PL168222B1 - Sposób wytwarzania owadobójczego peptydu PL PL PL - Google Patents

Abstract

1. Sposób wytwarzania owadobójczego peptydu przez prowadzenie hodowli rekombi- nantowych komórek gospodarza uprzednio poddanych transformacji lub transfekcji rekom- binantowym wektorem ekspresyjnym zawierajacym sekwencje DNA kodujaca owadobójczy peptyd izolowany z jadu pajaka Diguetia, znamienny tym, ze stosuje sie wektor majacy zdolnosc wywolywania ekspresji tej sekwencji kodujacej w transformowanych komór- kach i odzyskuje sie owadobójczy peptyd z hodowli rekombinantowych komórek gospo- darza. (54) Sposób wytwarzania owadobójczego peptydu PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania owadobójczego peptydu, wyizolowanego z jadu pająka Diguetia, mającego zastosowanie do zwalczania szkodników bezkręgowych.

W ostatnich latach społeczeństwa uświadomiły sobie zagrożenia związane ze stosowaniem syntetycznych środków owadobójczych zarówno dla środowiska naturalnego jak i ze względu na ich toksyczność dla ssaków. W rezultacie, znacznie spadło zużycie tych środków owadobójczych; nie zmieniła się jednak potrzeba skutecznego zwalczania szkodliwych owadów. Pobudziło to naukowców do prac nad nowymi sposobami niszczenia owadów.

Najszerzej stosowane środki owadobójcze oparte na mikroorganizmach pochodzą z bakterii Bacillus thuringiensis (oznaczonych w dalszej części opisu skrótem B.t.). Ten środek bakteryjny stosuje się do niszczenia wielu różnych gąsienic żerujących na liściach, chrząszcza japońskiego i komarów·. W opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 797 279 ujawniono hybrydowe komórki bakteryjne zawierające gen kodujący delta-endotoksynę z B.t. kurstaki oraz gen kodujący delta-endotoksynę z B.t. tenebrionis i ich wytwarzanie.

168 222

Te hybrydy B.t. wykazują aktywność przeciw owadom wrażliwym na szczepy B.t. kurstaki oraz przeciw owadom wrażliwym na szczepy B.t. tenebrionis. Na ogół, hybrydy te posiadają użyteczne właściwości owadobójcze, przewyższające właściwości mieszanin fizycznych szczepów macierzystych pod względem siły działania owadobójczego lub spektrum aktywności lub obydwu tych własności jednocześnie. Kompozycje owadobójcze zawierające takie mikroorganizmy można stosować do zwalczania owadów stosując te hybrydy w ilości skutecznej owadobójczo na owady lub do ich środowiska.

Inna pochodna bakterii B.t. jest ujawniona w publikacji europejskiego zgłoszenia patentowego nr 0 325 400 A1, odnoszącego się do hybrydowego genu toksyny, która jest toksyczna w stosunku do owadów z rzędu Lepidoptera, zwłaszcza hybrydowego genu delta-endotoksyny zawierającego część genu toksyny B.t., odmiana kurstaki Hd-73 i część genu toksyny z B.t., odmiana kurstaki, szczep HD-1. Ujawniony jest hybrydowy gen (DNA) toksyny kodujący białko wykazujące aktywność przeciw motylom.

Wykorzystywano również owadobójcze właściwości bakterii B.t. (publikacja europejskiego zgłoszenia patentowego nr 0 340 948). Wynalazek ten dotyczy hybrydowych toksyn owadobójczych, które wytwarza się przez fuzję regionu rozpoznawnia komórek nabłonkowych jelit genu B.t. z łańcuchem B toksyny błonicy. Powstaje hybrydowa toksyna B.t. wykazująca aktywność przeciw owadom z rzędu Lepidoptera.

W publikacji tej wspomniano, że ten hybrydowy gen B.t. można wprowadzić do rośliny lub klonować do baculowirusa wytwarzając toksynę, którą można odzyskiwać. Alternatywnie jako środek owadobójczy można użyć gospodarza noszącego w sobie hybrydowy gen B.t., stosując go bezpośrednio do środowiska zwalczanego owada.

W poszukiwaniu związków o działaniu owadobójczym uznano jod skorpiona jako potencjalne źródło związków o własnościach owadobójczych. W publikacji Zlotkin’a znajduje się doniesienie o wyizolowaniu z jadu skorpiona Leiurus quinquestriatus quinquestriatus dwu toksyn działających wybiórczo na owady. [Zlotkin i wsp.: An Excitatory and a Depressant Insect Toxin form Scorpion Venom both Affect Codium Conductance and Possess a Common Binding Site. Toksyny pobudzająca i depresyjna z jadu skorpiona działają na przewodnictwo jonów sodowych i posiadają wspólne miejsce wiązania, Arch. Biochem. and Biophysics, 240:877-87 (1985)]. W badaniach nad ich własnościami chemicznymi i farmakologicznymi okazało się, że jedna toksyna wywołuje szybkie pobudzające porażenie skurczowe larwy muchy, a druga wywołuje powolne, depresyjne porażenie zwiotczające. Obydwie toksyny wpływają na przewodnictwo jonów sodowych.

W kanadyjskim opisie patentowym nr 2 005 658 ujawniono skuteczne owadobójczo białko pochodzące ze skorpiona Leiurus quinquestriatus hebraeus Buthinae, z rodzaju Buthidae. W tym wynalazku, jad liofilizuje się i rozdziela na frakcje. Frakcję o najwyższej toksyczności w stosunku do larw i najniższej toksyczności w stosunku do myszy poddaje się dalszemu oczyszczaniu oznaczając końcowy produkt symbolami LqhP35.

Grishin w wydawnictwie Toxic components from Buthus eupeus and Lucosa singoriensis venoms z Instytutu Chemii Bioorganicznej i. Szemjakina, Akademia Nauk ZSRR, Moskwa, 117988, GSP-i, ZSRR, ujawnia cztery toksyny wyizolowane z jadu skorpiona Buthus eupeus toksyczne w stosunku do owadów. Opisuje on również izolację i oznaczenie własności toksycznego składnika jadu tarantuli Lucosa singoriensis. Surowy jad jest nietoksyczny dla owadów.

Odpowiednio do badań i rozwoju różnych kompozycji o własnościach owadobójczych, naukowcy opracowują sposoby wytwarzania genów dla owadobójczych substancji i wprowadzania ich do wybranych owadów. Opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 879 236 dotyczy sposobu wprowadzania wybranego genu sprzężonego z promotorem baculowirusa do genomu balculowirusa z wytworzeniem rekombinantowego wektora ekspresyjnego baculowirusa zdolnego do ekspresji tego wybranego genu w komórce owada. Sposób ten polega na rozszczepieniu DNA baculowirusa z wytworzeniem fragmentu DNA zawierającego gen polihedryny lub części tego genu, w tym, promotor polihedryny. W celu wytworzenia rekombinantowego wektora przeniesienia dokonuje się insercji tego fragmentu DNA do nośnika klonującego, a następnie wprowadza się wybrany gen do tego mody4

168 222 fikowanego nośnika klonującego, tak, że znajduje się on pod kontrolą promotora polihedryny. Taki rekombinantowy wektor przeniesienia kontaktuje się, DNA baculowirusa typu dzikiego; ma to na celu homologiczną rekombinację i wprowadzenie wybranego genu do genomu baculowirusa. Okazało się, że baculowirusAutographa californica (AcMNPV) i związany z nim promotor polihedryny są użyteczne do wytwarzania wirusowego wektora ekspresyjnego o wyjątkowo wysokim poziomie ekspresji wybranego genu w eukariotycznej komórce gospodarza.

Twórcy sugerują, że ten wektor ekspresyjny mógłby być użyty w systemie zwalczania owadów na drodze selekcji genu dla białka, które jest toksyczne w stosunku do szczególnych owadów albo pewnej grupy owadów i klonowania tego genu do wektora ekspresyjnego AcMNPV. Autorzy uważają, że wektor ten mógłby być zastosowany na roślinę lub zwierzę, które ma być chronione. Taki rekombinantowy wirus mógłby wnikać do komórek ściany jelitowej wraz z pokarmem pożeranym przez owada, gdzie mogłaby się zaczynać jego replikacja. W alternatywnej propozycji można byłoby dokonać insercji tego genu do genomu baculowirusa tak, aby mogła zachodzić jego fuzja ze strukturalną sekwencją genu polihedryny w taki sposób, aby powłoczka polihedronu była dysocjowana w środowisku alkalicznym jelita owada i uwalniał się toksyczny produkt.

Następny sposób wytwarzania owadobójczych genów i wprowadzania ich do chronionych celów został ujawniony przez Cutler’a w publikacji: Electroporation: Being Developed to Transform Crops: Success with Model Crop Confirmed. [Elektroporacja: Rozwój w kierunku transformacji roślin uprawnych: Potwierdzony sukces z modelową rośliną uprawną), AG Biotech. News, tom 7(5):3 i 17 (1990)]. W artykule tym podano, że metodą elektroporacji DNA może być bezpośrednio wprowadzony do kiełkujących pyłków; pyłki te na powrót umieszczane w kwiatach dają nasiona, z których wyrastają transformowane rośliny. Ten sposób został z powodzeniem zastosowany w roślinach tytoniu i równie dobrze może być zastosowany w kukurydzy i lucernie. Może on być łatwiejszy od elektroporacji protoplastów, gdyż ostatecznym celem jest zapylenie kwiatów i pozwolenie kwiatom robić swoje a nie regeneracja rośliny, sposób ten polega na zbiorze pyłków, wywołaniu ich kiełkowania w płynie inicjującym kiełkowanie w czasie 30-60 minut, po którym to czasie łagiewka pyłkowa zaczyna wychodzić z ziarn pyłku, dodaniu żądanego DNA do ciekłej zawiesiny zawierającej te pyłki, wywołaniu szoku elektrycznego w celu otwarcia porów w łagiewkach pyłkowych, odmyciu nadmiaru DNA, nałożeniu zmienionych pyłków na znamiona słupków rośliny i czekaniu, aż powstaną nasiona. Może to być łatwy sposób wprowadzania dowolnego genu do roślin uprawnych.

Następny system dostarczania został ujawniony w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych. Ameryki nr 4 861 595, który dotyczy zastosowania traktowanych, zasadniczo niezmienionych komórek bakteryjnych jako systemu dostarczania związków białkowych do organizmów zwierzęcych i ludzkich. Komórki bakteryjne początkowo wytwarzają białko wewnątrzkomórkowe w wyniku aktywności genu homologicznego. Taki mikroorganizm wytwarzający białko jest traktowany metodami chemicznymi lub fizycznymi przy zasadniczym zachowaniu nienaruszonej komórki. W wyniku manipulacji procesem traktowania powstaje nierozmnażająca się, traktowana komórka bakteryjna bez istotnej straty aktywności wewnątrzkomórkowego związku. Ponieważ komórka nie ulega replikacji i będzie miała trwałą ścianę komórkową, która może być następnie rozerwana w żądanym miejscu układu trawiennego zwierzęcia lub człowieka, istnieje możliwość określonego w czasie i miejscu uwalniania produktów zamkniętych sposobem według wynalazku. Po odpowiednim traktowaniu, taką całą komórkę bakteryjną wytwarzającą białko stosuje się jako system dostarczania, tak, że nie jest potrzebne oczyszczanie wytworzonego związku. Materiałem wyjściowym według tego wynalazku może być każde białko, polipeptyd, aminokwas lub związek, w tym środek owadobójczy, który może być wytwarzany na drodze mikrobiologicznej.

Możliwość zastosowania technologii DNA do wprowadzenia syntetycznego genu zawierającego kod dla neurotoksyny z jadu skorpiona jest opisana przez CarbonelFa i wsp. w publikacji Synthesis of gene coding for an insect specific scorpion neurotoxin and attempts to express it using baculovirus vectors. [(Synteza genu kodującego działającą

168 222 wybiórczo na owady neurotoksynę skorpiona i próby jego ekspresji z użyciem wektorów baculowirusa) Gene 73:409-18 (1988)]. W artykule tym opisana jest możliwość zastosowania technologii DNA do wprowadzenia syntetycznego genu kodującego neurotoksynę zjadu skorpiona Buthus eupeus, do genomu baculowirusa w celu ulepszenia baculowirusów jako pestycydów. Badano wytwarzanie toksyny przy trzech metodach ekspresji z zastosowaniem układu ekspresyjnego AcMNPV opartego na promotorze polihedronu. Ekspresja samego genu złożonego z 36 kodonów dawała bardzo niewielkie ilości toksyny. Pewnym osiągnięciem było przyłączenie do toksyny peptydu sygnalnego. Znaczne poziomy białka były wytwarzane wówczas, gdy dokonano fuzji genu toksyny z N-końcem genu polihedronu. Wytwarzanie to było jednak 10 do 20-krotnie mniejsze od tego, jakie obserwuje się dla samego polihedronu. Uznano, że ekspresja nie jest ograniczana na poziomie transkrypcji lecz na poziomie post-transkrypcyjnym, włącznie z translacją i procesami stabilizacji białka. Nie wykryto porażającej aktywności wytwarzanych produktów toksyny.

W publikacji europejskiego zgłoszenia patentowego nr 0 431 829 ujawniono transgeniczne rośliny, w komórkach których zachodzi efektywna ekspresja toksyny działającej wybiórczo na owady pochodzące od drapieżnika polującego na owady w ilości wystarczającej do wywołania toksyczności u wybranych owadów żerujących na tkankach tej rośliny. Opisano tam konkretną toksynę wyizolowaną z jadu skorpiona Androctonus australis.

Wyizolowano również toksyny ekstrahowane z jadu pająków. Geren, w publikacji Neurotoxins and Necrotoxins of Spider Venoms [Neurotoksyny i nekrotoksyny jadów pająków, J.Toxixol. - Toxix Reviews, 5(2):161-170 (1986)], dokonał przeglądu prac nad neurotoksynami i nekrotoksynami. Sugeruje on, że cząsteczki jadu pająków mogą służyć jako substancje modelowe dla specyficznych środków owadobójczych.

W opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 925 665 ujawniono sposoby leczenia serca i chorób neurologicznych przez podanie toksyn pochodzących od pająków Agelenopsis aperta i Hololena curta. Toksyny te wykazują również aktywność specyficznego blokowania kanałów wapniowych lub blokowania receptorów aminokwasów pobudzających, która to aktywność może być użyta do zwalczania owadów i podobnych szkodników.

Przedmiotem publikacji europejskiego zgłoszenia patentowego nr 0 395 357 są poliaminy i polipeptydy wyizolowane z jadu pająka Agelenopsis aperta. Poliaminy te działają antagonistycznie na neuroprzekaźniki aminokwasów pobudzających. Polipeptydy i jedna z poliamin blokują natomiast kanały wapniowe w żywych komórkach różnych organizmów. Autorzy rozważają możliwość użycia tych blokerów kanałów wapniowych do zwalczania szkodników bezkręgowych.

W publikacji europejskiego zgłoszenia patentowego nr 0 374 940 opisane są toksyny wyizolowane zjadu pająka Hololena curta. Polipeptydy te mogą znaleźć zastosowanie jako środki owadobójcze i lecznicze, np. jako blokery kanałów wapniowych i antagoniści glutaminianu.

Bowers i wsp. w publikacji: Identification and purification of an irreversible przesynaptic neurotoxin from the venom of the spider Hololena curta [(Identyfikacja i oczyszczanie nieodwracalnej pre-synaptycznej neurotoksyny z jadu pająka Hololena curta), Proc. Natl. Acad. Sci. 84:3506-35010 (1987)], ujawnili białkową neurotoksynę, którą wyizolowali z jadu pająka Hololena curta oraz jej działanie hamujące przewodnictwo nerwowo-mięśniowe u larw Drosophila. Autorzy sugerują, że toksyna ta blokuje kanały wapniowe pre-synaptyczne w neuronach motoiycznych Drosophila.

Quistad i wsp. w publikacji: Paralytic and Insecticidal Toxins from the Funnel Web Spider, Hololena Curta [(Toksyny porażające i owadobójcze pająka z rodziny Agelenidae, Hololena Curta), Toxicon 29(3):329-336 (1991)] opisali jeden peptyd i dziesięć kurtatoksyn oczyszczonych z jadu Hololena curta oraz ich działanie po wstrzyknięciu do larw motyli.

Stapleton i wsp. w publikacji: Curtatoxins: Neurotoxic insecticidal polypeptides isolated from the funnel-web spider Hololena curta [(Neurotoksyczne owadobójcze polipeptydy wyizolowane z pająka Hololena curta), J. Biol. Chem. 265(4):2054-2059 (1990)], donieśli o trzech polipeptydowych neurotoksynach wyizolowanych z jadu pająka Hololena curta i ich działaniu na świerszcza acheta domestica.

168 222

Quicke i Usherwood w publikacji: Extended Summaries Pesticide Group Physicochemical and Biophysical Panel Symposium Novel Approches in Agrochemical Research [(Rozszerzone podsumowanie Grupy Pestycydów oraz panelowe sympozjum fizykochemiczne i biofizyczne na temat nowych kierunków w badaniach agrochemicznych), Pestic, Sci. 20: 315-317 (1987)] donoszą, że toksyny znajdujące się w jadach pasożytniczych os i w jadach pewnych pająków z rodziny araneidae, wstrzyknięte owadom, powodują ich szybkie porażenie. Autorzy sugerują, że toksyny pająka są blokerami regulowanych receptorem kationo-selektywnych kanałów błonowych, które współdziałają z otwartymi kanałami regulowanymi przez receptory glutaminianowe mięśni szkieletowych szarańczy. Opisali oni toksyny o niskim ciężarze cząsteczkowym obecne wjadach pająków Argiope i Araneus oraz toksyny wyizolowane z gruczołów jadowych pająka Joro, Nephila clavata.

Inne badania dotyczące własności wyizolowanych toksyn z jadu pająków ujawniły zdolność nisko-cząsteczkowych czynników wyizolowanych z jadu pająka z rodziny Agelenidae do odwracalnego wiązania się z kanałami wapniowymi. W opisie opublikowanym pod nr WO 89/07608 ujawniono, że te aktywne czynniki o niskim ciężarze cząsteczkowym odwracalnie wiążą się z kanałami wapniowymi z selektywnością i powinowactwem wystarczającym do wygaszania przewodnictwa wapniowego w neuronach i pozwalającym na wyizolowanie i oczyszczenie struktur kanałów wapniowych. Jady te okazały się toksyczne dla ssaków.

Inne zastosowania toksyn pająków są opisane przez Jackson’a i Parks’a w publikacji: Spider Toxins: Recent Aplications in Neurobiology [(Toksyny pająka: ostatnie zastosowania w neurobiologii)], Ann. Rev. Neurosci. 12-405-14 (1989)]. Autorzy piszą, że istnieje ogromna heterogeniczność toksyn pochodzących z różnych rodzajów taksonomicznych. Badania świadczą o specyficznych gatunkowo własnościach kanałów wapniowych; jady pajęcze mogą wykazywać właściwości antagonistów kanałów wapniowych. Opisane jady pajęcze działają na kręgowce. Autorzy uważają, że jady te mogą się stać źródłem toksyn działających selektywnie na owady, przydatnych w rolnictwie.

