BG98079A - Инсектицидно ефективни пептиди - Google Patents

Abstract

Изобретението се отнася до инсектицидно ефективнипептиди, изолирани от отровата на паяк Diguetia, до методи за получаване и приложение на инсектицидите и ДНК, кодираща такива инсектицидно ефективни пептиди.

Description

Вастоядото жаоЖретекю е е отнася до жмсеятждмлк© ефективни нентндх»По-енсжжално, жло·ротонжсто е· отнася до ваоакткдвдяо офоктжвжж аонтждж, конто могат да Жъдат жжжжжражк от отрова ма заяж M/raatia , де ДНК кодирана тахжва вноеятмкмдк® еректквмн пеятидм, да методи ва получаваме жа сжокматхто пептидв в до методв ва контролираме на ЖезгрвОмачнх вроджтелж,

Иввоотжо а, чо пое» зооледяжто годжжж обществеността остро осъвиава рноховоте ма сколяата среда ж тмсохчкоетта нрк Ооваймждж«е, свързана е употребата ма ежмтотвмлх жкоектвдвдж.З реаултат на това, нвиолввакето на твам жмсежтмдхди е Ожло яамаломе рявко· Остава оЖаме жеобходжмоотта от ефежтжвек контрол на нмсектнте» Това о подтикнало веелвдоватмито да равраЖотват яовж методи са контрол жа жнеектнто.

Най-жжрокс жзполвванмте млкроЖйалнж пеетиякдж превахоадат οι Жакторяята Шиг1пд1еаж1о / по-нататък в телета нооооош съкратено В,^*/,Тов» Жамтврналек агент се яалалзуяа ва контрол на .жвлрчжж лжотокаяз. гъаежчо*,'

ма ЗДЩ 9 4,79?.£О, ьздадеа ла 10 ямуъря 1989 годжжа кл Котела*» в ожтруджжвж, охжег* 4 ах герж&лив хлоявж, омъ.д*«9 гоя· ко=.т© кодира ва ♦xurstaki ладтл-емдотовввж ж гмга,. коджрад аа let· ton^hrionia делта-енлотокожж в тяхвото иеяуяаваже· ХжЯрадвто®*** оа акткввм спрямо вроджтолв, чувотвжтолив хямВИи kttiwtatel дахове, както я спрямо жреджтолв, чуоотвжтелия гш 3»1. ЪамаЪуЯауНд чамовете ·Главя©, тоои жлЯрждж жжат яажмвмя кясектжджджи ово9отва, кеят© яровмхожкат твоя, каЯледаважв от фявжчоекж смоов ва жаходкж / аодмтвлекж/ мамево в уелевжлгав ва определено ямжо ва жвееятидждаа акткжноет клх в уолевмята ва ояемтьр от актввкоот вля к ярм д>ет©и1меоктжаждв»то виьетажя, садъ^ маял таквва хжкрооргввяямж могат да «адат жозелвважж оа уялжояавав на вяоеятя през аридагаяе аа хмариджто и жяеоктвцядхо офеятивио нолачоотво япооеттто яли към тяхната ©реда.

5руг® пзоизводао от Зштер^ята?·*· е оляеаяо в йврояейока патжжтяа валяка, пу5ликад^я F 3 38S 400 А1, «вдадена ж^И1гоу &

Т@аа мзов^еюш е« е»жаеж д« жМдодок «меаяя·» г®в» κ·*χ о таксзнви към дял ек ря лж здомтжЛо-ояедяаяяо» лооЗрогожвояе вял» ва тя хяврждоя олта-аадотояовяов гоя, оъд-ьрквю таот отВ·#· ▼аГеВшнит Ж-Г5 ▼mr.iraretaXi токожво* гол в нает от томякяовжд гоя от^»1· .ХкОрждямят токежноа гоя /ДНК/, коджрая я>отожя който spstema яжтжяиоот оярямо джпожрвля кмоектж овца е отмовя,

Бак?ержят1*®*е жяяелзвжяа ояцо яорадж иеДиято жяооктжцжджж ев©9етва в Жвяию^вва жатежтяа валяка, nyiaxxtw* & Θ 340 ·4Β» жададежа ма в ©ятруджжадиТова яаоОротокхо оо отжаоя д<

ххвямжж яеотждмжж ?омелия, които оо аолужават <ре» оливажото ма разпознат учавгмв от оявтолжалжа клотва от то$во жа двевят о гев хм В веригата ва джфтвдггея токови, аа да ое аолутж ждвж хмбрад тсжожж, кс.сго е акт;·: з ек евряма джжояржлм жкевввв· Предиодата е·, че хиб;ждкжжт ’-»'“·ι*μ може да Седа вмъква? а раата* мж· жлж да ·· кломира s «ажул^вдруа, «а да оа цромвведе «сдава, войто мажв да «ъде кзадаяш^дторяативв·, гоотоархомхжхът, оад»₽ж хжбрждажж H»t· _{rttR jcse д&} ,,_в>и ^зяолаувая маса хяоактжцжд «ри» аряж© ярилозишие мм охолната среда ка вшроажжта жваав**·.

Пра преучвамето за ихоохтижхджж сьадвхояжя Ш« кдеатъ^мадарама •тревата ма екарвмо^ чаго «дам възможен източиха ва еъедмвеик*, осигурявам* жмвежтмцмдмм овоно?ва.даа селективхж овреме живектж токожкж,Жклж жзолмражж ат отровата ва окорниома Х**1итаз «ularaeetrlatua ootanawtrlMM Р*»мл>юм ·· ШШв и вирудиждж в статията Стимулирах а падтиок&к хяоактж такава, извлечем а» ©трева жа ажарвмаж, който злият каят· върху макараараваджмаана ма натрия «ама ж ирмтежажа е9жо мкетс ма овързваме“, Mod*·» жвй Blepayeiee, 240 t вТМ? C.J985 )·

При вееледване аа тахкхте фжмжчеакж ж »армакологкчжж свойства е 4жла разкрито, ч· едак такоия араджвжква бъраа е«жмулжрав» ховтрахтжвяа / свиващи/ парализа яа ларва жа муха, а други томях преджзвмжва баваа подтвокащв, отпуож&яа парахжаа.М двата токсина влияят върху алектропроводжмао««а иа катржж»

Канадокж н&темт 2,305,8S3, ввдадек ка 19 ажж 1990 годям яа МаШ1ж _а оъхруднъцж описва кае ек ти ще дмо ©Фехт^хои и ре*ежа подучен от скорпяояа baluraa щДямвийН.аШ» ttaWaaoa SatMi»^,V з това изовротекн· отровата мафжлвжжра ж ое раждам ма Фраждяж.Фражккята с най-висока токежчвоет оярямо ларвж ж яай«кжвжата тмевянеет ©прямо ммякж ое подлага яа доя ьлкители© зрпжотважа ж храМяжжт продукт · тожж, дмтжрая ката * bqi₽55 *· ih'iakm, *»'г_0ЖвмЧ|_ЯЖ компокектя ат отрова яа оароиж _ж Luaasa eigmriaasia _я> АЬвфШ XastituW of Moorga^a

Cbaetatry, 05SE Aaa&aay of ЗоАаавав> Mqbow 11Τ9Θ8» W-4_tUSO, синова чтрн токсина, моолжрани от отрова аа скорвжова ВхШш ецрехм , конто са токсжчим спрямо мясектж.Овжоаяо о еък® така жаолвраямв « характерно «има та иа тсмкончмМн ш хоклоиояе от отровата ма тарактулата /вид паяк/ Шоааа аЩРГ&аш!·· Нае·работената отрова но · токсична към жнеектите,

В оъотвотетжио ® проучването я раоработто» овършан о раажжнж оъетавж с лжсоктжккдкж овобетва, научните работмини работят яа равработжамето ма методи в а получаваме жа жкеектжняд* нж гожж ж вмъкваното на това гоим във *родятела, обект на мзеледламо«Лат«нт ма ЗДЩ > 4^176,536, жздадем аа 7 ноември 1Т8Т година иа 3alth вйошвт· , се отнася до метод оа вмкорворакия /включване/ жа жвбрак ток», ожрогнат е бакуловжруоок » времотор вътре в бакуловкруоок гея ом, аа да ое жолучв рев ом·имант ек бахужовкруео] експрес момея вектор, епос обем да екежрееира жебрекжл гем в дадена клетка на хкоокт^етодът включва етцмгване жа бакуловжруска ДЖ •а да ее золучж ДПС фрагмент, съдържан нмкжодркмов гея вля чает от вето» вклжчжтмко волжкадржяов жремоторПВа да ее жолучх рсксмбжнажтш иреноожм вектор, ДЖ фрагмента ое вмъква в кловяцак носител в елед тева набран res ое вмъква в тоаж модифицирам клек» рад ноожтел, така че оъкжят е аед контрола яа аелихедрмковжя промотор,?екокбжкактмгят ареноемм вектор след това вваимодеЖатву* ва е бакуловжруеяа ЖС от див твк, така че да ое неважно xw ад ежката рекоибккакжж и включваното на нзбраяяя гея в Фжул&яхру&яия г еиои. Баку ловм рус w oalifQTflie» fleWIFF) и свърванвят е него ножмходржжов жрокотор е уотаковеяо че е полезен врк ролучаванет© ма вжруоек ексвреококея вектор, си особен на неключателно вивмм нжва аа схепресвя ка даден ивбрав гви в еук армеена клетка ва гоотоаржемкхя.

Изобретателите предполагат, че океароежокквят вектор трябва >· • · дд «ъде жзлолзвая в срсгема аа камтреяяраме «а аяоштя чрез яадбя .рая» жа гея, който произвежда прстеми, тотем ек aw оаецяфвчеа жжсект ала към ва^?де.7»я сп-г/га от жяееят» а клояяраме аа това гев в*еШР¥ окспр®с ;омж»я в^ктор.То дршожагат оъцо така, чо векторът в*, могъл да бъде ирклсгАся към раотеажото ала аввотяото е

което трябва да бъде задвтеяо.?ехомбжиактжжят вжруо бв могъл да обхваже кл&тхжте аа чревната, атома олед заглъдажо от ажеехта а да зад оч и е аьзарог.3ййдсдво.'идо алтеря&тжвка яредаяложемив е да ео вмъкне гена вътре » бакуловжруейия гелож, така че том <м ».огъл да оа ао«о*оджяж към лолмхедрийояата структурна жволодоватояжоот по такъв иачкж, то поляхедрсиовот® накратко «а могла да бъде даог дахраяо чрез ждоионжв жж алкалмж^фелоожл ма чермото жа яжеекта и «яоиям лродукт бж шгъл да ое оевобода»

Друг метод за волучжваже ма кжеоктнцждаа гожл а въвеждал*о*« ям в обект, който трябва да бъде заздвтек е оагкеаи в Cutler ^яЕдектропо радия» Разработена ва трансформиране ка култура» Уовож е зетвърдоа образец ка култура*,*& МаНееЬЛ*· wl· Tf5) XTCWW В таза етатая е посочено, че ДЮС може да бъде елштроаоржража двректжо з вотълвац «а цветеи пра «еж а че цветааят ярамед може да ое доставя обратно върху цветето, ва да в а образуват сомова, лоито след това оа развяват в тр&ио>орммранж растення.ЩезЕ метод е бял жзползваж усвошо вря тютюневи раетежмл, а аъцо така доло да бъде уеаекеи вря царевица ж л^доряа.?озж метод мож® ш Фъдо по-лесеи, отколко то олектрожорацията жа аротойлаотм, тъМ като ©еаоваата дол о да ое опражвт цветята ж вота цветовете да овържат работата* вмеото да е» регеязржра р«отемьете,:'от<здът ое оъвг в еъбаражо аа двете* оржвоц, отглеждането му /волължака/' а среда за раввжтже в продължение на ЗО-dJ мжиутж, след което тръбжчхата аа цветния правеж де зааочже да жзляаа яааъж ci доле-δ- .., .. .. ,.. ....

ζсвето агниш, пркй&гяее да д*-да.дата ДНК кш яеяжаяа вудадазда, ©мжраада дааяжда ггзадац, прелегаяа да еждаярвчасхж ик аа да ·· оззоряж aajm а ярьвгчката йи а^дада, еявввава sa жзляяшата дяк и а& жзчзкски.е цветен првада върху ©лжзалдеяо йж ррсяв· мгеео, олед ко«те ее жачаква локате еа ©©разуват вее ежа Лоза йода де Раде един десен метод за «>·.< е > дан е на шжеш»» яда » У‘.гщ-;цт рдстгжги» и аьтдат иа Сх-х '' 4,1‘61_шойх, ί’»дм« «ж t> азгуея ite> гад, ла *^,дга’^аа&в j^6waHa_{e езК}еа.ае едва ддаьлЕЖЯезяа ©глтдаа аа довя· suLBfc.l’c/Si. кз ©а>©*<***>* ©е одааол да яявалзважея· на οίρ«6οτ«№, so с.ъеетзс иктактми ликреъ*алнг клетки ката еввтвма за аоетавея· s£ яр&тежниая еьеддаемия ма «явоях^ и хсрв*ов;м?вдаж1п?яе млеяжв иьраевачалие врс&засадат ярояежи зъяравжетдаа© ядарвдсзвом нсчол© хда гда. '.родужмраг^яя арояевм мткров α· ©«развява е хважчдада вля хзкчдакн е редена, лдантс ялеяхаяа ©яда© е© съждаяв® жктажтда, .--емажулац^лта аа ародеел нч ©вредете· ®одь до колуч&вда© кв йя«рслгфе^&4н©₽йж &sp«ac геж мжаройаалмв давяяж а ©а зяачмтелва загуба аа актмвмесять аа в мгревАдаъчя®*© сьеддадав<*.Г»Ж като клетвата да ое ь*з»родад(*ма и ще ®’<® адрааа «ддаъчва β*«β·| ходя© може д.д <м© .«аачуидаа олад яеда » вдава©*© мдеяа щ ©у хравоомвлаявдмада схц^-ема «а ^зигястс. или човдаа, това дава «нзмедаоет да с» ©тзелелк зьвм«я© мам да α· ялдаара ©е»©®©здада* Μ·*?© аг, вродухтжя·, хьжзрля^вм ©ъгязвжс въярвавоя© жздарвявжи·» След додходлаа смгравоткн, самата микро^жамжа клеяка, прадуцирада аротекв се гзддазуза като ©нстома за ддаяаяажа, така че яе е жво^хедам© ва«м арвчжоядаве ма а олучажда© е дадмждам.©^соая© в да е цре***шв, яод&п^яякд, ельнакасемжа мля еьдаммшда, ^км^чвя· я© ъмадатжшцц», хожт© иегах да се адаучая чрез дакрдедадав ©ред» ояяа а начжжж, кснит да ^:-W:· взясдзвзах. хат« адаодда джяармал ма изовре»«««ето·

...... .. .....

Зъзмо^м остта от използване на ДНК технология за включване на сжктетвчен гои, колтв кодира невротоконн, намерен в отрова жа скорниои е описана от б.пгЪопсИ ж сътрудница, * Сжмтевиражв жа гои, ходиращ опеяи^чеи към дадели, инсенти яевротокежн иа екорнио ж оптж жа неговото осчтрсснрайе «рев жвползваве жа бакулевжруожи вектори¹*, Gene 73:4Ji-13 / 1^83/.3 таза статия · лосочеиа възможността от изаодавая· на ДНК технология ва инкорпориране /включване/ иа изкуствен ген, койт© кодира незротсесия, камерен в отровата на скорпион, oupeu· в бакуловвруеняя гении, ва да се лодобрят бакуловируините пествцждп,Ввеледванж иа трв метода я& вкслресг.л, като се използува зодлхед рогова, базирана яв и ром от© р Ас'Л PV екапреоиояаа система за осъществявано на прожвсамостоятелно водотвот® иа токсин^Еиспресая иа 36 кодов гежЗУне оежгурява прожв веждаяе иа токиина.Известен успех е леитжгагат о прикрепването на ожгиалеи пеаткд към тохсина.Знапжтелин нива ярстежи ое получават, когато токсиновия ген се свърже към К-терминала на полихедроноз ген «Производството обаче е дооет до двадесет пъти по-малко, отказ кото това се наблюдава за самия палжхедрок«Не co смита, «е огракичемжото на експресията е при нивото на транскрипция, а при поет-транскрипционжото ниво, включвано транслация в стабилност иа протежиа.Ио бе открита паралитична активност на тохеивовите продукти·

УвропеЯска патентна заявка, публикувана под номер 343188· списва трамегеиетичии растения, които ефективно екопреежрат ж овейте клетки специфичен спрямо иноакти токов* на едя* насектви хищник в количество, което е достатъчно да причиии токсичност къи определени жкеектк, хранени се е тъканите иа растението. Описаният конкретен токсин е изолиран от отрова иа скорпиона

Освен това, тзследователяте са бжлж в състояние да ивояврат токсини от отровата на паяци. Новротококнв в нехро3tONUi от отрова ма паяк”, l.Toxicol»-®©jda lerlewe 5<2h права преглед ма една разработка, отяаояца се до яевротекоивя * нежротохожжж я предполага, че челркулжте ма отровата от паяк могат да осигурят модели за специфична инсектицида·

Патент вя ад^!” я 4,925,634 издаден ма Jaoksotta Partes аа

Х5 май 1>90 годжжа опасва методи за леяемне ма сърдечни в иевроло— гжчяж заболявалия чрез прилагане на токсини, пелучожж от паяците Ш«1епорв1в apex~tn _e ilololean cwrta. Токсините са ефектно ми сицо тажа и като специфичен калциев кавал ала хато отммулирацж бложжрацж средства за амжнокясаижжом рецеятор, което може да биде използвано спрямо мноекти ж блжаки до тях вредители.

Европейска патентна заяма, публжхуважа под комар 0 ЗМ 587 описва полиамини ж полжпаптждж, изолираяи от отровата жа паяка Agoloaopol aperta· иолжамиижто оа аитагохветв по отяояежяе яа стнмулврацжто амжмехжеелияжж новротракемитерж.Полипептидхте ж един от полиамжямп блокират калциевите кавали в живи клетжв аа раалжчжж оргаижомж. Предлага ое жаполвважето ма споменатите блекмрацн калциевите кавал] средства при контрол на беогръбначнк вредители·

Европейска патентна заявка, публикувана под номер 9 374 МО описва токекжя, изолирани от отровата на паяка Hololena aorta· Полипептжджто са полезни като инсектициди и при фармацевтични про» ратж, като например валцово наям антагонисти спрямо калциев кавал и глутамат.

я сътрудници, * Идеятжфикацжж ж пречистване на необратим просккаптичен мевротокевк от отровата ма паяка ВоЮХева curta,«Proc>M_aU.»ene.sfe..84l5506-3510 f 1987 ) _# впжова протеин ©в мовротокеия, изолиран от отровата на паяка Bololena Gurta н неговата ммхжбжцвя на иевромуекулната трансмисия /предаване/ в aapBK^Sr0s0iAila .Авторите предполагат, че токоинът блокира пресинаптичияте калциеви канали в двигателните канали при

3cuietae в сътрудници, «Паралитиккл в икоектжциднж тохоънж от лаях о фунжеебрасна аалззша,Ио1о1йпа Curia Toxicon t»/3/i3t>* 336 /Ю1/, олясва едм« дезткд а десет куртатоковкж, яренаотеив от отрова ча паяка Но1о1сп'> curt® и ефекта, когато оа/хяжектират/ впръокат в ларви жа цкпокпжлг.

Stapleton ж сьтрудкжцк,'Куртагокажхя*:Невротокевнии жисектидадив юяйяеатйдж, изолирани ст паях е Фуквеобрааиа яаяжкка llalolcna curta*¹ ·0Μ.«μ· 269/4/iS034*?05T /Ю>$/, озвсва три зслкпептждаж иезротсхаййа, мсолжрхмж ©т отровата на паяка Hololena curt?» _й ефекта по отнояенке яа дурежж *οΜβΉ йоядазМоа· 'uic’cle ж ЦвИетиюой , *?8.виврвка_е ебобидена теотинвдка група 1 списък жа рх-зихохуаглнъ к ?>ьс^кеични симпозиуми; Новг постижения в агрохимиясектата изследователска работа? Ρ*βϋ·«3ο1· β3ι31δ*

31? / 1®87/, ©писва, че токсините, яамжрацж ос в отровите иа д&развтн^те с.сж н в отровите на кякок паядж, праведа кръгла паяязпи пркчмкяват йърза даралмза, когато ае внръскат в ннеехтите«Авторите догонват, те токоияит» на палка са блокирани средства по откове* вие ва редакторите на затворените чембрании канали, селективни към даде катиои, които взажмодайетвуват е отворения канал, затварян ос от глутаматните рецептори на ок ©летните мускули иа прелетния ехакалец«Пубдиханията цитира тококи* е ммско молекулно тегло яцик в отровата на палците ^rgiope _я traaaua както ж токови, изолиран от отровните ялови иа палка, ^epfciln elweta·

Лругя нволедваиия се отнасят до свойствата иа жаолираин от отрова яа паля токсини, разярмлж опособяостта яа мх торете е нжохо молекулно тегло, изолирани от отровата иа паяк, правен Фуиж· образна яалжяма, да се овързват аообратнмо с калциевите канали. WO ЗТ/07608, издаден ма »4 август 1>в> година каСМегкаау я сътрудници описва, че тези активни уактори е ниско молекулно тегло се овързват обратимо към калциевите канали о доотатъкиа

-1 >оиедифкчяоет ж афт^?*т «в за -/иждожаване проводимостта на калям* в неврса1жте к й-u дц aosMc/ г изолиране я пречистване на структурите жа ««·.$ к*ЙМй Лотажеашо е, ч· теаж ©трева оа ТОКСИЧНИ ©Вяно fOBiUiil: Дг;ТВ»

Яругж прмложек^я иа отровете ва паяк оа еижеаяи в J^eMsc® ж тагкв ’Токсини на паядя: Лееледин пр»лож«и>я в я«вре©в ©л огията’ Ша Пет Wmwoeei 12:4)5*14 /1#ЗВ/,3 тази статия · посочено, че еъжеетвува голяма хетерогемсст в токекните иа различните тахсон ом» ж. Признава се, че екоп^рюдентита покайват епецнфячия овоЛства иа калциевите канали в зависимост от видовете и че ©тревата от паяк ложе да осжгурм антагонисти на калциевите канали.Установен© е, че дискутираните отровк от паяк оказват влияние върху SearpaBначии.Статията сън» така определя отровите от паяк като възможен източник иа специфични токсини спрямо лнсехти, за нриложоое в земеделието.

и сътрудници, ’Изолиране и бкологжчиа активност на еиизптмчки токсини от отровата на паяк, правен фуянееЛравна паяжина Agelenopoio Aporta « _в Insect KeuroeMeslstry яой Beuro19® pMy®iolo<y 198$, Borkowc дай Seism ede,,!imaM Freee,Wew Verses посочва, че редица пеитидни токовия, които амтагожнеират сжиантнч мата трансмисия /предаваме/ а жноектв, са «или изолирани от паяка Melempele aperta.

Патент яа САП 4,355,4)5, издаден на 3 август 1989 годни! иа ^5вй1скя _ж сътрудници описва един редентореи нихиВитор, получен от отроинит* жлези на паяка Joro , както и метода за неговото получаване .Съединението иаа иноектидждеи «феиет® когато ниеехтите еа в контакт със съединението, носено от течен илж твърд носител.

Патент и® САЩ ® 4,918,107 медаден на 17 април 1990 година

Il ма м о*тр,удикс.м с·: отласгл до •зъ^жквахг,· 'хоето ама ияхмОлраща ах тм злост спрямо га .яг-лиатмия ртцептор, метод за засуча* него н» това аьедвменяе· « шоентьцжд«1 fiw?fci, съдържащ оъщото с>в.ц’и«л:5е.С»аджигл: се е е чоск з течен вжв твърд аоомтвл о нрвВа* вя дмспвргарад шгмг? н е е проага директао χ-ш растението хдв xw азотното, ховто трябва да й^дат аацит еня »п мока доза е оректмв ма като жмоектьммд в ама нмого наеха токскчяоот азрамо аозаЛжхжж м риба я яажхо м^аагепркгййо влвямно аирху «кожната ереда.

