PL170630B1 - Srodek owadobójczy PL PL PL - Google Patents

Abstract

1. Srodek owadobójczy zawierajacy substancje czynna i nosnik, znamienny tym, ze jako substancje czynna zawiera oczyszczony, owadobójczy peptyd wyizolowany z jadu pajaka Diguetia majacy nastepujaca sekwencje aminokwasowa ID nr 1 Ala Lys Asp Gly Asp Val GIu Gly Pro Ala Gly Cys Lys Lys Tyr 5 10 15 Asp Val GIu Cys Asp Ser Gly GIu Cys Cys Xaa Lys Gin Tyr Leu 20 25 30 Trp Tyr Lys Trp Arg Pro Leu Asp Cys Arg Cys Leu Lys Ser Gly 35 40 45 Phe Phe Ser Ser Lys Cys Val Cys Arg Asp Val 50 55 lub akceptowana w rolnictwie lub ogrodnictwie sól tego peptydu. PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest środek owadobójczy zawierający jako substancję czynną oczyszczony, owadobójczy peptyd, wyizolowany z jadu pająka Diguetia, który umożliwia zwalczanie szkodników bezkręgowych.

W ostatnich latach społeczeństwa uświadomiły sobie zagrożenia związane ze stosowaniem syntetycznych środków owadobójczych dla środowiska naturalnego i ze względu na ich toksyczność dla ssaków. W rezultacie, znacznie spadło zużycie tych środków owadobójczych; nie zmieniła się jednak potrzeba skutecznego zwalczania szkodliwych owadów. Pobudziło to naukowców do prac nad nowymi sposobami niszczenia owadów.

Najszerzej stosowane środki owadobójcze oparte na mikroorganizmach pochodzą z bakterii Bacillus thuringiensis (oznaczonych w dalszej części opisu skrótem B.t.). Ten środek bakteryjny stosuje się do niszczenia wielu różnych gąsienic żerujących na liściach, chrząszcza japońskiego i komarów. W opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 797 279 ujawniono hybrydowe komórki bakteryjne zawierające gen kodujący deltaendotoksynę z B.t. tenebrionis i ich wytwarzanie. Te hybrydy B.t. wykazują aktywność przeciw owadom wrażliwym na szczepy B.t. kurstaki oraz przeciw owadom wrażliwym na szczepy B.t. tenebrionis. Na ogół, hybrydy te posiadają użyteczne właściwości owadobójcze, przewyższające właściwości mieszanin fizycznych szczepów macierzystych pod względem siły działania owadobójczego lub spektrum aktywności lub obydwu tych własności jednocześnie. Kompozycje owadobójcze zawierające takie mikroorganizmy można stosować do zwalczania owadów stosując te hybrydy w ilości skutecznej owadobójczo na owady lub do ich środowiska.

Inna pochodna bakterii B.t. jest ujawniona w publikacji europejskiego zgłoszenia patentowego nr 0 325 400, odnosząca się do hybrydowego genu toksyny, która jest toksyczna w stosunku do owadów z rzędu Lepidoptera, zwłaszcza hybrydowego genu deltaendotoksyny zawierające część genu toksyny B.t., odmiana kurstaki HD-73 i część genu toksyny z B.t.,

170 630 odmiana kurstaki, szczep HD-1. Ujawniony jest hybrydowy gen (DNA) toksyny kodujący białko wykazujące aktywność przeciw motylom.

Wykorzystywano również owadobójcze właściwości bakterii B.t. (publikacjaeuropejskiego zgłoszenia patentowego nr 0 340 948). Wynalazek ten dotyczy hybrydowych toksyn owadobójczych, które wytwarza się przez fuzję regionu rozpoznawania komórek nabłonkowych jelit genu B.t. z łańcuchem B toksyny błonicy. Powstaje hybrydowa toksyna B.t. wykazująca aktywność przeciw owadom z rzędu Lepidoptera.

W publikacji tej wspomniano, że hybrydowy gen B.t. można wprowadzić do rośliny lub klonować do baculowirusa wytwarzając toksynę, którą można odzyskiwać. Alternatywnie, jako środek owadobójczy można użyć gospodarza noszącego w sobie hybrydowy gen B.t., stosując go bezpośrednio do środowiska zwalczanego owada.

W poszukiwaniu związków o działaniu owadobójczym uznano jad skorpiona za potencjalne źródło związków o własnościach owadobójczych. W publikacji Zlotkin’a znajduje się doniesienie o wyizolowaniu z jadu skorpiona Leiurus quinquestriatus quinquestriatus dwu toksyn działających wybiórczo na owady [Zlotkin i wsp.: An Excitatory and a Depressant Insect Toxin from Scorpion Venom both Affect Sodium Conductance and Possess a Common Binding Site (Toksyny pobudzająca i depresyjna z jadu skorpiona działają na przewodnictwo jonów sodowych i posiadają wspólne miejsce wiązania), Arch. Biochem. and Biophysics, 240:877-87 (1985)]. W badaniach nad ich własnościami chemicznymi i farmakologicznymi okazało się, że jedna toksyna wywołuje szybkie pobudzające porażenie skurczowe larwy muchy a druga wywołuje powolne, depresyjne porażenie zwiotczające. Obydwie toksyny wpływają na przewodnictwo jonów sodowych.

W kanadyjskim opisie patentowym nr 2 005 658 ujawniono skuteczne owadobójczo białko pochodzące ze skorpiona Leiurus quinquestriatus hebraeusButhinae, z rodzaju Buthidae. W tym wynalazku, jad liofilizuje się i rozdziela na frakcje. Frakcję o najwyższej toksyczności w stosunku do larw i najniższej toksyczności w stosunku do myszy poddaje się dalszemu oczyszczaniu oznaczając końcowy produkt symbolami LqhP35.

Grishin w wydawnictwie Toxic components from Buthus eupeus and Lucosa singoriensis venoms z Instytutu Chemii Bioorganicznej im. Szejakma, Akademia Nauk ZSRR, Moskwa, 117988, GSP-i, ZSRR, ujawnia cztery toksyny wyizolowane z jadu skorpiona Buthus eupeus toksyczne w stosunku do owadów. Opisuje on również izolację i oznaczenie własności toksycznego składnika jadu tarantuli Lucosa singoriensis. Surowy jad jest nietoksyczny dla owadów.

