて、組換えまたは交差を行い、バキュロウィルスゲノ
ムへ組換え体遺伝子の挿入を生じる。生じた修飾された
ハイブリッドバキュロウィルスＤＮＡは回収して増殖さ
せ、昆虫防除におけるバキュロウィルスの毒性または殺
虫作用を増強するのに使用し得る。そのようなＩｆｉえ
バキュロウィルスはまたボンビクス・モリ細胞のような
昆虫細胞に感染（形質転換またはトランスフェクト）し
てＤＦまたはＤＦＡを生産する発現ベクターとして使用
し得る。そのような修飾ウィルスの基本的な作成方法は
既知であり、例えば米国特許第４７４５０５１号に報告
されている。利尿因子様ポリペプチドのそのような系に
活性形で発現され、モして／または殺虫活性を増強する
能力は思いがけなくも判定された。

米国特許第４７４５０５１号に詳細に報告されたように
バキュロウィルス（核多角体ウィルスまたはＮＰＶ）を
含む任意の多角体遺伝子はオートグラファ・カリフォル
ニカＮＰＶを含めそのようなベクターおよび殺虫剤の調
製に使用し得る。ボンビクス・モリＮＰＶに基づいたも
う一つの系もまた重要であり、それに関する基本的な情
報は入手可能であり（例えば公開されたヨーロッパ特許
出願第０１７５８５２号参照）、ＮＰＶ類ヲＤＦおよび
ＤＦＡ多角体の発現に使用し、それとともにＮＰＶ類の
殺虫活性の増強にも使用し得ることを証明するものとし
て採用し得る。

は約１３０Ｋｂの環状ＤＮＡを含んでいる。多角体遺伝
子の転写制御配列を含んでいるＤＮＡをゲノムＤＮＡか
ら切り出し、ＤＦＡ遺伝子を有する転移（シャトル）ベ
クターに、好ましくはＤＦ遺伝子の開始コドン（ＡＴＧ
’）が多角体開始コドン（ＡＴＧ）が配置されたところ
がら５ｂｐ下流となるように結合させる。

より具体的には上記のヨーロッパ特許出願第０゜１７５
８５２号［マエダら、ネーチャー　（Ｎａｔｕｒｅ）、
３１５巻、５９２頁（１９８５年）も参照］に報告され
ているようにＢ　ｍ　Ｎ　Ｐ　Ｖからの多角体遺伝子の
転写制御配列を含んでいるＤＮＡをｐＢｍＥ３６型のプ
ラスミドへ挿入する。そのようなプラスミドは約１０．
５Ｋｂを有し、ｐＢＲ３２２配列に多角体遺伝子を含ん
でおり、第２図に示したｐＢｍＥ３６で見出される多角
体遺伝子からの関連配列とともに第１図に示した。この
多角体構造遺伝子を切り出し、多角体遺伝子プロモータ
ーの後へ合成リンカ−またはプラスミドポリリンカーを
挿入する。そのようなベクターは、あとで行う相同組換
えのためにそれぞれ約３Ｋｂのボンビクス・モリＤＮＡ
由来の５′および３°断片、これらの断片の間へＤＦ遺
伝子を挿入するめのリンカ−マーカー遺伝子（アンピシ
リンに対する）および細菌の複製開始点を有する。この
ようにしてベクターＤＮＡは昆虫ウィルス多角体構造遺
伝子ＤＮＡを含んだ昆虫ウィルスＤＮＡ配列によって５
゛および３°をはさまれたＤＦまたはＤＦＡポリペプチ
ドを暗号化しているＤＮＡを含んで作成される。プラス
ミドｐＢｍＥ３６は実施例８に記載する一層好ましいベ
クターｐＢＥ２８４を調製するのに使用される。ベクタ
ーｐＢＥ２８４は多角体遺伝子の前後に配置したボンビ
クス・モリ由来の３Ｋｂフランキング断片をなお有して
おり、翻訳開始配列前の２個の塩基対を除けば完全な５
°フランキング領域を含んでいる。ベクターｐＢＥ２８
４はさらに追加的なＫｐｎ＋、およびＳａｃ　１部位を
有する。第１図にｐ　Ｂ　ｍ　Ｅ　３６型の基本的なプ
ラスミドをヌクレオチド位置に番号を付けて示し、併せ
て多角・体遺伝子昆虫（リンカ−領域）の−収約な位置
を示す、第２図は多角体構造遺伝子の欠失何およびρＢ
Ｅ２８４を提供する修飾前の多角体遺伝子（リンカ−領
域）の翻訳開始コドン周辺の配列を詳細に示す、第３図
はｐＢＥ２８４のリンカ−領域の配列を、第２図と対比
して変化した配列を小文字活字で示し、併せて挿入され
た制限酵素部位を示す、このように１ラスミドｐＢＥ２
８４は多角体プロモーター配列からすぐ下流にＥｃｏＲ
ｌ、ＸｂａｌおよびＡａｔ　Ｉ制限酵素部位を提供し、
それによって利尿因子をプラスミドへ挿入する手段を提
供する。所望のシャトルベクター（ｐＢｍＤＨ−１）の
ｐＤＨＣおよびｐＢＥ２８４からの調製は実施例９に示
す。

ついでシャトルベクターｐ　Ｂ　ｍ　Ｄ　Ｈ−１をウィ
ルスＤＮＡまたはＢｍＮＰＶと接触させ、ｐＢｍＤＨ−
１由来のＤＦを含有するＢｍＮＰＶでウィルスＤＮＡを
トランスフェクトする。ＤＦ遺伝子を発現させ、感染し
た昆虫でＤＦを生成することが可能な組換えＢｍＮＰＶ
ウィルスを得る同時トランスフェクトおよび組換えウィ
ルスの殺虫剤としての使用については実施例７に記載す
る。

ＤＦまたはＤＦＡポリペプチドはＤＦまたはＤＦＡ遺伝
子を含有するこの発明の修飾したバキュロウィルスから
主として既知の方法で生物工学的に生産し得る。宿主細
胞をおよそ生産に所望される目的量に培養（発育）し、
ついでこの発明の修飾バキュロウィルスＤＮＡで感染さ
せ、得られた感染（形質転換またはトランスフェクト）
細胞がＤＦまたはＤＦＡを発現（生産）し得るように維
持する。そのようなプロセスは細胞に対するウィルスの
破壊的な効果を考慮してバッチ規模で行う。

好適な宿主細胞はアミノ酸配列のＣ−末端をアミド化で
き、例えば昆虫細胞、哺乳動物細胞および酵母細胞等で
ある。

この発明の修飾したバキュロウィルスは、修飾していな
い天然ウィルスを使用し得る一般的な方法で（即ちウィ
ルス感受性の昆虫の座へ有効量を適用することにより）
それ自体殺虫剤として使用し得る。上記のようにして生
産した修飾ウィルスは天然ＤＮＡ配列を含むことによっ
て、ＤＦまたはＤＦＡの再生、致死的な感染および発現
のためそのような目的を実行可能としまたは適格である
ことが判明した。修飾したウィルスは修飾していない天
然ウィルスと都合よくまた組合わせ、さもなければ同時
に適用し得る。そのような修飾し、もしくは天然のバキ
ュロウィルスの殺虫有効量を含有する殺虫剤組成物は、
原則として粘土、ラクトース、脱脂大豆粉末のようなタ
ンパク質物質のような不活性担体を含有することによっ
て適用を助ける。特にタンパク質物質のような担体は摂
食誘引剤であり、含有しているバキュロウィルスの安定
性を増強し得る。そのような組成物は修飾ウィルスまた
は未修飾ウィルスの提供を高めるため望ましくは低温で
、例えば−２０℃で貯蔵する。

この発明によって提供される組成物は、粒子状組成物と
してバキュロウィルスを粘土および／またはタンパク質
マトリックス中に確保している多数の微粒子からなる組
成物となし得る。そのような粒子に関してここで用いた
「確保する」の話はバキュロウィルスの若干の部分が粒
子表面に露出してマトリックスに埋め込まれているもの
を包含し、またバキュロウィルスがマトリックスをカプ
セルとしてその中に完全に包まれているものをも包含す
る。後者の状態の方が好ましく、またこの発明の粒子と
して優れている８この組成物の粒子は１５０ミクロンを
超えず１５０ミクロンまでの微粒子であることを都合よ
い特徴とし、さらにこの発明の特徴は５〜１００ミクロ
ン、好ましくは５〜５０ミクロン、特に５〜２５ミクロ
ンの粒子径を有する満足すべき組成物を容易に製造でき
ることである。

この発明の組成物のこの態様では、マトリックス材料は
、バキュロウィルスおよびマトリックス材料重量合計の
６５〜９９．９重量％、好ましくは８５〜９９重量％を
占める０組成物に使用される粘土は、商業的に入手可能
な加工された微細な主として粉末化された性質の任意の
粘土であってこれを例示すればカオリン（Ｋａｏｌｉｎ
）粘土、オランチャ（Ｏｌａｎｃｈａ）粘土、アタパル
ガス（Ａｔｔａｐｕｌｇｕｓ）粘土、ベントナイト（Ｂ
ｅｎ　ｔｏｎ　ｉ　ｔｅ　）粘土等が挙げられる。好ま
しい粘土はオランチャおよびアタパルサイトである。ま
たマトリックス材料として使用する野菜タンパク質はＷ
Ｊ、４４１１な主として粉末形態に加工された任意のさ
まざまなタンパク質供給源から得られる。これらの材料
は好ましくは脱脂し、さもなければ実質的に脂肪を含有
しないものである。野菜タンパク質供給源を例示すれば
大豆、綿の実、ヒマワリの種子および種々の酵母抽出物
等である。好ましい野菜タンパク質供給源は大豆タンパ
ク質および綿の実のタンパク質であって好ましくは脱脂
した供給源、−層好ましくは脱脂した大豆タンパク質で
ある。動物タンパク質の代表例としては脱脂乳、カゼイ
ン、卵アルブミンである。