ίаоледааяа е и*дс така умотрНата на бокуловируси като вмомкс ек тмодх. Сомово ят кздостат.к на дахя ммд блкуловируоя ярм вааамавамето' хм хата Шаохмовктамждк в чв те аа баамо-девотвадаг. Ларвите, които доенат днамя вмд бикухожируаж оЗмкмаввмо уяхрея омед ό до 7 дни.Дрез това аначвтелвж период от в^еае змразеявтв дарзж дродълламат да се .срамят в нож· да н&отъаж звачжтожво увре» дано на кулг^рм-зе.

./'срйдй комбинирането ва зревлввшто , овървахв о някое ежктетичкж. ииоектициди, аклъ-чзадж тоховчхоот, рвоково по отзовели· && ©кожната среда в загубваме ма офжхаомостта, дължащо се ва рввкот«игмоот, оадоотзува _аю_Р«м_>.»_МУ_Гв^_1ей|йво»»ш₁«.

ма неаи средства и иачимж аа контрол^ вклкчитедко разраОо* >«шет© на рекомбннмнами Вахуловжруов чрез генното кнжеиеретво, които екс дресират протеин ока тшовкв, епос ©В мм да направят нодооспособен гост ©приемника пв-Зьрзо, отхолкото аакуховируската зараза пер ев.

/асгоящото жзобрвтехж· осигурява нов жжоахтхдждмо ефективен дептвд, аначлтелхо оречхетвх в жзолжрад се от отрова ма паяк в неговата соли, држедлхвм в земеделието ж градинарството.

Зчнта се, че имоектмдмдх© ерективнмте звптвди ма това мзобрвтеше к-ат мо зноока стече» ад сал ек ги и лост за безгрлбмачмж в по-специално вааектм.Освеа това, инсектициди© ефективните пеятид!

12· оъгласжо наотояжотс изобретен*·, е показват че са пс-адсско ефтктжввж жисвктьджда са>шо зажг. за земеделието врудвтелж м по тоеж «ачжя е е очктат че представялзат ва.-’ч?ь пр»ноо s областта на «оятроляра— нет© *а ВеогрвВкачнж зредктелв.

Допъд«т®лнс, настоялото ? зоВрствю е ссугурява яова значжтел· не ваолжрааа ДШС последователност, ходкзгдз. ичоектжандне ефективен поятжд, по зъдептво жзолврад се ох отрова яа паяк Mgpietle»

Яастоадото изобретение осигурява съз.о та-β в нов реяоввжиаитен екепрвойоиек вектор, съдързадг JWK последовател пост, която кодира пнсехтнцидпо ος «ктгвеп пептжд, по сътестве нзолирад ее от стража на паяк Digvatin, ,където векторът е способен да осъпествй експресията ва споменатата нодисажа последователност в трансформирани хдатхв.

В допълпеаке, частоядото изобретение осигурява чове режомВа кантнн клетки, ма гоотоприемних, трансформирани или пресечени с Д1Ж последователност» ходжрада кжсектнжи.дке ефективен пептжд, по същество изолиращ се от отрова на наяж Tiguetia по такъв ини даващ зъзмовмоот на клетката на гостоприемни* да експрес®са споменатия пептид»

Допълнително, пвстсящстс езо<регенте осигурява но» оекомбхпактем бакудовп аус*н екс.трееиоием вектор, спосоСея да жарава жлж скспресжра ГЖ последователност, кодираща жвсектидидяо ефект» вея поптид, то еъшеетво жвслирад ое от отровата ма паяк Mguetia в гостопрмемдаюе жлж » клетка еа кноект-гостоприемнмк·

Допълнително, неотоядото ивоОретекие осигурява нов метод за получаване на тнсектицидно ефективен пептжд, по същество изол] раи се от отровата нй паж и пвптжд, получен по тоаи начин· методът вклгчза етапите на култивиране иа рекеивинаятнж клетки на гостоприемния, където еджн увкокОинактея екепресиомея вектор, • · • · · · · · ···· · · · · ··· f равоформмрам asm мречьажмт а лл’лематвте нл«тхш*’ва *гоотоармгчажж ама ДЖ аоеледааагоаи^ех, надьрлш лшсктидяджо афсковеа жежтжд, ао овч««»е жаодмр^ч αβ wt оранта жа пали Г1дш>Т1а ,кжто споя·* аат»я ««стар · способа ооъзестжв «мжрстжята аа «асасавтата жоджреда иоолелсвателдоог ж трамофоримрввжтс мию | ж авомошниг жнеектаджадо ефштмвек пштвд о« извлича от ржом^мнаатмата млегвчна култура от гиахопразмиж·

Домьлймтвлмо, тста-щото жзобрвтевкй оожгуржва лозо, траиегвветмчво раатовйс, съдиржчл© дж лоалвдвватвдмаот, кодарида жжо«1· тжджджо tlacrna яезтжд, лс owtia мзслзящ се от отровата жа жаля гХаивМа , «гздоо АЛХ досладожатсласет с> мим » заредзавив* тл лшая жа ааомшитот© разтамне ала > дреджестзлж «с. ся ом ежат ос раотважа, «аха че зиираоерната черта аа оомрзожлта за ваомежатата ЛИК 5©оедо»атолй©сг so удаслодоа ©т слвджамлтс псмйлвйия ма ваомвматото ^аохем.© чров -и*иь© р&ммиожвале лаж <ре» возиолове ра».мшожааак« ·

Двймлнмтелво, .швтояаотс мсоеретаижс овйгурлва лов метод ас кштрол н& бозгръбиачам врзджолж, който жклкязд даатактуважо жа еаешшатжте вредоедж о вфштжвао холвчеотв© от жжеактмдвдае еф»чтж»ш пшхжд, з© о.гцзотвб оаодраа се от ©трохата ма м«лк Mguetis _м квговж еолм, иржшоо » вшеделйет® влж в рраджмарството, деаълмлтелже, жастоядот© жсеРретежме осмгурлва жож метод ва кодтрол жа болррабяачнж вредителя, мо£то включва коитактуваяс жа саемежатжто зрсдатвлм с рмомЗимамтаж бмкуловмрус, ожоообоя да ахочровира ©рехтмзао количество от жжоект^дждя© ефжтмвеж жожтид, яо са>ж®отао ксолврам оо ©т стражата жа заяж Sifactia ж кеговжте зрмшлмзм s земеделието &&% ж г^дккаретвот© сол©.

Доньлжмтелко, пасгсг^отс язобретемле соигурява м©в жяеектандем смотал, овдърваа хаеежтйцидве ефечтжвмо холмчеотво от жвзектгввлио •'г-ттч -.-. -ъпготяо ©аолялащ се от ©твовата па пштг · л;5’Д<1 ί’ίη р ..*>?<- «ντο -ι '><, ,«л^вт? в аемекеягето вяв в град»* яарегаетг еожн ваел с -дае за атюяаяиете ад· градшгажт··*· иггс® песгтел.

Уояълнттеянп, г>яг·?пялото s зобретеви© ©оигупяаа яойо аятв*яя< а© същество имуиоршкакоиослосо-зно с иясштйцидно ©фектквея ιβΒΤΒΧ, по същество мзолмр&д се от отровата на п&яи Diguetia» неговат© приемлива в земеделието ш а градинарството солв.

Допълват·**®, ааотонцото кзобретеаие осигурява нов метал за използване ва антителата.ва тоьа изобретение ва откриване иал;чието аа инсемтидадно ефективен пвптид, по същестзо изелвращ ©е от отровата на паяк THwetia , включващ етапите на получавай© на ©трева от паяк ; контактувай© на отровата иа палка със споменатите антитела, свързани / спретнати/ към маркировка за откриван·^ к откриване на белязаните антитела, свързани към споменатия пектжд,

Допълнително, настоящето изобретени.© осигузлва а®н метод за използване на антителата ни това изобретен/© за пречиствана на ийсектацад&о ефективен пептид, то съцеетво мзолмращ е* ©т отрова на паяк ^г4в»*Нв _# включващ етапите ма ©зъраваа© па антитяло»© към твърда подлолка ; контактуване иа разтвор, съдържащ опоаава— тка пептад със споменатото антитяло, свързано квм споменатата твърда подложка, като ао тези начин споменатия паптвд, намиращ се в разтвора ое арикредва към споменатото антитяло ; отделяй© на споменатия дептвд, црнк репеи към споменатото антитяло, свързан към споменатия твърд носител /'подложка/| и събиране на прочис©енъя паятид.

допълчатедно, настоялото изобретение осигурява нова проба па ДЙК, получена от ДНК последователяоот, кодираща вноектнщидяо ефективен дептяд, по същество изолиращ ае ©т атравя вя паяк Diguetiа· * · ♦ · · · · · · · • ♦ · · · · · · · »·« · ···· · · · · · · · «: Γ'.κ:··/ιτ > VaarypadA so· метод сткрлваже кадежкато н& ллаежжма* кедарацд κκ··κτμιιμ·· ершткжсх сеатгд, к® / а:,г ггг® iso-op**· ее в» ©аравата жа залк

ОДтеЗДж .ькжзжв?*·’ *т’п.1?е ча получава·· «а жужлевжовж xieunx ·» яаяж $ хсжтахтув«£€ г.:0йь>ли5 аумлеоовл «жважжжж · ДО зро<а«

К£ това лзо^ретежм· ж ^ткрАваме ла з почел», тата apoia, овърв&иа кмс oacvsasTwa мукхожжожа х^есаааа.

Фигура 1 хзсврл гжва WJ? НР5© /жажвоафемгоо гечжа л^алагхгулфхя а сврахжж && ж& cfciuu ахрваа в» паяка пидм^^д,

OsaltlSS кат? «е оязлзужа 5уа.д*.«лт 0,1 X 7Ри хъ< адечвкжтржж*

Фрютз 2 првдатазлнаа 7®;; джтавижт© ксжаемаазм·

Схгура 2 лсжаавхЖ «·ο««ακ «и 1 уМ ας етмставе-аа енчечтлчяа чраазяга ;л /’трззааааг/ ав·-··a^anffty колатералок-^А 1 амрамгдальл ддг^чая. сл*хдо ® хидакишидви црж аа-жд»/’а«|.ян· а<ш:за даио чрездгпг*» -аммма»· ©патамиа ка аекдощшпга яря •©радя «и© зрш· /а/ аа 3 тжчута зр*дв ар»®аажко»о ка Ъ К j„s а /·/ з?«з пмтдоаж ©ι 1ο*£··3 мнкугл ©4 ад пдаиазппвзо <ш w Ч 9Д·

Теза отчзтожтл ва ждвятжчаж, което жакаава, ча ара «<шв гео»ж®ж«рацв.я, X К ВЛ мяка актжзао-зт зльж ЯВ · лоам да мак· да $>£· ©ахроа при т@зх аза?.

яредохавл-ава карла

, едм-н оакуаовяруееа арвнеежм еог.тор, поевя геяа* хо5то хаджра зрвИ К >»Ж,

Фвгура 4 яродотаая одая ояж» иа жшракъвяа»© драмм· «а вмдо пр® тптшеза mama* / 1000_t000 ττπ/τρ» дпота /,

Овгура S ©юаоОЕоелта «а TSX да мргди&мва яде де. зрея? вая яре/длж^к^·© от РХ >Л рааяукжшв»

А«Д»Фйиад.а.

Кахт© · ваге^вувак тук₉ жзравът кжоактмхшдм© ефекта»·» •13

1ймд, jo o*4so’-‘4t. И4ид:мащ ο<ί ο/·у*/рЬва*жа'Вадк^давШа ^и ахахл» ·» вжаектндядз© е^ховам. зейДьдл;, κμϊ9 μ вмеектвамке ефектшнш фрагдемзв at еа<мемМй?а вемкахъж шжш, докодхея·

аедзгидъж е дог ах да ?Ην ι

ла аьдеатв© ет^дамМа зооред- --'9 ч

етвом всява й да в зе давеотвл на озеиаажвегмве · гвав •Зяаоз.Такава жвтвчжицц о& лаарвшр рдеомбжшоке дожучакв жидяа ф5«кз»ляй аезтвда·

Каква е явдвдаааа ту&₉ мдовъф Веркжжът ^пек©дреензнез всх··^ вкджчва в «сторя, siPKto са сна^Идв да «воараеврвт ДНК ау-злед^ватвкЖ©СТХ, ВКЛЧЧеМХ XJK ТЯХ, ХЪД«Г9 TaKS·^ Πβ·£<Μ©ΒΜ«ίΜΛΟΟ»Μ Ш •шцугптио озъреажи -хъж др/Гг ягвжсдоалтвдаеетж, алс^евяв да. асъже&тм.£ тждаат* шазрвахкаДадразакрп. е е, вайрекж че ма ааиаг» дав жвърда каякрттжа, че *ом «иареошв векшрм «р^Лва да йъдат възярджзаедуху; з оргпж'язкп-гоотозр4’©4ксмжв ш иат© «ъдймй. хх* жвта верхедвлна чазт ·« хрвмоасмавяата ДВК*Я*ж© е, ч· лжжшма ка въвтроавводгияев 4% гж жаяравжла ервквъжаа же«аерат»авж,Шсбшеже, ввравъж ”окезрсахоа®! аектер* ярафт овалва едаа фуккдяочаяаа дефв* жхда.~ ж всяка 2Ж повйел©аат£ЖйСЮ», която * ааооевжа да еоъ-деежжв •всяреопя на едк еяедафжчев ..W код, разпежокек s асл е wjuhok в тези термин, хава еъдгят ет аргЛаГ4 към еаежкфжчг&та поаледавв· тенаост.Обгкневсхо, ·.,? талгпгвяте вояршвшога вектори а рехаьгбккапттгтв СТ гехжккж чевте аа вьв ажд «а •хлазмждж'·, кожте ее ©«вавжт дс трьс текове дка дтсДжо-уеукака ЛЖ, хмий з тяхната •взеторвг. 1ор<-а че еа евърввяж .пък хр0к©в©ма«аЛ1иаФмгд* ж ·««»©>· ее кздолвунат за^ж.гг*о, като зжазгодът е тай-о^жа^знолгвякета ферма жа вектор^Обече, жзе5рот«®ието възжажврява да ш»!» ж тежки другк £орев на «ежреепшжж вектерж, *ожте жвяъдажваж еввжвалежжжж Фунгдо к геят© аоеледоватедио етават жевветжи в зракткката.

»Ре*омбвеаятяж яжеткт еа геетожрж-ешгк· ое отмжав да

17· * * * * · · · клетки, кожто оа ©или г?анс ?орл/ф.ши с КекУори,** ©издадени като ое жвлолзуват рекомОйзгхитмь дш техники.

налдате от семе«стао· X'Pietid®е светавлязат единствен род, Llgaetia , rif.vrti?' ®ргс.1ея оеивиовеко ое накарат в хдозаиадн/те Съеднаои.. .д/п. / аклтмтелио Калифоримя/ ж ексикс. Тези малки маяци ианл^тат с^^лн* наашвж е жеарадаляа форма аърху всякакъв жмд ;аатевдя ж -.-рдети, тасдхявтелмо м върху кактуож.хЖмн1мч ивте видове -^v^^a*^^a ₀& чодоОни ма товечет© паяци хи^ямда, чожто 0 охота ое храаят е ьрьхлетялв ги инсекти, ьъцракв че яво^ретею ето ее ое огралкчава до някак»» теере· тмчоохм довода, меооикдовената сьмдтом-лтааогия, а&^лш&ъдаа внрвскваке на мноектндадмо ефективните яедткдм на това ъзсшретени| в имомтж е много аедобма да смммтомжте» наФнмажажж когато ее ми рис «са аесатрьджк, един ал.чаломден Хха^м активатор ма ю<а* .кавал ама токо и ма от окорнаон от оамеметво SutMdae в рода Butfcn· навестик като преоикяптичет активатори на Ма^г халал.· предполага &< че оломенатмте жноектмцидво ефективни зеятида могат да црвчикят часткчна деполяривация на мускулните к/млк нервш те цеморани, внзмоамс влгяедаи ма На* яла К* камалл.ио^епедаалмо» очаква ее» че споменатите жноектицждио ефективни яезтидж ярячиняжат повтаряцо се експлозивно разтоварваме в нервите, които еа чувствителни към блокиране от теtрод©токсин,хака, вероятно чувствителните на напрежение натриеви канали ж£х мембраните на нервите е длетото на действие на тези аедтвдм.

ь. «.аол&раме на пептидн от отрова на итрода от паяк «оже да оъде отделена от Dlgaatla аооред’· отвом ко^то м да е к.заестек метод» кат© екстракция от жлеза на иакк ох цефалоторакер‘ оглед обаче да се избегнат аримеож е отровата ма игкка и изолираните токсин», за предпочитане отровата ма паяка ее получава чрез елострнчеека отмиулаци-я на каяка, жа Д1

-ι-J** * * ·· ·· ·» ·· ое арлчяял ©свббеж,.7 3^|е кя глухата и последваце всмухваве жа в©вободоната отрова,и п :^д©7л»р.-т.яаже вамъреяважото жа отровата

-·* чро» жвтжчаяо жавад или хемолгмра, както « озвоако в Патакт ма

0М1 4,fBP,O4<

^•лед като ое получж отр&аага от палва вре· техники?· на електрическо довареждане, ©шата може да бъде рракци «играно не неяижте яецтвдмм / токснновм/ компоненти, кат© ое използува високоефективна течна хроматография /' ^rtB рь С^н/ вля хроматография е гоиха рклтраижж или чреа др^-гъ долови* методи ка фраквяемнраве.л допълва* нме,ч ест© е желателно яа крайно Фракциоиираяе жа отровата от паяк да ©ъде иввървеъа виеояо-ефективиа течна хроматография .

гака, като ое използува метода иа електрическо ^саарехдаме, от паяка звьраан с хроматография s гелво филтруване ж/илж с течна хроматеграфмя е висока o-уективмсот или *.?угк пожобнв техники, тежи ва като хроматография с хидророоя© веадмодежств-ге, е аъзмосто да з получат значително пречистени токсвки от шяк.ч*е бъде арецемечо оваче, че и други еквввалектни толнввж също могат да въдат женел· звавъ в обхвата на настоящото иасйретев^е, за да ое каодират т<жоами от паяк,дака маоаъраммте токсмвв ^огат -и? оидат оценени ва амимокмаолммма аоолодоватдлност в васектицкдма ахт.й»'юа'г чреб лезката ка оавщмалмет»·ie * тави оо«»аат методи·

Ь· > и©ек»ι·цидно ефективни пеятидж» част ©якото вао*»рет«мге в екюн от кояемтито ой осигурява иасектвкидао ©фоатъвон псатвд и мегови вмеектг.цвдва ефективни Фрагменти, по оъцоство «речЕстея и ваодиращ се ©т отрова на иаяк _м неговите п ри смай ви за земеделието вли градинарството 0 ©МЕ .

„лед взели рамото ма лмоекткцидмо ефективната, съдвраица я« тид фоакдъя и след като е пречистена както е описем© тук, опреден ip—· мето иа амжяокжоелимиата дооледсвателиост може да бъде жззървено по хобто и да е известен на опедлалкотжте в тааж облает мачжя, като например К<*тер»'нална аминокжоелвижа последователност и жзполззаието иа авто ; нгизиран секзеятор на аминокиселини.

От описаното тук че етан® ясно, че друга ммсектйцидн© ефекти вкн протеини ©ъцо ее очаква да бъдат включени в обхвата ма жзобр /

теяието.Т.о·, .предполага ее, че други инежтвцидхо ефективни певти ди е възможно да бъдат изолирани от Mguotia освен опжсакит© тук подробно трх. аептида.Сдедвацото се отнася до едно семейство жноекткжждн© ефективни кжкххди протсжик, изолирали сс от

Членове от това семеЗгтво ннсохтицждмо ефективни пептиди, изолиран ©τ^·®·**^ мат следните характериотикжз

1/ Размер: при веички варира между около 6200 до около 7200 далтона и дължимата ка ачваакисединната верига варира от около 55 до около 65 аминокиселиниι

2/ запазен амиаокис©лижех ториммал: ЗЕ<? И) ЖИ 1» 5 и 5

са идентични за първите :от амьнох.ьселини ;	хомоложа и ос ле ис
З/ЗБс II· Ж)|.	1,3 я 5 имат повече от 40 4
жателмоет ;
4/ЗЖ‘ Г‘ Ж>1 остатъци ;	1, 3 ж 5 имат около 7 или 8	цветежжем eeoaoe

5/ Гружжраже ма гена : гехжте за аооечо от ©дим от тези тохеижж хзглежда еа еълокалкзжраяж участъци жа геномна ЖК, което е въамошо да означава, че теза геям могат всичките да нрохзлжаат от един едижотввж наследствен ген,

По-специално, трж кноектидндмо ороктивмж пептиди оа кзоорамж и охарактеризярани.Първкят, DK >.2 е изолиран и неговата амин окис елжнна последователност както е разтълкувана от изолирана) сДЮС изглежда както е определена з .Данните от масова

Й J* опектросконих показват два жзозжма, съдързищн една запазваца ъувать· туцял /замествахе/ пр- гозмдгя 23. единият нзозям съдържа, треонхх πρι позиция: 29, а другият съдържа глутамжм при позиция 26.Глутаминовжят жзозмм е е около 27 атс she ааоови еджнжци по-голям, отколхото треокинозжят жзоохм.По-нататък в описанието, всякакво цитиране на Р К 9.2 трябва да ое интерпретира като цитирано на който и да е ж/ил» н ка двата изозима.Х) К 9.2 се характеризира & молекулно тегло около 9371 * 9397 дал тона, както е определено чрез масова спектрометрия х преместване като единичен лик върху виеоко-ефектввма течна хромат графжя σ обратна раза, вторият пептмд, DК 11 9ехе «зохкрам в ое характеризира е чолекулмо тегло около 9700 дал тона или около 6740 дал той а, както е определено чрез газова еяехврометрил в преместване като единичен пик върху високо-ефективна течна хроматография с обра на фаза· По-специално, тази активна фракция на вкеоко··ефективната течна хроматография /Н?1 С/ е идентифицирана че има ачяиокисединна последователност, както е разтълкувано от изолираната сДНК ж какво е показано в ЖО Ш Ж>»3 · Накрал, един треви член на веза вноеквицидно-офектжвхо протеиново семейство, 0 К 12 е схарахт©ризирая чрез молекулно тегло около 7100 далтона или около 7030 далтона, какво е определен© чрез масова спектрометри м се придвижва като едкиичея пвк върху вечна високо ефективна хроматография © обратна фаза.