Równolegle z rozwojem badań nad różnymi kompozycjami o własnościach owadobójczych, naukowcy opracowują sposoby wytwarzania genów dla owadobójczych substancji i wprowadzania ich do wybranych owadów. Opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki 4 879 236 dotyczy sposobu wprowadzania genu sprzężonego z promotorem baculowirusa do genomu baculowirusa z wytworzeniem rekombinantowego wektora ekspresyjnego baculowirusa zdolnego do ekspresji tego wybranego genu w komórce owada. Sposób ten polega na rozszczepieniu DNA baculowirusa z wytworzeniem fragmentu DNA zawierającego gen polihedryny lub część tego genu, w tym promotor polihedryny. W celu wytworzenia rekombinantowego wektora przeniesienia dokonuje się insercji tego fragmentu DNA do nośnika klonującego, a następnie wprowadza się wybrany gen do tego modyfikowanego nośnika klonującego, tak że znajduje się on pod kontrolą promotora polihedryny. Taki rekombinantowy wektor przeniesienia kontaktuje się z DNA baculowirusa typu dzikiego; ma to na celu homologiczną rekombinację i wprowadzenie wybranego genu do genomu baculowirusa. Okazało się, że baculowirusa Autographa californica (AcMNPV) i związany z nim promotor polihedryny są użyteczne do wytwarzania wirusowego wektora ekspresyjnego o wyjątkowo wysokim poziomie ekspresji wybranego genu w eukariotycznej komórce gospodarza.

Twórcy sugerują, że ten wektor ekspresyjny mógłby być użyty w systemie zwalczania owadów na drodze selekcji genu dla białka, które jest toksyczne w stosunku do szczególnych owadów albo pewnej grupy owadów i klonowania tego genu do wektora ekspresyjnego AcMNPV. Autorzy nadmieniają, że wektor ten mógłby być zastosowany na roślinę lub zwierzę, które ma być chronione. Taki rekombinantowy wirus mógłby wnikać do komórek ściany jelitowej wraz z pokarmem pożeranym przez owada, gdzie mogłaby się zaczynać jego replikacja.

170 630

W alternatywnej propozycji można byłoby dokonać insercji tego genu do genomu baculowirusa tak, aby mogła zachodzić jego fuzja ze strukturalną sekwencją genu polihedryny w taki sposób, aby powłoczką polihedronu była dysocjowana w środowisku alkalicznym jelita owada i uwalniał się toksyczny produkt.

Następny sposób wytwarzania owadobójczych genów i wprowadzania ich do chronionych celów został ujawniony przez Cutler’a w publikacji: Electroporation: Being Developed to Transform Crops: Success with Model Crop Confirmed [(Elektroporacja: Rozwój w kierunku transformacji roślin uprawnych: Potwierdzony sukces z modelową rośliną uprawną), AG Biotech. News, tom 7(5):3 i 17 (1990)]. W artykule tym podano, że metodą elektroporacji DNA może być bezpośrednio wprowadzony do kiełkujących pyłków; pyłki te na powrót umieszczane w kwiatach dają nasiona, z których wyrastają transformowane rośliny. Ten sposób został z powodzeniem zastosowany w roślinach tytoniu i równie dobrze może być zastosowany w kukurydzy i lucernie. Może on być łatwiejszy od elektroporacji protoplastów, gdyż ostatecznym celem jest zapylenie kwiatów i pozwolenie kwiatom robić swoje a nie regeneracja rośliny. Sposób ten polega na zbiorze pyłków, wywołaniu ich kiełkowania w płynie inicjującym kiełkowanie w czasie 30 - 60 minut, po którym to czasie łagiewka pyłkowa zaczyna wychodzić z ziaren pyłku, dodaniu żądanego DNA do ciekłej zawiesiny zawierającej te pyłki, wywołaniu szoku elektrycznego w celu otwarcia porów w łagiewkach pyłkowych, odmyciu nadmiaru DNA, nałożeniu zmienionych pyłków na znamiona słupków rośliny i czekaniu, aż powstaną nasiona. Może to być łatwy sposób wprowadzania genu do roślin uprawnych.

Następny system dostarczania został ujawniony w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 861 595, dotyczącym zastosowania traktowanych, zasadniczo niezmienionych komórek bakteryjnych jako systemu dostarczania związków białkowych do organizmów zwierzęcych i ludzkich. Komórki bakteryjne początkowo wytwarzają białko wewnątrzkomórkowo w wyniku aktywności genu homologicznego. Taki mikroorganizm wytwarzający białko jest traktowany metodami chemicznymi lub fizycznymi przy zasadniczym zachowaniu nienaruszonej komórki. W wyniku manipulacji procesem traktowania powstaje nierozmrażająca się, traktowana komórka bakteryjna bez istotnej straty aktywności wewnątrzkomórkowego związku. Ponieważ komórka nie ulega replikacji i będzie miała trwałą ścianę komórkową, która może być następnie rozerwana w żądanym miejscu układu trawiennego zwierzęcia lub człowieka, istnieje możliwość określonego w czasie i miejscu uwalniania produktów zamkniętych w ten sposób. Po odpowiednim traktowaniu, taką całą komórkę bakteryjną wytwarzającą białko stosuje się jako system dostarczania, tak, że nie jest potrzebne oczyszczanie wytworzonego związku. Materiałem wyjściowym według tego opisu patentowego może być każde białko, polipeptyd, aminokwas lub związek, w tym środek owadobójczy, który może być wytwarzany na drodze mikrobiologicznej.

Możliwość zastosowania technologii DNA do wprowadzenia syntetycznego genu zawierającego kod dla neurotoksyny z jadu skorpionajest opisana przez CaronelFa i wsp. w publikacji Synthesis of gene coding for an insectspecific scorpion neurotoxin and attempts to express it using baculovirus vectors, [(Synteza genu kodującego działającą wybiórczo na owady neurotoksynę skorpiona i próby jego ekspresji z użyciem wektorów baculowirusa) Gene 73; 409-18 (1988)]. W artykule tym opisana jest możliwość zastosowania technologii DNA do wprowadzenia syntetycznego genu kodującego neurotoksynę z jadu skorpiona Buthus eupeus, do genomu baculowirusa w celu ulepszenia baculowirusów jako pestycydów. Badano wytwarzanie toksyny przy trzech metodach ekspresji z zastosowaniem układu ekspresyjnego AcMNPV opartego na promotorze polihedronu. Ekspresja samego genu złożonego z 36 kodonów dawała bardzo niewielkie ilości toksyny. Pewnym osiągnięciem było przyłączenie do toksyny peptydu sygnalnego. Znaczne poziomy białka były wytwarzane wówczas, gdy dokonano fuzji genu toksyny z N-końcem genu polihedronu. Wytwarzanie to było jednak 10 do 20-krotnie mniejsze od tego jakie obserwuje się dla samego polihedronu. Uznano, że ekspresja nie jest ograniczana na poziomie transkrypcji lecz na poziomie post-transkrypcyjnym, włącznie z translacją i procesami stabilizacji białka. Nie wykryto porażającej aktywności wytwarzanych produktów toksyny.

W publikacj i europejskiegozgłoszenia patentowego nr 0431829 ujawniono transgeniczne rośliny, w komórkach których zachodzi efektywna ekspresja toksyny działającej wybiórczo na

170 630 owady pochodząca od drapieżnika polującego na owady w ilości wystarczającej do wywołania toksyczności u wybranych owadów żerujących na tkankach tej rośliny. Opisano tam konkretną toksynę wyizolowaną z jadu skorpiona Androctonus australis.