W publikacji Isolation and Biological Activity of Synaptic Toxins from the Venom of the Funnel Web Spider, Agelenopis Aperta (Izolacja i aktywność biologiczna toksyn synaptycznych z jadu pająka z rodziny Agelenidae, Agelenopsis Aperta) zawartej w książce Insect Neurochemistry i i Neurophysiology, 1986, wyd. Borkovec i Gelman, Humana Press, New Jersey, 1986, Adams i wsp. piszą, że z pająka Agelenopsis aperta wyizolowano wiele toksyn peptydowych, które antagonizują przewodnictwo synaptyczne u owadów.

W opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 855 405 ujawniono inhibitor receptora otrzymany z gruczołówjadowych pająka Joro i sposób jego wytwarzania. Związek ten ma działanie owadobójcze przy jego kontakcie z owadem, jeśli jest podany w formie ciekłej lub stałej.

W opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 918 107 opisano związek o aktywności inhibitora receptora glutaminianowego, sposób wywarzania tego związku i zawierający go preparat owadobójczy. Związek, w ciekłym lub stałym nośniku z dodatkiem środka dyspergującego, podaje się bezpośrednio na roślinę lub zwierzę, które ma być chronione przed owadami. Jako insektycydy są skuteczne już niskie dawki; charakteryzują się one bardzo niską toksycznością w stosunku do ssaków i ryb i bardzo niewielkim niekorzystnym wpływem na środowisko.

Zastosowanie baculowirusów jako bioinsektycydów również było badane. Największą wadą baculowirusów typu dzikiego jako bioinsektycydów jest to, że działają powoli. Larwy zakażone drogą pokarmową baculowirusem typu dzikiego na ogół podają w ciągu 5 do 7 dni. W znacznej części tego czasu takie zakażone larwy nie przestają żerować, co może powodować znaczne niszczenie zbiorów.

Ze względu na wiele złożonych problemów związanych ze stosowaniem syntetycznych środków owadobójczych, takich, jak toksyczność, niebezpieczeństwo dla środowiska, zanikanie skuteczności z powodu rozwoju oporności, istnieje ciągła potrzeba rozwoju nowych środków do zwalczania bezkręgowców, w tym rozwoju zmienionych genetycznie rekombi168 222 nantowych baculowirusów, wytwarzających białka toksyn unieczynniających gospodarza szybciej niż sama infekcja baculowirusem.

Sposób wytwarzania owadobójczego peptydu przez prowadzenie hodowli rekombinantowych komórek gospodarza uprzednio poddanych transformacji lub transfekcji rekombinantowym wektorem ekspresyjnym zawierającym sekwencję DNA kodującą owadobójczy peptyd izolowany z jadu pająka Diguetia, polega zgodnie z wynalazkiem na tym, że stosuje się wektor mający zdolność wywoływania ekspresji tej sekwencji kodującej w transformowanych komórkach i odzyskuje się owadobójczy peptyd z hodowli rekombinantowych komórek gospodarza.

Korzystnie stosuje się sekwencję DNA kodującą owadobójczy peptyd o ciężarze cząsteczkowym oznaczanym metodą spektrometrii masowej około 6371-6397 daktonów i dający jeden pik w chromatografii cieczowej z odwróconymi fazami, a zwłaszcza o ciężarze cząsteczkowym oznaczonym metodą spektrometrii masowej około 6740 daltonów i dający jeden pik w chromatografii cieczowej z odwróconymi fazami lub o ciężarze cząsteczkowym oznaczonym metodą spektrometrii masowej około 7080 daltonów i dający jeden pik w chromatografii cieczowej z odwróconymi fazami.

Korzystnie stosuje się sekwencję DNA kodującą w zasadzie peptyd zdefiniowany sekwencją ID nr 1, nr 2, nr 3, nr 4, nr 5 lub nr 6.

Sposobem według wynalazku otrzymuje się nowy owadobójczy peptyd, w znacznym stopniu oczyszczony i wyizolowany z jadu pająka Diguetia oraz dopuszczalne w rolnictwie i ogrodnictwie sole tego peptydu.

Peptydy owadobójcze otrzymane sposobem według wynalazku wykazują wysoki stopień selektywności w stosunku do bezkręgowców, a zwłaszcza owadów. Ponadto, te owadobójcze peptydy okazały się bardzo skutecznymi insektycydami dla owadów ważnych w rolnictwie, a zatem uważa się, że stanowią istotny wkład w dziedzinie zwalczania szkodników bezkręgowych.

Nowa, wyizolowana sekwencja DNA koduje peptyd owadobójczy, wyizolowany z jadu pająka Diguetia.

Nowy rekombinantowy wektor ekspresyjny zawierający sekwencje DNA kodującą owadobójczy peptyd wyizolowany z jadu pająka Diguetia ma zdolność wywoływania ekspresji tej sekwencji w transformowanych komórkach.

Nowa, rekombinantowa komórka gospodarcza, poddana transformacji lub transfekcji sekwencją DNA kodującą owadobójczy peptyd wyizolowany z jadu pająka Diguetia pozwala na ekspresję tego peptydu w komórce gospodarza.

Nowy rekombinantowy wektor ekspresyjny baculowirusa, zdolny do ekspresji sekwencji DNA kodującej owadobójczy peptyd wyizolowany z jadu pająka Diguetia, w gospodarzu lub w komórce owada jako gospodarza.

Sposób wytwarzania owadobójczego peptydu wyizolowanego z jadu pająka Diguetia obejmuje etapy: hodowli rekombinantowych komórek gospodarza, uprzednio poddanych transformacji lub transfekcji rekombinantowym wektorem ekspresyjnym, zawierającym sekwencję DNA kodującą owadobójczy peptyd wyizolowany z jadu pająka Diguetia, który to wektor ma zdolność wywoływania ekspresji tej sekwencji kodującej w transformowanych komórkach oraz odzysku tego owadobójczego peptydu z hodowli komórek rekombinantowego gospodarza.

Transgeniczna roślina zawiera sekwencję DNA kodującą owadobójczy peptyd wyizolowany z jadu pająka Diguetia, wprowadzoną do linii zarodkowej tej rośliny lub przodka tej rośliny, w taki sposób, że cecha ekspresji tej sekwencji DNA jest dziedziczna w następnych pokoleniach tej rośliny pochodzących z rozmnażania płciowego lub wegetatywnego.

Zwalczanie szkodników bezkręgowych polega na kontaktowaniu tych szkodników z rekombinantowym baculowirusem, zdolnym do ekspresji owadobójczego peptydu wyizolowanego z jadu pająka Digutia lub jego soli akceptowanych w rolnictwie i ogrodnictwie.

Stosowanie przeciwciał do oczyszczania owadobójczego peptydu wyizolowanego z jadu pająka Diguetia obejmuje etapy: koniugowania przeciwciała ze stałym nośnikiem, kontaktowania roztworu zawierającego peptyd z przeciwciałem skoniugowanym ze stałym

168 222 nośnikiem, dzięki czemu ten peptyd obecny w roztworze przyłącza się do tego przeciwciała, usunięcia tego peptydu przyłączonego do przeciwciała skoniugowanego ze stałym nośnikiem, zebrania oczyszczonego peptydu.

Figura 1 przedstawia wynik analizy HPLC z odwróconymi fazami pełnego jadu pająka Diguetia canities w gradiencie 0,1% kwasu trójfluorooctowego (TFA) z acetonitrylem. Widoczne są trzy grupy składników testowanych na myszach. Frakcja 2 reprezentuje składniki aktywne w stosunku do larwy motyla tytoniowego.

Figura 2 przedstawia peptyd DK 9.2 testowany w stężeniu i μ M na przewodnictwo synaptyczne (wzbudzenie piku populacji) w synapsie komórki piramidalnej obocznej - CA i Schaffer’a w skrawkach hipokampu szczura. Przedstawiono dane reprezentują uśrednione w czasie zapisy pików populacji (a) na 5 minut przed dodaniem DK 9.2 i (b) w przedziale czasu 15-20 minut po dodaniu DK 9.2. Zapisy te są identyczne, co oznacza, że przy tym stężeniu DK 9.2 nie wykazuje aktywności na ośrodkowy układ nerwowy szczura, co można było stwierdzić w tej próbie.

Figura 3 przedstawia mapę pWR9, wektora przeniesienia opartego na baculowirusie, zawierającego gen kodujący preDK 9.2.

Figura 4 przedstawia wyniki próby ciągłego karmienia noworodków larw motyla tytoniowego dietę wirusową (1000,000 jednostek PIB/g diety).

Figura 5 przedstawia zdolność tetrodotoksyny (TTX) zapobiegania lub odwracania wyładowań wywołanych przez DK 9.2 A. Definicje.

Stosowany w opisie termin owadobójczy peptyd izolowany z jadu pająka Diguetia obejmuje peptydy aktywne jako środki owadobójcze, oraz owadobójcze fragmenty tych peptydów z dowolnego źródła, o ile tylko peptyd jest izolowany z Diguetia dowolną znaną techniką. Źródła te obejmują np. owadobójcze peptydy produkowane techniką rekombinacji dNa.

Termin wektor ekspresyjny obejmuje wektory, w których zachodzi ekspresja zawartych w nich sekwencji DNA, przy czym te sekwencje są operacyjnie związane z innymi sekwencjami umożliwiającymi tę ekspresję. Zakłada się, jakkolwiek nie zawsze można to bez zastrzeżeń stwierdzić, że te wektory ekspresyne muszą się replikować w organizmach gospodarza albo jako episomy albo jako integralna część chromosomalnego DNA. Brak zdolności replikacji sprawiałby, iż byłyby nieskuteczne. Reasumując, wektor ekspresyjny jest definicją określającą funkcję i każda sekwencja DNA zdolna do efektywnej ekspresji kodu określonego DNA w niej zawartego jest objęta tym terminem, gdyż stosuje się on do określonej sekwencji. Na ogół, wektory stosowane w technikach rekombinacji DNA występują często w postaci plazmidów, czyli cząstek kolistego, dwuniciowego DNA, który w formie wektora nie jest związany z chromosomem. Terminy plazmid i wektor stosuje się wymiennie, gdyż plazmi jest najpowszechniej stosowaną formą wektora.

Termin rekombinantowe komórki gospodarza określa komórki, które zostały transformowane wektorami skonstruowanymi z użyciem technik rekombinacji DNA.

Według ostatnich badań, rodzina pająków Diguetidae ostatnio składa się z jednego rodzaju, Diguetia. Gatunki wchodzące w skład rodzaju Diguetia na ogół zamieszkują południowo-zachodnie obszary Stanów Zjednoczonych (w tym Kalifornię) i Meksyk. Te małe pająki przędą rozprzestrzeniające się, nieregularne pajęczyny na wielu rodzajach roślin i krzewów, w tym na kaktusach. Różne gatunki Diguetia są, jak większość pająków, drapieżnikami, z łatwością pożerającymi większość typów owadów, które złowią.

Zaobserwowano niezwykłe objawy po wstrzyknięciu owadom owadobójczych peptydów. Objawy te bardzo przypominają te, jakie obserwuje się po wstrzyknięciu owadom weratrydyny, alkaloidu będącego aktywatorem kanałów sodowych, albo toksyn skorpiona z rodziny Buthidae i z rozwoju Buthus, o których wiadomo, że są aktywatorami pre-synaptycznych kanałów sodowych. Uważa się, że owadobójcze peptydy mogą powodować częściową depolaryzację błon mięśniowych i/lub nerwowych, co może mieć wpływ na kanały sodowe lub potasowe. Konkretniej, uznaje się, że owadobójcze peptydy wywołują powtarzające się wyładowania w nerwach wrażliwych na blokowanie tetradoksyną. Tak więc, jest

168 222 prawdopodobne, że miejscem działania tych peptydów są zależne od napięcia kanały sodowe w błonach nerwowych.

B. Izolowanie peptydów z jadu Diguetia

Jad pająka można pozyskać z Diguetia w dowolny znany sposób, np. przez ekstrakcję gruczołów jadowych z głowotułowia. Jednak, w celu uniknięcia zanieczyszczeń w jadzie i wyizolowanych toksynach, korzystnie zbiera się jad pająka przez elektryczną stymulację pająków, powodując uwalnianie jadu i następne zassanie, zbierając uwolniony jad i zapobiegając jego zanieczyszczeniu cofającymi się płynami lub hemolimfą, na co zwrócono uwagę w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 925 664.

Po ściągnięciu jadu techniką dojenia elektrycznego, frakcjonuje się go na składniki peptydowe (toksyny) techniką wysoksprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) lub techniką chromatografii w żelu albo inną dogodną techniką frakcjonowania. Ponadto, w wielu przypadkach wskazane jest końcowe frakcjonowanie jadu pająka techniką HPLC.

Tak więc, stosując technikę elektrycznego dojenia pająka w połączeniu z chromatografią żelową i/lub wysokosprawną chromatografią cieczową i inne odpowiednie techniki, takie jak chromatografia interakcji hydrofobowej, możliwe jest uzyskanie w zasadzie oczyszczonych toksyn pająka. Należy jednak zaznaczyć, że w celu wyizolowania toksyn pająka można stosować inne równoważne techniki w wyizolowanych toksynach oznacza się sekwencje aminokwasowe i aktywność owadobójczą znanymi sposobami.

C. Peptydy o działaniu owadobójczym

Sposobem według wynalazku wytwarza się peptyd owadobójczy, oczyszczony, izolowany jad z pająka Diguetia oraz akceptowane w rolnictwie i ogrodnictwie sole tego peptydu.

Po wyizolowaniu i oczyszczeniu w podany w opisie sposób działającej owadobójczo frakcji zawierającej peptyd, prowadzi się oznaczenie sekwencji aminokwasowej dowolnym znanym sposobem, takim jak sekwencjonowanie rozpoczynane od aminokwasu z końcową grupą aminową lub użycie automatycznego aparatu do sekwencjonowania aminokwasów.

Na podstawie niniejszego ujawnienia będzie zrozumiałe, że zakresem wynalazku mogą być objęte dodatkowe białka o działaniu owadobójczym. Oznacza to, iż przypuszcza się, że poza wyszczególnionymi w opisie trzema peptydami, z pająka Diguetia można jeszcze wyizolować inne peptydy o działaniu owadobójczym. Następujące dane odnoszą się do rodziny owadobójczych białek możliwych do wyizolowania z Diguetia. Członkowie tej rodziny owadobójczych peptydów wyizolowanych z Diguetia mają następujące wspólne cechy charakterystyczne:

1) wielkość: wszystkie posiadają wielkość od około 6200 do około 7200 daltonów i od około 55 do około 65 aminokwasów w łańcuchu;

2) zachowawczy (konserwatywny) koniec aminowy: sekwencje ID numery 1, 3 i 5 są identyczne jeśli chodzi o pierwsze pięć aminokwasów;

3) sekwencje ID numery 1, 3 i 5 wykazują stopień homologii powyżej 40%;

4) sekwencje ID numery 1, 3 i 5 posiadają około 7 do 8 reszt cysternowych;

5) skupiska genów: geny dla ponad jednej z tych toksyn są sekcjami genomowego DNA o wspólnej lokalizacji, co wskazuje, że geny te mogą pochodzić z jednego genu - przodka.

Konkretnie, wyizolowano i scharakteryzowano trzy peptydy owadobójcze. Wyizolowano więc peptyd pierwszy, DK 9.2., a jego sekwencję aminokwasową, oznaczono jako produkt translacji wyizolowanego cDNA. Jest ona przedstawiona jako sekwencja ID nr 1. Wyniki spektroskopii masowej wskazują na istnienie dwu izozymów zawierających konserwatywne podstawienie w pozycji 26. Jeden izozym zawiera w pozycji 26 treoninę, a drugi zawiera w pozycji 26 glutaminę. Izozym glutaminowy ma masę atomową większą o około 27 jednostek od izozymu treoninowego. W dalszej części opisu, oznaczenie DK 9.2 należy rozumieć jako jeden z izozymów lub obydwa. Ciężar cząsteczkowy DK 9.2 oznaczony metodą spektrometrii masowej wynosi około 6371-6397 daltonów; w chromatografii HPLC z odwróconymi fazami daje jeden pik.

Wyizolowany drugi peptyd, DK 11 scharakteryzowano ciężarem cząsteczkowym wynoszącym według oznaczenia metodą spektrometrii masowej około 6700 daltonów lub około 6740 daltonów i pojedynczym pikiem na chromatogramie HPLC z odwróconymi

168 222 fazami. Konkretnie, zidentyfikowano, że ta aktywna frakcja HPLC posiada sekwencję aminokwasową, określoną na podstawie wyizolowanego cDNA, przedstawioną jako sekwencja ID nr 3. W końcu, dotychczas scharakteryzowano trzeciego przedstawiciela tej rodziny białek owadobójczych; DK 12 posiada ciężar cząsteczkowy około 7100 daltonów albo 7080 daltonów według oznaczenia metodą spektrometrii masowej i wędruje jako pojedynczy pik w HPLC z odwróconymi fazami. Tymczasowo uznano, że frakcja ta ma sekwencję aminokwasową przedstawioną jako SEQ nr 5. Te trzy wyizolowane peptydy, odpowiadające sekwencjom SEQ ID nr 1, 3 i 5 wykazują w zasadzie taką samą aktywność owadobójczą. Przypuszcza się, że inne peptydy zawierające około 55 do 65 aminokwasów, powyżej 40 procentową homologię z sekwencjami ID nr 1,3 lub 5 i około 7 do 8 reszt cysteiny będą wykazywać taką samą aktywność owadobójczą. Takie peptydy mogą istnieć w stanie naturalnym albo mogą być wytwarzane metodami technologii rekombinacji DNA, znanymi specjalistom.

D. Identyfikacja sekwencji kodującej dla peptydów owadobójczych.

Wykorzystując opisane powyżej, częściowe dane o sekwencjach aminokwasowych można wyizolować i zidentyfikować geny odpowiedzialne za wytwarzanie białek izolowanych z tego pająka. Wiele metod jest dostępnych dla uzyskania genu odpowiedzialnego za wytwarzanie peptydu. Przykłady takie są zawarte w publikacji Fuqua’y i wsp.: A simple PCR method for detection and cloning low abundant transcript [(Prosta metoda CPR wykrywania i klonowania mniej licznych transkryptów). Biotechnique, tom 9, nr 2 (sierpień 1990)]; Frohman’a M.A., RACE: Rapid amplification of cDNA ends [(Rasa: Szybka amplifikacja końców cDNA), protokóły reakcji PCR, wyd. Innis i wsp., Academic Press, Dan Diego, CA (1990)] oraz w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki, nr 4 703 008 o tytule: DNA Sequences Encoding Erythropoietin (Sekwencje DNA kodujące erytropoetynę).

