JPH09173084A - 殺虫に有効なペプチド - Google Patents
殺虫に有効なペプチドInfo
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- JPH09173084A JPH09173084A JP8308806A JP30880696A JPH09173084A JP H09173084 A JPH09173084 A JP H09173084A JP 8308806 A JP8308806 A JP 8308806A JP 30880696 A JP30880696 A JP 30880696A JP H09173084 A JPH09173084 A JP H09173084A
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- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
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- A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 ディグエチア（Ｄｉｇｕｅｔｉａ）くも毒液
から単離し得る殺虫に有効なペプチドへの転写及び発現
を制御せしめる遺伝子、および該遺伝子を組み込んだ発
現ベクター、および該発現ベクターで形質転換または形
質導入せしめられた形質転換体または形質導入体の取得
に関する。 【解決手段】 ディグエチア固体からのｍＲＮＡの分
離、分離したｍＲＮＡの同定、ｍＲＮＡからのｃＤＮＡ
の合成、合成したｃＤＮＡのクローニングベクターへの
挿入、組換えＤＮＡの構築、組換えＤＮＡの宿主細胞へ
の導入、形質転換細胞の検出及び選択、および形質転換
細胞からの殺虫に有効なペプチドの採取から構成され
る。
から単離し得る殺虫に有効なペプチドへの転写及び発現
を制御せしめる遺伝子、および該遺伝子を組み込んだ発
現ベクター、および該発現ベクターで形質転換または形
質導入せしめられた形質転換体または形質導入体の取得
に関する。 【解決手段】 ディグエチア固体からのｍＲＮＡの分
離、分離したｍＲＮＡの同定、ｍＲＮＡからのｃＤＮＡ
の合成、合成したｃＤＮＡのクローニングベクターへの
挿入、組換えＤＮＡの構築、組換えＤＮＡの宿主細胞へ
の導入、形質転換細胞の検出及び選択、および形質転換
細胞からの殺虫に有効なペプチドの採取から構成され
る。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は殺虫に有効なペプチ
ドに関する。更に詳しくは本発明はとりわけて、ディグ
エチア（Ｄｉｇｕｅｔｉａ）くも毒液から単離しうる殺
菌に有効なペプチド、このように殺虫に有効なペプチド
をコードするＤＮＡ、該ペプチドの製法、および無脊椎
害虫を制御する方法に関する。
ドに関する。更に詳しくは本発明はとりわけて、ディグ
エチア（Ｄｉｇｕｅｔｉａ）くも毒液から単離しうる殺
菌に有効なペプチド、このように殺虫に有効なペプチド
をコードするＤＮＡ、該ペプチドの製法、および無脊椎
害虫を制御する方法に関する。
【０００２】近年、人々は合成殺虫剤の使用に伴う環境
上の危険および哺乳動物の毒性に気が付いてきた。その
結果として、これらの殺虫剤の使用は迅速に低下した。
然し、有効な昆虫制御の必要性は変化していない。これ
が研究者を昆虫制御の新規な方法の開発にかりたててい
る。
上の危険および哺乳動物の毒性に気が付いてきた。その
結果として、これらの殺虫剤の使用は迅速に低下した。
然し、有効な昆虫制御の必要性は変化していない。これ
が研究者を昆虫制御の新規な方法の開発にかりたててい
る。
【０００３】
【従来の技術とその課題】最も広く使用されている微生
物殺虫薬はバクテリウム バシラススリンジエンスイス
（以後Ｂ．ｔ．と呼ぶ）から誘導される。この細菌剤は
種々の食葉毛虫、ジャパニーズ ビートルおよび蚊を制
御するために使用される。ナカムラらの米国特許第４，
７９７，２７９号明細書（１９８９年１月１０日発行）
にはＢ．ｔ．クルスタキイ デルターエンドトキシンを
コードする遺伝子およびＢ．ｔ．テネブリオニス デル
ターエンドトキシンをコードする遺伝子を含むハイブリ
ッド細菌細胞およびそれらの製法が記載されている。
Ｂ．ｔ．ハイブリッドはＢ．ｔ．クルスタキイ菌株に敏
感な害虫に対して、ならびにＢ．ｔ．テネブリオニス菌
株に敏感な害虫に対して活性である。一般にこれらのハ
イブリッドは有用な殺虫性をもち、その殺虫性は殺虫活
性の水準の点で、または活性のスペクトルの点で、ある
いは両者の点で、親菌株の物理的混合物によって観察さ
れるものよりもすぐれている。このような微生物を含む
殺虫組成物は、殺虫に有効な量のハイブリッドを昆虫に
またはその環境に加えることによって昆虫と斗うために
使用することができる。
物殺虫薬はバクテリウム バシラススリンジエンスイス
（以後Ｂ．ｔ．と呼ぶ）から誘導される。この細菌剤は
種々の食葉毛虫、ジャパニーズ ビートルおよび蚊を制
御するために使用される。ナカムラらの米国特許第４，
７９７，２７９号明細書（１９８９年１月１０日発行）
にはＢ．ｔ．クルスタキイ デルターエンドトキシンを
コードする遺伝子およびＢ．ｔ．テネブリオニス デル
ターエンドトキシンをコードする遺伝子を含むハイブリ
ッド細菌細胞およびそれらの製法が記載されている。
Ｂ．ｔ．ハイブリッドはＢ．ｔ．クルスタキイ菌株に敏
感な害虫に対して、ならびにＢ．ｔ．テネブリオニス菌
株に敏感な害虫に対して活性である。一般にこれらのハ
イブリッドは有用な殺虫性をもち、その殺虫性は殺虫活
性の水準の点で、または活性のスペクトルの点で、ある
いは両者の点で、親菌株の物理的混合物によって観察さ
れるものよりもすぐれている。このような微生物を含む
殺虫組成物は、殺虫に有効な量のハイブリッドを昆虫に
またはその環境に加えることによって昆虫と斗うために
使用することができる。
【０００４】バクテリウム Ｂ．ｔ．からの別の誘導体
はジルロイ（Ｇｉｌｒｏｙ）およびウイルコックス（Ｗ
ｉｌｃｏｘ）の欧州特許出願公開公報第 ０３２５４０
０Ａ１号明細書に記載された。この発明は鱗しょう類の
昆虫に対して毒性であるハイブリッド毒性遺伝子に関す
る。更に詳しくはこの発明はＢ．ｔ．ｖａｒ．クルスタ
キイＨＤ−７３毒性遺伝子の一部およびＢ．ｔ．ｖａ
ｒ．クルスタキイ菌株ＨＤ−１からの毒性遺伝子の一部
を含むハイブリッド デルタ−エンドトキシン遺伝子に
関する。鱗しょう類昆虫に対して活性をもつタンパクを
コードするハイブリッド毒性遺伝子が開示された。
はジルロイ（Ｇｉｌｒｏｙ）およびウイルコックス（Ｗ
ｉｌｃｏｘ）の欧州特許出願公開公報第 ０３２５４０
０Ａ１号明細書に記載された。この発明は鱗しょう類の
昆虫に対して毒性であるハイブリッド毒性遺伝子に関す
る。更に詳しくはこの発明はＢ．ｔ．ｖａｒ．クルスタ
キイＨＤ−７３毒性遺伝子の一部およびＢ．ｔ．ｖａ
ｒ．クルスタキイ菌株ＨＤ−１からの毒性遺伝子の一部
を含むハイブリッド デルタ−エンドトキシン遺伝子に
関する。鱗しょう類昆虫に対して活性をもつタンパクを
コードするハイブリッド毒性遺伝子が開示された。
【０００５】バクテリウムＢ．ｔ．はまたウイルコック
ス（Ｗｉｌｃｏｘ）らの欧州特許出願公開公報第 ０３
４０９４８号明細書においてその殺虫性について利用さ
れている。この発明はハイブリッド毒素に関し、この毒
素はＢ．ｔ．遺伝子の昆虫腸上皮細胞認識領域をジフテ
リアトキシンＢ鎖に融合して鱗しょう類昆虫に対して活
性なハイブリッドＢ．ｔ．毒素を産生することによって
製造される。ハイブリッドＢ．ｔ．遺伝子は植物に挿入
するか又はバキュロウイルスにクローンして回収可能な
毒素を産生し得るということが示唆されている。あるい
はまた、ハイブリッドＢ．ｔ．遺伝子を含む宿主は目標
とする昆虫の環境への直接の適用によって殺虫剤として
使用することもできる。
ス（Ｗｉｌｃｏｘ）らの欧州特許出願公開公報第 ０３
４０９４８号明細書においてその殺虫性について利用さ
れている。この発明はハイブリッド毒素に関し、この毒
素はＢ．ｔ．遺伝子の昆虫腸上皮細胞認識領域をジフテ
リアトキシンＢ鎖に融合して鱗しょう類昆虫に対して活
性なハイブリッドＢ．ｔ．毒素を産生することによって
製造される。ハイブリッドＢ．ｔ．遺伝子は植物に挿入
するか又はバキュロウイルスにクローンして回収可能な
毒素を産生し得るということが示唆されている。あるい
はまた、ハイブリッドＢ．ｔ．遺伝子を含む宿主は目標
とする昆虫の環境への直接の適用によって殺虫剤として
使用することもできる。
【０００６】殺虫性化合物の研究において、サソリ毒液
が殺虫特性を与える化合物の可能な源として確認され
た。さそりレイウルスクインクエストリアタス（Ｓｃｏ
ｒｐｉｏｎ Ｌｅｉｕｒｕｓ ｑｕｉｎｑｕｅｓｔｒｉ
ａｔｕｓ）の毒液から単離された２つの殺虫選択性毒素
がＺｌｏｔｋｉｎらの“Ａｎ Ｅｘｃｉｔａｔｏｒｙａ
ｎｄ ａ Ｄｅｐｒｅｓｓａｎｔ Ｉｎｓｅｃｔ Ｔｏ
ｘｉｎ ｆｒｏｍ Ｓｃｏｒｐｉｏｎ Ｖｅｎｏｍ ｂ
ｏｔｈ Ａｆｆｅｃｔ Ｓｏｄｉｕｍ Ｃｏｎｄｕｃｔ
ａｎｃｅ ａｎｄ Ｐｏｓｓｅｓｓ ａ Ｃｏｍｍｏｎ
Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｉｔｅ”Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ，２４０：８７７−
８７（１９８５）によって明らかにされた。その化学的
および薬理学的性質に関する研究において、一つの毒素
がハエの幼虫の早い刺戟収縮麻痺を誘発し、そして他の
一つの毒素がおそい抑制弛緩性麻痺を誘発することがわ
かった。両者はいずれもナトリウム・コンダクタンスに
影響を与えた。
が殺虫特性を与える化合物の可能な源として確認され
た。さそりレイウルスクインクエストリアタス（Ｓｃｏ
ｒｐｉｏｎ Ｌｅｉｕｒｕｓ ｑｕｉｎｑｕｅｓｔｒｉ
ａｔｕｓ）の毒液から単離された２つの殺虫選択性毒素
がＺｌｏｔｋｉｎらの“Ａｎ Ｅｘｃｉｔａｔｏｒｙａ
ｎｄ ａ Ｄｅｐｒｅｓｓａｎｔ Ｉｎｓｅｃｔ Ｔｏ
ｘｉｎ ｆｒｏｍ Ｓｃｏｒｐｉｏｎ Ｖｅｎｏｍ ｂ
ｏｔｈ Ａｆｆｅｃｔ Ｓｏｄｉｕｍ Ｃｏｎｄｕｃｔ
ａｎｃｅ ａｎｄ Ｐｏｓｓｅｓｓ ａ Ｃｏｍｍｏｎ
Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｉｔｅ”Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ，２４０：８７７−
８７（１９８５）によって明らかにされた。その化学的
および薬理学的性質に関する研究において、一つの毒素
がハエの幼虫の早い刺戟収縮麻痺を誘発し、そして他の
一つの毒素がおそい抑制弛緩性麻痺を誘発することがわ
かった。両者はいずれもナトリウム・コンダクタンスに
影響を与えた。
【０００７】Ｚｌｏｔｋｉｎらのカナダ特許第２，００
５，６５８号明細書（１９９０年６月１９日発行）には
スコーピオン（さそり）レエイウルス クインクエスト
リアタス ヘブラエウスブチナエ（ｈｅｂｒａｅｕｓ
Ｂｕｔｈｉｎａｅ）、ブチダエ（Ｂｕｔｈｉｄａｅ）か
ら誘導された殺虫に有効なタンパクが記載されている。
この発明では、毒液は凍結乾燥され、いくつかの留分に
分離される。幼虫に対して最高の毒性をもち、マウスに
対して最低の毒性をもつ留分を更なる精製にかけ、そし
て最終生成物が“Ｌｇｈ Ｐ３５”と呼ばれるものであ
る。
５，６５８号明細書（１９９０年６月１９日発行）には
スコーピオン（さそり）レエイウルス クインクエスト
リアタス ヘブラエウスブチナエ（ｈｅｂｒａｅｕｓ
Ｂｕｔｈｉｎａｅ）、ブチダエ（Ｂｕｔｈｉｄａｅ）か
ら誘導された殺虫に有効なタンパクが記載されている。
この発明では、毒液は凍結乾燥され、いくつかの留分に
分離される。幼虫に対して最高の毒性をもち、マウスに
対して最低の毒性をもつ留分を更なる精製にかけ、そし
て最終生成物が“Ｌｇｈ Ｐ３５”と呼ばれるものであ
る。
【０００８】Ｇｒｉｓｋｉｎの“Ｔｏｘｉｃ ｃｏｍｐ
ｏｎｅｎｔｓ ｆｒｏｍ Ｂｕｔｈｕｓ ｅｕｐｅｕｓ
ａｎｄ Ｌｕｃｏｓａ ｓｉｎｇｏｒｉｅｎｓｉｓ
ｖｅｎｏｍｓ，”Ｓｈｅｍｙａｋｉｎ Ｉｎｓｔｉｔｕ
ｔｅ ｏｆ Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ，ＵＳＳＲ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ
ｓ，Ｍｏｓｃｏｗ １１７９８８，ＧＳＰ−１，ＵＳＳ
Ｒにはスコーピオン（さそり）バサス（Ｂｕｔｈｕｓ）
エユピーウス（ｅｕｐｅｕｓ）の毒液から単離された昆
虫に対して毒性の４つの毒素が記載されている。また、
タランチュラルウコサ スインゴリエンスイス（ｔａｒ
ａｎｔｕｌａ Ｌｕｃｏｓａ ｓｉｎｇｏｒｉｅｎｓｉ
ｓ）の毒液の毒性成分の単離と特性も記載されている。
粗毒性は昆虫に対して無毒である。
ｏｎｅｎｔｓ ｆｒｏｍ Ｂｕｔｈｕｓ ｅｕｐｅｕｓ
ａｎｄ Ｌｕｃｏｓａ ｓｉｎｇｏｒｉｅｎｓｉｓ
ｖｅｎｏｍｓ，”Ｓｈｅｍｙａｋｉｎ Ｉｎｓｔｉｔｕ
ｔｅ ｏｆ Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ，ＵＳＳＲ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ
ｓ，Ｍｏｓｃｏｗ １１７９８８，ＧＳＰ−１，ＵＳＳ
Ｒにはスコーピオン（さそり）バサス（Ｂｕｔｈｕｓ）
エユピーウス（ｅｕｐｅｕｓ）の毒液から単離された昆
虫に対して毒性の４つの毒素が記載されている。また、
タランチュラルウコサ スインゴリエンスイス（ｔａｒ
ａｎｔｕｌａ Ｌｕｃｏｓａ ｓｉｎｇｏｒｉｅｎｓｉ
ｓ）の毒液の毒性成分の単離と特性も記載されている。
粗毒性は昆虫に対して無毒である。
【０００９】殺虫性をもつ種々の組成物に関する研究と
開発に対応して、研究者は殺虫性遺伝子を産生しこれら
を目標の宿主に導入する方法の開発に従事した。スミス
（Ｓｍｉｔｈ）およびサンマース（Ｓｕｍｍｅｒｓ）ら
の米国特許第４，８７９，２３６号明細書（１９８９年
１１月７日発行）は、バキュロウイルス プロモーター
と組合せた選択された遺伝子をバキュロウイルスゲノム
に導入して、昆虫細胞中の選択された遺伝子を発現しう
る組換えバキュロウイルス発現ベクターを構築する方法
に関するものである。この方法はポリヘドリン・プロモ
ーターを含むポリヘドリン遺伝子またはそのタンパクを
含むＤＮＡ断片を作るためにバキュロウイルスＤＮＡの
開裂を包含する。組換え伝達ベクターを作るために、Ｄ
ＮＡ断片をクローニング・ビヒルクに挿入し、次いで選
択遺伝子をこの変性クローニング・ビヒクルに挿入して
それがポリヘドリン・プロモーターの制御のもとにある
ようにする。組換え伝達ベクターを次いで野生型のバキ
ュロウイルスＤＮＡと接触させてバキュロウイルスゲノ
ムの中への選択遺伝子の相同組換えと取り込みを行う。
バキュロウイルス アウトグラファ カリホルニカ（ｂ
ａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌ
ｉｆｏｒｎｉｃａ）（ＡｃＭＮＰＶ）およびその関連ポ
リヘドリン・プロモーターは真核生物宿主細胞中の選択
された遺伝子の非常に高水準の発現をなしうるウイルス
発現ベクターを構築するのに有用であることが見出され
た。
開発に対応して、研究者は殺虫性遺伝子を産生しこれら
を目標の宿主に導入する方法の開発に従事した。スミス
（Ｓｍｉｔｈ）およびサンマース（Ｓｕｍｍｅｒｓ）ら
の米国特許第４，８７９，２３６号明細書（１９８９年
１１月７日発行）は、バキュロウイルス プロモーター
と組合せた選択された遺伝子をバキュロウイルスゲノム
に導入して、昆虫細胞中の選択された遺伝子を発現しう
る組換えバキュロウイルス発現ベクターを構築する方法
に関するものである。この方法はポリヘドリン・プロモ
ーターを含むポリヘドリン遺伝子またはそのタンパクを
含むＤＮＡ断片を作るためにバキュロウイルスＤＮＡの
開裂を包含する。組換え伝達ベクターを作るために、Ｄ
ＮＡ断片をクローニング・ビヒルクに挿入し、次いで選
択遺伝子をこの変性クローニング・ビヒクルに挿入して
それがポリヘドリン・プロモーターの制御のもとにある
ようにする。組換え伝達ベクターを次いで野生型のバキ
ュロウイルスＤＮＡと接触させてバキュロウイルスゲノ
ムの中への選択遺伝子の相同組換えと取り込みを行う。
バキュロウイルス アウトグラファ カリホルニカ（ｂ
ａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌ
ｉｆｏｒｎｉｃａ）（ＡｃＭＮＰＶ）およびその関連ポ
リヘドリン・プロモーターは真核生物宿主細胞中の選択
された遺伝子の非常に高水準の発現をなしうるウイルス
発現ベクターを構築するのに有用であることが見出され
た。
【００１０】その発明者は、特定の昆虫に対して又は昆
虫のスペクトルに対して毒性のあるタンパクを生ずる遺
伝子を選択することにより、そして、その遺伝子をＡｃ
ＭＮＰＶ発現ベクター中でクローニングすることによっ
て、その発現ベクターが昆虫の制御するための系に使用
しうることを示唆している。彼等はこのベクターが保護
すべき植物または動物に適用しうることを示唆してい
る。組換えウイルスは昆虫により摂取されて後の腸壁の
細胞に浸入することができる。別の示唆は遺伝子をバキ
ュロウイルスのゲノムに挿入して、それらをポリヘドロ
ンコーティングが昆虫腸管のアルカリ条件によって解離
して毒性生成物が放出されるように、ポリヘドリン構造
配列に融合させることである。
虫のスペクトルに対して毒性のあるタンパクを生ずる遺
伝子を選択することにより、そして、その遺伝子をＡｃ
ＭＮＰＶ発現ベクター中でクローニングすることによっ
て、その発現ベクターが昆虫の制御するための系に使用
しうることを示唆している。彼等はこのベクターが保護
すべき植物または動物に適用しうることを示唆してい
る。組換えウイルスは昆虫により摂取されて後の腸壁の
細胞に浸入することができる。別の示唆は遺伝子をバキ
ュロウイルスのゲノムに挿入して、それらをポリヘドロ
ンコーティングが昆虫腸管のアルカリ条件によって解離
して毒性生成物が放出されるように、ポリヘドリン構造
配列に融合させることである。
【００１１】殺虫性遺伝子を作ってこれを保護すべき標
的に導入する更なる方法は、カットラー（Ｃｕｔｌｅ
ｒ）の“Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ：Ｂｅｉｎｇ
Ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｔｏ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍ Ｃ
ｒｏｐｓ：Ｓｕｃｃｅｓｓ ｗｉｔｈ Ｍｏｄｅｌ Ｃ
ｒｏｐ Ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ，”ＡＧ Ｂｉｏｔｅｃ
ｈ．Ｎｅｗｓ ｖｏｌ．７（５）：３＆１７（１９９
０）に記載されている。この文献は、ＤＮＡが発芽花粉
中に直接にエレクトロポレートされうること、および花
粉は花に戻って種を作り、次いでこれが形質転換植物に
成長しうることを、教示している。この方法はタバコに
都合が良く、またトウモロコシ、ウマゴヤシにも都合が
良い。この方法は、究極の目的が花を受粉させ、植物の
再生よりもむしろ“花を利用する”ことであるので原形
質体のエレクトロポレーションよりも容易でありうる。
この方法は花粉を収集し、これを３０〜６０分間発芽培
地中で発芽させ、その後に花粉管は花粉粒の放出を始
め、その花粉を含む液体懸濁物に所望のＤＮＡを加え、
電気ショックを与えて花粉管の細孔を開け、過剰のＤＮ
Ａを除去し、そして変化した花粉を植物の柱頭の上に置
き、種が生成するまで待つことから成る。この方法は遺
伝子を穀物植物に移転させるのに容易な方法である。
的に導入する更なる方法は、カットラー（Ｃｕｔｌｅ
ｒ）の“Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ：Ｂｅｉｎｇ
Ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｔｏ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍ Ｃ
ｒｏｐｓ：Ｓｕｃｃｅｓｓ ｗｉｔｈ Ｍｏｄｅｌ Ｃ
ｒｏｐ Ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ，”ＡＧ Ｂｉｏｔｅｃ
ｈ．Ｎｅｗｓ ｖｏｌ．７（５）：３＆１７（１９９
０）に記載されている。この文献は、ＤＮＡが発芽花粉
中に直接にエレクトロポレートされうること、および花
粉は花に戻って種を作り、次いでこれが形質転換植物に
成長しうることを、教示している。この方法はタバコに
都合が良く、またトウモロコシ、ウマゴヤシにも都合が
良い。この方法は、究極の目的が花を受粉させ、植物の
再生よりもむしろ“花を利用する”ことであるので原形
質体のエレクトロポレーションよりも容易でありうる。
この方法は花粉を収集し、これを３０〜６０分間発芽培
地中で発芽させ、その後に花粉管は花粉粒の放出を始
め、その花粉を含む液体懸濁物に所望のＤＮＡを加え、
電気ショックを与えて花粉管の細孔を開け、過剰のＤＮ
Ａを除去し、そして変化した花粉を植物の柱頭の上に置
き、種が生成するまで待つことから成る。この方法は遺
伝子を穀物植物に移転させるのに容易な方法である。
【００１２】さらなる伝達系はバーンズ（Ｂａｒｎｅ
ｓ）およびエドワーズ（Ｅｄｗａｒｄｓ）の米国特許第
４，８６１，５９５号明細書（１９８９年８月２９日発
行）に記載されている。この発明は動物およびヒトへの
タンパク化合物の供給系として、処理した、実質的に自
然のままの微生物細胞を使用することに関する。この微
生物細胞は始めに相同遺伝子を介して細胞内にタンパク
を産生する。このタンパク産生微生物を化学的または物
理的手段によって処理するが、細胞は実質的に自然のま
まである。この処理法の操作は細胞内化合物の活性の目
立った損失なしに非増殖処理微生物細胞を生ずる。細胞
は複製ではなく、そして安定な細胞壁をもつのでこの細
胞壁は次いで動物またはヒトの消化系の所望場所で破壊
されることができ、従ってこの発明によってカプセルさ
れた生成物のタイミング化された又は標的化された放出
を可能にする。適当な処理の後に、タンパク生成微生物
細胞それ自体は生成化合物の精製を必要とせずに供給系
として使用される。微生物手段によって産生されうる、
殺虫剤を含む、すべてのタンパク、ポリペプチド、アミ
ノ酸または化合物はこの発明の出発材料でありうる。
ｓ）およびエドワーズ（Ｅｄｗａｒｄｓ）の米国特許第
４，８６１，５９５号明細書（１９８９年８月２９日発
行）に記載されている。この発明は動物およびヒトへの
タンパク化合物の供給系として、処理した、実質的に自
然のままの微生物細胞を使用することに関する。この微
生物細胞は始めに相同遺伝子を介して細胞内にタンパク
を産生する。このタンパク産生微生物を化学的または物
理的手段によって処理するが、細胞は実質的に自然のま
まである。この処理法の操作は細胞内化合物の活性の目
立った損失なしに非増殖処理微生物細胞を生ずる。細胞
は複製ではなく、そして安定な細胞壁をもつのでこの細
胞壁は次いで動物またはヒトの消化系の所望場所で破壊
されることができ、従ってこの発明によってカプセルさ
れた生成物のタイミング化された又は標的化された放出
を可能にする。適当な処理の後に、タンパク生成微生物
細胞それ自体は生成化合物の精製を必要とせずに供給系
として使用される。微生物手段によって産生されうる、
殺虫剤を含む、すべてのタンパク、ポリペプチド、アミ
ノ酸または化合物はこの発明の出発材料でありうる。
【００１３】サソリ毒液中に見出される神経毒をコード
する合成遺伝子をＤＮＡ技術を使用してくみ入れること
の可能性はカルボネル（Ｃａｒｂｏｎｅｌｌ）らの“Ｓ
ｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ａ ｇｅｎｅ ｃｏｄｉｎｇ
ｆｏｒ ａｎ ｉｎｓｅｃｔ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｓ
ｃｏｒｐｉｏｎｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎ ａｎｄ ａｔｔ
ｅｍｐｔｓ ｔｏ ｅｘｐｒｅｓｓ ｉｔ ｕｓｉｎｇ
ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ，”Ｇｅｎ
ｅ ７３：４０９−１８（１９８８）において探究され
ている。この文献はさそり，バサスエウペウス（Ｂｕｔ
ｈｕｓ ｅｕｐｅｕｓ），の毒液中に見出される神経毒
をコードする合成遺伝子をＤＮＡ技術を使用してバキュ
ロウイルス・ゲノムに組み入れてバキュロウイルス・殺
虫剤を改良する可能性を教示している。ポリヘドロン・
プロモーター基材ＡｃＭＮＰＶ発現系を使用して毒性産
生を行う３つの発現方法が研究された。３６コドン遺伝
子単独の発現は毒素の少量産生を与えた。いくつかの成
功は毒素へのシグナルペプチドの付着により見出され
た。かなりな水準のタンパクは、毒素遺伝子がポリヘド
ロン遺伝子のＮ−末端に融合したときに産生された。然
しながら、産生はポリヘドロンそれ自身について観察さ
れたものよりも１０〜２０倍少なかった。発現の限界は
転写の水準にあるとは信じられなかったが、翻訳および
タンパクの安定性を含めて後一転写水準にあると信ぜら
れた。毒素生成物の麻痺活性は検出されなかった。
する合成遺伝子をＤＮＡ技術を使用してくみ入れること
の可能性はカルボネル（Ｃａｒｂｏｎｅｌｌ）らの“Ｓ
ｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ａ ｇｅｎｅ ｃｏｄｉｎｇ
ｆｏｒ ａｎ ｉｎｓｅｃｔ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｓ
ｃｏｒｐｉｏｎｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎ ａｎｄ ａｔｔ
ｅｍｐｔｓ ｔｏ ｅｘｐｒｅｓｓ ｉｔ ｕｓｉｎｇ
ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ，”Ｇｅｎ
ｅ ７３：４０９−１８（１９８８）において探究され
ている。この文献はさそり，バサスエウペウス（Ｂｕｔ
ｈｕｓ ｅｕｐｅｕｓ），の毒液中に見出される神経毒
をコードする合成遺伝子をＤＮＡ技術を使用してバキュ
ロウイルス・ゲノムに組み入れてバキュロウイルス・殺
虫剤を改良する可能性を教示している。ポリヘドロン・
プロモーター基材ＡｃＭＮＰＶ発現系を使用して毒性産
生を行う３つの発現方法が研究された。３６コドン遺伝
子単独の発現は毒素の少量産生を与えた。いくつかの成
功は毒素へのシグナルペプチドの付着により見出され
た。かなりな水準のタンパクは、毒素遺伝子がポリヘド
ロン遺伝子のＮ−末端に融合したときに産生された。然
しながら、産生はポリヘドロンそれ自身について観察さ
れたものよりも１０〜２０倍少なかった。発現の限界は
転写の水準にあるとは信じられなかったが、翻訳および
タンパクの安定性を含めて後一転写水準にあると信ぜら
れた。毒素生成物の麻痺活性は検出されなかった。
【００１４】欧州特許出願公開公報第０４３１８２９号
明細書には遺伝子導入植物が記載されており、これは植
物組織を摂取する選択的昆虫に毒性を生ぜしめるに十分
な量で昆虫捕食者の昆虫特異性毒素をそれらの細胞中に
有効に発現する。記述された特定の毒素がスコルピオン
（さそり）アンドロクトナス オーストラリスの毒液か
ら単離された。
明細書には遺伝子導入植物が記載されており、これは植
物組織を摂取する選択的昆虫に毒性を生ぜしめるに十分
な量で昆虫捕食者の昆虫特異性毒素をそれらの細胞中に
有効に発現する。記述された特定の毒素がスコルピオン
（さそり）アンドロクトナス オーストラリスの毒液か
ら単離された。
【００１５】研究者はまたくも（ｓｐｉｄｅｒｓ）の毒
液から抽出した毒素を単離することもできた。ゲレン
（Ｇｅｒｅｎ）の“Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎｓ ａｎｄ
Ｎｅｃｒｏｔｏｘｉｎｓ ｏｆ Ｓｐｉｄｅｒ Ｖｅｎ
ｏｍｓ，”Ｊ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．−Ｔｏｘｉｎ Ｒｅｖ
ｉｅｗｓ ５（２）：１６１−１７０（１９８６）は神
経毒および壊死毒を再検討して、くもの毒液分子は特定
の殺虫剤のモデルを提供しうることを示唆している。
液から抽出した毒素を単離することもできた。ゲレン
（Ｇｅｒｅｎ）の“Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎｓ ａｎｄ
Ｎｅｃｒｏｔｏｘｉｎｓ ｏｆ Ｓｐｉｄｅｒ Ｖｅｎ
ｏｍｓ，”Ｊ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．−Ｔｏｘｉｎ Ｒｅｖ
ｉｅｗｓ ５（２）：１６１−１７０（１９８６）は神
経毒および壊死毒を再検討して、くもの毒液分子は特定
の殺虫剤のモデルを提供しうることを示唆している。
【００１６】ジャクソンおよびパークスの米国特許第
４，９２５，６６４号明細書（１９９０年５月１５日発
行）にはくも（スパイダー）アジェレノプスイス アペ
ルタアンド ホロノナクルタから誘導される毒素を適用
することによる心臓および神経学的疾患の治療法が記載
されている。この毒素はまた、昆虫および関連害虫に対
して使用しうる特定のカルシウムチャンネルもしくは興
奮アミノ酸受容体遮断剤としても有効である。
４，９２５，６６４号明細書（１９９０年５月１５日発
行）にはくも（スパイダー）アジェレノプスイス アペ
ルタアンド ホロノナクルタから誘導される毒素を適用
することによる心臓および神経学的疾患の治療法が記載
されている。この毒素はまた、昆虫および関連害虫に対
して使用しうる特定のカルシウムチャンネルもしくは興
奮アミノ酸受容体遮断剤としても有効である。
【００１７】欧州特許出願公開公報第０３９５３５７号
明細書にはくもアジェレノプジスアペルタの毒液から単
離されたポリアミン類およびポリペプチド類が記載され
ている。このポリアミンは興奮アミノ酸神経伝達剤に拮
抗する。ポリペプチド類、およびポリアミン類の１つ、
は種々の有機体の生きた細胞のカルシウムチャンネルを
遮断する。無脊椎害虫の制御に該カルシウムチャンネル
遮断剤の使用が示唆される。
明細書にはくもアジェレノプジスアペルタの毒液から単
離されたポリアミン類およびポリペプチド類が記載され
ている。このポリアミンは興奮アミノ酸神経伝達剤に拮
抗する。ポリペプチド類、およびポリアミン類の１つ、
は種々の有機体の生きた細胞のカルシウムチャンネルを
遮断する。無脊椎害虫の制御に該カルシウムチャンネル
遮断剤の使用が示唆される。
【００１８】欧州特許出願公開公報第０３７４９４０号
明細書にはスパイダー（くも）ホロレナ クルタの毒液
から単離した毒物が記載されている。ポリペプチドは殺
虫剤として有用であり、そして医薬においてたとえばカ
ルシウムチャンネルおよびグルタメート拮抗剤として有
用である。
明細書にはスパイダー（くも）ホロレナ クルタの毒液
から単離した毒物が記載されている。ポリペプチドは殺
虫剤として有用であり、そして医薬においてたとえばカ
ルシウムチャンネルおよびグルタメート拮抗剤として有
用である。
【００１９】ボウアーらの“Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉ
ｏｎ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ
ｉｒｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ ｐｒｅｓｙｎａｐｔｉｃ
ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｖｅｎｏ
ｍ ｏｆ ｔｈｅ ｓｐｉｄｅｒ Ｈｏｌｏｌｅｎａ
ｃｕｒｔａ，”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．８４：３５０６−３５１０（１９８７）には、スパ
イダー（くも）ホロレナクルタの毒液から単離したタン
パク質神経毒およびそのドロソフイラ幼虫における神経
筋肉伝達の阻止が記載されている。著者はこの毒物がド
ロソフイラ モーター ニューロンにおけるブレシナプ
テイック・カルシウムチャンネルを阻止することを示唆
している。
ｏｎ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ
ｉｒｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ ｐｒｅｓｙｎａｐｔｉｃ
ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｖｅｎｏ
ｍ ｏｆ ｔｈｅ ｓｐｉｄｅｒ Ｈｏｌｏｌｅｎａ
ｃｕｒｔａ，”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．８４：３５０６−３５１０（１９８７）には、スパ
イダー（くも）ホロレナクルタの毒液から単離したタン
パク質神経毒およびそのドロソフイラ幼虫における神経
筋肉伝達の阻止が記載されている。著者はこの毒物がド
ロソフイラ モーター ニューロンにおけるブレシナプ
テイック・カルシウムチャンネルを阻止することを示唆
している。
【００２０】キスタドらの“Ｐａｒａｌｙｔｉｃ ａｎ
ｄ Ｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄａｌ Ｔｏｘｉｎｓ ｆｒｏ
ｍ ｔｈｅ Ｆｕｎｎｅｌ Ｗｅｂ Ｓｐｉｄｅｒ，Ｈ
ｏｌｏｌｅｎａ Ｃｕｒｔａ，”Ｔｏｘｉｏｎ ２９
（３）：３２９−３３６（１９９１）には、ホロレナ・