Wyizolowano również toksyny ekstrahowane z jadu pająków. Geren, w publikacji Neurotoxins and Necrotoxins of Spider Venoma [(Neurotoksyny i nekrotoksyny jadów pająków), J. Toxicol.-Toxin Reviews, 5(2): 161 -170 (1986)], dokonał przeglądu prac nad neurotoksynami i nekrotoksynami. Sugeruje on, że cząsteczki jadu pająków mogą służyć jako substancje modelowe dla specyficznych środków owadobójczych.

W opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 925 664 ujawniono sposoby leczenia serca i chorób neurologicznych przez podanie toksyn pochodzących od pająków Agelenopsis aperta i Hololena curta. Toksyny te wykazują również aktywność specyficznego blokowania kanałów wapniowych lub blokowania receptorów aminokwasów pobudzających, która to aktywność może być użyta do zwalczania owadów i podobnych szkodników.

Przedmiotem publikacji europejskiego zgłoszenia patentowego nr 0 395 357 sąpoliaminy i polipeptydy wyizolowane z jadu pająka Agelenopsis aperta. Poliaminy te działają antagonistycznie na neuroprzekaźniki aminokwasów pobudzających. Polipeptydy i jedna z poliamin blokują natomiast kanały wapniowe w żywych komórkach różnych organizmów. Autorzy rozważają możliwość użycia tych blokerów kanałów wapniowych do zwalczania szkodników bezkręgowych.

W publikacji europejskiego zgłoszenia patentowego nr 0 374 940 opisane są toksyny wyizolowane z jadu pająka Hololena curta. Polipeptydy te mogą znaleźć zastosowanie jako środki owadobójcze i lecznicze, np. jako blokery kanałów wapniowych i antagoniści glutaminianu.

Bowers i wsp. w publikacji: Identification and purification of an irreversible presynaptic neurotoxin from the venom of the spider Hololena curta [(Identyfikacja i oczyszczanie nieodwracalnej presynaptycznej neurotoksyny z jadu pająka Hololena curta), Proc. Natl. Acad. Sei. 84:3506-3510 (1987)], ujawnili białkową neurotoksynę, którą wyizolowali z jadu pająka Hololena curta oraz jej działanie hamujące przewodnictwo nerwowo-mięśniowe u larw Drosophila. Autorzy sugerują, że toksyna ta blokuje kanały wapniowe presynaptyczne w neuronach motorycznych Drosophila.

Quistad i wsp. w publikacji: Paralytic and Insecticidal Toxins from the Funnel Web Spidser, Hololena Curta [(Toksyny porażające i owadobójcze pająka z rośliny Agelenidae, Hololena Curta), Toxicon 29(3):329-336 (1991)] opisali jeden peptyd i dziesięć kurtatoksyn oczyszczonych z jadu Hololena curta oraz ich działanie po wstrzyknięciu do larw motyli.

Stepleton i wsp. w publikacji: Curtatoxina: Neurotoxic insecticidal polypeptides isolated from the funnel-web spider Hololena curta [(Neurotoksyczne owadobójcze polipeptydy wyizolowane z pająka Hololena curta), J. Biol. Chem. 265(4):2054-2059 (1990)], donieśli o trzech polipeptydowych neurotoksynach wyizolowanych z jadu pająka Hololena curta i ich działaniu na świerszcza Acheta domestica.

Quicke i Usherwood w publikacji: Extended Summaries Pesticides Group and Physicochemical and Biophysical Panel Symposium Novel Approches in Agrochemical Research’' [(Rozszerzone podsumowanie Grupy Pestycydów oraz panelowe sympozjum fizykochemiczne i biofizyczne na temat nowych kierunków w badaniach agrochemicznych), Pestic. Sci. 20:315317 (1987)] donoszą, że toksyny znajdujące się w jadach pasożytniczych os i w jadach pewnych pająków z rodziny araneidae, wstrzyknięte owadom, powodują ich szybkie porażenie. Autorzy sugerują, że toksyny pająka są blokerami regulowanych receptorem kationo-selektywnyeh kanałów błonowych, które współdziałają z otwartymi kanałami regulowanymi przez receptory glutaminianowe mięśni szkieletowych szarańczy. Opisali oni toksyny o niskim ciężarze cząsteczkowym obecne w jadach pająków Argiope i Araneus oraz toksyny wyizolowane z gruczołów jadowych pająka Joro, Nephila clavata.

Inne badania dotyczące własności wyizolowanych toksyn z jadu pająków ujawniły zdolność nisko-cząsteczkowych czynników wyizolowanych z jadu pająka z rodziny Agelenidae do odwracalnego wiązania się z kanałami wapniowymi. W opisie patentowym nr WO 89/07608 ujawniono, że te aktywne czynniki o niskim ciężarze cząsteczkowym odwracalnie wiążą się z kanałami wapniowymi z selektywnością i powinowactwem wystarczającym do wygaszania

170 630 poztwoZyistwa wapniowego w neuronach i pozwalających na wyizolowanie i oczyszczenie struktur kanałów wapniowych. JaZy te okazały się toksyczne Zla ssaków.

Inne zastosowania toksyn pająków są opisane przez Jackon’a i Parks’a w publikacji: SpiZer Toxins: Recent Applications in Ntuobbiblbge [(Toksyny pająka: ostatnie zastosowania w ntuoobiologii1, Ann. Rev. N^rosci. 12:405-14- (1989)]. Autorzy piszą, że istnieje ogromna htttrogtyicznbść toksyn pochoZzących z różnych roZzajów taksonomicznych. BaZania świaZczą o specyficznych gatunkowo własnościach kanałów wapniowych; jaZy pajęcze mogą wykazywać właściwości antagonistów kanałów wapniowych. Opisane jaZy pajęcze Zziałają na kręgowce. Autorzy uważają, że jaZy te mogą się stać źróZłem toksyn Zziałających selektywnie na owaZy, przyZatnych w rolnictwie.

W publikacji Isolation anZ Biological Activity of Synaptic Toxins from the Venom of the Funnel Web SpiZer, Agelenopsis Aperta (Izolacja i aktywność biologiczna toksyn synaptycznych z jaZu pająka z roZziny AgeleniZae, Agelenopsis Aperta) zawartej w książce Insect Neurochemistry anZ Neurophysiology, 1986, wyZ. Borkoves i Gelman, Humana Press, New Jersey, 1986, AZams i wsp. piszą, że z pająka Agelenopsis aperta wyizolowano wiele toksyn peptyZowych, które antagonizują przewoZnictwo synaptyczne u owaZów.

W opisie patentowym Stanów ZjeZnoczonych Ameryki nr 4 855 405 ujawniono inhibitor receptora otrzymany z gruczołów jaZowych pająka Joro i sposób jego wytwarzania. Związek ten ma Zziałanie owaZobójszt przy jego kontakcie z owaZem, jeśli jest poZany w f ormie ciekłej lub stałej.