天然供給源から得られたタンパク質物質は非タンパク質
物質の相当量を含有し、ここで用いる「タンパク質ｊお
よびタンパク質物質の語は、一般に実際のタンパク質を
少なくとも約２５重量％程度まで含有している材料を指
す、好ましい野菜タンパク質のような非常に好適な材料
は通常実際のタンパク質を４０％〜７５％含有している
。

個々の粒子および組成物全体はバキュロウィルスが比較
的低濃度であってもよいが、最低実用的な観点から組成
物は少なくとも１．０マイクログラム／ミリリツトル（
７７ｍ１）のＬＤｓａ活性当量を含有することが望まし
い０組成物の効力は好適に０．００１　ｙ／ｍ１〜１．
Ｏｒ／ｍｌの範囲であり、通常０．００３ｒ／ｍ１〜０
．４７／ｍ＋の範囲である。使用され参考にされる殺虫
活性もしくは効力の測定値は、３０℃で発育させた第１
虫齢幼虫の５０％に対する標準投与量を提供するのに必
要な餌のマイクログラム／ミリリットル（７７ｍ　＋）
で報告されたＬＤ、。値に基づいている。その方法はト
リコブシア・二（Ｔｒｉｃｈｏｐｕｓｉａ　ｎｌ）Ｎ　
Ｐ　Ｖの効力評価に関してインセクト・パソロジ−［（
ＩｎｓｅｃｔＰａｔｈｏｌｏｇｙ）、６巻、７３７〜４
５頁（１９６５年）］に基本的に報告されている。

この発明により提供された粒子化した組成物は所望の殺
虫有効量を有し、光による不活性化および熱変性による
効力低下に対する抵抗性を改善することを特徴とする。

この組成物の他の性質、ことに物理的性質はさまざな因
子によって変化し、特にマトリックスに使用した材料に
よって変化する。マトリックスが粘土だけからなる組成
物は一般に良好な水和性を特徴とするが、展着性に乏し
い傾向があり、ある場合にはやや柔らかな粒子からなる
こともある。一方、マトリックスが野菜タンパク質だけ
からなる組成物は一般に良好な展着性および硬さを特徴
とするが、水和性が乏しい傾向がある。動物タンパク質
を大量に含有している組成物は良好な展着性を示すが、
水和性および硬さに乏しい傾向がある。したがって特に
好ましいマトリックス材料は野菜タンパク質、粘土およ
びその混合物からなる群から選ばれる。またマトリック
スが植物タンパク質および粘土をよく混和した混合物か
らなる組成物は良好な水相性、展着性および硬さを提供
する利点を有するばかりでなくその他の好ましい性質を
示す、したがって特に好ましいこの発明の組成物はマト
リックスが植物タンパク質と粘土との双方の混合物から
なるものである。野菜タンパク質の粘土に対する重量比
はタンパク質が粘土に対して０．１〜１０重量部の範囲
であり、好ましくは植物タンパク質が粘土に対して０．
３〜４重量部、−層好まｌ、　＜は粘土に対して０．５
〜３重量部である。

［実施例］ ［製剤実施例］ ＤＦ　　ＤＮＡ配列を有するバキュロウィルス調製品８
０ｇを水５００ｍ１　とワーリングブレンダーで１分間
混和する。オランチャ粘土１５００ｇおよびに一ソイ（
Ｋ−８ａｙ　（商標）、脱脂大豆粉末）８２０ｇを水１
１リットルに懸濁し、これをバキュロウィルス懸濁液と
混合する。混合物の最終容量が１５リツトルとなるまで
水を加えて、その都度均一な懸濁液が得られるまでそれ
ぞれよくかき混ぜる。混合物を２０００〜４０００ρｓ
ｉの圧力でオリフィスＮｏ、ＳＡ、０．０４４４を使用
して入口温度３２０　　Ｆ（１６０℃）および出口温度
１６０　　Ｆ（約７１℃）で噴霧乾燥し、噴霧乾燥粒子
組成物を作成する。

多角体プロモーターを含んでおり他のハイブリッド殺虫
作用ウィルスを作成するオートグラファカリフオルニカ
ＤＮＡの類似の組立てに有用なオートグラファ・カリフ
ォルニカ由来の配列を挿入したその他のプラスミドおよ
びベクターの組立てを実施例に例示的に示す、下記の実
施例は単にこの発明を説明するためのものであってこれ
によって発明の範囲を限定するものではない。

［実方！ＩＭＡ］ 生物検定 ベルらの報告による人工餌でマンズカ・セクスタを飼育
する［ベルら、（１９７６年）、アナルズオブ・エント
モロジカル・ソサイエテイー・オブ・アメリカ（Ａｎｎ
、　Ｅｎｔｏｍｏｌ、　Ｓｏｃ、　Ａｍ、）、６９巻、
３６５〜３７３頁コ、アオムシ（ビニリス・ラバエ（Ｐ
ｉｅｒｉｓ　ｒａｐａｅ））はトレッチュラーらにより
報告された餌［トレッチュラーら、（１９８５年）ジャ
ーナル・オブ・エコノミツク・エンドモロジー　（Ｊ、
　Ｅｃｏｎ、　Ｅｎｔｏｍｏｌ、　）、７８巻、１５２
１〜１５２３頁コに新鮮なキラペラの葉を食欲刺激剤と
して追加することによって修飾し飼育する。各３リツト
ルずつの仕込み餌をブレンダーですり潰し、未熟なキャ
ベツの葉は加える前に加熱（１５分間、１６３℃）する
。

マンズカ・セクスタ生物検定（生体内）マンズカ・セク
スタの後期第５期幼虫は飼育後４８時間で体重を３０％
減少する。ＤＦに対するこの見掛けの感受性を合成りＦ
活性の検定に使用する。匍旬前、飼育後のマンズカ・セ
クスタを消灯直後に使用する（１２−１２光周期）、こ
れらの幼虫の体重を測り、腹部領域の昆虫血液系へ合成
りＨ０，１μｇとともに「マンズ力食塩水」２４μｍ（
４ｒｎＭ　　ＮａＣｌ、４０ｍＭ　　ＫＣＩ、３ｍＭ（
：　ａ　Ｃ＋　２．１８ｍＭ　ＭｇＣｈ）または食塩水
２５μｍを注射する。４時間後、もう−度これらの動物
の体重を測り、糞粒の乾燥重量を差し引いて水分の喪失
合計重量を測定する。

し実施例Ｂ］ 昆虫制御（殺虫作用）活性の測定／評価の一検定はポリ
ペプチドの接触および浸透力に基づいて行う、ＤＭＳＯ
をそのような取り込みを促進する担体として使用する。

したがって評価する因子を約３０％水性ＤＭＳＯに溶解
し、２０日齢に揃えた鱗翅目昆虫（マンズカ・セクスタ
）の試験群を第３虫齢初期に約２７℃でこの溶液を種々
の濃度（１ｍｇ／ｍｌおよび１０倍系列希釈濃度）で適
用する０発育遅延および残りの脱皮期を通じて生存率に
ついて昆虫を評価し、その結果をＤＭＳＯ溶液だけで処
理した対照群と比較する。

実施例１ 抽出および予備精製 ファレート成虫マンズカ・セクスタを成虫羽化の２４〜
４８時間前に断頭し、頭部を冷凍する。

冷凍した頭部の脳を含んでいる後頭部および心臓体／ア
ラタ体複合部に直径５ｍｍのコルクポーラ−で穴を明け
、抽出まで一８０℃で貯蔵する。

マンズカ・セクスタの摘み取った一万個の頭部（新鮮重
量的４２０ｇ）を冷アセｌ＝ン１５００ｍ１でホモジナ
イズしてＰ遇する。残留物をＩＭＨＯＡｃ／２０ｍＭ　
　ＨＣＩ（０，１ｍＭ　　フェニルメチルスルホニルフ
ルオリドおよび新たに調製した０、０１ｍＭペプスタチ
ンＡを含む）１５００ｍ１で抽出し、１００００Ｘｇで
２０分間遠心する。

同じ溶液１２００ｍ１でベレットを再抽出、再遠心した
後、１−ルした上清をＩＭ　ＨＯＡｃで平衡化したＳＰ
−セファデックスＣ−２５カラム（２５Ｘ　７００　ｍ
　ｍ、支持体容積３００ｍ１）に掛ける。１ｍｌ当りｌ
）ｔＭ　　ＨＯＡｃ、０．０５Ｍ　ＮＨｉ　ＯＡ　ｃ　
（Ｔ）　Ｈ４、Ｏ）およびそれぞれ０．０５Ｍ、０．１
Ｍ、０，４Ｍおよび０．８Ｍ　ＮＨ４０Ａｃ（ｐＨ７，
０）を含む溶液１０１００Ｏでカラムを溶出する。ＤＨ
活性を有する０、４Ｍおよび０．８ＭのＮ　Ｈ４０Ａｃ
の両画分を０．１％トリフルオロ酢酸（Ｔ”　Ｆ’　Ａ
　）で平衡化した逆層ビダック（Ｖｉｄａｃ）Ｃａ充填
物（２０〜３０μｍ、ポリエチレンフリットを含んだ７
５ｍ１ポリプロピレンシリンジ簡）１０ｇへ直接適用す
る。カートリッジを１ｍｌ当り０．１％ＴＦＡおよび０
．１％ＴｒＡ２容液の２０％、３５％および５０％ＣＨ
３ＣＮ溶液１００ｍ１ずつでそれぞれン容出する。ＤＨ
は３５％ＣＨ，ＣＮ１０．１％ＴＦＡ画分から回収され
る。