カルタの毒液から精製した１種のペプチドおよび１０種
のカルタトキシンおよび鱗しょう類幼虫に注入したとき
の効果が記載されている。
ｄ Ｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄａｌ Ｔｏｘｉｎｓ ｆｒｏ
ｍ ｔｈｅ Ｆｕｎｎｅｌ Ｗｅｂ Ｓｐｉｄｅｒ，Ｈ
ｏｌｏｌｅｎａ Ｃｕｒｔａ，”Ｔｏｘｉｏｎ ２９
（３）：３２９−３３６（１９９１）には、ホロレナ・
カルタの毒液から精製した１種のペプチドおよび１０種
のカルタトキシンおよび鱗しょう類幼虫に注入したとき
の効果が記載されている。
【００２１】スタプレトンらの“Ｃｕｒｔａｔｏｘｉｎ
ｓ：Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃ ｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄａｌ
ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｏ
ｒｍｔｈｅ ｆｕｎｎｅｌ−ｗｅｂ ｓｐｉｄｅｒ Ｈ
ｏｌｏｌｅｎａ ｃｕｒｔａ，”Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．２６５（４）；２０５４−２０５９（１９９０）に
は、スパイダー（くも）ホロレナ カルタの毒液から単
離した３種のポリペプチド神経毒およびクリケット・ア
チェタ・ドメスティカに及ぼす効果が記載されている。
ｓ：Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃ ｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄａｌ
ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｏ
ｒｍｔｈｅ ｆｕｎｎｅｌ−ｗｅｂ ｓｐｉｄｅｒ Ｈ
ｏｌｏｌｅｎａ ｃｕｒｔａ，”Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．２６５（４）；２０５４−２０５９（１９９０）に
は、スパイダー（くも）ホロレナ カルタの毒液から単
離した３種のポリペプチド神経毒およびクリケット・ア
チェタ・ドメスティカに及ぼす効果が記載されている。
【００２２】クイッケおよびユシヤーウッドの“Ｅｘｔ
ｅｎｄｅｄ ＳｕｍｍａｒｉｅｓＰｅｓｔｉｃｉｄｅｓ
Ｇｒｏｕｐ ａｎｄ Ｐｈｙｓｉｃｏｃｈｅｍｉｃａ
ｌａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｐａｎｅｌ Ｓｙ
ｍｐｏｓｉｕｍ Ｎｏｖｅｌ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ
ｉｎ Ａｇｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃ
ｈ，”Ｐｅｓｔｉｃ．Ｓｃｉ．２０：３１５−３１７
（１９８７）には、寄生スズメバチの毒液に存在する及
び若干のクモの毒液に存在する毒物は昆虫に注射したと
きに迅速な麻痺を生ぜしめることが記載されている。著
者はこのクモの毒物が、イナゴの筋肉のグルタメート受
容体によってゲートを開く開放チャンネルと相互作用す
る受容体ゲートのカチオン選択性膜チャンネルの遮断剤
であることを示唆している。この刊行物はアルジオープ
およびアラネウスのクモの毒液中の低分子量の毒物ナフ
タレン女郎グモ（ネフィラ・クラバタ）の毒液腺から単
離した毒物に言及している。
ｅｎｄｅｄ ＳｕｍｍａｒｉｅｓＰｅｓｔｉｃｉｄｅｓ
Ｇｒｏｕｐ ａｎｄ Ｐｈｙｓｉｃｏｃｈｅｍｉｃａ
ｌａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｐａｎｅｌ Ｓｙ
ｍｐｏｓｉｕｍ Ｎｏｖｅｌ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ
ｉｎ Ａｇｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃ
ｈ，”Ｐｅｓｔｉｃ．Ｓｃｉ．２０：３１５−３１７
（１９８７）には、寄生スズメバチの毒液に存在する及
び若干のクモの毒液に存在する毒物は昆虫に注射したと
きに迅速な麻痺を生ぜしめることが記載されている。著
者はこのクモの毒物が、イナゴの筋肉のグルタメート受
容体によってゲートを開く開放チャンネルと相互作用す
る受容体ゲートのカチオン選択性膜チャンネルの遮断剤
であることを示唆している。この刊行物はアルジオープ
およびアラネウスのクモの毒液中の低分子量の毒物ナフ
タレン女郎グモ（ネフィラ・クラバタ）の毒液腺から単
離した毒物に言及している。
【００２３】単離されたクモの毒液からの毒物の性質に
関する別の研究は、クモ（ファンネル−ウエブ スパイ
ダー）の毒液から単離した低分子量因子のカルシウムチ
ャンネルへの可逆的結合の能力を明らかにした。チェル
スキイらのＷＯ８９／０７６０８（１９８９年８月２４
日発行）には、これらの活性な低分子量因子が十分な特
異性および親和性をもってカルシウム・チャンネルに可
逆的に結合してニューロン中のカルシウム・コンダクタ
ンスをなくし、カルシウム・チャンネル構造体の単離と
精製を可能にすることが記載されている。これらの毒液
はヒトに対して毒性であることが見出された。
関する別の研究は、クモ（ファンネル−ウエブ スパイ
ダー）の毒液から単離した低分子量因子のカルシウムチ
ャンネルへの可逆的結合の能力を明らかにした。チェル
スキイらのＷＯ８９／０７６０８（１９８９年８月２４
日発行）には、これらの活性な低分子量因子が十分な特
異性および親和性をもってカルシウム・チャンネルに可
逆的に結合してニューロン中のカルシウム・コンダクタ
ンスをなくし、カルシウム・チャンネル構造体の単離と
精製を可能にすることが記載されている。これらの毒液
はヒトに対して毒性であることが見出された。
【００２４】クモの毒物の他の応用はジャクソンおよび
パークスの“Ｓｐｉｄｅｒ Ｔｏｘｉｎｓ：Ｒｅｃｅｎ
ｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｂｉ
ｏｌｏｇｙ，”Ａｎｎ Ｒｅｖ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ １
２：４０５−１４（１９８９）に論じられている。この
文献は種々の毒物には毒性の非常な不均一性が存在する
ことを教示している。それは実験がカルシウム・チャン
ネルの種特異性を示唆したこと及びクモ毒液がカルシウ
ム・チャンネル拮抗剤を提供しうることを認めている。
論じられたクモ毒液は脊椎動物に悪影響を与えることが
見出される。この文献はまたクモ毒液を農業用途の昆虫
特異性毒物の可能な資源と確認している。
パークスの“Ｓｐｉｄｅｒ Ｔｏｘｉｎｓ：Ｒｅｃｅｎ
ｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｂｉ
ｏｌｏｇｙ，”Ａｎｎ Ｒｅｖ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ １
２：４０５−１４（１９８９）に論じられている。この
文献は種々の毒物には毒性の非常な不均一性が存在する
ことを教示している。それは実験がカルシウム・チャン
ネルの種特異性を示唆したこと及びクモ毒液がカルシウ
ム・チャンネル拮抗剤を提供しうることを認めている。
論じられたクモ毒液は脊椎動物に悪影響を与えることが
見出される。この文献はまたクモ毒液を農業用途の昆虫
特異性毒物の可能な資源と確認している。
【００２５】アダムスらの“Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎ
ｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ
Ｓｙｎａｐｔｉｃ Ｔｏｘｉｎｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ
Ｖｅｎｏｍ ｏｆ ｔｈｅ Ｆｕｎｎｅｌ Ｗｅｂ Ｓ
ｐｉｄｅｒ，Ａｇｅｌｅｎｏｐｓｉｓ Ａｐｅｒｔ
ａ，”ｉｎ Ｉｎｓｅｃｔ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ ａｎｄ Ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ １９
８６，Ｂｏｒｋｏｖｅｃａｎｄ Ｇｅｌｍａｎ編集、ヒ
ューマナ・プレス、米国ニュージャー州 １９８６年に
は、昆虫のシナプス伝達に拮抗する多重ペプチド毒物が
クモＡｇｅｌｅｎｏｐｓｉｓ ａｐｅｒｔａから単離さ
れたことが記載されている。
ｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ
Ｓｙｎａｐｔｉｃ Ｔｏｘｉｎｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ
Ｖｅｎｏｍ ｏｆ ｔｈｅ Ｆｕｎｎｅｌ Ｗｅｂ Ｓ
ｐｉｄｅｒ，Ａｇｅｌｅｎｏｐｓｉｓ Ａｐｅｒｔ
ａ，”ｉｎ Ｉｎｓｅｃｔ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ ａｎｄ Ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ １９
８６，Ｂｏｒｋｏｖｅｃａｎｄ Ｇｅｌｍａｎ編集、ヒ
ューマナ・プレス、米国ニュージャー州 １９８６年に
は、昆虫のシナプス伝達に拮抗する多重ペプチド毒物が
クモＡｇｅｌｅｎｏｐｓｉｓ ａｐｅｒｔａから単離さ
れたことが記載されている。
【００２６】ヨシオカらの米国特許第４，８５５，４０
５号明細書（１９８９年８月９日発行）には女郎グモ毒
液腺から得られた受容体阻止剤およびその製造法が記載
されている。この化合物は、昆虫が液体または固体に担
持された該化合物に接触するとき、殺虫効果をもつ。
５号明細書（１９８９年８月９日発行）には女郎グモ毒
液腺から得られた受容体阻止剤およびその製造法が記載
されている。この化合物は、昆虫が液体または固体に担
持された該化合物に接触するとき、殺虫効果をもつ。
【００２７】ナカジマらの米国特許第４，９１８，１０
７号明細書（１９９０年４月１７日発行）にはグルタメ
ート受容体抑止剤活性をもつ化合物、該化合物の製造
法、および該化合物を含む殺虫剤組成物が記載されてい
る。該化合物は分散剤を加えた液体または固体キャリヤ
ー中に担持され、保護すべき植物または動物に直接に適
用される。低い調剤量は殺虫剤として効果的であり、哺
乳動物および魚に対して非常に低い毒性しかもたず、そ
して環境に対して小さい悪影響しかもたない。
７号明細書（１９９０年４月１７日発行）にはグルタメ
ート受容体抑止剤活性をもつ化合物、該化合物の製造
法、および該化合物を含む殺虫剤組成物が記載されてい
る。該化合物は分散剤を加えた液体または固体キャリヤ
ー中に担持され、保護すべき植物または動物に直接に適
用される。低い調剤量は殺虫剤として効果的であり、哺
乳動物および魚に対して非常に低い毒性しかもたず、そ
して環境に対して小さい悪影響しかもたない。
【００２８】バイオ殺虫剤としてのバキュロウイルスの
使用も探究された。バイオ殺虫剤としての野生型のバキ
ュロウイルスの主な欠点はそれらが遅効性であることで
ある。野生型のバキュロウイルスを摂取する幼虫は一般
に５〜７日間以内に死ぬ。感染幼虫はこの時間のかなり
な部分のあいだ食物を摂出しつづけ、実質的な穀物の損
害が起こりうる。
使用も探究された。バイオ殺虫剤としての野生型のバキ
ュロウイルスの主な欠点はそれらが遅効性であることで
ある。野生型のバキュロウイルスを摂取する幼虫は一般
に５〜７日間以内に死ぬ。感染幼虫はこの時間のかなり
な部分のあいだ食物を摂出しつづけ、実質的な穀物の損
害が起こりうる。
【００２９】
【課題を解決するための手段】毒性、環境の危害、およ
び抵抗による効力の損失を含めた合成殺虫剤に伴う問題
の組合せにより、バキュロウイルス感染自体よりも迅速
に宿主を不能になしうるタンパク毒物を発現する遺伝子
工学組換えバキュロウイルスの開発を含む無脊椎動物制
御の新規手段の開発の必要性がひきつづいて存在する。
本発明によれば、ディグエチアくも毒液から実質的に精
製され単離しうる新規な殺虫に有効なペプチドおよびそ
の農業的または園芸的に許容しうる塩が提供される。
び抵抗による効力の損失を含めた合成殺虫剤に伴う問題
の組合せにより、バキュロウイルス感染自体よりも迅速
に宿主を不能になしうるタンパク毒物を発現する遺伝子
工学組換えバキュロウイルスの開発を含む無脊椎動物制
御の新規手段の開発の必要性がひきつづいて存在する。
本発明によれば、ディグエチアくも毒液から実質的に精
製され単離しうる新規な殺虫に有効なペプチドおよびそ
の農業的または園芸的に許容しうる塩が提供される。
【００３０】本発明の殺虫に有効なペプチドは無脊椎動
物とくに昆虫に対して高度の選択性をもつと信ぜられ
る。その上、本発明の殺虫に有効なペプチドは農業的に
重要な害虫に対して高度に有効な殺虫剤であることが実
証され、従って無脊椎害虫制御の分野に重要な貢献を示
すと信ぜられる。
物とくに昆虫に対して高度の選択性をもつと信ぜられ
る。その上、本発明の殺虫に有効なペプチドは農業的に
重要な害虫に対して高度に有効な殺虫剤であることが実
証され、従って無脊椎害虫制御の分野に重要な貢献を示
すと信ぜられる。
【００３１】本発明によれば、配列番号７に記載される
アミノ酸配列またはその部分と実質的配列相同性を持つ
アミノ酸配列を特徴とするプレプロ配列であり、該プレ
プロ配列またはその部分が成熟ペプチドの分泌および／
または折りたたみを指示することを特徴とするプレプロ
配列が提供される。
アミノ酸配列またはその部分と実質的配列相同性を持つ
アミノ酸配列を特徴とするプレプロ配列であり、該プレ
プロ配列またはその部分が成熟ペプチドの分泌および／
または折りたたみを指示することを特徴とするプレプロ
配列が提供される。
【００３２】更に本発明によれば、配列番号７に記載さ
れるアミノ酸配列またはその部分と実質的配列相同性を
持ち、ペプチドに操作的に結合されたアミノ酸配列を特
徴とする遺伝子構造体が提供される。
れるアミノ酸配列またはその部分と実質的配列相同性を
持ち、ペプチドに操作的に結合されたアミノ酸配列を特
徴とする遺伝子構造体が提供される。
【００３３】更に本発明によれば、配列番号８に記載さ
れる配列またはその部分と実質的配列相同性を持つ配列
を特徴とするプロモータ配列であり、該プロモータ配列
が組換え構造体中の遺伝子の発現を指示することを特徴
とするプロモータ配列が提供される。
れる配列またはその部分と実質的配列相同性を持つ配列
を特徴とするプロモータ配列であり、該プロモータ配列
が組換え構造体中の遺伝子の発現を指示することを特徴
とするプロモータ配列が提供される。
【００３４】更に本発明によれば、配列番号８に記載さ
れる配列またはその部分と実質的配列相同性を持ち、発
現される遺伝子に操作的に結合された配列を特徴とする
組換え構造体が提供される。
れる配列またはその部分と実質的配列相同性を持ち、発
現される遺伝子に操作的に結合された配列を特徴とする
組換え構造体が提供される。
【００３５】更に本発明によれば、ディグエチアくも毒
液から実質的に単離しうる殺虫に有効なペプチドをコー
ドする新規な実質的に単離されたＤＮＡ配列が提供され
る。
液から実質的に単離しうる殺虫に有効なペプチドをコー
ドする新規な実質的に単離されたＤＮＡ配列が提供され
る。
【００３６】更に本発明によれば、ディグエチアくも毒
液から実質的に単離しうる殺虫に有効なペプチドをコー
ドするＤＮＡ配列を含む新規な組換え表現ベクターが提
供される。このベクターは形質転換細胞中の該暗号配列
の発現を行うことができる。
液から実質的に単離しうる殺虫に有効なペプチドをコー
ドするＤＮＡ配列を含む新規な組換え表現ベクターが提
供される。このベクターは形質転換細胞中の該暗号配列
の発現を行うことができる。
【００３７】更に本発明によれば、ディグエチアくも毒
液から実質的に単離しうる殺虫に有効なペプチドをコー
ドするＤＮＡ配列で、宿主細胞が該ペプチドを発現する
ように、形質転換又はトランスフェクションさせた新規
な組換え宿主細胞が提供される。
液から実質的に単離しうる殺虫に有効なペプチドをコー
ドするＤＮＡ配列で、宿主細胞が該ペプチドを発現する
ように、形質転換又はトランスフェクションさせた新規
な組換え宿主細胞が提供される。
【００３８】更に本発明によれば、ディグエチアくも毒
液から実質的に単離しうる殺虫に有効なペプチドをコー
ドするＤＮＡ配列を、宿主に又は宿主昆虫細胞に発現し
うる、新規な組換えバキュロウイルス発現ベクターが提
供される。
液から実質的に単離しうる殺虫に有効なペプチドをコー
ドするＤＮＡ配列を、宿主に又は宿主昆虫細胞に発現し
うる、新規な組換えバキュロウイルス発現ベクターが提
供される。
【００３９】更に本発明によれば、ディグエチアくも毒
液から実質的に単離しうる殺虫に有効なペプチドを製造
する新規な方法、およびその方法によって産生されるペ
プチド、が提供される。この方法は宿主細胞中で形質転
換又はトランスフェクションされた組換え発現ベクター
がディグエチアくも毒液から実質的に単離しうる殺虫に
有効なペプチドをコードするＤＮＡ配列をもち、このベ
クターが形質転換細胞中で該暗号配列の発現を行いうる
組換え宿主細胞を培養する工程；およびこの組換え宿主
細胞の培養物から殺虫に有効なペプチドを採取する工
程；を含む。
液から実質的に単離しうる殺虫に有効なペプチドを製造
する新規な方法、およびその方法によって産生されるペ
プチド、が提供される。この方法は宿主細胞中で形質転
換又はトランスフェクションされた組換え発現ベクター
がディグエチアくも毒液から実質的に単離しうる殺虫に
有効なペプチドをコードするＤＮＡ配列をもち、このベ
クターが形質転換細胞中で該暗号配列の発現を行いうる
組換え宿主細胞を培養する工程；およびこの組換え宿主
細胞の培養物から殺虫に有効なペプチドを採取する工
程；を含む。
【００４０】更に本発明によれば、ディグエチアくも毒
液から実質的に単離しうる殺虫に有効なペプチドをコー
ドするＤＮＡ配列を含み、これを植物または植物の祖先
の生殖細胞系列に導入して、ＤＮＡ配列の発現の形質が
有性伝播または無性伝播により植物の次の世代に引きつ
がれる、新規な世代交替植物が提供される。
液から実質的に単離しうる殺虫に有効なペプチドをコー
ドするＤＮＡ配列を含み、これを植物または植物の祖先
の生殖細胞系列に導入して、ＤＮＡ配列の発現の形質が
有性伝播または無性伝播により植物の次の世代に引きつ
がれる、新規な世代交替植物が提供される。
【００４１】更に本発明によれば、ディグエチアくも毒
液から実質的に単離しうる殺虫に有効なペプチドおよび
農業的に又は園芸的に許容しうる塩の有効量に害虫を接
触させることから成る無脊椎害虫を制御する新規な方法
が提供される。
液から実質的に単離しうる殺虫に有効なペプチドおよび
農業的に又は園芸的に許容しうる塩の有効量に害虫を接
触させることから成る無脊椎害虫を制御する新規な方法
が提供される。
【００４２】更に本発明によれば、ディグエチアくも毒
液から実質的に単離しうる殺虫に有効なペプチドおよび
その農業的または園芸的に許容しうる塩の有効量を発現
しうる組換えバキュロウイルスを害虫と接触させること
から成る無脊椎害虫を制御する新規な方法が提供され
る。
液から実質的に単離しうる殺虫に有効なペプチドおよび
その農業的または園芸的に許容しうる塩の有効量を発現
しうる組換えバキュロウイルスを害虫と接触させること
から成る無脊椎害虫を制御する新規な方法が提供され
る。
【００４３】更に本発明によれば、ディグエチアくも毒
液から実質的に単離しうる殺虫に有効なペプチドおよび
その農業的にまたは園芸的に許容しうる塩を農業的また
は園芸的に許容しうるキャリヤーに含む新規な殺虫用組
成物が提供される。
液から実質的に単離しうる殺虫に有効なペプチドおよび
その農業的にまたは園芸的に許容しうる塩を農業的また
は園芸的に許容しうるキャリヤーに含む新規な殺虫用組
成物が提供される。
【００４４】更に本発明によれば、ディグエチアくも毒
液から実質的に単離しうる殺虫に有効なペプチドおよび
農業的または園芸的に許容しうるその塩と実質的に免疫
反応する新規な抗体が提供される。
液から実質的に単離しうる殺虫に有効なペプチドおよび
農業的または園芸的に許容しうるその塩と実質的に免疫
反応する新規な抗体が提供される。
【００４５】更に本発明によれば、ディグエチアくも毒
液から実質的に単離しうる殺虫に有効なペプチドの存在
を検出するために本発明の抗体を使用する新規な方法で
あって次の諸工程すなわちくも毒液を得る工程；くも毒
液を検出可能な標識に結合した抗体と接触させる工程；
および該ペプチドに結合した標識のついた抗体を検出す
る工程；を含む新規な方法が提供される。
液から実質的に単離しうる殺虫に有効なペプチドの存在
を検出するために本発明の抗体を使用する新規な方法で
あって次の諸工程すなわちくも毒液を得る工程；くも毒
液を検出可能な標識に結合した抗体と接触させる工程；
および該ペプチドに結合した標識のついた抗体を検出す
る工程；を含む新規な方法が提供される。
【００４６】更に本発明によれば、ディグエチアくも毒
液から実質的に抽出しうる殺虫有効性ペプチドを精製す
るために本発明の抗体を使用する新規な方法であって次
の諸工程すなわち抗体を固体支持体に結合させる工程；
該ペプチドを含む溶液を固体支持体に結合した抗体と接
触させて溶液中に存在するペプチドを抗体に付着させる
工程；固体支持体に結合した抗体に付着したペプチドを
除去する工程；および精製ペプチドを収集する工程を含
む新規な方法が提供される。
液から実質的に抽出しうる殺虫有効性ペプチドを精製す
るために本発明の抗体を使用する新規な方法であって次
の諸工程すなわち抗体を固体支持体に結合させる工程；
該ペプチドを含む溶液を固体支持体に結合した抗体と接
触させて溶液中に存在するペプチドを抗体に付着させる
工程；固体支持体に結合した抗体に付着したペプチドを
除去する工程；および精製ペプチドを収集する工程を含
む新規な方法が提供される。
【００４７】更に本発明によれば、ディグエチアくも毒
液から実質的に単離しうる殺虫に有効なペプチドをコー
ドするＤＮＡ配列から誘導される新規なＤＮＡプローブ
が提供される。
液から実質的に単離しうる殺虫に有効なペプチドをコー
ドするＤＮＡ配列から誘導される新規なＤＮＡプローブ
が提供される。
【００４８】更に本発明によれば、ディグエチアくも毒
液から実質的に単離しうる殺虫に有効なペプチドをコー
ドする核酸の存在を検知する新規な方法であって次の諸
工程すなわちくもの核酸を得る工程；この核酸を本発明
のＤＮＡプローブと接触させる工程；および核酸に結合
したプローブを検出する工程；を含む新規な方法が提供
される。
液から実質的に単離しうる殺虫に有効なペプチドをコー
ドする核酸の存在を検知する新規な方法であって次の諸
工程すなわちくもの核酸を得る工程；この核酸を本発明
のＤＮＡプローブと接触させる工程；および核酸に結合
したプローブを検出する工程；を含む新規な方法が提供
される。
【００４９】Ａ．定義 ここに使用する「ディグエチアくも毒液から実質的に単
離しうる殺虫に有効なペプチド」とは殺虫に有効なペプ
チドならびに該ペプチドが従来技術において知られる技
術のいずれかによってディグエチアから実質的に単離し
えたものである限りすべての技術からのペプチドの殺虫
に有効な断片、を包含する。このような資源としてたと
えば組換えで産生された殺虫に有効なペプチドがあげら
れる。
離しうる殺虫に有効なペプチド」とは殺虫に有効なペプ
チドならびに該ペプチドが従来技術において知られる技
術のいずれかによってディグエチアから実質的に単離し
えたものである限りすべての技術からのペプチドの殺虫
に有効な断片、を包含する。このような資源としてたと
えば組換えで産生された殺虫に有効なペプチドがあげら
れる。
【００５０】ここに使用する「発現ベクター」はそこに
含まれたＤＮＡ配列を発現しうる、そしてこのような配
列がその発現を行いうる他の配列に操作可能に結合され
るベクターを包含する。必ずしもはっきりと述べていな
いけれども、これらの発現ベクターは宿主有機体中でエ
ピソームとして又は染色体ＤＮＡの一体的な一部として
再生可能でなければならないということがそれとなく述
べられている。明らかに複製能力の欠如はそれらを効果
的に操作不能にする。要約して、「発現ベクター」は機
能的な定義で与えられ、ここで取り扱われる特定化され
たＤＮＡコードの発現を行いうるすべてのＤＮＡ配列は
それが特定化された配列に利用されるという点でこの用
語に含まれる。一般に、組換えＤＮＡ技術において利用
される発現ベクターは多くの場合「プラスミド」の形態
にあり、これは環状２重らせんＤＮＡと呼ばれ、このも
のはそれらのベクターの形態において染色体に結合して
はいない。「プラスミド」と「ベクター」は互換的に使
用される。プラスミドはベクターの最もふつうに使用さ
れる形態だからである。然しながら、本発明は等価な機
能を果し、その後の技術において知られるようになった
そのような他の形態の発現ベクターを含むことが意図さ
れる。
含まれたＤＮＡ配列を発現しうる、そしてこのような配
列がその発現を行いうる他の配列に操作可能に結合され
るベクターを包含する。必ずしもはっきりと述べていな
いけれども、これらの発現ベクターは宿主有機体中でエ
ピソームとして又は染色体ＤＮＡの一体的な一部として
再生可能でなければならないということがそれとなく述
べられている。明らかに複製能力の欠如はそれらを効果
的に操作不能にする。要約して、「発現ベクター」は機
能的な定義で与えられ、ここで取り扱われる特定化され
たＤＮＡコードの発現を行いうるすべてのＤＮＡ配列は
それが特定化された配列に利用されるという点でこの用
語に含まれる。一般に、組換えＤＮＡ技術において利用
される発現ベクターは多くの場合「プラスミド」の形態
にあり、これは環状２重らせんＤＮＡと呼ばれ、このも
のはそれらのベクターの形態において染色体に結合して
はいない。「プラスミド」と「ベクター」は互換的に使
用される。プラスミドはベクターの最もふつうに使用さ
れる形態だからである。然しながら、本発明は等価な機
能を果し、その後の技術において知られるようになった
そのような他の形態の発現ベクターを含むことが意図さ
れる。
【００５１】「組換え宿主細胞」とは組換えＤＮＡ技術
を使用して構築されたベクターで形質転換を受けた細胞
のことをいう。
を使用して構築されたベクターで形質転換を受けた細胞
のことをいう。
【００５２】クモ科ディグエチダエ（Ｄｉｇｕｅｔｉｄ
ａｅ）は現在単一の属ディグエチア（Ｄｉｇｕｅｔｉ
ａ）から成る。ディグエチア種は一般に南西米国（カリ
フォルニアを含む）およびメキシコで見出される。これ
らの小さいクモはサボテンを含む多くの種類の植物およ
び灌木に広大な不規則な巣を張る。種々のディグエチア
種は、ほとんどのクモと同様に、一般に肉食動物であ
り、遭遇する多くの種類の捕獲昆虫を容易に捕食する。
ａｅ）は現在単一の属ディグエチア（Ｄｉｇｕｅｔｉ
ａ）から成る。ディグエチア種は一般に南西米国（カリ
フォルニアを含む）およびメキシコで見出される。これ
らの小さいクモはサボテンを含む多くの種類の植物およ
び灌木に広大な不規則な巣を張る。種々のディグエチア
種は、ほとんどのクモと同様に、一般に肉食動物であ
り、遭遇する多くの種類の捕獲昆虫を容易に捕食する。
【００５３】本発明はどのような論理的理由にも限定さ
れることを意味しないけれども、本発明の殺虫に有効な
ペプチドを昆虫に注射する際にみられる異常な症候は、
アルカロイドＮａ+ チャンネル活性化剤ベラトリジンま
たはＮａ+ チャンネル活性として知られるブチダエ（Ｂ
ｕｔｈｉｄａｅ）科およびブザ（Ｂｕｔｈｕｓ）属から
のサソリ毒物を昆虫に注射するときにみられる症候に非
常に類似している。この殺虫に有効なペプチドは、多分
Ｎａ+ またはＫ+ チャンネルに影響する、筋肉および／
または神経膜の部分的な脱分極を生ぜしめうると信じら
れる。更に詳しくは、この殺虫に有効なペプチドはテト
ロドトキシンによるブロックに敏感な神経の反復的なバ
ースト放電を誘発すると信ぜられる。従って、多分これ
はペプチドの作用の部位である神経膜上の電圧感受性ナ
トリウム・チャンネルである。
れることを意味しないけれども、本発明の殺虫に有効な
ペプチドを昆虫に注射する際にみられる異常な症候は、
アルカロイドＮａ+ チャンネル活性化剤ベラトリジンま
たはＮａ+ チャンネル活性として知られるブチダエ（Ｂ
ｕｔｈｉｄａｅ）科およびブザ（Ｂｕｔｈｕｓ）属から
のサソリ毒物を昆虫に注射するときにみられる症候に非
常に類似している。この殺虫に有効なペプチドは、多分
Ｎａ+ またはＫ+ チャンネルに影響する、筋肉および／
または神経膜の部分的な脱分極を生ぜしめうると信じら
れる。更に詳しくは、この殺虫に有効なペプチドはテト
ロドトキシンによるブロックに敏感な神経の反復的なバ
ースト放電を誘発すると信ぜられる。従って、多分これ
はペプチドの作用の部位である神経膜上の電圧感受性ナ
トリウム・チャンネルである。
【００５４】Ｂ．ディグエチア毒液からのペプチドの単
離 クモ毒液はセファロトラックスからのクモの毒液腺抽出
のような知られた方法によってディグエチアから取り除
くことができる。然しながら、クモ毒液および単離され
た毒物の内部の不純物を避けるために、クモ毒液はクモ
を電気的に刺戟して毒液を放出させ、次いで放出毒液を
吸引によって集めることによって得るのが好ましい。吐
出またはヘモリンパ球による毒液の汚染の阻止は米国特
許第４，９２５，６６４号明細書に記載されている。
離 クモ毒液はセファロトラックスからのクモの毒液腺抽出
のような知られた方法によってディグエチアから取り除
くことができる。然しながら、クモ毒液および単離され
た毒物の内部の不純物を避けるために、クモ毒液はクモ
を電気的に刺戟して毒液を放出させ、次いで放出毒液を
吸引によって集めることによって得るのが好ましい。吐
出またはヘモリンパ球による毒液の汚染の阻止は米国特
許第４，９２５，６６４号明細書に記載されている。
【００５５】クモ毒液を電気的ミルキング技術によって
えたならば、それは高性能液体クロマトグラフィー
（“ＨＰＬＣ”）またはゲル濾過クロマトグラフィーま
たは他の有用な分離技術を使用してそのペプチド（毒
物）成分に分別することができる。また、それはＨＰＬ
Ｃによって行われるクモ毒液の最終分別にとって望まし
いことが多い。
えたならば、それは高性能液体クロマトグラフィー
（“ＨＰＬＣ”）またはゲル濾過クロマトグラフィーま
たは他の有用な分離技術を使用してそのペプチド（毒
物）成分に分別することができる。また、それはＨＰＬ
Ｃによって行われるクモ毒液の最終分別にとって望まし
いことが多い。
【００５６】従って、クモの電気的ミルキング技術をゲ
ル濾過クロマトグラフィーおよび／または高性能液体ク
ロマトグラフィーおよび他の関連技術たとえば疎水性相
互作用クロマトグラフィーと組合せて使用して、実質的
に精製されたクモ毒液を得ることができる。然しなが
ら、他の等価な技術を本発明の範囲内で使用してクモ毒
液を単離することができるということが理解されるであ
ろう。このように単離された毒物は当業者に周知の方法
によってアミノ酸配列および殺虫活性を検査することが
できる。
ル濾過クロマトグラフィーおよび／または高性能液体ク
ロマトグラフィーおよび他の関連技術たとえば疎水性相
互作用クロマトグラフィーと組合せて使用して、実質的
に精製されたクモ毒液を得ることができる。然しなが
ら、他の等価な技術を本発明の範囲内で使用してクモ毒
液を単離することができるということが理解されるであ
ろう。このように単離された毒物は当業者に周知の方法
によってアミノ酸配列および殺虫活性を検査することが
できる。
【００５７】Ｃ．殺虫に有効なペプチド 本発明はその一面において、ディグエチアくも毒液から
実質的に精製および単離しうる殺虫に有効なペプチドお
よび殺虫に有効なその断片、ならびに農業的に又は園芸
的に許容しうるそれらの塩を提供する。
実質的に精製および単離しうる殺虫に有効なペプチドお
よび殺虫に有効なその断片、ならびに農業的に又は園芸
的に許容しうるそれらの塩を提供する。
【００５８】殺虫に有効なペプチド含有留分が単離およ
び精製されたならば、アミノ酸配列の決定は当業者に周
知の方法たとえばＮ−末端アミノ酸配列法および自動ア
ミノ酸シークエンサーの使用により行うことができる。
び精製されたならば、アミノ酸配列の決定は当業者に周
知の方法たとえばＮ−末端アミノ酸配列法および自動ア
ミノ酸シークエンサーの使用により行うことができる。
【００５９】この開示から、追加の殺虫に有効なタンパ
ク類が本発明の範囲内にあると予期されることが理解さ
れるであろう。すなわち、他の殺虫有効ペプチドがここ
に詳細に述べる３種の他にディグエチアから単離可能で
あると信ぜられる。ディグエチアから単離される殺虫に
有効なペプチドのこの系列のメンバーは次の特性を分か
ち合っていると思われる。
ク類が本発明の範囲内にあると予期されることが理解さ
れるであろう。すなわち、他の殺虫有効ペプチドがここ
に詳細に述べる３種の他にディグエチアから単離可能で
あると信ぜられる。ディグエチアから単離される殺虫に
有効なペプチドのこの系列のメンバーは次の特性を分か
ち合っていると思われる。
【００６０】１）大きさ：すべて約６２００〜約７２０
０ダルトンの範囲および長さで約５５〜約６５アミノ酸
の範囲； ２）保存アミノ末端：配列番号：１，３および５は最初
の５個のアミノ酸について同じである； ３）配列番号：１，３および５は４０％より大きい配列
の相同性をもつ； ４）配列番号：１，３および５は約７または８のシステ
イン残基をもつ； ５）遺伝子のクラスターリング：これらの毒物の１つ以
上に対する遺伝子はゲノムＤＮＡの共局在化部分である
ようにみえ、このことは多分これらの遺伝子がすべて単
一祖先の遺伝子からひきつがれたものでありうることを
示すものである。
０ダルトンの範囲および長さで約５５〜約６５アミノ酸
の範囲； ２）保存アミノ末端：配列番号：１，３および５は最初