W opisie patentowym Stanów ZjeZnoczonych Ameryki nr 4 918 107 opisano związek o aktywności inhibitora receptora glutamiyianoótgo, sposób wytwarzania tego związku i zawierający go preparat owaZobójczy. Związek, w ciekłym lub stałym nośniku z ZoZatkiem śroZka Zyspergującego, poZaje się btzpośrtZyio na roślinę lub zwierzę, które ma być chronione przeZ owaZami. Jako insektycyZy są skuteczne już niskie Zawki; charakteryzują się one niską toksycznością w stosunku Zo ssaków i ryb i barZzo niewielkim niekorzystnym wpływem na środowisko.

Zastosowanie baculowirusów jako bioinsektycyZów również było baZane. Największą waZą baculowirusów typu Zzikiego jako bioinsektycyZów jest to, że Zziałają powoli. Larwy zakażone Zrogą pokarmową basulowiousem typu Zzikiego na ogół paZają w ciągu 5 Zo 7 Zni. W znacznej części tego czasu takie zakażone larwy nie przestają żerować, co może powoZować znacznie zniszczenie zbiorów.

Ze wzglęZu na wiele złożonych problemów związanych ze stosowaniem syntetycznych śroZków owaZobójczych, takich jak toksyczność, niebezpieczeństwo Zla śroZowiska, zanikanie skuteczności z powoZu rozwoju oZporności, istnieje ciągła potrzeba rozwoju śroZków Zo zwalczania bezkręgowców, w tym rozwoju zmienionych genetycznie rekombmantowesh baculowirusów, wytwarzających białka toksyn unieczenyiajnsesh gospoZarza szybciej niż sama infekcja basulowirustm.

PrzeZmiotem wynalazku jest śroZek owaZobójczy złożony z substancji czynnej i nośnika zawierający jako substancję czynną oczyszczony, owaZobójczy peptyZ wyizolowany z jaZu pająka Diguetia, bąZź akceptowaną w rolnictwie lub ogroZyictóit sól tego peptyZu, mający następującą sekwencję aminokwasową ID nr 1

Ala Lys Asp Gly Asp Val Glu Gly Pro Ala Gly Cys Lys Lys Tyr 5 10 15

Asp Val Glu Cys Asp Ser Gly Glu Cys Cys Xaa Lys Gin Tyr Leu 20 25 30

Trp Tyr Lys Trp Arg Pro Leu Asp Cys Arg Cys Leu Lys Ser Gly

40 45

Phe Phe Ser Ser Lys Cys Val Cys Arg Asp Val

170 630 albo mający następującą sekwencję aminokwasową ID nr 3

Ala Lys Asp Gly Asp Val Lys Gly Pro Ala Gly Cys Met Lys Tyr

15 15

Lys Ser Gly Asp Cys Arg Gly Lys Thr Cys Cys Asp Gin Gin Tyr

22 30

Leu Trp Tyr Lys Trp Arg Asn Leu Ala Cys Arg Cys Phe Thr Val

44 45

GIu Val Phe eys Lys Asp Cys Trp Cyy Asn Asp Ile Ser

55 albo mający następującą sekwencję aminokwasową ID nr 5

Ala Lys Asp (Sil' Asp rCp Glu G I y Pro Pp Gly Xaa Leu Lys Met

15 15

Gly Glu Leu Xaa Lys Gis G^ TGt Xaa Xaa TTr Lys Val Tyr LyL

22 30

Pyr Trp Lys Trp Arg Lys Leu Glu Cys Leu Gly Lys Asn Asp Gly

45 45

Prp Phe Lys Lys Lys LTn he C yC Csp Glu Arg XaaAnn Pro Xaa

55 60

Xaa Xaa

Korzystny środek według wynalazku zawierajako substancję czynnąjad pająka Diguetia canaties.

Owadobójczy peptyd mający sekwencję aminokwasową ID nr 1 ma korzystnie ciężar cząsteczkowy oznaczony metodą spektrometrii masowej około 6371 - 6397 daltonów, który daje jeden pik w chromatografii cieczowej z odwróconymi fazami.

Owadobójczy peptyd mający sekwencję aminokwasową ID nr 3 ma korzystnie ciężar cząsteczkowy oznaczony metodą spektrometrii masowej około 6740 daltonów, który daje jeden pik w chromatografii cieczowej z odwróconymi fazami.

Owadobójczy peptyd mający sekwencję aminokwasową ID nr 5 ma korzystnie ciężar cząsteczkowy oznaczony metodą spektrometrii masowej około 7080 daltonów, który daje jeden pik w chromatografii cieczowej z odwróconymi fazami.

Owadobójczy peptyd mający sekwencję aminokwasową ED nr 1 jest kodowany następującą sekwencjA dNa określoną jako ID nr 2

GCC AAG GAC GGC GAC GTC GAG GGG CCP GCG 00

GGC PGC AAG AAA PAC GAC GPA GAG TGC GAC 50

AGT GGA GAG PGC PGC MMS AAG CAG TAC CTG 90

PGG TAC AAG TGG CGA CCC CTG GAT TGC CGA 120

TGC CTA AAG AGC GGT TTC TTC AGC AGC AAG 150

TGC GTT TGC AGA GAC GTG PAGATTTGAA ATGAAATTCG 188

TGTTCPTPPT PGGPPGTPAGA TGACCTSATG AAACAACTGA 228

CAPGGAAPAAA ACAAAATTGA APGAAPPGAA AAAAAAAAAA 268

AAAAAGC

275

170 630 peptyd o sekwencji aminokwasowej ID nr 3 jest kodowany następującą sekwencją DNA określoną jako ID nr 4

GCC AAG GAT GGC GAT GTC AAG GGA CCT GCT GGC TGC ATG AAG TAC AAG 48

AGC GGA GAC TGC AGA GGC AAA ACT TGC TGC GAC CAA CAG TAC CTC TGG 96

TAC AAG TGG CGG AAT CTT GCA TGC AGG TGC TTC ACG GTC GAA GTG TTC 144

AAG AAG GAC TGC TGG TGC AAC GAC ATC AGT TAATTCCACA TGAAGAAGTA 194

AGCATCTCCT 200 a peptyd o sekwencji aminokwasowej ID nr 5 jest kodowany następującą sekwencją DNA określoną jako ID nr 6

ATATTACAAG CCGCTCCAGT AGCCGAAGAA GCCTAAGCCA AGAACCCAGG

TCCGCCCACA 60

ATG AAG GTT TTT GTT GTA CTG TTG TGC TTG TCT CTG GCA GCA GTT TAC 108

GCC TTG GAG GAA AGA CTA GAC AAA GAC GCC GAC ATC ATG CTT GAT TCA 156

CCA GCC GAC ATG GAA AGA GCG AAG GAC GGT GAC GTG GAA GGG CCT GCG 204

GGC TGC AAG AAA TAC GAC GTA GAG TGC GAC AGT GGA GAG TGC TGC MMS 252

AAG CAG TAC CTG TGG TAC AAG TGG CGA CCC CTG GAT TGC CGA TGC CTA 300

AAG AGC GGT TTC TTC AGC AGC AAG TGC GTT TGC AGA GAC GTG 342

TAGATTTGAA TTCCAAC.