実施例２ 精製 ビグツクＣ４半調製用液体クロマトグラフィー液体クロ
マトグラフィー（ＬＣ）にりるこの精製および以後の精
製はパーキン−エルマー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）４
１０型バイオ＜Ｂｉｏ＞ポンプ、レオダイン（Ｒｈｅｏ
ｄｙｎｅ　）ループインジェクターおよび常時２２０ｎ
ｍに合わせたクラトス（Ｋｒａｔｏｓ）　７８３型可変
波長検出器で実施する。これまでのＤＦを単離する試み
では、逆層カートリッジ段階または半調装用精製物から
溶媒を蒸発する際に、多分他のタンパク質を伴って吸着
または酸化するため生物活性が減少または消失するのが
観察された。水で希釈した画分がポンプによりカラムへ
圧入されるように溶媒分配バルブの前のｒ［ｌＪ溶媒系
に設置したレオダイン５３０２型バルブによってポンプ
系統を修飾することにより、この問題を解決した。実施
ＩＭＩからの活性成分を水２００ｍ１で希釈し、２０％
ＣＨ）ＣＮの０．１％ＴＦＡ溶液で予じめ平衡化したビ
グツクＣ４半調製用カラム（１０Ｘ２５０ｍｍ）へポン
プで圧入する。０．１％ＴＦＡのＣＨ，ＣＮ溶液２０−
４０％の直線濃度勾配を用いて５ｍｌ／分の流速で８０
分間カラムを溶出し１０ｍ！の両分を採取する。ＤＦ活
性は３４〜３８分で溶出する両分で見出される。これら
を合わせて、水４０ｍ！で希釈し、これを再度同じカラ
ムに今度は１０％１−プロパツール＜１−Ｐｒ０Ｈ）１
０．１％ＴＦＡで平衡化して圧入する。保持された物質
を０．１％ＴＦＡの１−プロパツール溶液１０−３０％
の直線濃度勾配により５ｍ１ノ分の流速で８０分間溶出
し、１０ｍ１の画分を採取する。

ＤＦは４８〜５２分の画分で回収される。

ＴＳＫ　　５Ｐ−５ＰＷ　ＬＣ Ｏ１ＩＭリン酸！ｉ液（ＰＨ６，２５＞２ｍｌ　を添加
した後、上記の活性画分を１０％ＣＨ、ＣＮを含有する
０、０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，２５）で平衡化した
ＴＳＫ　　５Ｐ−５ＰＷイオン交換カラム（７，５Ｘ７
５ｍｍ）に掛ける。カラムを１０％ＣＩ（、ＣＮを含有
する０、０２Ｍリン酸Ｍｔｌｉ液（ｐＨ６，２５）のＯ
−０，１Ｍ　ＮａＣ＋溶液で１０分間、ついで同じ＃ｌ
ｌ液液０．１−０．４Ｍ　ＮａＣ１溶液で６０分間の連
続した２つの濃度勾配で１ｍｌ／分の流速で溶出する。

２ｍｌの両分を採取する。

ＤＦは４８−５２分の画分で回収される。

ビダ・ツクＣ４分析用ＬＣ 緩衝塩および１０％ＣＨ３ＣＮを含有する上記の両分か
らの活性成分を合わせ、５ｍｌループインジェクターで
３０％ＣＨ３ＣＮ１０．１％へブタフルオロ醋酸（ＨＦ
　Ｂ　Ａ　）溶液で平衡化したビグツクＣ４カラム（４
，６Ｘ１５０ｍｍ）に掛けた。カラムを３０−４０％Ｃ
Ｈ３ＣＮ濃度勾配のｏ、ｉ％ＨＦＢＡ溶液で１．５ｍｌ
／分の流速で７５分間溶出し３ｍｌの両分を採取する。

ＤＦは３６−３８分の画分にだけ回収された。

ビグツクＣ４多孔性ＬＣ 上記の段階で得られた活性画分を水６ｍｌに希釈し、５
ｍｌループインジェクターを用いてビグツクＣ４多孔性
カラム（２，Ｉ　Ｘ２５０ｍｍ）へ２回注入する。カラ
ムを２０％ＣＨ，ＣＮの０゜１％ＴＦＡ溶液で平衡化す
る。カラムを２０−４０％ＣＨＩＣＮ１０．１％ＴＦＡ
の直線濃度勾配で０．３ｍｌ／分の流速で１００分間溶
出し、６９．０〜７１．５分をピークとして精製したＤ
Ｆを回収する。

実施例３ トリプシン消化 実施例２で得られた精製ＤＦ（１，５０モル）をトリ１
シン１ｔｔｇ　（ＴＰＣＫ処理、シグマ（Ｓｉｍａ））
１μｇを含有する０、１Ｍ　　）−リス−ＨＣｌ（ｐ　
Ｈ８。

０）１０．０１Ｍ　ＣａＣｌ２５０μｌに溶解する。

３５℃で２時間インキュベートした後、反応混合物をビ
グツクｃｐｓカラム（４，６Ｘ　１００ｍｍ）へ掛ける
。断片ペプチドは０−４０％ＣＨ，ＣＮの０．１％ＴＦ
Ａの濃度勾配で０．５ｍｌ／分の流速で８０分間溶出す
る。その結果を第２表に示す。

実施例４ 配列分析 実施例２および３からの精ＷＡＤＦおよびトリプシン消
化したペプチドをアプライド・バイオシステム（Ａｐｐ
ｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）４７７　Ａ型パルス液
相プロティンシーケンサ−を使用して配列決定した。

遊離したフェニルチオヒダントイン（Ｐ　Ｔ　Ｈ）アミ
ノ酸はオン・ライン・アナライザー（アプライドバイオ
システム１２０Ａ型）によって解析した。

実施例５ アミノ酸分析 精製したＤＦおよびトリプシン消化したペプチドを６Ｎ
　　ＨＣＩ／１％フェノール蒸気で加水分解する（１１
０℃、２０時間）、加水分解物をフェニルチオカルバモ
イルアミノ酸誘導体へ変換した後、ウルトラスフェア（
Ｌｌｌｔｒａｓｐｈｅｒｅ）ＯＤ　Ｓカラム＜４−６　
×１５０　ｍ　ｍ　）を使用する逆層ＬＣによって分析
する。

開始ｗＬ街液（Ｄ）は１．１５ｍＭ）−リエチルアミン
および２％メタノールを含有する０、０５Ｍ酢酸ナトリ
ウム（リン酸でｐＨ６に調節）である。

溶出緩衝液は有機溶媒として、（Ｂ）は５０％メタノー
ル、（Ｃ）は５０％Ｃ８３ＣＮを含有する以外は上記と
同一である。カラム洗浄溶媒（Ａ）は７０％ＣＨ，ＣＮ
水溶液である。緩衝液はパーキン−エルマー４型ポンプ
を用い、下記のプログラムにしたがって導入する（第３
表で星印で示した以外の時間は上記による直線濃度勾配
を用いた。これらは段階的濃度勾配または均等区分であ
る）。

［第３表］ ０分　　１．０　ｍ１７分 ２１分 ３０分 ４５分　　　ｌｌ ５５分”　　１．５　ｍ１７分 ７１分”　　１．０　ｍ１７分 ０　　　３０％　　　　０ ０　　　　０　　　３５＄ ０　　　　０　　　４９％ １００χ　　　００ １００％ ７０！ ６５χ Ｈ ０ｏｚ （第３表つづき） 実施例２の各段階から得られた両分は新たに発生したビ
ニリス　ラバエの成虫を用い、ドレスらがダナウス・プ
レクシプス（Ｄａｎａｕｓ　ｐｌｅｘｉｐｐｕｓ）につ
いて先に報告し、参考として本明細書に包含させた検定
方法にしたがい、生体内で検定する［ドレスら、ジャー
ナル・オブ・インセクト・フイジオロジー（Ｊ、Ｉｎ５
ｅｃｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、）、２５巻、８９５〜９０１
頁］、ドレスらによって報告された光同期に基づく熱パ
ルスの適用に追加して、ファレート成虫を温水浴上（５
４５℃）に置いたボール箱に入れて成虫羽化を揃える。

新たに羽化した成虫のチョウは脱皮後１分以内にＣＯ３
で麻酔する。

ついでそれらの頚を１５分以内に結紮して、直ちに断頭
し、その傷を融解したロウで密封する。各動物を１オン
スのプラスチック製コツプの縁から翅をひろげるまで吊
るす、断頭したすべてのチョウは脱皮の１時間以内に秤
量する。断頭していない対照は羽化して約１５分後に秤
量し、それ以外は処置をしない、容器への吸着を防ぐた
め、溶媒を蒸発させる前にすべての試験画分にウシ血清
アルブミン（ＢＳＡ）（５０μｇ）を添加する。処置し
た動物は「マンズカ食塩水」５μｍに溶解した試験画分
５μｍを胸部腹側に注射する。断頭した対照は食塩水５
μｌを投与する。蒸発を防ぐためプラスチック製カップ
に蓋をする。注射して３０分後にチョウをもう一度秤量
する。この間の体重減少を腸から排泄された液体とみな
す。

正味の正常利尿を測定するには、未処置対照の平均体重
減少から処置対照の平均体重減少を差し引く、典型的な
１１４ｍｇの未処置昆虫対照動物の３時間検定で平均体
重減少は２３ｍｇ（平均体重の２０％）である０食塩水
５μｍを注射した典型的な１１８ｍｇの断頭対照動物の
平均体重減少はｌ１ｍｇ（平均体重の９％〉である０頭
１個分に相当するＤＦ食塩水溶液５μｍを注射した典型
的な１１８ｍｇの断頭動物の平均体重減少は２４ｍｇ（
平均体重の２０％）である、処置し断頭した動物の体重
減少は正味の正常利尿の分数として表す。

実施例６ 生物工学的方法 別に示すことを除いて、次の一般的方法および操作をｐ
ＤＨＣなどのベクターの構築についてここに記載した生
物工学的試験の実施に使用した。

遺伝子構築 ＤＮＡフラグメントを相補的な鎖のように化学的に合成
した。鎖を遺伝子のフラグメントを形成するようにアニ
ールし、−度に１つプラスミドに結合し、結果として完
全遺伝子構築物ができた。中間および最終プラスミド構
築物は、制限エンドヌクレアーゼ消化およびゲル電気泳
動法により診断制限部位の存在および部位について分析
した。構築物は、最終配列を確証するために配列分析し
た。