の５個のアミノ酸について同じである； ３）配列番号：１，３および５は４０％より大きい配列
の相同性をもつ； ４）配列番号：１，３および５は約７または８のシステ
イン残基をもつ； ５）遺伝子のクラスターリング：これらの毒物の１つ以
上に対する遺伝子はゲノムＤＮＡの共局在化部分である
ようにみえ、このことは多分これらの遺伝子がすべて単
一祖先の遺伝子からひきつがれたものでありうることを
示すものである。
【００６１】更に詳しくは、３つの殺虫に有効なペプチ
ドが単離され確認された。第１に、ＤＫ９．２が単離さ
れ、そのアミノ酸配列は、単離されたｃＤＮＡから翻訳
される如く、配列番号１に定義される如く現れる。マス
・スペクトロスコピーのデータは位置２６に保存的置換
を含む２つのイソ酵素を示唆している。一方のイソ酵素
は位置２６にトレオニンを含み、他方は位置２６にグル
タミンを含む。グルタミン・イソ酵素はトレオニン・イ
ソ酵素より大きい約２７の原子量単位である。以後のＤ
９．２に対する全ての言及はイソ酵素のいずれか一方の
及び／又は両方のイソ酵素のことをいうものと解釈すべ
きである。ＤＫ９．２はマス・スペクトロメトリーによ
って決定される時約６３７１〜６３９７ダルトンの分子
量によりおよび逆相ＨＰＬＣ上の単一ピークとしての移
動によって特徴づけられる。第２に、ＤＫ１１が単離さ
れ、マス・スペクトロメトリーによって決定される時約
６７００ダルトンまたは約６７４０ダルトンの分子量に
よっておよび逆相ＨＰＬＣ上の単一ピークとしての移動
によって特徴づけられる。更に詳しくは、この活性ＨＰ
ＬＣ分画は配列番号３に示されるように、単離されたｃ
ＤＮＡから翻訳される時アミノ酸配列をもつことが同定
された。最後に今日まで、この殺虫に有効なタンパク系
列の第３メンバーＤＫ１２はマス・スペクトロメトリー
によって決定される時約７１００ダルトンまたは約７０
８０ダルトンの分子量によっておよび逆相ＨＰＬＣの単
一ピークとしての移動によって特徴づけられた。更に詳
しくはこの活性分画は配列番号５に示すようにアミノ酸
配列をもつことが仮に示された。単離された３つのペプ
チドは配列番号１，３および５に相当し、実質的に同じ
殺虫活性を示す。配列番号１，３または５と４０％より
大きい配列相同性の約５５〜６５個アミノ酸もち且つ約
７また８個のシステイン残基をもつ他のペプチドも実質
的に同じ殺虫活性を示す事が予期される。このようなペ
プチドは天然に存在するか、または当業者に知られてい
る組換えＤＮＡ技術の方法によって製造することができ
る。このようなペプチドは天然産のものであれ、組換え
技術によって産生されたものであれ、本発明の範囲内で
あることが意図される。
ドが単離され確認された。第１に、ＤＫ９．２が単離さ
れ、そのアミノ酸配列は、単離されたｃＤＮＡから翻訳
される如く、配列番号１に定義される如く現れる。マス
・スペクトロスコピーのデータは位置２６に保存的置換
を含む２つのイソ酵素を示唆している。一方のイソ酵素
は位置２６にトレオニンを含み、他方は位置２６にグル
タミンを含む。グルタミン・イソ酵素はトレオニン・イ
ソ酵素より大きい約２７の原子量単位である。以後のＤ
９．２に対する全ての言及はイソ酵素のいずれか一方の
及び／又は両方のイソ酵素のことをいうものと解釈すべ
きである。ＤＫ９．２はマス・スペクトロメトリーによ
って決定される時約６３７１〜６３９７ダルトンの分子
量によりおよび逆相ＨＰＬＣ上の単一ピークとしての移
動によって特徴づけられる。第２に、ＤＫ１１が単離さ
れ、マス・スペクトロメトリーによって決定される時約
６７００ダルトンまたは約６７４０ダルトンの分子量に
よっておよび逆相ＨＰＬＣ上の単一ピークとしての移動
によって特徴づけられる。更に詳しくは、この活性ＨＰ
ＬＣ分画は配列番号３に示されるように、単離されたｃ
ＤＮＡから翻訳される時アミノ酸配列をもつことが同定
された。最後に今日まで、この殺虫に有効なタンパク系
列の第３メンバーＤＫ１２はマス・スペクトロメトリー
によって決定される時約７１００ダルトンまたは約７０
８０ダルトンの分子量によっておよび逆相ＨＰＬＣの単
一ピークとしての移動によって特徴づけられた。更に詳
しくはこの活性分画は配列番号５に示すようにアミノ酸
配列をもつことが仮に示された。単離された３つのペプ
チドは配列番号１，３および５に相当し、実質的に同じ
殺虫活性を示す。配列番号１，３または５と４０％より
大きい配列相同性の約５５〜６５個アミノ酸もち且つ約
７また８個のシステイン残基をもつ他のペプチドも実質
的に同じ殺虫活性を示す事が予期される。このようなペ
プチドは天然に存在するか、または当業者に知られてい
る組換えＤＮＡ技術の方法によって製造することができ
る。このようなペプチドは天然産のものであれ、組換え
技術によって産生されたものであれ、本発明の範囲内で
あることが意図される。
【００６２】Ｄ．本発明の殺虫に有効なペプチドの暗号
配列の同定 本発明の別の面によれば、ディグエチアくも毒液から実
質的に単離しうる殺虫に有効なペプチドをコードする実
質的に単離されたＤＮＡ配列が提供される。
配列の同定 本発明の別の面によれば、ディグエチアくも毒液から実
質的に単離しうる殺虫に有効なペプチドをコードする実
質的に単離されたＤＮＡ配列が提供される。
【００６３】上記のようにして得た部分アミノ酸配列の
データを使用して、クモから単離しうるタンパクの産生
に関与しうる遺伝子を単離および同定しうる。ペプチド
の産生に関与しうる遺伝子を得るために多数の方法を利
用することができる。例としてフクア・エス（Ｆｕｑｕ
ａ，Ｓ．）らの“Ａ ｓｉｍｐｌｅ ＰＣＲ ｍｅｔｈ
ｏｄ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｌｏｎ
ｉｎｇ ｌｏｗ ａｂｕｎｄａｎｔ ｔｒａｎｓｃｒｉ
ｐｔ，”Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，ｖｏｌ．９Ｎｏ．
２（１９９０年８月）；フローマン（Ｆｒｏｈｍａｎ，
Ｍ．Ａ．）の“Ｒａｃｅ：Ｒａｐｉｄ ａｍｐｌｉｆｉ
ｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ ｅｎｄｓ”，ＰＣＲ
ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，イニシスら編集、米国カルホルニ
ア州サンジエゴのアカデミック・プレス（１９９０年）
刊行；および米国特許第４，７０３，００８号明細書
“ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ Ｅｎｃｏｄｉｎｇ Ｅ
ｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ”があげられる。上記の米
国特許明細書を引用によってここにくみ入れる。
データを使用して、クモから単離しうるタンパクの産生
に関与しうる遺伝子を単離および同定しうる。ペプチド
の産生に関与しうる遺伝子を得るために多数の方法を利
用することができる。例としてフクア・エス（Ｆｕｑｕ
ａ，Ｓ．）らの“Ａ ｓｉｍｐｌｅ ＰＣＲ ｍｅｔｈ
ｏｄ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｌｏｎ
ｉｎｇ ｌｏｗ ａｂｕｎｄａｎｔ ｔｒａｎｓｃｒｉ
ｐｔ，”Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，ｖｏｌ．９Ｎｏ．
２（１９９０年８月）；フローマン（Ｆｒｏｈｍａｎ，
Ｍ．Ａ．）の“Ｒａｃｅ：Ｒａｐｉｄ ａｍｐｌｉｆｉ
ｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ ｅｎｄｓ”，ＰＣＲ
ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，イニシスら編集、米国カルホルニ
ア州サンジエゴのアカデミック・プレス（１９９０年）
刊行；および米国特許第４，７０３，００８号明細書
“ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ Ｅｎｃｏｄｉｎｇ Ｅ
ｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ”があげられる。上記の米
国特許明細書を引用によってここにくみ入れる。
【００６４】要約すると、決定されたアミノ酸配列をコ
ードする、または決定されたアミノ酸配列をコードする
そのようなＤＮＡ分子に対して相補的ＤＮＡ鎖を表す、
ＤＮＡ分子が合成される。この合成ＤＮＡ分子は次いで
組換えＤＮＡ分子を含む細胞クローン中のＤＮＡ配列の
相同性をプローブするために使用することができる。組
換えＤＮＡ分子は、クモのような有機体のゲノムＤＮＡ
から誘導された、またはクモのような有機体の細胞また
は組織から単離されたｍＲＮＡのｃＤＮＡコピーから誘
導されたＤＮＡ配列を部分的に含む。一般に１５個以上
のヌクレオチドのＤＮＡ分子が相同ＤＮＡの特異性の同
定のために必要である。この数は配列中の少なくとも５
個のアミノ酸の特異性の決定を必要とする。それぞれの
アミノ酸は６個まで特異なトリヌクレオチドＤＮＡ配列
またはコドンをコードすることができるので決定された
アミノ酸配列をコードすることのできる異なったＤＮＡ
分子の数は非常に大きくなりうるということが理解され
るであろう。それ故、すべての可能な合成ＤＮＡプロー
ブを個々に試験することは実際的ではなく、若干のこの
ようなＤＮＡ分子のプールが付随的にプローブとして使
用される。「変性」プローブと呼ばれるこのようなプー
ルの産生は当業技術において周知である。プローブ混合
物中の唯一個のＤＮＡ分子は問題の遺伝子に対して正確
な配列の相同性をもつであろうけれども、高度の相同性
のみが必要とされるので、プール中の若干の合成ＤＮＡ
分子は該遺伝子を特異的に同定することができるという
ことがまた理解されるであろう。それ故、問題の遺伝子
の満足すべき単離はすべての可能なＤＮＡプローブ配列
を含まない合成ＤＮＡプローブのプールを用いて達成さ
れうる。一般に、有機体によってまれに利用されるコド
ンはプローブプール中に表わされる必要はない。事実、
単一配列のＤＮＡプローブはそれぞれのアミノ酸につい
て有機体によって最もしばしば利用されるＤＮＡコドン
のみを包含させることによって製造される。然しこの試
みは必ずしも常に成功するものではないことが理解され
るであろう。
ードする、または決定されたアミノ酸配列をコードする
そのようなＤＮＡ分子に対して相補的ＤＮＡ鎖を表す、
ＤＮＡ分子が合成される。この合成ＤＮＡ分子は次いで
組換えＤＮＡ分子を含む細胞クローン中のＤＮＡ配列の
相同性をプローブするために使用することができる。組
換えＤＮＡ分子は、クモのような有機体のゲノムＤＮＡ
から誘導された、またはクモのような有機体の細胞また
は組織から単離されたｍＲＮＡのｃＤＮＡコピーから誘
導されたＤＮＡ配列を部分的に含む。一般に１５個以上
のヌクレオチドのＤＮＡ分子が相同ＤＮＡの特異性の同
定のために必要である。この数は配列中の少なくとも５
個のアミノ酸の特異性の決定を必要とする。それぞれの
アミノ酸は６個まで特異なトリヌクレオチドＤＮＡ配列
またはコドンをコードすることができるので決定された
アミノ酸配列をコードすることのできる異なったＤＮＡ
分子の数は非常に大きくなりうるということが理解され
るであろう。それ故、すべての可能な合成ＤＮＡプロー
ブを個々に試験することは実際的ではなく、若干のこの
ようなＤＮＡ分子のプールが付随的にプローブとして使
用される。「変性」プローブと呼ばれるこのようなプー
ルの産生は当業技術において周知である。プローブ混合
物中の唯一個のＤＮＡ分子は問題の遺伝子に対して正確
な配列の相同性をもつであろうけれども、高度の相同性
のみが必要とされるので、プール中の若干の合成ＤＮＡ
分子は該遺伝子を特異的に同定することができるという
ことがまた理解されるであろう。それ故、問題の遺伝子
の満足すべき単離はすべての可能なＤＮＡプローブ配列
を含まない合成ＤＮＡプローブのプールを用いて達成さ
れうる。一般に、有機体によってまれに利用されるコド
ンはプローブプール中に表わされる必要はない。事実、
単一配列のＤＮＡプローブはそれぞれのアミノ酸につい
て有機体によって最もしばしば利用されるＤＮＡコドン
のみを包含させることによって製造される。然しこの試
みは必ずしも常に成功するものではないことが理解され
るであろう。
【００６５】遺伝子配列を同定するための１つの技術は
複製連鎖反応（ＰＣＲ）を使用している。たとえば米国
特許第４，６８３，１９５号明細書および第４，６８
３，２０２号明細書参照。本質的に、ＰＣＲは配列の２
つの資料部分が知られているときに、えらばれたＤＮＡ
配列の産生を可能にする。問題の配列のそれぞれの末端
に相当するプライマー、すなわちオリゴヌクレオチド・
プローブがえられる。ＰＣＲを使用して、ＤＮＡ配列の
中心部分が次いで合成により産生される。
複製連鎖反応（ＰＣＲ）を使用している。たとえば米国
特許第４，６８３，１９５号明細書および第４，６８
３，２０２号明細書参照。本質的に、ＰＣＲは配列の２
つの資料部分が知られているときに、えらばれたＤＮＡ
配列の産生を可能にする。問題の配列のそれぞれの末端
に相当するプライマー、すなわちオリゴヌクレオチド・
プローブがえられる。ＰＣＲを使用して、ＤＮＡ配列の
中心部分が次いで合成により産生される。
【００６６】独特のクモ毒液遺伝子をコードする遺伝子
を得るために、このようなＰＣＲを使用する１つの方法
において、ＲＮＡはクモから単離され、精製される。次
いでデオキシチミジレート末端オリゴヌクレオチドをプ
ライマーとして使用してクモＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写
する。上記の変性プローブにおけるように、合成ＤＮＡ
分子または合成ＤＮＡ分子の混合物は先に決定された毒
液タンパクのアミノ末端アミノ酸配列をコードしうるも
のとして製造される。このＤＮＡ混合物をデオキシチミ
ジレート末端オリゴヌクレオチドと共に使用してＰＣＲ
反応を開始させる。ＰＣＲ反応を開始させるのに使用す
る合成ＤＮＡ混合物は所望のｍＲＮＡ配列に対して特異
的であるので所望のｄＤＮＡのみが、効果的に増幅され
る。合成生成物は多数の周知のクローニング・ベクター
のいずれかに結合しうる増幅ｃＤＮＡを表す。これに逆
らうことなしに、ペプチドの“系列（ファミリー）”が
類似のアミノ酸配列をもつクモ毒液中に存在しうるこ
と、およびこのような場合、混合オリゴヌクレオチドプ
ライマー配列の使用はこれらの関連ペプチドをコードす
る１つ以上の関係ｃＤＮＡの増幅をもたらすこと、が理
解されるであろう。関連ペプチドをコードする遺伝子も
本発明の範囲内にある。関連ペプチドも有用な殺虫活性
をもつからである。
を得るために、このようなＰＣＲを使用する１つの方法
において、ＲＮＡはクモから単離され、精製される。次
いでデオキシチミジレート末端オリゴヌクレオチドをプ
ライマーとして使用してクモＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写
する。上記の変性プローブにおけるように、合成ＤＮＡ
分子または合成ＤＮＡ分子の混合物は先に決定された毒
液タンパクのアミノ末端アミノ酸配列をコードしうるも
のとして製造される。このＤＮＡ混合物をデオキシチミ
ジレート末端オリゴヌクレオチドと共に使用してＰＣＲ
反応を開始させる。ＰＣＲ反応を開始させるのに使用す
る合成ＤＮＡ混合物は所望のｍＲＮＡ配列に対して特異
的であるので所望のｄＤＮＡのみが、効果的に増幅され
る。合成生成物は多数の周知のクローニング・ベクター
のいずれかに結合しうる増幅ｃＤＮＡを表す。これに逆
らうことなしに、ペプチドの“系列（ファミリー）”が
類似のアミノ酸配列をもつクモ毒液中に存在しうるこ
と、およびこのような場合、混合オリゴヌクレオチドプ
ライマー配列の使用はこれらの関連ペプチドをコードす
る１つ以上の関係ｃＤＮＡの増幅をもたらすこと、が理
解されるであろう。関連ペプチドをコードする遺伝子も
本発明の範囲内にある。関連ペプチドも有用な殺虫活性
をもつからである。
【００６７】最後に、産生されたｃＤＮＡ配列は通常の
技術を使用して適当なベクター中にクローン化され、分
析されそしてヌクレオチド塩基配列が決定されうる。殺
虫に有効なタンパクをコードするＤＮＡはたとえば配列
番号：２および４で表わされる。これらのＰＣＲ生成物
の直接のアミノ酸翻訳は、それらが成熟タンパクのため
の完全な暗号配列に対応することを明白にするであろ
う。成熟ＤＫ９．２をコードするｃＤＮＡの他に、この
ＤＫ９．２暗号配列のｃＤＮＡ配列の上流がクローン化
され配列化された（配列番号７）。この完全なｍＲＮＡ
の翻訳はＤＫ９．２がシグナルペプチド、プロペプチド
およびその成熟毒物を含む前駆体タンパクとして合成さ
れることを明らかにした。シグナルペプチドの機能は合
成ポリペプチドを分泌させる標的として重要であると考
えられる。シグナル配列は新しく合成されたタンパクの
適正な局在化を確保する上で重要な役割を演じる。一般
にそれらは“トポジエニックシグナルズ（ｔｏｐｏｇｅ
ｎｉｃｓｉｇｎａｌｓ）”（ブローベル，ジーのＰｒｏ
ｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．７７，
１４９６−１５００（１９８０））を提供し、これらは
細胞に対して内部の又は外部の種々の目的に対して付着
したタンパク配列を標的にしている。これは、その標的
部位が細胞外にある分泌タンパクにとって特に重要であ
る。組換えタンパク産生にとってそれがより容易である
ことができるとき、細胞を分解すべきであることよりも
細胞外媒質から発現タンパクを精製することそして全細
胞抽出物から精製することがまた有用である。タンパク
を精製する方が容易であることも有望である。ＤＫ９．
２の前駆体タンパクをコードするｃＤＮＡによってコー
ドされるシグナルペプチドは次の配列の１７個のアミノ
酸から成るものと信ぜられる。 Met-Lys-Val-Phe-Val-Val-Leu-Leu-Cys- Leu-Ser-Leu-Ala-Ala-Val-Tyr-Ala
技術を使用して適当なベクター中にクローン化され、分
析されそしてヌクレオチド塩基配列が決定されうる。殺
虫に有効なタンパクをコードするＤＮＡはたとえば配列
番号：２および４で表わされる。これらのＰＣＲ生成物
の直接のアミノ酸翻訳は、それらが成熟タンパクのため
の完全な暗号配列に対応することを明白にするであろ
う。成熟ＤＫ９．２をコードするｃＤＮＡの他に、この
ＤＫ９．２暗号配列のｃＤＮＡ配列の上流がクローン化
され配列化された（配列番号７）。この完全なｍＲＮＡ
の翻訳はＤＫ９．２がシグナルペプチド、プロペプチド
およびその成熟毒物を含む前駆体タンパクとして合成さ
れることを明らかにした。シグナルペプチドの機能は合
成ポリペプチドを分泌させる標的として重要であると考
えられる。シグナル配列は新しく合成されたタンパクの
適正な局在化を確保する上で重要な役割を演じる。一般
にそれらは“トポジエニックシグナルズ（ｔｏｐｏｇｅ
ｎｉｃｓｉｇｎａｌｓ）”（ブローベル，ジーのＰｒｏ
ｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．７７，
１４９６−１５００（１９８０））を提供し、これらは
細胞に対して内部の又は外部の種々の目的に対して付着
したタンパク配列を標的にしている。これは、その標的
部位が細胞外にある分泌タンパクにとって特に重要であ
る。組換えタンパク産生にとってそれがより容易である
ことができるとき、細胞を分解すべきであることよりも
細胞外媒質から発現タンパクを精製することそして全細
胞抽出物から精製することがまた有用である。タンパク
を精製する方が容易であることも有望である。ＤＫ９．
２の前駆体タンパクをコードするｃＤＮＡによってコー
ドされるシグナルペプチドは次の配列の１７個のアミノ
酸から成るものと信ぜられる。 Met-Lys-Val-Phe-Val-Val-Leu-Leu-Cys- Leu-Ser-Leu-Ala-Ala-Val-Tyr-Ala
【００６８】シグナルペプチドの他に、ＤＫ９．２暗号
配列の上流に配置されたｍＲＮＡの翻訳はプロペプチド
を表した。プロペプチドの機能は知られていない。プロ
ペプチドは次の配列の２１個のアミノ酸ペプチドであ
る。 -Leu-Glu-Glu-Arg-Leu-Asp-Lys-Asp-Ala-Asp-Ile -Met-Leu-Asp-Ser-Pro-Ala-Asp-Met-Glu-Arg-
配列の上流に配置されたｍＲＮＡの翻訳はプロペプチド
を表した。プロペプチドの機能は知られていない。プロ
ペプチドは次の配列の２１個のアミノ酸ペプチドであ
る。 -Leu-Glu-Glu-Arg-Leu-Asp-Lys-Asp-Ala-Asp-Ile -Met-Leu-Asp-Ser-Pro-Ala-Asp-Met-Glu-Arg-
【００６９】これらの前駆ペプチドすなわちプレプロ配
列は生体内および／または試験管内で発現されるときＤ
Ｋ９．２または他の組換えタンパクの安定性、発現およ
びホルデイングに対して非常に貢献しうる。これらの配
列またはその部分は、他の分子の発現に、たとえば遺伝
子の構成に有用であることを実証しうるということがま
た予見される。本発明の一部として、我々はまた他のシ
グナルおよび／またはプロペプチド配列が組換え体ＤＫ
９．２の発現に使用しうることを確認するためのデータ
を供給することもできるであろう。
列は生体内および／または試験管内で発現されるときＤ
Ｋ９．２または他の組換えタンパクの安定性、発現およ
びホルデイングに対して非常に貢献しうる。これらの配
列またはその部分は、他の分子の発現に、たとえば遺伝
子の構成に有用であることを実証しうるということがま
た予見される。本発明の一部として、我々はまた他のシ
グナルおよび／またはプロペプチド配列が組換え体ＤＫ
９．２の発現に使用しうることを確認するためのデータ
を供給することもできるであろう。
【００７０】Ｅ．組換え体の発現 皿に本発明によればディグエチアくも毒液から実質的に
単離しうる殺虫に有効なペプチドをコードするＤＮＡを
含む組換え発現ベクターが提供される。このベクターは
形質転換細胞中で暗号配列の発現を行うことができる。
また本発明によれば、ディグエチアくも毒液から実質的
に単離しうる殺虫に有効なペプチドをコードするＤＮＡ
配列で宿主細胞を、それが該ペプチドを発現させるよう
に、形質転換またはトランスフェクションさせた組換え
宿主細胞が提供される。
単離しうる殺虫に有効なペプチドをコードするＤＮＡを
含む組換え発現ベクターが提供される。このベクターは
形質転換細胞中で暗号配列の発現を行うことができる。
また本発明によれば、ディグエチアくも毒液から実質的
に単離しうる殺虫に有効なペプチドをコードするＤＮＡ
配列で宿主細胞を、それが該ペプチドを発現させるよう
に、形質転換またはトランスフェクションさせた組換え
宿主細胞が提供される。
【００７１】所望のタンパクをコードする適切なＤＮＡ
配列の提供は、当該技術で今や知られている組換え技術
を使用してタンパクの産生を行うことを可能にする。暗
号配列は、タンパクの天然資源からｃＤＮＡまたはゲノ
ム配列を回収することによって得ることができ、あるい
は遺伝子のヌクレオチド配列から決定される正確なアミ
ノ酸配列を使用して合成的に製造することもできる。こ
の暗号ＤＮＡが合成的に製造されるとき、意図される宿
主の周知のコドンを採択することができるという利点が
ある。
配列の提供は、当該技術で今や知られている組換え技術
を使用してタンパクの産生を行うことを可能にする。暗
号配列は、タンパクの天然資源からｃＤＮＡまたはゲノ
ム配列を回収することによって得ることができ、あるい
は遺伝子のヌクレオチド配列から決定される正確なアミ
ノ酸配列を使用して合成的に製造することもできる。こ
の暗号ＤＮＡが合成的に製造されるとき、意図される宿
主の周知のコドンを採択することができるという利点が
ある。
【００７２】必要な調節配列、たとえばプロモーター、
および好ましくはエンハンサーおよび末端制御を含む発
現機構は容易に入手することができ、そして多種類の宿
主について当該技術において知られている。たとえばサ
ンプルーク（Ｓａｍｂｒｏｃｋ）らのＭｏｌｅｃｕｌａ
ｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａ
ｎｕａｌ，第２版，コールド・スプリング・ハーバープ
レス（１９８９年）刊行を参照。
および好ましくはエンハンサーおよび末端制御を含む発
現機構は容易に入手することができ、そして多種類の宿
主について当該技術において知られている。たとえばサ
ンプルーク（Ｓａｍｂｒｏｃｋ）らのＭｏｌｅｃｕｌａ
ｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａ
ｎｕａｌ，第２版，コールド・スプリング・ハーバープ
レス（１９８９年）刊行を参照。
【００７３】従って、所望のタンパクは原核生物および
真核生物の双方の系で製造することができ、多くのタン
パクの場合、処理系のスペクトルをもたらす。
真核生物の双方の系で製造することができ、多くのタン
パクの場合、処理系のスペクトルをもたらす。
【００７４】最もふつうに使用される原核生物系はイー
コリ（大腸菌）であるが、他の系たとえばビー スブ
チリスおよびシュードモナスもまた有用であると予期さ
れる。原核生物系の好適な調節配列としてＩａｃプロー
モーター、ｔｒｐプローモーター、ハイブリッドプロモ
ーターたとえばｔａｃプロモーター、ラムダ・ファージ
ＰＬプロモーター、を包含する構成および誘導の双方の
プロモーターがあげられる。一般に、異種タンパクは融
合または成熟のいずれかのタンパクとしてこれらの宿主
中で産生することができる。所望の配列が成熟タンパク
として産生されるとき、産生された配列は必ずしも効果
的に除去されないメチオニンにより先行され得る。従っ
て、ここに要求されるペプチドおよびタンパクはバクテ
リアで産生されるときはＮ末端メチオニンにより先行さ
れ得る。その上、構造は、ペプチドの暗号配列がタンパ
クの分泌をもたらす作動シグナルペプチドにより先行さ
せる構成が作製される。原核生物宿主にこのようにして
産生されるときは、シグナル配列は分泌の際に除去され
る。
コリ（大腸菌）であるが、他の系たとえばビー スブ
チリスおよびシュードモナスもまた有用であると予期さ
れる。原核生物系の好適な調節配列としてＩａｃプロー
モーター、ｔｒｐプローモーター、ハイブリッドプロモ
ーターたとえばｔａｃプロモーター、ラムダ・ファージ
ＰＬプロモーター、を包含する構成および誘導の双方の
プロモーターがあげられる。一般に、異種タンパクは融
合または成熟のいずれかのタンパクとしてこれらの宿主
中で産生することができる。所望の配列が成熟タンパク
として産生されるとき、産生された配列は必ずしも効果
的に除去されないメチオニンにより先行され得る。従っ
て、ここに要求されるペプチドおよびタンパクはバクテ
リアで産生されるときはＮ末端メチオニンにより先行さ
れ得る。その上、構造は、ペプチドの暗号配列がタンパ
クの分泌をもたらす作動シグナルペプチドにより先行さ
せる構成が作製される。原核生物宿主にこのようにして
産生されるときは、シグナル配列は分泌の際に除去され
る。
【００７５】広範囲の種類の真核生物の宿主が組換え異
種タンパクの産生のために今や利用しうる。バクテリア
における如く、真核生物の宿主は所望のタンパクを直接
に産生する発現機構で形質転換させることができるが、
もっとふつうにはタンパクの分泌を達成するためにシグ
ナル配列が提供される。真核生物系は高級有機体のタン
パクをコードするゲノム配列中に起こりうるイントロン
を処理しうるという追加の利点をもつ。真核生物系はま
た、たとえば若干のアミノ酸残基のグリコシル化、酸化
または誘導体化、配座制御などをもたらす種々の処理機
構を提供する。
種タンパクの産生のために今や利用しうる。バクテリア
における如く、真核生物の宿主は所望のタンパクを直接
に産生する発現機構で形質転換させることができるが、
もっとふつうにはタンパクの分泌を達成するためにシグ
ナル配列が提供される。真核生物系は高級有機体のタン
パクをコードするゲノム配列中に起こりうるイントロン
を処理しうるという追加の利点をもつ。真核生物系はま
た、たとえば若干のアミノ酸残基のグリコシル化、酸化
または誘導体化、配座制御などをもたらす種々の処理機
構を提供する。
【００７６】ふつうに使用される真核生物系として、イ
ースト、昆虫細胞、哺乳動物細胞、鳥類細胞、および高
級植物細胞があげられる。このリストは全てではない。
これらの宿主系のそれぞれにおいて使用するのに適合し
且つ操作可能な好適なプロモーターが利用し得ると同時
に終止配列およびエンハンサー、たとえばバキュロウイ
ルスポリヘドリン・プロモーターとして、利用しうる。
前述の如く、プロモーターは構成性または誘導性のいず
れかであり得る。たとえば哺乳動物系において、ＭＴＩ
Ｉプロモーターは重金属イオンの添加によって誘発され
うる。
ースト、昆虫細胞、哺乳動物細胞、鳥類細胞、および高
級植物細胞があげられる。このリストは全てではない。
これらの宿主系のそれぞれにおいて使用するのに適合し
且つ操作可能な好適なプロモーターが利用し得ると同時
に終止配列およびエンハンサー、たとえばバキュロウイ
ルスポリヘドリン・プロモーターとして、利用しうる。
前述の如く、プロモーターは構成性または誘導性のいず
れかであり得る。たとえば哺乳動物系において、ＭＴＩ
Ｉプロモーターは重金属イオンの添加によって誘発され
うる。
【００７７】所望の宿主に好適な発現機構の構造の特徴
は当業者に知られている。タンパクの組換え産生につい
ては、そのタンパクをコードするＤＮＡはえらばれた発
現に好適に結合され、この系は次いで適合する宿主中に
形質転換され、次いで外来遺伝子の発現が起こる条件下
で培養され保持される。このようにして産生された本発
明の殺虫に有効な成分は、細胞を分解することによっ
て、又は適当な且つ当業者に周知の培地からの分離によ
って、その培養物から回収される。
は当業者に知られている。タンパクの組換え産生につい
ては、そのタンパクをコードするＤＮＡはえらばれた発
現に好適に結合され、この系は次いで適合する宿主中に
形質転換され、次いで外来遺伝子の発現が起こる条件下
で培養され保持される。このようにして産生された本発
明の殺虫に有効な成分は、細胞を分解することによっ
て、又は適当な且つ当業者に周知の培地からの分離によ
って、その培養物から回収される。
【００７８】主となるアミノ酸配列のわずかな変異は、
ここに例示したペプチドに比べて実質的に均等または増
大した活性をもつタンパクをもたらしうるということが
理解される。これらの変異は部位制御・突然変異誘発に
よるものと考えることができるし、あるいは本発明のペ
プチドを産生する宿主の突然変異による如き偶発的なも
のと考えることができる。これらの全ての変異が殺虫活
性が保持される限り包含される。タンパクの突然変異は
コードするＤＮＡのヌクレオチド配列の変化に基づき
（ふつうに発生する又は特別に記載したタンパクに対し
て）その一次構造を変える。これらの突然変異として特
にアレリック変異型があげられる。タンパクの一次構造
の突然変異的変化は欠失付加または置換に帰因する。
「欠失」は１つ以上の内部アミノ酸残基が不在であるポ
リペプチドと定義される。「付加」とは野生型に比べて
１つ以上の付加的な内部アミノ酸残基をもつペプチドと
定義される。「置換」は１つ以上のアミノ酸残基が他の
残基によって置換されることから生ずる。タンパク「断
片（フラグメント）」はポリペプチドが関係するタンパ
クの一次アミノ酸配列の一部分と等しい一次アミノ酸配
列から成るポリペプチドである。
ここに例示したペプチドに比べて実質的に均等または増
大した活性をもつタンパクをもたらしうるということが
理解される。これらの変異は部位制御・突然変異誘発に
よるものと考えることができるし、あるいは本発明のペ
プチドを産生する宿主の突然変異による如き偶発的なも
のと考えることができる。これらの全ての変異が殺虫活
性が保持される限り包含される。タンパクの突然変異は
コードするＤＮＡのヌクレオチド配列の変化に基づき
（ふつうに発生する又は特別に記載したタンパクに対し
て）その一次構造を変える。これらの突然変異として特
にアレリック変異型があげられる。タンパクの一次構造
の突然変異的変化は欠失付加または置換に帰因する。
「欠失」は１つ以上の内部アミノ酸残基が不在であるポ
リペプチドと定義される。「付加」とは野生型に比べて
１つ以上の付加的な内部アミノ酸残基をもつペプチドと
定義される。「置換」は１つ以上のアミノ酸残基が他の
残基によって置換されることから生ずる。タンパク「断
片（フラグメント）」はポリペプチドが関係するタンパ
クの一次アミノ酸配列の一部分と等しい一次アミノ酸配
列から成るポリペプチドである。
【００７９】好ましい「置換」は保存性のもの、すなわ
ち１つの残基が同じ一般型の別一つの置換基によって置
換されているものである。よく理解されるように、天然
アミノ酸は酸性、塩基性、中性および極性、または中性
および非極性および／または芳香族性として下位分類さ
れうる。生来の形態とは異なるコード化ペプチドは置換
されたアミノ酸の基と同一の基に由来するアミノ酸に対
する置換コドンを含有することが一般に好ましい。
ち１つの残基が同じ一般型の別一つの置換基によって置
換されているものである。よく理解されるように、天然
アミノ酸は酸性、塩基性、中性および極性、または中性
および非極性および／または芳香族性として下位分類さ
れうる。生来の形態とは異なるコード化ペプチドは置換
されたアミノ酸の基と同一の基に由来するアミノ酸に対
する置換コドンを含有することが一般に好ましい。
【００８０】従って一般に、塩基性アミノ酸Ｌｙｓ，Ａ
ｒｇ，およびＨｉｓは交換可能であり；酸性アミノ酸Ａ
ｓｐおよびＧｌｕは交換可能であり；中性極性アミノ酸
Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ｃｙｓ，Ｇｌｎ，およびＡｓｎは交換