Peptydy owadobójcze będące składnikiem środka według wynalazku wykazują wysoki stopień selektywności w stosunku do bezkręgowców a zwłaszcza owadów. Ponadto, te owadobójcze peptydy okazały się bardzo skutecznymi insektycydami dla owadów ważnych w rolnictwie, a zatem, uważa się, że stanowią istotny wkład w dziedzinie zwalczania szkodników bezkręgowych.

Sposób wytwarzania owadobójczego peptydu wyizolowanego z jadu pająka Diguetia obejmuje etapy: hodowli rekombinantowych komórek gospodarza, uprzednio poddanych transformacji lub transfekcji rekombinantowym wektorem ekspresyjnym, zawierającym sekwencję DNA kodującą owadobójczy peptyd wyizolowany z jadu pająka Diguetia, który to wektor ma zdolność wywoływania ekspresji tej sekwencji kodującej w transformowanych komórkach oraz odzysku tego owadobójczego peptydu z hodowli rekombinantowego gospodarza.

Sposób zwalczania szkodników bezkręgowych z zastosowaniem środka według wynalazku polega na kontaktowaniu tych szkodników ze skuteczną ilością owadobójczego peptydu wyizolowanego z jadu pająka Diguetia lub jego soli akceptowanych w rolnictwie lub ogrodnictwie.

Środek owadobójczy według wynalazku zawiera skuteczną ilość peptydu owadobójczego wyizolowanego z jadu pająka Diguetia lub soli tego peptydu akceptowanych w rolnictwie i ogrodnictwie w nośniku akceptowanym w rolnictwie i ogrodnictwie.

Do wykrywania obecności peptydu owadobójczego wyizolowanego zjadu pająka Diguetia może być użyte przeciwciało w sposobie obejmującym etapy: uzyskania jadu pająka; kontaktowania tego jadu z tymi przeciwciałami sprzężonymi z wykrywalnym znacznikiem; wykryciu znakowanego przeciwciała związanego z tym peptydem.

Przeciwciała można stosować do oczyszczania owadobójczego peptydu wyizolowanego z jadu pająka Diguetia w sposobie obejmującym etapy; koniugowania przeciwciała ze stałym nośnikiem; kontaktowania roztworu zawierającego peptyd z przeciwciałem skoniugowanym ze stałym nośnikiem, dzięki czemu ten peptyd obecny w roztworze przyłącza się do tego przeciw170 630 ciała; usunięcia tego peptydu przyłączonego do przeciwciała skoniugowanego ze stałym nośnikiem; zebrania oczyszczonego peptydu.

Figura 1 przedstawia wynik analizy HPLC z odwróconymi fazami pełnego jadu pająka Diguetia canities w gradiencie 0,1% kwasu trójfluorooctowego (TFA) z acetonitrylem. Widoczne są trzy grupy składników testowanych na myszach. Frakcja 2 reprezentuje składniki aktywne w stosunku do larwy motyla tytoniowego.

Figura 2 przedstawia peptyd DK 9.2 testowany w stężeniu 1 μΜ na przewodnictwo synaptyczne (wzbudzenie piku populacji) w synapsie komórki piramidalnej obocznej - CA i Schaffer’a w skrawkach hipokampu szczura. Przedstawione dane reprezentują uśrednione w czasie zapisy pików populacji (a) na 5 minut przed dodaniem DK 9.2 i (b) w przedziale czasu 15-20 minut po dodaniu DK 9.2. Zapisy te są identyczne, co oznacza, że przy tym stężeniu DK 9.2 nie wykazuje aktywności na ośrodkowy układ nerwowy szczura, co można było stwierdzić w tej próbie.

Figura 3 przedstawia mapę pWR9, wektora przeniesienia opartego na baculowirusie, zawierającego gen kodujący preDK 9.2.

Figura 4 przedstawia wyniki próby ciągłego karmienia noworodków larw motyla tytoniowego dietą wirusową (100.000 jednostek PIB/g diety).

Figura 5 przedstawia zdolność tetrodotoksyny (TTK) zapobiegania lub odwracania wyładowań wywołanych przez DK 9.2.

Stosowany w opisie termin owadobójczy peptyd izolowany z jadu pająka Diguetia obejmuje określone wyżej peptydy aktywne jako środki owadobójcze, oraz owadobójcze fragmenty tych peptydów z dowolnego źródła, o ile tylko peptyd jest izolowany z Diguetia dowolną znaną techniką. Źródła te obejmują np. owadobójcze peptydy produkowane techniką rekombinacji DNA.

Termin wektor ekspresyjny obejmuje wektory, w których zachodzi ekspresja zawartych w nich sekwencji DNA, przy czym te sekwencje są operacyjnie związane z innymi sekwencjami umożliwiającymi tę ekspresję. Zakłada się, jakkolwiek nie zawsze można to bez zastrzeżeń stwierdzić, że te wektory ekspresyjne muszą się replikować w organizmach gospodarza albo jako episomy, albo jako integralna część chromosomalnego DNA. Brak zdolności replikacji sprawiałby, iz byłyby nieskuteczne. Reasumując, 'wektor ekspresyjny jest definicją określającą funkcję i każda sekwencja DNA zdolna do efektywnej ekspresji kodu określonego DNA w niej zawartego jest objęta tym terminem, gdyż stosuje się on do określonej sekwencji. Na ogół, wektory ekspresyjne stosowane w technikach rekombinacji DNA występują często w postaci plazmidów, czyli cząstek kolistego, dwuniciowego DNA, który w formie wektora nie jest związany z chromosomem. Terminy plazmid i wektor stosuje się wymiennie, gdyż plazmid jest najpowszechniej stosowaną formą wektora.

Termin rekombinantowe komórki gospodarza określa komórki, które zostały transformowane wektorami skonstruowanymi z użyciem technik rekombinacji DNA.

Według ostatnich badań, rodzina pająków Digutidae składa się z jednego rodzaju, Diguetia. Gatunki wchodzące w skład rodzaju Diguetia na ogół zamieszkują południowo-zachodnie obszary Stanów Zjednoczonych Ameryki (w tym Kalifornię) i Meksyk. Te małe pająki przędą rozprzestrzeniające się, nieregularne pajęczyny na wielu rodzajach roślin i krzewów, w tym na kaktusach. Różne gatunki Diguetia są, jak większość pająków, drapieżnikami, z łatwością pożerającymi większość typów owadów, które złowią.