По-спецжаляо, тази активна фракция експериментално показва че има амжнокжоелямяа последователност, какво е показано вЗТг ГГ МО· 5 ·

Трвто изолирани яонвжда, съотвотетвацм маЗЕ<? ХВ WS| ti_t 3 ж S проявяват по съцосвво еднаква кнсектмцждка активност.Очаква eo_t чо другжво пепвждм, амацв около 9S до 96 аминокиселини, по-голяна от 40 4 кочоложиа последователност v^^r' ® ii_t3 х 5 и приблизително 7 жлх 3 циотеиковж остатъка де проявяват по същество съвета иаоектицидаа активност.Такива пептидк тогат да съществуват в ·21· ... ,, природата жлж могат да бъдат' чолученя чрез’метйДж Ма рекомбжнаитна ДНК техника, познати на апец^алмсткта в тази облает«Такива иентмдя независимо дали еа естествено срещащи ее клек еа получени рекокбж· важене, ее ечитат кае© адслхчеяи в обхвата ва това изобретение» Г. •'дежтжфжкация ма кодиращата последователност на жиевхтжкндио•факти вижте аептидг па тов? изобретение·

В друг аспект, маетоящото изобретение оежгурява до еъщоотве наалжрава ДЖ последователност, кодираща имоектвщидко ефективеж пептид, до същество изолиращ е· от отровата жа паяк Oiguatia

Като ее вадела ват дамнжт· за частичката аюшокио единна последователиеет, получена както е оджеажо по»горо, гените, отговорни за произвеждането ма протеини, изолиращи ее от паяк, могат j бъдат изолирани ж идекткфжцжраим*На разположение еа редяща методи за получаване иа генж, отговорни за произвеждането иа пептид, Примери за такива методи са^ипиа и сътрудници Обинновеи ?Cit метод за открмваже в кмоякраже ма инак жзобилва трамкркпт/хонже/’ BloteeWque, m«9, Jio«2 (Ш 1)90) | УетйлмцМ.А.,

Вид* Бързо увеличал»· иа с.ЩК кражща^й _>₽СК protocol·,ей.Iaaiа ·< <1990} а1«,Асяйеи1е Free®,S^n DU^oiSrа патент иа CU ς 4,703,006 *Д2К поаледователкоетн, кодиращи eparponjHHBUf ко^то патент · • »хлА.чек тук чрез референция»

Накратко, синтезира се една ЛЯК молекула, конте кодира определената амжмокисалмака поаледователиоот клж конте яредетавлн допълнителната ДНК нинка към такава ДпК молекула, холто кодира определената аминокисединна последежателиоат«Т&ав синтетична ДКК молекула може да ее използува след това за проба за хомоложжата ДЗК лоследователяост в клетъчни клонове, съдържащи рекомбижантиж ДЯК молекули, които лклкчмат отчасти ДНК последователности, долуч аи от геноняа ДЖ жа даден организъм, кат© например ое лаяк или пък полученн от е^^п/ копия на м ДИК молекули, жзояираил от клети

-ΓΡвля тъкани аа даден организъм, к£Гто*Ааяркме>* от ·ώύη «Обикновено оа необходими ДНК молекули е петнадесет /16/ нуклеотнда жди повече за уникална идентирикацгя на ход сложна ДНК, като споменатият б pci изисква уникално определение яа най-малко пет /а/ амкиокноелини в •див последователност».^ бъде оценено, че броят на различните ДНК молекули, които могат да кодират определената амин окис единна после· дователност може да аьде μηοιό голям, тъй като всяка аминокиселина може да бъде кодирана до мест /6/ уянкалаж трииуклеоткдми ДНК последователности или кодоаж«Сдедователно, не е практично да се тестват всички възможни синтетични ДНК проби поотделно и се използуват като проби сборове от д-колко такива ДНК молекули едновременно «получаeaseто w* такива сборове или пулозе,които се цитират като дегенератни проби ж! добре изяестиа в практиката«Slo бъде оценено съцо така, че докато са де една ДНК молекула в пробната омео це има точна лом сложна последователност за гена, обект на интерес, то няколко от ©иитетичяите ДЖ молекули в пула могат да бъдат способни на уникално мдеятифяцлраие иа спочематяя ген тъЗ като се изисква сало аиоока стетел на домология«Освен това, успежж взелирайе аа гена, представляващ интерес може да бъде иззърнено със сборове или пулове от синтетични ДНК проби, конто не съдържат всички възможжк Ж пробни последователно©ти.Обикновено, кедонм които се азползьат рядко от организма не е нужно да бъдат предова· вени в пробния пул. Фактически, една единична последователност на ДЖ проба мока да бъде получена чрез включван® само на ДНК кодони! конто най-често се използват от организма за всяка аниншне елина, въпрши че це бъде преценено, че това постижение е не винаги усяежно.

-,даа техника на идентифициране яа генна последователност /сдасвенция/ използува полимеразната верижна реакция /РСГ/. Внж ианраиер патенти на САд 4,683,1*6 и 4,683,SOS, които патенти са

-23« ·· ·· ·· ·· ·· ·· включени тук чрез референция важната пожммеразна верижна реакция -»3SP дава аьзможиост за получаването иа небрана ДЮС пооледователноет, когато двете тершшални части иа е «каем цвята еа известни. Примерни или олигонуклеотмдям проби ое получават, които светват* отват на всеки краИ аа лоаледодлтелността/секвеицията/ оЗект иа интерес .Като се използува ЖР, централната част на ДНК позледсвателноатта се получава след това емнтетично.

При еднн такъв метод с използваме ма ОР ва получаваме на геяа, който кодира уникалния ген ма отровата иа паяк, ЖК ее веела· ра от паяка и ее пречнеоа.Олигомуклеотнд иман оа край д секси тимивн дилат ое използува след това като пример аа да ое превърне -ΉΚ на палка в сДНК.След това ое получава е ада синтетична ДНК молекула ши аиес от синтетични дКК молекули както прк дегонератната проба, описана по-горе, която може да кодира анино-тормииалната анкмокаео* лннма последователност ма протемна ма отровата, както е преди това окредолемеЛанз ДНК с-изс се използува заедно о олигонуклеотада, окончаващ с деокетткммдглат за да започва 8CW реакшш.Ш* като използваната ©вятетячиа ДЯК оиео за започване на FW реакцията е специфична за желаната м^Ж последователност, оамо желаната аДНК це бъде ефектквко уголемена.Полученият продукт представлява увелв* чена оЖК, които може да Зъд© свързана км която к да е от редица» иавестни клонмрадрк вектор».Де бъде променено, чо в отровата ъа паяците могат да еъцостауват оеиежотва” от пептмдя, конто не имат подобни ашшокнсединни последователкоотж м че в а луч «.в използването на оиесеит олигешуклеотхдам прзмЬрни последователно©тм може да доведе до увеличаване ми един нлв позече от близките оГМ , кодиращи теб» орсдвв пеятидн.Гените, кодиращи сродни яентмл оа оъцв в обхвата на изобретен», ето, тим като сродните пептида сьак имат полезни Еясектициднт активмостл..

*£4* ...... .. ., ......

Накрая, полдаеяата c.IHK *гоол*едеватолиоет*може да бъде кладираяа в подход/; д вектор, като з© изпод»ужат познати техники, анализира ©е и ев онредажл нуклвотидната базова последоватажкоет*. Д1Ж последователностите, кодкрацн инсектициди© ©ректианн протеини оа предотазеии например вВЕг In ?Ю 1 £ и 4*£дяо директно тълкува· на амвмоквселините на тези ХПГ продукт* де покаже, че те еъответм отвуват ма завързаната кодирала последозаталиост за зрелия иротежв .3 дол-лззнпе към аддх кодира дата зряла X/ К 9*2, оЩК поел ai затзлноотта по принципа па лрогинотока на X) К 9,2 ходиралата лослг дозатедяост оа клонмра и сшаоадмра /ЗГг Ip N0 ί7/»2ьлкуяаието на здз-разната мРНК показла, че D К 9*2 е синтезиран като един прекураорен протзня, оъдържац сигнален пептид, пропептид л зрял такоин.Дейатвжето па сигнала..;; пзптид се счита че е важно за цоловата сокрещ/я да аммтазираи яентад лслжпептид,Сигналната поол< дователкост играе важа а ролл при осигуряване на подходящата локализация ма иозо-свитезьраджя протеин «Главно яй осигурява “тояогеинж аигн&лж* /В1оШ,а.Ргоа_шЯа9.л©аб*8в1.«,Б.2.я· 77, 149^ —1^00 {1980) ₉чиято задача е де прикрепят протеиновата пеолодователноот вък различни чзотон&змачеяия вътре з клетката жя!

въмнната страда за клетката.Това е особено яалзао за секретнрш иж протеина, чиито ©жгн&лпи лоста ©а извънклетъча©«Сигналната последователност © от полза съцо така и при пропяводството на рекадбинантен протеин, тък като mow до-леон© да бъде прочистен» «копр&зирания протеин ©т извънклетъчната среда, откодкото да трябва да се разтворят клетките и да ое пречиства от ©бщИк клетъчен котракт «Код* радият сжга&леп пептид от сДЖ, кодираца за прекурсорнии протеин на 3 А Х.2 се счита че се състои от 17 шшиоки©©лнмп със следната последозатслноот:

—Leu-51u-Slu-» 'sp—Lyfo. Asp· Αΐ^Αβρ·!!© αι.«η» i«p^etwGlu»,AroЬеи»Зе₽»Ьш— *1*-⁴1 -wV’p.l—п.щг-. Q.a

В доагншевке квм с?. гаелн-п юзтяд, раачдеажето аа жУНК ршвводокажа зо прмиддва яцотяветоча аа 2» К PJS коджрацвта пооледоваX тежжоет показва еджч з /с лентяи ‘..е^-зтвжатс ва жрааавтжджата зооладоватаяжовт е жежзвестно.Jроасптмдът е едни пвятмд о 21 ачммоммсолжжя със елвдаааа последователност ί * тйм-еи- * з р-Ьу з» * £ Р* 11 ¹ ©Р-П ® «с -ie t-Leu— А в р—i s r-J’ го— 1: w * ε- p»£t.e t—61ο*».4τβΡ

Im зревурооршз аввмда жлж зреяр&с ек в акцията, могат да допринесат много за отаамлнсотта, шснр&оижта м дубдхр&нето па Х?К 9*£ «да друга рековожнактмь црстсмнв, когато ©е ексаресжрат яж 8«ао ж/жлж мм ажт ро .Иредни-жа «© също така, че тезс посяедоватедиовтк жлм t«ttk чаотм логал да бъдат от полза дрм «сеяреемата яа други молекули, яазрммер дра ксиструмраже на даден геи» Като част от това изобретение са ж осигурените от нае дамяи, «ожто да потвърдят, че ж други оигналнй ж/млк аропезтгдмл поеледоватаяжм тм биха могли да бъдат мзчовзмажж за екодроожктз иа рекомЗгиантеж β К 9.2,

Д» Хекомбяиаитма експресия»

Настоящото изобретение ©амгурява в допмкенг.с рзкомбинактаж експреси ©мен. вектор, съдържащ ДшС последователност, която кодира инсектицидно ефективен цедтжд, по сьщеотма мзслмрад ос от отрова ва жажк^Ави®^!® «Зовторът е споообов да осьцеотзж даозроаьлта яа кодиращата последователност в трансформирани кдсТлизобочп.сто осигурява съд© така и реконбииаитнн клетки от гоотопркаиш», трима форми ранж или тр&яофвктираам с ДйК дсюладозателмост, кодарада жжоекткцмджо ефективен яедтъд, и© аьщестзо иаалмрац ое от отрова на зажВМн·*!® до нмчвж, лапад аъзножаост ма клетката-гоотовраок* нмк да «кспрвсира пенткда»

Осигуряването аа подхогзща ДНК поодможагшаст, ходжращв хажажмлж аротежв алява прсгззодотвот· aa яротекжа, като ее »аползуват жзвеотдо в дрантихата техшши«Кодираа»*та последователност може да бъде получена чрез подобряваме на еЖК жлж геномма последм еателаоот от естштаеп източник дротеан млъ може д& Оаде получела зо гзхуотаен мачмн, к&тс се използува точната аминохиоединна последователност, опрел елена от милост» дяата последователност на тежа· Когато кодиращата 1Ж се получава синтетично е благоприятно да се вземе познат предпочитан ходов от гостсприемаика, който co възнамерява да се използва·

Вкспресиожните системи, съдържащи нужните моитролнв оеквсед циж/гдк последователности/ такива като например промсторк ж за предпочитане усилватели в термкиациснни контрол» оа лесно достъажж в дозкатв а лрактпкетз за различни гозтопржемнжци^жж например, SaBferoct и сътруднадж, ^olemaler Cloning а ^Ъотяхоту »^аая1, Second xid, Uoxd Spring Harbor ?reee ( t$3)i·

Рака, желаните протеъи^ могат да бъдат яслучени както в прокариотжчни, така ж в еукармотичик системи, в резултат на което, а случая с много протевни,се получава един спектър от обработен» форми·

Чай-еироко използваната ирожаржотична система запазва 2.C0I¹· , въпреки че друг» системи, като например ^*eabtiii« _β Pseucoaonne _ов очаква също дм бъдат от полза .Подходящи контроли» последователност» за лрохариотичам снет ши включват както коязтитутквжж така и нядуднрацн лроаоторв, включващи продотора, промотора, хгбридян гтмзмоторм като например*^яс пре-отора и-паойе рМда Pt иромотор.Обикновено могат да се получат чужди протеин: в тези гоотоприемиици или като сливане или като зрели протеини. Иогато желаната псюледсзатодасст се получи като зрели протеини, поду» мата пссжедояатадхоот бъда предхождана от кетионжн, κοί»ο не · необходимс да -5ъдс «с;рзн«й.Съответно, пеитвдмте х аротежката, за комтс о* :« ротен д.тук, могат да бъдат предхождан® ат 1й-термхяален Мат , дадучааат з бактеръя»Оаавя теза, могат да бъдат нпир-Шйеу ατρ,,χτ^ρκ, където «сдвражата последователност за пепткда ое цреулок^ от операт®вон окгаадоа дозтад, поете вода до еадроджат* на дретенка«когато ое произвежда в ароа®. ри етична root заря еааадж по «амин, оягналмата оеявемдзя <зе отстранява пр е ах рецйжта.

На раздоложенхе еа понастоящем май-раалжчжж еукаржотячкя гостояржемшщж ва произвеждало аа ракембямзитнж чужди ^рстеиаз* Кяхт© в бактерията, еукар»етичните гостояржемажо могат да бъдат трансформирай» е екепреежожо системи, жооо произвеждат казания протеяп дяреитяо, «© по-общоаржото е осигуряването на. сжгжалжхта последователности, ва ад ее повлияе к® секрецията ма яротахаа. Еухарнотжчкмте овотемя имат жщв «да© допължвтежяо предимство, че те еа в състояние да обр^ботзал интрол», <онто лог&т ад ее ореадат в гедомявте дослодователЕости, колвращг проток» на »искъ ерганизки»Х йукариотжчкжте сшн». осигуряват също така различни мехаяизм: иа обработване, което аоди до например до гликозиладия, оксидация /окисляване/ мля дериватвзащвя на някои амкхокиоелмш1ж остатъци, структурен контрол и т.н.

Общоизполавеките еукаржотмчян системи включват дрожди, клетки от жясежти, клетки от безабяяжж, пткчх клетки и клетки от вножи растения.Изброяването не е изчерпателно.rfa раааолож®ое еа подходяща промотори, които са съвместими ж работоспособни ярм употреба във всеки от тези тилове гостоприемамци а така също са термжнацжонми сжзенщо « усилвателя, х«тс например бакулонкруожж! полахедрияов промотср.Иаито е посочено по-горе, промотори»е могат

-es···*.··, ,··..··. ......

_t * ' * · · ♦ · » · · » β t да бъдат конотитутизаи ш жи ..удгръйй oe.tianwH·?» ‘©’ежетекн на бозайници, ЧТП проноторът да бьд© цндужкраж чрез прибавянето ка Йоик на тезки метали.

На еаецйалжотмте я тазл ибласт на вззеотнм подробностите за мзграадането на ©ксярео^оздг е*ют©о,3а реконбммажтиото проьзвевдаи< на протеин, ДНК кодирането е ло.-.додячо да ©е ©върже вътре в екс а ре©«©ината система по избор и след тоаа системата е е траноророра з оъвмеотнмиж гоотопрнемнмн, който ©лед това ее отглежда в поддържа при уздоаня, ффбмИИ ир« които ое извърнва еквнраокя на чуждия ген·. Така педучеякят ияеентицядас ефоттмвш протеже жа това изобретение ©е 1'3.адича от културата ш чрез лизиоан© /разлагане/ да клетките « кан ое културедната ©реда, както е аоджодяцо ж известно иа one— цкаднстчте в тави област.

Яомо е, че минимални модификация яа първоначалната ачияожнсединна лосдедоватеяност може да доведе до получавано «а протеини, конто инат по оъцеотз© ежвйвадемтца или ©аонд«к© активно©?, в ©развойно с аватидмте, експериментирали туж.Гезн модмфнкацмв могат да бъдат предваргтедяо ©бниолежн, като например мутагеновкс насочвам през определено място или чж дсдцфихацжвте мотат да бъдат случай*· ви, дата например чрез мутации в гоотоярмонмижа, който произвежда дяятида ма кзобретението, като веъчкн тези модв^мкацив оа вкр^ченя дотолкова, докожкотс иноектдифхата активност е запазена.”ДутацмяТ« в даден црот<шн променя неговата пъраоначадие структура/ отпиех ое до естествено срвегад се или специфично опвеаи протеин/, което ее дължи иа πречените в и;/клеоти.шн«а последователност на ЯНК, която го кодвра«?е*и мутноии епецн.->чно включват алйличям варианти.

хутациожинте промени » първоначалната структура на .даден протеин, могат да бъдат hi ол учени и резултат на зрибавгне или зам ес тван ».^ППремахамхе” е определено катс е.хим .-юлгаентид, в но.«то е χι-н илк повече зътреяни с .«-.нежноел^нн.”! остатъка липсват.Прибавяне © онредодм© • · жато а мша окис siukk

sacr.wa чрез замествал? на един йлл повече змейоки©еляжзя остатъка е друга оетатъць. Ъотезяо» «фрагмент* озяачава полки еа«жд,еъдър<» жад зървожачалжа амияок*сшвгша последаваталяоат, която е вдавтжчяа аа едва част от пързошачалмата аосдедователиос* жа яротвкжа, към коЛтс ее отаазя по«*с»птпда.

Предпсчжтаав ’Чзмеотважжя· еа този, кожго оа «ожеерзативля^ «♦«.където даде» остатък ее замества. е друг от същия ©еяовеч тия. Яожо о, че еетоотвеяо орецажжте ое амтпокиселияж могат да бъдат кд&офждтраня в подклавове-, като например виселичяж, алкален, ж®утралжв в лолярмм в яеутралит ж меполяряв ж/вжж ароматчи.Оввхнев екс ое предпочитат tee* коджракя яептв дв, комто се различават ат еетесеземите >ормя, съдърващи зачеотея» кодояж за амжяокиселини, кожто оа от същата група, кадто тези на аачеетожата амжнокиеелжжа.

И така, глави© алкалната ач^йояиеелаяжЬув, Arg в Hie са ваажмозакевяешц пжоеликквте амюнокгсел?.ии ‘«5 п й»* ваажмозане· жломж > жеутралжита поляряж амйискиеелжяж^гУ^Лг^^йВ.Мв ж Ажа оа азчамозамевеемг > меполлрайте аллфатиж киселият «Ху^АХщ^Ш V<_tXj«T_{iest оа} коюорк^тмвяи яо отмовеял® едва във друга / жо пора дж размера,Му ж Из са по-близко овързаяж ж VaI,Tle жХ»еа еа до-блнзко овързжжв/ ж жромътжжте' лмии<жшс«лжвя ^Ъе.Тгр * Туг оа »за»ч©»а’4зяя«о ·

Шар че V© о меволнрма меутраляа амжмокмселжжа,оъ1ата представлява трудност поради иеЛвото влхяяже върху хоиФсрчяпжята и заместваме със жили жмеето Pro ме се предпочитат, с жзключевме когат© могат да ое получат съдите жлж подобя® коифортжжожки резултат®.долярвм ачжяокиеелжмм, коя*© представят кожеерватммнм прояем» вкл. чват Ser_tfki ,ΰΐη, .βη | ж до по-малка етеаея,ш< ♦· 3 дояълмеияе, въяракх ч® са кллсифв.длражв а рдзлвчж® хатегоржж, «•CJ—

АХа, СХу ж sar ягмш че o* μ^μ«μμ№μηι нсуг’дояъливтеиив мкм в тазж група чоже гъда кжаежТОцараа · яевярввет аеутр&жх ададокжсгл;л;я .^лкоя зачаотвакжж · кодови за амвкокжоелж· х>: от различни ju-'-одо цогм* сио да бъда* ее полза·

Порадх еежгурл&хнето ьд ^жонбвжажтжн матерналж ва apetemn зз жс ззобр етани «то, тезв лротс^ш могат да бъдат получеиж тя» Р'«<омбм-.п.н7аа тежаажа, както м чрез алтоматжвжражж ежктеааторн на амш! смие елини .Поради ралжообразиотв от неет-трамолвдяоммж харажтвркотжжв, дадаяи от раалмчжх влеткн-гоотавржеммидл се яояу» чааат оъдо ж различия аодмфшажл жа οοτοοτβοηο-θροημητο от нротвжжж» Вджж йодиращ* раи* жротежж оо различала ее иемодхфлджра! явя нротежя » резултат от поот-ервжаладжекжж олучаж, конто ft реже· Я£1 гзжхозвладията, вижданията жлж модела жа лиивдадзл вля ма яървмчаата, жтпрвчлата жлж тр&тжчжата структура на яроеемка ж ©а жочонж разбера е© в обхвата на взобретмьето, както · претемдж· .раи©»

Би трябвало да бъде отбелязана еевон «см, ч© ако жоемз·» те ту» яроеекяж, тахвва като^ ***>1 оа золучеал оантетлчно, mow да б%де иалразено замезтвлсс е аглжисквселкжк, конто ке еа кодвшшж от гена .Алт еркативш* ©ет&тъдя включват жажрнмер ааош«квоелмжжто а формулата Н^М/Ойр/ж 600Н, където g е t-β»

Те оа кеутралмж, жеиолярнм аюанохнселшяа, като назркмер оарковжн Я®¹ /, т-бутвлвлажжж уИутжлгднджк Ь1<-мвтвл жаолевдвм ι _& морловджж Я®*® / »>ожжлглжцнжът вндример може да бъде замеетея е Тгр, Туг жлж^® , ароматна неутрална амжяокже«лжяа | джтрулжм /€W ж метжожнжоужфоонже Jb$ / еа яоляряи но неутзалив, цшедохакежлал&нжн е неутрален ма ж жеислярон, адотежиовата хкошка / ©уа/ е кваелжжжа ж орявтжж /Оге/ о алкаленЛожформаджятв, дазжда евоРовата ва пролваовмео оататъдж може да бъде золучена, ако един нжж до»ече от теан оета· • · • · • · · · • · · · · · · ··· ···· ·· « • · ··· ·· ·· ··· _β • · · · ···· · · β тъда · заместел с хндрожовпрслви’ / *нур/7......

2* ТраиогенеВвчнк рас-гепкя.

.аотождотс* zaOsipstBaxe в допълнени· ©ажгурява трано renew®· растения, амъртди ДдК зосаедозатзжмоет, кодлрада. ипоехтмцждно •Иктаваа дадтад, а© оъдаатзо нзслароц ос· а? отрожа иа паяк въведен в гшогвчната лгяня аа раствмлетс, тава че жарахтериите черти на шодресня кд Д-Ж соодвдозатвлноатта е· умаолвдязат от •в«даада«е л©колемна ни раахвдаетс чрвв полов· рдамножаиан· дам йегаолово раздно^аваме·

С

Гените, коджръда имаадткдидда ер^н хазните пштвдн ©ъглази· вдатождото кзобретеа.·.· могат да бъдат зъладеим в рутени ето чрев тданикит· иа гедаото лмжез&тво, кслто зрм продададстззто за легенда в кдеткът· на рдатнкдато ое очаква да бъдат полево като средата© з<* «©итрелираие «а вредни адоеноми*0о»зн тава, з»зчо.шо е да ее получи рдатажяо, което лхжаа по-лесно ясваож пдосл&мгт·, отнолкуте оатеотвдао-арсдадатв е· амда»·.

Кодиражвмт уча©*·» аа ажоеяткцидао вфгктввиия вмгттдвв гш, вайте може да бъде мвпслзиак за трдаф&рмграио на растезгето иож· .дЛ' w дс бъде далата дължина кла частичка дагиана дъдзвжа да тома.

Необлодр.мс е обаче, генетичната поал«д©заталаоа«, кодираща аа леитма да бъде ©квереспрама и да е® залучн като адаз пепгвд в яслучената растителна клетжа«Счи«а се, че ДНК адкто ат гс-ноъна ДЖ к ©ДШС, така м от ахатетична ДШЕ, жадарада дасектждадно афжтшюм жж педтнд може да бъде кла ала вада жа трдаорорладая.Ссвем това, «див ген вол· да бъда моавтружрда «дагмчао ода сДГК клон, частично с гоиомея имен и частично съ© ©ймтзтмчш гал а раалмчлж кембинадав от 9&х»£ дояъдиек^о, кшрада за дшгидзи гда ножа да въдарвв «дата от рдадачда аъдове, рдалмчав от ааточжжва да изолиран-^ пежтад»

Оса е* това, енажва ое жнешет^даддо ефтткдада near ад да • · · » • · · може да 2ъде комбнкьрея е съ©джн«ине млж съедгнеамя, за да се

...... ·· ·· ·.