可能であり；非極性脂肪族酸Ｇｌｙ，Ａｌａ，Ｖａｌ，
Ｉｌｅ，およびＬｅｕは相互に保存性であり（ただし寸
法のためにＧｌｙおよびＡｌａはより密接に関連があ
り、そしてＶａｌ，ＩｌｅおよびＬｅｕはより密接に関
連がある）；そして芳香族アミノ酸Ｐｈｅ，Ｔｒｐ，お
よびＴｙｒは交換可能である。
ｒｇ，およびＨｉｓは交換可能であり；酸性アミノ酸Ａ
ｓｐおよびＧｌｕは交換可能であり；中性極性アミノ酸
Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ｃｙｓ，Ｇｌｎ，およびＡｓｎは交換
可能であり；非極性脂肪族酸Ｇｌｙ，Ａｌａ，Ｖａｌ，
Ｉｌｅ，およびＬｅｕは相互に保存性であり（ただし寸
法のためにＧｌｙおよびＡｌａはより密接に関連があ
り、そしてＶａｌ，ＩｌｅおよびＬｅｕはより密接に関
連がある）；そして芳香族アミノ酸Ｐｈｅ，Ｔｒｐ，お
よびＴｙｒは交換可能である。
【００８１】Ｐｒｏは非極性中性アミノ酸であるけれど
も、それは立体配座におけるその影響のゆえに、難点を
表す。同一の又は類似の立体配座の結果がえられ得ると
きを除いてＰｒｏによる又はＰｒｏに代わる置換は好ま
しくない。保存性の変化を表す極性アミノ酸としてＳｅ
ｒ，Ｔｈｒ，Ｇｌｎ，Ａｓｎがあげられそしてより小さ
い程度にＭｅｔがあげられる。さらに、異なったカテゴ
リーに分類されているけれども、Ａｌａ，Ｇｌｙおよび
Ｓｅｒは交換可能であると思われ、そしてＣｙｓは付加
的にこのグループに適合するか、または極性中性アミノ
酸に分類することができる。異なったクラスからのアミ
ノ酸に対するコドンによる置換も有用であるかもしれな
い。
も、それは立体配座におけるその影響のゆえに、難点を
表す。同一の又は類似の立体配座の結果がえられ得ると
きを除いてＰｒｏによる又はＰｒｏに代わる置換は好ま
しくない。保存性の変化を表す極性アミノ酸としてＳｅ
ｒ，Ｔｈｒ，Ｇｌｎ，Ａｓｎがあげられそしてより小さ
い程度にＭｅｔがあげられる。さらに、異なったカテゴ
リーに分類されているけれども、Ａｌａ，Ｇｌｙおよび
Ｓｅｒは交換可能であると思われ、そしてＣｙｓは付加
的にこのグループに適合するか、または極性中性アミノ
酸に分類することができる。異なったクラスからのアミ
ノ酸に対するコドンによる置換も有用であるかもしれな
い。
【００８２】本発明のタンパクのための組換え材料が提
供される故に、これらのタンパクは組換え技術によっ
て、ならびに自動化アミノ酸合成器によって製造するこ
とができる。種々の宿主細胞によって与えられる翻訳後
の特性の変化の故に、天然産タンパクに対して種々の修
飾が得られる。タンパクのグリコシル化、アミド化また
はリピド化パターン、あるいはタンパクの一次，二次ま
たは三次構造を変化させる翻訳後の事柄の結果として、
「修飾（ｍｏｄｉｔｉｅｄ）」タンパクは未修飾タンパ
クとは異なるが、もちろん権利として請求する本発明の
範囲内に含まれる。
供される故に、これらのタンパクは組換え技術によっ
て、ならびに自動化アミノ酸合成器によって製造するこ
とができる。種々の宿主細胞によって与えられる翻訳後
の特性の変化の故に、天然産タンパクに対して種々の修
飾が得られる。タンパクのグリコシル化、アミド化また
はリピド化パターン、あるいはタンパクの一次，二次ま
たは三次構造を変化させる翻訳後の事柄の結果として、
「修飾（ｍｏｄｉｔｉｅｄ）」タンパクは未修飾タンパ
クとは異なるが、もちろん権利として請求する本発明の
範囲内に含まれる。
【００８３】ここに述べるタンパク、たとえば配列番号
１、が合成的に作られる場合、遺伝子によってコードさ
れないアミノ酸による置換もなしうる、ということが更
に注意されるべきである。別法の残基の例としてたとえ
ば式Ｈ2 Ｎ（ＣＨ2 ）n ＣＯＯＨ（ｎは２〜６である）
のωアミノ酸があげられる。これらは中性、非極性のア
ミノ酸たとえばザルコシン（Ｓａｒ）、ｔ−ブチルアラ
ニン（ｔ−ＢｕＡｌａ）、ｔ−ブチルグリシン（ｔ−Ｂ
ｕＧｌｙ）、Ｎ−メチルイソロイシン（Ｎ−Ｍｅｌｌ
ｅ）、およびノルロイシン（Ｎｌｅｕ）があげられる。
たとえばフェニルグリシンは芳香族中性アミノ酸Ｔｒ
ｐ，ＴｙｒまたはＰｈｅの代わりになることができ、シ
トルリン（Ｃｉｔ）およびメチオニン・スルホキサイド
（ＭＳＯ）は極性であるが中性であり、シクロヘキシル
アラニン（Ｃｈａ）は中性であって非極性であり、シス
テイン酸（Ｃｙａ）は酸性であり、そしてオルニチン
（Ｏｒｎ）は塩基性である。プロリンの立体配置一致性
は、これらの１つ以上がヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）
によって置換されるときにえられる。
１、が合成的に作られる場合、遺伝子によってコードさ
れないアミノ酸による置換もなしうる、ということが更
に注意されるべきである。別法の残基の例としてたとえ
ば式Ｈ2 Ｎ（ＣＨ2 ）n ＣＯＯＨ（ｎは２〜６である）
のωアミノ酸があげられる。これらは中性、非極性のア
ミノ酸たとえばザルコシン（Ｓａｒ）、ｔ−ブチルアラ
ニン（ｔ−ＢｕＡｌａ）、ｔ−ブチルグリシン（ｔ−Ｂ
ｕＧｌｙ）、Ｎ−メチルイソロイシン（Ｎ−Ｍｅｌｌ
ｅ）、およびノルロイシン（Ｎｌｅｕ）があげられる。
たとえばフェニルグリシンは芳香族中性アミノ酸Ｔｒ
ｐ，ＴｙｒまたはＰｈｅの代わりになることができ、シ
トルリン（Ｃｉｔ）およびメチオニン・スルホキサイド
（ＭＳＯ）は極性であるが中性であり、シクロヘキシル
アラニン（Ｃｈａ）は中性であって非極性であり、シス
テイン酸（Ｃｙａ）は酸性であり、そしてオルニチン
（Ｏｒｎ）は塩基性である。プロリンの立体配置一致性
は、これらの１つ以上がヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）
によって置換されるときにえられる。
【００８４】Ｆ．形質転換（トランスジェニック）植物 更に本発明によれば、ディグエチアくも毒液から実質的
に単離しうる殺虫に有効なペプチドをコードするＤＮＡ
配列を、そのＤＮＡ配列の発現が有性増殖または無性増
殖を介して植物の次世代にうけつがれるように、植物の
生殖細胞系列に導入して含む形質転換植物が提供され
る。
に単離しうる殺虫に有効なペプチドをコードするＤＮＡ
配列を、そのＤＮＡ配列の発現が有性増殖または無性増
殖を介して植物の次世代にうけつがれるように、植物の
生殖細胞系列に導入して含む形質転換植物が提供され
る。
【００８５】本発明により殺虫に有効なペプチドをコー
ドする遺伝子は遺伝工学技術によって植物に導入するこ
とができる。この技術により植物細胞中のペプチドの産
生は昆虫害虫を制御する手段として有用であることが予
期される。それ故、天然種よりもより大きい昆虫耐性の
植物を作ることが可能である。
ドする遺伝子は遺伝工学技術によって植物に導入するこ
とができる。この技術により植物細胞中のペプチドの産
生は昆虫害虫を制御する手段として有用であることが予
期される。それ故、天然種よりもより大きい昆虫耐性の
植物を作ることが可能である。
【００８６】植物を形質転換させるために使用しうる殺
虫に有効なペプチド遺伝子に対するコード領域は遺伝子
の全長または部分的に活性の長さでありうる。然しなが
ら、ペプチドをコードする遺伝子配列を発現させ、生成
した植物細胞中で機能的ペプチドとして産生させること
が必要である。殺虫に有効なペプチドをコードするゲノ
ムＤＮＡとｃＤＮＡおよび合成ＤＮＡの双方を使用して
形質転換することができる。更に、遺伝子はｃＤＮＡク
ローンから部分的に、ゲノム・クローンから部分的に、
および合成遺伝子およびそれらの種々の組合せから部分
的に構成されうる。また、ペプチド遺伝子をコードする
ＤＮＡはその単離されたペプチド資源以外の種々の種か
らの部分を含むことができる。その上、殺虫に有効なペ
プチドは別の化合物（単数または複数）と組み合わせる
ことができ、キメラ遺伝子を含みそしてこの化合物を発
現する形質転換された植物中に予想外の殺虫特性を生ぜ
しめるがと信ぜられる。これらの他種化合物として、た
とえば昆虫に対して経口毒性を持つプロテアーゼ阻害剤
またはバシラス・ツリンジエンシス由来のポリペプチド
があげられる。バシラス・ツリンジエンシス蛋白は昆虫
の腸細胞膜のカリウム透過性の変化を生ぜしめ、そして
膜中に小孔を発生させる。他の孔形成性タンパクを殺虫
に有効なペプチドと組み合わせて使用することもでき
る。このような孔形成性タンパクの例はマガイニン、セ
クロピン、アタシン、メイイチン、グラミシジンＳ、ナ
トリウム・チャンネル・タンパク、および合成断片、ス
タフイロコッカス アウレウスのα−トキシン、アポリ
ポプロテインおよびそれらの断片、アラメチシンおよび
種々の合成アンフイパシック・ペプチドである。細胞膜
に結合してエンドサイト−シスを増強させるレクチンは
別の種類のタンパクであり、このタンパクは本発明の殺
虫に有効なペプチドと組合せて使用でき植物を遺伝的に
昆虫耐性に改変する。
虫に有効なペプチド遺伝子に対するコード領域は遺伝子
の全長または部分的に活性の長さでありうる。然しなが
ら、ペプチドをコードする遺伝子配列を発現させ、生成
した植物細胞中で機能的ペプチドとして産生させること
が必要である。殺虫に有効なペプチドをコードするゲノ
ムＤＮＡとｃＤＮＡおよび合成ＤＮＡの双方を使用して
形質転換することができる。更に、遺伝子はｃＤＮＡク
ローンから部分的に、ゲノム・クローンから部分的に、
および合成遺伝子およびそれらの種々の組合せから部分
的に構成されうる。また、ペプチド遺伝子をコードする
ＤＮＡはその単離されたペプチド資源以外の種々の種か
らの部分を含むことができる。その上、殺虫に有効なペ
プチドは別の化合物（単数または複数）と組み合わせる
ことができ、キメラ遺伝子を含みそしてこの化合物を発
現する形質転換された植物中に予想外の殺虫特性を生ぜ
しめるがと信ぜられる。これらの他種化合物として、た
とえば昆虫に対して経口毒性を持つプロテアーゼ阻害剤
またはバシラス・ツリンジエンシス由来のポリペプチド
があげられる。バシラス・ツリンジエンシス蛋白は昆虫
の腸細胞膜のカリウム透過性の変化を生ぜしめ、そして
膜中に小孔を発生させる。他の孔形成性タンパクを殺虫
に有効なペプチドと組み合わせて使用することもでき
る。このような孔形成性タンパクの例はマガイニン、セ
クロピン、アタシン、メイイチン、グラミシジンＳ、ナ
トリウム・チャンネル・タンパク、および合成断片、ス
タフイロコッカス アウレウスのα−トキシン、アポリ
ポプロテインおよびそれらの断片、アラメチシンおよび
種々の合成アンフイパシック・ペプチドである。細胞膜
に結合してエンドサイト−シスを増強させるレクチンは
別の種類のタンパクであり、このタンパクは本発明の殺
虫に有効なペプチドと組合せて使用でき植物を遺伝的に
昆虫耐性に改変する。
【００８７】ペプチド遺伝子のプロモーターはキメラ遺
伝子配列を発現させるのに有用であると期待されるが、
他のプロモーターも有用であることが期待される。有用
である有効な植物プロモーターは超産生性プロモーター
である。このペプチドの遺伝子配列と操作可能に結合し
ているこのプロモーターは、形質転換植物が害虫に対し
て耐性を増大するように、ペプチドの発現を促進するこ
とができるものであるべきである。本発明に有用である
と予想される超産生性植物プロモーターは周知である。
プロモーターに操作可能に結合する殺虫に有効なペプチ
ド遺伝子を含むキメラ遺伝子配列は所望の植物を形質転
換させるために適切なクローニング・ベクター中に結合
させることができる。一般に、宿主細胞に適合しうる種
から誘導される複製および調節配列を含むプラスミドま
たはウイルス（バクテリオファージ）ベクターが使用さ
れる。クローニング・ベクターは典型的には複製源を持
つと同時に形質転換された宿主細胞中に表現型選択マー
カー、代表的には抗生物質に対する耐性を提供しうる特
異的遺伝子を持つであろう。形質転換用ベクターは宿主
細胞中での形質転換後にこれらの表現型マーカーによっ
て選択され得る。
伝子配列を発現させるのに有用であると期待されるが、
他のプロモーターも有用であることが期待される。有用
である有効な植物プロモーターは超産生性プロモーター
である。このペプチドの遺伝子配列と操作可能に結合し
ているこのプロモーターは、形質転換植物が害虫に対し
て耐性を増大するように、ペプチドの発現を促進するこ
とができるものであるべきである。本発明に有用である
と予想される超産生性植物プロモーターは周知である。
プロモーターに操作可能に結合する殺虫に有効なペプチ
ド遺伝子を含むキメラ遺伝子配列は所望の植物を形質転
換させるために適切なクローニング・ベクター中に結合
させることができる。一般に、宿主細胞に適合しうる種
から誘導される複製および調節配列を含むプラスミドま
たはウイルス（バクテリオファージ）ベクターが使用さ
れる。クローニング・ベクターは典型的には複製源を持
つと同時に形質転換された宿主細胞中に表現型選択マー
カー、代表的には抗生物質に対する耐性を提供しうる特
異的遺伝子を持つであろう。形質転換用ベクターは宿主
細胞中での形質転換後にこれらの表現型マーカーによっ
て選択され得る。
【００８８】有用であると予期される宿主細胞として細
菌宿主たとえばイー・コリ、サラルモネラ リフイムリ
ウム（ｒｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、およびセラチア マ
ルセスセンス（ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）；および真核生
物の宿主たとえばイーストまたはフイラメンタス ファ
ンジ（ｆｕｎｇｉ）があげられる。
菌宿主たとえばイー・コリ、サラルモネラ リフイムリ
ウム（ｒｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、およびセラチア マ
ルセスセンス（ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）；および真核生
物の宿主たとえばイーストまたはフイラメンタス ファ
ンジ（ｆｕｎｇｉ）があげられる。
【００８９】クローニング・ベクターおよび該ベクター
で形質転換された宿主細胞は一般に、ベクターのコピー
数を増幅させるために使用される。増幅したコピー数を
用いて、ペプチド遺伝子を含むベクターを単離すること
ができ、そしてたとえば、ここに記述した遺伝子配列を
植物または他の宿主細胞に導入するために使用される。
で形質転換された宿主細胞は一般に、ベクターのコピー
数を増幅させるために使用される。増幅したコピー数を
用いて、ペプチド遺伝子を含むベクターを単離すること
ができ、そしてたとえば、ここに記述した遺伝子配列を
植物または他の宿主細胞に導入するために使用される。
【００９０】外来遺伝子を発現する植物の製造法は知ら
れている。たとえば、植物組織をエイ ツメファシエン
ス（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）により植物，植物組
織または細胞の直接感染または共培養；外因性ＤＮＡの
プロトプラスト（原形質体）への直接の遺伝子転移；Ｐ
ＥＧの接種；顕微注射およびマイクロプロジエクタイル
・ボンバードメント；によって形質転換させることがで
きる。
れている。たとえば、植物組織をエイ ツメファシエン
ス（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）により植物，植物組
織または細胞の直接感染または共培養；外因性ＤＮＡの
プロトプラスト（原形質体）への直接の遺伝子転移；Ｐ
ＥＧの接種；顕微注射およびマイクロプロジエクタイル
・ボンバードメント；によって形質転換させることがで
きる。
【００９１】電気穿孔法（エレクトロポレーション）に
よるタバコの形質転換はＡｇ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｙ Ｎｅｗｓ，Ｖｏｌ．７，ｐ，３および１７（１９
９０年９月／１０月号）に記載の技術によって確立され
た。この技術において、植物のプロトプラスト（原形質
体）は殺虫に有効なペプチド遺伝子構造を含むプラスミ
ドの存在下で電気穿孔される。高いフィールド強度の電
気インパルスは生体膜を透過性にしてプラスミドの導入
を可能にする。電気穿孔された植物のプロトプラストは
細胞壁を再構築し、分化して植物カルスを生成する。発
現した殺虫に有効なペプチドを持つ形質転換植物細胞の
選択は上記の表現型マーカーを使用して達成される。外
因性ＤＮＡは任意の形態で、たとえば裸の線状、環状ま
たは高次コイル型のＤＮＡ、リポソームに包まれたＤＮ
Ａ、スフェロプラスト中のＤＮＡ、他の植物プロトプラ
スト中のＤＮＡ、塩で複合化されたＤＮＡ及びその他の
形態で、プロトプラストに加えることができる。
よるタバコの形質転換はＡｇ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｙ Ｎｅｗｓ，Ｖｏｌ．７，ｐ，３および１７（１９
９０年９月／１０月号）に記載の技術によって確立され
た。この技術において、植物のプロトプラスト（原形質
体）は殺虫に有効なペプチド遺伝子構造を含むプラスミ
ドの存在下で電気穿孔される。高いフィールド強度の電
気インパルスは生体膜を透過性にしてプラスミドの導入
を可能にする。電気穿孔された植物のプロトプラストは
細胞壁を再構築し、分化して植物カルスを生成する。発
現した殺虫に有効なペプチドを持つ形質転換植物細胞の
選択は上記の表現型マーカーを使用して達成される。外
因性ＤＮＡは任意の形態で、たとえば裸の線状、環状ま
たは高次コイル型のＤＮＡ、リポソームに包まれたＤＮ
Ａ、スフェロプラスト中のＤＮＡ、他の植物プロトプラ
スト中のＤＮＡ、塩で複合化されたＤＮＡ及びその他の
形態で、プロトプラストに加えることができる。
【００９２】アグロバクテリウムによって形質転換させ
うるすべての植物細胞、および形質転換細胞から再生さ
れた全植物も本発明により形質転換させて、形質転換し
た殺虫に有効なペプチド遺伝子を含む形質転換した全植
物を産生することもできる。コメの形質転換はデイ・エ
ム・ライネリ（Ｄ．Ｍ．Ｒａｉｎｅｒｉ）らの“Ａｇｒ
ｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓ
ｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆ ｒｉｃｅ（Ｏｒｙｚａ ｓａ
ｔｉｖａ ｌ．）”，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖ
ｏｌ．８，ｐｐ３３−３８（１９９０年１月）によって
確立された。
うるすべての植物細胞、および形質転換細胞から再生さ
れた全植物も本発明により形質転換させて、形質転換し
た殺虫に有効なペプチド遺伝子を含む形質転換した全植
物を産生することもできる。コメの形質転換はデイ・エ
ム・ライネリ（Ｄ．Ｍ．Ｒａｉｎｅｒｉ）らの“Ａｇｒ
ｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓ
ｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆ ｒｉｃｅ（Ｏｒｙｚａ ｓａ
ｔｉｖａ ｌ．）”，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖ
ｏｌ．８，ｐｐ３３−３８（１９９０年１月）によって
確立された。
【００９３】殺菌に有効なペプチド遺伝子を植物細胞に
導入する別の方法は植物細胞を、殺虫に有効なペプチド
遺伝子で形質転換させたエイ．ツメファシエンスで感染
させることである。当業技術において知られている適当
な条件下に、形質転換植物細胞を生育して発芽、根を生
成させ、更に形質転換植物に成長させることである。殺
虫に有効なペプチド遺伝配列は適当な植物細胞に、たと
えばエイ．ツメファシエンスのＴｉプラスミドによっ
て、導入することができる。Ｔｉプラスミドはエイ．ツ
メファシエンスによる感染の際に植物細胞に伝達され、
植物ゲノムに安定して一体化される。
導入する別の方法は植物細胞を、殺虫に有効なペプチド
遺伝子で形質転換させたエイ．ツメファシエンスで感染
させることである。当業技術において知られている適当
な条件下に、形質転換植物細胞を生育して発芽、根を生
成させ、更に形質転換植物に成長させることである。殺
虫に有効なペプチド遺伝配列は適当な植物細胞に、たと
えばエイ．ツメファシエンスのＴｉプラスミドによっ
て、導入することができる。Ｔｉプラスミドはエイ．ツ
メファシエンスによる感染の際に植物細胞に伝達され、
植物ゲノムに安定して一体化される。
【００９４】Ｔｉプラスミドは形質転換細胞の産生に不
可欠と信じられている２つの領域を含む。これらの１つ
はトランスファーＤＮＡ（Ｔ ＤＮＡ）と呼ばれ、腫瘍
の形成を誘起する。他方は毒性領域と呼ばれ、腫瘍の形
成に必須であるがその維持には必須でない。植物ゲノム
に転移するＴＤＮＡ領域は、その転移能力が影響をされ
ることなしに、酸素の遺伝子配列の挿入によって大きさ
を増大させることができる。腫瘍発生遺伝子を除いて、
それらがもはや妨害しないようにすることによって、改
良Ｔｉプラスミドを次いで本発明の遺伝子構造を適当な
植物細胞に転移するためのベクターとして使用すること
ができる。
可欠と信じられている２つの領域を含む。これらの１つ
はトランスファーＤＮＡ（Ｔ ＤＮＡ）と呼ばれ、腫瘍
の形成を誘起する。他方は毒性領域と呼ばれ、腫瘍の形
成に必須であるがその維持には必須でない。植物ゲノム
に転移するＴＤＮＡ領域は、その転移能力が影響をされ
ることなしに、酸素の遺伝子配列の挿入によって大きさ
を増大させることができる。腫瘍発生遺伝子を除いて、
それらがもはや妨害しないようにすることによって、改
良Ｔｉプラスミドを次いで本発明の遺伝子構造を適当な
植物細胞に転移するためのベクターとして使用すること
ができる。
【００９５】遺伝子物質はまた、ポリエチレングリコー
ル（ＰＥＧ）を使用することによって植物細胞に転移す
ることができる。ＰＥＧは細胞によって取り込まれる遺
伝子物質と沈殿複合体を形成する。植物細胞へのＤＮＡ
の転移はまた、単離プロトプラスト、培養細胞および組
織への注入および若木および植物の分裂組織への注入に
よって達成されうる。形質転換植物およびそれからの後
代は当該技術に知られる常法によってえられる。
ル（ＰＥＧ）を使用することによって植物細胞に転移す
ることができる。ＰＥＧは細胞によって取り込まれる遺
伝子物質と沈殿複合体を形成する。植物細胞へのＤＮＡ
の転移はまた、単離プロトプラスト、培養細胞および組
織への注入および若木および植物の分裂組織への注入に
よって達成されうる。形質転換植物およびそれからの後
代は当該技術に知られる常法によってえられる。
【００９６】外来ＤＮＡ配列を植物細胞に導入する別の
方法は、粒子にＤＮＡを付着させ、これを「遺伝子銃」
と呼ばれるシューティング装置によって植物細胞に押し
込むことから成る。すべての植物組織または植物器官を
この方法の標的として使用することができ、例として生
体内および試験管内の胚、先端組織および他の分裂組
織、つぼみ体組織および生殖組織があげられるが、これ
らに限定されない。形質転換細胞およびカルスは次の確
立された方法によって選択される。目的とする組織を体
細胞胚または再生シュートを形成するために誘発し、当
該技術で知られる確立された方法により形質転換植物を
与える。適当な方法は使用される植物種に従ってえらば
れる。形質転換とうもろこし植物は高速マイクロプロジ
ェクタイルを使用して遺伝子を胚形成細胞に転移するこ
とによって製造された。“Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ ａ
ｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｃｈｉｍｅｒｉｃ
ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｏｇｅｎｙ ｏｆ
ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍａｉｚｅｐｌａｎｔｓ”，Ｂ
ｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．８，ｐｐ８３３−
８３８（１９９０年９月）参照。
方法は、粒子にＤＮＡを付着させ、これを「遺伝子銃」
と呼ばれるシューティング装置によって植物細胞に押し
込むことから成る。すべての植物組織または植物器官を
この方法の標的として使用することができ、例として生
体内および試験管内の胚、先端組織および他の分裂組
織、つぼみ体組織および生殖組織があげられるが、これ
らに限定されない。形質転換細胞およびカルスは次の確
立された方法によって選択される。目的とする組織を体
細胞胚または再生シュートを形成するために誘発し、当
該技術で知られる確立された方法により形質転換植物を
与える。適当な方法は使用される植物種に従ってえらば
れる。形質転換とうもろこし植物は高速マイクロプロジ
ェクタイルを使用して遺伝子を胚形成細胞に転移するこ
とによって製造された。“Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ ａ
ｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｃｈｉｍｅｒｉｃ
ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｏｇｅｎｙ ｏｆ
ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍａｉｚｅｐｌａｎｔｓ”，Ｂ
ｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．８，ｐｐ８３３−
８３８（１９９０年９月）参照。
【００９７】再生された植物はくみ入れた外来ＤＮＡに
対してキメラでありうる。もし外来ＤＮＡを含む細胞が
小胞子または大胞子のいずれかに発達すると、合成され
た外来ＤＮＡが生殖器官に伝達される。もし外来ＤＮＡ
を含む細胞が植物の体細胞であるとキメラでない形質転
換植物は芽または茎の切断から生体内でまたは試験管内
で当該技術に知られている次の確立された方法で、栄養
（無性）増殖の通常の方法によって産生される。このよ
うな方法は使用する植物種に応じてえらばれる。
対してキメラでありうる。もし外来ＤＮＡを含む細胞が
小胞子または大胞子のいずれかに発達すると、合成され
た外来ＤＮＡが生殖器官に伝達される。もし外来ＤＮＡ
を含む細胞が植物の体細胞であるとキメラでない形質転
換植物は芽または茎の切断から生体内でまたは試験管内
で当該技術に知られている次の確立された方法で、栄養
（無性）増殖の通常の方法によって産生される。このよ
うな方法は使用する植物種に応じてえらばれる。
【００９８】植物細胞または植物の形質転換後に、ペプ
チドが発現されるように形質転換されたこれらの植物細
胞または植物は、適当な表現型マーカーによって選択さ
れる。これらの表現型マーカーとして、抗生物質耐性体
があげられるが、これに限定されない。その他の表現型
マーカーも当該技術で知られており、本発明に使用する
ことができる。種々の異なった形質転換系により、すべ
ての植物タイプを原則として、それらが本発明の殺虫に
有効なペプチドを発現するように、形質転換させること
ができる。
チドが発現されるように形質転換されたこれらの植物細
胞または植物は、適当な表現型マーカーによって選択さ
れる。これらの表現型マーカーとして、抗生物質耐性体
があげられるが、これに限定されない。その他の表現型
マーカーも当該技術で知られており、本発明に使用する
ことができる。種々の異なった形質転換系により、すべ
ての植物タイプを原則として、それらが本発明の殺虫に
有効なペプチドを発現するように、形質転換させること
ができる。
【００９９】実際にすべての植物が培養細胞または組織
から再生されうることを示す証拠が増大している。これ
らの例としてすべての主要な穀物、さとうきび、てんさ
い、綿、フルーツおよびその他の樹木、マメ類および野
菜があげられるが、これらに限定されない。これらの植
物のすべてがアグロバクテリウムによって形質転換しう
るか否かについての知識は現在のところ限られている。
アグロバクテリウムのための天然植物宿主である種は試
験管内で形質転換しうる単子葉（モノコチレンドナス）
植物、とくに穀類および草はアグロバクテリウムに対し
て天然宿主ではない。アグロバクテリウムを使用してそ
れらを形質転換させる試みは現在まで不成功であった。
ある種の単子葉植物をアグロバクテリウムによって形質
転換することができるとい証拠が今や増加しつつある。
今や入手可能になった新規な実験方法を使用して、穀類
および草の種も形質転換させることができる。
から再生されうることを示す証拠が増大している。これ
らの例としてすべての主要な穀物、さとうきび、てんさ
い、綿、フルーツおよびその他の樹木、マメ類および野
菜があげられるが、これらに限定されない。これらの植
物のすべてがアグロバクテリウムによって形質転換しう
るか否かについての知識は現在のところ限られている。
アグロバクテリウムのための天然植物宿主である種は試
験管内で形質転換しうる単子葉（モノコチレンドナス）
植物、とくに穀類および草はアグロバクテリウムに対し
て天然宿主ではない。アグロバクテリウムを使用してそ
れらを形質転換させる試みは現在まで不成功であった。
ある種の単子葉植物をアグロバクテリウムによって形質
転換することができるとい証拠が今や増加しつつある。
今や入手可能になった新規な実験方法を使用して、穀類
および草の種も形質転換させることができる。
【０１００】アグロバクテリウムによって形質転換され
得るさらなる植物種としてはイポモエア（Ｉｐｏｍｏｅ
ａ），パシフロラ（Ｐａｓｓｉｆｌｏｒａ，シクラメン
（Ｃｙｃｌａｍｅｎ），マラス（Ｍａｌｕｓ），プルラ
ス（Ｐｒｕｎｕｓ），ローザ（Ｒｏｓａ），ルバス（Ｒ
ｕｂｕｓ），ポプラス（Ｐｏｐｕｌｕｓ），サンタリオ
ン（Ｓａｎｔａｌｉｏｎ），アリウム（Ａｌｌｉｕ
ｍ），リリウム（Ｌｉｌｉｕｍ），ナジサス（Ｎａｃｉ
ｓｓｕｓ），アナナス（Ａｎａｎａｓ），アラチス（Ａ
ｒａｃｈｉｓ），ファゼオラス（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ）
およびピサム（Ｐｉｓｕｍ）があげられる。再生は植物
の種から種に変化するが、一般に殺虫に有効なペプチド
遺伝子の多重コピーを含む形質転換プロトプラストの懸
濁液がまず最初に提供される。次いで胚形成がプロトプ
ラスト懸濁液からの天然の胚のような成熟と発芽の段階
にまで誘発される。培地は一般に種々のアミノ酸とホル
モンを含む。シュートとルーツ（根）はふつう同時に発
生する。効率的な再生は培地、遺伝子型および培養の由
来に依存する。これら３つの可変因子が制御されるなら
ば、再生は十分に再現性があり反復可能である。
得るさらなる植物種としてはイポモエア（Ｉｐｏｍｏｅ
ａ），パシフロラ（Ｐａｓｓｉｆｌｏｒａ，シクラメン
（Ｃｙｃｌａｍｅｎ），マラス（Ｍａｌｕｓ），プルラ
ス（Ｐｒｕｎｕｓ），ローザ（Ｒｏｓａ），ルバス（Ｒ
ｕｂｕｓ），ポプラス（Ｐｏｐｕｌｕｓ），サンタリオ
ン（Ｓａｎｔａｌｉｏｎ），アリウム（Ａｌｌｉｕ
ｍ），リリウム（Ｌｉｌｉｕｍ），ナジサス（Ｎａｃｉ
ｓｓｕｓ），アナナス（Ａｎａｎａｓ），アラチス（Ａ
ｒａｃｈｉｓ），ファゼオラス（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ）
およびピサム（Ｐｉｓｕｍ）があげられる。再生は植物
の種から種に変化するが、一般に殺虫に有効なペプチド
遺伝子の多重コピーを含む形質転換プロトプラストの懸
濁液がまず最初に提供される。次いで胚形成がプロトプ
ラスト懸濁液からの天然の胚のような成熟と発芽の段階
にまで誘発される。培地は一般に種々のアミノ酸とホル
モンを含む。シュートとルーツ（根）はふつう同時に発
生する。効率的な再生は培地、遺伝子型および培養の由
来に依存する。これら３つの可変因子が制御されるなら
ば、再生は十分に再現性があり反復可能である。
【０１０１】形質転換植物細胞から生育した成熟植物は
自己増殖して同系繁殖植物を生じうる。この同系繁殖植
物は殺虫に有効なペプチドの遺伝子を含む種子を産生す
る。これらの種子は殺虫に有効なペプチドを発現する植
物を産生するように生育し得る。同系繁殖を使用して昆
虫耐性ハイブリッドを開発させることができる。この方
法において、昆虫耐性の同系繁殖系は別の同系繁殖系と
交差してハイブリッドを生じる。
自己増殖して同系繁殖植物を生じうる。この同系繁殖植
物は殺虫に有効なペプチドの遺伝子を含む種子を産生す
る。これらの種子は殺虫に有効なペプチドを発現する植
物を産生するように生育し得る。同系繁殖を使用して昆
虫耐性ハイブリッドを開発させることができる。この方
法において、昆虫耐性の同系繁殖系は別の同系繁殖系と
交差してハイブリッドを生じる。
【０１０２】二倍体植物において、典型的には、一方の
親を殺虫に有効なペプチド（毒素）遺伝子配列によって
形質転換させることができ、他方の親は野生種である。
この両親の交配後、第一世代ハイブリッド（Ｆ1 ）は１
／２毒素／野生種：１／２毒素／野生型の分布を示す。
これらの第一世代ハイブリッド（Ｆ1 ）は自己増殖して
第二世代ハイブリッド（Ｆ2 ）を生ずる。Ｆ2 ハイブリ
ッドの遺伝子分布は１／４毒素／毒素：１／２毒素野生
種：１／４野生種／野生種である。毒素／毒素の遺伝性
質をもつＦ2 ハイブリッドは昆虫耐性植物として選択さ
れる。
親を殺虫に有効なペプチド（毒素）遺伝子配列によって
形質転換させることができ、他方の親は野生種である。
この両親の交配後、第一世代ハイブリッド（Ｆ1 ）は１
／２毒素／野生種：１／２毒素／野生型の分布を示す。
これらの第一世代ハイブリッド（Ｆ1 ）は自己増殖して
第二世代ハイブリッド（Ｆ2 ）を生ずる。Ｆ2 ハイブリ
ッドの遺伝子分布は１／４毒素／毒素：１／２毒素野生
種：１／４野生種／野生種である。毒素／毒素の遺伝性