ＤＮＡ合成 一本鎖ＤＮＡフラグメント（オリゴヌクレオヂド）を標
準０−メチルまたはβ−シアノエヂルーデオキシヌクレ
オチドホスホルアミダイト・ケミストリー（サイエンス
（Ｓ　ｃｉｅｎｃｅ）　２３０巻、２８１−２８５頁、
（１９８５年））を使用した自動固相法により合成した
。ベックマン・システム・ｌプラスＤＮＡシンセサイザ
ーまたはアプライド・バイオシステム・モデル３８０Ａ
−ＤＮＡシンセサイザーのどちらかをそれぞれの製造者
から提供された化学的キットを使用してオリゴヌクレオ
チド合成に使用した。

遺伝子フラグメント構築 二本鎖ＤＮＡ遺伝子フラグメントを緩衝ＮａＣｌ溶液（
典型的には１０ｍＭトリス−ＨＣＬｐＨ７゜５．２０ｍ
ＭＮａＣｌ、０．１ｍＭＥＤＴＡ、１．５ｘＱエペンド
ルフ・マイクロツユ−’７’り４００μρ中で２種の相
補的オリゴヌクレオチドをそれぞれおよそ５μ９混合し
て構築した。混合物を６５から１００℃で５分から２０
分間加熱し、ゆっくりと１０分から６０分間かけて室温
にもどした。

結合 ＤＮＡフラグメントの結合は、標準的方法（マニアチス
ら、モレキュラー・クローニング＋４６頁（１９８２年
））またはタカラ・コーボレーションにより製造された
ライゲーション・キットにより実施した。典型的には、
結合反応物５０μａは、脱りん酸付着エンド・ベクター
ＤＮＡ４０ｐｍｏ！、付着エンド挿入ＤＮＡ２０ｐｍｏ
ｌおよび２５ｍＭ）リス−０１、ｐＨ７，８，１０ｍＭ
ＭｇＣＩ２．４ｍＭメルカプトエタノールおよび０．４
ｍＭＡＴＰ中の０．０２５ＵＴ４ＤＮＡリガーゼを含む
。ベクターが脱りん酸化されていない場合は、挿入ＤＮ
Ａ　８０　ｐｍｏｌを含むことを除いて類似方法を実施
する。タカラ・キット溶液の使用時は、上記の記載と同
様なベクターおよび挿入ＤＮＡｆｆ１をタカラ・キット
溶液Ａ２０μＱおよびタカラ・キット溶液８５μρに加
えた。標準結合反応物は、４°ＣＩ６時間インキュベー
トした。タカラ・キット結合物は、１６℃３０分間イン
キュベートした。正確な結合反応条件は、個々の反応に
より変化する。さらに、平滑エンド・フラグメントを結
合する場合、平滑エンド・フラグメントに適した条件を
使用する（例えば１００倍高いりガーゼ濃度）。それぞ
れの結後形質転換反応および結果生じる形質転換体の分
析を次に行った。−収約に、形質転換反応後の細菌学的
コロニーから選択されたＤＮＡは、以下に記載されたミ
ニ・スケール製造法により製造され、制限酵素消化およ
びゲル電気泳動法により分析された。それぞれ特定の結
合生成物に適した制限酵素は結果生ずる組み変えプラス
ミドが目的とする配置をもつことが確認できるように選
択した。

形質転換・ 形質転換に有効なＪＭＩＯＩ細菌細胞を、グリセリンを
１５％になるように細胞に加え、細胞を凍らせ、使用す
るまで一７０℃に保つとの点で修正した標準ＣａＣｒｔ
処置方法で製造した。組み変えプラスミドによる細胞の
形質転換には、結合反応物５および５０μｍ２を水冷し
た５０ｍＭＣａＣ１゜５０μｇと混合した。本溶液を新
たに解凍した有効なＪＭＩＯＩ細胞２００μｇに加え、
混合物を水浴で３０分間インキュベートした。細胞に４
２℃で６０から９０秒熱でショックを与え、２分間水上
で冷却した。細菌培地（ＴＵＭ）１．２ｍｌを加え、混
合物を３７℃で１時間撹拌した。培養物１００から２０
０μＱをＴＡまたはＴＡＸ　！プレートに塗布し、−晩
中３７℃でインキュベートした。

プラスミド・ミニ・スケールＤＮＡ製造法変換プレート
からのコロニーをと’）、１　、　５ｆｆＱエペンドル
フ・マイクロフユーゲ管中でＴＵＭ培地１岐およびアン
ピンリン５０μ９／Ｉｔ（１（こ接種した。

ミニ培養を３７℃で６から１８時間インキュベートし、
プラスミドＤＮＡの小規模試料を急速煮沸方法（マニア
デスら、前掲、３６６頁）で製造するが、既知利用方法
もまた使われる。

細菌培地 ＴＵＭ培地 １０９／（ｌバクト・トリプトン ５９／ｑバクト酵母抽出物 ５ｇ／ＣＮａＣ１ ０，７９／ｆ２Ｋ　ＣＩ ０．２５９／ρＭ　ｇ　Ｓ　Ｏ４・７ＨｚＯＴ（ＪＭ培
地および １５９＃２バクト寒天 ＴＴＪＭプレート ＴＡ（ＴＵＭ／アンピンリンプレート）ＴＵＭプレート
および １００ｆｆｆ２／ｌ）アンピシリン ＴＡＸ　Ｉプレート　　ＴＡプレートおよび５０ｘＱ／
　Ｑ　　Ｘ　ｇａｌ（５−ブロモ４−クロロ−３−イン
ドリル〜β −Ｄ−ガラクトシド） ４０ｘＱ／Ｑ　　Ｉ　Ｐ　Ｔ　Ｇ　（イソプロピルチオ
−β−ガラクト シド） 制限酵素消化 制限エンドヌクレアーゼをニュー・イングランド・バイ
オチック、インターナショナル・バイクテクノロジーズ
・インコーホレイテッド（Ｉ　ｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａ
ｌ　　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ、　）
またはプロメガ・バイオチック（Ｐ　ｒｏｍｅｇａ　　
Ｂ　１０ｔｅｃ）から購入し、提供者の指示書により使
用した。典型的には、プラスミドＤＮＡＩから５μ９お
よび酵素ｌから一２ＱＵを使用して制限酵素反応物２Ｏ
−５０ｔｔＱを作った。また反応物は、ＩＯＸ反応緩衝
液の１０分の１容量を含み、これは酵素提供者からの緩
衝液または３種の制限酵素緩食液（マニアデスら、前掲
、４５３頁）の１種を用いた。

アガロースゲル電気泳動 ＤＮＡフラグメントを０．５から４％アガロース（ＢＲ
Ｌアガロース、ＢＲＬ、ＬＭＰアガロースまたはＦ　Ｍ
　ＣＮｕＳ　１ｅｖｅＧ　Ｔ　Ｇアガロース）、エチノ
ウムブロミド０　、　５　ｕ９／ｘＱ、　　４０ｍＭ　
トリスアセテートおよびｐＨ８，３１ｍＭエチレンジア
ミン四酢酸を含むゲルで分析した。電気泳動は、水平電
気泳動タンクでマニアデスら、前掲に記載された標準的
方法により行なった。エヂジウムブロミド染色ＤＮＡフ
ラグメントを短波ＵＶ光で発色しおよびポラロイド４Ｘ
５カメラおよびポラロイド型５７フイルムによりＵＶ変
換照明装置で写真に写した。未知フラグメントの大きさ
は隣接ＤＮＡの標孕の大きさ（ＢＲＬＩｋｂラダーまた
はラムダ相ＨｉｎｄＩＩＩ消化）を比較し決定した。フ
ラグメントがゲル電気泳動法で精製された時、最終フラ
グメントをアガロースゲルから切り除き、透析管の小片
で電気溶出した。

の５′突出から平滑末端への変換 ５°突出付着エンドのＤＮＡフラグメントをエシェリヒ
ア・コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩのフ
レナラフラグメントを使用した充填反応により平滑エン
ド・フラグメントに変換した。

３°突出から平滑末端への変換 ３゛突出付着エンドのＤＮＡフラグメントをＴ４　Ｄ　
Ｎ　Ａ−ポリメラーゼまたはエシェリヒア・コリ（Ｅ、
　ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼ■のフレナラフラグメ
ントを使用した３°→５゛工ンドヌクレアーゼ反応によ
り平滑エンド・フラグメントに変換した。

ＤＮＡ配列決定 合成遺伝子部分を含むプラスミドをサンガー・ジデオキ
シ法またはその変法を使用して配列決定した。プラスミ
ド感染細胞をヘルパー・ファージＭ１３ＫＯ７で共同感
染させ、−末鎖ＤＮＡを製造者であるファルマシア・イ
ンコーホレイテッドが示すように精製した。ＤＮＡ配列
決定反応をＵＳバイオケミカルズのセクエナーゼ・キッ
トまたはデュポン／ＮＥＮのジデオキノ配列キットを使
用して行なった。反応物およびゲルをキット製造者が提
供したプロトコールに記載されたように行った。

実施例７ 組換え体ＢｍＮＰＶウィルスの製造。具体的方法および
操作。

１１組換え体ＢｍＮＰＶウィルスの構築Ａ、ＤＮＡ抽出
用ウィルス粒子の構築 組換え体ウィルスの構築用ウィルスＤＮＡは、感染細胞
培養液または感染幼生から製造する。

培養細胞からのウィルス製造は次のように行なう。１５
０ｍｍ皿（３０ａ＋７！培地中２Ｘ１０”細胞）中に全
面成長細胞の単層を感染用のものとして作る。

培地を吸引除去し、野生型ＢｍＮＰＶ約１０ＩＩＰＦＵ
を含む希釈ウィルス液５００μＱ−１ｍ（２を、各１５
Ｏｎ＋＋ｅ皿に加える。１５分間隔で揺動しながら６０
分間インキュベーション後、培地１７ｍ１２を加える。