• · ·, • « ·· * ♦ * ·· яолучат неочачеамжте ввсдаткджднк сводства в трчизефордправоте раето* ж*е, оъдъртдо хжмгериж гекв, които екаярескрат смеджнж&ят&«?езл други оъеджожжя <юг»т да яжлдеваг прстеавжж жм»8вторж, като яг»врв· мор таивм, конто имат орална токежчноет спрлво здсекзд жяж яолт* веятмг ат ВееЮя» Л^токяът от яркчинчва «аиеяенже в прсвуеялввостта в& калка а клетъчната мембрана мв червото аа жноакта ж е® йредподага че ©йроува мажи и ops в мембраната ..цругк обряауващж хор» протон a и съдо йжжа мога» дз бъдат жа.полваанм в комбмнадмв е мчоектимжджо еевктжшште аштмдж_вП.рнмерж ям такива образуващи поря дротемзж са мигажмте» дшрошшите, аташшмт·, меятав, грамвцидам - , вротежми иа ватржезжте ноалж ж емжтетжчжв фрагменти, ^-токсавът на Jt^payiocoeeue шт-еов ааоояожретевмм в ташм Фрвгиомтв, аламетжджк к разджчаж жиъя* жи алнфатжж жевтидж.лзжтшште, кожзо оу овързват &*& жембрааж в ужилват овдоадтозата @а друг квае протевии, коитз вяха мотам да б вдаат каяелзаажв в ко.-.!бзмаджж л ижсчж?мци.дн.с оФежтйвкжте пойтидг ма каетомщото нзобротомюа, за да os хензгкчмс гастеимш ва уетоХчжвоат опряло амоектм.

ичакма ое промоторът ма яватндявя геи ж бъде йодеаен прж шежроеюраже на хваериата генетична аославодателвоот, мо се оважва въже тава ж други промогорж да бъдат от лолза^Жмж ее»аоож рмстжт лен «ром ©тор, които може да зъде аолезея е евръжрод/дм рачиш арове тор.Тевж арсмотер ее свързва оперитивяо е геаегмчяата аооасдулатол мост за пеотжда н би тразвило да бъде сдоаозея да аяомага екадр-зо ята на жожтжда, това че тр&яорорлираяото раатше да «ша доамжомд уотоМчквое? към вредните кжоектк^)връжпридудмраамт® раетмтедаж Промотори, κοίτα ее очаква да бъдат аоаозвж в това кзобретелне еа жзжоотви·

-53• · · ·

Хкжерпмя генетична носледеватолнеот, оъдърдацв ннееаенцадш ефективен гептмдем ген, оперативно свързан нън даден промовер· нож* да бъде овъраама а колхоляи клсньраи. жеж«ор,жнас аа яа се «равофорвт m еезаиото раетенх е^бимновоно кдаьмаднж ждк иируснг /божтергафа^ възпронвв^зедада в контролна пооледрватвлкостж »лойвлизат от вждове, еъдаееомн о иааодваааата оо«еа*г<м1Г€№рмамн ок*КЛомшрадаят вектор обикновено иоеи олио ршпножвавлдфхо начала г.вите и ояоцифмчмм гени, конто еа зпоаобиж да осигурят фенот1шг®»* «· еелехцмокиж бавааа в драксфсрмлрамите хлетки-гоетоар^вюяицк, ткочко уотеЖчнви на йнтибжсткая.Травофораио&жктя вжтож могат ла бъдат подОрами 'ii’^eaa феяотипячяж белел» елад тлнийДормааия в «летка-гоетоаривамн’!.

*летки-гоетояръемжиад, кожто ое очаква да бъдат делтазки о& прокариотж, включително бактеряалмж говтоаркемхякв, като лапрттор «.аоИ , тууМжт*2з и 8*тт-л<н f и еукартотжчя* гоотоприекятдж» тактва като иоеждт. нлж квиковжда. гъби·

Клекарадият вектор « тръне формираната глзтка-гоотопрвемкак е гштора е е жзполауаат глава© аа рамикавака броя на копията аа адастора.2 увеллчекжя брой келмя, векторите оъдърладж ведтждол гея яегат да бъдат мзсорао ж да ое излолавжт надрммар ва жъжевд к« геяетичкжта азолелоллтллжоотж, одиеажм тук, в раетокеето кла в други клетки-гоотоприехмикл· гввестш» за методк ла получаване аа р&атаок, които екелро* задо чужди гекж^азржкер, разтмтедаа тъкал кожа да бъде трааофорораяа чрез дууектко заразяван* жлм «дяовремоин© култлвкража аа раетшла, уаетиееян& тъкан жли клетка 3 директно прежвъраляе ла ген на екеогаяяа ДЮС към протозжаотж | тдху1ажзя е Ж |мйхромнжеитъраае ж бомбалдъраке чрез микронаогрея ваке·

34темето на пяазимдя, инсектициди© ефектжвна пептидна гвие тнчна структура.Елекгя чвекя нчпулоя със силно поле обратимо преминават през биомабраякте, което дава възномгоот за въвеждай е ж пломидито.£яоктропорграните протоплаотк преобразяват клетъчната етеяа, разделят и образуват растителен калу«.Селекция ма трансформираните растителни клетки е експреси рая инсектнцндно ефективен яептжд може да бъде осъществена като ое използуват фенотиличкж маркери, както е описанс по-горе«Към протояластиее чоже да ее прибави екс стенна ДНК в каквато и да е /орна, като например линейка, пръстеновидна или сврьхспирална ДНК, ДНК капсул и рана в лидоземн, ДНК и ареропластж, ДНК в други растителни проеопдасти, ДНК в жмнм комплекс със соли я други>

Зончкж растителни клетки, които могат да бъдат трансформирани от A^roWoteriia» _й цел» растения, регенериран* от транофорди рамите клетжж,ногат съцо да бъдат трансформирани съгласно изобретението, така че да ое произведат чрансформирани цели растения, конто съдържат прехвърлен кясемтнцидяо ефективен пеотидея ген .Трансформация при оризови растения е била потвърдена ет Г> «М» Rainer! _м сътрудници,Трансформация на оризови растения посред* отвей Агробактеркум вг?Ф1тп &· /»_f Moteclmoloey том 3, етр. 33-38 / януари 1»0 г·/·

Друг метод за въвеждане на иноехтжцвдмо ефективен пвашок ген в раотвтело клетви ее съотон · заразяване ма растителна клет ха е , трансформиран е ннаехтгцждяо ефект»* ва поптидеи гоя. При подходяци, известни в практиката условия, трансформираните растителни клетки се отглеждат за да оо образува израстъци, корени и да ое развият допълнително в трансформирани

I

-35раатекия,йн0ектмщ_;д1к е-рокткаю.те пспяЩ»‘Гоиетачал последователности могат да бъдат зъзедски з подходящи растителни клетки, напра мор поередетвом ti плазммд от A.twcefaeiene.T ί плавмидът ое прехвърля към раетителките клетки чрез заразяваме е ^А*$Ш1еУяе1ева к ое интегрира стабилно в раститехния геиом.Т/ злавмидите оъ :ърям два участъка, които ее считат за валии при проиеведетвото иа трам формирани клетки.Единият от тях, наречен трансферна ДНК / Т ДЯК/ имдуцЕра /предизвиква/ образуването на тумор· Другият, наречен е термина вирулентен участък, е от значение за образуването, но ее и за поддържането на «уморите· Т ДНК участъкът, хоато ее пренася към растителния гечом, мохе да бъде увеличен по размер чрез вмъкване на генетична секвеиция иа ензим без да ее повлияе върху него· вата епоеобноет на арсхвърлякеЛрое отстраня вая е ма гените предизвиквали тумори, така че «е повече да не ее намесват, модифиадразвят Т< плаемид може да бъде използван олед това като един вехто; за прехвърляне на гонките структури иа изобретението в подходиха растителна клетка·

Генетичният материал може да бъде съцо така прехвърлен в растителма клетка чрез използване на полиетиленгликол /ЖХ /,κοΐτ образува комплексна утаДка е генетичния материал, хоДто е взет от клетката,

Траясфержт ка ДВК в растителна клетка може да бъде яостжгкат оъцо таха и чрез впръскване и изолираните протеплаота ка култивирани клетки и тъкани и чрез впръсквано » мериетемии тъкани нжж на млади растения /израстъци/ и растекмя,Траяог«етжчияте растения и техните потомства ее получават чрез хоивенцмоналяи, познат» в практиката методи·

Друг метод аа въвеждане на чужди хжкх ДМК пооледователкоез /евкиенцим/ в растителните клетки ее състои в прикрепването на ДЯК към частици, които елен *<>»<* бе вкарват принудително в расти—38— телнж клетки посредством кзотрелвацо устроАство', *гекка пуйка*·.

За цаките иа таак процедура ложе да бъде жзнолавана всякаква тънен или растителен орган, включително, но бел да се ограничава до ембриони, апихалнж /д^л-горня/ и друм мержотеми, пъпки, соматжчмз и пояем тъкаха ин вгво и ин витро «Транс генетичните клетха и калуч се подбират като се следват установени в практиката процедури, Избраните тъкан» се иидуцират /предизвикват/ за да образуват соматични ембриони или регенеративиж пъпки, конто да дадат траногенетжчнж раотея.я съгласно установени и познати в практиката процедури «Подходената процедура може да бъде избрана в съответен» а използваните растителни вмдово,Траиогснетжчнв царевични растеж» бяха получени чрез използване иа виеоко-окоросткв михроонарядх за прехвърляне иа гени в ембрмогении клетки·Унаоледеване а експрес» на хжнерни гени в прогоните иа трансгенетични царевични раотонил* Mo4ectaolo$y > т©м стр« 333-638 /септ,19б0 г·/

Регенерираните растения могат да бъде» химержчни по отмонеиме ка зх яздената чтеда ДНК.Ако клетките, съдържам чужа ДНК се развиват н ижкро- или в махроспсри, интегрираната чужда ДНК це бъде хдежж^адехрдеа предадена по наследство ка поколението по полов начжн,Ахо клетките, съдържан^ чуждата ДНК са аоматвч-ив клет кн от растението, нехжмервчнж трансгенетични растения оо получава чрез конвенционалните методи на яегетацвмко / безполово/ размножавано или ин живо, от пъпки или части от етабло илв жн витро, като се олодиат установен», добре известни в практиката процедура Такива процедури могат да бъдат подбрани в зависимост от използва нит® видове растения·

След траисфор $аш ята на растителната клетка илв растеикета тези растителни клетки млм растения оа така трансформирани, че пептидът е експресжрея и ложе да бъде направено селекционирано ч₽ *7подходящ фенотнпжчеи .-.а дк ер .Тези иаот»пични маркери /жа рак те риж особености/ включват без да ое ограничават до антибвотичма резнете тиоот*Друрж феиотйпичнй маркери оа също познати в практиката ж могат да бъдат използвана в това изобретение·

Поради разнообразието от различни трансформационни еистенх, по принцип всички типове растения могат бъдат трай©формирани, така че те да експрес spar иисектицкдмо ефективен пептид на настоящото изобретен;··

Има достатъчно доказателства, че практически всички растежи, могат да бъдат регенерирани от култивирани клетки или тъкани, вклю чнтеляо, но без да се ограничава до всички основни видово зърнеш култура, захарна тръстика, памук, плодови н други дървета,бобови раотея.я в зеленчукови растения.Лонаетоящем има ограничени познали по отноненне иа това, дали всички тевж растения могат да бъдат трансформирани ня чрез «groWterXisa .Видовете, която са естествен растителен гостенрвемижх заAgrcWseteriiHi могат да бъдат траяоформирани хи витро.Едносемедолните растения в по-спецгално зърнените култури и тревните растения не еа естествените гостопржсмницж за *groDeeteriim .Усилията за тяхното трансформиране, като се използ aaAgrobactorlum _са били безуспеииж* досега.Оега се появи едно доказателство, че някои едаосемеделнж растения могат да бъдат трай формирани отМгО'ЪасФег1Ш1*Иапозззайки новите експериментални поети жея»я, които сега станаха на разположение, зърнени култури ж трим растителни видове еъ^о могат да бъдат в състояние да ое траиоформз рат.

Други родове растения, които могат да бъдат трансформирани _Wp_e#A®«'b^terlt»B_MjIK,_Bat Iposooa, Paeeiflorn, Cyolnaen, йаХая,

Prunus, Рова, SuW, Popolu©, SaBfcaXtm, *lliua, Liliw3,Naeissue, аплпйз, «ггсМв, PMaGeolus u Pioua· —33— 'Fares оранията варира а зависимост от вид? ка растскгята, на обикновено най-напред се осигурява оуеленвия от трамеформкражж протопластж, съдържао многобройкя копия ма жмеектмцидно ефективни делтидек геи.След това може да се жндудира /преди»вик®/ образуване на ембрион от протоп лае тната суспензия до етана на е ъз ра вая е и покълвано, конто при естествените ембриони.Култу редната ©реда обиж ловено еьдьрка различни аигнокиоелинм и хормони.Пъахмте к ксраните обикновено ое развиват еднсврймеино.афнкаотжата регенерация це вавжол от средата, от генотипа и от историческите ©ообевоот» жа растението.Дх© тези орн три различни фактора се контролират, тогава регенерацията е напълно възпроизаодтма и не бъде в състояние да са повтори.

Зрелите растения, отгледани от трансформирани растителни клетки могат да бъдат получаване на растение с уяасл д&ят> белеаи. Растежната, което е получено по този начин дава семена съдържани гена жа жжсектгцждно ефективния пептгд.1’езк семена «oral да бъдат отгледани до получаваме ма растения, която експреомрат инсектнцкдно ефективния пептид. даотенията-потомцм могат да «*»дат жзтолзвану например за развиваме на хибриди, които са устойчиви /понасят/ жмсвхтм.Ярй този метод, потомотвената линия, кеят© аив· ся нао яханите се кръстосва с Друга потомствена лянмя, за да се получи хибрида,

При диялождижте растения обикновено единият родител може да бъде трансформирам чрез нисежтн.цмдио ефективната пептвдиа /тсжожжова/ генетична последователжост, а другият родител е от дивия тип.След кръстосване да родителска»® растения, първата генерация хибриди / де доказва едно разпределени® от 1/2 ТОКОМН/ДНВ ТИП I 1/2 токсин/ ДИВ ТИЛ. Тежи хибриди ΟΪ първото поколение / ое опраазат помежду аж за получаван® яа второ —39— поколение хибриди /©>./ .Генетичното равпрящахожи···»*.*^ Хйбрижита · 1/4 токсин/токсин $ 1/Р токсин див тия I 1/4 дни ежа / джв тжп. f_£ хибридите в генетичния строеж токсин / токсин еа избражн като понасящи иновкти раптея/я*

Както е използван тук, терминът вариант описва фен©типичните из-ленения, които еа стабилни и наследствени, включително наследствена вариация, която е предаден» по полея начин на потомствените раст пия при условна, че вариантът ще експресира кноектнцндно ефективния пептжд на изобретението.Същ© така, както е използувай тун терминът мутант списва вариация, като резултат иа условията иа околната сред такива като радиация, или яш в резултат иа генетична вариация, в която характерните белези ое предават по мейотичек път, съгласно уст ‘.яовеягте закони ««* наследствеността.утактното растение обаче зее още трябва да екопресира пептида на изобретението.

Главно, идеалният инеектицидно ефективен протези които е избран и който трябва да бъде експрвсврап в дадено траисгенетично растение ще бъде този, който се характеризира със своята безопастчм яоот по отиомение и® непредвидени ияоекти ж гръбначни животни* Трябва да се изберат такива експрес»,оння системи, чисто ниво на експресия постига инсектициди® ефективност Лака, тази техническа осъществимо©» аа получаване на т.къва трансгенетнчнж, важни за земеделието растения ое очаква .да предложи иа земеделските произво; телн едно допълнително защитно средство за употреба в сложната система за контрол ма вредител», за да се намали вредата от насекомите по отнонание я® културните растения по еднм ехслогичесхж отговорен начин.

Ж. Приложение на пептидмте като инсектициди.

Юмта се, че инсоктьцндио ефективните пептидж на това изобретение са полезни пр® контрол на безгръбначни вредители, такива като рода bepidoptera » ^ЧР®³ контактуване иа вредителите е

-<·>

ефективно количество от шъд, съгласно тона *^обретем/о.Лоддсдяяо, жнсектите са арвддочвтанитв вредители*

Известни. са четодм за контактуваме на безгръбначни вредителя о нентнд аа контрол на споменатите в реди тели «Примери за тахива методи оа ажнтетжчно капсули райе яа протеина аа орално югльдаме от аредвтазвто.^даеоо^инантйи гостопрмемницм, «сомреаараци протеин»· то на това изобретение, такива като Ржеийоаот® fiuoreaceaa могат да бъдат умъртвени и да се приложат к*м вредътелине за носле, защо орално поглъщане жаж в контрол*

Мзбира ое, методите за контролиране ма безгръбначни вредители, като се използват протеините ма еова изобретение могат да бъдат жзползвани в комбинации с други методи за контрол из нреджтож.Нанрвмер, транс ген етични те растенмд и Е* Q&lt , посочена догоре, могат да бъдат коиетруирани да експрес и par друга токсини на безгръбначни, в зависимост от тъпа иа вредителите които трябва да бъдат контролирани* осигурява а е инсектициди© ефективен състав, еъдърж&ц инсектидъди© еректжвио количество от пептнд съгласно ластоядсто изобретение а негова соли, пржемлави » звмеделмет© ш градинарството, в носител, комто е приемлив за земеделието ллж градинарството· 3*. Антитела към инсектицжджо ефективни пентидж*

Друг аоншт аа това изобретен;.е са антитела за йисектвцидя! ефективните пеатждж «а тоз- взобретенме. j ©писанието по-нататък •да бъдат цитирани различни методологии, известим на спецмалиотнте в таз. област аа имунологията за откриван© и дречьстъан© на. нентидж, реакч^оносяссобаи е антителата ©пмевни тук.

За едно антитяло ос казва че е ’'способно да свързва¹* д®дея;

молекула, ако to е s състонихе да вз<*ж модела гвува сагецифвчи© с имекудата, докат© свърже молекулата към антитялото*лермжнът •епитоп” означава,, <м тази част на даден пептиден антиген, която можа да бъде раззозната ж свързана от антитялото. Даден антягея moss да има ежи или повече от един епвтоц.Даден антиген* е способен да предизвика животното да произведе антвтяло, което е в състояние да'свърже към елитен на този антиген.Фпецйфнчната реакция, цитирана оо-гсре означава, ча антигенът це имуиовзаимодеМотвува по ежа виооко селективен начкя, еъо съответствалото му антитяло, а я« е гаодастзо други антитела, което може да бъде зредвтлккано от други антигени» »Ь

Терминът антитяло” /А® / вля ^я чоиоклоналио антитяло® / . з1>/ както е използван тук означава че включва иитактни г»олекуфрагменти/, който еа епоеобкм да свържат даден антиген»! На фрагментите 5ЧЪ ιφ

Ладова До фрагмента на иитактното антитяло, далеч по-бързо от циркулацията и могат да имат зе-мажо нееяежунчно тъканм© свързване на мкл антитялото на инсекта.

Антителата на настоящото изобретение могат да бъдат получени по конто в да е от различните .<етодм.’.-етодг за получаваме на такива антитела оа Добре известни и описани напълно а литература» Вжж например^^Ьгоо^м сътрудници, ^лабораторно ръководство за молекулярно клоиираяе*, второ издаяке|Р®1^ Spring Berber Pre»®, том 3, глава 18 / Г>ЗФ г»/».:апример, клетка екс преси рани ммсектвцидно ефективен пвдтнд мли негов ррагмеит, иогат да бъдат приложе ни към животно с оглед да ое предизвика проиезеждаяето аа серум, съдържаш поликзонаяяж антитела, които еа способни да свързват ммсектицмджо ефективния пептвд.Главно, ииоектяцидно ефективен дептидеи фрагмент ое получава ж пречиства, за да стане по оьцеетв свободен от естествени замърсявания клв ;ш даден иноектицидко ефективен пеятилеа фрагмент ос синтезира съгласно известни в практиката метеж .Пречистеният Фрагмент кли синтезираният ррагмея * * * · · * * ·· · · жли комбин&цнх ©т пречисгсяи естествени фрагмент® и/влт езятезжрани фрагменти могат ^и.а бъдат вьвелени в животжс, ее да ое аронзваде цоликлодален аатнсвр.? ·’ с яо-голя-^а епецифячяа активност.

аемокложаляк ачтьтела йогнт да бъдат зеяучежж, чатс ое м»яе< вуваж известна технология и.* хкбрндсмя.Такива процедури лклвчват главно имунизиране аа дадено животи© е ияеектжцждж© ежтивей пеят»деж аятигеж.Сдлежоднттте ля техква животни ее екетрохзрат м ее смесват е подходяща долей©мма клетъчна лжния.Веяка«ва подходяща п келааомяа клет&чъа. ле.и.-..я «еж?· -;г бъде оползваае. съглася© настоя— г;охо ъзсбфотояие.Плед шшЕляилавчр оливаното, дежученжте ххбрмдомяж клеткг ос поддържат селективно ε подходяща, среда к след това ©е кхонмр&т чроз ограничено разреждане .Хиб ри доиш- те клетки, токучекя посредством такава селекция след тове се анализиpar, за да се идентифицират клоновете, х©кта°ЙЙЙЯ1?*ителз,сж способкв да свързват ипсехтицидно ефективния пелтгдев октигек,

Кко лед«идният източник е онечжетев, само никои от кибридоВ нхте клетки ще произведат антитела, способня да ое свържат към пелтида / други хибрьдокни клетки ще врекгакдат ант^тлло, сиоеобнс да свърне примесите пептида /.Така, моке да се окаже необходимо да се сортират хибридомните клетки от тези, ксъте се способни да секретират антитяло, което е в сьотоянле да^Йзърже кад педтида. Такъв 0К1Ж1ШИГ жлм сортираме ее нззърква за аре^лочитане чрез жжкубирмяе аа проба от чептида / от отрова/ в «рмсъствтето яа цоноклоналко антитяло, секрети рало от които в да е група на дадеш хибридемня клетки х вдентирицмраяе не всякакви лабридо^нъ клетва,, опоообо да еекрутират антитяло, което е а състояние да «^градиш ра или смекчи способността на отровата да .парализира даден жнеаве. Олед капо бъде идентифицирана такава хибридомнъ клетки, та мока да йъде размножена клондано чрез изяолвв«яв ма познати ма спмциадистмте в тазъ οόα -..хе/,; , ла да ©ς л случи спецнфвчаотс те отис на неятила алтхзткдо.

За пречиста^ «то на .шш мясштем селективен токсин, еотес тава вля рексжйкиаитен, а&тс се използува афзявтетяа яа аитетлло J хроматографжя е леоблоди-ло да зе използва антитяло, ксегс е oiociH и© да ос свърже към кможт; цидао ефектжжмйл телтид.Такова аятжтвж ©бвкяовемо бъде шо ^сноклозгално антитяло.Ожед като ее аолучя спецхфмчао за неятжда мояоклонално автктядо, съяото може да ее вмебвлжзнра / обездвжжж/ чде« свързване към твърда подложка v да се жзползувъ за сречво Tease на аеятжда от естеетвеза отрова ш е* друг» хзточхкця, като се използва и.^у&сарвмътетнъ хроматография съгласно методи, които за добре лоаиатг в практиката. .Такива метод! еа в оъетоамке да цъделстват аа голяма степен не пречистване и по този лачжн ое хс^то е по същество свободен от естествени замърсителя.Както е употребено тук, за даден пестмд се казва че е ”по същество сиободем от еотествеиж замърсители* ако същият са намара във фор-да, в конто шпезат съедгяеяия е кемто той и е свързан естествено » норнаяно / т.с. дд_;гн протони, липнди, кнрЗох^.дратк е V»/·

След като ео пречист», senтилът може да бъде мзползувая ъа ъчунъсиране «е. за; both с / такова като «г.кка илж завя/ © оглед да ое преди, заека промзвезздамето ка золиклоналяо ажтмеяло, савяж* фмчно спрямо пея гада..

,αίΙΚ п.робв е подходящ размер, обжкковеяо от 10 до 50 куклео?, да, могат да бъдат нолучевн от ДНК последователност, кодирай инаектщгдно вФ<-.ктгшгя пептад, пс същество жзолярьщ ое от отрова аа паяк . Такива проби могат да бъдат взползважв за откриване дрмовствнетс на ДНК кодираща йвсект«цядао ефектжв·· цеитид, по същество изолиращ ое от отрова аа паяк ^А’*ФР*^в*1* чрез .·: - : :<.· :”: ’?