質をもつＦ2 ハイブリッドは昆虫耐性植物として選択さ
れる。
【０１０３】ここで使用する変異体は安定で且つ遺伝性
であり、そして植物の子孫に有性的に伝達される遺伝性
変異を包含する表現型変化を記述する。ただし変異体は
依然として本発明の殺虫に有効なペプチドを発現する。
また、ここで使用されている如く、突然変異体は、環境
条件の結果として、たとえば放射線により、又はよく知
られている遺伝の法則により形質が減数分裂的に伝達さ
れる遺伝的変異の結果として、の変化を記述する。然し
ながら、突然変異体植物は本発明のペプチドを依然とし
て発現するものでなければならない。
であり、そして植物の子孫に有性的に伝達される遺伝性
変異を包含する表現型変化を記述する。ただし変異体は
依然として本発明の殺虫に有効なペプチドを発現する。
また、ここで使用されている如く、突然変異体は、環境
条件の結果として、たとえば放射線により、又はよく知
られている遺伝の法則により形質が減数分裂的に伝達さ
れる遺伝的変異の結果として、の変化を記述する。然し
ながら、突然変異体植物は本発明のペプチドを依然とし
て発現するものでなければならない。
【０１０４】一般に、形質転換植物中で発現されるよう
に選択される理想的な殺虫に有効なペプチドは非標的の
昆虫および脊椎動物に対するその安全性によって特徴付
けられるものである。発現系は発現水準が殺虫効力を与
えるように選択される。従って、このような農業的に重
要な形質転換植物を得るこの技術的容易性が、環境に責
任のある方法で作物への昆虫の損害を減少させるための
完全な害虫管理法に使用する付加的武器を農家に与える
ことが期待される。
に選択される理想的な殺虫に有効なペプチドは非標的の
昆虫および脊椎動物に対するその安全性によって特徴付
けられるものである。発現系は発現水準が殺虫効力を与
えるように選択される。従って、このような農業的に重
要な形質転換植物を得るこの技術的容易性が、環境に責
任のある方法で作物への昆虫の損害を減少させるための
完全な害虫管理法に使用する付加的武器を農家に与える
ことが期待される。
【０１０５】Ｇ．殺虫剤としてのペプチドの適用 本発明の殺虫に有効なペプチドは、害虫を有効量の本発
明のペプチドと接触させることによって、鱗翅目（Ｌｅ
ｐｉｄｏｐｔｅｒａ）のような無脊椎害虫を制御するの
に有効である。都合のよいことに、昆虫は駆除すること
が好ましい害虫である。
明のペプチドと接触させることによって、鱗翅目（Ｌｅ
ｐｉｄｏｐｔｅｒａ）のような無脊椎害虫を制御するの
に有効である。都合のよいことに、昆虫は駆除すること
が好ましい害虫である。
【０１０６】無脊椎害虫をペプチドと接触させて害虫を
制御する方法は知られている。例として合成的にカプセ
ル化した害虫の経口摂取用のタンパクがあげられる。本
発明のタンパクを発現する組換え宿主、たとえばシュー
ドモナス フルオレスセンス、は熱で死滅させ、その後
の経口摂取および制御のために害虫に適することができ
る。
制御する方法は知られている。例として合成的にカプセ
ル化した害虫の経口摂取用のタンパクがあげられる。本
発明のタンパクを発現する組換え宿主、たとえばシュー
ドモナス フルオレスセンス、は熱で死滅させ、その後
の経口摂取および制御のために害虫に適することができ
る。
【０１０７】いうまでもなく、本発明のタンパクを使用
して無脊椎害虫を制御する方法は、他の害虫制御法と組
合せて使用することもできる。たとえば、先に述べた形
質転換植物およびイー．コリを、制御すべき害虫の種類
および存在する他の重要可変因子に応じて、他の無脊椎
毒素を発現させるために処理することができる。
して無脊椎害虫を制御する方法は、他の害虫制御法と組
合せて使用することもできる。たとえば、先に述べた形
質転換植物およびイー．コリを、制御すべき害虫の種類
および存在する他の重要可変因子に応じて、他の無脊椎
毒素を発現させるために処理することができる。
【０１０８】本発明によるペプチドおよび農業的に又は
園芸的に許容しうるその塩の殺虫に有効な量を農業的に
又は園芸的に許容しうるキャリヤー中に含む殺虫剤組成
物も提供される。
園芸的に許容しうるその塩の殺虫に有効な量を農業的に
又は園芸的に許容しうるキャリヤー中に含む殺虫剤組成
物も提供される。
【０１０９】Ｈ．殺虫に有効なペプチドに対する抗体 本発明の別の面によれば、本発明の殺虫に有効なペプチ
ドに対する抗体が提供される。次の記述において、ここ
に述べる抗体と反応性のペプチドを検出および精製する
ための免疫学の当業者に周知の種々の方法論について言
及がなされる。
ドに対する抗体が提供される。次の記述において、ここ
に述べる抗体と反応性のペプチドを検出および精製する
ための免疫学の当業者に周知の種々の方法論について言
及がなされる。
【０１１０】もし抗体はある分子と特異的に反応して該
分子を抗体に結合させる場合には、抗体は分子に“結合
しうる”ものと言われる。用語“エピトープ”は抗体に
よって認識され結合されうるペプチド抗原のその部分の
ことをいう。抗原は１個以上のエピトープをもつことが
できる。“抗原”は動物を誘発してその抗原のエピトー
プに結合しうる抗体を生成させることができる。上記の
特異的反応は、抗原がその対応する抗体と高度に選択的
方法で免疫反応し、他の抗原によって誘発されうる他の
多くの抗体とは反応しないということを示す意味であ
る。
分子を抗体に結合させる場合には、抗体は分子に“結合
しうる”ものと言われる。用語“エピトープ”は抗体に
よって認識され結合されうるペプチド抗原のその部分の
ことをいう。抗原は１個以上のエピトープをもつことが
できる。“抗原”は動物を誘発してその抗原のエピトー
プに結合しうる抗体を生成させることができる。上記の
特異的反応は、抗原がその対応する抗体と高度に選択的
方法で免疫反応し、他の抗原によって誘発されうる他の
多くの抗体とは反応しないということを示す意味であ
る。
【０１１１】ここに使用する用語“抗体”（Ａｂ）また
は“モノクローナル抗体”（Ｍａｂ）とは抗原に結合し
うるそのままの分子ならびにその断片（たとえばＦａｂ
およびＦ（ａｂ′）2 断片）を含む意味である。Ｆａｂ
およびＦ（ａｂ′）2 断片は、円形から更に容易に明ら
かなように、そのままの抗体のＦｃ断片を欠き、昆虫抗
体のより少い非特異的組織結合をもちうる。
は“モノクローナル抗体”（Ｍａｂ）とは抗原に結合し
うるそのままの分子ならびにその断片（たとえばＦａｂ
およびＦ（ａｂ′）2 断片）を含む意味である。Ｆａｂ
およびＦ（ａｂ′）2 断片は、円形から更に容易に明ら
かなように、そのままの抗体のＦｃ断片を欠き、昆虫抗
体のより少い非特異的組織結合をもちうる。
【０１１２】本発明の抗体は種々の方法のいずれかによ
って製造することができる。このような抗体の製造法は
周知であり、文献に十分に記載されている。たとえばサ
ンブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）らの“Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａ
ｎｕａｌ”，第２版、コールド・スプリング・ハーバー
・プレス、Ｖｏｌ．３，Ｃｈ．１８（１９８９）を参照
のこと）。たとえば、殺虫に有効なペプチド又はその断
片を発現する細胞は動物に投与して殺虫に有効なペプチ
ドに結合しうるポリクローナル抗体を含む血清の産生を
誘発させることができる。一般に、殺虫に有効なペプチ
ド断片を製造し、精製してこれを天然の夾雑物を実質的
に含まないものにするか、または殺虫に有効なペプチド
断片を当該技術において知られている方法により合成す
る。精製された断片または合成された断片のいずれか一
方または精製された天然断片および／または合成された
断片の組合せを動物に投与して大きな特異的活性のポリ
クローナル抗血清を製造する。
って製造することができる。このような抗体の製造法は
周知であり、文献に十分に記載されている。たとえばサ
ンブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）らの“Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａ
ｎｕａｌ”，第２版、コールド・スプリング・ハーバー
・プレス、Ｖｏｌ．３，Ｃｈ．１８（１９８９）を参照
のこと）。たとえば、殺虫に有効なペプチド又はその断
片を発現する細胞は動物に投与して殺虫に有効なペプチ
ドに結合しうるポリクローナル抗体を含む血清の産生を
誘発させることができる。一般に、殺虫に有効なペプチ
ド断片を製造し、精製してこれを天然の夾雑物を実質的
に含まないものにするか、または殺虫に有効なペプチド
断片を当該技術において知られている方法により合成す
る。精製された断片または合成された断片のいずれか一
方または精製された天然断片および／または合成された
断片の組合せを動物に投与して大きな特異的活性のポリ
クローナル抗血清を製造する。
【０１１３】モノクローナル抗体は周知のハイブリドー
マ技術を使用して製造することができる。一般に、この
ような方法は動物を殺虫に有効なペプチド抗原で免疫に
することを含む。このような動物の脾臓細胞を抽出して
好適な骨髄腫細胞系と融合させる。すべての好適な骨髄
腫細胞系を本発明により使用することができる。融合後
に、生成ハイブリドーマ細胞を好適な培地中に選択的に
保持し、次いで制限希釈によってクローニングを行う。
このような選択により得られたハイブリドーマ細胞を次
いで分析して殺虫に有効なペプチド抗原に結合しうる抗
体を分泌するクローンを同定する。
マ技術を使用して製造することができる。一般に、この
ような方法は動物を殺虫に有効なペプチド抗原で免疫に
することを含む。このような動物の脾臓細胞を抽出して
好適な骨髄腫細胞系と融合させる。すべての好適な骨髄
腫細胞系を本発明により使用することができる。融合後
に、生成ハイブリドーマ細胞を好適な培地中に選択的に
保持し、次いで制限希釈によってクローニングを行う。
このような選択により得られたハイブリドーマ細胞を次
いで分析して殺虫に有効なペプチド抗原に結合しうる抗
体を分泌するクローンを同定する。
【０１１４】もしペプチド源が不純であると、ハイブリ
ドーマ細胞のわずかなもののみがペプチドに結合しうる
抗体を産生するであろう（他のハイブリドーマ細胞はペ
プチド夾雑物に結合しうる抗体を産生する。）。従っ
て、ペプチドに結合しうる抗体を分泌しうるものをハイ
ブリドーマ細胞の中から検索（スクリーニング）するこ
とが必要になる。このようなスクリーニングは、ペプチ
ド（または毒）の資料を特定のハイブリドーマ細胞のグ
ループのそれぞれから分泌されたモノクローナル抗体の
存在下で培養し、そして昆虫を麻痺させる毒液の能力を
中和または減衰させうる抗体を分泌することのできるハ
イブリドーマを同定することによって達成されるのが好
ましい。このようなハイブリドーマが同定されたなら
ば、それを当該技術で知られる方法によってクローンと
して増殖させてペプチド特異性モノクローナル抗体を産
生させることができる。
ドーマ細胞のわずかなもののみがペプチドに結合しうる
抗体を産生するであろう（他のハイブリドーマ細胞はペ
プチド夾雑物に結合しうる抗体を産生する。）。従っ
て、ペプチドに結合しうる抗体を分泌しうるものをハイ
ブリドーマ細胞の中から検索（スクリーニング）するこ
とが必要になる。このようなスクリーニングは、ペプチ
ド（または毒）の資料を特定のハイブリドーマ細胞のグ
ループのそれぞれから分泌されたモノクローナル抗体の
存在下で培養し、そして昆虫を麻痺させる毒液の能力を
中和または減衰させうる抗体を分泌することのできるハ
イブリドーマを同定することによって達成されるのが好
ましい。このようなハイブリドーマが同定されたなら
ば、それを当該技術で知られる方法によってクローンと
して増殖させてペプチド特異性モノクローナル抗体を産
生させることができる。
【０１１５】昆虫選択性の毒素、天然または組換体を、
抗体親和性クロマトグラフィーを使用して精製するため
に、殺虫に有効なペプチドに結合しうる抗体を使用する
ことが必要である。一般に、このような抗体はモノクロ
ーナル抗体である。ひとたびペプチド特異性モノクロー
ナル抗体がえられたならば、それは固体担体に結合させ
ることによって不動化して、天然毒素または他の資源か
らのペプチドを、当該技術に周知の方法によって免疫親
和クロマトグラフィーを使用して精製するのに使用する
ことができる。このような方法は高度の精製を調停する
ことができ、天然夾雑物を実質的に含まないペプチドを
産生することができる。ここに使用するように、もしペ
プチドが自然に及び通常に結合される化合物（すなわち
他のタンパク、脂質、炭化水素など）を欠く形態で存在
するならば、このペプチドは“天然夾雑物を実質的に含
まない”ものといわれる。
抗体親和性クロマトグラフィーを使用して精製するため
に、殺虫に有効なペプチドに結合しうる抗体を使用する
ことが必要である。一般に、このような抗体はモノクロ
ーナル抗体である。ひとたびペプチド特異性モノクロー
ナル抗体がえられたならば、それは固体担体に結合させ
ることによって不動化して、天然毒素または他の資源か
らのペプチドを、当該技術に周知の方法によって免疫親
和クロマトグラフィーを使用して精製するのに使用する
ことができる。このような方法は高度の精製を調停する
ことができ、天然夾雑物を実質的に含まないペプチドを
産生することができる。ここに使用するように、もしペ
プチドが自然に及び通常に結合される化合物（すなわち
他のタンパク、脂質、炭化水素など）を欠く形態で存在
するならば、このペプチドは“天然夾雑物を実質的に含
まない”ものといわれる。
【０１１６】ひとたびペプチドが精製されたならば、そ
れはペプチド特異性ポリクローナル抗体の産生をもたら
すために動物（たとえばマウスまたはラビット）を免疫
するのに使用することができる。好適な大きさの、一般
に１０〜５０ヌクレオチドのＤＮＡプローブをディグエ
チアくも毒液から実質的に単離しうる殺虫に有効なペプ
チドをコードするＤＮＡ配列から誘導することができ
る。このようなプローブは、ディグエチアくも毒液から
実質的に単離しうる殺虫に有効なペプチドをコードする
ＤＮＡの存在を、毒液と該ＤＮＡプローブとを接触さ
せ、該ＤＮＡに結合したプローブを当業者に周知の方法
で検出することによって、検出することができる。
れはペプチド特異性ポリクローナル抗体の産生をもたら
すために動物（たとえばマウスまたはラビット）を免疫
するのに使用することができる。好適な大きさの、一般
に１０〜５０ヌクレオチドのＤＮＡプローブをディグエ
チアくも毒液から実質的に単離しうる殺虫に有効なペプ
チドをコードするＤＮＡ配列から誘導することができ
る。このようなプローブは、ディグエチアくも毒液から
実質的に単離しうる殺虫に有効なペプチドをコードする
ＤＮＡの存在を、毒液と該ＤＮＡプローブとを接触さ
せ、該ＤＮＡに結合したプローブを当業者に周知の方法
で検出することによって、検出することができる。
【０１１７】Ｉ．遺伝子工学による殺虫性微生物 殺虫に有効なペプチド単独または別の昆虫毒素との組合
せは、バキュロウイルスおよびハイブリッド・バクテリ
アのような微生物の毒性を活性化または増大させるのに
有用であると予期される。ヘリオシス ビレスセンス
（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ）（ｃｏｔ
ｔｏｎ ｂｏｌｌｗｏｒｍ）、オルギア シュードッガ
タ（ｏｒｇｙｉａｐｓｅｕｄｏｔｓｕｇａｔａ）（Ｄｏ
ｕｇｌａｓ ｆｉｒ ｔｕｓｓｏｃｋ ｍｏｔｈ）、リ
マンチア デイスパー（Ｌｙｍａｎｔｉａ ｄｉｓｐｅ
ｒ）（ｇｙｐｓｙ ｍｏｔｈ）、オートグラファ カル
フォルニア（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａｃａｌｉｆｏｒｎｉ
ｃａ）（ｄｌｆａｌｆａ ｌｅｏｐｅｒ）、ネオデイプ
リオン サーティファー（Ｎｅｏｄｉｐｒｉｏｎ ｓｅ
ｒｔｉｆｅｒ）（Ｅｕｒｏｐｅａｎ ｐｉｎｅ ｆｌ
ｙ）、およびランスプシレシア ポノネラ（Ｌａｎｓｐ
ｃｙｒｅｓｉａ ｐｏｍｅｎｅｌｌａ）（Ｃｏｄｌｉｎ
ｇ ｍｏｔｈ）を感染させるものを含む種々のバキュロ
ウイルスがいくつかの国で登録され、殺虫剤として使用
されている。少なくとも１種の昆虫選択性毒素のゲノム
への導入は、このような農薬の能力を著しく増大させる
ことが期待される。
せは、バキュロウイルスおよびハイブリッド・バクテリ
アのような微生物の毒性を活性化または増大させるのに
有用であると予期される。ヘリオシス ビレスセンス
（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ）（ｃｏｔ
ｔｏｎ ｂｏｌｌｗｏｒｍ）、オルギア シュードッガ
タ（ｏｒｇｙｉａｐｓｅｕｄｏｔｓｕｇａｔａ）（Ｄｏ
ｕｇｌａｓ ｆｉｒ ｔｕｓｓｏｃｋ ｍｏｔｈ）、リ
マンチア デイスパー（Ｌｙｍａｎｔｉａ ｄｉｓｐｅ
ｒ）（ｇｙｐｓｙ ｍｏｔｈ）、オートグラファ カル
フォルニア（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａｃａｌｉｆｏｒｎｉ
ｃａ）（ｄｌｆａｌｆａ ｌｅｏｐｅｒ）、ネオデイプ
リオン サーティファー（Ｎｅｏｄｉｐｒｉｏｎ ｓｅ
ｒｔｉｆｅｒ）（Ｅｕｒｏｐｅａｎ ｐｉｎｅ ｆｌ
ｙ）、およびランスプシレシア ポノネラ（Ｌａｎｓｐ
ｃｙｒｅｓｉａ ｐｏｍｅｎｅｌｌａ）（Ｃｏｄｌｉｎ
ｇ ｍｏｔｈ）を感染させるものを含む種々のバキュロ
ウイルスがいくつかの国で登録され、殺虫剤として使用
されている。少なくとも１種の昆虫選択性毒素のゲノム
への導入は、このような農薬の能力を著しく増大させる
ことが期待される。
【０１１８】本発明で使用するために特に好適であると
期待される組換え発現ベクターは米国特許第４，８７
９，２３６号明細書に記載されている種類のようなバキ
ュロウイルス発現ベクター（ＡＴＣＣカタログ「Ｃｅｌ
ｌ Ｌｉｎｅ ａｎｄ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ」６ｔｈ
ｅｄ．，（１９８８）ｐｐ１６６〜１６７）である。該
米国特許を引用のためここに組み入れる。またカーボネ
ル（Ｃａｒｂｏｎｅｌｌ）らの“Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ
ｏｆ ａ ｇｅｎｅ ｃｏｄｉｎｇ ｆｏｒ ａｎ ｉ
ｎｓｅｃｔ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｓｃｏｒｐｉｏｎ ｎ
ｅｕｒｏｔｏｘｉｎ ａｎｄ ａｔｔｅｍｐｔｓ ｔｏ
ｅｘｐｒｅｓｓ ｉｔ ｕｓｉｎｇ ｂａｃｕｌｏｖ
ｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ，”Ｇｅｎｅ，７３：４０９
−４１８（１９８８）も参照されたい。このようなベク
ターは、ディグエチアくも毒液から実質的に単離しうる
殺虫に有効なペプチドをコードするＤＮＡ配列がオート
グラファ カルホルニア（ＡｃＭＮＰＶ）発現ベクター
のようなバキュロウイルスの中にクローン化されうる系
において有用であると予期される。米国特許第４，８７
９，２３６号およびミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）らのＳｃｉ
ｅｎｃｅ，２１９，７１５−７２１（１９８３）に記載
の発現ベクター参照。組換え発現ベクター・ウイルスは
次いで植物または動物に適用することができ、その際の
昆虫は害虫であり、ウイルスが害虫に摂取されるとき、
組換えウイルスは腸壁の細胞に浸入して複製を始める。
複製中、殺虫に有効なタンパクの遺伝子は発現されて、
昆虫が野生種のＡｃＭＮＰＶウイルスを摂取した場合よ
りも短い時間で昆虫の無能化もしくは死をもたらす。
期待される組換え発現ベクターは米国特許第４，８７
９，２３６号明細書に記載されている種類のようなバキ
ュロウイルス発現ベクター（ＡＴＣＣカタログ「Ｃｅｌ
ｌ Ｌｉｎｅ ａｎｄ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ」６ｔｈ
ｅｄ．，（１９８８）ｐｐ１６６〜１６７）である。該
米国特許を引用のためここに組み入れる。またカーボネ
ル（Ｃａｒｂｏｎｅｌｌ）らの“Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ
ｏｆ ａ ｇｅｎｅ ｃｏｄｉｎｇ ｆｏｒ ａｎ ｉ
ｎｓｅｃｔ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｓｃｏｒｐｉｏｎ ｎ
ｅｕｒｏｔｏｘｉｎ ａｎｄ ａｔｔｅｍｐｔｓ ｔｏ
ｅｘｐｒｅｓｓ ｉｔ ｕｓｉｎｇ ｂａｃｕｌｏｖ
ｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ，”Ｇｅｎｅ，７３：４０９
−４１８（１９８８）も参照されたい。このようなベク
ターは、ディグエチアくも毒液から実質的に単離しうる
殺虫に有効なペプチドをコードするＤＮＡ配列がオート
グラファ カルホルニア（ＡｃＭＮＰＶ）発現ベクター
のようなバキュロウイルスの中にクローン化されうる系
において有用であると予期される。米国特許第４，８７
９，２３６号およびミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）らのＳｃｉ
ｅｎｃｅ，２１９，７１５−７２１（１９８３）に記載
の発現ベクター参照。組換え発現ベクター・ウイルスは
次いで植物または動物に適用することができ、その際の
昆虫は害虫であり、ウイルスが害虫に摂取されるとき、
組換えウイルスは腸壁の細胞に浸入して複製を始める。
複製中、殺虫に有効なタンパクの遺伝子は発現されて、
昆虫が野生種のＡｃＭＮＰＶウイルスを摂取した場合よ
りも短い時間で昆虫の無能化もしくは死をもたらす。
【０１１９】ハイブリッド・ウイルスはまた欧州特許出
願第０３４０９４８号明細書にも有用であると予想され
ることが教示されている。本発明のＤＮＡを発現するハ
イブリッド・ウイルスは変化した昆虫宿主範囲をもつウ
イルスを生ずると予測される。たとえば、融合タンパク
は本発明のＤＮＡと、発現された殺虫に有効なペプチド
を宿主昆虫標的に向けるための特異的昆虫腸管細胞認識
タンパクとから成るハイブリッド遺伝子の単一ポリペプ
チド生成物として発現させることができた。
願第０３４０９４８号明細書にも有用であると予想され
ることが教示されている。本発明のＤＮＡを発現するハ
イブリッド・ウイルスは変化した昆虫宿主範囲をもつウ
イルスを生ずると予測される。たとえば、融合タンパク
は本発明のＤＮＡと、発現された殺虫に有効なペプチド
を宿主昆虫標的に向けるための特異的昆虫腸管細胞認識
タンパクとから成るハイブリッド遺伝子の単一ポリペプ
チド生成物として発現させることができた。
【０１２０】種々の原核生物および真核生物の微生物を
形質転換させて欧州特許出願第０３２５４００号明細書
に教示されている方法によって殺虫に有効なタンパクを
コードするハイブリッド毒素遺伝子を発現させることが
できる。
形質転換させて欧州特許出願第０３２５４００号明細書
に教示されている方法によって殺虫に有効なタンパクを
コードするハイブリッド毒素遺伝子を発現させることが
できる。
【０１２１】本発明のタンパクをコードする遺伝子をも
つプラスミドから成るハイブリッドバクテリア細胞は本
発明の方法に有用であると期待される。昆虫はこのハイ
ブリッドを昆虫に適用することによって制御される。た
とえば米国特許第４，７９７，２７９号明細書を参照。
この特許を上記のことを十分に示すものとして参照のた
めにここに記載する。
つプラスミドから成るハイブリッドバクテリア細胞は本
発明の方法に有用であると期待される。昆虫はこのハイ
ブリッドを昆虫に適用することによって制御される。た
とえば米国特許第４，７９７，２７９号明細書を参照。
この特許を上記のことを十分に示すものとして参照のた
めにここに記載する。
【０１２２】本発明に使用するために好適であるバキュ
ロウイルスを用いる他の例はトマルスキイ（Ｔｏｍａｌ
ｓｋｉ）らの“Ｉｎｓｅｃｔ ｐａｒａｌｙｓｉｓ ｂ
ｙｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｅｘｐ
ｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａｍｉｔｅ ｎｅｕｒｏｔｏｘ
ｉｎ ｇｅｎｅ”，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：８２−８５
（１９９１）およびステワート（Ｓｔｅｗａｒｔ）らの
“Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ｉｍｐｒｏ
ｖｅｄ ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ｉｎｓｅｃｔｉｃｉ
ｄｅ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ａｎ ｉｎｓｅｃｔ−ｓ
ｐｅｃｉｆｉｃ ｔｏｘｉｎ ｇｅｎｅ”，Ｎａｔｕｒ
ｅ，３５２：８５−８８（１９９１）；マックカチエン
（ＭｃＣｕｔｃｈｅｎ）らの“Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ
ｏｆ ａ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｂａｃｕｌｏｖ
ｉｒｕｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ａｎ ｉｎｓｅｃｔ
ｓｅｅｃｔｉｖｅ Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎ：Ｐｏｔｅ
ｎｔｉａｌ ｆｏｒ Ｐｅｓｔ Ｃｏｔｒｏｌ，”Ｂｉ
ｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９：８４８−８５１（１９９
１）、に記載されている。
ロウイルスを用いる他の例はトマルスキイ（Ｔｏｍａｌ
ｓｋｉ）らの“Ｉｎｓｅｃｔ ｐａｒａｌｙｓｉｓ ｂ
ｙｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｅｘｐ
ｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａｍｉｔｅ ｎｅｕｒｏｔｏｘ
ｉｎ ｇｅｎｅ”，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：８２−８５
（１９９１）およびステワート（Ｓｔｅｗａｒｔ）らの
“Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ｉｍｐｒｏ
ｖｅｄ ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ｉｎｓｅｃｔｉｃｉ
ｄｅ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ａｎ ｉｎｓｅｃｔ−ｓ
ｐｅｃｉｆｉｃ ｔｏｘｉｎ ｇｅｎｅ”，Ｎａｔｕｒ
ｅ，３５２：８５−８８（１９９１）；マックカチエン
（ＭｃＣｕｔｃｈｅｎ）らの“Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ
ｏｆ ａ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｂａｃｕｌｏｖ
ｉｒｕｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ａｎ ｉｎｓｅｃｔ
ｓｅｅｃｔｉｖｅ Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎ：Ｐｏｔｅ
ｎｔｉａｌ ｆｏｒ Ｐｅｓｔ Ｃｏｔｒｏｌ，”Ｂｉ
ｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９：８４８−８５１（１９９
１）、に記載されている。
【０１２３】Ｊ．交差ハイブリッド形成：関連化合物の
プローブとしてのＤＮＡ配列 適切な寸法のＤＮＡプローブは本発明のＤＮＡ配列から
誘導することができる。このようなプローブは、他の原
料からの核酸を用いるハイブリッド形成によって、本発
明の殺虫に有効なペプチドをコードする核酸の存在を検
知するために使用することができる。シグナル配列、ｃ
ＤＮＡの断片、または全ｃＤＮＡでさえ、コードするオ
リゴヌクレオチド・プローブを用いる低い制御条件下で
のスクリーニングは、ここに述べた毒素分子のファミリ
ーと機能上相同性をもつ他の活性ペプチドへの接近を可
能にする。本発明のＤＮＡ配列から生じるヌクレオチド
・プローブを用いる交差ハイブリッド形成のための良好
な候補である核酸の原料は同じ属であるが異なった種の
クモに限定されず、関連する属のクモ、および同じ属で
あるが異なった場所のクモがあげられる。
プローブとしてのＤＮＡ配列 適切な寸法のＤＮＡプローブは本発明のＤＮＡ配列から
誘導することができる。このようなプローブは、他の原
料からの核酸を用いるハイブリッド形成によって、本発
明の殺虫に有効なペプチドをコードする核酸の存在を検
知するために使用することができる。シグナル配列、ｃ
ＤＮＡの断片、または全ｃＤＮＡでさえ、コードするオ
リゴヌクレオチド・プローブを用いる低い制御条件下で
のスクリーニングは、ここに述べた毒素分子のファミリ
ーと機能上相同性をもつ他の活性ペプチドへの接近を可
能にする。本発明のＤＮＡ配列から生じるヌクレオチド
・プローブを用いる交差ハイブリッド形成のための良好
な候補である核酸の原料は同じ属であるが異なった種の
クモに限定されず、関連する属のクモ、および同じ属で
あるが異なった場所のクモがあげられる。
【０１２４】Ｋ．プロモーター配列の同定 本発明の別の面はクモのＤＫ９．２の合成を制御するプ
ロモーター配列を提供する。ＤＫ９．２の遺伝子の構成
は、成熟毒素ｃＤＮＡをプローブとして用いてゲノム・
ライブラリーをスクリーニングすることによって試験さ
れた。転写開始（ｃＤＮＡの５′末端であると推定され
る）の上流上のゲノムＤＮＡの分析は推定のプロモータ
ーの存在を示す。プロモーター領域の４２１塩基対のＤ
ＮＡ配列は配列番号８で示される。この推定上のプロモ
ーターが転写開始部位のすぐ上流の領域に通常存在する
本質的な制御シグナルの多くを含む（プロモーター制御
シグナルの記載については、マックナイト（ＭｃＫｎｉ
ｇｈｔ）らの１９８２年Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａ
ｌ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｓｉｇｎａｌｓ ｏｆ ａｎ Ｅ
ｕｃａｒｙｏｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｃｏｄｉｎｇ
Ｇｅｎｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２１７：３１６を参照され
たい）。カノニカルＴＡＴＡボックスは提案された転写
開始部位から−３０の位置に現れ、ＲＮＡ合成の開始点
を制御するのに重要であると示唆される。更に上流には
２つの末梢パリンドローム配列が存在し、そのうちの１
つはＲＮＡポリメラーゼII酵素の結合に重要であると考
えられるコンセンサスＣＡＡＴボックスを含む。このプ
ロモーター、またはこのプロモーターの領域は植物、動
物または細菌細胞中たとえば組換え構造中の種々の遺伝
子の転写および発現に用途をもつことが予見される。
ロモーター配列を提供する。ＤＫ９．２の遺伝子の構成
は、成熟毒素ｃＤＮＡをプローブとして用いてゲノム・
ライブラリーをスクリーニングすることによって試験さ
れた。転写開始（ｃＤＮＡの５′末端であると推定され
る）の上流上のゲノムＤＮＡの分析は推定のプロモータ
ーの存在を示す。プロモーター領域の４２１塩基対のＤ
ＮＡ配列は配列番号８で示される。この推定上のプロモ
ーターが転写開始部位のすぐ上流の領域に通常存在する
本質的な制御シグナルの多くを含む（プロモーター制御
シグナルの記載については、マックナイト（ＭｃＫｎｉ
ｇｈｔ）らの１９８２年Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａ
ｌ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｓｉｇｎａｌｓ ｏｆ ａｎ Ｅ
ｕｃａｒｙｏｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｃｏｄｉｎｇ
Ｇｅｎｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２１７：３１６を参照され
たい）。カノニカルＴＡＴＡボックスは提案された転写
開始部位から−３０の位置に現れ、ＲＮＡ合成の開始点
を制御するのに重要であると示唆される。更に上流には
２つの末梢パリンドローム配列が存在し、そのうちの１
つはＲＮＡポリメラーゼII酵素の結合に重要であると考
えられるコンセンサスＣＡＡＴボックスを含む。このプ
ロモーター、またはこのプロモーターの領域は植物、動
物または細菌細胞中たとえば組換え構造中の種々の遺伝
子の転写および発現に用途をもつことが予見される。
【０１２５】
【実施例】次の実施例は本発明の範囲内の特定の組成物
および方法を具体的に示すためのものであるが、それら
は本発明の範囲を限定することを意図するものではな
い。
および方法を具体的に示すためのものであるが、それら
は本発明の範囲を限定することを意図するものではな
い。
【０１２６】材料および方法 クモは米国アリゾナ州ブラック・キャニオン・シティの
スパイダー・ファーム・インコポレーテッドから入手
し、種の同定はスパイダー・ファーム・インコポレーテ
ッドによって提供された。ディグエチア・キャニテイー
ズのクモを電気的にミルク化して毒液を採取した。安全
ガードを使用する方法を用いて毒液が逆流または血液リ
ンパ球によって汚染させるのを防いだ。
スパイダー・ファーム・インコポレーテッドから入手