Najogólniej, syntetyzuje się cząsteczkę DNA, która koduje określoną sekwencję aminokwasową albo reprezentuje nić DnA komplementarną do tej cząsteczki DNA, kodującej tę określoną sekwencję aminokwasową. Taką syntetyczną cząsteczkę DNA można następnie użyć jako sondę do oznaczenia homologii sekwencji DNA w kolonach komórkowych zawierających rekombinantowe cząsteczki DNA zawierające w swej części, sekwencje DNA pochodzące z genomowego DNA organizmu, takiego jak pająk lub pochodzące z kopii cDNA cząsteczek mRNA wyizolowanych z komórek lub tkanek organizmu, takiego jak pająk. W zasadzie, do jednoznacznej identyfikacji homologicznego DNA wymagane są cząsteczki DNA o długości piętnastu (15) lub więcej nukleotydów. Ta liczba pozwala na jednoznaczne oznaczenie co najmniej pięciu (5) aminokwasów w sekwencji. Należy zaznaczyć, że ilość różnych cząsteczek DNA, które mogą kodować określoną sekwencję aminokwasową jest bardzo duża, gdyż każdy aminokwas może być kodowany przez do sześciu (6) unikalnych trójnukleotydowych sekwencji DNA lub kodonów.

Testowanie wszystkich możliwych sond DNA indywidualnie jest zatem niepraktyczne; stosuje się natomiast pule (zbiory) niektórych takich cząsteczek DNA. Wytwarzanie takich puli, nazywanych sondami zdegenerowanymi jest znane w technice. Należy również zaznaczyć, że podczas gdy tylko jedna cząsteczka DNA w mieszaninie stanowiącej sondę będzie wykazywała dokładną homologię sekwencji z oznaczonym genem to wiele syntetycznych cząsteczek DNA w puli może jednoznacznie identyfikować ten gen, gdyż wymagany jest tylko wysoki stopień homologii. Tak więc, można dokonać izolacji żądanego genu mając do dyspozycji pulę sond DNA, która to pula sond nie zawiera wszystkich możliwych sekwencji DNA. Na ogół, kodony, które niezbyt często są wykorzystywane przez dany organizm nie muszą być reprezentowane w puli sond. Faktycznie, sondę pojedynczej sekwencji DNA można wytworzyć tylko przez włączenie jedynie tych kodonów DNA dla danego aminokwasu, które są najczęściej używane przez organizm, jakkolwiek trzeba stwierdzić, że podejście to nie zawsze jest uwieńczone powodzeniem.

Jedną z technik identyfikacji sekwencji DNA jest enzymatyczna amplikacja in vitro, czyli tak zwana reakcja łańcuchowa z udziałem polimerazy (reakcja PCR). Jest ona ujawniona w opisach patentowych Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 683 195 i 4 683 202.

168 222

Zasadniczo, reakcja PCR pozwala na zsyntetyzowanie wybranej sekwencji DNA wówczas, gdy znane są dwie końcowe części tej sekwencji. Uzyskuje się primery lub sondy oligonukleotydowe, korespondujące w każdym końcem tej sekwencji. Przy stosowaniu reakcji PCR środkową część sekwencji DNA wytwarza się syntetycznie.

Jednym z takich sposobów postępowania z użyciem reakcji PCR do otrzymywania genu kodującego unikalny gen jadu pająka jest wyizolowanie i oczyszczenie RNA pająka. W celu dokonania odwrotnej transkrypcji tego RNA do cDNA stosuje się primer z ogonem dezoksytymidylanowym. Następnie przygotowuje się synteyczną cząsteczkę DNA lub mieszaninę syntetycznych cząsteczek DNA w formie opisanej powyżej zdegenerowanej sondy zawierających kod dla N-terminalnej sekwencji aminokwasowej białka jadu uprzednio oznaczonego. Tę mieszaninę DNA łącznie z oligonukleotydem z dołączonym ogonem dezoksytymidylanowym stosuje się do zapoczątkowania reakcji PCR. Ponieważ syntetyczna mieszanina DNA użyta do zapoczątkowania reakcji PCR jest specyficzna w stosunku do żądanej sekwencji mRNA to tylko żądany cDNA będzie ulegał amplifikacji. Wytworzony produkt jest zamplifikowanym cDNA, który można poddać ligacji z dowolnym znanym wektorem klonującym. Należy zaznaczyć, że w jadach pająków mogą występować rodziny peptydów o podobnych sekwencjach aminokwasowych i w takich przypadkach użycie mieszaniny sekwencji primerów oligonukleotydowych może dawać amplifikację jednego lub większej ilości pokrewnych cDNA kodujących te pokrewne peptydy. Geny kodujące pokrewne peptydy są również objęte zakresem wynalazku, gdyż peptydy te także posiadają również użyteczne właściwości owadobójcze.

W końcu, wytworzoną sekwencję cDNA klonuje się do odpowiedniego wektora stosując znane techniki, analizuje się ją i oznacza w niej sekwencję zasad nukleotydowych. Sekwencje DNA kodujące białka owadobójcze przedstawione są jako sekwencje ID nr 2 i ID nr 4. Bezpośrednia translacja uzyskanych produktów reakcji PCR do aminokwasów ujawnia, że odpowiada ona całkowitej sekwencji kodującej dla dojrzałego białka.

Poza cDNA kodującym dojrzałe białko DK 9.2, sklonowano i zsekwencjonowano sekwencję cDNA w górę od sekwencji kodującej DK 9.2. Jest to sekwencja ID nr 7. Translacja całkowitego mRNA dowiodła, że białko DK 9.2 jest syntetyzowane jako białko prekursorowe, posiadające peptyd sygnalny, propeptyd i dojrzałą toksynę. Przypuszcza się, że peptyd sygnalny ma ważne znaczenie dla procesu wydzielania zsyntetyzowanego polipeptydu. Sekwencja sygnalna pełni ważną rolę w zapewnieniu właściwej lokalizacji nowo zsyntetyzowanego białka. Generalnie, są to sygnały topogeniczne [Blobel G. Proc. Nat. Acad. Sci., USA, 77,1496-1500 (1980)], które kierują przyłączoną sekwencję białkową do różnych miejsc przeznaczenia w obrębie komórki lub poza komórką. Jest to szczególnie ważne dla białek wydzielanych, których miejsca przeznaczenia znajdują się poza komórką. Jest to również pomocne przy produkcji rekombinantowych białek, gdyż łatwiej jest oczyszczać białko wydzielane z płynów pozakomórkowych niż prowadzić lizę komórek i oczyszczenie z pełnego ekstraktu komórkowego. Przypuszcza się, że peptyd sygnalny kodowany przez cDNA kodujący białko prekursorowe DK 9.2 składa się z 17 aminokwasów o następującej sekwencji:

Met-Lys-V al-Ala-Ala-V al-Leu-Leu-Cys-Leu-Ser-Leu-Ala-Ala-V al-Tyr-Ala.

Poza peptydem sygnalnym, translacja sekwencji mRNA zlokalizowanej w górę od sekwencji kodującej DK 9.2 ujawniła propeptyd. Funkcja tego propeptydu jest nieznana. Składa się on z 21 aminokwasów o następującej sekwencji:

-Leu-Glu-Glu-Arg-Leu-Asp-Lys-Asp-Ala-Asp-Ile-Met-Leu-Asp-Ser-Pro-Ala-Asp -Met-Glu-Arg-.

Te peptydy prekursorowe lub prepro sekwencja mogą mieć duże znaczenie dla stabilności, ekspresji i pofałdowania białka DK 9.2 lub innych białek rekombinantowych podczas ekspresji in vitro i/lub in vitro. Zakłada się również, że te sekwencje lub ich części mogą się okazać użyteczne przy ekspresji innych cząsteczek, np. konstrukcji genowych. Dane potwierdzają, że do ekspresji rekombinantowego DK 9.2 mogą być użyteczne inne sekwencje sygnalane i/lub propeptydowe.

168 222

E. Ekspresja rekombinantowa

Rekombinantowy wektor ekspresyjny zawiera sekwencję DNA kodującą owadobójczy peptyd izolowany z jadu pająka Diguetia. Wektor ten umożliwia ekspresję sekwencji kodującej w transformowanych komórkach. Rekombinantowe komórki gospodarza transformowane lub poddane transfekcji sekwencją DNA kodują owadobójczy peptyd izolowany z jadu pająka Diguetia, w sposób pozwalający na ekspresję tego peptydu w komórce gospodarza.

Uzyskanie odpowiedniej sekwencji DNA kodującej żądane białko umożliwia wytwarzanie tego białka z zastosowaniem znanych technik rekombinacji. Sekwencję kodującą można otrzymać pozyskując sekwencję cDNA lub genomową z naturalnego źródła białka lub na drodze syntezy, stosując odpowiednią sekwencję aminokwasową określoną na podstawie sekwencji nukleotydowej genu. Jeśli kodujący DNA przygotowuje się syntetycznie, można wykorzystać znaną preferencję kodonów wybranego gospodarza.

Systemy ekspresyjne zawierające potrzebne sekwencje kontrolne, takie jak promotory i korzystnie wzmacniacze i sekwencje kontrolne zakańczania są znane i łatwo dostępne dla wielu rodzajów gospodarzy. Są one opisane np. przez Sambrook’a i wsp. w książce: Melecular Cloning a Laboratory Manual, II wyd., Cold Spring Harbor Press (1989).

Tak więc, żądane białka można wytwarzać zarówno w systemach prokariotycznych, jak i eukariotycznych, uzyskując w przypadku wielu białek cale spektrum przetwarzanych form.

Najpowszechniej stosowanym systemem prokariotycznym jest E.coli, jakkolwiek uważa się, że B. subtilis i Pseudomonas mogą być również użyteczne. Odpowiednimi sekwencjami kontrolnymi dla systemów prokariotycznych są promotory zarówno konstytutywne, jak i indukowane, w tym promotor lac, promotor trp, promotory hybrydowe takie, jak promotor tac, promotor faga lambda P1. Na ogół, w tych gospodarzach można wytwarzać obce białko albo w postaci białek fuzyjnych albo dojrzałych. Jeśli żądane sekwencje są wytwarzane jako dojrzałe białka to powstająca sekwencja może być poprzedzana metioniną, która nie zawsze jest efektywnie usuwana. Tak więc, peptydy i białka mogą być poprzedzane przez N-terminalną metioninę, jeśli są one wytwarzane w bakteriach. Ponadto, mogą być wytwarzane konstrukcje, w których sekwencja kodująca dany peptyd jest poprzedzana przez operacyjny peptyd sygnalny, w wyniku czego uzyskuje się sekrecję tego białka. W gospodarzach prokariotycznych ta sekwencja sygnalna jest usuwana podczas sekrecji.

Do wytwarzania rekombinantowych obcych białek stosuje się obecnie wiele różnych gospodarzy eukariotycznych. Tak, jak bakterie, organizmy gospodarzy eukariotycznych można transformować systemami ekspresyjnymi, które wytwarzają żądane białko bezpośrednio, ale częściej wprowadza się sekwencje sygnalne, co umożliwia sekrecję białek. Dodatkową zaletą stosowania systemów eukariotycznych jest to, że mają zdolność przetwarzania intronów, które mogą występować w sekwencjach genomowych kodujących białka organizmów wyższych. Systemy eukariotyczne uruchamiają również wiele mechanizmów przetwarzania, w wyniku których następuje glikozylacja, utlenianie lub derywatyzacja pewnych reszt aminokwasowych, regulacja konformacji i podobne procesy.

Do powszechnie stosowanych systemów eukariotycznych należą drożdże, komórki owadzie, komórki ssaków, komórki ptaków oraz komórki wyższych roślin. Lista ta nie jest wyczerpująca. Znane są odpowiednie promotory, zgodne i funkcjonujące w każdym z tych typów gospodarzy oraz sekwencje zakańczania i wzmacniania, jak np. promotor polihedryny z baculowirusa. Promotory mogą być również konstytutywne lub indukowane. Przykładowo, w systemach ssaków, promotor MTII można indukować dodaniem jonów metali ciężkich.

Szczegóły dotyczące konstruowania systemów ekspresyjnych odpowiednich dla żądanych gospodarzy są znane. W celu wytwarzania białka techniką rekombinacji, poddaje się ligacji DNA kodujące to białko z wybranym systemem ekspresyjnym i transformuje się nim zgodnego z tym systemem gospodarza, po czym prowadzi się hodowlę tego gospodarza, utrzymując go w warunkach, w których zachodzi ekspresja obecnego genu. Wytworzone sposobem według wynalazku owadobójcze białko odzyskuje się z hodowli albo przez lizę komórek albo z brzeczki hodowli, co jest znane w technice.

168 222

Rozumie się, że niewielkie modyfikacje w pierwszorzędowej sekwencji aminokwasowej mogą dawać białka o w zasadzie równoważnej lub wzmożonej aktywności w porównaniu do wymienionych w opisie peptydów. Modyfikacje te mogą występować w wyniku ukierunkowanej mutagenezy albo być przypadkowe, np. w wyniku mutacji zachodzących w gospodarzu wytwarzającym peptyd sposobem według wynalazku. Wszystkie te mutacje wytwarza się zgodnie z wynalazkiem, jak długo zachowana jest ich aktywność owadobójcza. Mutacja w białku zmienia jego strukturę pierwszorzędową (w stosunku do powszechnie występującego lub szczególnie opisanego białka) w wyniku zmian w sekwencji nukleotydowej DNA kodującego to białko. Mutacje te dotyczą zwłaszcza wariantów alleli. Zmiany mutacyjne w pierwszorzędowej strukturze białka są wynikiem delecji, addycji lub podstawień. Terminem delecja definiuje się brak jednej lub większej ilości wewnętrznych reszt aminokwasowych w polipeptydzie. Terminem addycja definiuje się obecność jednej lub większej ilości dodatkowych wewnętrznych reszt aminokwasowych w polipeptydzie w porównaniu z typem dzikim. Podstawienie jest wynikiem zastąpienia jednej lub kilku reszt aminokwasowych przez inne reszty. Fragmentem białkowym określa się polipeptyd składający się z pierwszorzędowej sekwencji aminokwasowej, która jest identyczna z częścią sekwencji pierwszorzędowej białka, z którym ten polipeptyd wykazuje podobieństwo.

Korzystne są 'podstawienia, konserwatywne, to znaczy takie, w którym jedna reszta jest zastąpiona inną resztą tego samego ogólnego typu. Aby to dobrze zrozumieć, aminokwasy występujące w stanie naturalnym można klasyfikować na kwaśne, zasadowe, obojętne lub polarne oraz niepolarne i/lub aromatyczne.

W zasadzie jest korzystne, jeśli peptydy różniące się od formy natywnej zawierają podstawienie kodowane przez kodony dla aminokwasów, które należą do tej samej grupy co zastępowany aminokwas.

Tak więc, zasadowe aminokwasy: Lys, Arg i His są wzajemnie wymienialne; kwaśne aminokwasy: Asp i Glu są wzajemnie wymienialne: obojętne polarne aminokwasy: Ser, Thr, Cys, Gin i Asn są wzajemnie wymienialne: niepolarne alifatyczne aminokwasy: Gly, Ala, Val, Ile i Leu są w stosunku do siebie konserwatywne (ale jeśli chodzi o wielkość, Gly jest bardziej spokrewniony z Ala natomiast Val, Ile i Leu są bardziej pokrewne w stosunku do siebie); oraz aromatyczne aminokwasy Phe, Trp i Tyr są wzajemnie wymienialne.

Ponieważ Pro jest aminokwasem niepolarnym i obojętnym, sprawia on kłopoty z powodu wpływu na konfromację; podstawienia przez lub zamiast Pro nie są korzystne, z wyjątkiem przypadków, kiedy uzyskuje się tę samą lub podobną konformację. Polarnymi aminokwasami reprezentującymi zmiany konserwatywne są Ser, Thr, Gln, Asn i w mniejszym stopniu Met. Ponadto, jakkolwiek klasyfikowane w różnych kategoriach, aminokwasy Ala, Gly i Ser wydają się być wzajemnie wymienialne a Cys dodatkowo pasuje do tej grupy albo może być klasyfikowana w grupie polarnych, obojętnych aminokwasów. Mogą być również użyteczne pewne podstawienia kodowane przez kodony dla aminokwasów z różnych klas.

Białka rekombinantowe wytwarza się technikami rekombinacji, jak również w automatycznych syntetyzerach aminokwasów. Ze względu na różnorodność procesów post-translacyjnych zachodzących w różnych komórkach gospodarzy uzyskuje się również różnorodne modyfikacje w stosunku do białek występujących w stanie naturalnym. Modyfikowane białko różni się od białka niemodyfikowanego; wynika to z procesów post-translacyjnych, które zmieniają modele glukozylacji, amidowania albo wiązania z lipidami lub też pierwszo- drugo- lub trzecio-rzędową strukturę białka. Wszystkie one wytwarza się sposobem według wynalazku.

Należy również zauważyć, że jeśli białka wytwarzane według wynalazku, takie jak sekwencja ID nr 1, wytwarza się syntetycznie, można wprowadzić podstawienie aminokwasem, który nie jest kodowany przez gen. Do takich alternatywnych reszt należą przykładowo w-aminokwasy o wzorze HzN(CH2)_nCOOH, gdzie n oznacza liczbę 2 do 6. Do takich obojętnych, niepolarnych aminokwasów zalicza się sarkozynę (Sar), tert-butyloalaninę (t-BuAla), tert-butyloglicynę (t-BuGly), N-metylo-izoleucynę (N-Melle) oraz norleucynę (NLeu). Przykładowo, fenyloglicynę można podstawić na miejsce aromatyczne obojętnego aminokwasu, np. Trp, Tyr albo Phe; cytrulina (Cit) i sulfotlenek metioniny (MSO) są polarne ale obojętne, cykloheksyloalanina (Cha) jest obojętna i niepolarna, kwas cysteino14

168 222 wy (cya) jest zasadowy. Właściwości konformacyjne reszt proliny można uzyskać, jeśli jedną lub więcej tych reszt zastąpi się hydroksyproliną (Hyp).

F. Transgeniczne rośliny

Transgeniczne rośliny zawierają sekwecją DNA kodującą owadobójczy peptyd wyizolowany z jadu pająka Diguetia wprowadzoną do linii zarodkowej rośliny w taki sposób, że cecha ekspresji tej sekwencji DNA jest dziedziczona w następnych pokoleniach tej rośliny pochodzących z rozmrażania wegetywnego lub płciowego.

Geny kodujące owadobójcze peptydy wprowadza się do rośliny technikami inżynierii genetycznej, oczekując że wytwarzanie tego peptydu w komórce roślinnej będzie skutecznym sposobem zwalczania owadów. Jest zatem możliwe wyhodowanie rośliny bardziej opornej na owady od odmian naturalnych.

Regionem kodującym genu dla owadobójczego peptydu stosowanym do transformacji rośliny może być gen o pełnej długości lub część aktywnej długości tego genu. Konieczne jest jednak, aby zachodziła ekspresja sekwencji genetycznej kodującej peptyd z wytworzeniem białka funkcyjnego w otrzymanej komórce roślinnej. Uważa się, że do transformacji może być zastosowany DNA uzyskany zarówno z DNA genomowego, j ak i cDNA oraz DNA syntetyczny kodujący owadobójczy peptyd. Ponadto, taki gen można konstruować częściowo z klonu cDNA, częściowo z klonu genomowego i częściowo z genu syntetycznego lub stosując różne powyższe kombinacje. W dodatku, DNA zawierający gen dla peptydu może zawierać części z różnych gatunków innych niż źródła wyizolowanego peptydu.