• · · ι *: II ι · ··· ·

ДНК 7 4’5« Та и‘отнриваям W нроба»а,виар* контактуване на атрева о еаяа хьх енонекатата ,ΉΚ •я«. р.»_Л(?<р_ЙОМ иачиж* нзвоовнж на вледхадиетите и тази област.

I». Мнеттмдидй» микроб»., аолучени чрео геняо нямжаретво»

Яоектидидао енктизои? юнтнд оаностолтолно най и номбя иадгя с друг токеги ст »нсеит се очаква да бъда подззои п.ак активиране или усилване т<ш©йчноотта жа хииробж, заниза ката бамулозазуеж ж хябрмдаи бактарвн».

Няколко бежуяаwpyea, жлкчжтоано тазж, кежто заразява? йеНоШХч MreeatWчервей яа ©амажвина жа памукови. раатшжя/, OzwliA pH&udotsu^Ata ^я®**^а д^пеоула но борежи туфк от Пглаа · bttomsb* вЙХЛЖоа ''»« ««««« де лшеряата/, ^оМ pries зег11ГаЙ«Д чух* я® 1вропе1еям* 5®^ жЬадареутеМц тзояопеИ^ / тхлдое мслед/ ®& бели регистрирани в някоя стражи н «а мапеллвлкм като я «е гиди ля «Въвеждането яж иа!« мажи© еджи селектка®к я прямо гжеектд токегя в геиома, ое очаква да заоижи ваччитолоо активността на тангве сестьцЕЛЯ,

Сччта ее, че един речокбийант®» екепоееножея яечтер бж бжя особен© чъдходкк ва използване в това изобретение, а вмете бодгловиоуеек експфаеьокен вектор, такъв като например ©т тта, жяв<« е патент на ·*^ 4,873,236, κοίτ® патент е включен ту» чре референция» »жж същ® Сoxbcncll и еътруднкцв винтов иа ген, кедв раж ва чевротскенн от скоркиож, специфичен опряно жнеоктв ж оямтв жа неговото «епртоирел® ”рлв използвано иа баяуяовируаяж вектори’’®*®* , 731409-413 /1383 г,/.Очаква ое векторът да бъде полазен в овбзша, където ЛЖ поеледоватежвовт, кодираща жяеттидядно ефектьвеи пестт&д, пс същество жзодкрад ее от отрож ва дали Мв®®31е мен® яя бъде илонираиа в бак^левкруе, такъв като ’utogro-pMa califотш/*·^{8 33 И}Л ® окевреежемия вектор е описан в патент на W 4,873,836 в от Ми Пат и сътрудаад, — Ί&— • · · · • · е е · ·

ВКСЯрООЕВмек >«!·₽ *erat V'g.* теза at пржложат към дотекве·· илж ш авветмоте вържу коеа аедек вредят·* в жегата ввруем ·· когьлме а» ^чвредко«о л- лекам^., у»зкомбеда*тмед« вжруе ща завладее клатедте аа чречяа; и7-._ьа <„ _че злаочме възаредзвяадаие.Ло вреже яа възкроязвождавето, гсаъж за шаектмеджо ефективен аротвия де с» вколрзоира» в резултат аа ксото ъноектьт де стане недееепооо* боя £« де Зьда умъртви _а ,αο-г.ратък период от вреже» отколко те ако икеекта е погълнал дизмд тия взруе AoIKPV, 'вроаейеда латедтаа задвка 0 340 >48 ео твърдя» .«· дедеж Л£бр£дея вирус оъцо ое очдкза да бъде аолевев.Хкбр»жед» взруо, окаароояраж ДВХ яа това а^обретадго ое очаква де даде здруо» коМт »йа артшшн обхват ао огжоееиле ка яяоея1'Ж-гойтолрявмаици,Напремер, олети □ р-стоки бижа потя» да бъдат еяояреонраял като едкякчев полипоптиден продукт е едбредеж гея, еъдържац ДЖ «в «ева веобре тек*· в слеЦйфичем аротежл» раепеедавед кл-зтжяте ма червото аа едоекта» за да яоочж еедвроедредед лвожтадждяе ефектквеа поятжд към дадедмя йдсехт-гостойрйеийлк.

Различни лрокарвотжчед а аукарлогвчвв .иккробв могат да бедз тредофордаралв ва да вкспрооират обреден токсинов гам, аоднред жжаштлцидяс ефвкедвея яротоед чрез яотода» еаноая в Ввредеййжа затоятжа зълва* 3 325 4?3.

Хмбредлв бшторяа.шв клеткк» змъряедн злавммд е гея» кедв· ред за яротевяа яа това *а обратен*· ее очаква да бъдат долевял в яотеда яа настоящото ед©брегови··?леехтите 5*ед могли ж* бъда» коятроли рани чрез дредагаие яа кмбрлдкте към кжсско«в»Внж еддрк* мер явтект аа Сж 4,7>7»й?Р, който аатеят е едючея тук чред рефероздо»

Друга дряиерк яа предожмк бакуловвруеж» които могат да 8а —48— _л '·· '··' '·· ·.* *..· бъдат подходяци за използвае в настолното в а обрат еня е еа опвоаии • ВммЗоШ сътрудници, Парализа яа жжоомтж чреа онопреом пооредотвом бажужовируо яа яезротохвзиов ген в черво**, КаШ»· , 38* ι 8**88 /1891/ и tcmsrt и сътрудници, ’Съвдаваяе «а педобде бакуаовяруоен жноектмцжд, съдържа» специфичен спрямо виоентв тоножиов гея·, Mature , 332 t 35*38 / 1991 /фМавоМквв * βΒορχι жици, * йвоработважо яа рекомбаяантея вакуловируо, окопревира» селективен към мнаектм неврстокоия 1аъвможиост аа контрол аа вреш _9m«Wtoetelo*r , 9 I 848-881 / 1991 /·

И, Кръстосана хибридизация t ДШС последователности /сехвеяцяж/ като проба аа близки съединени»·

ДНК проби в подходя» размер могат да бъдат получена от ДйК последователнеет от това жвобретеяие.Такзва врвбк могат да бъдат ввполаважа аа откри вай е калжчкото на нуклеинова кжеежвна, кодирана иноектжцядмо ефективен пептнд на това ижобретеяме чре» лкбрвджнацжж е нуклеинови киселини от други жзточнжня«Проожважо*е или сортирането е олвгонуклеотвдяж проба, кодирани сигналната оеквемция, фрагменти от ©ДЖ или даже цялата ©ДНК »ря делови» на намалена строгост »о даде аъзчозгаоет аа достъп до друга активни иеитидв о Функционална хомологм спрямо семейството на описаните тук токоиновж чолждет,1*зтсчници на нуклеинова кжоеляжж, конто биха могли за бъдат подходящ» аа кръстосаме хябрнди*ацжл е нуклоотиджи проби, получени от ДНК последователност ма това жооброто* ние включват, боа да ое ограничава до тях, паяци от ©ъциж род, яс от раалвчжв видово, паяци от блясък род в палим от сънни род, в» от различни моста·

Идентификация яа А промоторка последователност.

Друг аспект ма това изобретение осигурява промоторжа воол< дователиост, която контролира еиитозжражето на ДК 9·* в пална.

-47- ..· .· ... .,

Организацията ка за ЛК Р.2 е изследвана чроз скрвинкг/греея· ваме/ на гежомяа библиотека, като се жваолзуяа »а гроба оДИК ка арял токсин«Анализът ма гекомяата ДйК го прнкцяна на против от сила на тракоярякцяоналник старт / счета оо че е β· крак ка оДИК/ не показва наличието на предполагаем промотор*ДЖ нооледожателяовт* та за 421 базежи двоДкж ма промоторнжя участва ое макара в ШДО XX $0 !8.?овв предполагаем прошотор съдържа много от ваяните хонтрс яли сигнала, конто ое намират главно » участъка директно насочен нагоре от трансяациокнотс стартово място. / За преглед на пр<жоторни контроли» сигнал в я сътрудници, 1*82 г.Тралокридцмояяж коитролаи свгяаля на еув&рмотЕчеи, протеин-коджрец гея .Selene® 217 t 316./ Уджи приет ΤΑ2Λ депозит ое явява арж позиция -30 от ярехяеямото траискрипцвенко стартово няето и ее счита за важен нри контролирането на стартовата точна жа еиктеаж« райето на ЖК.Осзем аротжвоток, съцеетвуват две крайни палкндрсм' нм последователности, едната от конте съдържа съгласувания OAAf депозит, който ое счита за важен за свързването на ЖК полимера* мия II ензим· Предвижда се, че този прсмотор или участъците на този промотор «е намерят приложение при транскрипцията н експресията на различни гени в растенкежя, животно жлн бактериални клетки, например арв даден ремочбинамтен строеж.

Следваните примери еа представени за да жлжвтрират дадени състави ж методи а обхвата на настоялото квобретокве, но те няма за цел да ограничат обхват·., иа настоялото изобретение.

Материали н четоди

Паяците ое доставят и видовете се определят, осигурен© ©1 Зр4й< r Mam_tIn©#of Block City* Де·

Палци cmltiea _{бе доя<} електрически за отрова, кат© ci вапочзува четод, -to га ;»<д«тчи ’*>£««* за..й>|Дотаратавааю ожечиотзаяето иа отроч ?а *? >сз обратно кзтичаме ихж о жемсхкмфа· Пречистване ма токсин - Лео·.-сй-5 стена отрова / съхражеяа а ри *80®б/ ое раамръзява, разчесва се напълно м оо ржзтзарл в □·! разтвор ι трифлуорецетжа киселжжа ! 1Ш/ преди да се подложи ма кроматогра· фия.Необработената отзова се ^р.кциоиира чрез течал хроматсграфкя о обратна фаза / WKLv/, като ое включва разтворители» ожотема йвхмън Голд 1?в в 163 фотодлодшв подреден® детектора» мвдулж·. Ацзтожвтрвл в маоаропакол ое използват мое в комбинации ο ΤΡΛ като реагент е Донки двойкк.Олсдващате колони оъо защитни колежи от оъщжл но дол ое използват за а оечмотваимлтат>у»«т«т 300 A WP вътрежви

0_1й холоха / О w х 4»А кв омвев диаметър , 12«м размер ма «в частиците/ Дуйяс 330 А С^_а аналитична кодова / S3 х 4,6 нж вътревеи диаметър, δ мм размер ма частиците/ мУ.тйяю 300 А 0_>8 подулрежаратмвва колона / 25 ом х 10 мм вътрежож диаметър, 3 мм размер яа частиците/· Откриването на пиха оо извървза чрез контра л зрак е при SSO жм в фракциите се събират е мжкрофр&кциомен колеж· >©p®XbSOI gas. Фоттгл рракциж ое лхофилвзират до сухо след фракцв©нирайето хе· съхраняват пра -30®С·

Касова опектромвтръж о бързо бомбардиране о атои / РО-И ' /· Масовият спектър беже отчетем при Университета в Илхиожо върху να жжетрумеитв яа / О-./Е масов спектрометър кри стандартни RA8 условия / коеиояов газ, разделяне 1300, увеличаващ ое волтаж 8xV, температура ма източника яа нагряваме 43®/ · Пробите / около 1 жив микрограм/ ое анализират в 4 шжкролжтра тмоглщеуол, съдържащ 23 воден разтвор яа Т₽А / 1,3 % /· ямг? ι

Първоначално фракциожлраяе в ндентнфйяацмл на фражщвжто, съдържаща инсектицид в» пептид, от общата отрова и9Мдав^1а оноАм!

Лаофилжзираха обща отрова, S3 мжхролнтра, добата от «47ст&Мзн, както е слисано ио-горо^ое разтваря в 0.1 & разтвор да трифмуородетна к*селааа / ТРА/ в о» подлага да фракцивя и рая е чрез течна хрочатогрармя е обратна .раза върху п олуп pen арата зна Vyoao колона, хато се използува ел^жрако ккЗВШкв скорост жхкЯд на потока ст 3.5 мл, в шшута*Използва зе линеен градит на алоеита, като се започва със смес 85 ι 15 на зодаа разтвор 0.1 1 1Ж J 53 $ ццетоямтрнл, ).1 > 1Р1 ж а е завърнал ода с мее 50 ι 50 онзд 180 мннутн.

Шш tota»,,w</. в^дшжлйи^ шж'.

1	3^
4	Sf.e
5
3	57.1
J	«2 «8
10	66 Л
XI	88.7
1Й	71.4
15	77.1
ϊβ	186.1
17	131.4

Венка фракция се кжифилжжжрж жжнахаа.охмн«мж ое концентрира жяжммяя чрез лоофилизацся от елиента, последвано от лнофклваацнл о вода«Остатъкът ее оъкракяза прн -30*0, Всяка фр&кцмя ее разтваря в «5 идаролитра буфермраи ^зъологмчея солен разтзор за нноектжцгдда оцедаа.Имоектидадната активност на ни кон фракции ое потвърждава чрез тествано спрямо червея по пъпните жа тзтюязаето раетенжя /НеИоФМе vireeceW·?!?^ /Таблица I/.

TBW ларва, вот отделим за всяка франция се жнжектжрвт · 3 мккролмтра от тестовия разтзср, лъто ое използува 80 чжкролитрова опржв цопа _f взърваят о 33 чанометрачвж кллл н PS 800 повтарял чвкрсдозатори ямектир&кето етажа чрез вмъкваме ва иглата в страничната средна липня аа корема / 5«за до еджямя от кражата/ ujpju ©дшн ъгъл, за да се адПегие увреждажй© жа аьтрелмж ©prams .След жажаатмраже, seer./ ьисект а© нос тава в отделен коатейжер, съдържад жзжуотвела дйета.ЖОл^демвята ое мааъръваг перкоджчъо| ааралазаза са гз^рви часа омад иьжвктмрнье.Средйвта теаавш мааа ст 0.3 авлаграм* аа червея ас «втшевшаа шмм ае к»аолзва >;зъ Езчисллиане ял дсаата.Вдма сермя от момтроко мноштж ее вяжвж· «.«ат ο&κο а ^уферв^аа солен разтвор.

Наралмзахв. се разввва иоохеаомао м се арвджеотва ©т еджж иъръод ма моно жзраземв «уокулва слъамв.Црм остръте случ&в, теза спазма започват lft*SO авлута след м&жвяствраже ж поотаявако ве увеличават по аатежавтет дслато ларвата втале надьлво негодва. /оилкога гредереавто се задазва а& а свеж е от ФЗ чада ал<ц* знжактж· p&aeiC.loBA дело era се случва дорв когато е арждоата лоза д®д леталната и ларвата евеатуалао оо вьзс то овява .Залата жа треперел е е еО-ожгуравя аддък&гер ва томаачаадтта | ларва воал&жшк до точаа та а& дължа дар&лжаа а/ьла хштракхцш на тялото ле оо вьзот&аовлва 1ДъЖдА I

Голввчхост аа t^I « рр&лдаж ©т отрова жа naftaa^^^i^ ₀^ Ша до ©тжожежже ъа ffcvv /?.S WE/грам

$2»	пзрвоаечалж* наз&лкЯ№жМ	лжрважажлжаа J парализа след £4 часа
1	0	0
4	η 'W	0
е	0	0
г	10С	100
t	130	100
Ю	100	100
11	100	100
1«	100	100
13	3	3
IS	0	0
1?	Q	0
контрола	0	0

-si-

* , » * * * ♦ · парализата е озределниа к Vto^eo πυόό^οοτ ·»»·»«© екта да β· държи правила© когдт·- зьрт». кл.я обръда, ♦♦ n /1, «кзнеадсмт s-i о-зддта ©трона е коднчеетвет© ©т ж©*9© и да е тежвжж, което се к^дкуа нормално в оджж мжхрелнпф от лялата жздоака отрова ; S >ч и', от _;;5 чиЕрслдтра раздал лае © 10 $ ©т зъзстдисзея л остатък»

иречмсгваяе па Фракддж > от PigoalAa оаММев

Главните компожеити на 1Ш активната ураждия 9 ·· првчивтвв» до лоиогаяиост / едяа видима и а/па или зона, получена чоезкрку^у електрофореза, прнвлмзхтаза© а чолвкулко тегло п а гзажжната на «,ЖЮ дялкана/ чрез една дппълкителма хроинтогра^я през VyM· ·>

колона / *5 ок х 10 ми »ътре«ея диаметър/, като а© използува лги©ен / 1,0 jVmhh./ разтворител ma гради©ят от взоирожажмк/ ОД <

Т₽А лрк 3,9 мл/ижв. и прк контролиране ври 22-3 нм / мажометра/«.

Откриването иа зет и. еъбмрането ма фракади ее азвъряяа ваят© е описано а пример !♦ ^ъбъре.т се две Фраккки t пърза«а> кат© ·· аожра £.1,ЗХ минути / фражш-я Ф«1/, а втората при ©.ми рая© 21,39 адя.ли! / фракция л,2/· ♦

Фрака»» >·1 Λ О® К©*ГЦвЙТрИрйТ чрез лиофкямзалкя 09 ©л®©«та, последвано ат лм©филмеаа~я от вода, ври което ©отамфют*?М|В*· *.1 и Ф.2, о-ствзтм«.^р*чяотваи« ж» лъофилгвираилт© фражляя ·· уотамоин че е кай-иадко 9> >*Ус©внов» ©е, че остатъка 9,2, аолучея от 23 мжкродятра обца с-трова съдържа около б мииретрпм* чм* пр©т©* ин.Зстатък 3.2 ее тесто· »а ииоектьишдва актишоот »арли9 чер··· е© пъпките на тютшеииrv раотепин, кактр с оп.чсакс а зрпнвр 1, <р©9 ця^йккран© пя ле «на ο·τ пет .лновлтн е δ,δ '«иьръгреяа оотатъя в б,фжрирак кожен р&етаоу л кече тюекти само е буферир&к ©©лея разтв©' ©и дн елужт за-коя тролн. .име ·>«£>,‘.го се изследва* &ъ<д 24 часа и ©лед •32•' - · · · · ..' .. ..

часа «Отчитам ето да резултатите след Й4 часа при валяка теви иисектк, третирани с остатъка във ажл на разтвор показва че те еа вараляяжражж я сяед ттва удара», докато кектролнгте жжооктж изглеждат нермалмо«Никакза ι юхкна не ее забелязва след 48 часа.

Анализът та тоз^з долтептид чрез матова езеятрометрвя е бързо бомбакдкраже ® атом показва. молекулно тегло 8371 X Л» Ааалияът ма M*repwf« ямата акянокне«лична поолздоязтеляоот, полу— чене в дадена амииокиое.дання .югледлватолкост еа остатъка >«8 а «о «ъщеетво както е показано в ЗГФ χτ Wt ами* окяо елини А~83» жв токаян o<fl?ifaetle o.t в H»virew»y» (Wt) а приблизително 1.0 жмоя/гр«С!жмггтомяте оа подобни па тоав, овъреа· яж е яойла-здето яа обдч отрова, както е описан© в «тример 1.

RWM

Пречистваже на фракция 11 ат^тч1яатМ?. оряЛМез

До колебай начин на този от гршмер t, фржрук 11 изолирала от обдата отрова на®1^леФ1п спММве както е лгртаео 1 ое пречиства допълнително чвев течаа хр<жатог.раРня о обратна >мза, като ее получава една Фоакхдая.тазг Фракция ее концентрира чрез лиофжлжзжраяе от елюента, ппялодвенс от лгоъклиа^^ане от веда, при което отт&ва остатък, обозначен като остатък И.Този остатък се тества ва имсектвдждна активност оч аячо ’тзяел по пъпките на тотюкевж пас тения пои 5.0 VK /гр·., .както е посочено в яоммер 2«Слад 24 часа 30 < от име петите, третиражм о остатък 11 но-хавват парализа, а след 48 часа б? 4 от иисектито, третирани о тези пее· тил проявяват парализа.УонтролжЕте икоект» изглеждат нормално· Ажалвзът иа този чолвзептвд чрез часова спектрометри* е бързо бомбаждкроже с атом показна молекулно тегло 8740 * 2* Анализът на ?!-терминалната имняокиоалияна последователно·*» ваяу* чека в е.дмт, частична ачигкжнеед: ида последователност за остатък 1:

-53е по «ъдеетя© кюете » з ;*?<-» тт; ж>13,аммиоккеелжиж I**·*

ЖЖР 4

И реч ж» t вая е не. фрикция 12 OT’Dif’wti® в«йНе·

По »ачж», чодебен не този от врживр 8, Фракция if е· веела· р® от ебтата отрова o?MfoHl« ©«nAties , както в време? 1 а ее нречнотзс до.тъжяктеяно чре» те^аа хроматография е обратна фма, при което е® нолучагл една рршчияЛвев фракция се кеядентрира чрея лиод^якагране от елшоа, последване ст лкофЕЛмзвраке от вода, което остава еакн оссатьк, на реч еж остатък *8»Теак остатъч е® тества за кмеектмпмдаа активност сарямо черввМ ио тютюневите пъпки, както е посочено й арякер 2«След 84 часа 100 < от жасемтите, третирани © остатък 18 проявяват саралкеа, а след 48 часа 80 < от нвеечтгт® трети рзкк о ештатък 12 проявяват парализа» контролните вкожо изгдегшт нормално*

Лнллкзът иа теши аолх«дтейтад чрез масов® сгектрометрвя е бърз© бомбаидираи® е ат<ж погазва молекула© тегло 7080 ♦ 8. Дналтвът ча ГТ-тврминалната амжнекжеежмика пссле^сзателяоот, получена в ексясрвментаанатс. чаетжчеа амжнезеиселгнка последователност за остатък 12 е яакте е доквзано в П< МО

Ограижчемото .то^в-гяе на материал не дава яъзможжоет ва аоетезка етандертгзвжвя на ?о*сн»иеетта | в резултат, еетатж 2.Г ее тества зри дозн / нйол/гр./ 3» < и 87 у зо-геломз, отковчето остатък IX ж 12 съотеетае^збраквте довя имат за цел да псогят обхвата ст лудли^ална летална ’©ва до кж.»о б®е ефект, и© тоза но се «остяга мот венччя сл^аж .Въпреки това резултатите «оказват че гезж яеяткдж нчат твърд® г<· добие тстгенчяоетUJetafi· 8.8 нож® -ад бъде малко чо—штааож еткоякото я-ттй, и© разликата вероятно е мо-м@лха от е-в.ч ааятзр ? .мнекна.чната 100 $ летална дезе. за тззн зечт^ди / ©’’^•тък 9W_t ?.* т 1? с· »вявв от 8,8

-Б4до 5,0 вмол/гр«Тя се ералкяза блЕгсШрхятяо*·β хамй^Мкте оо ма пазара инсектициди ; те ;.луб >?.з ..-са например има повърхностна 1Л)_ ~ ('SAW) 0* 1.3 Я :од/г;.

ПЛУ.:5^ 3 .Изолирам® аа гени, кодиращи аа оетатъцж ж 11, изолжрами от отрова аа Iguotio canities

Етан 1 s Изолираме на ЖК

Паяци ое събират от вънями източници я ое вдонтжфжцжрат KaToDi©ietie cenitie® ,Ποτ паяка се замразяват ж главогръда ее отстранява под течем азот· ?Ж ее екстрахира от главогрьдите, като се използува протокола ма Choacaynaki гаазвЯ 5?»с1й1, Imlytioel BiocWai-tryi52_t 156 / 1087/,Лолиаденмлатма носеща РЯК / мЖК/ ое

Seas St Омжтезжраме ма оДШС

Преносимата РНК ое мдмвръаа транскрибирана до сДНК е обратима трнскриптаза пгсМ baboretorl^l^Tc от левмммнем вкрус от мивка /BotMeeda Beseсе използува протокола на производителя· в оиДК сжмтезех кхт

Шаее И микролжтровата реакционна смес съдържа ензимния буфер, доставех /Boehriag®»’ ’^:гаВа“^«Я⁾„р. г .А...ЦЯ , 30 нгр. af*)Hot 1_пр>4, /Рго«.ев,Иаа1воп,*Р I имол с?т всяха от деоксинуклеозидни трифоефати и 100 микрограма от обратима траяокридтаза. Реакционната смес се жмкубвра в продължение яа 1 час при температура 37®С в продължава още 10 минути пра 4£*С«*оакциснхата смес се утаява с етанол и отново ое суспендира в 20 микролитра вода· ^,;'тап 3 ί Синтез на пример

Смес на дегенератна примерна ДНК последователност, която може да кодира аа аминокяселминате остатъци 1 до 3, съгласно

ЗЕС> ID ΝΟι 1 _{ее зьотаа}я, _чаТо ее използуват някои кодонсви яредпо&ό·,; ♦ < *>·**» j, чжтакжя иа T>ro®ophila, за да ο ©’’намали‘ДеГ4яе.рацията,Този пример се смжтезжра от Университета в Howard Hughes МеМе< ХавЦ1 на договорна основе.