感染後６０−７２時間で細胞液を集め、３０００ｒｐｍ
、５℃で２０分間遠心する。さらに２０分間３０００　
ｒｐｍで遠心後、低速上清を１０００００ｇで６０分間
遠心する。ペレットを約２ｍ１２の１０ｍＭ）リスＨＣ
Ｑ（ｐＨ７，５）、ＩｍＭＥＤＴＡ中に、強くピペット
操作および回動してけんだくさせる。ＳＷ２８０一ター
用４０ｍＱ管に入れた２０−５０％（ｗ／ｗ）Ｌよ糖直
線勾配上に、ウィルスけんだく液６ｍ１２を常法通り負
荷する。２００００ｒｐｍ、１５°Ｃで９０分間遠心後
、ウィルスバンドが勾配を約３分の２下った所に見られ
る。勾装置〜２ｍｇを、シリンジと針を用い管の側面に
穿孔してとる。ウィルス液を蒸留水で２０倍以上に希釈
し、ｌ０００００ｇで６０分間遠心して沈殿させる。上
清を捨て、管の表面上に残る液をキムワイプで除く。沈
殿を少量のｌｏｍＭトリスＨＣＱ（ｐＨ７，５）、１ｍ
ＭＥＤＴＡにけんだくし、その夜番２００μｍ２（ＤＮ
Ａ０．３−０．５Ｒｇ／ｍｃ）を１．５ｍＱポリプロピ
レン試験管（−８０℃で貯蔵可能）中に移す。平均収量
は１５０ｍｍ皿１個の培養液からウィルスＤＮＡ約５μ
ｇである。

幼生からのウィルスＤＮＡ精製の場合、まず多角体状封
入体を精製する。次のようにして、大量のウィルス粒子
を容易に精製できる。かいこ幼虫の５金策１日のものを
用いる。１０’−１０’ＰＰＵを含むウィルス成約２０
μＱおよび通常適当量の抗生物質（６０ｍ９／ｍ（ｌカ
ナマイシンの１／２０容）を、シリンジを用いて血リン
パ中に注入する。

感染４−５日後、幼生を蒸留水入りのびん中に集め、１
−１０日間５°Ｃで貯蔵する。多角体は低速遠心により
幼生から精製し、５°Ｃで貯蔵し得る。

約［０”個の多角体（充填容積として数百μｍ２）を沈
殿させ、約４ｔａｉ２の０．１ＭＮａｔＣＯａ、０．０
５Ｍ　Ｎ　ａ　ＣＱにけんだくする。氷トで３０分間イ
ンキュベーション後、溶液は透明乳白色になる。これを
３００　Ｏｒｐｍで５分間遠心し、上清を２０−５０％
しょ糖勾配上に前記のようにして積層する。遠心後、培
養液の場合と同じ方法によりウィルス粒子を勾配から精
製する。

Ｂ、構築用ウィルスＤＮＡの製造 同時移入用ウィルスＤＮＡは、上記のように精製したウ
ィルス粒子から製造する。ＮＰＶのＤＮＡに蛋白質が強
く結合しているので、ＤＮＡの抽出には下記の処理をす
ることが重要である。さらに、ＢｍＮＶＰウィルスＤＮ
Ａのサイズの大きさ（約１３０　ｋｂ）を考慮すると、
ＤＮＡを抽出中に回動またはエタノール沈殿するのはよ
くない。少なくともＤＮＡ０．３ｒｔ９／ｍＱを含むウ
ィルス液２００μρを、ＤＮＡの抽出に通常使用する。

次に１０％５ＤＳ５．Ｏμｄおよび２０　肩ｇ／　ｍＱ
ブチロアーゼＫ（メルク）２０μＱを、エッペンドルフ
管に入れたＤＮＡに加える。指はじくことにより緩やか
に混合する。３７℃で２−５時間インキュベーション後
、溶液を等量のフェノールで２−３回抽出し、等量のフ
ェノール：クロロホルム（１：ｌ）で抽出し、等量のク
ロロホルムで２回抽出する。各抽出は、管を極めてゆっ
くり倒立させることにより行なう。

クロロホルムによる最後の抽出以外は、有機下層をピペ
ットマンで除く。約１％ＳＤＳを含む精製ＤＮＡ液は、
４℃で少なくとも４か月貯蔵可能である。制限酵素によ
る消化物は、ＳＤＳの影響を避けるためｌ：５に希釈す
る。

Ｃ１組換え体プラスミドｐＢｒｎＤＨ−１および野生型
ウィルスＤＮＡの同時移入 組換え体ウィルスは、カルシウム仲介同時移入細胞中に
おける組換え体プラスミドＤＮＡと野生型ウィルスＤＮ
Ａの相同的組換えによって構築する。同時移入法は、は
乳類細胞に用いたものと同様である。

２種の液をエッペンドルフ管中に作る。溶液Ａ（２５０
μＱ）は、ウィルスＤＮＡ５μＱ１組換え体プラスミド
ＤＮＡ５μｍ２，２ＭＣａＣＱ、３０ｔｔＱおよび蒸留
水２１０μＱを混合した場合、ウィルスＤＮＡを２ｕｇ
、組換え体プラスミドｐＢｍＤＨ−１を５μ８．０．２
５ＭＣａＣ１２ｅからなる。溶液Ｂ（２５０μ０は、５
０ｍＭへペス、０．２８ＭＮａＣ（１２５０μＱを試駒
管に入れて３５ｍＭＮａｔＰＯ＊および３５ａＭＮａＨ
ＰＯ，各５μ１２を加えて得た場合、５０ｍＭヘペス緩
衝液（ｐＨ７、１）、０．２８ＭＮａＣＱ、　０　、７
　ｍＭ　Ｎ　ａｆｆｉ　Ｐ　Ｏ４および０　、７　ｍＭ
ＮａＨＰＯ２からなる。カルシウム沈殿を行なうため、
溶液Ａを、パスツールピペットからの空気を暖やかに吹
込んでいる溶液Ｂ中にピペットマンで滴下する。溶液の
色は沈殿が起ると僅かに乳白色になる。

室温で３０分インキュベーション後、混合物５００μＱ
を、６０ｍｒ皿中の８ｍＮ細胞培養物中に加える。抗生
物質のストック液（例えば６０７Ｍ９／　ｍＱカナマイ
シン１０μａ）を加えて汚染を防ぐ。同時移入混合物の
添加６−１６時間後、培地を新しいものに代え、細胞を
さらに５日間培養する。多角封入体は、移入４−５日後
にみられる。細胞培養液を、組換え体ウィルス分離のた
めのプラークアッセイに付す。

Ｄ、ＤＨ遺伝子をもつ組換え体ウィルスの単離多角体遺
伝子がＤＨ遺伝子に置きかわっている組換え体ウィルス
は、光学顕微鏡を用いて、感染核中に封入体が産生され
ないことにより検出される。野生型ウィルスから組換え
体ウィルスを分離するには、本書に記載のプラークアッ
セイを用いる。同時移入ウィルス試料を感染した単層細
胞を０７５％ジ−プラーク・アガロースで重層する。

一般に、生成するプラーク中僅か０．２−３％が封入体
陰性である。

同時移入５−６日後の培養液は、通常約１０７ＰＦＵ／
ｍ１２を含有する。液を集めプラークアッセイ用に希釈
する。通常、１％ＦＣＳ含有ＴＣ−１００で希釈するこ
とにより、下記３種の液を作る。

（Ａ）１０−３希釈液。移入細胞液１０１ｉ（を培地１
ｍａに混入する。（Ｂ）１（Ｉ’希釈。液（Ａ）１００
μ（を培地９００μｆ２に加える。（Ｃ）１０−５希釈
。液（Ｂ）１００μＱを培地９００μＱに加える。各液
１ＯＯ（または２００）μＱをプラークアッセイ用６０
ｍｍ皿中の８ｍＮ細胞に加える。

組換え体ウィルスにより生成したプラークを、光学顕微
鏡により、低倍率（ｘ４００）および高倍率（ｘ１２０
０）の組合わせを用いてスクリーンする。第２重層上の
ニュートラルレッド染色を省いて光学顕微鏡による組換
え体ウィルスの同定を容易にする。重石５日後には、光
学顕微鏡を用いずにプラークを容易に同定できる。低倍
率で皿をみると、野生型プラークは暗色を示す。組換え
体プラークは僅かに明色を示す。場合により、顕微鏡を
僅かに焦点外にして調べると組換え体プラークの発見が
容易となる。候補は、下記特性により高倍率で確認でき
る。多角封入体はみられないが、細胞によっては多角封
入体に似た結晶（但し明確な輪郭はない）を生成する。

細胞によって完全に覆われていない領域は、通常細胞成
長の阻害によるプラークである。場合により、拡張した
核をもつ細胞、明確な細胞膜をもつ円形細胞または収縮
した細胞がプラーク中にみられる。

組換え体ウィルスにより生成したプラークにフェルトペ
ンで印をつけ、パスツールピペットでとり上げる。パス
ツールピペットをプラークに垂直に突きさし、アガロー
スプラグを１ｍ（の１％Ｆ’Ｃ５含有ＴＣ−１００中に
力強く吸上げて破砕する。

この液は約１０３ＰＰｔＪを含む。第２および第３プラ
ーク精製により純クローンを分離する。

同時移入細胞からの組換え体ウィルスの分離はまた、適
当な希釈物の感染後９６ウエルプレートを用いて行なう
こともできる。細胞毒性を示すが多角体産生を示さない
ウェル中の細胞は組換え体ウィルス感染によるものであ
り、純粋分離物は組換え体ウェル試料の希釈物をプレー
ト処理してクローンされる。予期される部位にＤＨ遺伝
子をもつ組換え体ＢｍＮＰＶウィルスは、バイブリダイ
ゼーションと制限エンドヌクレアーゼ分析を用いる確認
により前記の実験で採取される。

■、かいこ幼虫における組換え体ＢｍＮＰＶの発現 Ａ１組織培養培地約５μρ中に入れた組換え体ＢｍＮＰ
Ｖ（２ＸＩ　０５ＰＦ’Ｕ）を、第５令第１日のかいこ
幼虫の体腔中に注入する。天然ウィルスを用いた対照も
同様に行なう。結果は６日間毎日評価し、組換え体ウィ
ルスが第６日までに見られる死亡幼虫の数を増すことが
わかる。このような２重実験の結果を下記第４表に要約
する。