Sądzi się również, że ten owadobójczy peptyd można łączyć z innym związkiem lub związkami uzyskując nieoczekiwane właściwości transformowanej rośliny zawierającej geny chimerowe, wytwarzającej te związki. Do tych innych związków zalicza się inhibitory proteazy. np. te, które wykazują doustną toksyczność w stosunku do owadów lub polipeptydy z Bacillus thuringiensis. Białko B. thuringiensis powoduje zmiany w przenikalności potasu przez błonę komórkową jelita owada. Sądzi się, że generuje ono małe pory w tej błonie. W kombinacji z peptydami owadobójczymi można stosować inne białka tworzące pory. Przykładami takich białek tworzących pory są magaininy, cecropiny, attacyny, meiittiny, gramicydyna S, białka kanału potasowego i fragmenty syntetyczne, -toksyna ze Staphylococcus aureus, apolipoproteiny i ich fragmenty, alamethicin i wiele syntetycznych peptydów amfipatycznych. Inną klasą białek, które mogą być stosowane w kombinacji z peptydami owadobójczymi wytwarzanymi według wynalazku do genetycznej modyfikacji roślin w celu nadania im oporności na owady są lektyny, wiążące się z błonami komórkowymi i wzmagającymi endocytozę.

Sądzi się, że promotor genu peptydowego będzie użyteczny podczas ekspresji chimerowej sekwencji genetycznej, jednak inne promotory mogą być również użyteczne. Wydajnym promotorem roślinnym może się okazać promotor nadprodukcji. Ten promotor związany operacyjnie z sekwencją genetyczną dla peptydu powinien mieć zdolność wywoływania ekspresji tego peptydu, w wyniku czego transformowana roślina ma zwiększoną oporność na szkodniki owadzie. Roślinne promotory nadprodukcji, które mogą być użyteczne w wynalazku są znane.

W celu transformowania żądanej rośliny poddaje się ligacji chimerową sekwencję genetyczną zawierającą gen,dla owadobójczego białka operacyjnie związany z promotorem w odpowiednim wektorze klonującym. Na ogół, stosuje się wektory plazmidowe lub wirusowe (bakteriofagi) zawierające sekwencje replikacji i kontroli pochodzące z gatunków wykazujących zgodność z komórką gospodarza. Wektor klonujący będzie na ogół zawierał źródło replikacji oraz specyficzne geny będące fenotypowymi markerami selekcji w transformowanych komórkach gospodarza, na ogół, oporności na antybiotyki. Po transformacji komórki gospodarza te markery fenotypowe są podstawą selekcji transformowanych wektorów. Uważa się, że jako komórki gospodarza mogą być użyteczne organizmy prokariotyczne, w tym E. coli, Salmonella ryphimurium i Serratia marcescens oraz eukariotyczne, takie jak drożdże lub grzyby nitkowate.

Wektor klonujący i transformowaną wektorem komórkę gospodarza na ogół stosuje się do zwiększania liczby kopii tego wektora. Dysponując zwiększoną ilością kopii można

168 222 izolować wektory zawierające gen dla tego peptydu i np. stosować go do wprowadzenia opisanych powyżej sekwencji genetycznych do rośliny lub innych komórek gospodarza.

Znane są metody wytwarzania roślin, w których zachodzi ekspresja obcych genów. Przykładowo, można transformować tkankę roślinną przez bezpośrednią infekcję lub kohodowlę roślin, tkanki roślinnej lub komórek w Agrobacterium tumefaciens; bezpośrednie wprowadzenie egzogennego DNA do protoplastów'; inkubację z poliglikolem etylenowym; mikroiniekcję i bombardowanie mikropociskami.

Została potwierdzona możliwość transformacji tytoniu przez elektroporację [(Ag. Biotechnology News, tom 7, str. 3 i 17 (wrzesień/październik 1990)]. W tej technice protoplasty roślinne poddaje się elektroporacji w' obecności plazmidów zawierających konstrukcje genetyczne dla peptydu owadobójczego. Impulsy elektryczne o wysokiej mocy pola odwracalnie zwiększają przepuszczalności błon biologicznych pozwalając na wprowadzenie plazmidu. Prostoplasty roślinne po elektroporacji odbudowują ściany komórkowe, dzielą się i tworzą kallus roślinny. Selekcję transformowanych komórek roślinnych, w których zachodzi ekspresja owadobójczego peptydu prowadzi się na podstawie markerów fenotypowych w sposób opisany powyżej. Egzogenny DNA dodaje się do protoplastów w dowolnej formie, np. w formie DNA nagiego liniowego, kolistego lub w formie wtórnie zwiniętej, mikrokapsułkowanego w liposomach, w sferoplastach, w innych protoplastach roślinnych, w formie kompleksów z solami i podobnych postaci.

Wszystkie komórki roślinne, które można transformować za pomocą Agrobacterium i całe rośliny regenerowane z tych transformowanych komórek można również transformować, z wytworzeniem transformowanych pełnych roślin, zawierających przeniesiony gen dla owadobójczego peptydu. Raineri D.M. i wsp. potwierdzili transformację ryżu w publikacji: Agrobacterium-mediated transformation of rice (Oryza sativa 1.), [(Transformacja ryżu za pomocą Agrobacterium, Biotechnology, tom 8, str. 33-38 (styczeń 1990)].

Innym sposobem wprowadzenia genu owadobójczego peptydu do komórek roślinnych jest zakażenie komórki roślinnej przez A. tumefaciens transformowany genem dla owadobójczego peptydu. W odpowiednich warunkach znanych w technice prowadzi się wzrost transformowanych komórek roślinnych z utworzeniem się odrośli, korzeni i dalszego rozwoju do całych transformowanych roślin. Sekwencje genetyczne dla owadobójczego peptydu wprowadza się do odpowiednich komórek roślinnych, np. stosując plazmid Ti z A. tumefaciens, Plazmid Ti wnika do komórek roślinnych jednocześnie z infekcją przez A. tumefaciens i w trwały sposób integruje się z genomem roślinnym.

Plazmidy Ti zawierają dwa regiony, co do których istnieją przypuszczenia, że mają zasadnicze znaczenie dla powstawania transformowanych komórek. Jeden z nich, nazwany transferowym DNA (T DNA) wywołuje powstawanie nowotworu. Drugi, zwany regionem wirulencji ma znaczenie dla powstawania ale nie utrzymywania się nowotworu. Rozmiary regionu T DNA, który przenika do genomu roślinnego można zwiększyć przez insercję sekwencji genetycznej dla enzymu, nie naruszając jego zdolności do przenikania. Po usunięciu genów powodujących nowotwory tak, aby nie mogły szkodzić, można stosować taki modyfikowany plazmid Ti jako wektor do przenoszenia konstrukcji genowych do odpowiedniej komórki roślinnej. Materiał genetyczny można również przenosić do komórki roślinnej techniką z użyciem glikolu polietylenowego (PEG), tworzącego kompleks precypitacyjny z materiałem genetycznym, który jest pobierany przez roślinę.

Przeniesienia DNA do komórek roślinnych można również dokonać przez injekcję do wyizolowanych protoplastów, hodowlę komórek i tkanek i następną injekcję do tkanek merystematycznych (twórczych) sadzonek i roślin. Transgeniczne rośliny i rośliny potomne uzyskuje się w znany sposób.

Innym sposobem wprowadzania sekwencji obcego DNA do komórek roślinnych jest przyłączenie tego DNA do cząstek, które są następnie w sposób wymuszony wprowadzane do komórek roślinnych za pomocą przyrządów zwanych pistoletami genowymi. W tej procedurze prowadzonej in vitro lub in vivo, celem może być każda tkanka lub organ roślinny, w tym zarodki, stożki wzrostu i inne tkanki merystematyczne, pączki, tkanki somatyczne i płciowe. Po wykonaniu ustalonych procedur, transgeniczne komórki i kallus

168 222 poddaje się selekcji. Docelowe komórki pobudza się do wytwarzania somatycznych zarodków albo regeneruje się odroślą, prowadząc hodowlę transgenicznych roślin w znany sposób. Odpowiednią technikę dobiera się stosownie do gatunku rośliny. Transgeniczne rośliny kukurydzy otrzymywano przez wprowadzenie genów do komórek embriogenicznych wstrzykując mikro-pociski z dużą szybkością, co podano w publikacji: Inheritance and expression of chimeric genes in the progeny of transgenic maize plants [(Dziedziczenie i ekspresja genów chimerowych u potomstwa transgenicznych roślin kukurydzy), Biotechnology, tom 8, str. 833-838 (wrzesień 1990)].

Regenerowana roślina może być chimerowa w stosunku do wprowadzonego obcego DNA. Jeśli komórki zawierające ten obcy DNA rozwijają ssę w mikrospory bądź w makrospory, zintegrowany obcy DNA będzie przekazywany następnym pokoleniom pochodzącym z rozmnażania płciowego. Jeśli natomiast komórki zawierające ten obcy DNA są komórkami somatycznymi rośliny, wówczas powstają nie-chimerowe rośliny transgeniczne na drodze rozmnażania wegetatywnego (bezpłciowego), albo in vivo, z pączków lub z sadzonek łodyg albo in vitro, po wykonaniu znanych, ustalonych zabiegów. Rodzaj takich zabiegów dobiera się stosownie do rodzaju rośliny.

Po transformacji komórki roślinnej lub rośliny dokonuje się selekcji tych komórek lub roślin, w których zaszła transformacja z ekspresją peptydu w oparciu o odpowiedni marker fenotypowy. Do takich markerów fenotypowych należy między innymi marker oporności na antybiotyk. W wynalazku mogą być również stosowane inne markery fenotypowe znane w technice.

Dysponując wieloma różnymi systemami transformowania, w zasadzie wszystkie typy roślin można transformować w taki sposób, aby zachodziła w nich ekspresja owadobójczego peptydu.

Obecnie ciągle wzrasta ilość dowodów na to, że praktycznie wszystkie rośliny można regenerować z hodowli komórkowych lub tkankowych, nie wyłączając wszystkich większych gatunków zbożowych roślin uprawnych, trzciny cukrowej, buraka cukrowego, bawełny, drzew owocowych i innych drzew, roślin strączkowych i warzyw. Jednak wiedza o tym, czy wszystkie te rośliny dają się transformować przez Agrobacterium jest obecnie ograniczona. Gatunki będące naturalnymi gospodarzami roślinnymi dla Agrobacterium dają się transformować in vitro. Rośliny jednoliścienne a zwłaszcza zboża i trawy, nie są naturalnymi gospodarzami dla Agrobacterium. Dotychczas nie udało się ich transformować z użyciem Agrobacterium. Coraz więcej faktówwskazujejednakna to, że pewne roślinyjednoliścienne mogą być transformowane przez Agrobacterium. Stosując nowe techniki eksperymentalne, które obecnie stały się dostępne, można również transformować zboża i trawy.

Do innych rodzajów roślin, które dadzą się transformować przez Agrobacterium należą: Ipomoea, Passiflora, Cyclamen, Malus, Prunus, Rosa, Rubus, Populus, Santalion, Allium, Lilium, Nacissus, Ananas, Arachis, Phaseolus i Pisum.

Sposób regeneracji jest różny dla różnych gatunków roślin ale na ogół, na początku sporządza się zawiesinę transformowanych protoplastów zawierających wiele kopii genu dla peptydu owadobójczego. Tę zawiesinę protoplastów pobudza się do tworzenia zarodków i rozwoju do stadium dojrzewania i kiełkowania, tak jak zarodki naturalne. Podłoża hodowli będą na ogół zawierały różne aminokwasy i hormony. Pędy i korzenie normalnie rozwijają się jednocześnie. Wydajna regeneracja będzie zależeć od podłoża, od genotypu i od historii hodowli. Jeśli te trzy zmienne się kontroluje, wówczas regeneracja jest w pełni odtwarzalna i powtarzalna.

Dojrzałe rośliny, wyrosłe z transformowanych komórek samozapyla się wytwarzając rośliny wsobne. Takie rośliny wsobne dają nasiona zawierające gen dla owadobójczego peptydu. Po wysianiu tych nasion uzyskuje się rośliny, w których zachodzi ekspresja owadobójczego peptydu. Takie hodowle wsobne można stosować do np. hodowli hybryd odpornych na owady. W tym sposobie, oporną na owady linię wsobną krzyżuje się z inną linią wsobną wytwarzając rośliny hybrydowe.

W roślinach diploidalnych, w zasadzie jedna roślina rodzicielska może być transformowana sekwencją genetyczną dla owadobójczego peptydu (toksyny) a inna roślina rodzicielska

168 222 może być typem dzikim. Po skrzyżowaniu rodziców, w pierwszym pokoleniu hybrydowym (F1) wystąpi rozkład cech: 1/2 z genem toksyny/typ dziki: 1/2 z genem toksyny/typ dziki. To pierwsze pokolenie hybrydowe (F1) po hodowli wsobnej da drugie pokolenie hybrydowe (F 2). Rozkład cech genetycznych w pokoleniu (F2) będzie następujący: 1/4 z genem toksyny/ z genem toksyny: 1/2 z genem toksyny/ z genem toksyny: 1/4 typu dzikiego/typu dzikiego. Hybrydy F2 z cechą genetyczną: z genem toksyny/ z genem toksyny wybiera się jako rośliny oporne na owady.

Opisany powyżej wariant dotyczy zmian fenotypowych, które są trwałe i dziedziczne, łącznie z dziedziczeniem zmian, które są przenoszone drogą rozmnażania płciowego na rośliny potomne, pod warunkiem, że w roślinach tych ciągle zachodzi ekspresja owadobójczego peptydu. Stosowany w opisie termin mutant, dotyczy zmian wynikaj ących z warunków środowiska, takich jak promieniowanie lub będących wynikiem zmian genetycznych, w których dana cecha jest przenoszona drogą mejozy według ustalonych praw dziedziczenia. W takim mutancie roślinnym musi jednak ciągle zachodzić ekspresja peptydu.

W zasadzie, idealne owadobójcze białko wybrane jako to, które ma być wytwarzane w transgenicznych roślinach, powinno się charakteryzować bezpieczeństwem w stosunku do owadów nie będących celem zwalczania oraz kręgowców. Systemy ekspresy'ne powinny być tak dobrane, aby poziom ekspresji zapewniał skuteczność owadobójczą. Sądzi się, że techniczna wykonalność uzyskania takich transgenicznych roślin o dużym znaczeniu w rolnictwie da rolnikom dodatkową broń do stosowania w całym systemie walki ze szkodnikami przyczyniając się do zmniejszenia zniszczenia roślin uprawnych przez owady w sposób nie przynoszący szkody dla środowiska.

G. Zastosowanie peptydów jako środków owadobójczych

Uznaje się, że owadobójcze peptydy wytwarzane sposobem według wynalazku będą użyteczne w zwalczaniu bezkręgowców szkodników, takich jak motyle przy kontaktowaniu tych szkodników ze skuteczną ilością otrzymanego peptydu. Korzystnymi szkodnikami są tu owady.

Sposoby kontaktowania szkodników bezkręgowych z peptydem w celu ich zwalczania są znane. Przykłady takich sposobów obejmują syntetyczne zmikrokapsułkowanie tego białka i podanie owadowi drogą pokarmową. Rekombinantowe organizmy gospodarza, wytwarzające białka, takie jak Pseudomonas fluorescens zabija się w wysokiej temperaturze i stosuje na owady z przeznaczeniem do spożycia przez owada i zniszczenia go.

Sposoby niszczenia szkodników bezkręgowych z użyciem białek można stosować w połączeniu z innymi metodami zwalczania tych szkodników. Przykładowo, można transformować transgeniczne rośliny i E. coli w taki sposób aby wytwarzały inne toksyny działające na szkodniki bezkręgowe, zależnie od typu zwalczalnych szkodników i innych istotnych zmiennych.

H. Przeciwciała przeciw owadobójczym peptydom

Istnieją przeciwciała przeciw owadobójczym peptydom. W immunologii znane są różne metody wykrywania i oczyszczania peptydów reagujących z przeciwciałami.

Określa się, że przeciwciało ma zdolność wiązania cząsteczki, jeśli swoiście reaguje z tą cząsteczką wiążąc się z nią. Termin epitop oznacza tę część antygenu peptydowego, która jest rozpoznawana i wiązana przez przeciwciało. Antygen może posiadać jeden lub więcej epitopów. Antygen ma zdolność pobudzania zwierzęcia do wytwarzania przeciwciał zdolnych do wiązania się z epitopem tego antygenu. Termin reakcja swoista oznacza, że antygen wchodzi w reakcję immunologiczną, w sposób wysoce selektywny, z odpowiednim dla niego przeciwciałem, ale nie z wieloma innymi przeciwciałami, wywoływanymi przez inne antygeny.

Stosowany w opisie termin przeciwciało (Ab) lub przeciwciało monoklonalne (Mab) obejmuje całe cząsteczki oraz jej fragmenty (takie jak np. fragmenty Fab i F(ab ’)2 zdolne do wiązania antygenu. Fragmenty FAb i F(ab’)2 nie zawierają fragmentu Fc całkowitego przeciwciała, są szybciej usuwane z krążenia i mogą się charakteryzować słabszym nie-specyficznym wiązaniem tkankowym niż przeciwciało owadzie.

168 222

Przeciwciała można wytwarzać różnymi sposobami. Sposoby uzyskiwania takich przeciwciał są znane i szeroko opisane w literaturze. [Np. Sambrook i wsp., Molecular Cloning; a laboratory manual (Klonowanie molekularne, podręcznik laboratoryjny, II wyd., Cold Spring Harbor Press, tom 3,18,1989)]. Przykładowo, komórki wytwarzające owadobójczy peptyd lub jego fragment można podawać zwierzęciu w celu indukowania wytwarzania surowicy zawierającej poliklonalne przeciwciała zdolne do wiązania tego owadobójczego peptydu. Na ogół, wytwarza się taki fragment owadobójczego peptydu i oczyszcza się go, doprowadzając go do stanu w zasadzie wolnego od naturalnych zanieczyszczeń lub też, sposobami znanymi w technice syntetyzuje się taki fragment owadobójczego peptydu. Zarówno oczyszczony, jak i syntetyczny fragment albo kombinację oczyszczonych naturalnych fragmentów i/lub syntetycznego fragmentu wprowadza się do organizmu zwierzęcia pobudzając w ten sposób wytwarzanie poliklonalnej anty-surowicy o większej aktywności swoistej.

Przeciwciała monoklonalne można wytwarzać stosując znaną technologię hybrydów nowotworowych (hybridoma), w zasadzie procedury te polegają na immunizacji zwierzęcia antygenem owadobójczego peptydu. Limfocyty śledziony (splenocyty) takich zwierząt poddaje się następnie ekstrakcji i fuzji z odpowiednią linią komórkową szpiczaka. W wynalazku można stosować dowolną odpowiednią linię komórek szpiczaka. Po fuzji, mieszańcowe komórki nowotworu utrzymuje się na odpowiedniej pożywce selektywnej, po czym klonuje się metodą ograniczonych rozcieńczeń. Uzyskane w wyniku takiej selekcji komórki hybridoma analizuje się, identyfikując klony wytwarzające przeciwciała zdolne do wiązania antygenu owadobójczego peptydu.