Птая 4 ι раз жв. ря вам е

Насочвано от пример ензимно размиря вана ва ДЖ е термоуето чнва ДНК полжмераза е опиоано нам-напред от ж сътрудници,

Science, ез>|487 /1688 г«/.3а каяхте целн, 5 нжхролхтра цефажоте· ракова оДЖ _вж rigooiia _{св ж}а_Я©_Лвува мат© каблох в полкмеразжа верижна реакция, включваща реагенти, които ое съдържат в кит за разниря вая е на да ®е»а W jerkin КХлег CetiJ J/.Реакцията на раз виряване оъдържа чувствителни и нечуватвитоякж пример» в 2 чжкролкхщ* мола концентрация, 100 иикромола от всеки деохаинуклеотмдеа трифосфат и 4 единици от термоустойчива рекомОинажтна Tao 1 полжморава·Реакцията протича в ДНК термичен цжклер, производство иа Persia ЬХвет Cetae · ,*_меЖе_МВЯ©е© размиря вам е на тежа, кодирам з остатък Т.2 от оеменвтво на близки токсини о подобна НН^-термжваяна аминокиселинма последователност ое постига, като се жзпола^ ва строго определена отвръщаща температура /&З^вС/.Тезк условия размжряват една единична ДЖ, която яма около 275 основях двойки в дължината еж, както е определено чрез електрофореза © агарозея гел.Когато ое използуват по-малко строги условия на отвръщане, повече от пет развирежи продукта биха могли да бъдат открити чре! електрофореза с агарозен гел с размер в границите на около 200 до зв3 венозни двойки·Тези различен РО» продукти, получени при по малка точност вероятно кодират полипеятждж, конто са блмзкя по амжжохиоелхнха последователност, в приблизителен размер ж в жнеектицидиа акти*гоот до остатък 6.2.Такива близки полипептнд би могло да се ачаква да акь-чзат остатъци 11 и 12, тъ! като

Ίΐ—терминалните последователности на тези полипептвдв са много подобни една на друга и към остатък 6,2, както е показано в

А 0 5 —»5t>—

Етап S t Клони рая е на 'KJSP продукти

Продуктите ₽Ш? както от реакцията е вноска етрогоот, таке м от реакцията е ихска строгост се пречистват аа да ое отстранят кшиклжяЕенвте прикерм, като се кзползува уотроЖство за разделяме зо молекулен размер ь.ентр?кон-1^;Х> / Дмикон/ .Запазените продукти след това се емклат с реотрикцжояния ензим lie* I / MBW/_tS IVvaeкее, У VI/, хоАто разцепва сп/сча^я ее надолу / 3* «pat/ пример, оставяйки едва лепкав крал .Менторът pKs Йг^авеяю ,WoHa_tCl/ ое смила двойно е Еоо» V /СЗ Mockcaiecl/ * ® I, за да et образуват местата, апецжфхчии за ръководено клони рап е. Вектор и имоърт се свързват и трансформират в комзлеке DH3 ₽*Лолония лифтове е е пресява е белязана вътремна проба в предполагаеми* те колонна се охарактеризират допълнително чрез определяне на последозателяоетта Л'3 Mooteeaical*· Вестеше Venrton 2.0 / на мжнжпрепаратжвна ДЮС, като се използува вътренната проба като пример.

.)влвто ЛНК последователности на оДЯК иясъртите на две 1^Швв са показани вЗЕ’· Ц) ЖМ2 ж 4. Само преджижт е получен в клонове, произлезли от строгата ?С» реакция, докато в двата тжпа на оДШС инсърти са намерени в кленово, получени от продуктите * на реакцията ВС® е по-малка строгост .Амин окис свинката последователност на полжпептмда, кодирана otSED ID Ж>«2 е показана в

SSC ID Ж) Н.Този полипептид има М-тердинална последователност идентична е определената аа остатък 9.2. Гзчисленото чолекулмо тегло ка този полвпептид е 637?.» далтона.ДопуекаЖкк че всички циотежня в сстестжеяия полилеитид присъстват във фермата на вътрежконолекулнж дисулфмдмй зръзци /цжетевн/, изчисленото молекулно тегло би могло да бъде 6368.7 ддлтома.Следователно, този поляпептжд изглежда че е идентичен е лолвзентжда, изолирам от

-57в остатък >.2, хоато показва молжуяно‘Тегло 66^1·— δ чрез масова опектрометржя.АикиоииселЕниата лоследователмост на полипеятида, кодирана чреа^^г· И' з4 е показана bSSc IT; МО зЗ.Тозх полвпептжд има ЬХ-терминална последователност, идентична е тази определена са остатък И.^свеи това, този долвпептжд наглежда че е еъцият полждептвд, изолиран в остатък 11· гшо? е

Токсичност спрямо бозайници

Обца отрова, 5 михролитра, получена от В· еав1Пм както е описано тук , е фатална аа мивка чрез мнтраперитожеално инжектирано /If/ в три отделни теста.Третхражата миша първоначално не ее различава от контролните, третирана със солен разтвор» Около 10 до 1.5 минути след инжектирането, третираната мивка става умерено хилерактмвна, проявявайки характерна подскачане походка» Това ое последва от кратък период ма накоордиаацжя, мъчително диване и конвулоки.Зюъртта следва след 2 минута от първоначалната атака на симптомите»

Остатъци 9*2, 11 и 12 ее инжектират иатраперитонеално в мишка в приблизителни дози от 4.2, 0.4 в 1.2 мг/жг съответно, като и за трите петмда не се наблюдават ефекти в период от 24 час«

Остатък 9.2 се инжектира в церебралните кухия» дрм четири, минни / около 28 грача/ при доза около 30 микрограма за жйвотмо /около 1 мг/кг/«Виках ви ефекти ме се забелязват през цялото време до 48 часа е след инжектирането.Други мммкж ое инжектират антре· первтопеално /I?/ е около 125 чикрограма / 4»2 мг/кг/ от остатък 9.2 и не се наблюдава никакъв оракт»

За охарактеризираме на токсичността на тави отрова спрямо гръбначни мзотжи, ооидьяеак .^зово-обрати ми фракции на облата отрова се изследват ир> мивка / Фигура 1/.Фракция & съдържа компонентите е активност спрямо червей по тютюневите пъпки·/23vv/«

Ярж доза, еквивалентна аа £Ь м.ккрслвзра от общата отрова /VV ¥Ж/, вктрапермтожеалното инжектиране а фракцнж 1 в 1 няма никакъв ефект ; Фракция 3 ja»a съците аие-ктв, наблюдавани прн михентиране иа облата отрова.Тези резултати предполагат ад но ясно разделяне между жжсектмшджо ефективната ^хтивмост в токсичната активност към гръбначни живото, налични а ксжонентхте на отровата от Plgaetia с«йМез.

Влектрофизаологмчмв данна

ДК t.i ое жзнмтва при 1 чжкромол по етножежие ва сгваптячна трансмисия / предгввгкак дакожмум на популация/ прж колатерален-СА 1 онмапо жа пирамидални клетка в арязълл /яаайби/ от мозъчните коремчета на плъх.Данмжте, представен» въз фигура 2 показват отчиталите резултата дрв оередиеко време на максимална популация /а/ за 5 минути преди прибавянето на ДК 3.2 н /о/ през интервал от 15-20 минути а лед прибавянето на S.S»$esm резултати пра показват, че тази концентрация ДК 9.2 няма активност прж. плъх

CII , която да може да бъде открита в този опит.Спктьт е в състоя ние да открие различни ефекти по отножеиге на различни йояни канали при бозайници и невропредаватехни рецептори /T.v^^mrwitklie ’’Използване иа вн витро мозъчни орязъцм в неврофармакологвята, в електрофизиологичните техник» във олотмята⁹, издание на

И.· .Qeiler, Alan ч»_# ^Т<>т& /.ао-епеци&лно, иолекулк конте предотвратяват мнактивж решето ма натриевите канал», такива като някои токовяж от скорпион, причиняват ясно изразено развяряв! не аа последната фала яа реакцията па популацмоиен връх / Кепес^а Р, уа* а У, 1ке^а ©>о У ^К*бТоксин от скорпион удължава фазата иа жжактжвацмя на завмевмия от напрежението натриев поток в хлжк жяолмрамж от плъх единична хмпокачпалиъ жевронн⁹,

-59- · .··. .··.„··. ....

ihrato Bea· 487 t 192—Т95,1'ЖУ/ 11m S»W»Her_t^a^iT«l Froduet 3elomee_t£ao·, ιι «публикувани наближения/· Bus ротна, Ж 9«2 е активен в првяар*т1 от зшоштв / домакиа муха/ а ря 130 аътк по— яжоки концентрации м до ©дим начин, който дава да оа предаоаага» че той предотвратява инактквмранете на натриевите канали и ри вноехтите.

ДЖИ1Р 8

Засечеш нагоре еДНК юеледователмооти/ееквяяцжж/, кодира ци прежуроора на ДК 9.2.

За да ое подучат насочена изгора «ек в вади» иа оДЯК, подир цв ДК й«2, в® ожитеви!» един вътретан олигонуклеотмд, о»отнететвад ма кужлеотядне киеелиниж остатъци от 159 до 178 върху нечувствителната мижа ма ЛИК последователностите, вредотавемж з ЗЖп П) Ж? jg₄ Реотрикциои»© място %ео И се я«ч«ре при $♦ крал иа този пример.Лесет микролитра от единлчяо узучана оДШС от отровна жлеза ое използват и ое стоязза опашата кри ше.йяип 3’ кра! о дежеигуановинови оетатъш посредством ензима терминална деокоиаухдеотйцта трааофераза ЯеиежгсМ .ЬпЪога· toriee /, jgo мваролйТрова реакционна смес, съдържаш 14 от ензима и 503.Ш _ее инкубира мри темворат?ра 37°С в продължение на 16 шнути. Пробата ое утаява о етанол в отново ое суспендира в 20 микролитра

Яаоочеште нагоре Д2К оеквакадв жа гоним специфичен арммер ое разммряват, като ое използува техника на закрепване ш надолу петок/арял токсин.Яавжмрителната реакция съдържа чувств» телжхн пример / 0 /С/ пример о отрязан spat/ и нечувствителен хрк.р . ..«ци.ршщм ^1Х>^ « *.«к>ммум«>»*ш1 грифосрат в 4 единаци тврноустойчйва ршаибикантнд^^ полк» м е рава· Температурният профил е както следва! 2 минути при 94°С, ~<5 ммяутж при 37*0, ι лЕнута ЗТ^У.’ Тоз*й цйжъл -ое'повтаря два път· ж след това програмата с« пгрвкмьш до идентичен профил, като се включва повжмека закаляваща температура от 54*0 при втория етап. Този цикъл ое повтаря 32 ·?*»«».

Закрепената Off да за при ЗЗЗЬр фрагмент, както е доказан© върху 4 % агарозен гел в присъствието яа етждиев бромнд.Теаж реакционен продукт ое използва за запълване на краищата, като ое взползва големият /KleaoW / фрагмент яа ДЯН золжмераза I от К.оо1, /Loleeulcr Mology ?-OBoure«a_r-.r?^ine^ χ ©« утаява чрез пркбавое яа етанол. Продуктът ое суспендира отново я ее смила е реотрикциояея еязвм,йсо Ж.Уововшикт Фрагмент се сближава в присъствието яа 1 мМ ензима

АТР чрез'74 кяиаза и ежел това ое свързва към Ево Ж и Вв© Ж _ _л<м~. ·’·' оак»*яцираща уевоек вектор ^ав^^®^етх^®^йЧПодклоаовете ое аиалжажрат црез>дв©1но усукана ДНК, като се използува сежзенава 2.0 /33» /·

Предаването на едНХ пооледователмоетжте, оъдърлкж в насочения катера участък към зрелия лен ти ден «десен показва ДХ 9^В който трябва да бъде синтезкран като едкн прш.урсорен протон .Насочената яото ре о.ЯЖ пое до сват ели оот е представена вЗВС IT- MOt 6 .Кодираният ярекуроорея .протеин ое състои от сигнална сдевенцъя и пропептицен участък /Si- IT ПО |7/, к г се отстранява, зд да се получи зрелия поптндеи токсин, хо»то е възможно да ое изолира от отрова иа паяк. Предполага оа, че сигналната и проп©стилната последователности еа необходжмж за произвеждането и секрети райето яа ;Ж S.2 s паяка.

W ХР 9

Отровя аа рдеомбимаптем бакуловируе

Сигнална одевенцжя /последователност/ на цжпдержлж /^оаев в сътрудкицж,Молекулярна регулация яа кленмрано и пълна едевенцвя на свързан е лемоцжамин ювеиилен хормон- подтискам протеин от хомолимфи ха инедетж^*^⁰^*^^®²¹* 25όι3ό9δ /1190/, ое конструира от два изкуствени олигонуклеотвдм, като се използува метода на et нерва ое пр^и-?тв©.т чрез Ясное^··?'/кг :;>>. . . гсгргфзик.Тезк два ©дигснуклса— тида споделят едш,. у-с -д бс-м· ,зс7ки на депълзктялка юслсдсса» теляоет прк техни* 4» терм? ιал.^;:©гато евввдаете ее зажалят в приеъсо?· ет© на чет.,.- м д-^с;. ·.·. бснуклвотъдо гр?фсдфдт1. s фрагмента ^r'len©vy s& ,Г^,?Т’ ', ее снмтезкра едкя двойяо-усукав продукт,^еакционянтс др-д;тсте се пречистват, като ее използува ххдрохеялааатянга хроматография и двоймо-уоуканит® ДНК молекула се усвояват с Лей- II, кххя рестрикциокадте ензими, подходящи ла вмъкване яа таза яасочем·.. ингоре е ех вещия на ДК >^,оДНК ее «·.* клонира в рК‘·- l^Cfe. (одклояовете се екрижират /отсяват/ за вмъкването яа сигналната еекввнщ-л и ое оценяват чрез 1ИК оеквемциоаяе.

ASK оехвенцирайето «ж поцвърадава едно структури© сливане между двете сЛМК последователности .чклоетяате синтетична геина конструкция се възбужда и адаптира за хлоямраме в мястото на ^^>1ие®^яс _f едвн ражудозируеш! преносим вектор / ^Ιηίητύ, J., в сътрудници, α,^ίτοίοο* 5415-50 /1&30//.Оекв-еицират ее еубклоаове за да ое потвърди правилното вмъквал® жа конетрукцмята,ЛЯК, сек*· диреща плазчид НЖ· потвърждава вмъкването ха синтезиран *оболуяващ паяка* ген / pre 4« >Д/ в б&куловируеиия преносим вектор pBhieBec f фигура 3/. Използвайехо яарВ1«©Зае вектора ускорява охрмжижг процеса, като вмъквахето яа навия рехомбяважтм ген а Закуловйрусмия геном се извършва чрез едновременна експресия на Д —галактодмд&за и ое открива чрез ирокдаа в цвета,кога!

ее отглежда върху определена среда.

Уекомбинантните бахулозкруеж, кодиращи яре ДК >.2 ее получават чрез транофекцмя ма клетки яа^Р^®-Н®>*8 frugiрегба щам af9 С*?вС,С1йГт) _{Uh(J jja χ} -4мкрограч<е№7 вмрусма ДЖ и 2 Miisporрана плазлилна ФК, като се използува протокола аа ~*Ε· · · ’ ’ “ · «*· ., *· ’ * * * · * · ·

Зщиаг йв1Ш / з ’ /ъкози vra„· а& лотода за**0ай>ловмруекх и ароцедури ^зс >-^«тъ.ни култура от вжееявж», Явжаж AgrioudU Ί-» tuTH·! Гхреrises* Bul'btts 1555» 1>88 г^.Четира дати олад тражефявш ята, р&зрежигшжя οι клотъчвл.л с_г-п?.-^<л»аит ее ялажярат върху 100 мм яглсчж, поеетн е 5 х I/⁵ '83 .<«еткж и с^^жриват е агароза,съдържаща ЛИЪяо 9Sb,n4tMer®euzg, / лято субстрат,? зрей 01 ίο 4 дена рохочбиааптито з:· откриват чрез «ежиия бледоеяи

Плаките во р^човьркиат о дьяета на Пдетвор и се лфсмжват ж цвят» лз« epi.^a»f08> excess ее използува повторя© зар&вяване е Sf$ клеткг, поеотм в ϊ-Βδ волба.Трн дена след заразяваяето ое събира аалъж обем от супериатан» ол иост разлзло нзолатв и са използува за приготвяне ив вкруоя* ПНК.Развмрявамето ма ?СЖ’, лото се ««ползува» вируояи опецжфъчкн прммерв от участъка, заобикалящ яголихедрпковтя гвк потвърждава, че пет ок маете вирусни и в олети съдържат пс.джо*· дяц по размер васърт « лизова какаото и ла е замърояваао е див ш Тмтрувъни жзходжи ревтвори sa. рекомбикянтнм звруен се пежучев&г олед това аж вд вк вгве в нн ангро тестване* идюлогвчна ажтжммсст ча ревомбинантен ДК 6U? ι

Ввологичиати активност на ре комби и© «тен остатък В «2 /£К »*Я пречъстеи от съдържана серум тъжанна жултурели» среда ее ввследв* в tsvv ларва в стадий да роовьтие вмстар.Лопжте се гачмеляват ма базата на от тестовия разтвор*При доза 16 «жврограма/гр*..

ршоибжнамажкя матергаж пргчннява вв.чвежв мускулен спазма % чаеа след ннжежтмржяв* .Половмката / 3 хм от 5.7 от тезж ларв» ое п?;жжм« зипат и настъпват овлни жоятракая» след 48 чаее, дожато другите ларви асе о-ze проявлват слаби w .гмезсии мускулни спчздй* Доза от 3 мякрограма/гр* също аж парализират 3 от б ларви, дооато доза от 5,2 мнкрограча/гр* паражквнра е ©τ в ларви,Резултатите потвърждават, че режомбинантния ЛК 9*2 е биологично ахтьвеи* ·· ·· .. ..·

Ротютбмяавтея вирус - и. вив© тестване

А. Биологична актввкост на ДК 3.2 рекомбинаитек ядрен поляхндровжсеж вярус (VACLK}»2)_#

1/ Хнтр^ваяе, на зъруемн ^реааратж» рмруснм жзжоднв разтворя се тжтруват чре» метода ма ояжт върху яхала /burt® _и сътрудница, *Обца вирусология*, 1178, етр» 21-32 7£1еу пп^д t>oue,Kew Тот&^^втрвте ое изразяват в условя· ята ка плака-обравувадм единици /FFU / аа единица обем, домат© делят· ое изразяват жатс» / ларва»&дма JW е фужжедожаллвлт еквивалент ва един зрял вириоя/вирус/ в препарата, където воотл ви слон е в състояние успешно да зараз» едиа клетиа-гоатояръемни /Ьиг1«? _м сътр,» tbi6 /, Например, 135 «летж-гсетазркемвждв биха могли да бъдат зарааеяи от зооти ммкролътър вкрусеа зреаарат,съдържам 106 /мл. / т,е. 1)3 IW/?одродятьр/.

2/ Зиоаяалжз ьжолсгичмата ажтжвяоет яа ДК >·£ рекоиблжаяткял ядрев лежихмхровжееи ввруе /гЮТ /_гу^л«Ж 9·2 ©е жзявтза в сер»и от с-питя с доза» преда «виж веда реалдал-етговор·? тезж ечитл» W» ларва /средна маса ожся© *^?г3 мг./ ое мяиоттира» с различим дови от ▼λ©; г. 9»2_{Я О}р_ед_& на тъкаяяа култура ъли само със среда на тъжаяяа култура /® ·13/»Κββτο прм еяскеркментмте е жнжажтираае на тотеми Сйиоаяж в пример 1, третираните ларви се държат в отделяй коит·!нерж с држ-бавяже «а храна и ое наблюдават перъодачяо.и5«л.инемйте резултат» иа два такива оякта © инжектиране жа вжрус оа илюстрирани в т-хбд:«ца П.Прк довж от _b0QQ^'W /ларва в по- гол яма, типьчнкт* екмятомж иа ДК тотевчкост / -лувжулмо тротероте м еяавмж/ ааяеч ват да е*· явяват около 24 часа след »ктестирането м най-малхо иолозия^та от тестовите иясекти са недееспособни / т.е. паралжзмя яж или частично парализирани/ след 43 часа.1зследваната кай-авожа доза, SOPMi /ларва предизвиква таейТерей© хтезазшее рамките ма

4*3 часа в прав» неспоооонв аа^~н$л*о 73 £ от ларвите а S3 до

140 часа.

В. Вжелогнчка активност ка^с7£ )»2 а еравквжме © дка тия

Цромедеми са ч<.м «лшл-miu мзел^дзаянл за азределияе ефишмн яостта aaV*cl)K ‘3*2 в о>*4д«д>*е с вегомв!· яриредътелсхл зъруоа ©т- джв ткж *-иАовГ‘лркя calif omlea иа «елх* ояътж е да ©е одуздод- д-.*дл. '-..-.pirn, инлокт^рояи βΤ’βΰΚ 9·2 етажът и^едосоЗди зл дс-^аже жwo, откс-лчото ларвж, зараз«кн е вдеиткф ма доза от ’iH-7»

1/ oay-i окологЕчагте акхдвнооти аа/»’·*·©*£ 9»2 jrrfe-MsOjfP? os ссазйяваг в серии от инжекнионо опити«Ларви яж червей ле тптпнеякее пъпки а последен ст.чдзй на раззжтгл/ИеИоШАа уХт^йосиз /_#«арвж л^реж ва ни залеоа гъосадца /—ic^pluri#? ni / н^памучея черв el яо пвекже де Д—>'7·Τη /

V«eTK% ? -pt- ’cSM йй вижоктярат е 5 х 10^-5Ц /ларва ο ; кодтроляп ларви се еяиеитарат оъс среда жа тъкажяа кудтуоа» Резултатите, оучиракг. з габляцв XII доказват, „ i*-Wf _ме *'с, ^.1»? _β зиачйТ^ляс лс-ахтввея» отчолхето^НжАжМОВГ при венчккте три зида.

В/ Опит яа подазднд

Ss да оо азследкч зктхямсетта ка’**©ГЮ%2 чое» иегдъцаж© е кообход*л*о 5,г зе произв-де този псх;<хкдряк-отри дателен Zi’^bV ргкекбняант въз Усрната да орално зарязквя-ие» Това се извьркш през ода опрем екна оихузня звТИ^Г)»?

е^~>'е*'Ж?7 , като ее иваол!

ндЗотол® за ссскзеемане kj / капрмчер^уре % ж сътр» орално пол-рок ©MS^HaKT’^’Va

J.virology §3/4/ _{f Χ}ό7·Μββ5 и Мое х еир», It3> г*, *гее·

МйТХ· Асзй »>..'©1 . qt! л

Θ651433-Μ56 /· плетките се заразява? арюаремежж ¥*С-..-Л»^^7ф»АсЬЖ1. V _4Ηθ8ζ<ς_ϊΒ<) инфекция^. / от 13 в t.