第４表 実験！、ボンビックス・モリ（Ｂｏｍｂｙｘ　ｍｏｒｉ
）第５令幼虫第１日１頭当り組織培地５μｇ中２×１０
５ＰＦＵウィルス注入。２７℃でインキュベート。

ＢｍＮＰＶ 実験２．ボンビックス・モリ（Ｂｏｍｂｙｘ　ｍｏｒｉ
）第５令幼虫第１日１頭当り組織培地５μρ中２×１０
５ＰＦＵウイルス注入。２７℃でインキュベート。

ＢｍＮＰＶ　　　　　　　　　　０　　０　　６　　６
　　６（利尿因子ＮＰＶ） Ｉｎ　　昆虫セルライン Δ、ＢｍＮ−４セルラインからのボンビックス・モリ（
Ｂｏｍｂｙｘ　ｍｏｒｉ）をセルラインを使用し、１０
％うし胎児面／１ｉ（Ｆｅ２）を添加した培地ＴＣ−１
００中で維持した。培地ＴＣ−１００の組成は下記のと
おりである。

成分　　　　　　量、Ｉ４　量／ｌ リットル　リットル （Ａ）ＫＣＩ ＣａＣＩ２ｆｆｉ・　２Ｈ２０ ＭｇＣａ、・６１−（，０ Ｍｇ５　Ｏ４・　７Ｈ２Ｏ グルコース トリドースブロス し−アラニン β−アラニン ■、−アルギニン　ＨＣＣ Ｌ−アスパラギン酸 Ｌ−アスパラギン Ｌ−グルタミン酸 し−グルタミン グリシン Ｌ−ヒスチジン Ｌ−イソロイシン し−ロイシン Ｌ−リジン　ＨＣＱ Ｌ−メチオニン Ｌ−フェニルアラニン １１．４８ｇ ５．２８ｇ ９．１２ｇ １１．１２ｇ ４．０ｇ １Ｑ、（１４ｇ ０．９ｇ ０．８ｇ ２．８ｇ １．４ｇ １．６ｇ ２．４ｇ ２．４ｇ ２．６ｇ １０．０ｇ ０．２ｇ ０．３ｇ ２．５ｇ ０．２ｇ ０．６ｇ ８７ｇ １．３２ｇ ２．２８ｇ ７８ｇ １．０ｇ ２．５１ ０．２３ｇ ０．２ｇ ０．７ｇ ０．３５ｇ ０．４ｇ ０．６ｇ ０．６ｇ ０．６５ｇ ２．５ｇ ０ｍ９ ５Ｍ９ ０．６２５ｇ １．１５ｇ Ｌ−プロリン ＤＬ−セリン Ｌ−スレオニン Ｌ−バリン （Ｂ）Ｌ−シスチン Ｌ−トリプトファン し−チロシン （Ｃ）ＮａＨｔＰ　Ｏ４・２　Ｈ−０ （Ｄ　）　Ｎ　ａ　ＨＣＯ３ （Ｅ）ｌｏｏｏｘ　　ビタミン類 １．４ｇ ４．４ｇ ｏ。７ｇ ０．４ｇ ｏ、１ｇ ０．４ｇ ０．２ｇ ４．５５ｇ １．４ｇ ｒａＱ ０．３５ｇ １．１ｇ ０．１７５ｇ ０．　Ｉｇ ５ｘｇ Ｏ，１ｇ ５０次９ １．１４ｇ ０．３５ｇ ］、ｍ１２ 上表中、成分Ｅ（Ｉ　Ｏ は次のとおり。

成　　分 チアミン　ＨＣｌ２ リボフラミン パントテン酸Ｃａ ピリドキシン　ＨＣｌ２ ｐ−アミノ安息香酸 葉酸 ００×ビタミン類）の組成 量／ｌｏｏｍ１２ ２．０貫９ ２　、０　ｍ９ ２．０η ２゜０肩９ ２　、　Ｏｒａ９ ２　、０　ａｔ；ｔ ニコチン酸 イノシトール ２　、０　ｍｇ ２　、　Ｏｘｇ コリン　ＨＣ（２０，Ｏｘ９ 継代培養温度は約２７℃である。全面成長細胞を新たな
完全培地にけんだくし、希釈比１：２で新しいフラスコ
に接種する。一般に、４−５日毎に細胞を継代する。

ＢｍＮ−４細胞は一７０°Ｃまたは液体窒素中で生存率
の低下なしに少なくとも６か月保存できる。

全面培養物から採取した細胞を、１０％ＦＣＳ含有新鮮
培地に水上で細胞密度２　Ｘ　ｌ　Ｏ’／ｍ（ｌにけん
だくする。細胞けんだく液をＤＭＳＯＩＯ％容と混合し
、１ｍｊアリコートを２ｎ＋ｆ２のねじ栓つきプラスチ
ック管にピペットで移す。これらの管をベーパータオル
２−３層で包んで温度低下速度を調節し、低温冷凍機に
移す。液体窒素中に保存する場合、管を一７０℃で数時
間インキュベーション後に移すことができる。ストック
から細胞を採取するには、管中の細胞を冷水浴中で急速
に解凍し、２５ｃｍ２フラスコ中に３−４．　ｍ（ｌの
新鮮培地を加えて接種する。細胞が表面に付着後、培地
を新鮮培地に置換する。培地中に付着しない死亡細胞が
みられる場合、これらの細胞は継代せずに培地を交換す
ることにより除くことができる。

Ｂ、’Ｔ”Ｃ−１００培地の製造 ＴＣ−１００培地は下記の方法で製造ずろ。培地は濾過
滅菌するので、培地調製中のウィルス汚染は回避される
。

下記のようにして濃縮（１００ＯＸ）ビタミンのストッ
ク液を別個に作っておくのが便利である。

ＩＯ成分各々を２回蒸留水１００ｍρに溶かず。これら
のストック液は一２０°Ｃで保存できる。緩やかな混合
後にさえ普通に沈殿が液中にみられるので、使用前によ
く混合する。

完全培地４リツトルを作るには、成分（Ａ）の各化合物
を２回蒸留水３リツトルに撹拌しながら加える。成分（
Ｂ）中の不溶のアミノ酸を５０°Ｃ付近で０．２Ｎ−Ｈ
Ｃｆ！１５０ｍ（に別個に溶かす。ＮａＨ２Ｐ　Ｑ　−
・４１−１２０とｉ’Ｊ　ａＨＣＯｓはそれぞれ蒸留水
１００ｍＱに溶かす。これらの別個に作った溶液と１０
０Ｏｘビタミンストック４ｍＱを上記溶液に加える。

成分の完全溶解後、５Ｎ−ＫＯＨ（通常２ｍρ以下）で
ｐＨを６．２に調節する。最後に、蒸留水で容量を４リ
ットルに調節する。プラークアッセイの場合、１．３３
（４／３）ＸＴＣ−１００を、完全培地１リツトル（第
２表）用化合物量を用いて単に７５０ｍＱにすることに
より製造する。ＴＣ−１００を高濃度にすると、５℃で
の保存中に沈殿を生じ細胞を傷害する可能性がある。

培地は禮過（０，２２μｍフィルター）滅菌し、５℃で
４か月まで保存することができる。フィルターの目づま
りを防ぐため、予備濾過を行なうのが有利である。

■、プラーク検定 ＢｍＮ−４細胞のＢｍＮＰＶのプラーク検定法はつぎの
ようなしのである。６０ｍｍ培養皿（培養光たり４−５
１ρ）中、２ＸＩＯ１１細胞の単細胞層をプラーク検定
に使用する。細胞はプラーク検定の少なくとら２時間前
に接種する。接種後培養皿をゆすって均一な細胞密度を
形成させる。

６０ｍｍ皿中の全面成長細胞から２個のプラーク検定用
の２個の６０ｍｍ皿ができる。

ウィルス感染に際しては、培養液を捨て（もし多量の場
合は吸引が望ましい）、ウィルス溶液（通常、稀釈後）
■００μＱ（または２００７ｚ＆）を添加する。１５分
間隔で振動しつつ１時間培養し、単細胞層に０．７５％
ジ−プラーク・アガロースおよび５％ＦＣＳを含有する
ＴＣ−１００培地をがぶ仕る。

上覆液は下記のように調製する。ジ−プラーク・アガロ
ースを培養ビン（または試験管）中に２回蒸留した蒸留
水中に３％で懸蜀し、高圧滅菌する。

培養ビンを高圧滅菌後４０−５０℃に維持し、アガロー
スおよび蒸留水を次の式で算出する。

アガロース（Ｊ９）　＝　（プレート数＋１）Ｘ３４Ｊ
１９水（ｘｆｆ）　＝　（プレート数＋１）ｘｌ、１３
ｍｃ５％ＦＣ８およびカナマイシン６０μ９／ｍ（ｌを
含有する、予め暖めた（３７℃月、３３ＸＴＣ−１００
培地をアガロース液に添加し、直ぐに混和する。量は次
のように算出する。

１．３３ＸＴＣ−ｔｏｏ（ｘｌ２）＝　（プレート数＋
１）Ｘ３．４４ｘρＦＣ３（好）＝（プレート数＋１）
Ｘｏ、２３ｇｇ１０００　ｘカナマイシン（６０ｉｙ／
ｊ！４）−（プレート数＋１）×９μｇ 細胞が脱離しないように、アガロース液（４，５ＲＱ）
を感染単細胞層上にゆっくりピペットで移す。

上覆プレートを、わずかに固化しはじめるまで２０分間
台上に放置する。４−６日間２７℃にてインキュベート
後プラークを確認することができる。

最初の溶液の力価は稀釈率およびプレートへの添加量に
よって測定する。プラークをよりはっきりと見えるよう
にするためにニュートラルレッド００２％を含有する２
回目のアガロース上復液を添加するのが好ましい。プラ
ークの測定は２回目の上覆後少なくとも１２時間後にす
べきである。