Jeśli źródło peptydu jest zanieczyszczone, wówczas tylko niektóre komórki hybridoma będą wytwarzały przeciwciała zdolne do wiązania się z tym peptydem (inne komórki hybridoma będą wytwarzać przeciwciało wiążące się z zanieczyszczeniami tego preparatu peptydowego). Tak więc, może się okazać niezbędny skrining komórek hybridoma zdolnych do wytwarzania przeciwciał wiążących się z tym peptydem. Taki skrining prowadzi się korzystnie przez inkubację próbki peptydu (lub jadu) wobec przeciwciała monoklonalnego wytwarzanego z każdej grupy komórek hybridoma i identyfikację każdej komórki hybridoma indukującej powstawanie przeciwciała zdolnego do neutralizacji lub osłabienia zdolności jadu do porażenia owada. Po zidentyfikowaniu takiej komórki hybridomalnej można ją namnażać przez klonowanie w znany sposób w celu wytworzenia swoistych w stosunku do peptydu przeciwciał monoklonalnych.

Dla oczyszczenia naturalnej lub rekombinantowej toksyny owadobójczej techniką chromatografii powinowactwa z przeciwciałem należy zastosować przeciwciało wiążące się z tym owadobójczym peptydem. Na ogół, takim przeciwciałem będzie przeciwciało monoklonalne. Po uzyskaniu przeciwciała monoklonalnego swoistego dla peptydu, można go immobilizować wiążąc go ze stałym nośnikiem i stosować do oczyszczania peptydu z naturalnego jadu albo z innych źródeł, metodą chromatografii powinowactwa, stosując sposoby znane w technice. Sposoby te zapewniają wysoki stopień oczyszczenia i otrzymanie peptydu w zasadzie wolnego od zanieczyszczeń naturalnych. W opisie peptyd określa się jako w zasadzie wolny do naturalnych zanieczyszczeń, jeśli występuje on w formie nie zawierającej związków, z którymi w stanie naturalnym jest normalnie związany (to znaczy, z innymi białkami, lipidami, węglowodanami i podobnymi związkami).

Po oczyszczeniu peptydu stosuje się go do immunizacji zwierzęcia (np. myszy lub królika) w celu wywołania wytwarzania przeciwciała poliklonalnego swoistego dla tego peptydu.

Sondy DNA o odpowiednich rozmiarach, na ogół od 10 do 50 nukleotydów, mogą pochodzić z sekwencji DNA kodujących owadobójczy peptyd w zasadzie izolowany z jadu pająka Diguetia. Takie sondy stosuje się do wykrywania obecności DNA kodującego owadobójczy peptyd w zasadzie izolowany z jadu pająka Diguetia przez kontaktowanie jadu z sondą DNA i wykrycie sondy skoniugowanej z tym DNA w znany sposób.

168 222

I. Przetworzone techniką inżynierii genetycznej mikroorganizmy owadobójcze.

Przypuszcza się, że owadobójczy peptyd, sam albo w połączeniu z inną toksyną owadzią, będzie użyteczny w potęgowaniu lub wzmaganiu toksyczności mikroorganizmów, takich jak baculowirusy i bakterie hybrydowe.

Wiele baculowirusów, w tym takich, które zakażają Heliothis virescens (motyla tytoniowego), Orgyia pseudotsugata (znamionówkę terniówkę), Lymantia dispar (brudnicę nieparkę), Autographa califomica (motyla lucerny), Neodiprion sertifer (muchę sosnową) i Lanspcyresia pomonella (owocówkę jabłkówkę) zostało zarejestrowanych w niektórych krajach i są stosowane jako pestycydy. Sądzi się, że wprowadzenie co najmniej jednej toksyny selektywnie działającej na owady do genomu baculowirusa znacznie zwiększy siłę działania tych pestycydów.

Zakłada się, że rekombinantowym wektorem ekspresyjnym szczególnie użytecznym w sposobie według wynalazku będzie wektor ekspresyjny baculowirusa, typu ujawnionego w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 879 236. Jest on również opisany przez CarbonelPa i wsp. w publikacji Synthesis of gene coding for an insect-specific scorpion neurotoxin and attemts to express it using baculovirus vectors, Gene, 73:409-418 (1988). Wektor ten może być użyteczny w systemie, w którym sekwencję DNA kodującą owadobójczy peptyd w zasadzie izolowany z jadu pająka Diguetia klonuje się do baculowirusa, takiego jak wektor ekspresyjny Aytographa califomica (AcMNPV) opisany w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 879 236 oraz przez Miller’a i wsp. w Science 219, 715-721 (1983). Ten rekombinantowy wirusowy wektor ekspresyjny mógłby być następnie stosowany na roślinę lub zwierzę, w stosunku do którego dany owad jest szkodnikiem. Kiedy wirus dostanie się do przewodu pokarmowego owada, atakuje komórki ścianyjelitowej i rozpoczyna replikację. Podczas replikacji będzie zachodziła ekspresja genu dla owadobójczego białka, co wywoła unieruchomienie lub śmierć owada w czasie krótszym, niż w przypadku spożycia przez owada wirusa typu dzikiego AcMNPV.

W opisie europejskiego zgłoszenia patentowego nr 0 340 948 znajduje się wiadomość o wirusie hybrydowym, który może się okazać użyteczny. Przypuszcza się, że ten wirus hybrydowy, w którym zachodzi ekspresja DNA może być wirusem o zmienionym zakresie gospodarzy owadzich. Przykładowo, mogła by w nim zachodzić ekspresja białek fuzyjnych w postaci pojedynczego polipeptydowego produktu genu hybrydowego zawierającego DNA według wynalazku oraz specyficznego białka rozpoznającego komórki przewodu pokarmowego owada, kierującego wytwarzany owadobójczy peptyd do określonego miejsca w organizmie owada jako gospodarza.

Sposobem ujawnionym w europejskim opisie nr 0 325 400 można transformować różne mikroorganizmy prokariotyczne i eukariotyczne, uzyskując ekspresję hybrydowego genu toksyny, kodującego owadobójcze białko.

Sądzi się, że w sposobie według wynalazku będą użyteczne hybrydowe komórki bakteryjne zawierające plazmid z genem kodującym owadobójcze białko. Owady mogłyby być zwalczane przez podanie tych hybrydów na owady. Jest to tematem opisu patentowego Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 797 279.

Jeszcze inne przykłady zastosowania baculowirusa, które mogłyby być użyte w sposobie według wynalazku podają: Tomalski i wsp. w pracy: Insect paralysis by baculovirus-mediated expression of a mite neurotoxin gene [(Porażenie owadów w wyniku ekspresji genu neurotoksyny stawonogów za pośrednictwem baculowirusa), Nature, 352: 82-85 (1991)], Stewart i wsp. w publikacji: Construction of an improved baculovirus insecticide containing an insect - specific toxin gene [Konstruowanie ulepszonego baculovirusa jako środka owadobójczego zawierającego gen toksyny specyficznej w stosunku do owadów, Nature, 352: 85-88 (1991)] i McCutchen i wsp. w pracy: Development of a recombinant Baculovirus expressing an insect selective Neurotoxin: Potential for Pest Control [(Badania nad rekombinantowym baculowirusem, w którym zachodzi ekspresja neurotoksyny działającej selektywnie na owady: Możliwości zwalczania owadów), Biotechnology, 9, 848-851 (1991)].

168 222

J. Hybrydyzacja krzyżowa: Sekwencje DNA jako sondy dla pokrewnych związków

Sondy DNA o odpowiedniej wielkości mogą pochodzić z sekwencji DNA. Sondy te stosuje się do wykrywania obecności kwasu nukleinowego kodującego owadobójczy peptyd metodą hybrydyzacji z kwasami nukleinowymi z innych źródeł. Skrining za pomocą sond oligonukleotydowych kodujących sekwencję sygnalną, fragmenty cDNA lub nawet cały cDNA w warunkach obniżonej mocy pozwala na dotarcie do innych aktywnych peptydów wykazujących homologię funkcjonalną z opisaną tu rodziną toksycznych cząsteczek. Źródła kwasów nukleoinowych, mogących być dobrymi kandydatami do hybrydyzacji krzyżowej z sondami oligonukleotydowymi preparowanymi z sekwencji DNA mogłyby obejmować pająki należące do tego samego rodzaju ale do innych gatunków, pająki należące do pokrewnych rodzajów oraz pająki należące do tego samego rodzaju, ale żyjących w różnych rejonach.

K. Identyfikacja sekwencji promotora

Sekwencja promotora kieruje syntezą DK 9.2 w pająku jest ważna. Organizację genu dla DK 9.2 badano za pomocą skriningu banku genomowego z cDNA dla dojrzałej toksyny jako sondy. Analiza genomowego DNA w górę od początku transkrypcji (przypuszcza się, że jest to koniec 5’tego cDNA) rzeczywiście wskazuje na obecność przypuszczalnego promotora. Sekwencja DNA dla 421 par zasad regionu promotora jest przedstawiona na sekwencji ID nr 8. Ten przypuszczalny promotor zawiera wiele ważnych sygnałów kontroli, które występują na ogół w regionie usytuowanym bezpośrednio w górę od miejsca startu translacji (przeglądu promotorowych sygnałów kontrolnych dokonali McKnight i wsp.: Transcriptional Control Signals of an Eucariotic Protein-Coding Gene [(Sygnały kontroli transkrypcji eukariotycznego genu kodującego białka), Science, 217, 315 (1982)]. Kanoniczna sekwencja TATA pojawia się w pozycji -30 od proponowanego miejsca startu transkrypcji i uważa się, że ma ona istotne znaczenie dla kontroli punktu startu dla syntezy RNA. Dalej w górę znajdują się dwie dystalne sekwencje palindromiczne, z których jedna zawiera zgodną sekwencję CAAT, której sądzi się, że pełni ważną rolę przy wiązaniu enzymu RNA polimerazy II. Przyjmuje się, że ten promotor albo regiony tego promotora znajdą zastosowanie do transkrypcji i ekspresji różnych genów w komórkach roślinnych, zwierzęcych lub bakteryjnych, np. w konstrukcjach rekombinantowych.

Przykłady

Dla ilustracji szczegółów wynalazku podaje się następujące przykłady.

Materiały i metody

Pająki uzyskano z firmy Spider Pharm. Inc. of Black Canyon City, AZ, która również dokonała identyfikacji gatunku. Pająki Diguetia canities dojono elektrycznie ściągając jad sposobem, w którym stosuje się zabezpieczenie przed zanieczyszczeniem jadu przez zawracające ciecze lub hemolimfę.

Oczyszczenie toksyny - surowy jad (przechowywany w temperaturze -80°C) rozmraża się, dokładnie miesza i przed chromatografią rozpuszcza w 0,1% kwasie trójfluorooctowym (TFA). Surowy jad frakcjonuje się metodą chromatografii cieczowej z odwróconymi fazami (RPCL), wprowadzając rozpuszczalnik Beckman System Gold 126 i moduły detektorowe z układem fotodiod 168. Jako odczynnik jonowo-kompleksujący stosuje się acetonitryl lub izopropanol w połączeniach z TFA. Do procesów oczyszczania stosuje się następujące kolumnami ochronnymi o tej samej matrycy: kolumna Dynamax 300 A RP C18 o wymiarach 25 cm x 4,6 mm średnicy wewnętrznej z wypełnieniem o wielkości cząstek 12 μ m; kolumna analityczna Vydac 300 A Cis o wymiarach 25 cm x 4,6 mm średnicy wewnętrznej i o wielkości cząstek 5 μm oraz kolumna pół-preparatywna Vydac A C18 o wymiarach 25 cm x 10 mm średnicy wewnętrznej i o wielkości cząstek 5 μm. Detekcji pików dokonuje się przez monitrowanie przy 220 nm i zbieranie frakcji z zastosowaniem kolektora do mikrofrakcji GILSON 208. Po frakcjonowaniu, wszystkie frakcje liofilizuje się do suchej pozostałości i przechowuje się w temperaturze -80°C. Spektroskopia masowa z bombardującą wiązką elektronów (FAB-MS)

168 222

Widma masowe oznaczano na uniwersytecie w Illinois w spektrometrze masowym VG ZAB-SE w warunkach standardowych dla spektrometrii masowej FAB (ksenon, zdolność rozdzielcza 1000, napięcie przyspieszenia 8 kV, temperatura źródła 40°C). Próbki (około 1 μ g) analizowano w 4 μ tioglicerolu z dodatkiem 25% wodnego roztworu kwasu trójfluorooctowego (TFA; 1,0%).

Przykład I. Wstępne frakcjonowanie i identyfikacja frakcji zawierających owadobójczy peptyd z pełnego jadu Diguetia canties

Ilość 25 μ 1 liofilizowanego pełnego jadu uzyskanego z Diguetia canities w sposób podany uprzednio rozpuszcza się w 0,1% kwasie trójfluorooctowym (TFA) i poddaje frakcjonowaniu metodą chromatografii cieczowej z odwróconymi fazami na półpreparatywnej kolumnie Vydac RP C18, prowadząc eluowanie z szybkością 3,5 ml/minutę. Stosuje się liniowy gradient eluantu, zaczynając od mieszaniny (85:15) wodnego 0,1% roztworu TFA:50% acetonitrylu, 0,1% TFA a kończąc na mieszaninie (50:50) po 180 minutach.

Frakcja	Czas retencji (średni, minuty)
1	3,2
4	29,6
6	48,2
8	57,1
9	62,8
10	66,4
11	68,7
12	71,4
13	77,1
16	126,1
17	131,4

Każdą frakcję zatęża się najpierw przez liofili:zację z eluantu a następnie przez liofilizację z wody. Pozostałości przechowuje się w temperaturze -80°C. Do oceny na działanie owadobójcze, każdą frakcję rozpuszcza się w 25 ml buforowanego roztworu soli fizjologicznej. Aktywność owadobójczą frakcji oznacza się w próbach na motylu tytoniowym (Heliothis virescens; TBW) (Tabela I).

Larwom TBW w ilości pięć larw na każdą frakcję podaje się przez injekcję 3 μm testowanego roztworu stosując strzykawkę Hamilton’a o pojemności 50 μ! z igłą o grubości oznaczonej numerem 33 i urządzenie do powtarzalnego mikrodozowania PB 600. Injekcje podaje się przez wprowadzenie igły do bocznośrodkowej części odwłoka, w pobliżu odnóży, w zagięcia aby uniknąć uszkodzenia narządów wewnętrznych. Po injekcji, każdego owada umieszcza się w oddzielnym pojemniku zawierającym sztuczny pokarm. Obserwacje prowadzi się periodycznie; porażenie mierzy się po 24 godzinach od iniekcjiDo wyliczania dawek bierze się średnią masę ciała larwy motyla tytoniowego równą 0,3 g. Grupie owadów kontrolnych wstrzykuje się tylko buforowany roztwór soli.

Porażenie rozwija się stopniowo i jest poprzedzone okresem nasilonych skurczy mięśniowych. W ciężkich przypadkach te skurcze zaczynają się w czasie 15-30 minut od iniekcji i stopniowo się nasilają aż do całkowitej niezdatności larw. Drżenie czasami utrzymuje się przez czas dłuższy od 48 godzin od iniekcji. Zdarza się to od czasu do czasu, nawet przy poddaniu dawki sub-letalnej, że larwy ostatecznie powracają do normy. Nasilenie drżenia jest najbardziej rzetelnym wskaźnikiem toksyczności; larwy doprowadzone do stanu całkowitego porażenia i/lub skurczu ciała nie powracają do normy.

168 222

Tabela 1

Toksyczność frakcji z chromatografii cieczowej z odwróconymi fazami (RPLC) pełnego jadu Diguetia canities na larwy TBW (7,5 jednostek WVE/g owada)

Frakcja	Początkowe porażenie (%)	Porażenie po 24 godz. (%)*
1	0	0
4	0	0
6	0	0
8	100	100
9	100	100
10	100	100
11	100	100
12	100	100
13	0	0
16	0	0
17	0	0
kontrola	0	0

* Terminem porażenie definiuje się niezdolność owada do odwrócenia się, jeśli jest przewrócony na bok lub na plecy.

* Jednostka WVE (równoważnik pełnego jadu) jest to ilość toksyny, która w normalnych warunkach jest obecna w jednym mikrolitrze pełnego, ściągniętego od pająka jadu; 5 jednostek WVE z frakcji 25 μΐ oznacza 20% odzyskanej ilości.

Przykład II. Oczyszczenie frakcji 9 z jadu Diguetia canities

Główne składniki aktywnej w stosunku do larw motyla tytoniowego frakcji 9 oczyszcza się do homogeniczności (dla każdego jedno widoczne pasmo w elektroforezie SDS-PAGE w zakresie ciężarów cząsteczkowych około 6500 daltonów) przez jedną dodatkową chromatografię na kolumnie Vydac RP C18 o wymiarach 25 cm x 10 mm średnicy wewnętrznej stosując liniowy (1,0% minutę) gradient rozpuszczalników: izopropanol /0,1% TFA przy szybkości 3,5 ml/minutę; monitrowanie prowadzi się przy długości fali 220 nm.

Detekcję pików i zbieranie frakcji prowadzi się, jak w przykładzie I. Zbiera się dwie frakcje: pierwszą schodzącą w 21,81 minucie (frakcja 9,1) i drugą, schodzącą w 22,39 minucie (frakcja 9.2).

Frakcje 9,1 i 9,2 zatęża się przez liofilizację z eluatu a następnie przez liofilizację z wody, otrzymując odpowiednio pozostałości 9,1 i 9,2. Oznaczona czystość liofilizowanych frakcji jest równa lub wyższa od 99%. Oznaczono, że frakcja 9,2 uzyskana z 25 μΐ pełnego jadu zawiera około 6 fig czystego białka. Pozostałość 9,2 oznacza się na aktywność owadobójczą wobec motyla tytoniowego w sposób opisany w przykładzie I przez podanie każdemu z pięciu owadów injekcji po 6,3 μg pozostałości w buforowanym roztworze soli i pięciu owadom kontrolnym jedynie buforowanego roztworu soli. Owady ocenia się po 24 i po 48 godzinach. Przy odczycie po 24 godzinach wszystkie owady traktowane roztworem pozostałości 9,2 są porażone i następnie giną podczas gdy owady kontrolne są normalne. Nie stwierdza się żadnych zmian po 48 godzinach.

Analiza tego polipeptydu metodą spektroskopii masowej z bombardującą wiązką elektronów wykazuje ciężar cząsteczkowy równy 6371 ± 2. Metodą analizy N-terminalnej sekwencji aminokwasowej ustalono częściową sekwencję aminokwasową dla pozostałości

9,2 przedstawioną na sekwencji ID nr 1, aminokwasy 1-33.

LD 50 frakcji 9,2 toksyny Diguetia wobec H.Virescens (larwy motyla tytoniowego) wynosi około 1,0 nmola/g. Objawy są podobne do tych, jakie obserwuje się przy podaniu pełnego jadu opisanych w przykładzie I.