し、種の同定はスパイダー・ファーム・インコポレーテ
ッドによって提供された。ディグエチア・キャニテイー
ズのクモを電気的にミルク化して毒液を採取した。安全
ガードを使用する方法を用いて毒液が逆流または血液リ
ンパ球によって汚染させるのを防いだ。
【０１２７】毒物の精製：粗毒液（−８０℃で貯蔵）を
解凍し、十分に混合して０．１％トリフルオロ酢酸（Ｔ
ＦＡ）にとかしてからクロマトグラフィーにかけた。ベ
ックマン・システム・ゴールド１２６溶媒および１６０
光ダイオードアレイ検出器を組み入れた逆相液体クロマ
トグラフィー（ＲＰＬＣ）によって粗毒液を分別した。
アセトニトリルまたはイソプロパノールをＴＦＡと組合
せてイオン対試薬として使用した。同じマトリックスの
ガード・カラムをもつ次のカラムを精製に使用した。Ｄ
ｙｎａｍａｘ ３００Ａ ＲＰ Ｃ18カラム（２５ｃｍ
×４．６ｍｍ内径、５μｍ粒子サイズ）、およびＶｙｄ
ａｃ ３００Ａ Ｃ18セミ−プレパレーテイブ・カラム
（２５ｃｍ×１０ｍｍ内径、５μｍ粒子サイズ）。ピー
クの検出は２２０ｎｍでのモニタリングおよび微分別コ
レクターを用いてフラクションを採取することによって
行った。すべてのフラクションは分別後に凍結乾燥し、
−８０℃で貯蔵した。
解凍し、十分に混合して０．１％トリフルオロ酢酸（Ｔ
ＦＡ）にとかしてからクロマトグラフィーにかけた。ベ
ックマン・システム・ゴールド１２６溶媒および１６０
光ダイオードアレイ検出器を組み入れた逆相液体クロマ
トグラフィー（ＲＰＬＣ）によって粗毒液を分別した。
アセトニトリルまたはイソプロパノールをＴＦＡと組合
せてイオン対試薬として使用した。同じマトリックスの
ガード・カラムをもつ次のカラムを精製に使用した。Ｄ
ｙｎａｍａｘ ３００Ａ ＲＰ Ｃ18カラム（２５ｃｍ
×４．６ｍｍ内径、５μｍ粒子サイズ）、およびＶｙｄ
ａｃ ３００Ａ Ｃ18セミ−プレパレーテイブ・カラム
（２５ｃｍ×１０ｍｍ内径、５μｍ粒子サイズ）。ピー
クの検出は２２０ｎｍでのモニタリングおよび微分別コ
レクターを用いてフラクションを採取することによって
行った。すべてのフラクションは分別後に凍結乾燥し、
−８０℃で貯蔵した。
【０１２８】ファースト・アトム・ボンバードメント質
量分析計（ＦＡＢ−ＭＳ）マス・スペクトルをイリノイ
大学のＶＧ機器ＺＡＢ−ＳＥ質量分析計を使用して標準
ＦＡＢ条件（キセノンガス、解像１０００、加速電圧８
ＫＶ、原料温度４０℃）のもとで記録した。試料（約１
μｇ）は２５％水性ＴＦＡ（１．０％）を含むチオグリ
セロール４μｌ中で分析した。
量分析計（ＦＡＢ−ＭＳ）マス・スペクトルをイリノイ
大学のＶＧ機器ＺＡＢ−ＳＥ質量分析計を使用して標準
ＦＡＢ条件（キセノンガス、解像１０００、加速電圧８
ＫＶ、原料温度４０℃）のもとで記録した。試料（約１
μｇ）は２５％水性ＴＦＡ（１．０％）を含むチオグリ
セロール４μｌ中で分析した。
【０１２９】実施例１ ディグエチア キャニテイーズの全毒液からの殺虫性 ペプチド含有フラクションの初期の分別と同定 前記のディグエチア キャニテイーズからえた凍結全毒
液２５μｌを０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）にと
かし、３．５ｍｌ／分の流速で溶離するセミ−プレパレ
ーテイブＶｙｄａｃ ＲＰ Ｃ18カラム上の逆相液体ク
ロマトグラフィーによる分別に付した。０．１％ＴＦ
Ａ：５０％アセトニトリル水溶液の８５：１５混合物で
始まり１８０分後に５０：５０％混合物で終わる線状勾
配の溶離液を使用した。
液２５μｌを０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）にと
かし、３．５ｍｌ／分の流速で溶離するセミ−プレパレ
ーテイブＶｙｄａｃ ＲＰ Ｃ18カラム上の逆相液体ク
ロマトグラフィーによる分別に付した。０．１％ＴＦ
Ａ：５０％アセトニトリル水溶液の８５：１５混合物で
始まり１８０分後に５０：５０％混合物で終わる線状勾
配の溶離液を使用した。
【０１３０】 それぞれのフラクションを溶離液からの凍結乾燥によっ
て、次いで水からの凍結乾燥によって濃縮した。残留物
を−８０℃で貯蔵した。それぞれのフラクションを緩衝
生理学的食塩溶液の２５μｌにとかして殺虫性を評価し
た。いくつかのフラクションの殺虫活性がタバコ毛虫
（ヘリオシス ビレスセンス）“ＴＢＷ”に対して試験
することによって確認された（表Ｉ）。
て、次いで水からの凍結乾燥によって濃縮した。残留物
を−８０℃で貯蔵した。それぞれのフラクションを緩衝
生理学的食塩溶液の２５μｌにとかして殺虫性を評価し
た。いくつかのフラクションの殺虫活性がタバコ毛虫
（ヘリオシス ビレスセンス）“ＴＢＷ”に対して試験
することによって確認された（表Ｉ）。
【０１３１】ＴＢＷ幼虫、各フラクションごとに５匹、
に試験溶液３μｌを、３３ゲージ針およびＰＢ６００反
復マイクロデイスペンサーを備える５０μｌハミルトン
注射器を使用して注射した。注射は注射針を腹部（前脚
の１つの近く）の横方向中央に浅い角度で注入すること
によって行い、内部器官の損傷を避けた。注射後、それ
ぞれの昆虫を人工飼料を含む別個の容器に入れた。観察
を周期的に行い、注射後２４時間で麻痺が測定された。
タバコ毛虫について０．３ｇの平均体重を投与量の計算
に使用した。１組の対照昆虫には緩衝食塩溶液のみを注
射した。
に試験溶液３μｌを、３３ゲージ針およびＰＢ６００反
復マイクロデイスペンサーを備える５０μｌハミルトン
注射器を使用して注射した。注射は注射針を腹部（前脚
の１つの近く）の横方向中央に浅い角度で注入すること
によって行い、内部器官の損傷を避けた。注射後、それ
ぞれの昆虫を人工飼料を含む別個の容器に入れた。観察
を周期的に行い、注射後２４時間で麻痺が測定された。
タバコ毛虫について０．３ｇの平均体重を投与量の計算
に使用した。１組の対照昆虫には緩衝食塩溶液のみを注
射した。
【０１３２】麻痺は徐々に進行し、その前に筋肉のケイ
レンがあった。ひどい場合には、これらのケイレンは注
射後１５〜３０分以内に始まり、徐々に強さを増し、遂
には幼虫は完全に無能力になった。時としてフルエは注
射後４８時間以上も続いた。致死量以下の薬量を投与し
たときにさえ時としてこれが起こり、幼虫は結局回復し
た。フルエのひどさは毒性の最も信頼しうる指標であ
り、全麻痺および／または体収縮の点にまで影響を受け
た幼虫は回復しなかった。
レンがあった。ひどい場合には、これらのケイレンは注
射後１５〜３０分以内に始まり、徐々に強さを増し、遂
には幼虫は完全に無能力になった。時としてフルエは注
射後４８時間以上も続いた。致死量以下の薬量を投与し
たときにさえ時としてこれが起こり、幼虫は結局回復し
た。フルエのひどさは毒性の最も信頼しうる指標であ
り、全麻痺および／または体収縮の点にまで影響を受け
た幼虫は回復しなかった。
【０１３３】
【表１】 * 麻痺は昆虫がその側面へまたは背面へねじられた時
にそれ自身を矯正することができない昆虫の無能力とし
て定義される。 ** ＷＶＥ：全毒液当量（ｗｈｏｌｅ ｖｅｎｏｍ ｅ
ｑｕｉｖａｌｅｎｔ）は全ミルク化毒液１μｌに通常存
在する毒素の量である。２５μｌ分離からの５ＷＶＥは
回収残留物の２０％である。
にそれ自身を矯正することができない昆虫の無能力とし
て定義される。 ** ＷＶＥ：全毒液当量（ｗｈｏｌｅ ｖｅｎｏｍ ｅ
ｑｕｉｖａｌｅｎｔ）は全ミルク化毒液１μｌに通常存
在する毒素の量である。２５μｌ分離からの５ＷＶＥは
回収残留物の２０％である。
【０１３４】実施例２ ディグエチア キャニテイーズのフラクション９の精製 ＴＢＷ活性フラクション９の主要成分を、イソプロパノ
ール／０．１％ＴＦＡの線状（１．０％／分）溶媒勾配
を使用して、Ｖｙｄａｃ ＲＰ Ｃ18（２５ｃｍ×１０
ｍｍ内径）の１つの追加クロマトグラフィーによって
３．５ｍｌ／分で２２０ｎｍでモニタして均一性した
（ほぼ６，５００ダルトンの分子量範囲で、ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ電気泳動によりそれぞれ１つの可視帯）に対して
精製した。ピークの検出とフラクション採取は、実施例
１に記載したように行った。２つのフラクションを集め
た。第１は２１．８１分（フラクション９．１）で溶離
し、第２は２２．３９分（フラクション９．２）で溶離
した。
ール／０．１％ＴＦＡの線状（１．０％／分）溶媒勾配
を使用して、Ｖｙｄａｃ ＲＰ Ｃ18（２５ｃｍ×１０
ｍｍ内径）の１つの追加クロマトグラフィーによって
３．５ｍｌ／分で２２０ｎｍでモニタして均一性した
（ほぼ６，５００ダルトンの分子量範囲で、ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ電気泳動によりそれぞれ１つの可視帯）に対して
精製した。ピークの検出とフラクション採取は、実施例
１に記載したように行った。２つのフラクションを集め
た。第１は２１．８１分（フラクション９．１）で溶離
し、第２は２２．３９分（フラクション９．２）で溶離
した。
【０１３５】フラクション９．１および９．２を溶離液
からの凍結乾燥によりおよびその後の水からの凍結乾燥
によって濃縮、それぞれ９．１および９．２の残留物を
残した。凍結乾燥したフラクションの純度は少なくとも
９９％であると見積られた。全毒液の２５μｌからえら
れた残留物９．２はほぼ６μｇの純タンパクを含むと推
定された。残留物９．２をタバコ毛虫に対する殺虫活性
について試験した。実施例１で述べたようにして、５匹
の昆虫のそれぞれに緩衝食塩溶液中の６．３μｇの残留
物を注射し、そして別の５匹の昆虫には対照として緩衝
食塩溶液のみを注射することによって試験を行った。２
４時間後、および４８時間後に昆虫を試験した。２４時
間の読みをおいて、残留物９．２溶液で処理した昆虫の
すべては麻痺し、次いで死んだが、対照昆虫は普通のよ
うにみえた。４８時間後にも変化は認められなかった。
からの凍結乾燥によりおよびその後の水からの凍結乾燥
によって濃縮、それぞれ９．１および９．２の残留物を
残した。凍結乾燥したフラクションの純度は少なくとも
９９％であると見積られた。全毒液の２５μｌからえら
れた残留物９．２はほぼ６μｇの純タンパクを含むと推
定された。残留物９．２をタバコ毛虫に対する殺虫活性
について試験した。実施例１で述べたようにして、５匹
の昆虫のそれぞれに緩衝食塩溶液中の６．３μｇの残留
物を注射し、そして別の５匹の昆虫には対照として緩衝
食塩溶液のみを注射することによって試験を行った。２
４時間後、および４８時間後に昆虫を試験した。２４時
間の読みをおいて、残留物９．２溶液で処理した昆虫の
すべては麻痺し、次いで死んだが、対照昆虫は普通のよ
うにみえた。４８時間後にも変化は認められなかった。
【０１３６】ファスト・アトム・ボンバードメント質量
分析計は６３７１±２の分子量を示した。Ｎ末端アミノ
酸配列分析は、配列番号１に実質的に示すように残留物
９．２の部分アミノ酸配列、アミノ酸１−３３、をもた
らした。
分析計は６３７１±２の分子量を示した。Ｎ末端アミノ
酸配列分析は、配列番号１に実質的に示すように残留物
９．２の部分アミノ酸配列、アミノ酸１−３３、をもた
らした。
【０１３７】エッチ ビレスセンス（ＴＢＷ）中のディ
グエチア毒素９．２のＬＤ50は約１．０ｎｍｏｌ／ｇで
あった。症候は実施例１で述べた全毒液の投与に伴われ
るものと類似していた。
グエチア毒素９．２のＬＤ50は約１．０ｎｍｏｌ／ｇで
あった。症候は実施例１で述べた全毒液の投与に伴われ
るものと類似していた。
【０１３８】実施例３ ディグエチア キャニテイーズの精製、フラクション１
１ 実施例２と同様にして、実施例１のディグエチア キャ
ニテイーズ全毒液から単離したフラクション１１を、逆
相液体クロマトグラフィーによって更に精製して１つの
フラクションを得た。このフラクションを、溶離液から
の凍結乾燥およびその後の水からの凍結乾燥によって濃
縮して残留物、標識残留物１１、を残した。この残留物
を実施例２で述べたように５．０ＷＶＥ／ｇでタバコ毛
虫に対する殺虫活性について試験した。２４時間後に、
残留物１１で処理した昆虫の８０％は麻痺を示し、そし
て４８時間後にはこのペプチドで処理した昆虫の６０％
が麻痺を示した。
１ 実施例２と同様にして、実施例１のディグエチア キャ
ニテイーズ全毒液から単離したフラクション１１を、逆
相液体クロマトグラフィーによって更に精製して１つの
フラクションを得た。このフラクションを、溶離液から
の凍結乾燥およびその後の水からの凍結乾燥によって濃
縮して残留物、標識残留物１１、を残した。この残留物
を実施例２で述べたように５．０ＷＶＥ／ｇでタバコ毛
虫に対する殺虫活性について試験した。２４時間後に、
残留物１１で処理した昆虫の８０％は麻痺を示し、そし
て４８時間後にはこのペプチドで処理した昆虫の６０％
が麻痺を示した。
【０１３９】このポリペプチドのファスト・アトム・ボ
ンバードメント質量分析計は６７４０±２の分子量を示
した。Ｎ末端アミノ酸配列分析は配列番号３に実質的に
示す部分アミノ酸配列、アミノ酸１−２９、をもたらし
た。
ンバードメント質量分析計は６７４０±２の分子量を示
した。Ｎ末端アミノ酸配列分析は配列番号３に実質的に
示す部分アミノ酸配列、アミノ酸１−２９、をもたらし
た。
【０１４０】実施例４ ディグエチア キャニテイーズの精製、フラクション１
２ 実施例２と同様にして、実施例１のようにディグエチア
キャニテイーズ全毒液から単離したフラクション１２
を逆相液体クロマトグラフィーによって更に精製して１
つのフラクションを得た。このフラクションを溶離液か
らの凍結乾燥、およびその後の水からの凍結乾燥によっ
て濃縮して、残留物、すなわち標識残留物１２を残し
た。この残留物を実施例２で述べたようにタバコ毛虫に
対する殺虫活性について試験した。２４時間後に、残留
物１２で処理した昆虫の１００％が麻痺を示し、４８時
間には残留物１２で処理した昆虫の８０％が麻痺を示し
た。対照昆虫は普通のようにみえた。ファスト・アトム
・ボンバードメント質量分析計によるこのポリペプチド
の分析は７０８０±２の分子量を示した。Ｎ末端アミノ
酸系列分析は配列番号５に示すように残留物１２の仮の
部分アミノ酸配列をもたらした。
２ 実施例２と同様にして、実施例１のようにディグエチア
キャニテイーズ全毒液から単離したフラクション１２
を逆相液体クロマトグラフィーによって更に精製して１
つのフラクションを得た。このフラクションを溶離液か
らの凍結乾燥、およびその後の水からの凍結乾燥によっ
て濃縮して、残留物、すなわち標識残留物１２を残し
た。この残留物を実施例２で述べたようにタバコ毛虫に
対する殺虫活性について試験した。２４時間後に、残留
物１２で処理した昆虫の１００％が麻痺を示し、４８時
間には残留物１２で処理した昆虫の８０％が麻痺を示し
た。対照昆虫は普通のようにみえた。ファスト・アトム
・ボンバードメント質量分析計によるこのポリペプチド
の分析は７０８０±２の分子量を示した。Ｎ末端アミノ
酸系列分析は配列番号５に示すように残留物１２の仮の
部分アミノ酸配列をもたらした。
【０１４１】残留のこの制限された供給は毒性の正確な
目盛りを許さず、その結果として残留物９．２は残留物
１１および１２よりそれぞれ３９％および６７％より高
い投与量（ｎｍｏｌ／ｇ）で試験された。選択された投
与量は最小致死量から効果のない水準までの範囲をカバ
ーするように意図された。それにもかかわらず、結果は
これらのペプチドが全く同様な毒性をもつことを示し
た。残留物９．２は他のものよりやや大きい能力をもつ
といえるが、その差は多分３の因子よりも小さい。これ
らのペプチド（残留物９．２、１１および１２）の最小
１００％致死量は３．０〜５．０ｎｍｏｌ／ｇであるよ
うにみえる。これは商業的殺虫剤に優に匹敵する。たと
えばテフルベンズロン（ｔｅｆｌｕｂｅｎｚｕｒｏｎ）
は１．０ｎｍｏｌ／ｇの代表的なＬＤ50（ＳＡＷ）をも
つ。
目盛りを許さず、その結果として残留物９．２は残留物
１１および１２よりそれぞれ３９％および６７％より高
い投与量（ｎｍｏｌ／ｇ）で試験された。選択された投
与量は最小致死量から効果のない水準までの範囲をカバ
ーするように意図された。それにもかかわらず、結果は
これらのペプチドが全く同様な毒性をもつことを示し
た。残留物９．２は他のものよりやや大きい能力をもつ
といえるが、その差は多分３の因子よりも小さい。これ
らのペプチド（残留物９．２、１１および１２）の最小
１００％致死量は３．０〜５．０ｎｍｏｌ／ｇであるよ
うにみえる。これは商業的殺虫剤に優に匹敵する。たと
えばテフルベンズロン（ｔｅｆｌｕｂｅｎｚｕｒｏｎ）
は１．０ｎｍｏｌ／ｇの代表的なＬＤ50（ＳＡＷ）をも
つ。
【０１４２】実施例５ ディグエチア キャニテイーズ毒液から単離された残留
物９．２および１１の暗号遺伝子の単離 工程＃１：ＲＮＡの単離 くもを外部の出所から採取し且つディグエチア キャニ
テイーズと同定した。生きたくもを凍結し、液体窒素下
で頭胸部を除いた。Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ，１６２，１５６（１９８７）に記載の
Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ及びＳａｃｃｈｉの治験実施計
画を使用して頭胸部からＲＮＡを抽出した。オリゴｄ
（Ｔ）セルロース（スエーデンのファーマシアＬＫＢ
製）クロマトグラフィーを使用してポリアデニル化メッ
センジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を精製した。
物９．２および１１の暗号遺伝子の単離 工程＃１：ＲＮＡの単離 くもを外部の出所から採取し且つディグエチア キャニ
テイーズと同定した。生きたくもを凍結し、液体窒素下
で頭胸部を除いた。Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ，１６２，１５６（１９８７）に記載の
Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ及びＳａｃｃｈｉの治験実施計
画を使用して頭胸部からＲＮＡを抽出した。オリゴｄ
（Ｔ）セルロース（スエーデンのファーマシアＬＫＢ
製）クロマトグラフィーを使用してポリアデニル化メッ
センジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を精製した。
【０１４３】工程＃２：ｃＤＮＡの合成 製造者の治験実施計画を使用してマウス白血病ウイルス
逆転写酵素（ベテスダ・リサーチ・ラボラトリース，Ｍ
Ｄ）でメッセンジャーＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写した。
２０μｌの反応混合物はｃＤＮＡ合成キット マンハイ
バーリンガー・マンハイム，ＩＮ）で供給される酵素緩
衝液、５０ｎｇのｍＲＮＡ、２単位のＲＮアーゼＨ、３
０ｎｇのｄ（Ｔ）Ｎｏｔ Ｉプライマー（プロメガ，マ
ジソン，ＷＩ）１ｍＭのそれぞれのデオキシヌクレオシ
ド トリホスフェート、および１００μｇの逆転写酵素
を含有した。この反応混合物を３７℃で１時間保温し、
４２℃で１０分間持続した。反応混合物をエタノールで
沈殿させ、２０μｌの水中に再懸濁させた。
逆転写酵素（ベテスダ・リサーチ・ラボラトリース，Ｍ
Ｄ）でメッセンジャーＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写した。
２０μｌの反応混合物はｃＤＮＡ合成キット マンハイ
バーリンガー・マンハイム，ＩＮ）で供給される酵素緩
衝液、５０ｎｇのｍＲＮＡ、２単位のＲＮアーゼＨ、３
０ｎｇのｄ（Ｔ）Ｎｏｔ Ｉプライマー（プロメガ，マ
ジソン，ＷＩ）１ｍＭのそれぞれのデオキシヌクレオシ
ド トリホスフェート、および１００μｇの逆転写酵素
を含有した。この反応混合物を３７℃で１時間保温し、
４２℃で１０分間持続した。反応混合物をエタノールで
沈殿させ、２０μｌの水中に再懸濁させた。
【０１４４】工程＃３：プライマーの合成 配列番号１に従ってアミノ酸残留物１〜８をコードする
ことができた同義プライマーＤＮＡ配列混合物を、若干
のショウジョウバエのコドン選択を用いることによって
設計して同義性を減少させた。このプライマーはユタ州
立大学のハワード・ヒーズ・メディカル・インスティテ
ュートの契約設備によって合成された。
ことができた同義プライマーＤＮＡ配列混合物を、若干
のショウジョウバエのコドン選択を用いることによって
設計して同義性を減少させた。このプライマーはユタ州
立大学のハワード・ヒーズ・メディカル・インスティテ
ュートの契約設備によって合成された。
【０１４５】工程＃４：増幅 熱安定性ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡのプライマー
指向酵素的増幅はサイキらのＳｃｉｅｎｃｅ，２３９：
４８７（１９８８）によって初めて記述された。我々の
適用のために、ディグエチア頭胸部ｃＤＮＡの５μｌ
を、ＧｅｎｅＡｍｐＴＭＤＮＡ増幅キット（パーキン・
エルマー・セタス，ＣＡに含まれる試薬を含有するポリ
メラーゼ鎖反応において鋳型として使用した。この増幅
反応は２μＭ濃度のセンスおよびアンチセンスプライマ
ー、１００μＭのそれぞれのデオキシヌクレオチドトリ
ホスフェートおよび４単位の熱安定性組換えＴａｇ Ｉ
ポリメラーゼを含んでいた。この反応はパーキン・エ
ルマー・セタスによって製造されたＤＮＡサーマルサー
クラー中で行われた。類似するＮＨ2 末端アミノ酸配列
をもつ関連毒素のファミリーからの、残留物９．２をコ
ードする遺伝子の選択的増幅は厳密なアンニーリング温
度（５８℃）を使用して達成された。これらの条件は、
アガロース・ゲル電気泳動によって測定して、約２７５
塩基対の長さをもつ単一ＤＮＡを増幅した。厳密さの少
ないアンニーリング条件を使用すれば、５個より多い増
幅生成物がアガロース・ゲル電気泳動によって検出され
ることができ、その大きさは約２００〜３６０塩基対の
範囲である。低い厳密さで得られたこれらの種々のＰＣ
Ｒ生成物はたぶんアミノ酸配列において、だいたいのサ
イズにおいてそして殺虫活性において残留物９．２に関
連するポリペプチドをコードする。そのような関連ポリ
ペプチドは残留物１１および１２を含むものと予測され
る。その理由はこれらのポリペプチドのＮ末端配列が、
配列番号１，３および５に示すように、相互に及び残留
物９．２に非常に類似しているからである。
指向酵素的増幅はサイキらのＳｃｉｅｎｃｅ，２３９：
４８７（１９８８）によって初めて記述された。我々の
適用のために、ディグエチア頭胸部ｃＤＮＡの５μｌ
を、ＧｅｎｅＡｍｐＴＭＤＮＡ増幅キット（パーキン・
エルマー・セタス，ＣＡに含まれる試薬を含有するポリ
メラーゼ鎖反応において鋳型として使用した。この増幅
反応は２μＭ濃度のセンスおよびアンチセンスプライマ
ー、１００μＭのそれぞれのデオキシヌクレオチドトリ
ホスフェートおよび４単位の熱安定性組換えＴａｇ Ｉ
ポリメラーゼを含んでいた。この反応はパーキン・エ
ルマー・セタスによって製造されたＤＮＡサーマルサー
クラー中で行われた。類似するＮＨ2 末端アミノ酸配列
をもつ関連毒素のファミリーからの、残留物９．２をコ
ードする遺伝子の選択的増幅は厳密なアンニーリング温
度（５８℃）を使用して達成された。これらの条件は、
アガロース・ゲル電気泳動によって測定して、約２７５
塩基対の長さをもつ単一ＤＮＡを増幅した。厳密さの少
ないアンニーリング条件を使用すれば、５個より多い増
幅生成物がアガロース・ゲル電気泳動によって検出され
ることができ、その大きさは約２００〜３６０塩基対の
範囲である。低い厳密さで得られたこれらの種々のＰＣ
Ｒ生成物はたぶんアミノ酸配列において、だいたいのサ
イズにおいてそして殺虫活性において残留物９．２に関
連するポリペプチドをコードする。そのような関連ポリ
ペプチドは残留物１１および１２を含むものと予測され
る。その理由はこれらのポリペプチドのＮ末端配列が、
配列番号１，３および５に示すように、相互に及び残留
物９．２に非常に類似しているからである。
【０１４６】工程＃５：ＰＣＲ生成物のクローニング 高いおよび低い厳密反応の両者からのＰＣＲ生成物は、
セントリコン−１００（アミコン）分子サイズ分離装置
を使用して精製して組み込まれなかったプライマーを除
いた。保持された生成物を次いで制限酵素Ｎｏｔ Ｉ
（ＭＢＲ，ミルウオーキー，ＷＩ）で消化させた。この
制限酵素は下流（３′末端）のプライマー内で開裂して
接着未部を残す。ベクターｐＫＳ（ストラタジーン，ラ
ジョラ，ＣＡ）はＥｃｏＲ Ｖ（ユーエス・バイオケミ
カル）およびＮｏｔ Ｉで２重に消化されて直接クロー
ニングに特異的部位を生成した。ベクターと昆虫とが結
合されて複合体ＤＮ５αＦ′に形質転換された。32Ｐ標
識化内部プローブを用いてコロニイ・リフトをスクリー
ニングし、候補コロニーをプライマーとしての内部プロ
ーブを使用してミニプレプＤＮＡを配列（ユーエス・バ
イオケミカルのシークナーゼ・バージョン２．０）する
ことによって更に確認した。
セントリコン−１００（アミコン）分子サイズ分離装置
を使用して精製して組み込まれなかったプライマーを除
いた。保持された生成物を次いで制限酵素Ｎｏｔ Ｉ
（ＭＢＲ，ミルウオーキー，ＷＩ）で消化させた。この
制限酵素は下流（３′末端）のプライマー内で開裂して
接着未部を残す。ベクターｐＫＳ（ストラタジーン，ラ
ジョラ，ＣＡ）はＥｃｏＲ Ｖ（ユーエス・バイオケミ
カル）およびＮｏｔ Ｉで２重に消化されて直接クロー
ニングに特異的部位を生成した。ベクターと昆虫とが結
合されて複合体ＤＮ５αＦ′に形質転換された。32Ｐ標
識化内部プローブを用いてコロニイ・リフトをスクリー
ニングし、候補コロニーをプライマーとしての内部プロ
ーブを使用してミニプレプＤＮＡを配列（ユーエス・バ
イオケミカルのシークナーゼ・バージョン２．０）する
ことによって更に確認した。
【０１４７】２つのクローンのｃＤＮＡ挿入の全ＤＮＡ
配列は配列番号２および４に示される。前者のみが厳密
なＰＣＲ反応から誘導されたクローン中に得られ、これ
に対してｃＤＮＡ挿入の両方のタイプが低い厳密のＰＣ
Ｒ反応の生成物から得られるクローン中に見出された。
配列番号２によってコードされたポリペプチドのアミノ
酸配列は配列番号１に示されている。このポリペプチド
は残留物９．２について決定されたのと同じＮ−末端配
列をもつ。このポリペプチドの計算された分子量は６３
７７．９ダルトンである。天然ポリペプチド中のすべて
のシスティンが分子内ジスルフィド結合（シスチン）の
型体で存在するとすると、計算された分子量は６３６
９．７ダルトンになる。それ故、このポリペプチドは質
量分析計によって６３７１±２の分子量を示した残留物
９．２中で単離されたペプチドと同じであるように思わ
れる。配列番号４によってコードされたペプチドのアミ
ノ酸配列は配列番号３に示される。このポリペプチドは
残留物１１について決定されたものと同じＮ末端配列を
もつ。それ故、このペプチドは残留物１１中で単離され
た同じポリペプチドであると思われる。
配列は配列番号２および４に示される。前者のみが厳密
なＰＣＲ反応から誘導されたクローン中に得られ、これ
に対してｃＤＮＡ挿入の両方のタイプが低い厳密のＰＣ
Ｒ反応の生成物から得られるクローン中に見出された。
配列番号２によってコードされたポリペプチドのアミノ
酸配列は配列番号１に示されている。このポリペプチド
は残留物９．２について決定されたのと同じＮ−末端配
列をもつ。このポリペプチドの計算された分子量は６３
７７．９ダルトンである。天然ポリペプチド中のすべて
のシスティンが分子内ジスルフィド結合（シスチン）の
型体で存在するとすると、計算された分子量は６３６
９．７ダルトンになる。それ故、このポリペプチドは質
量分析計によって６３７１±２の分子量を示した残留物
９．２中で単離されたペプチドと同じであるように思わ
れる。配列番号４によってコードされたペプチドのアミ
ノ酸配列は配列番号３に示される。このポリペプチドは
残留物１１について決定されたものと同じＮ末端配列を
もつ。それ故、このペプチドは残留物１１中で単離され
た同じポリペプチドであると思われる。
【０１４８】実施例６ 哺乳動物への毒性 ここに述べたＤ．キャニテイーズから得られる全毒液５
μｌは３つの別々の試験での腹腔内注射（ＩＰ）により
マウスに対して致死量であった。処理マウスは食塩水の
対照のものとは始には区別できなかった。注射後約１０
〜１５分で、処理マウスはやや活動過剰になり、特徴あ
る跳ぶような歩行を示した。この後に短い期間協調不
調、疲労した息使いおよびケイレンが続いた。死は症候
の最初の開始から２分以内に起こった。
μｌは３つの別々の試験での腹腔内注射（ＩＰ）により
マウスに対して致死量であった。処理マウスは食塩水の
対照のものとは始には区別できなかった。注射後約１０
〜１５分で、処理マウスはやや活動過剰になり、特徴あ
る跳ぶような歩行を示した。この後に短い期間協調不
調、疲労した息使いおよびケイレンが続いた。死は症候
の最初の開始から２分以内に起こった。
【０１４９】残留物９．２、１１および１２をそれぞれ
４．２、０．９および１．２ｍｇ／ｋｇの投与量でマウ
スに腹腔内注射したが３種のペプチドのすべてについて
２４時間内に何の効果もみられなかった。
４．２、０．９および１．２ｍｇ／ｋｇの投与量でマウ
スに腹腔内注射したが３種のペプチドのすべてについて
２４時間内に何の効果もみられなかった。
【０１５０】残留物９．２を４匹のマウス（約２８ｇ）
の大脳内脳室に約３０μｇ／マウス（約１ｍｇ／ｋｇ）
の投与量で注射した。注射後４８時間までのすべての時
間においてなんらの効果も認められなかった。別のマウ
スには約１２５μｇ（４．２ｍｇ／ｋｇ）の残留物９．
２を（ＩＰ）投与したが、なんの効果もみられなかっ
た。
の大脳内脳室に約３０μｇ／マウス（約１ｍｇ／ｋｇ）
の投与量で注射した。注射後４８時間までのすべての時
間においてなんらの効果も認められなかった。別のマウ
スには約１２５μｇ（４．２ｍｇ／ｋｇ）の残留物９．
２を（ＩＰ）投与したが、なんの効果もみられなかっ
た。
【０１５１】この毒液の脊椎動物に対する毒性を特徴づ
けるために、全毒液のプールした逆相フラクションをマ
ウスについて試験した（図１）。フラクション２はタバ
コ毛虫（ＴＢＷ）活性をもつ成分を含んでいた。２５μ
ｌの全毒液（ＷＶＥ）に等しい投与量で、フラクション
１および２の腹腔内注射はなんの効果ももたなかった。
フラクション３は全毒液の注射について観察されたのと
同じ効果を生じた。これらの結果は、ディグエチア キ
ャニテイーズ毒液の成分中に存在する殺虫に有効な活性
と脊椎動物に対する活性（毒性）との間に明瞭な分裂を
示唆している。
けるために、全毒液のプールした逆相フラクションをマ
ウスについて試験した（図１）。フラクション２はタバ
コ毛虫（ＴＢＷ）活性をもつ成分を含んでいた。２５μ
ｌの全毒液（ＷＶＥ）に等しい投与量で、フラクション
１および２の腹腔内注射はなんの効果ももたなかった。
フラクション３は全毒液の注射について観察されたのと
同じ効果を生じた。これらの結果は、ディグエチア キ
ャニテイーズ毒液の成分中に存在する殺虫に有効な活性
と脊椎動物に対する活性（毒性）との間に明瞭な分裂を
示唆している。
【０１５２】実施例７ 電気生理学データ ラットの海馬スライスのシャファー・コラテリアル−Ｃ
Ａ １ピラミダル細胞シナプス（Ｓｃｈａｆｆｅｒ ｃ
ｏｌｌａｔｅｒａｌ−ＣＡ １ ｐｙｒａｍｉｄａｌ
ｃｅｌｌ ｓｙｎａｐｓｅ）におけるシナプス伝達につ
いて、ＤＫ９．２を１μＭで試験した。図２に示すデー
タは（ａ）ＤＫ９．２添加前５分間の、及び（ｂ）ＤＫ
９．２添加後１０〜２０分のあいだの、時間平均母集団
スパイク（ｔｉｍｅ−ａｖｅｒａｇｅｄ ｐｏｐｕｌａ
ｔｉｏｎ ｓｐｉｋｅ）記録を表す。これらの記録は重
ね合わすことができ、この濃度において、ＤＫ９．２は
この分析で検出しうるラットＣＮＳに活性をもたないこ
とを示している。この分析は種々の哺乳動物のイオンチ
ャンネルおよび神経伝達受容体に及ぼす種々の効果を検
出することができる（テイ・ヴイ・ダンウイドイーの、
Ｔｈｅ Ｕｓｅ ｏｆ Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｂｒａｉｎ
Ｓｌｉｃｅｓ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌ
ｏｇｙ，ｉｎ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃ
ａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏ
ｌｏｇｙ，エッチ．エム．ゲラー編集、米国ニューヨー
ク州アラン・アール・リス・インコーポレーテッド（１
９８６年）刊行）。とくに、ナトリウム・チャンネルの
不活性化を阻止する分子、たとえばある種のサソリ毒、
は母集団スパイク応答の最後の相の著しい拡大を生ぜし
める（カネダ・エム，ミヤマ Ｙ，イケモト Ｙおよび
アカイケ Ｎ．のＳｃｏｒｐｉｏｎ ｔｏｘｉｎ ｐｒ
ｏｌｏｎｇｓ ａｎ ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎｐｈａ
ｓｅ ｏｆ ｔｈｅ ｖｏｌｔａｇｅ−ｄｅｐｅｎｄｅ
ｎｔ ｓｏｄｉｕｍ ｃｕｒｒｅｎｔ ｉｎ ｒａｔ
ｉｓｏｌａｔｅｄ ｓｉｎｇｌｅ ｈｉｐｐｏｃａｍｐ
ａｌ ｎｅｕｒｏｎｓ，Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．４８７：
１９２−１９５，１９８９；アラン・エル・ミューラー
のＮａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ
ｓ，Ｉｎｃ．，ｕｎｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｂｓｅｒｖ
ａｔｉｏｎｓ）。これとは対照的に、ＤＫ９．２は１０
０倍も低い濃度でおよび昆虫ナトリウム・チャンネルの
不活性化を阻止することを示唆する方法で昆虫調製（家
バエ）において活性である。