力価測定のために、プレートに添加したウィルス溶液は
、培養皿あたり１０−２００プラークになるように稀釈
する。感染培地中のウィルスの力価は感染状態の評価に
よって推定することができる。一般に最高力価は、培地
中１ｍρ当りほぼ１０８プラーク形成単位（ＰＦＵ）で
ある。最低測定力価は、たとえば、数回洗滌後、最初の
感染細胞の培地中で、Ｉ　Ｏ’−１０’ＰＦＵ／峠であ
る。

ウィルス力価は９６ウエル・プレートを用いて、ＴＣＩ
Ｄ、。とじて推定することらできる。

精製アガロース、ンーブラーク・アガロース（エフ・エ
ム・ノー・コーポレーション）が昆虫細胞に対する低毒
性の故に、上覆液として適していることが判明している
。上覆液はＴＣ−１００、ＦＣ８５％およびノープラー
ク・アガロース０．７５％を含有する。

実施例８− プラスミドｐＢＥ２８４（第１図および第３図参照）の
調製は、ここに記載されている説明およびっぎの記載か
ら明らかである。出発プラスミドは公知のプラスミドｐ
ＢｍＥ３６（第１および２図）およびｐＵｃ１９（ファ
ルマンア・インコーホレイテッド製）である。各々のプ
ラスミドをＨｉｎｄｌｌｌで切断し、ｐＢｍＳ６からの
３　、９　ｋｂフラグメントを直線化したｐＵｃＩ９に
連結し、ｐＥ３６−１を形成させる。ついでこのプラス
ミドをＢａｍＨＩおよびＳｍａＩで切断し、得られた大
きなフラグメントを、ＢａｍＨＩおよびＳｍａｌで切断
したλ（ラムダ）ファージから得た１　、　８　ｋｂフ
ラグメントに連結し、１）Ｅ３６−２（λＤＮＡはスペ
ーサーとして働く）を形成される。ついでプラスミドｐ
Ｅ３６−２を５ｎａＢｌで切断し、この直線化ＤＮＡを
Ｂａ１３１エクソヌクレアーゼで３０’Ｃ１，：テ、６
００ｍＭＮａＣｌ２．１２ｍＭ　ＣａＣ（−１１２ｍＭ
　ＭｇＣＱｔ、２０ｍＭＴｒｉｇ−Ｃａ、ＩｍＭ　ＥＤ
ＴＡ％ｐｌ（８，０中で処理する。この処理を、得られ
たＤ　Ｎ　Ａの長さの短縮（ＳｎａＩで切断して、スペ
ーサーＤＮＡを除き環状とし、細菌を形質転換し、単離
したものを配列決定後）を確認のため、何度も調べつつ
数回の実験として行う。単離体の１種、ｐＥａ６−３は
、ポリヘトリン遺伝子の出発コドン（ＡＴＧ）の原位置
に比較しｐＢＥ２８４中の短縮ＤＮＡに好ましい位置を
示す。

プラスミドｐＥ３６−３をＥｃｏＲＩおよびＫｐｎ■で
切断し、Ｅ（！ＯＲＩ突出部はふさぎ、ＫｐｎＩ突出部
は平滑化し、得られたＤＮＡはｐＥ３６−４を形成する
（新しいＥｃｏＲＩ部位有し、ｐＥ３６３のＳ　ａｃ　
ＩおよびＫｐｎ１部位は除かれる）。プラスミドｐＥ３
６−４をＥｃｏＲＩおよび５ｃａｌで切断し、およそ２
Ｋｐのフラグメントを後に使用するために分離する。

公知のプラスミドｐＢｍ０３０（公開ヨーロッパ特許出
願第０２２２４１２号に記載）をＥｃｏＲＩおよびＸｂ
ａｌで切断し、各々の突出部をふさぎ（クーレナウ（Ｋ
　ｌｅｎｏｗ））、末端を連結して、ｐｏａｏ−１を形
成する（新しいＥｃｏＲＩおよびＸｂａ１部位を有する
）。プラスミド０３０−１をＥｃｏＲＩおよびＸｂａｌ
で切断し、得られたおよそ５ｋｂのフラグメントを分離
し、ｐＥ３６−４から上記で分離されたおよそ２ｋｂの
フラグメントと連結し、目的のプラスミドｐＢＥ２８４
を調製する。

実施例９ プラスミドｐＤＨ−１の調製 プラスミドｐＢｍＤＨ−１はっぎのようにして調製する
ニブラスミドｐＤＨＣをＨｉｎｄＩＩＴで切断し、突出
部をフレナラでふさぎ、得られたＤＮＡをＥｃｏＲＩで
切断し、ＤＨ遺伝子を含むフラグメントを分離する。つ
いでこのフラグメントを、ｐＢＥ２８４をＥｃｏＲＩお
よびＡ、ａｔＴで切断して得られた大きなフラグメント
と連結し、ｐＢｍＤＨ−１を形成させる。ｐＢｍＤＨ−
１中で、連結領域およびポリヘトリン遺伝子の欠失出発
コドンおよび利尿因子遺伝子の導入出発コドンの配列は
下記のようである： ＊＊＊＊ ＴＡＡＧＧＡＡＴＴＣＡＴＧ ＡＴＴＣＣＴＴＡＡＧＴＡＣ −−−−＞Ｍｅｔ 式中、矢印は転写の方向であり、１個の星印は正常位置
またはポリヘトリン位置の欠失出発コドンの起点を示し
、３個の星印は利尿因子遺伝子中の出発つトンを示す。

寒皇履上立 ７の調製 プラスミドｐＡ６Ｅ７（第４図に示す）をつぎのように
して調製する。プラスミドｐＡｃＸ３３は、７２ｋｂの
ＡｃＮＰＶを含有しており、次のようにして構築する。

ＡｃＮＰＶゲノノ、（ポリヘトリン遺伝子を含む）から
の１２Ｋｂ　Ｘｈｏｌ／ＥｃｏＲＩフラグメントを含有
している公知のプラスミドｐＥＸＳ　９４２１３６をＥ
　ｃｏ　ＲＩで切断し、７．２ｋｂＥｃ。

Ｒ１−フラグメントをアガロース・ゲル電気泳動により
精製する。このフラグメントをＥｃｏＲＩ開裂ｐＴＺ１
８Ｒ中にクローンする。ついで２系列の反応を行いｐＴ
Ｚ１８Ｒポリリンカー制限部位を除去する。第１に、プ
ラスミドを部分的にＥｃ。

Ｒ１で切断しくプラスミドは２つの部位を含む）、直線
プラスミドを分離する。ＥｃｏＲＩ結合性末端をポリメ
ラーゼｌフレナラフラグメントを用いてふさぎ、平滑化
末端分子を再環化する。得られた分離体をＥｃｏＲＩ　
／　Ｈ１ｎｄｌ切断により分析し、ポリリンカーから離
れたＥｃｏＲ１部位を明確に欠失したプラスミドを選択
する。第２に、この新しいプラスミドをＥｃｏＲＩおよ
びＨｉｎｄＩ［Ｉ（二つの最も外側のポリリンカ一部位
）で切断し、フレナラで平滑化し、再環化してすべての
ポリリンカ一部位を欠いたプラスミドを生成させる。こ
のプラスミド構築はずべてのｐＴＺ１８Ｒポリリンカ一
部位を欠いており、ＡｃＮＰＶからの７　、２　ｋｂ　
Ｅｃ。

ｔ−Ｉ−フラグメントを含み、ｐＡｃＸ３３と称される
。

３ｋｂ　Ｓａｌ　Ｉフラグメントは完全にポリヘトリン
遺伝子を含有しており、ｐＥＸＳ９４２Ｂ６から、［］
ＴＺ１９Ｒベクターに２つの方向にサブクローンされ、
プラスミドｐｐｔおよびｐＰ２を生成する。５個の誤対
合塩基をもつ４２ヌクレオチドオリゴマーを合成し、変
異誘発を目的とするオリゴマー（アメルソヤム・キット
）に使用し、ポリヘトリン出発（ＡＴＣ；）コドンに対
し−５の位置に新しいＸｈｏ［部位を創造する。２個の
誤対合を有する２６ヌクレオチド・オリゴマーを合成し
、変異誘発を目的とするオリゴマーに使用し、ポリヘト
リン終止（ＴＡＡ）コドンの３塩基下流部位に新しいＸ
ｈｏ１部位を創造する。使用した４２および２６ヌクレ
オチド・オリゴマーは各々、次のようなヌクレオチド配
列を有する： ５　ＴＧＡＡＴＡＡＴＣＣＧＧＣＡＴＴＣＴＣＧＡＧＡ
ＧＧＴＴＴＴＴＴＴＡＴＴＡＣＡＡＡＡＣ３゜（４２量
体）および ５　’　ＡＡＴＡＡＣＡＡＴＧＴＣＴＣＧＡＧＴＴＴＴ
ＡＡＴＡＣ３°（２６量体）二重変異誘発プラスミドを
Ｘｈｏ［で２個の新しい部位で切断し、再環化し、特異
的なＸｈｏＩ部位を側面に有するポリヘトリン５°およ
び３゛非−記号化領域を含むプラスミドを生成する。解
読枠中に終止コドン（ＴＡＡ）の前に）Ｃｈｏｌ、　Ｅ
ｃｏＲＩ　。

ＰｓｔｌＳＳａｃｌ、ＸｂａＩ、ＫｐｎＩおよびＳｍａ
ｌを記号化した合成二重！１４５ｂｐオリゴマーをＸｂ
ａＩ中に挿入し、ポリヘトリン・プロモーターの後の多
重クローニング部位を創造する。この使用した二重鎖４
５ｂｐオリゴマーは次のような配列を有する： ５’　　ＴＣＧＡＧＡＡＴＴＣＴＧＣＡＧＡＧＣＴＣＴ
ＡＧＡＧＧＴＡＣＣＣＧＧ３　　　ＣＴＴＡＡＧＡＣＧ
ＴＣＴＣＧＡＧＡＴＣＴＣＣＡＴＧＧＧＣＣＧＴＡＡＴ
ＴＡＡＴＴＡＡ　　３゜ ＣＡＴＴＡＡＴＴＡＡＴＴＡＧＣＴ　　５’最後に、ポ
リヘトリン５゛および３°配列および多重クローン部位
を含むフラグメントをＥｃｏＲＶおよび５ｎａＢＩで切
断し、プラスミドｐＡｃＸ　３３（これはＥｃｏＲＶお
よび５ｎａＢＩで切断される）に挿入し、ｐＡｃＥ７を
得る。