съответно» • »

В същото време, едае г^-иа л* *# члетжв ое варавява* само е /й01/· е/.л*'Т след заразяването жахлувионмите теля ее събират чрез раз .t··*?·.». че .·<» клетвата и .джферекцжяяжо цежтосфугж* разе·/например, VVooc , 1W0, ДгоТафу 194|3®2-3>>/«Йяжлузтожимте хокто тела ее преброяват на хочдатометърЛяетмв*· е· заразени едможвнм чеяио о«еЖ9*2 и роизвежлат по-малко яа брой и по-чалжж тежа, отколчото плетките· заразеит само е ***Ае Дебна»* на лолихедразната иячлузчя / Г_»/ от смесеното заразяваше е 4.6 ‘13/ жлетка, докато добивът от чистото заразяване ο ν! ·Α.οΞΑΜ?ν ο

33,3 в Z клетва·

За оценката на бмологжчяата антввнее* яа пдяовоочеячс вн лечения ^АеДК 6·2 в сровиаиие а тази на ее мазола,ува опжт ΰ включване яа ддета*?меоеяа лян д»ж тгп »ΤΏ ое включва η храна на вие еж* же жа арариа основа нрж мсядентрация 10® ?ХВ/гр®ж яшвдж храна.Храната ое разпределя в малки межтеЯнерж, което слея това ее заразяват е яесжатжм ларви / 1 аа тоятейвер, а «20/, Яа контролни ларви се -шяат мжеатжчяи величества я©третирана храча, Ларчгт© ее оставят да се хранят колчето искат ν ее наблюдават держ•дмчяо за развиването на окштожте·Резултатите оа помазани з Таблица XX .Не се наблюдават иижажвж ефекта за първите 43 часа, не елед 7« часа ножече от 30 Е от лаоаяте, които са се хрзз.илх съе еж свий ?ХВ оа паражвек?аиж.По същото време вирусът от джв тия ие лроявява ефечт.След >6 часа позаче от Ж) < от ларвите, третирани ^йкочбкчал· тно оа парализирани, ложето сачо 10 $ от третираните ларви от диви.¹ тжп еа умрели жли умяраациСяед 120 часа, 100 & от рекодбЕнантяо» третираните ларви са мъртзм жли умиращи, в сравнение със 75 £ , ако ларвите са третирани е ** -Ао^ДШ.Така, лрж олвт яа хранене манто прг. т «пипани даоя олкт, ларвите третирани е -’AoAK‘i.2 оа нодее епособнв в значително ао-хратък αβηκοζ от време, отходното ларви*·

Лвтретираяж о wt -Ас -<

/ •-v*

Опит с доаг, у.

мз··-. :<з» ,.*. рсжзцлл-отговор a 2BV ϊ 'ί

7Ф > Ф» сЛ часа 72 часа М часа 120 часа

Леса Р

Лж/ла₽ш/

4И»ВЗДМН*ЯМКЧ»Ч1МтМ№*«<иаг««*МЯМММ*М^>«?'*^м‘'****.«·»««».·

й: < v w B'-i, ах*	0	ί3 >	130	1-00	too
5.1 χ ю4	J	= 5	»5	100	130
η 5.1 X I·.;	0	25	75	Ю	100
5·1 X ГО**	0	0	55	*5	100
5.1 X 1?	0	0	20	65	ед
Комтоола	0	□	□	0	0

-57«

ЗДВЛИЦА III.0 равнение иа*Я*еРД#·^.· чрез инжектиране в ларви иа червей а© тютжезите цъякн /TW/, «а залеза пеперуда jtCb / и иа памучен червей а© цвеклото / W/

Третираяе	Видове	часа	43 часа	-V*— часа	~W“ часа	Ί0Β~ часа	~ΈΓ часа
тавж%2	тж„	0	0	100	юо	«0	т
wt-AcffiPV	т	°5	0	0	0	0	°4
Контрола	ж	0	0	0	0	0	0
▼ЩЖ9е2	°s	е	юо	ЮО	too	100	S/A
	сь	о.	0	0	0	юо	В/А
Контрола	сь	0	0	0	0	0	W/A
тАеГСЗ.2	»*’«	0	Ю	90	юо	ЮО	100
т4~МИГГ	вш	0	0	0	0	0	100
Контрола	MW	0	0	0	0	0	ю

1/ Вирусите са жкжгттранн прк 5 х 13³рю /ларва! контролите са ннжнк тирана е кдектичии обеми от среда иа тзкакиа култура.

средна

2/ в . g | означава м*оа арйб ли акт «лис 330 мг. ва ларва.

3/ 2 от 8 ларви несъмнен© оа умрели от фивгческа травма, дълмаца о<

иа икжектвракет© н са авкличенв от яонататъаск анализ.

4/ Омьртностга « юо % иа деветия ден.

вредна

5/ » · 13 | означава маса, првблжзитммо 145 мг. за ларва.

4/ » * 20 ааТМйЖ^р j а · Ю мчМе&Ж» контролите | средна часа приблизително 230 мг. за ларва.

-53ЯОЕР 12

Пром©тор ааигснното ксдираие аа ДК9*2

За достъп иа ’гонтрслните елементи ма гада, кодиращ ДК 9*2 оо прави една геномна библнотека.ДЖ ое получава от палци· като ое пползува един протокол, адаптиран от Herman» айй FriscJimxf / в Фетодж в ©яш ©легията· том 152, л_сяйеа1с Pre»· гХве*»!·®?, οτρ· 180-183/*ДЯК ое разлага частично е За» ЗА > ое фрахцнеинра чрез центрофугиране в 10 % «38 < плътност захаросан градаеит пра 25,300 оборота в минута в продължение на 18 часа о ротор Tig “^0 /Веокаяа 0©.,, Ьф<3« /.Обединени ДИК фракции с 35*45 kb ое пригот· вят за кижеятираи© в Но I усвоен хоомидем вектор, като се жзполау ва метода ’частично запълване*.Една четвърт от лнтигацг©ямата смес

Ш се пакетира във рагови частнчхх, като ое използува Qigapak gold /Stmtngene _fbaJolln ₉ од/ж ©лед трансформация ее получава еквивалента яж е над 3 х на ДЖ от паяк «Библиотеката ое поставя в двадесет и пет 150 ям аетрисвм еъдчета в ое повдига върху найлонови Филтри за изпробване с белязана с радиоактивен атом ДШС« Колония лифтове на теменната библиотека atXlguatia ^ββ схриимрат в серии е белязана о радиоактивен атом оДНК, кодираща Ж 9.2 к олмгоиухлеотмди о белязан край, кодиращи амииотермкналн» те, х&рбохсмтермммалвте н вътревна проба.Дджн коямид, ©Ж2 ее хибридна»ра с всяха от пробите. Зее ®Х усвоена кооиидиа ДНК noxaai че 3«0 кО фрагмент хибридизира както с вътреизвата така и със С-терминалните проби«Двойно усукано еехвенцираке на хосиидиата ©ДЖ, като се използват трите примери, определен» догоре потвър» дава полирането на гвза за ДК 9«2 и предполага възможността, ч© другж / или друг/ геин от това семейство могат да пребивават иа същото оъеедяо място на ДНК, както амино терминалния олиговухлеотид / който има висока степния на хомоложноот към всички иисектн* цидно ефективни пептмди / ЗазЬЬва ‘ДноГоброМяяте места върху коонидмата ДНК.

За доотъп до ярем стори 5 я участък яа нн ва ДК ··* беяв Ойнтев1.ран олмгокуклеотк д, съответства». на вре / сигнална а ек венци» яа. чувствителната нмжка. 5W разнирязането между този нркмер в друг от навита гсн-спецг ^чш: примери бе планиран· сигналната ешвемцжл да бъде повече ст 3,990 насочен* нагоре потоци на ямино терминалния ексон. Лайнер върху яечуяетвгтелзата нивва злед сова е е използува за оеквеицвраяе на героиката ЛЖ в- участъка, директно насоча» нагоря към 5’ края на оДЖ, кодмр&ца сигналния пептид.

Оек в ежим рацммв ДЖ насочен нагоре поток на сигналната после дсвателност върху геночната ЛЕК предполага друг жмтрон приЪр-11 о началния метиоиинов кодон.Свитзвяра ее олигожукяеотндеи пример, на съответства» аа 5· участъка на прекуросрВ^ДК ·♦*, сДЯК в ое използува за зареждане яа ?W реакция за определяне големината на намесвалата се оеквеяция, която е между трамекрнпциояното н траядедионното изходни -госта. Раз н^рем продукт с 1,090 основни двойни потвърждава наличието ма иятрон и осигурява определяне на неговИв разчер.ДЮС е «венци pane на геномжата ДНК,ж насочена нагоре към траяехряпцяониото начало / приема ое че е еквивалентно на 5* края яа сДКК / не показва наличие на промотор. ДЙХ последователността на азомоторння участък е представена в Зе поете IP полагаем промотор съдържа много от важните контролна сигнали, ко*1 присъстват главно в други еукаристичяя промотори в участъка, дира тис насочен нагоре от тзанследъонното изходно няото. Този промоте. зли участъци от този промстор могат да бъдат използвани за транекркпцжя / тредолацжя на други еухармотжчам гени в бая терия,вируен растения или животни.

·?:>

Ο'.. .1? 13 *· *· ·· Зоврофиаиологмчми изследвания, свързани е иачияа иа дойотзие аа ДК 3.2

Навършват ое незрофжз^рдогичая изследвания аа пр ездата ш начина на деЗотажз яа ДК >.2.Отчетените резултати от иевромувжужжа връажа я аермферен нерв.пра жжчянка амазжат, че ЛК 9.2 преднзвик.ва повтарящо се избиващо разтоварване в нервите, които са чувства гидии към блокирано о тетрсдотоксин.Така, чнотото на действие на този токсин в вероятно чувствителния към напрежение натриев капал ма нервната мембрана. Допълнителни жзследашия показват, че ДК 9.2 последователно възбужда перк-Форните нерви при прагова концентрация от 10 И допълнение, той е най-малко 53 азтж по-активен /вилен/ а сравнение е токови 4 от сксрпяона bciuius ouiwBetrintme· по отновенве :<а бозайници.

Използваните няоисрякекталиа жжзотжи в този опит оа ларж» я демавяа муха θαβοβ доздвНеав трети стадий аа рздз»зде.Ларвж9· ое обездвжжват с карфици и ое отварят тръбно чрез суедек етрпло* виден разрез.Тялото се откарфичза м аът^екноотите се отстраняват за да ое открие •луок-глтурата ка стекат-д ка тялото.Където оъцеотв] ват, перифериите кории ое отделят и мозъка ое ототраиява.Препарат! са потаия в солен разтвор за кнсекти, състазем с? / чй/ι Ма01 /143/, км /а/, oaox_t / зла/, ^ox_t /4/, казоо₃ /»/ BivpFs /5/ рИ · 7.2.

Злежтрод, стимулиращ всмукването се прикрепва към който » да е удобен нервен ствол зм да се отчете иивромускулЕат_А траисмвсия.Граничната веяичжжа за стммулмраве ое аовжнава бавно докато се кабадават контракции ка шусжуля© влакно 5 жли 7.След това, тоя®, вдадио се пробожда е отчитащ вътреклетъчен ммкреелек«род, свързан към вътре гк< клетъчен кревялхчватвл, използван за следене на възбуждащите олод-еияапткчнв потенциали /gpsp / в отговор на стнмулмраяе на нерва. '

За отчитане аа повикващата се електрическа активност в периферни аервми влакна, всм/хи^жят електрод ее прикрепва към АС превключвател.Сигналите е* увеличават 130 пъти в моцкостта прониква при 3.3 в 1 .Всички отчевени резултати ее 1ЩвЯм11 св хоипютаризйраната инструментална система за демонстриране и анализ·

Първоначалните експерименти по отновмше действието на ДК ».й използват препарат от мевромуакули о съединение.Единично стимул райе ое подава към периферния нерв, което води до единичен 05'2 в мускулатурата на телесната отена.В присъствието на ДК 9*%_t едиквча стимул води до високс-честотяо разтоварваме на 1?5?» В допълнение кш разтоварването, предизвикано от стимулиране, спонтанно експлозивно разтоварване аъдо моме да ое появи и може да се запази за няколко минути.Времетраенето иа такова ехоплозжжмо разтоварваме дмбикнсвеио е над 1 секунда, а честотата на ^25*2 по това време е к® >30 · Наличието на експлозивно разтоварваме, причинява енергична контракция в мускулатурата на телесната стена, което създава трудности прь поддържане на вътреклетъчните отчитания тъй като електрода ое изхвърля от мускула по вреже на веацем»#·· контракцията, предизвикана от експлозивното разтоварване.Оъогзетнс ловенето експерименти. оа извървени в солен разтвор, съдържащ вхео« ха концентрация вкхнроза / 300 м/, който подеиона контракцията, но сставя електрическата активност неповлияка.Подобни резултати се получават, когато се използуват нормални солени разтвора или солени разтвори с високо еъдържмие на захароза.

Експлозивните разтоварвания, наблюдавани след третиране с ДК >.2 еа подобни ма тези, наблюдавани в присъствието ма токсин: от скорпион, протеини, които оа взвеотиж че взаимодействат е ί

чувствителните към напр елов; е н. токови каиздж ма·’нервните мембршш· Тава, експловяввзте разтоварвания била могла а» бъдат блокирана чрез опедифжчния към митривейте -«анали тетродотоксин /ТТХ/.Оаоеоб· ί

вестта на ТТХ да предотвратява или премахва предмазнквмето от ДК>Л взривяваме е прхааанс зьа фигура &·$>» фигура 51, EES’? се блокира мол препарата бързо от 1 чйхрохфяж ТТХ, което ааави кшцпшжпитж имтензивМ за последващо третираме е ЮО н'· дк 9«£.Подобен експеримент е показан във фигура 5В, където взривяване се предизвиква от ДМ и ае опира чрез последващо прилагане на Т?Х»3 тозн експеримент, началото на взривяването измества електрода от мускула, което води до взвъркваме на ново убоадане, когато трябва да ое възстанови запиоа₍ След като аече ее намери подходящ© място за провеждане ма отчитано· то, след® ое за взривяване около 2 минути и препарата показва прекъсване на активността секунди след третиране с ТТХ.

оглед да ее првдварат проблемите, свързани @ вътремиеклетъчното отчитаме от мускул с контракции, горните експерименти ее повтарят отново, като се използуват извънклетъчни записи от периферни нерви на Лйчиика.Тезн записи включват увеличаваща се сетивна нервна аятлзаост наред оъо спонтанна антмдромична активно©¹ на двигателни влакче.Три 70 П’, ДК ·,2 причинява увеличаване иа нервното разтоварване, което ке е повлияно от последването третиране със солен разтвор, яо ©е блокира бързо от 0.4 юкромола ТТХ» Освен това, прилагането на ТТХ преди ДК »·£ предотвратява появата на взривявано·

Дредаръео бяха допълнителни изследвания за определяне на чувствителността на ларвите на вмоокт към iut л аа сравняване иа неговата активност с таза на стандартен токсин ст скорпион. ДК *«2 ое тества върху пренарат от перифсрзи нерв, като се започва при 1 ОЛ а лонцентрацаята се повняава всеки пет мьаути мяж докато се набладава увеличавано на активността.В този препарат 1 н·' и ай са неактивни, «г *я* п-иизшиГопийО препарата ахал кратко забанияе.ГЧз^лтаТЕТе от нит препарата о яераж се използуват за определяне ефектияи т>.-- ц.. -т, -як концентрация яа ДК §.£ по отко* кевие на пера от янсек-т к сг .:/-? ле те вежв в таблица TV».

-ОТГОЮ^ ...............	Брой туетгряиуя	про» реакция-отгожор 4
1 нм	2	0	0
2 Ж1	X	0	3
5 ай	3	1	33
10 ιίί	3	3

Последната група експерименти определят по подобен качжж чузстввтежиоотта на хпдеактните нерв» в» токови 4 от ехорииояа 1oV.--.-f -n;tn-niestelrtu3fT,«t 4),Π?«ι·ί»»»· /а -V °* зо««»е«» ** концезтрадви отЬоТХ 4 до 530 к«, но но показват ефектДоза установяваме е в съответствие а араджжжж изследвания, при които е уетаяовеяе, че ЬпТХ 4 е специфичен за натриевите кажели, на боаа!< квца.Ло-аататъиио предизвикване на теза препарати о ДК >·£ изисква lMJ жМ аа да се получи реаквдл-отгозор.алабото повижаванс на ефективната пределна концентрация на ДК 3»2 вероятно ое дължи ма слабо блширад© действие от неажтивммл ЬпТХ 4 .Тезк енсдермченти демонстрират, че ДК й»£ е най-малжо 53 пъти по-амтйвен, отколчочо _а0 отноиеше нервите на насекоми.

жш.

С«К«вЯЦЯЯ ХГ /аоследозаталноот/

Ш'иеаяж·

А.;гнокьселин«а аоследсаетелмоет на Дй ;?.2 £ Кодираща оДШС последователност яа Ж 9*2

3, Аминолиселинна последователност аа ДК 11

Кодираща оДШС последователност на Ж 11

Аммионноелвяна последователност иа ДК 12

Двлаа сДЖ последояатолнсот, лодхрадв Ж

Aw нежно елинна последователност та сигнална/ водеща последователност аа пршурсормжя Ж 9.JB

ДНК последователност ва премоторякл участва

Ж 9.2

79.Л&И.ИД ........' ··-.

/1/ Обща информация:

/X/ Заявител* Xsrrn. J.Kr-ncko j ВгяЙТогй Оятт

V^n' arrnm : <T.P.fteter Jse&aon /II / Заглавна на ^зобротеч/ето* Икоштидядяс афентввнв яентжди /Ш/ Spot яа веквенцхяте /последователностите/* 3 /IV/ Адрес за ко;шеяоядечщив1 /А/ Получател* ^оо^®ос>, ЖавМжир», Burts?, Faettewtos & Weiria /В/ Уякца* •^•berty Pl see — Ш Floor /0/ Град J РМХлЗеХуМ® /т Z ^гтл* t PemrylvsMr /г/ Зтрс.яа ί ^*^*^ft* /з/ Пощеясай КОД! 13103 /V/ Хомдотъраа Форма аа зазчктаяе» /А/ среден т*ш ι дясната 3.-S амча, 1.44 M3 захранеше /В/ Комиютзр* хай **s/2 /3/ Оперираща «wwna * /X- / Оо^уезр ι /VI/ Текущи данни н& ааявката* /А/ Заявка номер» /в/ Дата яа подаваме* /3/ КлаокфнкаЦмя*

ЛХХ/ Дредямнк дялан за ааяшатв* /А/ Заявка номер * 142,373 /В/ Дата на подаваме* 1 март 1391 година /ТИХ/ Адвсштсва/areateiia ниформадаа* /А/ Bits *<Й» ^СаМезП, /3/ РеСфОТзадвоввн номер * 28,357 /0/ Геферешиллея/ сахсъчок номер I Ш 0-0054 /IX/ Телеиомуиихадг.онна иифо^лзцйЯt /А/ Хедефои ι /й!5/ 568-3130

/.2/ Телефажо : /ίΐά/ 3-34.5 J /1/ иифориицмА ва ·-'-'' 2L ftvs 1 ;

/1/ Лраитариаткп; ла д^ладсвателиоотеа /еакаекцълта/;

/и/ далжжнаг оо имьиок^сзллия /V ι тил ι аманокдаелина /Д / ι топология ι аеи&аеотяа /XX/ ипвеаяна иа оемлендмяш t 1 ι

Ί”·

Ъут

Mp

sir

VU

GXu

Fm

Un

ay

Cyr·

Lyn

\T®

*yr

5 '

10

15

Asp

m

Git*

Cye

Asp

Ser

Sly

Сув

Cye

I»

Lyn

Gl»

Tyr

Leu.

30

25

5C

Trr.

*yr

?rp

*T’-r

Pro

Leu

Arp

C*r

A2T

Cyr

Leu

^er

Gly

35’

40

45

PW

Pfce

Ser

Her

Lye

Gy·

Ш

Cya

A®p

Vai

/2/ Информация аа *^х *^!^^s * ¹ /1/ ХазажгаркотЕжл з* пооледоватйляосгтаА /А/ Амжад : 270 ©оясвид двойми /В/ Тип : аухлеялова кяоелижа /0/ Усукване I дйокио /I / топология > меишвезтяа

/IX/ 0a«	саняе ка	. β«.3«ω.«« . r «»> 5
GGG	**G G*C	GCC GAO (ИС GaG	GGG	СЮ1»	GOG
«la.	Lye ‘^p	Gly «ftp 7:11 ¢001	Gly	’.Pro	Ala
1		r,
GGC	те mg	AAA f AC GaC GT a	Gift	те	GAG
Gly	Cye Lye	SI SI ЖИ gt# .QyS AbB vpX	Glu	Oye	Asp
		15			20

GO

Ш GGA GaG TGC TGC <S A AG CAG TAG CTG

Sei* Gly Glu Cye Cye *яг Lye Gin Тут

90

Т03 W Ш TGG CGA CCC CTG GAT TGC CGI120

Trp Tyr bye Trp Pro Leu Asp Cys Arg

3540

TGC CT A I AO AGC GOT TTC ?TC AGC AGC А A®>00

Cys Leu £ув Ser Gly Pke Ρϊκο Ser Ser Lye <550

TGC GST TGC AGA GAC GTG ΤΑ0ΑΤΤΤ0ΑΑ ЖШт· 188

Cys Vai J|| |ц Asp Vai

TGTTCT2TTT T00TTGTA0A ТЗЮСТАвЗ АААЗААЗТЗА

CIT0AITW АСЛАААТТ0А АТ0ЖТТ0АА AAAAAAAAM

228

2GB

AAAAA0C /2/ Внформаянл ® ® ¹

275 /X/ Харахвериетен на пооледователмоовва ι /А/ Дължана: S8 аминокиселини /В/ Tbs t амвнокиоелжнв /С/ Твпологмя ι неизвестна /И/ Оаиеанжо яа аекввнциява!^® ЯОв 3 в

Ala Lye Asp Gly lap Vai bye Gly Pro Ala Gly Cy® Met bye 5 Ю

Lye Ser Gly Asp Cys

Arg Gly lye Hr Cys Cy® Asp Gin Gin

Ъ A* m·*

ДиЖ

/2/ Информация »a®^ ® ’ /I/ Характеристики на соквеицилта!

/А/ Дължина· 204 основан двс&вж /И/ Tas · нуклеинова киоелжка /0/ Усуканос«· двойна /I f Топология ι неизвестна .

/XI/ Ояжоаяже на секвенциява i^ST’^r ® ¹⁸⁵¹

GCC A AG GAT GGC GAT GTC AAG GGA CCT OCT ШС TGC ATG АА® TAG ΛΑ» |la Lys Asp Gly jep Vai Lya Gly Pre Ца Gly Cys Met Lye to Lye

Ш СЮД Μ TGC AG* СЖ А Λ* ντ Ж W0 ОШ слГс<$ ТАС «С T0G 9

Ser Gly Авр Cyv Лгл Gly Lyr, ?кт Сув Суе Му Gin ЗДв Т>Г Ban Wp < ~ 25 50 m tgg сто а*т т сс*. ?ос ум «ю то ато то gaa ято

Тут Lye ЗД1 Л*Ж isn l»eu U~ Gn ьт$ Cys Pke tfcr Vai Gin Vai РШ

4C43

Ш ЯМ GAC TTO TTO 2GC A AC GC ATC AST «ААТОС AC A TGAAGAWA t94 ly» lye дер Cy® Tro Cys ша Mp lie Ser

5055

ATOTOTOT204 /2/ Инфсрмацвя ea -*θΐ 5 » /I/ 1аралтериетикв ка овкаекцвяте» ®5 /А/ Делянка * 62 амжнотиселммж /1/ Тип 2 еджнокжоелини /I / Топология! неизвестна /XI/ Оииоанже ка овкванцията! ®0 IP W0> 5

Ala Bye Aep (My Авр .Htoe Siu (My Fro Fro Sly Xaa Beu lye Met t 5 1015 ®ly Glu Leu Xr« Lye Gly Gly Шг is® Xaa tfcr Lye Vai tyrlye

2550

5yr Try lye Trp Art lye Beu (Mu Cye Leu Sly lye Ma Asp(My

4045 ?rp P1M Lye Lye Phe lie Cys Asp Siu Arg Хед Mi Pro Xaa ⁴ 55m

Xaa Xaa /2/ Информация ва S®C IP SOi 8 /I/ Харажтеркотнжм ва секвзнцилта!