Ａ １ピラミダル細胞シナプス（Ｓｃｈａｆｆｅｒ ｃ
ｏｌｌａｔｅｒａｌ−ＣＡ １ ｐｙｒａｍｉｄａｌ
ｃｅｌｌ ｓｙｎａｐｓｅ）におけるシナプス伝達につ
いて、ＤＫ９．２を１μＭで試験した。図２に示すデー
タは（ａ）ＤＫ９．２添加前５分間の、及び（ｂ）ＤＫ
９．２添加後１０〜２０分のあいだの、時間平均母集団
スパイク（ｔｉｍｅ−ａｖｅｒａｇｅｄ ｐｏｐｕｌａ
ｔｉｏｎ ｓｐｉｋｅ）記録を表す。これらの記録は重
ね合わすことができ、この濃度において、ＤＫ９．２は
この分析で検出しうるラットＣＮＳに活性をもたないこ
とを示している。この分析は種々の哺乳動物のイオンチ
ャンネルおよび神経伝達受容体に及ぼす種々の効果を検
出することができる（テイ・ヴイ・ダンウイドイーの、
Ｔｈｅ Ｕｓｅ ｏｆ Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｂｒａｉｎ
Ｓｌｉｃｅｓ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌ
ｏｇｙ，ｉｎ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃ
ａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏ
ｌｏｇｙ，エッチ．エム．ゲラー編集、米国ニューヨー
ク州アラン・アール・リス・インコーポレーテッド（１
９８６年）刊行）。とくに、ナトリウム・チャンネルの
不活性化を阻止する分子、たとえばある種のサソリ毒、
は母集団スパイク応答の最後の相の著しい拡大を生ぜし
める（カネダ・エム，ミヤマ Ｙ，イケモト Ｙおよび
アカイケ Ｎ．のＳｃｏｒｐｉｏｎ ｔｏｘｉｎ ｐｒ
ｏｌｏｎｇｓ ａｎ ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎｐｈａ
ｓｅ ｏｆ ｔｈｅ ｖｏｌｔａｇｅ−ｄｅｐｅｎｄｅ
ｎｔ ｓｏｄｉｕｍ ｃｕｒｒｅｎｔ ｉｎ ｒａｔ
ｉｓｏｌａｔｅｄ ｓｉｎｇｌｅ ｈｉｐｐｏｃａｍｐ
ａｌ ｎｅｕｒｏｎｓ，Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．４８７：
１９２−１９５，１９８９；アラン・エル・ミューラー
のＮａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ
ｓ，Ｉｎｃ．，ｕｎｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｂｓｅｒｖ
ａｔｉｏｎｓ）。これとは対照的に、ＤＫ９．２は１０
０倍も低い濃度でおよび昆虫ナトリウム・チャンネルの
不活性化を阻止することを示唆する方法で昆虫調製（家
バエ）において活性である。
【０１５３】実施例８ ＤＫ９．２の前駆体をコードする上流ｃＤＮＡ配列 ＤＫ９．２をコードするｃＤＮＡの上流配列を得るため
に、配列番号２に存在するＤＮＡ配列のアンチセンスス
トランド上の核酸残基＃１５９〜１７８に相応する内部
オリゴヌクレオチド、を合成した。Ｅｃｏ ＲＩ制限部
位はこのプライマーの５′末端に存在する。一本鎖毒液
腺ｃＤＮＡの１０μｌは酵素，末端デオキシヌクレオチ
ド・トランスフェラーゼ酵素を（ベセスダ・リサーチ・
ラボラトリーズ）使用してデオキシグアノシン残基によ
りその３′末端がテイル化された。１４μの酵素および
５００μＭのｄＧＴＰを含む２０μｌの反応物を３７℃
で１５分間保温した。試料をエタノールで沈殿させ、２
０μｌのＨ2 Ｏに再懸濁させた。
に、配列番号２に存在するＤＮＡ配列のアンチセンスス
トランド上の核酸残基＃１５９〜１７８に相応する内部
オリゴヌクレオチド、を合成した。Ｅｃｏ ＲＩ制限部
位はこのプライマーの５′末端に存在する。一本鎖毒液
腺ｃＤＮＡの１０μｌは酵素，末端デオキシヌクレオチ
ド・トランスフェラーゼ酵素を（ベセスダ・リサーチ・
ラボラトリーズ）使用してデオキシグアノシン残基によ
りその３′末端がテイル化された。１４μの酵素および
５００μＭのｄＧＴＰを含む２０μｌの反応物を３７℃
で１５分間保温した。試料をエタノールで沈殿させ、２
０μｌのＨ2 Ｏに再懸濁させた。
【０１５４】遺伝子特異性プライマーのＤＮＡ配列上流
を、下流／成熟毒物ｃＤＮＡ配列に使用したものと同様
のアンカーＰＣＲ技術を使用して増幅させた。増幅反応
物はそのセンス（ａ ｄ（ｃ）テイルプライマー）およ
びアンチセンス プライマーを２μＭ濃度で、１００μ
Ｍのそれぞれのデオキシヌクレオチド トリホスフェー
ト、および４単位の熱安定組換えＴａｇポリメラーゼを
含んでいた。温度プロフィールは次のとおりであった。
９４℃で２分、３７℃で２分、３７℃で１分。このサイ
クルを２回繰り返し、次いでプログラムを第２工程で５
４℃の昇温アニーリング温度をくみ入れる同じプロフィ
ールに切り換えた。このサイクルを３２回繰り返した。
を、下流／成熟毒物ｃＤＮＡ配列に使用したものと同様
のアンカーＰＣＲ技術を使用して増幅させた。増幅反応
物はそのセンス（ａ ｄ（ｃ）テイルプライマー）およ
びアンチセンス プライマーを２μＭ濃度で、１００μ
Ｍのそれぞれのデオキシヌクレオチド トリホスフェー
ト、および４単位の熱安定組換えＴａｇポリメラーゼを
含んでいた。温度プロフィールは次のとおりであった。
９４℃で２分、３７℃で２分、３７℃で１分。このサイ
クルを２回繰り返し、次いでプログラムを第２工程で５
４℃の昇温アニーリング温度をくみ入れる同じプロフィ
ールに切り換えた。このサイクルを３２回繰り返した。
【０１５５】アンカーＰＣＲは、エチジウム ブロマイ
ドの存在下で４％アガロース・ゲル上に示めされるよう
に、３８０ｂｐ断片に生じた。この反応生成物を、イー
コリイ ＤＮＡポリメラーゼＩ（モレキュラー・バイ
オロジー・リソースズ、マジソン，ＷＩ）の大きな（Ｋ
ｌｅｎｏｗ）断片を使用して、末端部に充填し、エタノ
ールの添加によって沈澱させた。この生成物を再懸濁さ
せて制限酵素ＥｃｏＲＩで消化させた。この消化した断
片を酵素Ｔ４キナーゼにより１ｍＭのＡＴＰの存在下に
キネート化し、次いでＥｃｏＲＩ及びＥｃｏＲＶ消化ｐ
ＢルエスクリプスＫＳベクター（ＥｃｏＲＶ ｄｉｇｅ
ｓｔｅｄ ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔａｋｓ ｖｅｃｔｏ
ｒ）に接合させた。シーケナーゼ２．０（ＵＳＢ）を使
用する２本鎖ＤＮＡ配列化（シークエンシング）によっ
てサプクローンを分析した。
ドの存在下で４％アガロース・ゲル上に示めされるよう
に、３８０ｂｐ断片に生じた。この反応生成物を、イー
コリイ ＤＮＡポリメラーゼＩ（モレキュラー・バイ
オロジー・リソースズ、マジソン，ＷＩ）の大きな（Ｋ
ｌｅｎｏｗ）断片を使用して、末端部に充填し、エタノ
ールの添加によって沈澱させた。この生成物を再懸濁さ
せて制限酵素ＥｃｏＲＩで消化させた。この消化した断
片を酵素Ｔ４キナーゼにより１ｍＭのＡＴＰの存在下に
キネート化し、次いでＥｃｏＲＩ及びＥｃｏＲＶ消化ｐ
ＢルエスクリプスＫＳベクター（ＥｃｏＲＶ ｄｉｇｅ
ｓｔｅｄ ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔａｋｓ ｖｅｃｔｏ
ｒ）に接合させた。シーケナーゼ２．０（ＵＳＢ）を使
用する２本鎖ＤＮＡ配列化（シークエンシング）によっ
てサプクローンを分析した。
【０１５６】成熟ペプチド毒素の上流領域に含まれるｃ
ＤＮＡ配列の翻訳は前駆体タンパクとして合成されるべ
きＤＫ９．２を明らかにした。上流ｃＤＮＡ配列は配列
番号６に示された。コードされた前駆体タンパクはシグ
ナル配列とプロペプチド領域（配列番号７）を含む。こ
れらは削除されてクモ毒液から単離され得る成熟ペプチ
ド毒素を生ずる。シグナル配列とプロペプチド配列はク
モの中でのＤＫ９．２の産生と分泌に必要であると考え
られる。
ＤＮＡ配列の翻訳は前駆体タンパクとして合成されるべ
きＤＫ９．２を明らかにした。上流ｃＤＮＡ配列は配列
番号６に示された。コードされた前駆体タンパクはシグ
ナル配列とプロペプチド領域（配列番号７）を含む。こ
れらは削除されてクモ毒液から単離され得る成熟ペプチ
ド毒素を生ずる。シグナル配列とプロペプチド配列はク
モの中でのＤＫ９．２の産生と分泌に必要であると考え
られる。
【０１５７】実施例９ 組換えバキュロウイルスの構築 鱗翅類のシグナル配列（ＪｏｎｅｓらのＭｏｌｅｃｕｌ
ａｒ ＣｌｏｎｉｎｇＲｅｇｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ
Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆａ Ｈｅｍ
ｏｃｙａｎｉｎ−Ｒｅｌａｔｅｄ Ｊｕｖｅｎｉｌｅ
Ｈｏｒｍｏｎｅ−Ｓｕｐｒｅｓｓｉｂｌｅ Ｐｒｏｔｅ
ｉｍ ｆｒｏｍ Ｉｎｓｅｃｔ Ｈｅｍｏｌｙｍｐｈ
ｓ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：８５９６（１９
９０））を、Ｒｏｓｓｉらの方法（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．２５７：９２２６（１９８２））を使用して、２
つの合成オリゴヌクレオチドから構築した。２つの４８
マーズをイオン交換クロマトグラフィーによって精製し
た。これらの２つのオリゴヌクレオチドは、それらの
３′末端において、相補的配列の１１個の塩基対を共有
する。この配列を４個のデオキシリボヌクレオシド・ト
リホスフェートおよびＤＮＡ−ポリメラーゼＩのクレノ
ウフラグメントの存在下でアンニーリングするとき、２
本鎖の生成物が合成された。反応生成物をヒドロキシル
アパタイト・クロマトグラフィーを使用して精製し、２
本鎖ＤＮＡ分子をＡａｔｌｌ、クローン化されたＤＫ
９．２ｃＤＮＡのこの配列の上流をｐＫＳ−ＤＫ９ｃに
挿入するのに適した制限酵素で消化させた。サブクロー
ンをシグナル配列の挿入のためにスクリーニングし、そ
してＤＮＡ配列化によって評価した。
ａｒ ＣｌｏｎｉｎｇＲｅｇｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ
Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆａ Ｈｅｍ
ｏｃｙａｎｉｎ−Ｒｅｌａｔｅｄ Ｊｕｖｅｎｉｌｅ
Ｈｏｒｍｏｎｅ−Ｓｕｐｒｅｓｓｉｂｌｅ Ｐｒｏｔｅ
ｉｍ ｆｒｏｍ Ｉｎｓｅｃｔ Ｈｅｍｏｌｙｍｐｈ
ｓ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：８５９６（１９
９０））を、Ｒｏｓｓｉらの方法（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．２５７：９２２６（１９８２））を使用して、２
つの合成オリゴヌクレオチドから構築した。２つの４８
マーズをイオン交換クロマトグラフィーによって精製し
た。これらの２つのオリゴヌクレオチドは、それらの
３′末端において、相補的配列の１１個の塩基対を共有
する。この配列を４個のデオキシリボヌクレオシド・ト
リホスフェートおよびＤＮＡ−ポリメラーゼＩのクレノ
ウフラグメントの存在下でアンニーリングするとき、２
本鎖の生成物が合成された。反応生成物をヒドロキシル
アパタイト・クロマトグラフィーを使用して精製し、２
本鎖ＤＮＡ分子をＡａｔｌｌ、クローン化されたＤＫ
９．２ｃＤＮＡのこの配列の上流をｐＫＳ−ＤＫ９ｃに
挿入するのに適した制限酵素で消化させた。サブクロー
ンをシグナル配列の挿入のためにスクリーニングし、そ
してＤＮＡ配列化によって評価した。
【０１５８】ＤＮＡシークエンシングは２つのｃＤＮＡ
配列の間のイン−フレーム融合を確認した。全合成遺伝
子構造がｐＢｌｕｅＢａｃ，バキュロウイルス伝達ベク
ター，のＮｈｅＩ部位の中にクローニングするために実
施され適合された〔Ｖｉａｌａｒｄ，Ｊ．らのＪ．Ｖｉ
ｒｏｌｏｇｙ ６４；３−５０（１９９０）〕。サブク
ローンが構築物の正確な挿入を確認するために配列され
た。プラスミドＷＲ９のＤＮＡ配列化はバキュロウイル
ス伝導ベクターｐＢｌｕｅＢａｃ中の合成された“カタ
スパイダー（ｃａｔｅｒｓｐｉｄｅｒ）”遺伝子（ｐｒ
ｅＤＫ９．２）の挿入を確認した（図３）。ｐＢｌｕｅ
Ｂａｃベクターの使用は、我々の組換え遺伝子のバキュ
ロウイルス・ゲノム中への挿入はβ−ガラクトジダーゼ
の共発現を伴い、指示培地上で成長するときの色調変化
によって検出可能であるので、スクリーニング法を促進
する。
配列の間のイン−フレーム融合を確認した。全合成遺伝
子構造がｐＢｌｕｅＢａｃ，バキュロウイルス伝達ベク
ター，のＮｈｅＩ部位の中にクローニングするために実
施され適合された〔Ｖｉａｌａｒｄ，Ｊ．らのＪ．Ｖｉ
ｒｏｌｏｇｙ ６４；３−５０（１９９０）〕。サブク
ローンが構築物の正確な挿入を確認するために配列され
た。プラスミドＷＲ９のＤＮＡ配列化はバキュロウイル
ス伝導ベクターｐＢｌｕｅＢａｃ中の合成された“カタ
スパイダー（ｃａｔｅｒｓｐｉｄｅｒ）”遺伝子（ｐｒ
ｅＤＫ９．２）の挿入を確認した（図３）。ｐＢｌｕｅ
Ｂａｃベクターの使用は、我々の組換え遺伝子のバキュ
ロウイルス・ゲノム中への挿入はβ−ガラクトジダーゼ
の共発現を伴い、指示培地上で成長するときの色調変化
によって検出可能であるので、スクリーニング法を促進
する。
【０１５９】ｐｒｅＤＫ９．２をコードする組換えバキ
ュロウイルスは、１μｇのＡｃＭＮＰＶウイルスＤＮＡ
と２μｇのプラスミドＤＮＡとの混合物を用いて、Ｓｕ
ｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈのプロトコール（“Ａ Ｍ
ａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｂａｃｕ
ｌｏｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ Ｉｎｓｅｃ
ｔ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ
ｓ”，Ｔｅｘａｓ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｅｘｐ
ｅｒｉｍｅｎｔ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ Ｎｏ．１５５５，
１９８８）を使用することにより、スポドプテラ フル
ジペルダ（Ｓｐｃｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄ
ａ）菌株Ｓｆ９（ＡＴＣＣ＃ ＣＲＬ１７１１）細胞の
転写によって産生された。トランスフェクションの後４
日後に、細胞上澄の希釈物を、５×１０6 Ｓｆ９細胞で
接種された１００ｍｍプレート上に斑点状に付着させ、
そして基質としてＢｌｕｏ−ｇａｌ（ギブソ ＢＲＬ，
ガイゼルバーグ，ＭＤ）を含有するアガロースで覆っ
た。５〜６日以内に、組換え体はその淡青色によって検
出可能であった。パスツール・ピペットを使用してプラ
ークを拾い、媒質の１ｍｌに溶離させた。この溶離液を
使用して、Ｔ−２５フラスコ中に接種されたＳｆ９細胞
を再感染させた。感染後３日の後に、６種の異なった単
離物から小量の上澄液を集めて、ウイルスＤＮＡの製造
に使用した。ポリヘドリン遺伝子を包囲する領域からの
ウイルス特異性プライマーを使用するＰＣＲ増幅によ
り、６種のウイルス単離物のうちの５種が適切な大きさ
の挿入物を含み且つ野生型の汚染がないことを確認し
た。組換えウイルスの滴定ストックを次いで生体内およ
び試験管内の試験のために製造した。
ュロウイルスは、１μｇのＡｃＭＮＰＶウイルスＤＮＡ
と２μｇのプラスミドＤＮＡとの混合物を用いて、Ｓｕ
ｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈのプロトコール（“Ａ Ｍ
ａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｂａｃｕ
ｌｏｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ Ｉｎｓｅｃ
ｔ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ
ｓ”，Ｔｅｘａｓ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｅｘｐ
ｅｒｉｍｅｎｔ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ Ｎｏ．１５５５，
１９８８）を使用することにより、スポドプテラ フル
ジペルダ（Ｓｐｃｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄ
ａ）菌株Ｓｆ９（ＡＴＣＣ＃ ＣＲＬ１７１１）細胞の
転写によって産生された。トランスフェクションの後４
日後に、細胞上澄の希釈物を、５×１０6 Ｓｆ９細胞で
接種された１００ｍｍプレート上に斑点状に付着させ、
そして基質としてＢｌｕｏ−ｇａｌ（ギブソ ＢＲＬ，
ガイゼルバーグ，ＭＤ）を含有するアガロースで覆っ
た。５〜６日以内に、組換え体はその淡青色によって検
出可能であった。パスツール・ピペットを使用してプラ
ークを拾い、媒質の１ｍｌに溶離させた。この溶離液を
使用して、Ｔ−２５フラスコ中に接種されたＳｆ９細胞
を再感染させた。感染後３日の後に、６種の異なった単
離物から小量の上澄液を集めて、ウイルスＤＮＡの製造
に使用した。ポリヘドリン遺伝子を包囲する領域からの
ウイルス特異性プライマーを使用するＰＣＲ増幅によ
り、６種のウイルス単離物のうちの５種が適切な大きさ
の挿入物を含み且つ野生型の汚染がないことを確認し
た。組換えウイルスの滴定ストックを次いで生体内およ
び試験管内の試験のために製造した。
【０１６０】実施例１０ 組換えＤＫ９．２の生物学的活性 血清含有組織培養媒質から精製した組換え残留物９．２
（ＤＫ９．２）の生物学的活性を中間形態のＴＢＷ幼虫
で試験した。試験溶液のＡ280 を基準にして投与量を計
算した。１６μｇ／ｇの投与量で、組換え物質は注射後
２時間以内で著しい筋肉けいれんを起こした。これらの
幼虫の半数（３又は６匹）は麻痺して４８時間後にひど
く収縮したが、他の３匹の幼虫は依然として僅少から中
程度までの筋肉ケイレンを示しつづけた。８μｇ／ｇの
投与量でも３〜６匹の幼虫は麻痺したが、５．２μｇ／
ｇの投与量では２〜６匹の幼虫が麻痺した。これらの結
果は組換えＤＫ９．２が生物学的に活性であることを確
認するものである。
（ＤＫ９．２）の生物学的活性を中間形態のＴＢＷ幼虫
で試験した。試験溶液のＡ280 を基準にして投与量を計
算した。１６μｇ／ｇの投与量で、組換え物質は注射後
２時間以内で著しい筋肉けいれんを起こした。これらの
幼虫の半数（３又は６匹）は麻痺して４８時間後にひど
く収縮したが、他の３匹の幼虫は依然として僅少から中
程度までの筋肉ケイレンを示しつづけた。８μｇ／ｇの
投与量でも３〜６匹の幼虫は麻痺したが、５．２μｇ／
ｇの投与量では２〜６匹の幼虫が麻痺した。これらの結
果は組換えＤＫ９．２が生物学的に活性であることを確
認するものである。
【０１６１】実施例１１ 組換えバキュロウイルス−生体内試験 Ａ．ＤＫ９．２組換え核ポリヒドロシス・ウイルス（ｖ
ＡＣＤＫ９．２）の生物学的活性
ＡＣＤＫ９．２）の生物学的活性
【０１６２】１）ウイルス調製物の滴定 ウイルス・ストックをプラーク分析法（ルリア（Ｌｕｒ
ｉａ）らの“Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ”，１
９７８，ｐｐ２１−３２；ジョン・ウイリイ・アンド・
サンズ，ニューヨークによって滴定した。滴定は単位容
量当りのプラーク形成単位（ＰＦＵ）の単位で表現され
た。これに対して投与量はＰＦＵ／幼虫として表現され
た。ＩＰＦＵは調製物、すべてのヴィリオンが１つの宿
主細胞（ルリアら、の上記文献）を感染しうる調製物、
における１つの成熟ヴィリオンウイルス）の機能上の当
量である。たとえば、１０３宿主細胞は１０６ＰＦＵ／
ｍｌ（すなわち１０３ＰＦＵ／μｌ）を含むウイルス調
製物のそれぞれのマイクロリットルによって感染するこ
とができた。
ｉａ）らの“Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ”，１
９７８，ｐｐ２１−３２；ジョン・ウイリイ・アンド・
サンズ，ニューヨークによって滴定した。滴定は単位容
量当りのプラーク形成単位（ＰＦＵ）の単位で表現され
た。これに対して投与量はＰＦＵ／幼虫として表現され
た。ＩＰＦＵは調製物、すべてのヴィリオンが１つの宿
主細胞（ルリアら、の上記文献）を感染しうる調製物、
における１つの成熟ヴィリオンウイルス）の機能上の当
量である。たとえば、１０３宿主細胞は１０６ＰＦＵ／
ｍｌ（すなわち１０３ＰＦＵ／μｌ）を含むウイルス調
製物のそれぞれのマイクロリットルによって感染するこ
とができた。
【０１６３】２）バイオ分析 ＤＫ９．２組換え核ポリヒドロシス・ウイルス（ｒＮＰ
Ｖ）の生物学的活性ｖＡｃＤＫ９．２は一連の投与量応
答分析において試験した。これらの分析において、ＴＢ
Ｗ（幼虫）（平均質量約２５０ｍｇ）に組織培養培地中
のｖＡｃＤＫ９．２を種々の投与量で、又は組織培養培
地単独のみを注射した（ｎ＝１０）。実施例１に記載の
毒素注射実験のように、処理した幼虫を食飼の供給を伴
う個々の容器に保持して周期的に観察した。２つのこの
ような注射分析の組合せ結果を表IIに示す。５０００Ｐ
ＦＵ／幼虫およびそれ以上の投与量において、ＤＫ９．
２の毒性の代表的症候（筋肉の震え、および麻痺）が感
染後約２４時間で現れはじめ、そして４８時間以内に少
なくとも半分の試験昆虫が無能になった（すなわち麻痺
または部分的に麻痺した）。試験した最低投与量、すな
わち５０ＰＦＵ／幼虫、は４８時間以内に震えとケイレ
ンを誘発させ、そして９６〜１２０時間内に幼虫の少な
くとも７０％が無能になった。 Ｂ．野生型ＮＰＶと比較したｖＡｃＤＫ９．２の生物学
的活性 更に研究を行って、その親の野生型ウイルス、オートグ
ラファ・カルフォルニアＮＰＶ（ｗｔ−ＡｃＭＮＰＶ）
との比較においてｖＡｃＤＫ９．２の効力を決定した。
これらの分析の目的はｖＡｃＤＫ９．２に感染した幼虫
が等しい投与量のｗｔ−ＡｃＭＮＰＶに感染した幼虫よ
りもより少ない時間で無能になるか否かを決定すること
であった。
Ｖ）の生物学的活性ｖＡｃＤＫ９．２は一連の投与量応
答分析において試験した。これらの分析において、ＴＢ
Ｗ（幼虫）（平均質量約２５０ｍｇ）に組織培養培地中
のｖＡｃＤＫ９．２を種々の投与量で、又は組織培養培
地単独のみを注射した（ｎ＝１０）。実施例１に記載の
毒素注射実験のように、処理した幼虫を食飼の供給を伴
う個々の容器に保持して周期的に観察した。２つのこの
ような注射分析の組合せ結果を表IIに示す。５０００Ｐ
ＦＵ／幼虫およびそれ以上の投与量において、ＤＫ９．
２の毒性の代表的症候（筋肉の震え、および麻痺）が感
染後約２４時間で現れはじめ、そして４８時間以内に少
なくとも半分の試験昆虫が無能になった（すなわち麻痺
または部分的に麻痺した）。試験した最低投与量、すな
わち５０ＰＦＵ／幼虫、は４８時間以内に震えとケイレ
ンを誘発させ、そして９６〜１２０時間内に幼虫の少な
くとも７０％が無能になった。 Ｂ．野生型ＮＰＶと比較したｖＡｃＤＫ９．２の生物学
的活性 更に研究を行って、その親の野生型ウイルス、オートグ
ラファ・カルフォルニアＮＰＶ（ｗｔ−ＡｃＭＮＰＶ）
との比較においてｖＡｃＤＫ９．２の効力を決定した。
これらの分析の目的はｖＡｃＤＫ９．２に感染した幼虫
が等しい投与量のｗｔ−ＡｃＭＮＰＶに感染した幼虫よ
りもより少ない時間で無能になるか否かを決定すること
であった。
【０１６４】１）注射分析 ｖＡｃＤＫ９．２およびｗｔ−ＡｃＭＮＰＶの生物学的
活性を一連の注射分析において比較した。最終齢のタバ
コ・毛虫（ヘリオシス ビレスセンス）幼虫、キャベツ
・しゃくとりむし（トリコプルシア ニ）幼虫、および
ビートよとうむし（スポドプテラ エグジグア）幼虫に
５×１０5 ＰＦＵ／幼虫のｖＡｃＤＫ９．２またはｗｔ
−ＡｃＭＮＰＶを注射した。コントロール幼虫には組織
培養培地を注射した。表 IIIに要約した結果は、ｖＡｃ
ＤＫ９．２が上記３種のすべてにおいてｗｔ−ＡｃＭＮ
ＰＶよりも実質的により効果的であることを実証してい
る。
活性を一連の注射分析において比較した。最終齢のタバ
コ・毛虫（ヘリオシス ビレスセンス）幼虫、キャベツ
・しゃくとりむし（トリコプルシア ニ）幼虫、および
ビートよとうむし（スポドプテラ エグジグア）幼虫に
５×１０5 ＰＦＵ／幼虫のｖＡｃＤＫ９．２またはｗｔ
−ＡｃＭＮＰＶを注射した。コントロール幼虫には組織
培養培地を注射した。表 IIIに要約した結果は、ｖＡｃ
ＤＫ９．２が上記３種のすべてにおいてｗｔ−ＡｃＭＮ
ＰＶよりも実質的により効果的であることを実証してい
る。
【０１６５】２）飼育分析 摂取によるｖＡｃＤＫ９．２の活性を試験するために、
このポリヘドリン・ネガテイブ（ｐｏｌ- ）組換え体を
経口感染の形体で製造することが必要であった。これ
は、経口感染ｐｏｌ−組換え体ＮＰＶｓについての他の
研究者によって報告された方法（たとえば、クロダらの
１９８９年のＪ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６３（４）：１６
７７−１６８５、およびプライスらの１９８９年のＰｒ
ｏｃ Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８６：１４５３−
１４５６）を使用して、ｖＡｃＤＫ９．２とｗｔ−Ａｃ
ＭＮＰＶとの共吸蔵によって達成された。ＳＦ−９細胞
を、ｖＡｃＤＫ９．２およびＡｃＭＮＰＶによりそれぞ
れ１０および２の感染倍率（ＭＯＩ）で同時に感染させ
た。同時に、ＳＦ−９の第２グループの細胞をｗｔ−Ａ
ｃＭＮＰＶ単独（ＭＯＩ＝２）で感染させた。感染後５
日目に、細胞封入体を細胞破壊および分画遠心（たとえ
ばＷｏｏｄ，１９８０，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １０４：３
９２−３９９）によって収穫した。細胞封入体を血球計
でかぞえた。ｖＡｃＤＫ９．２とｗｔ−ＡｃＭＮＰＶと
に共感染した細胞はｗｔ−ＡｃＭＮＰＶ単独に感染した
細胞よりもより少なく且つより小さな細胞封入体を生じ
た。混合感染からのポリヘドラル細胞含有物（ＰＩＢ）
の収率は４．６ＰＩＢ／細胞であるのに対して、純ｗｔ
−ＡｃＭＮＰＶ感染からの収率は３３．３ＰＩＢ／細胞
であった。
このポリヘドリン・ネガテイブ（ｐｏｌ- ）組換え体を
経口感染の形体で製造することが必要であった。これ
は、経口感染ｐｏｌ−組換え体ＮＰＶｓについての他の
研究者によって報告された方法（たとえば、クロダらの
１９８９年のＪ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６３（４）：１６
７７−１６８５、およびプライスらの１９８９年のＰｒ
ｏｃ Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８６：１４５３−
１４５６）を使用して、ｖＡｃＤＫ９．２とｗｔ−Ａｃ
ＭＮＰＶとの共吸蔵によって達成された。ＳＦ−９細胞
を、ｖＡｃＤＫ９．２およびＡｃＭＮＰＶによりそれぞ
れ１０および２の感染倍率（ＭＯＩ）で同時に感染させ
た。同時に、ＳＦ−９の第２グループの細胞をｗｔ−Ａ
ｃＭＮＰＶ単独（ＭＯＩ＝２）で感染させた。感染後５
日目に、細胞封入体を細胞破壊および分画遠心（たとえ
ばＷｏｏｄ，１９８０，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １０４：３
９２−３９９）によって収穫した。細胞封入体を血球計
でかぞえた。ｖＡｃＤＫ９．２とｗｔ−ＡｃＭＮＰＶと
に共感染した細胞はｗｔ−ＡｃＭＮＰＶ単独に感染した
細胞よりもより少なく且つより小さな細胞封入体を生じ
た。混合感染からのポリヘドラル細胞含有物（ＰＩＢ）
の収率は４．６ＰＩＢ／細胞であるのに対して、純ｗｔ
−ＡｃＭＮＰＶ感染からの収率は３３．３ＰＩＢ／細胞
であった。
【０１６６】共吸蔵ｖＡｃＤＫ９．２の生物学的活性を
ｗｔ−ＡｃＭＮＰＶのそれとの比較において評価するた
めに、食餌取り込み分析を使用した。混合されたまたは
野生型ＰＩＢを１０5 ＰＩＢ／ｇ食餌の濃度で非寒天基
昆虫食餌中に取り込んだ。食餌は小さい容器に分配し、
次いで新生児ＴＢＷ幼虫に食餌させた（容器当り１匹、
ｎ＝２０）。対照幼虫には非処理食餌の同量を与えた。
幼虫にエイデイ・リビタム（ａｄ ｌｉｂｉｔｕｍ）を
食餌させ、症状の発達を周期的に観察した。結果を表II
に示す。最初の４８時間には効果は認められなかった
が、７２時間後には混合ＰＩＢを与えた幼虫の５０％以
上は麻痺した。野生種ウイルスはこの時点で効果をもた
なかった。９６時間後に、組換え処理幼虫の９０％以上
は麻痺したのに対して、野生種処理幼虫はその１０％の
みが死んだか又は死にかかったにすぎなかった。１００
時間後には、組換え処理幼虫の１００％が、ｗｔ−Ａｃ
ＭＮＰＣで処理した場合の７５％に比べて、死んだか死
にかかった。従って、飼育分析においても、注射分析に
おけるように、ｖＡｃＤＫ９．２処理幼虫はｗｔ−Ａｃ
ＭＮＰＶ処理幼虫よりも著しく短い時間で無能になっ
た。
ｗｔ−ＡｃＭＮＰＶのそれとの比較において評価するた
めに、食餌取り込み分析を使用した。混合されたまたは
野生型ＰＩＢを１０5 ＰＩＢ／ｇ食餌の濃度で非寒天基
昆虫食餌中に取り込んだ。食餌は小さい容器に分配し、
次いで新生児ＴＢＷ幼虫に食餌させた（容器当り１匹、
ｎ＝２０）。対照幼虫には非処理食餌の同量を与えた。
幼虫にエイデイ・リビタム（ａｄ ｌｉｂｉｔｕｍ）を
食餌させ、症状の発達を周期的に観察した。結果を表II
に示す。最初の４８時間には効果は認められなかった
が、７２時間後には混合ＰＩＢを与えた幼虫の５０％以
上は麻痺した。野生種ウイルスはこの時点で効果をもた
なかった。９６時間後に、組換え処理幼虫の９０％以上
は麻痺したのに対して、野生種処理幼虫はその１０％の
みが死んだか又は死にかかったにすぎなかった。１００
時間後には、組換え処理幼虫の１００％が、ｗｔ−Ａｃ
ＭＮＰＣで処理した場合の７５％に比べて、死んだか死
にかかった。従って、飼育分析においても、注射分析に
おけるように、ｖＡｃＤＫ９．２処理幼虫はｗｔ−Ａｃ
ＭＮＰＶ処理幼虫よりも著しく短い時間で無能になっ
た。
【０１６７】
【表２】
【０１６８】
【表３】
【０１６９】実施例１２ ＤＫ９．２をコードする遺伝子のプロモーター ＤＫ９．２をコードする遺伝子の制御因子を評価するた
めに、ゲノム・ライブラリーを作製した。ハーマン（Ｈ
ｅｒｒｍａｎｎ）およびフリシャウフ（Ｆｒｉｓｃｈａ
ｕｆ）から適用したプロトコール（“Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．１５２，アカ
デミック・プレス，インコーポレーテッド刊行，ｐｐ１
８０−１８３）を使用して、クモからＤＮＡを調製し
た。このＤＮＡをＳａｕ ３Ａにより部分的に消化さ
せ、ＴＬＳ−５５ローター（ベックマン・カンパニー，
リミテッド）を用いて２５，０００ｒｐｍで１６時間、
１０％−３８％ショー糖密度勾配の遠心分離によって分
画化した。２５−４５ｋｂのプールしたＤＮＡフラクシ
ョンを調製して、部分充填法を使用してＸｈｏ Ｉ消化
コスミド・ベクターに挿入した。結合性混合物の１／４
をＧｉｇａｐａｋ ｇｏｌｄ（登録商標）（Ｓｔｒａｔ
ａｇｅ，ＬａＪｏｌｌａ ＣＡ）を使用してファージ粒
子に充填し、形質転換後にクモＤＮＡの３×１０9 ｂｐ
以上の等価物をえた。このライブラリーを２５個の１５
０ｍｍペトリ皿上に平板にし、放射線標識化ＤＮＡでプ
ローブするためにナイロン・フィルター上にのせた。デ
ィグエチア・ゲノム・ライブラリーのコロニイリフツ
を、ＤＫ９．２をコードする放射性標識化ｃＤＮＡおよ
びアミノ末端、カルボキシ末端および内部プローブをコ
ードする端部標識化オリゴヌクレオチドを用いる系でス
クリーニングした。１つのコスミドｃＤＫ２はプローブ
のすべてでハイブリッド化された。Ｅｃｏ ＲＩ消化コ
スミドのＤＮＡのサザソブロットは３．０ｋｂ断片が内
部およびＣ−末端プローブの両者とハイブリッド化する
ことを示した。すでに同定された三つのプライマーを用
いるコスミドｃＤＫ２の二本鎖配列はＤＫ９．２に対す
る遺伝子の単離を確認した。そしてこの配列は、（ディ
グエチアの殺虫に有効な全てのペプチドに高度の相同性
を持つ）アミノ末端オリゴヌクレオチドがコスミドＤＮ
Ａ上の複合部位で始動するので、このファミリーからの
他の一つの（又は他の）遺伝子がＤＮＡの同一隣接片上
に存在し得る可能性を示唆する。
めに、ゲノム・ライブラリーを作製した。ハーマン（Ｈ
ｅｒｒｍａｎｎ）およびフリシャウフ（Ｆｒｉｓｃｈａ
ｕｆ）から適用したプロトコール（“Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．１５２，アカ
デミック・プレス，インコーポレーテッド刊行，ｐｐ１
８０−１８３）を使用して、クモからＤＮＡを調製し
た。このＤＮＡをＳａｕ ３Ａにより部分的に消化さ
せ、ＴＬＳ−５５ローター（ベックマン・カンパニー，
リミテッド）を用いて２５，０００ｒｐｍで１６時間、
１０％−３８％ショー糖密度勾配の遠心分離によって分
画化した。２５−４５ｋｂのプールしたＤＮＡフラクシ
ョンを調製して、部分充填法を使用してＸｈｏ Ｉ消化
コスミド・ベクターに挿入した。結合性混合物の１／４
をＧｉｇａｐａｋ ｇｏｌｄ（登録商標）（Ｓｔｒａｔ
ａｇｅ，ＬａＪｏｌｌａ ＣＡ）を使用してファージ粒
子に充填し、形質転換後にクモＤＮＡの３×１０9 ｂｐ
以上の等価物をえた。このライブラリーを２５個の１５
０ｍｍペトリ皿上に平板にし、放射線標識化ＤＮＡでプ
ローブするためにナイロン・フィルター上にのせた。デ
ィグエチア・ゲノム・ライブラリーのコロニイリフツ
を、ＤＫ９．２をコードする放射性標識化ｃＤＮＡおよ
びアミノ末端、カルボキシ末端および内部プローブをコ
ードする端部標識化オリゴヌクレオチドを用いる系でス