Przykład III. Oczyszczenie frakcji 11 jadu z Diguetia canities

Postępując w sposób podobny do opisanego w przykładzie II, frakcję 11 wyizolowaną z pełnego jadu Diguetia canities, jak w przykładzie I. Oczyszcza się dalej metodą chroma168 222 tografii cieczowej z odwróconymi fazami, uzyskując jedną frakcję. Frakcję tę zatęża się przez liofilizację z eluantu a następnie przez liofilizację z wody. Pozostałość oznaczoną numerem 11 testuje się aktywność owadobójczą wobec motyla tytoniowego przy stężeniu 5,0 jednostek WVE/g, jak podano w przykładzie II. Po 24 godzinach u 80% owadów traktowanych pozostałością 11 obserwuje się porażenie a po 48 godzinach porażenie występuje u 60% owadów traktowanych tym peptydem. Owady kontrolne pozostają normalne. Analiza tego polipeptydu metodą spektroskopii masowej z bombardowaniem wiązką elektronów daje ciężar cząsteczkowy równy 6740 ± 2. Metodą analizy N-terminalnej sekwencji aminokwasowej ustalono częściową sekwencję aminokwasową dla pozostałości przedstawioną na sekwencji ID nr 3, aminokwasy 1-29.

Przykład IV. Oczyszczanie frakcji 12 z jadu Diguetia canities

Postępując w sposób podobny do opisanego w przykładzie II, frakcję 12 wyizolowaną z pełnego jadu Diguetia canities jak w przykładzie I, oczyszcza się dalej metodą chromatografii cieczowej z odwróconymi fazami, uzyskując jedną frakcję. Frakcję tę zatęża się przez liofilizację z eluantu a następnie przez liofilizację z wody. Pozostałość oznaczoną numerem testuje się na aktywność owadobójczą wobec motyla tytoniowego jak w przykładzie II. Po 24 godzinach u 100% owadów traktowanych pozostałością 12 obserwuje się porażenie, a po 48 godzinach porażenie utrzymuje się u 80% owadów traktowanych tą pozostałością. Owady kontrolne pozostają normalne.

Analiza tego polipeptydu metodą spektroskopii masowej zbombardowaniem wiązką elektronów wykazuje ciężar cząsteczkowy równy 7080 ± 2. Metodą analizy N-terminalnej sekwencji aminokwasowej ustalono próbną częściową sekwencję aminokwasową dla pozostałości 12 przedstawioną na sekwencji ID nr 5.

Ograniczona ilość materii nie pozwoliła na dokładne oznaczenie toksyczności; w rezultacie pozostałość 9,2 testowano w dawkach (nmoli/g) o 39% wyższych niż odpowiednio pozostałość 11 i 12. Dawki dobierano tak, aby zawierały zakres od minimalnej dawki letalnej do dawki nie wywierającej żadnego działania, ale nie w każdym przypadku to osiągnięto. Uzyskane wyniki wskazują Jednak, że badane peptydy wykazują podobną toksyczność. Pozostałość 9,2 wydaje się mieć nieco silniejsze działanie niż pozostałe, ale różnica jest prawdopodobnie mniejsza od wskaźnika 3. Minimalna dawka letalna (100%) dla tych peptydów (pozostałości 9,2, 11 i 12) wynosi od 3,0 do 5,0 nmoli/g. Jest to korzystne porównanie z dostępnymi w handlu środkami owadobójczymi; przykładowo, miejscowa dawka LD 50 (SAW) teflubenzuronu wynosi 1,0 nmol/g.

Przykład V. Izolacja genów kodujących dla reszt 9,2 i 11 z jadu Diguetia canities

Etap nr 1: Izolowanie RNA

Pająki zbiera się ze źródeł zewnętrznych i identyfikuje jako Diguetia canities. Żywe pająki zamraża się, preparuje się głowotułów i przechowuje go w ciekłym azocie. Następnie prowadzi się ekstrakcję RNA z tych głowotułowiów według przepisu podanego przez Chomczyńskiego i Sacchi’ego w Analitical Biolochemistry, 162,156 (1987). Poliadenylowany informacyjny RNA (mRNA) oczyszcza się chromatograficznie na oligo d(T) celulozie (Pharmacia LKB, Szwecja).

Etap nr 2: Synteza cDNA

Informacyjny RNA podaje się odwrotnej transkrypcji do cDNA stosując odwrotną transkryptazę wirusa białaczaki mysiej dostarczoną z Bethesda Research Laboratories, MD, postępując według wskazań producenta. Ilość 20 μΐ mieszaniny reakcyjnej zawiera bufor enzymu dostarczony w zestawie do syntezy cDNA (Boehringer Mannheim, IN), 50 ng mRNA, 2 jednostki RNazy H, 30 ng primera d(T)Not z firmy Promega, Madison, WI, po 1 nM każdego z trójfosforanów dezoksynukleozydów i 100 xm odwrotnej transkryptazy. Mieszaninę reakcyjną inkubuje się przez godzinę w temperaturze 37°C a następnie przez 10 minut w temperaturze 42°C. Następnie mieszaninę tę strąca się etanolem i zawiesza w 20 μΐ wody.

Etap nr 3: Synteza primera

Mieszaninę zdegenerowanej sekwencji DNA primera, mogącą zawierać kod dla reszt aminokwasowych i do 8 według, sekwencji ID nr 1 przygotowuje się wykorzystując prefe24

168 222 rencję kodonów Drosophila w celu zmniejszenia degenracji. Primer ten zsyntetyzowano na Uniwersytecie w Utach, będącym jednostką podległą Howard Hygnes Medical Institute.

Etap nr 4: Amplifikacja

Enzymatyczną amplifikację DNA kierowaną primerem z udziałem termostabilnej polimerazy DNA po raz pierwszy opisał Saikki i wsp. [(Science, 239:487 (1988)].(Do naszych celów, jako matrycę do reakcji enzymatycznej amplikacji PCR stosuje się 5μΐ cDNA z głowotułowia Diguetia i reagenty zawarte w zestawie do amplikacji DNA GeneAmp™ firmy Perkin Elmer Cetus, CA).

Mieszanina reakcyjna do amplifikacji zawiera primery sensowne i antysensowne w stężeniu 2 μΜ. po 100 μ m każdego trójfosforanu dezoksynukleotydu i 4 jednostki termostabilnej rekombinantowej polimerazy Taq I. Reakcję prowadzi się w aparacie DNA Thermal Cycler wytwarzanym przez firmę Perkin Elmer Cetus. Selektywną amplifikację genu kodującego pozostałość 9,2 z rodziny pokrewnych toksyn z podobnymi N-końcówkami sekwencjami aminokwasowymi uzyskuje się stosując wysoką temperaturę przyżarzania (58°C). W tych warunkach amplifikuje się pojedynczy DNA o długości około 275 par zasad, jak wynika z oznaczenia metodą elektroforezy w żelu agarozowym. Jeśli się stosuje mniej ostre warunki przyżarzania, wówczas metodą elektroforezy w żelu agarozowym można zidentyfikować ponad pięć zamplifikowanych produktów o rozmiarach od około 200 do 360 par zasad. Te różne produkty reakcji PCR otrzymane w mieszaninach o niskiej mocy prawdopodobnie kodują polipeptydy pokrewne pod względem sekwencji aminokwasowej, średnich rozmiarów i aktywności owadobójczej z sekwencją w pozostałości 9,2. Przypuszcza się, że te pokrewne polipeptydy zawierają polipeptydy z pozostałości 11 i 12, gdyż sekwencję N-terminalne tych polipeptydów są wzajemnie do siebie bardzo podobne i są podobne do reszty 9,2, jest uwidocznione na sekwencjach ID nr 1, nr 3 i nr 5.

Etap nr 5: Klonowanie produktów reakcji PCR

Produkty reakcji PCR pochodzące zarówno w reakcji o wysokiej,jak i o niskiej mocy oczyszcza się usuwając nieprzereagowane primery, w urządzeniu do rozdziału według wielkości cząsteczek Centricon-100 (Amicon). Odzyskane produkty poddaje się trawieniu enzymem restrykcyjnym Not I (MBR) firmy Milwaukee, WI, odcinającym primer w końcu 3’ i pozostawiającym lepki koniec. Wektor pKS, dostarczony z firmy Stratagene (LaJolla, CA) trawi się podwójnie enzymami EcoR V (z US Biochemical) i Not I, uzyskując miejsca potrzebne dla ukierunkowanego klonowania. Wektor poddaje się ligacji z insertem i transformuje do kompleksu DH5 F. Skrining kolonii prowadzi się wykorzystując znakowaną 32p sondę wewnętrzną. Wybrane kolonie charakteryzuje się dalej przez sekwencjonowanie minipreparatów DNA w aparaturze US BiochemicaPs seąuenase, wersja 2,0 stosując jako primer sondę wewnętrzną.

Całkowite sekwencje DNA insertów cDNA z dwu klonów są przedstawione na sekwencjach ID nr 2 i nr 4. W klonach pochodzących z reakcji PCR o dużej mocy wykryto tylko pierwszy, podczas gdy w klonach pochodzących z reakcji PCR o słabej mocy znaleziono obydwa typy insertów cDNA. Sekwencja aminokwasowa polipeptydu kodowanego przez sekwencję ID nr 2 jest przedstawiona na sekwencji ID nr 1. Sekwencja N-terminalna tego polipeptydu jest identyczna z tą jaka występuje w pozostałości 9,2. Wyliczony ciężar cząsteczkowy tego polipeptydu wynosi 6377,9 daltonów. Przyjmując, że wszystkie cysteiny w naturalnym polipeptydzie występują w formie wewnątrzcząsteczkowych wiązań dwusiarczkowych (cystyny), wyliczony ciężar cząsteczkowy wyniósłby 6369,7 daltonów. Tak więc, polipeptyd ten wydaje się identyczny z polipeptydem wyizolowanym z pozostałości 9,2, którego ciężar cząsteczkowy oznaczony metodą spektrometrii masowej wynosi 6371 ± 2. Sekwencja aminokwasowa tego polipeptydu kodowanego przez sekwencję ID nr 4 jest przedstawiona na sekwencji ID nr 3. N-terminalna sekwencja tego polipeptydu jest identyczna z oznaczoną dla pozostałości 11. Tak więc, jest to ten sam polipeptyd, jaki wyizolowano w pozostałości 11.

Przykład VI. Toksyczność wobec ssaków

W trzech oddzielnych próbach ilość 5 μΐ pełnego jadu uzyskanego z D. canities w opisany powyżej sposób, podanego myszom dootrzewno (i.p.) okazała się śmiertelna dla

168 222 tych zwierząt. Traktowane myszy początkowo są nie do odróżnienia od myszy kontrolnych, którym podano jedynie roztwór soli fizjologicznej. Po 10-15 minutach od injekcji u traktowanych myszy pojawia się umiarkowana nadaktywność z charakterystycznym biegiem na tylnych łapach. Następnie występuje krótki okres braku koordynacji, ciężkiego oddechu i drgawek. Śmierć następuje w ciągu 2 minut od wystąpienia pierwszych objawów.

Pozostałości 9,2,11 i 12 wstrzykuje się dootrzewnowo myszom w średnich dawkach odpowiednio 4,3; 0,9 i 1,2 mg/kg, nie obserwując działania w ciągu 24 godzin u żadnego z tych trzech peptydów.

Pozostałość 9,2 podaje się w postaci injekcji do komór mózgowych czterem myszom (około 28 g) w dawce około 30 μg na zwierzę (około 1 mg/kg). Nie obserwuje się żadnego działania w czasie do 48 godzin od iniekcji. U jednej myszy, której podano dootrzewnowo 125 ug (4,2 mg/kg) pozostałości 9,2 również nie obserwuje się żadnej reakcji.

W celu oznaczenia toksyczności tego jadu dla kręgowców bada się na myszach pulowane frakcje uzyskane z chromatograficznego rozdziału (HPLC z odwróconymi fazami) pełnego jadu (fig. 1). Frakcja 2 zawiera składniki wykazujące aktywność wobec motyla tytoniowego (TBW). W dawce równoważnej ilości 25 ul pełnego jadu (WVE), dootrzewnowo podane frakcje 1 i 2 nie wywierają działania. Frakcja 3 daje taki sam efekt jak iniekcja pełnego jadu. Wyniki te wskazują na wyraźne oddzielenie działania owadobójczego od działania na kręgowce (toksycznego) związków występujących wjadzie Diguetia canities.

Przykład VII. Wyniki badań elektrofizjologicznych

Wpływ DK 9,2, w stężeniu iμ M na przekaźnictwo synaptyczne (wzbudzane odchylenia populacyjne) oznacza się na synapsach obocznych komórek piramidalnych CA i skrawków hipokampa szczura. Dane przedstawione na na fig.2 są uśrednionymi w czasie zapisami odchyleń populacyjnych (a) na 5 minut przed podaniem DK 9,2, (b) w czasie 15-20 minut po podaniu DK 9,2. Te zapisy nakładają się na siebie, co wskazuje, że przy tym stężeniu DK

9,2 nie wykazuje takiej aktywności na ośrodkowy układ nerwowy szczura, jaką można byłoby wykryć w tej próbie. W próbie tej wykrywa się wiele różnego rodzaju działań na różne kanały jonowe i receptory neuroprzekaźników ssaków (T.V. Dunwiddie: The Use of In Vitro Brain Slices in Neuropharmacology, In Electrophysiological Techniques in Pharmacology, wyd. H.M. Geller, Alan R. Liss, Inc., Nowy Jork, 1986). Szczególnie cząsteczki, które zapobiegają inaktywacji kanałów sodowych, takie jak niektóre toksyny skorpiona, powodują mocno wyrażone rozszerzenie ostatniej fazy wzbudzonych odchyleń populacyjnych [Kaneda M., Myama Y., Ikemoto Y. i Akaike N.: Scorpion toxin prolongs an inactivation phase of the voltage-dependent sodium current in rat isolated single hippocampal neurons; Brain Res. 487:192-195 (1989):Alan L.Mueller, Natural Product Sciences, Inc., obserwacje niepublikowane]. Odwrotnie, DK 9,2 wykazuje aktywność w preparatach owadzich (mucha domowa) w stężeniach 100 razy niższych, w sposób, który świadczy o zapobieganiu inaktywacji kanałów sodowych owada.

Przykład VIII. Sekwencja cDNA w kierunku 5’, kodujące prekursor DK 9,2

W celu uzyskania sekwencji w kierunku 5’ cDNA kodującego DK 9,2 syntetyzuje się wewnętrzną część oligonukleotydu odpowiadającą resztom kwasów nukleinowych od 159 do 178 na nici antysensownej sekwencji DNA przedstawionej jako sekwencja ID nr 2. Na końcu 5’ tego primera znajduje się miejsce restrykcyjne dla Eco RI. Do jednoniciowego cDNA z gruczołujadowego (10 ul) dosyntetyzowuje się nakońcu 3’ ogony reszt dezoksyguanozyny stosując enzym, terminalną tranferazynę dezoksynukleotydową (dostarczoną z firmy Bethesda Research Laboratories). Ilość 20 ul mieszaniny reakcyjnej zawierającej 14 μ M enzymu i 500 μΜ dGTP inkubuje się w temperaturze 37°C w czasie 15 minut. Następnie próbkę strąca się etanolem i zawiesza w 20 μ 1 wody.

Sekwencje DNA w górę od specyficznego primera gaenu amplifikuje się stosując technikę zakotwiczonej reakcji PCR podobną do tej, jaką stosuje się do sekwencji cDNA w dół od sekwencji cDNA dla dojrzałej toksyny. Amplifikacyjna mieszanina reakcyjna zawiera sensowny, (ogonowany a d(C) primer) i primery antysensowne w stężeniu 2 μ M, po 100 μ M każdego z trójfosforanów dezoksynukleotydowych i 4 jednostki termostabilnej rekombinantowej polimerazy Taq. Stosuje się następujące profile temperatury: 2 minuty w

168 222 temperaturze 94°C, 2 minuty w temperaturze 37°C, i minuta w temperaturze 37°C. Ten cykl powtarza się dwukrotnie po czym zmienia się program na profil identyczny, wprowadzając podwyższoną temperaturę zgrzewania 54°C w drugim etapie. Taki cykl powtarza się 32 razy.

W wyniku tej zakotwiczonej reakcji PCR uzyskuje się fragment o wielkości 380 par zasad, co stwierdza się po elektroforezie w 4% żelu agarozowym wobec bromku etidium. Produkt reakcji wypełnia się na końcach stosując większy fragment Klenowa DNA polimerazy I z E. coli (Molecular Biology Resources, Madison, WI), i strąca się etanolem. Z produktu przygotowuje się zawiesinę i trawi enzymem restrykcyjnym Eco RI. Trawiony fragment poddaje się działaniu kinazy T4 wobec 1 mM ATP i następnie ligacji z wektorem pBluescriptsKS uprzednio trawionym przez Eco RI i eco RV. Podklony analizuje się techniką sekwencjonowania dwuniciowego DNA, stosując Sequenase 2,0 (USB).

Translacja sekwencji cDNA zawartych w regionie w górę od sekwencji dla dojrzałego peptydu toksyny ujawnia, że DK 9,2 jest syntetyzowana jako białko prekursorowe. Sekwencja w górę tego cDNA jest przedstawiona na sekwencji ID nr 6. Kod dla białka prekursorowego składa się z sekwencji sygnalnej i regionu propeptydu (sekwencja ID nr 7) usuwanego podczas powstawania dojrzałego białka toksyny dającego się wyizolować z jadu pająka. Sądzi się, że sekwencje sygnalna i propeptydu są niezbędne do wytwarzania i wydzielania DK 9,2 u pająka.

Przykład IX. Konstruowanie rekombinantowego baculowirusa

Sekwencję sygnalną motyli opisaną przez Jones’a i wsp. [Molecular Cloning Regulation and Complete Sequence of a Hemocyanin-RElated Juvenile Hormone-Supressible Protein From Insect Hemolymphsa, J. Biol. Chem., 265:8596 (1990)] konstruuje się z dwóch syntetycznych oligonukleotydów w sposób opisany przez Rossi’ego i wsp. [J. Biol. Chem., 257-9226 (1982)]. Dwa 38-mery oczyszcza się metodą chromatografii jonowymiennej. Te dwa oligonukleotydy posiadają wspólnych 11 par zasad sekwencji komplementarnej na końcach 3’. Jeśli te sekwencje zgrzewa się wobec czterech trójfosforanów dezoksyrybonukleozydów i fragmentu Klenowa DNA polimerazy I, zachodzi synteza dwuniciowego produktu. Produkty reakcji oczyszcza się metodą chromatografii na hydroksyapatycie, po czym trawi się te dwuniciowe cząsteczki DNA enzymem restrykcyjnym Aat II, odpowiednim do następnej insercji tej sekwencji w kierunku w górę od cDNA dla DK 9,2 klonowanego w plazmidzie pKS-DK9c. Następnie prowadzi się skrining podklonów na obecność insercji tej sekwencji sygnalnej i analizuje się przez sekwencjonowanie DNA.