Zaobserwowano niezwykłe objawy po wstrzyknięciu owadom owadobójczych peptydów. Objawy te bardzo przypominają te, jakie obserwuje się po wstrzyknięciu owadom weratrydyny, alkaloidu będącego aktywatorem kanałów sodowych albo toksyn skorpiona z rodziny Buthidae i z rodzaju Buthus, o których wiadomo, że są aktywatorami pre-synaptycznych kanałów sodowych. Uważa się, że owadobójcze peptydy mogą powodować częściową depolaryzację błon mięśniowych i/lub nerwowych, co może mieć wpływ na kanały sodowe lub potasowe. Konkretniej, uznaje się, że owadobójcze peptydy wywołują powtarzające się wyładowania w nerwach wrażliwych na blokowanie tetrodotoksyną. Tak więc, jest prawdopodobne, że miejscem działania tych peptydów są zależne od napięcia kanały sodowe w błonach nerwowych.

170 630

Jad pająka można pozyskać z Diguetia w dowolny znany sposób, np. przez ekstrakcję gruczołów jadowych z głowotulowia. Jednak, w celu uniknięcia zanieczyszczeń w jadzie i wyizolowanych toksynach, korzystnie zbiera się jad pająka przez elektryczną stymulację pająków, powodując uwalnianie jadu i następne zassanie, zbierając uwolniony jad i zapobiegając jego zanieczyszczeniu cofającymi się płynami lub hemolimfą, na co zwrócono uwagę w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 925 664.

Po ściągnięciu jadu techniką dojenia elektrycznego, frakcjonuje się go na składniki peptydowe (toksyny) techniką wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) lub techniką chromatografii w żelu albo inną dogodną techniką frakcjonowania. Ponadto, w wielu przypadkach wskazane jest końcowe frakcjonowanie jadu pająka techniką HPLC.

Tak więc, stosując technikę elektrycznego dojenia pająka w połączeniu z chromatografią żelową i/lub wysokosprawną chromatografią cieczową i inne odpowiednie techniki, takie jak chromatografia interakcji hydrofobowej, możliwe jest uzyskanie w zasadzie oczyszczonych toksyn pająka. Należy jednak zaznaczyć, że w celu wyizolowania toksyn pająka można stosować inne równoważne techniki w wyizolowanych toksynach oznacza się sekwencje aminokwasowe i aktywność owadobójczą znanymi sposobami.

Po wyizolowaniu i oczyszczeniu w podany w opisie sposób działającej owadobójczo frakcji zawierającej peptyd, prowadzi się oznaczenie sekwencji aminokwasowej dowolnym znanym sposobem, takim jak sekwencjonowanie rozpoczynane od aminokwasu z końcową grupą aminową lub użycie automatycznego aparatu do sekwencjonowania aminokwasów.

Przypuszcza się, że poza wyszczególnionymi w opisie trzema peptydami, z pająka Diguetia można jeszcze wyizolować inne peptydy o działaniu owadobójczym. Następujące dane odnoszą się do rodziny owadobójczych białek możliwych do wyizolowania z Diguetia. Członkowie tej rodziny owadobójczych peptydów wyizolowanych z Diguetia mają następujące wspólne cechy charak tery sty czne:

1) wielkość: wszystkie posiadają wielkość od około 6200 do około 7200 daltonów i od 55 do około 65 aminokwasów w łańcuchu;

2) zachowawczy (konserwatywny) koniec aminowy: sekwencje ID numery 1, 3 i 5 są identyczne, jeśli chodzi o pierwsze pięć aminokwasów;

3) sekwencje ID numery 1, 3 i 5 wykazują stopień homologii powyżej 40%;

4) sekwencje ID numery 1, 3 i 5 posiadają około 7 do 8 reszt cysternowych;

5) skupiska genów: geny dla ponad jednej z tych toksyn są sekcjami genomowego DNA o wspólnej lokalizacji, co wskazuje, że geny te mogą pochodzić z jednego genu - przodka.

Konkretnie, wyizolowano i scharakteryzowano trzy peptydy owadobójcze. Wyizolowano więc peptyd pierwszy. DK 9.2, a jego sekwencję aminokwasową oznaczono jako produkt translacji wyizolowanego cDNA. Jest ona przedstawiona jako sekwencja ID nr 1. Wyniki spektroskopii masowej wskazują na istnienie dwu izozymów zawierających konserwatywne podstawienie w pozycji 26. Jeden izozym zawiera w pozycji 26 treoninę a drugi zawiera w pozycji 26 glutaminę. Izozym glutaminowy ma masę atomową większą o około 27 jednostek od izozymu treoninowego. W dalszej części opisu, oznaczenie DK 9.2 należy rozumieć jako jeden z izozymów lub obydwa. Ciężar cząsteczkowy DK 9.2 oznaczony metodą spektrometrii masowej wynosi około 6371 - 6397 daltonów; w chromatografii HPLC z odwróconymi fazami daje jeden pik.

Wyizolowany drugi peptyd, DK 11 scharakteryzowano ciężarem cząsteczkowym wynoszącym według oznaczenia metodą spektrometrii masowej około 6700 daltonów lub około 6740 daltonów i pojedynczym pikiem na chromatogramie HPLC z odwróconymi fazami. Konkretnie zidentyfikowano, że ta aktywna frakcja HPLC posiada sekwencję aminokwasową, określoną na podstawie wyizolowanego cDNA, przedstawioną jako sekwencja ID nr 3. W końcu, dotychczas scharakteryzowano trzeciego przedstawiciela tej rodziny białek owadobójczych; DK 12 posiada ciężar cząsteczkowy około 7100 daltonów albo 7080 daltonów według oznaczenia metodą spektrometrii masowej i wędruje jako pojedynczy pik w HPLC z odwróconymi fazami. Tymczasowo uznano, że frakcja ta ma sekwencję aminokwasową przedstawioną jako SEQ nr 5. Te trzy wyizolowane peptydy, odpowiadające sekwencjom SEQ ID nr 1,3 i 5 wykazują w zasadzie taką samą aktywność owadobójczą. Przypuszcza się, że inne peptydy zawierające około 55 do 65 aminokwasów, powyżej 40% homologię z sekwencjami ID nr 1,3 lub 5 i około 7 do 8 reszt

170 630 cysteiny będą wykazywać taką samą aktywność owadobójczą. Takie peptydy mogą istnieć w stanie naturalnym albo mogą być wytwarzane metodami technologii rekombinacji DNA, znanymi specjalistom. Peptydy te, występujące w stanie naturalnym i wytwarzane przez rekombinację DnA stanowią substancję czynną środka według wynalazku.

Wykorzystując opisane powyżej, częściowe dane o sekwencjach aminokwasowych można wyizolować i zidentyfikować geny odpowiedzialne za wytwarzanie białek izolowanych z tego pająka. Wiele metod jest dostępnych dla uzyskania genu odpowiedzialnego za wytwarzanie peptydu. Przykłady takie są zawarte w publikacji Fuqua’y S. i wsp.: A simplePCR method for detection and cloning low abundant transcript [(Prosta metoda CPR wykrywania i klonowania mniej licznych tran skryptów), Biotechnique, tom 9, nr 2 (sierpień 1990)]; Frohman’a M. A.: RACE: Rapid amplification of cDNA enda (Rasa: Szybka amplifikacja końców cDNA), protokoły reakcji pCr, wyd. Innis i wsp., Academic Press, San Diego, CA (1990) oraz w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 703 008 o tytule: DNA Sequences Encoding Erythropoietin (Sekwencje DNA kodujące erytropoetynę).