新規なオートグラファ・カリホルニカ（Ａｕｔｏｇｒａ
ｐｈａ　Ｃａ１Ｈｏｒｎｉｃａ）　・Ｎ　Ｐ　Ｖ転移ベ
クター、ｐＡｃＥ７はポリヘトリン・プロモーターに対
し６個の特異的クローニング部位（ＥｃｏＲＩ、Ｐｓｔ
Ｉ、５ａｃｌＳＸｂａ１．ＫｐｎｌおよびＳｍａＩ）３
’を含んでいる。これはまたクローニング部位に対し、
すべての解読枠３°中に終止コドンを含んでいる。ｐＡ
ｃＥ７は本来のＡｃＮＰＶ　ＤＮＡと相同組換えをプロ
モートするＡｃＮＰＶ　　ＤＮＡの６　、５　ｋｂを含
んでいる。

これは５′配列４ｋｂおよび３゛配列２　、５　ｋｂか
らなっている。プラスミドを第４図に示す。

実施例１１ 静 プラスミドｐＤＨＣを制限エンドヌクレアーゼ、Ｈｉｎ
ｄｌｌｌで切断し、得られた直線プラスミドをフレナラ
で処理し、突出部をふさぐ。ついでこの直線ＤＮＡをＥ
ｃｏＲＩで切断し、利尿因子構造遺伝子を含むプラスミ
ドを分離し、ＥｃａＲＩおよびＳｍａｒでプラスミドｐ
ＡｃＥ７を切断して得られた大きなフラグメントと連結
し、所望のシャトルベクター、すなわち、プラスミドｐ
ＡｃＤＨ−１を得る。

実施例１２ ｐＡｃＤＨ−１およびウィルス性ＤＮＡ力と何ｑ携樽−
「ジエネティック・エンジニアリング（Ｇｅｎｅｔｉｃ
Ｅ　ｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）　：　ブリンシブル・アン
ドメソツヅ（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ　　ａｎｄ　　Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ）Ｊ第８巻（１９８６年）、ブレナム・プレス
Ｎ、Ｙ、（Ｊ、に、セトローおよびＡ、ホレンダー編）
第２７７−２８８頁、異種遺伝子の高性能発現のための
昆虫バキュロウィルス（Ｂ　ａｃｕｌｏｖｊｒｕｓ）宿
主ベクター系と題ずろミラーら記載の方法により、プラ
スミドｐＡｃＤＩ−（ｌおよびオートグラファ・カリポ
ルニカ　ＮＰＶＤＮＡ（上記記載と同様に調製）を形質
導入（同時形質導入）下、結合し、生きている組換ハイ
ブリッドウィルスＤＮＡを得、プラーク検定後分離する
。

実施例６、第■部、Ａ部と同様に行った比較評価におい
て、組換ハイブリッド、ＡｃＮＰＶウィルスＤＮＡも、
本来のオートグラファ・カリポルニカ（Ａ　、　Ｃａｌ
ｉｆｏｒｎｉｃａ）ウィルスと比較して、アルファルフ
ァ・ンヤクトリ虫幼虫（オートグラファ・カリポルニカ
）の致死作用時間を短縮する強い殺虫作用を有している
ことを示している。

【図面の簡単な説明】

第１図はｐＢｍＥ３６型の基本的なプラスミドのヌクレ
オチド配列、第２図は多角体構造遺伝子の翻訳開始コド
ン周辺の配列、第３図は修飾されたｐＢＥ２８４のリン
カ−領域の配列および挿入された制限酵素部位、第４図
はプラスミドｐＡｃＥ７を示す。 図面の浄也：（内容に変更なし） ＦＩＧ、　　１ 特許出願人　サンド・アクヂエンゲゼルシャフト代理　
人　弁理士　青　山　葆　はか１名ＦＩＧ、　　４ ＦＩＧ、　２ ヒｃｏ）＜ｌ Ｃ１

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. （１）関連昆虫ポリペプチドを実質上含有せず、昆虫利
   尿因子活性を有するポリペプチド。
2. （２）昆虫利尿因子活性を有し、関連昆虫ポリペプチド
   を実質上含有しない、アミド化されたＣ−末端および下
   式（ I ） 【遺伝子配列があります】（ I ） で示されるアミノ酸配列を有する請求項１記載のポリペ
   プチド。
3. （３）実質上関連昆虫ポリペプチドを含有せず、下式（
   II） 【遺伝子配列があります】 （式中、ＸはＧｌｙ、Ｇｌｙ−ＬｙｓまたはＧｌｙ−Ｌ
   ｙｓ−Ａｒｇである） で示されるアミノ酸配列を有する前駆体ポリペプチド。
4. （４）（ａ）表Ａ においてヌクレオチド位置番号５４からヌクレオチド位
   置番号１７７にまたがる１２３個のヌクレオチドを含ん
   だＤＮＡ配列、または（ｂ）緊縮条件下にそのような１
   ２３個のヌクレオチド配列へハイブリッド形成するヌク
   レオチド配列により暗号化されている昆虫利尿活性を有
   するポリペプチド。
5. （５）表Ａのアミノ酸位置番号１７からアミノ酸位置番
   号５７にまたがる４１個のアミノ酸配列を含んだポリペ
   プチドを暗号化した、イントロンをもたないＤＮＡ配列
   を含んでいる単離されたＤＮＡ。
6. （６）イントロンをもたないＤＮＡ配列が表Ａのアミノ
   酸位置番号１７からアミノ酸位置番号５８にまたがる４
   ２個のアミノ酸配列を含んだポリペプチドを暗号化して
   いる請求項５記載のＤＮＡ。
7. （７）昆虫利尿因子活性を有するポリペプチドを暗号化
   しているＤＮＡ配列を含んだベクターＤＮＡ。
8. （８）ＤＮＡ配列が非相同的なプロモーターＤＮＡの発
   現制御下にあり、ここでそのＤＮＡ配列が表Ａのアミノ
   酸位置番号１７からアミノ酸位置番号５７にまたがる４
   １個のアミノ酸配列を含んだポリペプチドを暗号化して
   いる、イントロンをもたないＤＮＡ配列を含んでいる請
   求項７記載のベクターＤＮＡ。
9. （９）イントロンをもたないＤＮＡ配列が表Ａのアミノ
   酸位置番号１７からアミノ酸位置番号５８にまたがる４
   ２個のアミノ酸配列を含んだポリペプチドを暗号化して
   いる請求項８記載のベクターＤＮＡ。
10. （１０）プロモーターＤＮＡがＮＰＶ多角体プロモータ
    ーである請求項８記載のベクターＤＮＡ。
11. （１１）ポリペプチドを暗号化しているＤＮＡ配列が昆
    虫ウィルス多角体構造遺伝子ＤＮＡを含んだ昆虫ウィル
    スＤＮＡ配列により５′および３′をはさまれたもので
    ある請求項１０記載のベクターＤＮＡ。
12. （１２）プロモーターがボンビクス・モリ（Ｂｏｍｂｉ
    ｘ　ｍｏｒｉ）多角体プロモーターまたはオートグラフ
    ァ・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ　ｃａｌｉ
    ｆｏｒｎｉｃａ）多角体プロモーターである請求項１０
    記載のベクターＤＮＡ。
13. （１３）昆虫細胞に致死的に感染するのに適格であり、
    バキュロウィルス（ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ）ＤＮＡお
    よび昆虫利尿因子活性を有するポリペプチドを暗号化し
    ているＤＮＡ配列を含んでおり、その暗号配列をバキュ
    ロウィルスに発現させるよう作動し得るプロモーターの
    発現制御下にあるハイブリッドバキュロウィルスＤＮＡ
    。
14. （１４）ＤＮＡポリペプチド暗号配列が、（ａ）表Ａの
    ヌクレオチド位置番号５４からヌクレオチド位置番号１
    ７７にまたがる１２３個のヌクレオチド、または（ｂ）
    緊縮ハイブリッド形成条件下にそのような１２３個のヌ
    クレオチド配列へハイブリッド形成するヌクレオチド配
    列を含んでいる請求項１３記載のバキュロウィルスＤＮ
    Ａ。
15. （１５）ＤＮＡポリペプチド暗号配列が表Ａのアミノ酸
    位置番号１７からアミノ酸位置番号５７にまたがる４１
    個のアミノ酸配列を含んだポリペプチドを暗号化してい
    る、イントロンをもたないＤＮＡ配列を含んでいる請求
    項１３記載のバキュロウィルスＤＮＡ。
16. （１６）イントロンをもたないＤＮＡ配列が表Ａのアミ
    ノ酸位置番号１７からアミノ酸位置番号５８にまたがる
    ４２個のアミノ酸配列を含んだポリペプチドを暗号化し
    ている請求項１５記載のバキュロウィルス。
17. （１７）イントロンをもたないＤＮＡ配列が表Ａのアミ
    ノ酸位置番号１からアミノ酸位置番号５８にまたがる５
    ８個のアミノ酸を含んだポリペプチドを暗号化している
    請求項１６記載のバキュロウィルス。
18. （１８）ボンビクス・モリＮＶＰＤＮＡまたはオートグ
    ラファ・カリフォルニカＮＰＶＤＮＡである請求項１５
    記載のバキュロウィルス。
19. （１９）請求項１３〜１８記載のハイブリッドバキュロ
    ウィルスの殺虫作用有効量および不活性担体を含有して
    いる殺虫用組成物。
20. （２０）不活性担体に希釈した請求項１３〜１８記載の
    ハイブリッドバキュロウィルスＤＮＡの殺虫作用有効量
    を昆虫の座へ適用することからなるＮＰＶバキュロウィ
    ルス感受性昆虫の駆除方法。