Sekwencjonowanie DNA potwierdza zgodną z ramką odczytu fuzję tych dwóch sekwencji cDNA. Tę całkowitą syntetyczną konstrukcją genową wycina się i przygotowuje do klonowania do miejsca Nhel w plazmidzie pBluBac, będącym baculowirusowym wektorem przeniesienia [Vialard J. i wsp., J. Virology 64:3-50 (1990)]. Podklony sekwencjonuje się w celu potwierdzenia prawidłowej insercji tej konstrukcji. Sekwencjonowanie DNA plazmidu WR9 potwierdza insercję syntetycznego genu pająka-dostawcy (preDK 9,2) w baculowirusowym wektorze przeniesienia pBlueBac (fig.3). Użycie wektora pBlueBac przyspiesza proces skringu, gdyż insercji naszego rekombinantowego genu do genomu baculowirusa towarzyszy ko-ekspresja B-galaktozydazy, co wykrywa się przez zmianę barwy przy wzroście na pożywkach indykacyjnych.

Rekombinantowe baculowirusy kodujące preDK 9,2 wytwarza się przez transfekcję komórek Spodoptera frugiperda, szczep Sf9 (ATCC nr CRL1711) mieszaniną i ug wirusowego DNA AcMNPV i 2 μg plazmidowego DNA według przepisu podanego przez Summers’a i Smith’a (A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect Cell Culture Procedures, Texas Agricultural Experiment Bulletin, nr 1555,1988). Po czterech dniach od transfekcji, rozcieńczenia supernatantu komórkowego posiewa się na płytki o średnicy 100 mm, na które uprzednio wysiano 5 x 10⁶ komórek Sf9 i pokrywa się agarozą zawierającą jako substrat Bluo-gal (dostarczony z firmy Gibso BRL, Gaithersburg, MD). Po 5 do 6 dniach rekombinanty wykrywa się dzięki temu, że dają blado-niebieski kolor. Łysinki zbiera się pipetką Pasteura i rozprowadza w 1 ml pożywki. Taki eluent stosuje się do powtórnej infekcji komórek Sf9 wysianych do kolb T-25. Po 3 dniach od infekcji, z sześciu różnych izolatów zbiera się małe ilości supernatantu i stosuje go do preparowania wirusowego DNA.

168 222

W reakcji amplifikacji PCR z użyciem wirusowym, specyficznych primerów z regionu otaczającego gen polihedryny potwierdza się, że pięć z sześciu izolatów wirusowych zawiera prawidłowo usytuowany insert i nie wykazuje zanieczyszczeń typu dzikiego. Następnie przygotowuje się mianowanie roztwory podstawowe rekombinantowych wirusów do badań in vitro i in vitro.

Przykład X. Aktywność biologiczna rekombinantowego peptydu DK 9.2

Aktywność biologiczną rekombinantowej pozostałości 9,2 (DK 9,2) oczyszczonej od pożywki hodowlanej zawierającej surowicę oznacza się na larwach motyla tytoniowego (TBW). Dawki wylicza się na podstawie wartości A280 testowanego roztworu. W dawce 16wg/g. rekombinantowy materiał powoduje wyraźne skurczne mięśniowe po 2 godzinach od iniekcji. Połowa z tych larw (3 z sześciu) ulega porażeniu i silnemu skurczeniu po 48 godzinach podczas gdy u 3 innych larw w dalszym ciągu występują lekkie do umiarkowanych skurcze mięśniowe. Dawka 8 μg/g również poraża 3 na 6 larw, podczas gdy dawka 5,2 μg/g poraża 2 na 6 larw. Wyniki potwierdzają, że rekombinantowy materiał DK 9,2 wykazuje aktywność biologiczną.

Przykład XI. Rekombinantowy baculowirus - badania in vitro

A. Aktywność biologiczna rekombinantowego wirusa jądrowego polihedrozy DK 9,2 (vACDK 9,2)

1. Mianowanie preparatów wirusowych

Wirusowe preparaty podstawowe mianuje się metodą łysinek opisaną przez Luria’ego i wps. (General Virology, 1978, str. 21-32; John Wiley and Sons, Nowy Jork). Miara wyraża się w jednostkach tworzących łysinki (PFU) na jednostkę objętości, a dawki wyraża się w jednostkach PFU na larwę. Jedna jednostka PFU jest funkcjonalnym równoważnikiem jednego dojrzałego wirionu (wirusa) w preparacie, w którym każdy wirion ma zdolność zainfekowania jednej komórki gospodarza (Luria i wsp., jak wyżej). Przykładowo, jeśli 103 gospodarza są zarażone przez mikrolitr preparatu wirusowego zawierającego 106 PFU/ml to miano wynosi 103 PFU/ul.

2. Próby biologiczne

Aktywność biologiczną rekombinantowego wirusa jądrowego polihedrozy (rNPV) DK 9,2, vAcDK 9,2, oznacza się w seriach prób, w których prowadzi się oznaczenia zależności od dawki. W próbach tych, larwom motyla tytoniowego (o średniej masie 250 mg) podaje się iniekcji różnych dawek vAcDK 9,2 w pożywce hodowli tkankowej albo samej pożywki hodowli tkankowej (n = 10). Takjak w doświadczeniach iniekcji toksyny opisanych w przykładzie I, traktowane larwy utrzymuje się w osobnych pojemnikach, dostarczając karmę i prowadząc okresowe obserwacje. Połączone wyniki dwóch takich prób iniekcji wirusowych są przedstawione w tabeli II. W dawkach 5000 jednostek PFU/larwę lub wyższych zaczynają się pojawiać typowe objawy toksyczności DK 9,2 (drżenie mięśniowe i skurcze) po 24 godzinach od iniekcji i u co najmniej połowy testowanych larw występują objawy niezdolności ruchowej (porażenie lub częściowe porażenie) w ciągu 48 godzin. Najniższa testowana dawka, 50 jednostek PFU/larwę powoduje drżenia i skurcze w czasie 48 godzin i unieruchomienie u co najmniej 70% larw w czasie 96 do 120 godzin.

B. Aktywność biologiczna vAcDK 9,2 w porównaniu do NPV typu dzikiego.

Dalsze badania prowadzi się w celu oceny skuteczności vAcDK 9,2 w porównaniu z wirusem rodzicielskim typu dzikiego, czyli wirusem jądrowej polihedrozy Autographa californica (wt-AcMNNPV). Celem tych badań jest stwierdzenie, czy larwy zainfekowane przez vAcDK 9,2 ulegają niezdolności ruchowej w krótszym czasie niż larwy zarażone identyczną dawką wt-AcMNPV.

1. Próby iniekcji

Aktywność biologiczną vAcDK 9,2 i wt-AcMNPV porównuje się w seriach prób iniekcji. Larwom motyla tytoniowego (Heliothis virescens), larwom miernicy kapuścianej (Trichoplusiani i larwom szkodnika buraczanego (Spodoptera exigua) w ostatnim stadium rozwoju podaje się ilości 5 x 10⁵ jednostek PFU/larwę wirusa vAcDK 9,2 lub wirusa wt-AcMNPV. Kontrolnym larwom podaje się iniekcje pożywki hodowli tkankowej. Wyniki

168 222 przedstawione w tabeli III wykazują, że vAcDK 9,2 jest znacznie bardziej skuteczny niż wt-AcMNNPV w stosunku do wszystkich trzech gatunków.

2. Próby karmienia

W celu zbadania aktywności wirusa vAcDK 9,2 podanego drogą pokarmową należy wytworzyć rekombinant polihedryno-ujemny (poi-) w formie zakażającej drogą pokarmową. Dokonuje się tego przez ko-okluzję vAcDK 9,2 z wt-AcMNNPV stosując sposoby wytwarzania zakażającego drogą doustną pol-rekombinantowych wirusów jądrowej polihedrozy opisane przez innych badaczy [np. Kuroda i wsp., J. Virology 63(4): 1677-1685 (1989) i Price i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. 86-1453^1·4:5^, 1989]. Komórki sF-9 zakaża się jednocześnie wirusem vAcDK 9,2 i wt-AcMNPV odpowiednio 10-cio i 2-krotnością infekcji (MOI). W tym samym czasie zakaża się drugą grupę komórek sF-9 samym wt-AcMNNPV (wielokrotność = 2). Po 5 dniach od infekcji zbiera się ciała inkluzyjne przez rozerwanie komórek i wirowanie różnicowe (opisane np. przez Wood’a, Virology 104, 392-399,1980). Ciała inkluzyjne liczy się w hemacytometrze. Komórki, które zostały zakażone zarówno przez vAcDK 9,2, jak i wt-AcMNPV wytwarzają mniejszą ilość mniejszych ciał inkluzyjnych niż komórki zakażone samym wt-AcMNPV. Wydajność inkluzji polihedralnych (PIB) uzyskanych z infekcji mieszanej wynosi 4,6 PIB/komórkę podczas gdy wydajność z czystej infekcji wt-AcMNPV wynosi 33,3 PIB/komórkę.

W celu oceny aktywności biologicznej ko-okludowanego vAcDK 9,2 w porównaniu z wt-AcMNPV wykonuje się próbę podawania doustnego. Inkluzje polihedralne (PIB), mieszane lub typu dzikiego wprowadza się do bezagarowej pożywki owadów w stężeniu 10⁵ PIB/g pożywki. Pożywkę tę umieszcza się w małych pojemnikach i następnie podaje nowo wylęgniętym larwom motyla tytoniowego (jedna larwa na pojemnik, n = 20). Kontrolne larwy karmi się identycznymi ilościami nietraktowanej pożywki. Larwom pozwala się żerować do syta obserwując je okresowo i śledząc rozwój objawów. Wyniki są przedstawione w tabeli II. W ciągu pierwszych 48 godzin nie obserwuje się żadnych objawów ale po 72 godzinach, porażeniu ulega ponad 50% larw karmionych mieszanymi PIB. W tym czasie wirus typu dzikiego nie wywołuje żadnych objawów. Po 96 godzinach ponad 90% larw traktowanych rekombinantowym wirusem ulega porażeniu podczas gdy tylko 10% larw traktowanych wirusem typu dzikiego zdycha lub kona. Po 120 godzinach zdycha 100% larw traktowanych wirusem rekombinantowym i 75 % larw traktowanych wirusem wt-AcMNPV. Tak j ak w próbach podawania iniekcji, w próbie podawania drogą doustną larwy traktowane wirusem vAcDK 9,2 traciły zdolność ruchów w znacznie krótszym czasie niż larwy traktowane wirusem wt-AcMNPV.

Tabela 2

Zależności od dawki działania vAcDK 9,2 na motyla tytoniowego

Procent	porażenia
Dawka jednostek PFUlarwę	24 godziny	48 godzin	72 godziny	96 godzin	120 godzin
5,1 x 105	0	80	100	100	100
5,1 x 104	0	35	95	100	100
5,1 x 103	0	25	75	90	100
5,1 x 102	0	0	55	85	100
5,1 x 101	0	0	20	65	95
Kontrola	0	0	0	0	0

168 222

Przykład XII. Promotor dla genu kodującego DK 9,2

W celu uzyskania elementów kontrolnych genu kodującego dK 9,2 sporządza się bank genowy. DNA preparuje się z pająków według przepisu przygotowanego przez Herrmann’a i Frischaufa [Methods in Enzymology, tom 152, Academic Press, Inc., str. 180-183, 1987]. Ten DNA trawi się częściowo enzymem Sau 3A i frakcjonuje przez wirowanie w gradiencie gęstości 10% do 30% sacharozy przy 25 000 obrotów/minutę przez 16 godzin w wirówce TLS-55 (Beckman Co., Ltd.). Połączone frakcje zawierające DNA o wielkości 35 do 45 kilozasad przygotowuje się do insercji do trawionego enzymu Xho I wektora kosmidowego metodą częściowego wypełniania. Jedną czwartą mieszaniny litygacyjnej upakowuje się do cząstek faga stosując aparat Gipak gold™ dostarczony przez firmę Stratagene (LaJolla, Ca) i po transformacji uzyskuje się równoważnik ponad 3 x 10⁹ par zasad DNA pająka. Bank ten posiewa się na 25 płytek petriego o średnicy 150 mm, po czym przenosi na filtry nylonowe w celu związania z sondą znakowanego DNA.

Następnie wykonuje się skrining kolonii na filtrze z banku genomowego Diguetia w seriach ze znakowanym radioaktywnie cDNA kodującym DK 9,2 i ze znakowanymi na końcach oligonukleotydami kodującymi koniec aminowy, koniec karboksylowy i z sondą wewnętrzną. Jeden kosmid, cDK2, hybrydyzuje ze wszystkimi sondami. Przeniesienie Southerna trawionego eco RI kosmidowego DNA wykazuje fragment o wielkości 3,0 kilozasad hybrydyzujący z sondą wewnętrzną i C-terminalną. Dwuniciowe sekwencjonowanie kosmidu cDK2 z użyciem trzech primerów zidentyfikowanych powyżej pozwala na izolację genu dla DK 9,2 i stwarza przypuszczenie, że na tym samym przyległym kawałku DNA mogą znajdować się inne geny z tej rodziny, gdyż N-terminalny oligonukleotyd (który wykazuje wysoki stopień homologii ze wszystkimi owadobójczymi peptydami Diguetia) występuje jako primer w wielu miejscach kosmidowego DNA.

Aby uzyskać region promotora genu dla DK 9,2 syntetyzuje się oligonukleotyd odpowiadający sekwencji pre-sygnalnej na nici sensownej. Reakcja amplifikacji PCR między tym primerem a innymi naszymi specyficznymi w stosunku do genu primerami

Tabela III.

Porównanie działania cAcDK 9,2 i wt-AcMNPV podanych drogą iniekcji na larwy motyla tytoniowego (TBW), miernicy kapuścianej (CL) i szkodnika buraczanego (BAW)

Traktowanie	gatunek	24 godz.	48 godz.	72 godz.	96 godz.	120 godz.	168 godz.
vAcDK 9,2	TBW2	0	0	100	100	100	100
wt-AcMNPV	TBW	03	0	0	0	0	04
kontrola	TBW	0	0	0	0	0	0
vAcDK 9,2	CL5	0	100	100	100	100	N/A
wt-AcMNPV	CL	0	0	0	0	100	N/A
kontrola	CL	0	0	0	0	0	N/A
vAcDK 9,2	BAW6	0	70	90	100	100	100
wt-AcMNPV	BAW	0	0	0	0	0	100
kontrola	BAW	0	0	0	0	0	30

Wirusy wstrzykuje się w stężeniu 5 x 10 jednostek PFU/larwę; owadom kontrolnym wstrzykuje się identyczne objętości pożywki hodowli tkankowej.

n = 8; średnia waga larwy = 300 mg

168 222 dwie spośród ośmiu larw padly z powodu urazu fizycznego podczas iniekcji; zostały one wykluczone z dalszych analiz;

śmiertelność spowodowana przez wt-AcMNPV na 8 dzień wyniosła 100%;

n = 10; średnia waga larwy = 165 mg;

n = 20 dla vAcDK 9,2; n = 10 dla wt-AcMNPV i kontroli; średnia waga larwy = 200 mg. pozwala na usytuowanie sekwencji sygnalnej w miejscu ponad 3000 par zasad w górę od końca aminowego egzonu. Następnie, do sekwencjonowania genomowego DNA w regionie bezpośrednio w górę, do końca 5’ cDNA kodującego peptyd sygnalny, stosuje się primer na nici antysensownej.

Sekwencjonowanie DNA w górę od sekwencji sygnalnej na genomowym DNA wskazuje na obecność innego intronu w miejscu -11 par zasad od inicjacyjnego kodonu metioniny. Primer oligonukleotydowy odpowiadający regionowi 5’ cDNA dla prekursora DK 9,2 syntetyzuje się i stosuje do zapoczątkowania reakcji PCR, dla oznaczenia jak duża jest sekwencja wstawkowa między miejscami początku trankrypcji początku translacji. Produkt amplifikacji o wielkości 1000 par zasad potwierdza istnienie intronu i pozwala na oszacowanie jego wielkości. Sekwencjonowanie genomowego DNA w górę od miejsca początku transkrypcji (przyjmując, że jest on równoważny z końcem 5’cDNA) wykazuje obecność promotora. Sekwencja DNA regionu promotora jest przedstawiona na sekwencji nr 8. Ten przypuszczalny promotor zawiera wiele ważnych sygnałów kontroli, występujących na ogół u innych promotorów eukariotycznych w regionie bezpośrednio w górę od miejsca początku translacji. Ten promotor lub sekcje tego promotora można użyć do procesów transkrypcji/translacji innych genów eukariotycznych w bakteriach, wirusach, roślinach lub zwierzętach.

Przykład XIII. Badania neurofizjologiczne nad wyjaśnieniem mechanizmu działania białka DK 9,2.

W celu wyjaśnienia mechanizmu działania białka 9,2 prowadzi się badania neurofizjologiczne. Zapisy uzyskane z połączeń nerwowo-mięśniowych i z nerwów obwodowych larw wykazują, że DK 9,2 wywołuje powtarzające się wyładowania rozrywające w nerwach wrażliwych na blok tetrodotoksyną. Miejscem działania tej toksyny jest więc prawdopodobnie wrażliwy na napięcie kanał sodowy w błonie nerwowej. Dodatkowe badania wykazują, że DK 9,2 trwale pobudza nerwy obwodowe w stężeniu progowym wynoszącym 10 nM. Ponadto, siła działania DK 9,2 przewyższa co najmniej 50-krotnie toksynę ssaków nr 4 skorpiona Leuirus quinquestriatus.

W niniejszym badaniu jako zwierzęta doświadczalne służą larwy muchy domowej (Musca domestica) w trzecim stadium rozwoju między wylinkami. Larwy unieruchamia się igłami do preparowania owadów i otwiera się grzbietowo przez nacięcie środkowe strzałkowe. Korpus rozpina się płasko i usuwa się trzewia eksponując ścianę umięśnienia. Oddziela się nerwy obwodowe w miejscu, gdzie wychodzą z mózgu i usuwa się mózg. Preparat zanurza się w soli fizjologicznej dla owadów o składzie (wyrażonym w mM): NaCl (140), KCl (5), CaClz (0,75), MgCl₂ (4), NaHCO₃ (5) i bufor HEPES (5); pH = 7,2.

Do każdego dostępnego pnia nerwowego przyłącza się stymulującą elektrodę ssącą w celu zapisu przekaźnictwa nerwowo-mięśniowego. Próg stymulacji powoli podnosi się do czasu zaobserwowania skurczu włókna mięśniowego 6 lub 7. Następnie włókno to mocuje się na wewnątrzkomórkowej mikroelektrodzie rejestrującej, połączonej ze wzmacniaczem wstępnym wewnątrzkomórkowym, stosowanym do rejestracji Pobudzających Potencjałów Post-Synap tycznych (EPSP) w odpowiedzi na stymulację nerwu.

W celu rejestracji wstępującej aktywności elektrycznej w obwodowych włóknach nerwowych łączy się elektrodę ssącą ze wzmacniaczem wstępnym AC. Sygnały wzmacnia się 100 krotnie i moc na wyjściu filtruje się przy 0,3 i 1 kHz. Wszystkie zapisy przekształca się w postać numeryczną w skomputeryzowanym systemie oprzyrządowania MacLab w celu zobrazowania i analizy.