クリーニングした。１つのコスミドｃＤＫ２はプローブ
のすべてでハイブリッド化された。Ｅｃｏ ＲＩ消化コ
スミドのＤＮＡのサザソブロットは３．０ｋｂ断片が内
部およびＣ−末端プローブの両者とハイブリッド化する
ことを示した。すでに同定された三つのプライマーを用
いるコスミドｃＤＫ２の二本鎖配列はＤＫ９．２に対す
る遺伝子の単離を確認した。そしてこの配列は、（ディ
グエチアの殺虫に有効な全てのペプチドに高度の相同性
を持つ）アミノ末端オリゴヌクレオチドがコスミドＤＮ
Ａ上の複合部位で始動するので、このファミリーからの
他の一つの（又は他の）遺伝子がＤＮＡの同一隣接片上
に存在し得る可能性を示唆する。
【０１７０】ＤＫ９．２の遺伝子のプロモーター領域に
接近するために、我々はセンスストランド上のプレ／シ
グナル配列に相当するオリゴヌクレオチドを合成した。
このプライマーと我々の遺伝子特異性プライマーとの間
のＰＣＲ増幅はシグナル配列がアミノ末端エキソンの
３，０００ｂｐ以上の上流あることを遺伝地図にした。
次いでアンチセンスストランドのプライマーを次いで使
用して、シグナルペプチドをコードするｃＤＮＡの５′
末端の直接上流の領域にゲノムＤＮＡを配列した。
接近するために、我々はセンスストランド上のプレ／シ
グナル配列に相当するオリゴヌクレオチドを合成した。
このプライマーと我々の遺伝子特異性プライマーとの間
のＰＣＲ増幅はシグナル配列がアミノ末端エキソンの
３，０００ｂｐ以上の上流あることを遺伝地図にした。
次いでアンチセンスストランドのプライマーを次いで使
用して、シグナルペプチドをコードするｃＤＮＡの５′
末端の直接上流の領域にゲノムＤＮＡを配列した。
【０１７１】ゲノムＤＮＡ上のシグナル配列の上流に配
列するＤＮＡは開始メチオニンコードンからｂｐ−１１
における他の一つのイントロンを示唆した。前駆体ＤＫ
９．２ｃＤＮＡの５′領域に相当するオリゴヌクレオチ
ドプライマーを合成して、ＰＣＲ反応を始動させるのに
使用し、転写と翻訳の開始部位間にどのくらい大きな介
在配列が存在するかを決定した。１，０００塩基対の増
幅生成物はイントロンの存在を確認し、その大きさの推
定を与えた。（ｃＤＮＡの５′末端と同等であると仮定
される）転写開始までのゲノムＤＮＡ上流のＤＮＡ配列
はプロモーターの存在を示さない。プロモーター領域の
ＤＮＡ配列は配列の番号８中に存在する。この想像上の
プロモーターは、翻訳開始部位の直接上流領域中の他の
真核プロモーター中に一般に存在する多くの本質的な制
御シグナルを含む。このプロモーターまたはこのプロモ
ーターの区分を使用して、細菌、ウイルス、植物または
動物中の他の真核遺伝子の転写／翻訳を行うことができ
る。
列するＤＮＡは開始メチオニンコードンからｂｐ−１１
における他の一つのイントロンを示唆した。前駆体ＤＫ
９．２ｃＤＮＡの５′領域に相当するオリゴヌクレオチ
ドプライマーを合成して、ＰＣＲ反応を始動させるのに
使用し、転写と翻訳の開始部位間にどのくらい大きな介
在配列が存在するかを決定した。１，０００塩基対の増
幅生成物はイントロンの存在を確認し、その大きさの推
定を与えた。（ｃＤＮＡの５′末端と同等であると仮定
される）転写開始までのゲノムＤＮＡ上流のＤＮＡ配列
はプロモーターの存在を示さない。プロモーター領域の
ＤＮＡ配列は配列の番号８中に存在する。この想像上の
プロモーターは、翻訳開始部位の直接上流領域中の他の
真核プロモーター中に一般に存在する多くの本質的な制
御シグナルを含む。このプロモーターまたはこのプロモ
ーターの区分を使用して、細菌、ウイルス、植物または
動物中の他の真核遺伝子の転写／翻訳を行うことができ
る。
【０１７２】実施例１３ ＤＫ９．２の作用の様式に関連のある神経生理学的研究 ＤＫ９．２の作用の様式を明らかにするための神経生理
学的研究を行った。蛆の神経筋肉接合部および末梢神経
からの記録は、ＤＫ９．２がテトロドトキシンによるブ
ロックに敏感な神経中に繰り返しのバースト（ｂｕｒｓ
ｔ）放電を誘発することを示す。すなわち、この毒の作
用の部位は恐らく神経膜の電圧感受性ナトリウム・チャ
ンネルである。さらなる研究はＤＫ９．２が１０ｎＭの
閾値濃度で末梢神経を絶えず励起することを示した。ま
た、それはサソリ レイウラス（Ｌｅｉｕｒｕｓ）クイ
ンクエストリアタス（ｑｕｉｎｑｕｅｓｔｒｉａｔｕ
ｓ）の哺乳類毒素４の少なくとも５０倍の効力である。
学的研究を行った。蛆の神経筋肉接合部および末梢神経
からの記録は、ＤＫ９．２がテトロドトキシンによるブ
ロックに敏感な神経中に繰り返しのバースト（ｂｕｒｓ
ｔ）放電を誘発することを示す。すなわち、この毒の作
用の部位は恐らく神経膜の電圧感受性ナトリウム・チャ
ンネルである。さらなる研究はＤＫ９．２が１０ｎＭの
閾値濃度で末梢神経を絶えず励起することを示した。ま
た、それはサソリ レイウラス（Ｌｅｉｕｒｕｓ）クイ
ンクエストリアタス（ｑｕｉｎｑｕｅｓｔｒｉａｔｕ
ｓ）の哺乳類毒素４の少なくとも５０倍の効力である。
【０１７３】この研究に使用した実験動物は家バエ（Ｍ
ｕｓｃａ ｄｏｍｅｓｔｉｃａ）の第３齢幼虫である。
幼虫を虫ピンで固定して、医療用切開によって背面を開
けた。体部をピンで平らに開け、内蔵を除いて体壁筋系
を露出させた。脳に出る末梢神経を切断し、脳を除い
た。この調製物を次のもの（ｍＭ）から成る昆虫塩化ナ
トリウム水溶液を多量に注いだＮａＣｌ（１４０），Ｋ
Ｃｌ（５），ＣａＣｌ2（０．７５），ＭｇＣｌ
2 （４），ＮａＨＣＯ3 （５）およびＨＥＰＥＳ（５）
ＰＨ＝７．２。
ｕｓｃａ ｄｏｍｅｓｔｉｃａ）の第３齢幼虫である。
幼虫を虫ピンで固定して、医療用切開によって背面を開
けた。体部をピンで平らに開け、内蔵を除いて体壁筋系
を露出させた。脳に出る末梢神経を切断し、脳を除い
た。この調製物を次のもの（ｍＭ）から成る昆虫塩化ナ
トリウム水溶液を多量に注いだＮａＣｌ（１４０），Ｋ
Ｃｌ（５），ＣａＣｌ2（０．７５），ＭｇＣｌ
2 （４），ＮａＨＣＯ3 （５）およびＨＥＰＥＳ（５）
ＰＨ＝７．２。
【０１７４】刺激吸引電極をいずれかの便利な神経幹に
取付け、神経筋伝達を記録した。刺激の閾値は筋肉の収
縮繊維６〜７本が観察されるまで徐々に上昇した。次い
で、この繊維に記録用細胞内マイクロ電極を突き刺し、
これを細胞内予備増幅器（プレアンプリファイア）に接
続して、神経刺激に対する応答としてのＥｘｃｉｔａｔ
ｏｒｙ Ｐｏｓｔ Ｓｙｎａｐｔｉｃ Ｐｏｔｅｎｔｉ
ａｌｓ（ＥＰＳＰ）をモニターした。末梢神経繊維の上
昇する電気活性を記録するために、吸引電極をＡＣ予備
増幅器に取り付けた。シグナルを１００倍に増幅し、出
力を０．３および１ｋＨｚでフィルターした。すべての
記録をＭａｃＬａｂコンピュータ化器機系でデジタル化
して表示（ディスプレー）しそして分析した。
取付け、神経筋伝達を記録した。刺激の閾値は筋肉の収
縮繊維６〜７本が観察されるまで徐々に上昇した。次い
で、この繊維に記録用細胞内マイクロ電極を突き刺し、
これを細胞内予備増幅器（プレアンプリファイア）に接
続して、神経刺激に対する応答としてのＥｘｃｉｔａｔ
ｏｒｙ Ｐｏｓｔ Ｓｙｎａｐｔｉｃ Ｐｏｔｅｎｔｉ
ａｌｓ（ＥＰＳＰ）をモニターした。末梢神経繊維の上
昇する電気活性を記録するために、吸引電極をＡＣ予備
増幅器に取り付けた。シグナルを１００倍に増幅し、出
力を０．３および１ｋＨｚでフィルターした。すべての
記録をＭａｃＬａｂコンピュータ化器機系でデジタル化
して表示（ディスプレー）しそして分析した。
【０１７５】ＤＫ９．２の作用についての初期実験は神
経筋接合部調製試料を使用した。末梢神経に適用された
単一刺激は体壁筋肉中の単一ＥＰＳＰをもたらした。Ｄ
Ｋ９．２の存在において、単一刺激はＥＰＳＰの高周波
放電をもたらした。刺激−誘起放電の他に、自然のバー
スト放電も現れ、それらは数分間続いた。バーストの持
続は通常１秒以上であったが、バーストの間のＥＰＳＰ
の周波数は＞３０Ｈｚであった。バースト開始による収
縮の期間中、電極が筋肉から放出されるため、バースト
放電の存在は体壁神経筋中に激しい収縮を生ぜしめ、こ
れが細胞内の読みを保つのを困難にした。それ故、ほと
んどの実験は、収縮は抑制するが、幼虫の電気活性に影
響を及ぼさない高濃度のショ糖（３００ｍＭ）を含む塩
化ナトリウム水溶液中で行った。通常のあるいは高濃度
のショ糖塩化ナトリウム水溶液のいずれかを使用して同
様の結果をえた。
経筋接合部調製試料を使用した。末梢神経に適用された
単一刺激は体壁筋肉中の単一ＥＰＳＰをもたらした。Ｄ
Ｋ９．２の存在において、単一刺激はＥＰＳＰの高周波
放電をもたらした。刺激−誘起放電の他に、自然のバー
スト放電も現れ、それらは数分間続いた。バーストの持
続は通常１秒以上であったが、バーストの間のＥＰＳＰ
の周波数は＞３０Ｈｚであった。バースト開始による収
縮の期間中、電極が筋肉から放出されるため、バースト
放電の存在は体壁神経筋中に激しい収縮を生ぜしめ、こ
れが細胞内の読みを保つのを困難にした。それ故、ほと
んどの実験は、収縮は抑制するが、幼虫の電気活性に影
響を及ぼさない高濃度のショ糖（３００ｍＭ）を含む塩
化ナトリウム水溶液中で行った。通常のあるいは高濃度
のショ糖塩化ナトリウム水溶液のいずれかを使用して同
様の結果をえた。
【０１７６】ＤＫ９．２処理後に観察されるバースト放
電はサソリ毒α毒素の存在において観察されたものと似
ていた。そのタンパクは神経膜の電圧感受性ナトリウム
・チャンネルと相互作用することが知られている。従っ
て、バースト放電は特異性ナトリウム・チャンネルのブ
ロッカーであるテトロドトキシン（ＴＴＸ）によってブ
ロックされるべきである。ＤＫ９．２−誘発バーストを
阻止もしくは逆転させるＴＴＸの能力を図５に示す。図
５において、ＥＰＳＰは１μＭＴＴＸによって容易に阻
止され、１００ｎＭのＤＫ９．２による爾後の処理に対
して調製試料を不活性にした。同様の実験を図６にも示
すが、そこではバーストはＤＫ９．２によって誘発さ
れ、爾後のＴＴＸの適用によって逆転する。この実験に
おいて、バーストの着手は筋肉から電極を取りはずし、
そして記録を再決定する試みを行うときに突き刺しアー
チファクトを生ずる。好適な記録の部位が見出されたな
らば、バーストを約２分間モニターし、そして調製試料
はＴＴＸ処理後の数秒以内に活性の停止を示した。
電はサソリ毒α毒素の存在において観察されたものと似
ていた。そのタンパクは神経膜の電圧感受性ナトリウム
・チャンネルと相互作用することが知られている。従っ
て、バースト放電は特異性ナトリウム・チャンネルのブ
ロッカーであるテトロドトキシン（ＴＴＸ）によってブ
ロックされるべきである。ＤＫ９．２−誘発バーストを
阻止もしくは逆転させるＴＴＸの能力を図５に示す。図
５において、ＥＰＳＰは１μＭＴＴＸによって容易に阻
止され、１００ｎＭのＤＫ９．２による爾後の処理に対
して調製試料を不活性にした。同様の実験を図６にも示
すが、そこではバーストはＤＫ９．２によって誘発さ
れ、爾後のＴＴＸの適用によって逆転する。この実験に
おいて、バーストの着手は筋肉から電極を取りはずし、
そして記録を再決定する試みを行うときに突き刺しアー
チファクトを生ずる。好適な記録の部位が見出されたな
らば、バーストを約２分間モニターし、そして調製試料
はＴＴＸ処理後の数秒以内に活性の停止を示した。
【０１７７】収縮する筋肉からの細胞内記録に付随する
問題を克服するために、蛆の末梢神経からの細胞外の記
録を使用して上記の実験をくりかえした。これらの記録
は、運動神経繊維の自然発生の逆方向活性と共に、上昇
感覚神経活性から構成される。７０ｎＭにおいて、ＤＫ
９．２は塩化ナトリウム水溶液によるその後の処理によ
って影響されない神経放電の増大をもたらすが、０．４
μＴＴＸによって容易にブロックされる。また、ＤＫ
９．２前のＴＴＸの適用はバーストの出現を阻止する。
問題を克服するために、蛆の末梢神経からの細胞外の記
録を使用して上記の実験をくりかえした。これらの記録
は、運動神経繊維の自然発生の逆方向活性と共に、上昇
感覚神経活性から構成される。７０ｎＭにおいて、ＤＫ
９．２は塩化ナトリウム水溶液によるその後の処理によ
って影響されない神経放電の増大をもたらすが、０．４
μＴＴＸによって容易にブロックされる。また、ＤＫ
９．２前のＴＴＸの適用はバーストの出現を阻止する。
【０１７８】ＤＫ９．２に対する昆虫神経の感受性を決
定し、その能力を標準サソリ毒のそれと比較するため
に、さらなる研究を行った。ＤＫ９．２を１ｎＭで開始
する末梢神経調製試料について試験し、５分毎に濃度を
増大させるか、または活性の増大が観察されるまでそれ
を行った。この調製試料において、１ｎＭおよび５ｎＭ
のＤＫ９．２は不活性であったが、１０ｎＭは短い遅延
後に調製試料の活性を誘発した。５つの神経調製試料か
らの結果を使用して昆虫細胞のＤＫ９．２の有効閾値濃
度を決定した。これらの結果を表ＩＶに要約して示す。
定し、その能力を標準サソリ毒のそれと比較するため
に、さらなる研究を行った。ＤＫ９．２を１ｎＭで開始
する末梢神経調製試料について試験し、５分毎に濃度を
増大させるか、または活性の増大が観察されるまでそれ
を行った。この調製試料において、１ｎＭおよび５ｎＭ
のＤＫ９．２は不活性であったが、１０ｎＭは短い遅延
後に調製試料の活性を誘発した。５つの神経調製試料か
らの結果を使用して昆虫細胞のＤＫ９．２の有効閾値濃
度を決定した。これらの結果を表ＩＶに要約して示す。
【０１７９】 表 ＩＶ 濃 度 処理の数 応答の数 ％ 応 答 １ｎＭ ２ ０ ０ ２ｎＭ １ ０ ０ ５ｎＭ ３ １ ３３ １０ｎＭ ３ ３ １００ 実験の最後のグループは同様にして、サソリ（ｓｃｏｒ
ｐｉｏｎ Ｌｅｉｕｒｕｓ ｑｕｉｎｑｕｅｓｔｒｉａ
ｔｕｓ）（ＬｇＴＸ４）の毒物に対する昆虫神経の感受
性を決定した。調製試料（ｎ＝４）を５００ｎＭまでの
ＬｇＴＸ４の濃度にさらしたが、効果はなかった。この
発見は、ＬｇＴＸ４が哺乳動物のナトリウム・チャンネ
ルに特異性があることを見出した前述の研究に一致す
る。ＤＫ９．２によるこれらの調製試料の次の挑戦は応
答を得るために１０〜３０ｎＭを必要とした。ＤＫ９．
２の有効閾値濃度の僅かな上昇は恐らく不活性ＬｇＴＸ
４による弱いブロック作用に起因する。これらの実験
は、ＤＫ９．２がＬｇＴＸ４よりも少なくとも５０倍も
昆虫神経に対して活性であることを実証するものであ
る。
ｐｉｏｎ Ｌｅｉｕｒｕｓ ｑｕｉｎｑｕｅｓｔｒｉａ
ｔｕｓ）（ＬｇＴＸ４）の毒物に対する昆虫神経の感受
性を決定した。調製試料（ｎ＝４）を５００ｎＭまでの
ＬｇＴＸ４の濃度にさらしたが、効果はなかった。この
発見は、ＬｇＴＸ４が哺乳動物のナトリウム・チャンネ
ルに特異性があることを見出した前述の研究に一致す
る。ＤＫ９．２によるこれらの調製試料の次の挑戦は応
答を得るために１０〜３０ｎＭを必要とした。ＤＫ９．
２の有効閾値濃度の僅かな上昇は恐らく不活性ＬｇＴＸ
４による弱いブロック作用に起因する。これらの実験
は、ＤＫ９．２がＬｇＴＸ４よりも少なくとも５０倍も
昆虫神経に対して活性であることを実証するものであ
る。
【０１８０】〔配列表〕配列番号１はＤＫ９．２のアミ
ノ酸配列を示す。配列番号２はＤＫ９．２の暗号ｃＤＮ
Ａ配列を示す。配列番号３はＤＫ１１のアミノ酸配列を
示す。配列番号４はＤＫ１１の暗号ｃＤＮＡ配列を示
す。配列番号５はＤＫ１２のアミノ酸配列を示す。配列
番号６はＤＫ９．２をコードする完全ｃＤＮＡを示す。
配列番号７は前駆体ＤＫ９．２のシグナル／リーダー配
列のアミノ酸配列を示す。配列番号８はプロモーター領
域ＤＫ９．２のＤＮＡ配列を示す。
ノ酸配列を示す。配列番号２はＤＫ９．２の暗号ｃＤＮ
Ａ配列を示す。配列番号３はＤＫ１１のアミノ酸配列を
示す。配列番号４はＤＫ１１の暗号ｃＤＮＡ配列を示
す。配列番号５はＤＫ１２のアミノ酸配列を示す。配列
番号６はＤＫ９．２をコードする完全ｃＤＮＡを示す。
配列番号７は前駆体ＤＫ９．２のシグナル／リーダー配
列のアミノ酸配列を示す。配列番号８はプロモーター領
域ＤＫ９．２のＤＮＡ配列を示す。
【０１８１】配列のリスト １）一般情報 （ｉ）出願人：カレン・ジェイ・クラプコ；ブラッドフ
ォード・カル・バンワゲネン；ジェイ・アール・ハンタ
ー・ジャックソン （ii）発明の名称：殺虫に有効なペプチド （iii)配列の番号：８ （iv）通信の宛先 （Ａ）宛先人：ウッドコック，ウオッシュバウム，カー
ツ，マキエビッツおよびノリス （Ｂ）ストリート：ワン ライブラリー プレース ４
６階 （Ｃ）市：フィラデルフィア （Ｄ）州：ペンシルバニア （Ｅ）国：Ｕ．Ｓ．Ａ． （Ｆ）郵便番号：１９１０３ （ｖ）コンピュータ読み出し形体 （Ａ）ＭＥＤＩＵＭ ＴＹＰＥ：ＤＩＳＫＥＴＴＥ，
３．５ ＩＮＣＨ，１．４４Ｍｂ ＳＴＯＲＡＧＥ （Ｂ）ＣＯＭＰＵＴＥＲ：ＩＢＭ ＰＳ／２ （Ｃ）ＯＰＥＲＡＴＩＮＧ ＳＹＳＴＥＭ：ＰＣ−ＤＯ
Ｓ （Ｄ）ＳＯＦＴＷＡＲＥ：ＷＯＲＤＰＥＲＦＥＣＴ
５．０ （vi）現在の出願データ： （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願日： （Ｃ）分類： （vii)先願データ： （Ａ）出願番号：６６２，３７３ （Ｂ）出願日：１９９１年３月１日 （viii）代理人／エイジェント情報： （Ａ）名前：ジョン・ダブリュー・カルドウエル氏 （Ｂ）登録番号：２８，９３７ （Ｃ）リファレンス／ドケット番号：ＦＭＣ−００５４ （ix) 電話通信情報： （Ａ）電話：（２１５）５６８−３１００ （Ｂ）テレファックス：（２１５）５６８−３４３９
ォード・カル・バンワゲネン；ジェイ・アール・ハンタ
ー・ジャックソン （ii）発明の名称：殺虫に有効なペプチド （iii)配列の番号：８ （iv）通信の宛先 （Ａ）宛先人：ウッドコック，ウオッシュバウム，カー
ツ，マキエビッツおよびノリス （Ｂ）ストリート：ワン ライブラリー プレース ４
６階 （Ｃ）市：フィラデルフィア （Ｄ）州：ペンシルバニア （Ｅ）国：Ｕ．Ｓ．Ａ． （Ｆ）郵便番号：１９１０３ （ｖ）コンピュータ読み出し形体 （Ａ）ＭＥＤＩＵＭ ＴＹＰＥ：ＤＩＳＫＥＴＴＥ，
３．５ ＩＮＣＨ，１．４４Ｍｂ ＳＴＯＲＡＧＥ （Ｂ）ＣＯＭＰＵＴＥＲ：ＩＢＭ ＰＳ／２ （Ｃ）ＯＰＥＲＡＴＩＮＧ ＳＹＳＴＥＭ：ＰＣ−ＤＯ
Ｓ （Ｄ）ＳＯＦＴＷＡＲＥ：ＷＯＲＤＰＥＲＦＥＣＴ
５．０ （vi）現在の出願データ： （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願日： （Ｃ）分類： （vii)先願データ： （Ａ）出願番号：６６２，３７３ （Ｂ）出願日：１９９１年３月１日 （viii）代理人／エイジェント情報： （Ａ）名前：ジョン・ダブリュー・カルドウエル氏 （Ｂ）登録番号：２８，９３７ （Ｃ）リファレンス／ドケット番号：ＦＭＣ−００５４ （ix) 電話通信情報： （Ａ）電話：（２１５）５６８−３１００ （Ｂ）テレファックス：（２１５）５６８−３４３９
【０１８２】（２）配列番号１の情報 （ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ：５６個のアミノ酸 （Ｂ）種類：アミノ酸 （Ｃ）トポロジー：未知 （xi）配列の記述：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：Ｉ： Ala Lys Asp Gly Asp Val Glu Gly Pro Ala Gly Cys Lys Lys Tyr 5 10 15 Asp Val Glu Cys Asp Ser Gly Glu Cys Cys Xaa Lys Gln Tyr Leu 20 25 30 Trp Tyr Lys Trp Arg Pro Leu Asp Cys Arg Cys Leu Lys Ser Gly 35 40 45 Phe Phe Ser Ser Lys Cys Val Cys Arg Asp Val 50 55
【０１８３】（２）配列番号２の情報 （ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ：２７５個の塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）ストランド性：２重 （Ｄ）トポロジー：未知 （xi）配列の記述：配列番号２： GCC AAG GAC GGC GAC GTC GAG GGG CCT GCG 30 Ala Lys Asp Gly Asp Val Glu Gly Pro Ala 1 5 10 GGC TGC AAG AAA TAC GAC GTA GAG TGC GAC 60 Gly Cys Lys Lys Tyr Asp Val Glu Cys Asp 15 20 AGT GGA GAG TGC TGC MMS AAG CAG TAC CTG 90 Ser Gly Glu Cys Cys Xaa Lys Gln Tyr Leu 25 30 TGG TAC AAG TGG CGA CCC CTG GAT TGC CGA 120 Trp Tyr Lys Trp Arg Pro Leu Asp Cys Arg 35 40 TGC CTA AAG AGC GGT TTC TTC AGC AGC AAG 150 Cys Leu Lys Ser Gly Phe Phe Ser Ser Lys 45 50 TGC GTT TGC AGA GAC GTG TAGATTTGAA ATGAAATTCG 188 Cys Val Cys Arg Asp Val 55 TGTTCTTTTT TGGTTGTAGA TGACCTAATG AAACAACTGA 228 CATGAATAAA ACAAAATTGA ATGAATTGAA AAAAAAAAAA 268 AAAAAGC 275
【０１８４】（２）配列番号３の情報 （ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ：５８個のアミノ酸 （Ｂ）種類：アミノ酸 （Ｃ）トポロジー：未知 （xi）配列の記述：配列番号３： Ala Lys Asp Gly Asp Val Lys Gly Pro Ala Gly Cys Met Lys Tyr 5 10 15 Lys Ser Gly Asp Cys Arg Gly Lys Thr Cys Cys Asp Gln Gln Tyr 20 25 30 Leu Trp Tyr Lys Trp Arg Asn leu Ala Cys Arg Cys Phe Thr Val 35 40 45 Glu Val Phe Lys Lys Asp Cys Trp Cys Asn Asp Ile Ser 50 55
【０１８５】（２）配列番号４の情報： （ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ：２０４個の塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）ストランド性：２重 （Ｄ）トポロジー：未知 （xi）配列の記述：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４： GCC AAG GAT GGC GAT GTC AAG GGA CCT GCT GGC TGC ATG AAG TAC AAG 48 Ala Lys Asp Gly Asp Val Lys Gly Pro Ala Gly Cys Met Lys Tyr Lys 1 5 10 15 AGC GGA GAC TGC AGA GGC AAA ACT TGC TGC GAC CAA CAG TAC CTC TGG 96 Ser Gly Asp Cys Arg Gly Lys Thr Cys Cys Asp Gln Gln Tyr Leu Trp 20 25 30 TAC AAG TGG CGG AAT CTT GCA TGC AGG TCC TTC ACG GTC GAA GTG TTC 144 Tyr Lys Trp Arg Asn Leu Ala Cys Arg Cys Phe Thr Val Glu Val Phe 35 40 45 AAG AAG GAC TGC TGG TGC AAC GAC ATC AGT TAATTCCACA TGAAGAAGTA 194 Lys Lys Asp Cys Trp Cys Asn Asp Ile Ser 50 55 AGCATCTCCT 204
【０１８６】（２）配列番号５の情報： （ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ：６２個のアミノ酸 （Ｂ）種類：アミノ酸 （Ｃ）トポロジー：未知 （xi）配列の記述：配列番号５： Ala Lys Asp Gly Asp Phe Glu Gly Pro Pro Gly Xaa Leu Lys Met 1 5 10 15 Gly Glu Leu Xaa Lys Gly Gly Thr Xaa Xaa Thr Lys Val Tyr Lys 20 25 30 Tyr Trp Lys Trp Arg Lys Leu Glu Cys Leu Gly Lys Asn Asp Gly 35 40 45 Trp Phe Lys Lys Lys Phe Lle Cys Asp Glu Arg Xaa Asn Pro Xaa 50 55 60 Xaa Xaa
【０１８７】（２）配列番号６の情報： （ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ：３５９個の塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）ストランド性：２重 （Ｄ）トポロジー：未知 （xi）配列の記述：配列番号６： ATATTACAAG CCGCTCCAGT AGCCGAAGAA GCCTAAGCCA AGAACCCAGG TCCGCCACA 60 ATG AAG GTT TTT GTT GTA CTG TTG TGC TTG TCT CTG GCA GCA GTT TAC 108 Met Lys Val Phe Val Val Leu Leu Cys Leu Ser Leu Ala Ala Val Tyr -35 -30 -25 GCC TTG GAG GAA AGA CTA GAC AAA GAC GCC GAC ATC ATG CTT GAT TCA 156 Ala Leu Glu Glu Arg Leu Asp Lys Asp Ala Asp Ile Met Leu Asp Ser -20 -15 -10 CCA GCC GAC ATG GAA AGA GCG AAG GAC GGT GAC GTG GAA GGG CCT GCG 204 Pro Ala Asp Met Glu Arg Ala Lys Asp Gly Asp Val Glu Gly Pro Ala -5 1 5 10 GGC TGC AAG AAA TAC GAC GTA GAG TGC GAC AGT GGA GAG TGC TGC MMS 252 Gly Cys Lys Lys Tyr Asp Val Glu Cys Asp Ser Gly Glu Cys Cys Xaa 15 20 25 AAG CAG TAC CTG TGG TAC AAG TGG CGA CCC CTG GAT TGC CGA TGC CTA 300 Lys Gln Tyr Leu Trp Tyr Lys Trp Arg Pro Leu Asp Cys Arg Cys Leu 30 35 40 AAG AGC GGT TTC TTC AGC AGC AAG TGC GTT TGC AGA GAC GTG 342 Lys Ser Gly Phe Phe Ser Ser Lys Cys Val Cys Arg Asp Val 45 50 55 TAGATTTGAA TTCCAAC 359
【０１８８】（２）配列番号７の情報： （ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ：３８個のアミノ酸 （Ｂ）種類：アミノ酸 （Ｃ）ストランド性： （Ｄ）トポロジー：未知 （xi）配列の記述：配列番号７： Met Lys Val Phe Val Val Leu Leu Cys Leu Ser Leu Ala Ala -35 -30 -25 Val Tyr Ala Leu Glu Glu Arg Leu Asp Lys Asp Ala Asp Ile -20 -15 Met Leu Asp Ser Pro Ala Asp Met Glu Arg -10 -5 -1
【０１８９】（２）配列番号８の情報： （ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ：４２１個の塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）ストランド性：２重 （Ｄ）トポロジー：未知 （xi）配列の記述：配列番号８： TTTAGCAGCC CAAGGCTACA GAGCTGCCGC ACAGGTAAAC CTGAACTACA CAATGCCCCA 60 TGCCCACGCT CAAACCACAT ACACTCTTTC CCCAACTTTT TTTTTGGTAA AGACAGTTGT 120 TGCATTCTAA AAGCACGTTT TACTGCAGCT GCTCAGACTG TCTGCTGCTG GTCGAGGCAG 180 AGTATGTTTC CTACAGAATT CCACCGAAGC ATTGTTCGTG GTACGACGCA GTAAGCATGA 240 CGCTCAGTTT TTTTTGAATC GGAATATGTA ATATCTGCAG CGACACTTAT TGAAATGTTT 300 CTCCTTCGAC AAGCAATCGC TTTATCGGAA TACCTGCATG ACATAACTGA CAAAACACAT 360 GTGGCTCCAG AAACAACGAA AACATTCATT CCTGTATATA AGTATCGGAG GAGTGCTGTA 420 T 421
【図１】図１は全ディグエチア・カニテイーズ毒素のＲ
Ｐ ＨＰＬＣを示し、マウスで試験した３群の成分を示
す０．１％ＴＦＡ：アセトニトリルの勾配を使用するＲ
Ｐ ＨＰＬＣである。留分２はＴＢＷ活性成分を表す。
Ｐ ＨＰＬＣを示し、マウスで試験した３群の成分を示
す０．１％ＴＦＡ：アセトニトリルの勾配を使用するＲ
Ｐ ＨＰＬＣである。留分２はＴＢＷ活性成分を表す。
【図２】図２はラットのハイポキャンパルのスライス中
のＳｃｈａｆｆｅｒコレテラールＣＡ−１ピラミダル細
胞シナプスにおけるシナプス伝達（励起集団スパイク）
の１μＭにおいて試験したＤＫ９−２を示す。描かれた
データは（ａ）ＤＫ９．２添加前５分間の及び（ｂ）Ｄ
Ｋ９．２添加後１５〜２０分間の時間平均集団スパイク
の記録を表す。これらの記録は同じであり、このことは
この濃度において、ＤＫ９．２はこの分析で検出されう
るラットＣＮＳの活性をもたないことを示すものであ
る。
のＳｃｈａｆｆｅｒコレテラールＣＡ−１ピラミダル細
胞シナプスにおけるシナプス伝達（励起集団スパイク）
の１μＭにおいて試験したＤＫ９−２を示す。描かれた
データは（ａ）ＤＫ９．２添加前５分間の及び（ｂ）Ｄ
Ｋ９．２添加後１５〜２０分間の時間平均集団スパイク
の記録を表す。これらの記録は同じであり、このことは
この濃度において、ＤＫ９．２はこの分析で検出されう
るラットＣＮＳの活性をもたないことを示すものであ
る。
【図３】図３はｐｒｅＤＫ９．２をコードする遺伝子を
はこぶバキュロウイルス転換ベクターｐＷＲ９の遺伝子
地図である。
はこぶバキュロウイルス転換ベクターｐＷＲ９の遺伝子
地図である。
【図４】図４はネオネート・タバコ毛虫（１０００，０
００ＦＩＢ／ｇｍ食飼）の連続ウイルス供給分析（ｆｅ
ｅｄｉｎｇ ａｓｓａｙ）である。
００ＦＩＢ／ｇｍ食飼）の連続ウイルス供給分析（ｆｅ
ｅｄｉｎｇ ａｓｓａｙ）である。
【図５】図５はＤＫ９．２−誘起バースチング（ｂｕｒ
ｓｔｉｎｇ）を阻止または反転させるＴＴＸの能力を示
す。
ｓｔｉｎｇ）を阻止または反転させるＴＴＸの能力を示
す。
【図６】図６はＤＫ９．２によってバーストを誘発さ
せ、その後にＴＴＸを適用してそのバースチングを反転
させるＴＴＸの能力を示す。
せ、その後にＴＴＸを適用してそのバースチングを反転
させるＴＴＸの能力を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｐ 21/08 // Ｃ１２Ｐ 21/08 7823−4Ｂ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｃ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:92） (72)発明者 カレン，ジョーン クラプチョ アメリカ合衆国ユタ州 84109 ソールト レイク シティ サン ラファエル ア ベニュー 3840 (72)発明者 ブラッドフォード，カル ヴァンワーゲネ ン アメリカ合衆国ユタ州 84102 ソールト レイク シティ 1070イースト 300サ ウス アパートメント 507 (72)発明者 ジョン，ランドルフ，ハンター ジャクソ ン アメリカ合衆国ユタ州 84109 ソールト レイク シティ ギルロイ ロード 3661
Claims (2)
- 【請求項１】 配列番号８に記載される配列またはその
部分と実質的配列相同性を持つ配列を特徴とするプロモ
ータ配列であり、該プロモータ配列が組換え構造体中の
遺伝子の発現を指示することを特徴とするプロモータ配
列。 - 【請求項２】 配列番号８に記載される配列またはその
部分と実質的配列相同性を持ち、発現される遺伝子に操
作的に結合された配列を特徴とする組換え構造体。
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| DE69320456T2 (de) * | 1992-01-16 | 1999-04-29 | Metrologic Instr Inc | An einem koerper befestigter handfreier laserabtaster und seine anwendung |
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