Najogólniej, syntetyzuje się cząsteczkę DNA, która koduje określoną sekwencję aminokwasową albo reprezentuje nić DNA komplementarną do tej cząsteczki DNA, kodującej tę określoną sekwencję aminokwasową. Taką syntetyczną cząsteczkę DNA można następnie użyć jako sondę do oznaczenia homologii sekwencji DNA w klonach komórkowych zawierających rekombinantowe cząsteczki DNA zawierające w swej części, sekwencje DNA pochodzące z genomowego DNA organizmu, takiego jak pająk lub pochodzące z kopii cDNA cząsteczek mRNA wyizolowanych z komórek lub tkanek organizmu, takiego jak pająk. W zasadzie, do jednoznacznej identyfikacji homologicznego DNA wymagane są cząsteczki DNA o długości piętnastu (15) lub więcej nukleotydów. Ta liczba pozwala na jednoznaczne oznaczenie co najmniej pięciu (5) aminokwasów w sekwencji. Należy zauważyć, że ilość różnych cząsteczek dNa, które mogą kodować określoną sekwencję aminokwasową jest bardzo duża, gdyż każdy aminokwas może być kodowany przez do sześciu (6) unikalnych, trójnukleotydowych sekwencji DNA lub kodonów. Testowanie wszystkich możliwych sond DNA indywidualnie jest zatem niepraktyczne; stosuje się natomiast pule (zbiory) niektórych takich cząstek DNA. Wytwarzanie takich puli, nazywanych sondami zdegenerowanymi jest znane w technice. Należy również zaznaczyć, że podczas gdy tylko jedna cząsteczka DNA w mieszaninie stanowiącej sondę będzie wykazywała dokładną homologię sekwencji z oznaczonym genem, to wiele syntetycznych cząsteczek DNA w puli może jednoznacznie identyfikować ten gen, gdyż wymagany jest tylko wysoki stopień homologii. Tak więc, można dokonać izolacji żądanego genu mając do dyspozycji pulę sond DNA, która to pula sond nie zawiera wszystkich możliwych sekwencji DNa. Na ogół, kodony, które niezbyt często są wykorzystywane przez dany organizm nie muszą być reprezentowane w puli sond. Faktycznie, sondę pojedynczej sekwencji DNA można wytworzyć tylko przez włączenie jedynie tych kodonów DNa dla danego aminokwasu, które są najczęściej używane przez organizm, jakkolwiek trzeba stwierdzić, że podejście to nie zawsze jest uwieńczone powodzeniem.

Jednąz technik identyfikacji sekwencji DNAjest enzymatyczna amplifikacja in vitro, czyli tak zwana reakcja łańcuchowa z udziałem polimerazy (reakcja PCR). Jest ona ujawniona w opisach patentowych Stanów Zjednoczonych Ameryki nr nr 4 683 195 i 4 683 202. Zasadniczo, reakcja PCR pozwala na zsyntetyzowanie wybranej sekwencji DNA wówczas, gdy znane są dwie końcowe części tej sekwencji. Uzyskuje się primery lub sondy oligonukleotydowe, korespondujące z każdym końcem tej sekwencji. Przy stosowaniu reakcji PCR środkową część sekwencji DNA wytwarza się syntetycznie.

Jednym z takich sposobów postępowania z użyciem reakcji PCR do otrzymywania genu kodującego unikalny gen jadu pająka jest wyizolowanie i oczyszczenie RNA pająka. W celu dokonania odwrotnej transkrypcji tego RNA do cDNA stosuje się primer z ogonem dezoksytymidylanowym. Następnie przygotowuje się syntetyczną cząsteczkę DNA lub mieszaninę syntetycznych cząsteczek DNA w formie opisanej powyżej zdegenerowanej sondy zawierających kod dla N-terminalnej sekwencji aminokwasowej białka jadu uprzednio oznaczonego. Tę mieszaninę DNA łącznie z oligonukleotydem z dołączonym ogonem dezoksytymidylanowym stosuje się do zapoczątkowania rekacji PCR. Ponieważ syntetyczna mieszanina DNA użyta do

170 630 zapoczątkowania reakcji PCR jest specyficzna w stosunku Zo żąZanej sekwencji mRNA, to tylko żąZany cDNA bęZzie ulegał amplifikacji. Wytworzony proZukt jest zamplifikowanym cDNA, który można poZZać ligacji z Zowolnym znanym wektorem klonującym. Należy zaznaczyć, że w jaZach pająków mogą występować roZziny peptyZów o poZobnych sekwencjach aminokwasowych i w takich przypaZkach użycie mieszanych sekwencji primerów oligonukltoteZowesh może Zawać amplifikację jeZnego lub większej ilości pokrewnych cDNA koZujących te pokrewne peptyZy.

W końcu, wytworzoną sekwencję cDNA klonuje się Zo oZpowieZniego wektora stosując znane techniki, analizuje się ją i oznacza w niej sekwencję zasaZ yukleotyZoóech. Sekwencje DNA koZ^ące białka owaZobójsze prztZstawiont są jako sekwencje ID nr 2 i ID nr 4. BezpośreZnia translacja uzyskanych proZuktów reakcji PCR Zo aminokwasów ujawnia, że oZpowiaZa ona z całkowitej sekwencji koZująstj Zla Zojrzalego białka.

Poza cDNA koZującym Zojrzałe białko DK 9.2, sklonowano i zsekwencjonowayo sekwencję cDNA w górę oZ sekwencji koZującej DK 9.2. Jest to sekwencja ID nr 7. Translacja całkowitego mRNA ZowioZła, że białko DK 9.2 jest syntetyzowane jako białko prekursorowi posiaZające peptyZ sygnalny i Zojrzałą toksynę. Przypuszcza się, że peptyZ sygnalny ma ważne znaczenie Zla procesu wyZaielania zsyntetezoóanego polipeptyZu. Sekwencja sygnalna pełni ważną rolę w zapewnieniu właściwej lokalizacji nowo zsyntetyzowanego białka. Generalnie, są to sygnały topogeniszne [Blobel G., Proc. Nat. AcaZ. Sci., USA, 77,1496-1500 (1980)], które kierują przyłączoną sekwencję białkową Zo różnych miejsc przeznaczenia w obrębie komórki lub poza komórką. Jest to szczególnie ważne Zla białek wyZaie^ych, których miejsca przeznaczenia znajZują się poza komórką. Jest to również pomocne przy proZukcji rekombinantowych białek, gZyż łatwiej jest oczyszczać białko wyZaielane z płynów pozakomórkowych niż prowaZzić liżę komórek i oczyszczanie· z pełnego ekstraktu komórkowego. Przypuszcza się, że peptyZ sygnalny koZowany przez cDNA koZujący białko prekursorowe dK 9.2 skłaZa się z 17 aminokwasów o następującej sekwencji:

Met-Lys-Val-Phe-Val-Val-Leu-Leu-CysLeu-Ser-Leu-Ala-Ala-Val-Tyr-Ala.