/А/ Дължиш t 35» основни даойиж /в/ Тнн i нуклеинова киселина /0/ Усуеваже» двойно /1 / Топология ι неизвестна

ХХХХ /П/ Ониоание на оеквенцьята* SFo Ц) Hot β I тТТАСААТОСТОТОАТО ATOTOAlGAA ТОСТАДТОСА AGAACCCATO TCCGCCACA <

ATG AAG GTT TO GTT GT A CTG TO TGC TO TOT CTG GCA SC’ GTT TM5^ •Ъ-

Ве>

1»уе

να

Vai

Vnl

Leu

Leu

'Cyi*

W

’sir

* · · « Ьей'

AXA

Ala

VM

Tyr

-35

—30

-25

gcc

m

GAG

GAA

AG λ

CT*

GAC

A * A

GAO

GCC

GW

ATC

AfG

CTT

GAT

Ala

Leu

Gin

Glu

At®

ijOtx

ASp

bye

Asp

Ala

Asp

n·

Met

Ian

Asp

Ser

-20

-75

-W

CCA

зее

G-AC

ATG

GA a

GOG

MG

GAC

GGT

GW

gtg

GA A

GGG

COT

«Зм

ВГО

Па

asp

Bet

Glu

Am

Ala

Lya

Asp

Gly

Asp

Val

Gia

Gly

Pro

Ala

-5

1

5

10

GGC

тос

A AG

AAA

SAC

GAO

GT A

GAG

TGC

GW

AGT

0GA

GAG

TGC

TOC

Ш

Gly

Сув

by»

bye

Syr

Авр

Vai

Gin

Cye

A*P

Ser

Gly

Gin

Cys

црв

-¾¾¾

75

20

25

AAG

CAG

TW

ctg

tgg

TAG

A. AG

TOG

cga

CCC

CTG

GAT

TGC

CGA

TGC

OTA

500

lye

Gin

Syr

Ш

Trp

Syr

Lye

Trp

Arg

Fro.

Ian

Asp

eye

Arg

Cys

ban

30

55

W

AlG

AGC

GGT

ttc

TTC

AGC

AGC

A1G

TGC

»

TGC

A@A

GW

GTG

542

lye

Ser

Gly

Pho

Ser

Ser

Lya

Cyo

Vai

Cye

Arg

ASp

Vai

45

50

55

? ттосаас

359 /2/ Икфори&цжя аа SEc XX? Ж)< 7 /X/ Характеристики ма о «в акцията:

/А/ Дължиш, t 33 акинсжкоеликв /а/ Тжп ι амииокуоааишй /0/ Уеуквала:

/X / Топология 1 кеиавеетяа /XX/ Оаиоаяяе ка секважцмята: ®0 ® ?

Mat

by»

να

ИН

να

να

Leu

Leu

Су·

Lau

Ser

ban

ДЖж

Ala

-35

-30

-25

να

Tyr

Ala

Ian

Glu

Am

ban

Asp

£ys

Asp

Ala

ΛΒ₽

Xie

-20

-75

Mat

Leu

Asp

Ser

Pro

Ala

Asp

Met

Glu

Alg

-70

-5

—7

⁵ :/»/ Ияформадаа «а Г ROs 8

ЛЕ/ Характернотики яа ееквеицягнм /А/ Дължана! 481 основни. дзо,Шж /3/ Тжп « жуклемнойг- кжсвланм /0/ Уоукваие! дзойао /X / Топология? ”п?пзж?таа /XX/ Опявам»е яа оекзевдията! SBC И> КО | 8 шшшаю шаногаса самюяква:

тгтлвсавсс

0ЯД£ЮС2*СА (ИОМ®Ж

WCCCACOCT

СМАССАСИТ лСАСТСЖС c»w»«wwm

AWAWT?W сшжшто

СШЗЗДООАС

OTGGCTCCAG пшслсвт» стаошд*тт

ТТТТТ*-ТС

ДАОСААТСеС мм$Амтл

WTGCA0CT й(И*й *2Ш

TTfATCGGo д*с.«гасАтг

ДОДОШАЗДЮ TCTCKJTGCTG GTCGAGGCA^ mGWGGW атшоасос л mWTOCAG CGWACT-2at

5?MJO«JCAW «С«ДМЯ»Л сстАтт Авгияотв

GTUGCATGJU

CAAAACWA|g

GiGTGCTtm

Claims (20)

1, Значателяо препис-ген, иксектжцждме «рок тътен пептжд, изолира;

ее от отрова на я ip.?rti^A млж негова пркемлжм в земеделието жлж а градж;Ш.:стлстс .сол.

2, Поите*, съглася© претенция 1, характеризиращ ее е том» wo отровата от ваях е от Mguotl?» евММо·»

3· Родектжцждио е*метивея яептжд, съгласно дротонцж* 1» ларвите ржзвраж ее е това, че га молекулно тегло около $371-839? двятоя определен© чрез ходова опектрометржя ж пренаетваяе като едкнжчоя шжк върху вжеокоорвктжона течна хроматограхяя е обратна фаза ж негова приемлива в земеделието жлж · граджжарствоте сол·

4· Ржеектжцждк© ефзктввея иезтжд, еъглаояе нретеиция 1» характержзжраж ое е това, че има не същество оъмм аминохвоелжииа последователност, както е определено в t!) Ж) t 1,

5« нсекткдждно ефективен поптжд, съгласно вретенил 1» дарактермзжрад ее е това, че жна молекулно тегло около $740 дал тока, както е оарежелоко чрез лаеова опектрсметркл ж преместване като оджнвчом пжк върху зжс©неефективна точна хроматография о обратна фаза ж негова нриошггза а земеделието жлж з градинарството сол·

4. гнвектжцжда© ©фоктавоа пепткд, еьглаояс претенция 1, характеризиращ ое е това, че жма по същество съцътъ амжнокжселжяка последователите», хакте е определено * В) ЙО ι 5·'

7. иноектждвдне ефективен вентил, съгласие протекция 1» характеризиращ ое с теза, че има молекулно тегло около 7030 далтожа, както е определена чрез часова опектрометрмл и премествано като единичен пик прк вксоксе.ехтивна течна хроматографи я с обратна фаза и негова приемлива в земеделието или в градинарството еел»

8· йнсектицмдн© ефективен пептжд, съгласно претенция 1, характеризиращ ое о това, чо има от© същество същата амин ©кисели има • * • β

9. Звачвтежжо аа ;л ’ооледователиоет, жарахтервзхражв ·· е том, че ДНК послвдвв^теляоот ксдвра ваеатцкдке пелткд, за аъяоотло шеджрад. ое ст отрова за паяк Mguetia·

10. ДНК съглася© ирвтеажвя 3, харажтервзжража оо е том, чо отровата от аалк з от Tlguetia emltiee·

11· Зжачвтеляе хзелярам ДНК лоалодФзаталвает, еъглаове вретекдхя 9, характерязжрвща ое о това, ч« ЖК лоелед©ватеяяеетта · каят© е оягр©дележа в Е 50 ι 2· if, Зжачжтажжо жволжража ДНК яееледоветелжеет еъглмко вретек* жив 9, характедеежрахв се с това, че ДНК яоззодоватвжжоотта · както е ояределеяа в Ж) ι 4,

13. Зкачятежжо жзолярама ДНК зоследоватоляоет оъглаеже претежджж 9, хврахтеркзмрат® ое с това, чв ЖК яооледоватвлякотта в както е ооредвжека в

SFO П- НО ι

14. ?ехоз#жжажтоа екепреожонш вектор, харажтержажраж ое в ажак^ш едва ДНК яоеледователзоет, жаджрацв жжзектккжджо ефектазеж аввтвд, во еъкоотяо жзежярад ее от отрова аа яллл DifOBtla харахтодезжра» ое е това, че векторът в еяоеИоя да ©съдествв окаореела ка евококатата воеледователкеот ка кежвражо · трааефор· кжражв клетка.

15. Реком*1шажтеа мзвреежвжоа в«*тер,евгжавк© врвтзвжжж 14, харажтвржажра» ее е това, че отровата ет важа е от ЗДдооМа crniitiee.

18. РвкомОкажтеж екслресжеяек вектор, оъглаожо претеякжя 14, харажторжзврад ее е това, че одомематата ДНК вооледевателжоат коджра жжеоктждядяо афектжвея жежтжд, «карактерваврак е молекушк тегло вколо S371-839? далтека, «акт© е ©арадалеко чрез масова евштрометряя в аремеетвако катс одкжвчвк жвж върху вжоохоефетваа точка тограф.·.к с сОратна фаоа·

17. Рекомбжнактек ако преси ом ®н лектор, съгласно претекцмя 14, характери»·рая ое с това, че с.юм«ватата ДНК последователиеот ао еъаоотво кадвра зептпда, опрачелен в STC XD ЯО ι

18« Рокомбкаантен ексзресвонеа вектор, съгласна претеадмя 14, характервохраж се о това, че споменатата ДНК коелодоаатолкое* кодира ихеехтицждмо еуакт»пея иептжд, като оаомежатият пожткд е оларакторкажрав е лоягакулкс тегло около 8740 халтава, овредолево чрез масова ояектреметржя и зремеотваже като оджжвчеж яжк върху вжо ок ©ефективна точка хрсматография а оВратка фаза.

19· Рекомбвкаяток екепрвекомек вектор, съгласно претезкия 14, характермзжрад оо о това, че озокежатата ДНК зоолодоватолжеет по съяеетв© кедвра пеятжда, определеи в F ПО ι 3,

20· ?окомбжкамтеж екопроокожен вектор, съгласие претенция 14, характеривжрад ое о това, че екомсшатата ДНК яооледователкеет кодира жжеектжжждно ороктивоя пввтвд, охарактеризиран о «злекулжо тегло около 7080 далтона, определено чрез масова спеорометржя в зромоотважо като едхикчен шие върху вжоокееФектжваа течна хремата график с оЗратяа фаза.

21· Уокоибякаяток меепреожожея вектор^ оъглаожо протека** 14, жарамтеркзмрад ое е това, че споменатата ДНК последователноот зо съцевтво кодира нептжда, опре дележ в S8Q ΧΓ НО ι $·

22* РекояОииажтен мконревжавек вектор, съглаове аретеяцжя 14, характер»·кран ое с това, че споменатата ДНК пееледователкоет е по оъцоотво въжета, както е определена в SFQ ID ?Ю ι 2·

2.% РекожОжнамтен exesреемвя оя вектор, съглася© претекджя 14, хяражтернакрея ое о това, че ояемематата ДОС зооледоватолмоот е зе съжоотво таза, озределена в · 4·

24. Нкомбиимктея екеяреовокок вектор, еъглаеко зротонжвж 14, характеризирам ее е това, чеспатата* ЖК последователност е ме същество таен, определена и Ϊ? И ·

25« РскомЗннантеи скепраемонен вектор, съгласно претенция 14, характеризиращ оо е това, че опознатите транс форми рая» клетки са от растения, подаващи 8« аа часово нападаме от ммоемтж·

26, Трокогекко растение, характеризиращо ее с това, че има една ДЖ последователяост, кодираща ижеоктидижо офоятжвеж жежтжд, co същество жзожжращ ое от отрова ма паяк Dlguotia , вмъкната в зародишната лжжжж на споменатото растение илж в прародител на ежемшатото растежно, така че характерната черта н* експресията ва споменатата ДНК последователност ое унаеледява от последващите поколения жа споменатото растеж»е посредством полово размножаване нлм в е» полово размножаване,

27« РекомОнамтея Тйкуловирусея охонреонокен вектор, опоооСен да жзразж / екопреомра/ ДНК поелодозателяоет, жодираща вноектнцждяо ефективен жежтжд, а» същество жзолжращ ое от отрова на паяк

BigNtta , в гостоприелжик нлж в влетяа на име«т-гостояриемни

23« .Рекомбжжаятож Вакулоздрусеи експрес и онен вектор, съгласно претенция 27, характеризиращ се е това, че споменатият експресивен нен вектор о «акулевкруавн геи ом, охарактеризирам чрез ©помената та ДНК последователност, вмъкната в полиходрммез ген ж прн тражекржвниожм контрол ва ίакуловнрусси полкхедринов промотор»

22« РекомОжжамтка клетка от гостоприемно., транс формирана жлж пресечена @ ДНК последователност, характеризираща ее о това, че е

ДНК последователността, кодираща инсектициди© ефективен пептнд, по същество изолиран от отрова жа паяк _яо начин, даващ възможност на клетката-гоетоприечмик да експреоира споменатия пептжд.

30. ?екомЗвнантня клето на гостожрнемнвк, съгласно претенция

2Т, характеризиращи се о това, че споменатата отрова от паяк о от ^iguetia canities. ’..··..·* ..-..

31, ?ек®м®иааити$ клетка яа. гостонрмеикиж, съгласи© претенция £9» характеризиращи се с гоос, че опшмш&тата ДИК ясследеватвлаоет кодира жнеектицидже ефективен. пептмд, охарактеризиран чрез молеку© мо тегл© ©хол© 6371- 63>7 дхлтоиа, както е определено чрез часова ©цектреметркя в зреча-стз/ше като вдииичеи пжн върху висохоеректввма точна хремата гракал с ©Фрата* >ааа.

32, :³ехомЗйяаатз?г клетки «а госгоармеммяк, съглася© тровеният £9, характеризиращи сс с теза, че ©поменатата ХИК я©елФД©»ателн©«1 и© същество кодира зштжда, оп ред елен в- ЗЖ? 11’ Ж) i 1.

33, РекомОиааитии клеткж ма гостоариемжж, съгласно претекцмя

29. характерааярад ее е това, че споменатата ДНК последователност кодира жнеектмцидяо туокт»-веа пептмд, охарактержвжраи © желекулио тегло ©кол© 5740 далтшт, както е определен© чрез масова сяежтрометржя и премествай© като едянмен. чжж върху високоефективна течна хроматогра-рмя © обратна раза,

34, Рексмбжиаятмм клетки ня гвстоар^емижк, съгласно претенция £9, характеризираща ое е това, че зпочаяатата ДНК лоследователиоот то същество и одира двятжда, определеа в Т? W ι J.

35, Рекочбжиактчя «легии жа г©ст®прхомнжж, съгласно яретежжжя £ характер»»»радж се с тоза, че ©поменатата ДНК пеожедоватеяиоот кодира иясектицждио е^ект*«еж иеятжд, ©характери©края чрез молекулно тегло ©кел© 7030 далтока, каят© е ояредежеи© чрез масова спектрометгл.я ж лремеотваже кат© едмжкчеа тжж върху ©ведаоофоктж» жа течна хроматография е ©Вратна фава,

35. ®«комбвнантнж клгткж на гоотоприечимк, съгласи© претенция

29, харажтери©ира»о ое е това, че споменатата ДНК яоследеватажмеот по оъцество кодира пеятида, одредолм в Й Ю I f.

37, Рекочбжжактнж клетки на гоотопр; емяжк, съгласно претенция

29, жарантержомраца ое с това, че споменатата ДНК последователxoot · β® оънеетво .Л«..‘

38, ?вкембмжантж> г гостопрмвмяжж, съглася· «р «тоя вля

Ей, трактврввжра»х- си с гсз.,, че оаомшатата 4ШС м©оаад«аа?®лмов1 • а· «ъщоотао оаред ежех ата о & ^·

39· РакомшакжШ' кд#гхж i иотопрявмяна, оъглмж· яротожжм 2Ф, харакгериажрац^ &в с това, ч« опомш&т&та ЖК поелвдозатолнасч « по аъщвстжв оаредеаамата в ”·

40. йотод за получавай· ма жневктшквдно ефоктвжвж яеатжд, характеризиран co о това, чо вхжмчва :

/а/ ^уловаразе ма ршомбжааятнв хлатхи ма гоотшржемнжк, характери» о тоаа, че одш: рокомбакаятеж ««©преежокен вектор,вв т^раяафодаежраншш »лж прехзърдем и сдоманатит· клатех ма говтввр·· ошкх жна ДЖ лослодоматвлаовт, кодират шовятмандио аФ«ч?и»ва аептмд, ао аъноетво ^волжрад аа от отрова да паяк шраатержоарац са е гола, ча ажгорът о опоеобая да ооъяветвж •копровъя аа саомзнат^та код вра да поолвдозатолмоат в трааофмрмвраим клетка | и /·/ жоаочамо яМ аасаша-мя жвоштмдидао офвктжоам пвптжд от ршшйг.надтаата клетъчна ауят/ра жа годтояряомннха.

41. ?екомбош1тяо яронозедоа ментад, подучен еъгласио метода жа арвтзах&я 40.

42. :®тод, съгласно дретшджя 40, харахттркожраг; с® с това,, че сдохематата ДШС песледоватвлиост жаджра киевктжцмдго офвятхвои пвдтмд, оларахторжвжраж чрво жг»л охуля о тегло около б'71-ff двлтома, кше е определен© чрез масова спекпснвтртя а ярожвгтвая· яжте одмкчоа цдк върху високо офехтвкжа точка хроматеграфвж с обрата и. ф-ава*

43. Метод, сьгд&ояо дретвжцгя 40, характержоярах с« е това, чо споменатата ДЮС последователност по същество ходжра дептх*, си ре дележ з

S10 ТЮ Ж>| 1

-7* “ - · «·β· *··

44. Уетед, еъглаоно лре?ен«.»я*Чоу· ха^4к/ервМ>мк* ·· © том, та сяомекатата ЖК пееледоеателност коджра хиооктнщядмо ефективен пдагтид, охарактеризиран чрез чолекулмо тегло около 4740 дал тека, както е определено чрез uaeosa спектрометрнн ж зремеотваяо «ата едияичеи пик върху виешсо-ОФжтевяа точна хроматография е обратна фаза*

4S* рвтод, съгласно претенщмя 40, характеризиращ ое о това, че споменатата ДЖ поелгповатедяост по същество кодира пектина, оязеделек в зе^ IT NOj 3·

48, Метод, съглаомс претенции 40, характеризиращ ее о това, че е ломенатата ДНК последователност код мра имеактищидко ефективен лепти д, охарактерязисан «рев молекулно тегло около 7080 дал тома, кант© е определено чрез масова онектрометрия ж зремоотванз като единичен пак върху високоефективна течна хроматография ° обрати» фаза.

47. летод, съгласно протеклия 40, характеризиращ се о това, че сномекатата ДОС пооледоватакнеот по същество кодира пеятида, определен в I? ж>1 5,

43* Дотод, еъглаоко лретеяцня 40, характеризиращ се е това, че споменатата ДОК чослетоиатолноет е по същество тази, определена _в 3£О П) йОз 2,

49» Лстод, оъглаеко протеклия 40, характеризиращ ое с това, че споменатата ДОС последователност е жо същество тави, определена _в ЗЕЕ ID Ш 4«

SO* метод, съгласно сретендвя 40, дарактеривжращ се е това, че споменатата ДОС яоолодователжмт е во същество тази, шцшделема _в ЗЕЕ Ц_; HQ, g,

51* метод за контролиране ва 4еагръбмачкя вредители, характеризиращ ое о това, че опомематжто вредители вектажтуват с ефективно количество пезтмд, изолиращ ое от отрова иа наш Digtietla «З— ш негова оол, иягемлква в земеделието вля градя·арати©то,

62* йетод, оъглаадс- претенцкя Si, характержвжрац ©е а това, че отровата от жаля · от Diguetin c^nitloe.

S3, Хетод, аъглаомо лретеадхл 51, характвривнраж е© е това, че вредителят· оа жяеоктм.

54» Метод, иьглаожо «претенция 31, характормвнрац ое е това, чв вредителите оа ^₽i^f*optora.

5ft. Мттед за кохтролжраже аа бевгръбмачяи вредители, жардхтвражи рац ое о това, че оасшежатжте вредители контактуват о реконбжнажтек 6«хуловжруе, емоеебеи да ежомреоира ефсктжвж© количество от stеятид, изолиран се от отрова на .паяк Di^arMa· 5€. инсектицид ом състав, хадомтержзжраж ое е това, че съдържа иясвктхцддмо ефективно молмчеотв© от пштжд е«гласно претекдая

33 млв негова оол, нркемлжиа в земеделието вля градинарството в приемлив в зенедвляет© яли градинарството неон тел, 5?. Антитяло, характеризиращо ое с това, че но еъдоотво е вмуиореантивно о повежда, изолиран от отрова на пада DigneMa· S5. Антитяло, съгласно нретенжжя 57, характеризиран© ое е това, че отровата от паяк е от Eipuetin emitter· 5*>. Метод за използва»е на антителата, съгласно претенция 57, ва откриване наличието на инсектицида© ефективен жштяд, но оъц·етве изолиоащ се ©т отрова на нали Dl&uetia , характер® вираж ое е това, че вкжхчва!

/а/ получаваме на отрова от паяк, /В/ контактуване ма отровата от паяка еъе еионмвтите внпк* тела, еирегнати към маркировка ва откривано в /в/ откривано ив Теляванжте антитела. 4тт*Р.· тия лептид,

60, 1етод, оъгланк© претенция 5>, характеризиран се о това, че отровата от паяк · от- · ......

61. ЛЖ дроба, характермвмраш ое с това, че е получена от

ДЖ всоледомеолхоо», -соджра-м инаеатвцждво ефективен «МИА, яе оьцеотво маолжраж ое сг отрова на паля rtgostte·

62. Метод ка еткрмоа»© наличието жа «укламиоаа киселяха, коджраШ инае«т»яЕдно офдетлзеа поптад, по съдоотао жзолкрад ое от етровь аа лаях Мги®Нп _t хараятеривхрвж ©е е това, че вхлючва /а/ получаван· яз луялеиножа хмоодзла от паля, /4/ хоятантув&не аа апежежатата нуклеяяоаа хиоаляяа е ДНК οροί ата, съгласяо дрзтоцмя 81 ; я /в/ откриваза ка споядеатата ароба, озъраааа хъж опдеежавам вуклеянова цисзллиа.

<3. Иетод за язлолазаао ма амтвтелата, оъглаояо дратеимкя S7, ва зреччотаало <<а ипоеатлцкдно афдетивде пелтжд, по същество взолррл-з от от отрова ча таях MpieMa _а характеривжрап ое е тела, че адл.зчза· /а/ оъодчнпваяе на антитялото »ж твърж хоеятел | /в/ хентахтувахе иа ралтвер, съдържах апондеатмя пдетнд оъе едадгенатзтс азтятлле, ззързаяс хап од^мемътгн твърд попитал, като хо теаж заняз опо-цтения пдетяд ое замяра з разтвора пряк репеи към а изпънатото антитяло | /в/ отделяло за айоманатпж лтчтжд, прнчрепде хьм споменатото антитяло, озързляо лъч еночейатия твърд неоитвл | м /г/ събжраял яа снамдеа»я отделен чевтяд»

64, ⁷з<кгро йгоолйдователчовт, охарактаржежрака. чрез амиаокаселп-ша Coens хозатслмост, имаща по еъдоотзо ошвдечваляата хемологн!

звс п» Ш 7, е ажннохкотлпечата последователност, определена в

ж.зу част от нея, хаодетеризяраде ее е това, че саокеявтата врвяр© позледолателнест иля на©е от нож хдетронира ©дереджета

13— ж/илж мап»аако иа яапължо ρ&8·ίχτ«κ,’·ορΗθ*π«ι»Χ»»’

85« Генка втрухтура, характерхажрежа ое е това, на включва амжножнеелинна поолежователиотт, имаща но сълеотвс същата хомоложяа повледоватолнест е аминокисединната иовлодожатвлновт, определена в SIC Г МО 8 t жлм част ет кея, оперативно оеърваяв към пептжд.

<8, Прсмоторяа носледователноот, характервжжракв «е е икри « една иооледователиоет, имана по оъиоетво лемележиата носледевателкеат иа амжнежжоажжнната последователност, от ред елша в

3X0 £0 Ж)< 9 ежи част от нея, дарак терк одрана ое е това, чо оаомонатата иромотерна паеледоватажкоот насочва сковрмжята ва гвм в рекоибжяаятиата структура,

87, Рекамбвнажтиа структура, характер» виража ое о това, че има една последователност, по оъжоотво с еднаква хожояош «миг иоелодоватежноотта, определена в g^r $ | няж чаот от кея, оперативно овъроана към гола, който трябва да бъде ехопрееярам,

83, аеектмжидко афективай пептид, характеривирак ое с това, че споменатият пектжд съдържа:

/а/ дължина иа аьултало около 8$ до около 88 аминекнеелини| /б/ има повече от 40 4 жомоложка последователиоот е

Sir 11 met 1 ,8 жлж 5 | ж /в/ жш нрвблжвитеяво 7 жлж 8 кнотсииовя остатъка,

88, Пентжд, съгласно дретежжжя 88, жаражтернвлращ се е това* че жеточникът ма повежда е отрова от паяк Mguotla·