W początkowych badaniach nad działaniem DK 9,2 stosuje się wypreparowane połączenia nerwowo-mięśniowe. Pojedynczy bodziec przyłożony do nerwu obwodowego wywołuje pojedynczy potencjał post-synaptyczny (EPSP) w ścianie umięśnienia larwy. W obecności DK 9,2, pojedynczy bodziec wywołuje wyładowania EPSP o wysokiej częstotli168 222 wości. Poza tymi wywołanymi bodźcem wyładowaniami, pojawiają się spontaniczne wyładowania rozrywające utrzymujące się przez kilka minut. Czas trwania takiego wyładowania wynosi na ogół ponad sekundę a częstotliwość potencjałów post-synaptycznych podczas wyładowania wynosi > 30 Hz. Takie wyładowania rozrywające powodują silne skurcze mięśniowe, co sprawia, że utrzymanie rejestrów wewnątrzkomórkowych staje się trudne, gdyż elektroda jest wyrzucana z mięśnia podczas wywołanego wyładowaniem skurczu. Dlatego większość eksprerymentów prowadzi się w roztworze soli zawierającym wysokie stężenie sacharozy (300 mM), co osłabia skurcze, lecz nie wpływu na aktywność elektryczną. Podobne wyniki uzyskuje się stosując albo zwykły roztwór soli albo z wysokim stężeniem sacharozy.

Wyładowania rozrywające obserwowane po traktowaniu DK 9,2 są podobne do tych,jakie występują w obecności - toksyn skorpiona będących białkami, o których wiadomo, że wchodzą w interakcję z wrażliwymi na napięcie kanałami sodowymi błon nerwowych. Tak więc, wyładowania rozrywające powinny być blokowane przez specyficzny bloker kanałów sodowych, tetrodotoksynę (TTX). Działanie TTX zapobiegające lub odwracające wyładowania wywołane przez DK 9,2 jest przedstawione na fig. 5. Na fig. 5A jest uwidocznione, że EPSP są natychmiast blokowane przez stężenie i uM TTX i preparat staje się niewrażliwy na następne traktowanie stężeniem 100 nM DK 9,2. Podobne doświadczenie jest przedstawione na fig. 5B, gdzie wyładowania rozrywające się indukowane przez DK 9,2 i odwracane przez następne podania TTX. W tym doświadczeniu wzbudzenie wyładowania wypiera elektrodę z mięśnia, co powoduje błąd pomiaru, gdy usiłowano ponownie ustabilizować zapis. Po znalezieniu odpowiedniego miejsca zapisu monitrowano wyładowania w czasie około 2 minut, po czym zanikała aktywność preparatu w ciągu sekund po podaniu TTX.

Dla przezwyciężenia trudności związanych z pomiarami wewnątrzkomórkowymi z kurczącego się mięśnia, powtarza się powyższe doświadczenia prowadząc zapisy pozakomórkowe z nerwów obwodowych larw. W zapisach tych rejestruje się aktywność nerwów wstępujących czuciowych oraz samoistną aktywację antydromową (przewodzących w odwrotnym kierunku) włókien motorycznych. Przy stężeniu 70 nM, dK 9,2 powoduje wzrost wyładowań nerwowych, na które nie ma wpływu następne traktowanie solą fizjologiczną lecz wyładowania te są natychmiast blokowane stężeniem 0,4 ąM TTX. Podanie TTX przed DK 9,2 zapobiega pojawieniu się wyładowań rozrywających.

Dodatkowe badania prowadzi się również dla oznaczenia wrażliwości nerwów owadzich na DK 9,2 i dla porównania siły jego działania ze standardową toksyną skorpiona. DK

9,2 oznacza się na preparacie nerwów obwodowych, wychodząc ze stężenia i nM i zwiększając to stężenie co 5 minut albo do zaobserwowania wzrostu aktywności. W tym preparacie, stężenie i nM i 5 nM DK 9,2 są nieaktywne ale stężenie 10 nM wzbudza aktywność w tym preparacie po krótkiej zwłoce. Wyniki z pięciu preparatów nerwów stosowanych do oznaczania efektywnego stężenia progowego DK 9,2 na larwy owadów są przedstawione w tabeli IV.

Tabela IV

Stężenie	Ilość prób (traktowanie)	Ilość odpowiedzi	%
Odpowiedź 1 nM	2	0	0
2 nM	1	0	0
5 nM	3	1	33
10 nM	3	3	100

W ostatniej grupie doświadczeń oznacza się w podobny sposób wrażliwość larw owadów na toksynę 4 skorpiona Leiurus quinquestriatus (LqTX 4). Preparaty (n = 4) poddaje się działaniu LqTX w stężeniach do 500 nM bez efektu. Ten wynik jest zgodny z poprzednimi spostrzeżeniami, że LqTX 4 wykazuje selektywne działanie na kanały sodowe ssaków. Następne poddanie tych preparatów na działanie DK 9,2 wymaga dawki 10-30 nM, aby uzyskać odpowiedź. To lekkie podwyższenie efektywnego stężenia progowego DK 9,2 wynika prawdopodobnie ze słabego działania blokującego tego nieaktywnego LqTX 4. Doświadczenie te wykazują, że DK 9,2 jest przynajmniej 50 razy bardziej aktywny w stosunku do nerwów owadów niż LqTX 4.

Tabela V

sekwencja ID	Opis sekwencji
1	sekwencja aminokwasowa DK 9,2
2	sekwencja kodująca cDNA dla DK 9,2
3	sekwencja aminokwasowa DK 11
4	sekwencja kodująca cDNA dla DK 11
5	sekwencja aminokwasowa DK 12
6	Całkowita sekwencja cDNA kodująca DK 9,2
7	sekwencja aminokwasowa dla sekwencji sygnalnej (liderowej dla prekursora DK 9,2
8	sekwencja DNA dla promotora regionu DK 9,2

Wykaz sekwencji (1) INFORMACJA OGÓLNA (i) ZGŁASZAJĄCY: Karen J.Krapcho; Bradford Carr VanWagenen; J.R.Hunter Jackson (ii) TYTUŁ WYNALAZKU: Peptydy owadobójcze (iii) ILOŚĆ SEKWENCJI: 8 (iv) ADRES DO KORESPONDENCJI:

(A) NAZWISKO: Woodcock, Washburn, Kurtz, Mackiewicz i Norris (B) ULICA: one Liberty Place - 46th Floor (c) MIASTO: Philadelphia (D) STAN: Pennsylvania (e) Kraj: Stany Zjednoczone Ameryki (F) Numer kodowy: ZIP: 19103 (v) FORMA CZYTELNA DLA KOMPUTERA:

(A) Dysk miękki: Dyskietka 3,5 calova, i 44 Mb (B) Komputer: IBM PS/2 (C) System operacyjny: PC-DOS (D) Program: Wordperfect 5,0 (vi) BIEŻĄCE DANE O ZGŁOSZENIU:

(A) Numer zgłoszenia:

(b) Data zgłoszenia:

(C) Klasyfikacja:

(vii) DANE O WCZEŚNIEJSZYM ZGŁOSZENIU:

(A) Numer zgłoszenia: 662,373 (b) Data zgłoszenia: 1 marzec 1991 (viii) INFORMACJA O AGENCIE/RZECZNIKU;

(A) Nazwisko: John W.Caldwell, Esq, (B) Numer rejestracyjny: 28,937 (C) Numer dokumentów: FMC-0054 (ix) INFORMACJA O TELEKOMUNIKACJI:

(A) Telefon: (215)568-3100 (B) Telefax: (215)568-3439

168 222 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NR 1 (1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) Długość: 56 aminokwasów (b) Typ: aminokwas (D) Topotogia : nieznana (XI) OPIS SEKWENCJI: sekwencja ID nr 1

Ala Lys Asp Gly Asp Val Glu Gly Pio Ala Gly Cys Lys Lys Tyr 5 10 15

Asp Val Glu Cys Asp Ser Gly Glu Cys Cys Xaa Lys Gin Tyr Leu 20 25 30

Trp Tyr Lys Trp Arg Pro Leu Asp Cys Arg Cys Lys Ser Gly

40 45

Phe Phe Ser Ser Lys Cys Val Cys Arg AspVal

55 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NR 2 (i) CHARAKTERYSTYKA. SEKWENCJI

(A)	Długość :	275 par zasad
(B)	typ: kwas	nukle inowy
(C)	Ilośćnici	: dwie
(D)	Topologia	: nieznana

(xi) OPIS SEKWENCJI ; sekwencja ID nr 2

GCC AAG GAC GGC GAC GTC GAG GGG CCT GCG 30

Ala Lys Asp Gly Asp Val Glu Gly Pro Ala

5 10

GGC TGC AAG AAA TAC GAC GTA GAG TGC GAC 6(0

Gly Cys Lys Lys Tyr Asp Val Glu Cys Asp

20

AGT GGA GAG TGC TGC MMS AAG CAG TAC CTG 90

Ser Gly Glu Cys Cys Xaa Lys Gin Tyr Leu

30

TGG TAC AAG TGG CGA CCC CTG GAT TGC CGA 120

Trp Tyr Lys Trp Arg Pro Leu Asp Cys Arg

40

TGC CTA AAG AGC GGT TTC TTC AGC AGC AAG 150

Cys Leu Lys Ser Gly Phe Phe Ser Ser Lys

50

TGC GTT TGC AGA GAC GTG TAGATTTGAA ATGAAATTCG 1B8

Cys Val Cys Arg Asp Val

TGTTCTTTTT TGGTTGTAGA TGACCTAATG AAACAACTGA 228

CATGAATAAA ACAAAATTGA ATGAATTG AA ΑΑPΑΑΑΑΑPΑ 268

AAAAAGC

275

168 222 (2) INFORMACJA DLA SEKWENCJI ID HR 3 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) Długość:

(B) Typ:

(D) Topologia: nieznana (ii) OPIS SEKWENCJI; sekwencja ID nr 3

Ala Lys Asp Gly Asp Val Lys Gty Pro Ala Gly Cys Met Lys Tyr 5 10 15

Lys Ser Gly Asp Cys Arg Gly Lys Thr Cys Cys Asp Gin Gin Tyr

25 30

Leu Trp Tyr Lys Trp Arg Asn Leu Ala Cys Arg Cys Phe Thr Val 35 40 45

Glu Val Phe Lys Lys Asp Cys Trp Cys Asn Asp lle Ser 50 55 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID HR 4;

(I)	HHAAATTEYSSTKAA SEKWECJJI; (A) Długość: 204 pary zasad (B) typ: kwas nukleinowy (C) Ilość nici: dwie (D) Topologia : nieznana
(XI)	OPIS	SEKWENCJI	; sekwencja ID

nr 4

GCC AAG GGT GGG GAT GTC AAT GGA CCT G CT TGC TGG ATG AAG TAC ATG Ala Lys Asp Gly Asp Val Lys Gly Pro Ala Gly Cys Met Lys Tyr Lys 15 1 0 1 5

AGC AAG GAC TGC AGA GGC AGG TGC TTG CAG CAC CA6 TAC CTA TGG Ser Gly Aap Cys Arg Gly Lyo Thr Csi Cyl Asp Gin Gin Ty r Trp

25 30

TAC CCG TGG CCG AAT CTT GCA TGC CGA TAG ATCA CG GAC aGT GGA TTC Tyr Lyp Τψ A^ Am Leu Ala cip Arg Cys Phe Thr Va0 Glu Va I Phe

40 45

CCA CCG ACC TGA TAA TGA AAC GAG ATC AGT GCCTAAACGC AACCGCCGAC Lyp Lys Asp Cys Trp Cys Asn Asp He Ser

55

144

194

CGGCGGGGGG

204

168 222 (2) IHFOWACJJA O SEJWEaUJI ID nr 5 (i) (CHARAKTERY STWL 8E!KreSCCI;

(A) Długość: 6I animokwaey (B) Typ: aminokwasy (D) Topologia : nieznana (xi)OPIS SEKWEHCJI: sekwencja ID nr 5

Ala lys Asp Gly Asp Phe Glu Gly Pro Pro Gly Xaa Leu Lys Met 1 5 10 15

Gly Glu Leu Xaa Lys Gly Gly Thr Xaa Xaa Thr Lys Val Tyr Lys 20 25 30

Tyr Trp Lys Trp Aro Lys Leu Glu Cys Leu Gly Lys Asn Asp Gly 35 40 45

Trp Phe Lys Lys Lys Phe Be Cys Asp Glu Aro Xaa Asn Pro Xaa 50 55 60

Xaa Xaa (2) IHFOFJMACJA O S SEKWENCJI ID HR β (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWEHCJI

(A)	Długość ;	359 par zasad
(B)	Typ: kwas	nukleinowy
(C)	Ilość nici	: podwójna
(D)	Topologia:	nieznana
(xi) OPIS SEKWEHCJI	; Sekwencja ID nr

ATATTACAAG CCGCTCCAGT AGCCGAAGAA GCCTAAGCCA AGAACCCAGG TCCGCCACA 60

ATG AAG GTT TTT GTT GTA CTG TTG TGC TTG TCT CTG GCA GCA GTT TAC 108

Met Lys Val Phe Val Val Leu Leu Cys Leu Ser Leu Ala Ala Val Tyr

-35 -30 -25

GCC TTG GAG GAA AGA CTA GAC AAA GAC GCC GAC ATC ATG CTT GAT TCA 155

Ala Leu Glu Glu Arg Leu Asp Lys Asp Ala Asp Ile Met Leu Asp Ser

-20 -15 -10

CCA GCC GAC ATG GAA AGA GCG AAG GAC GGT GAC GTG GAA GGG CCT GCG 20

Pro Ala Asp Met Glu Arg Ala Lys Asp Gly Asp Val Glu Gly Pro Ala

-5 15 10

GGC TGC AAG AAA TAC GAC GTA GAG TGC GAC AGT GGA GAG TGC TGC MMS 222

Gly Cys Lys Lys Tyr Asp Val Glu Cys Asp Ser Gly Glu Cys Cys Xaa

20 25

AAG CAG TAC CTG TGG TAC AAG TGG CGA CCC CTG GAT TGC CGA TGC CTA 300

Lys Gln Tyr Leu Trp Tyr Lys Trp Arg Pro Leu Asp Cys Arg Cys Leu

35 40

AAG AGC GGT TTC TTC AGC AGC AAG TGC GTT TGC AGA GAC GTG 342

Lys Ser Gly Phe Phe Ser Ser Lys Cys Val Cys Arg Asp Val

50 55

TAGATTTGAA TTCCAAC

359

168 222 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID HR 7 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) Długość : 36 aminokwasów (B) Typ: kminonwasy (C) Ilość nici:

(D) Topologia: nieznana (xi) OPIS SEKWENCJI ; Sekwencja ID nr 7

Met Lys Val Phe Vai Val Leu Leu Cys Leu Ser Leu Ala Ala -35 -30 -25

Val Tyr Ala Lu Glu Glu Arg Leu Asp Lys Asp Ala Asp He -20 -15

Met Leu Asp Ser Pro AJa Asp Met Glu Arg -10 .5 .1 (2) INFOP.KACJA O SEKWENCJI ID NR 3 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) Długość : 421 pa zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Ilość nici: podwójna (D) Topologia: nieznana (xi) OPIS SEKWENCJI ; Sekwencja ID nr 8

TTTAGCAGCC CAAGGCTACA GAGCTGCCGC ACAGGTAAAC CTGAACTACA CAATGCCCCA

TGCCCACGCT CAAACCACAT ACACTCTTTC CCCAACTTTT I Π NGGTAA AGACAGTTGT TGCATTCTAA AAGCACGTTT TACTGCAGCT GCTCAGACTG TCTGCTGCTG GTCGAGGCAG

AGTATGTTTC CTACAGAATT CCACCGAAGC ATTGTTCGTG GTACGACGCA GTAAGCATGA CGCTCAGTTT TTTTTGAATC GGAATATGTA ATATCTGCAG CGACACTTAT TGAAATGTTT CTCCTTCGAC AAGCAATCGC TTTATCGGAA tacctgcatg ACATAACTGA CAAAACACAT GTGGCTCCAG AAACAACGAA AACATTCATT CCTGTATATA AGTATCGGAG GAGTGCTGTA

120

180

240

300

360

420

421

FIG. I

FIG.2

168 222 synDK 9.2

BamHI 8038 H ind ΉΓ 8138 KpnI8468 H ind ΙΠ 9068 Sal Γ10088 HindIHlO118

Nhel'7660 fst 17260

BamHI 7250

EcoRZ6l6O

SacI 5340

Xho 11900

BstE I 960 HindlU 0/14348 pUC B Amp

EcoRl427O Xbo 14210 BamHI 3960

Sal I 3180

Sal 12870 Nsi 12600

FIG. 3

168 222

LARW PORAŻONYCH LUB MARTWYCH

FIG.. 4

168 222

msec

FIG. 5A

FIG. 5B

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz.

Cena 1,50 zł

Claims (10)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób wytwarzania owadobójczego peptydu przez prowadzenie hodowli rekombinantowych komórek gospodarza uprzednio poddanych transformacji lub transfekcji rekombinantowym wektorem ekspresyjnym zawierającym sekwencję DNA kodującą owadobójczy peptyd izolowany z jadu pająka Diguetia, znamienny tym, że stosuje się wektor mający zdolność wywoływania ekspresji tej sekwencji kodującej w transformowanych komórkach i odzyskuje się owadobójczy peptyd z hodowli rekombinantowych komórek gospodarza.
2. 2. Sposób według zastrzeżenia 1, znamienny tym, że stosuje się sekwencję DNA kodującą owadobójczy peptyd o ciężarze cząsteczkowym oznaczanym metodą spektrometrii masowej około 6371-6397 daktonów i dający jeden pik w chromatografii cieczowej z odwróconymi fazami.
3. 3. Sposób według zastrz. I, znamienny tym, że stosuje się sekwencję DNA kodującą w zasadzie peptyd zdefiniowany sekwencją ID nr 1.
4. 4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się sekwencję DNA kodującą owadobójczy peptyd o ciężarze cząsteczkowym oznaczonym metodą spektrometrii masowej około 6740 daltonów i dający jeden pik w chromatografii cieczowej z odwróconymi fazami.
5. 5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się sekwencję DNA kodującą w zasadzie peptyd zdefiniowany sekwencją ID nr 3.
6. 6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się sekwencję DNA kodującą owadobójczy peptyd o ciężarze cząsteczkowym oznaczonym metodą spektrometrii masowej około 7080 daltonów i dający jeden pik w chromatografii cieczowej z odwróconymi fazami.
7. 7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się sekwencję DNA kodującą w zasadzie peptyd zdefiniowany sekwencją ID nr 5.
8. 8. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się sekwencję DNA zdefiniowaną przedstawioną sekwencją ID nr 2.
9. 9. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się sekwencję DNA zdefiniowaną przedstawioną sekwencją ID nr 4.
10. 10. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się sekwencję DNA zdefiniowaną przedstawioną sekwencją ID nr 6.