Poza peptyZem sygnalnym, translacja sekwencji mRNA zlokalizowanej w górę oZ sekwencji koZującej DK 9.2 ujawniła propeptyZ. Funkcja tego propeptyZu jest nieznana. SkłaZa się on z 21 aminokwasów o następującej sekwencji:

-Leu-Glu-Glu-Arg-Leu-Asp-Lys-Asp-Ala-Asp-lle-Met-Leu-Asp-Ser-Pro-Ala-Asp-Met-Glu-ArgTe peptyZy prekursorowe lub prepro sekwencja mogą mieć Zuże znaczenie Zla stabilności, ekspresji i pofałZowania DK 9.2 lub innych białek rekombinantowych poZczas ekspresji in vivo i/lub in vitro. ZakłaZa się również, że te sekwencje lub ich części mogą się okazać użyteczne przy ekspresji innych cząsteczek, np. konstrukcji genowych. Dane potwierZzają, że Zo ekspresji rekombinantowego DK 9.2 mogą być użyte inne sekwencje sygnalne i/lub propeptyZowe.

Rekombinantowy wektor ekspresyjny zawiera sekwencję DNA koZującą owaZobójczy peptyZ w aasaZaie izolowany z jaZu pająka Diguetia. Wektor ten umożliwia ekspresję sekwencji koZującej w transformowanych komórkach. Rekombinantowe komórki gospoZarza transformowane lub poZZane transfekcji sekwencją DNA koZują owaZobójczy peptyZ izolowany z jaZu pająka Diguetia, w sposób pozwalający na ekspresję tego peptyZu w komórce gospoZarza.

Uzyskanie oZpowieZniej sekwencji DNA koZującej żnZant białko umożliwia wytwarzanie tego białka z zastosowaniem znanych technik rekombinacji. Sekwencję koZującą można otrzymać pozyskując sekwencję cDNA lub genomową z naturalnego źróZła białka lub na ZroZze syntezy, stosując oZpowieZnią sekwencję aminokwasową określoną na poZstawie sekwencji

170 630 nukleotydowej genu. Jeśli kodujący DNA przygotowuje się syntetycznie, można wykorzystać znaną preferencję kodonów wybranego gospodarza.

Systemy ekspresyjne zawierające potrzebne sekwencje kontrolne, takie jak promotory i korzystnie wzmacniacze i sekwencje kontrolne zakańczania są znane i łatwo dostępne dla wielu rodzajów gospodarzy. Są one opisane np. przez Smbrook’a i wsp. w książce: Melec ular Cloning a Laboratory Manuał, II wyd. Cold Spring Harbor Press (1989).

Tak więc, żądane białka można wytwarzać zarówno w systemach prokariotycznych jak i eukariotycznych, uzyskując w przypadku wielu białek całe spektrum przetwarzanych form.

Najpowszechniej stosowanym systemem prokariotycznym jest E.coli, jakkolwiek uważa się, że B.subtilis i Pseudomonas mogą być również użyteczne. Odpowiednimi sekwencjami kontrolnymi dla systemów prokariotycznych są promotory zarówno konstytutywne jak i indukowane, w tym promotor lac, promotor trp, promotory hybrydowe, takie jak promotor tac, promotor faga lambda Pi. Na ogół, w tych gospodarzach można wytwarzać obce białko albo w postaci białek fuzyjnych albo dojrzałych. Jeśli żądane sekwencje są wytwarzane jako dojrzałe białka to powstająca sekwencja może być poprzedzana metioniną, która nie zawsze jest efektywnie usuwana. Tak więc, peptydy i białka mogą być poprzedzane przez N-terminalną metioninę, jeśli są one wytwarzane w bakteriach. Ponadto, mogą być wytwarzane konstrukcje, w których sekwencja kodująca dany peptyd jest poprzedzana przez operacyjny peptyd sygnalny, w wyniku czego uzyskuje się sekwencję tego białka. W gospodarzach prokariotycznych ta sekwencja sygnalna jest usuwana podczas sekrecji.

Do wytwarzania rekombinantowych obcych białek stosuje się obecnie wiele różnych gospodarzy eukariotycznych można transformować systemami ekspresyjnymi, które wytwarzają żądane białko bezpośrednio, ale częściej wprowadza się sekwencje sygnalne, co umożliwia sekrecję białek. Dodatkową zaletą stosowania systemów eukariotycznych jest to, że mają zdolność przetwarzania intronów, które mogą występować w sekwencjach genomowych kodujących białka organizmów wyższych. Systemy eukariotyczne uruchamiają również wiele mechanizmów przetwarzania, w wyniku których następuje glikozylacja, utlenianie lub derywatyzacja pewnych reszt aminokwasowych, regulacja konformacji i podobne procesy.

Do powszechnie stosowanych systemów eukariotycznych należą drożdże, komórki owadzie, komórki ssaków, komórki ptaków oraz komórki wyższych roślin. Lista ta nie jest wyczerpująca. Znane są odpowiednie promotory, zgodne i funkcjonujące w każdym z tych typów gospodarzy oraz sekwencje zakańczania i wzmacniania, jak np. promotor polihedryny z baculowirusa. Promotory mogą być również konstytutywne lub indukowane. Przykładowo, w systemach ssaków, promotor MTII można indukować dodaniem jonów metali ciężkich.

Szczegóły dotyczące konstruowania systemów ekspresyjnych odpowiednich dla żądanych gospodarzy są znane. W celu wytwarzania białka techniką rekombinacji, poddaje się ligacji DNA kodujące to białko z wybranym systemem ekspresyjnym i transformuje się nim zgodnego z tym systemem gospodarza, po czym prowadzi się hodowlę tego gospodarza, utrzymując go w warunkach, w których zachodzi ekspresja obcego genu. Wytworzone owadobójcze białko odzyskuje się z hodowli albo przez lizę komórek albo z brzeczki hodowli, co jest znane w technice.

Rozumie się, że niewielkie modyfikacje w pierwszorzędowej sekwencji aminokwasowej mogą dawać białka o w zasadzie równoważnej lub wzmożonej aktywności w porównaniu do wymienionych w opisie peptydów. Modyfikacje te mogą występować w wyniku ukierunkowanej mutagenezy albo mogą być przypadkowe, np. w wyniku mutacji zachodzących w gospodarzu wytwarzającym peptyd. Mutacja¹' w białku zmienia jego strukturę pierwszorzędową (w stosunku do powszechnie występującego lub szczególnie opisanego białka) w wyniku zmian w sekwencji nukleotydowej dNa kodującego to białko. Mutacje te dotyczą zwłaszcza wariantów alleli. Zmiany mutacyjne w pierwszorzędowej strukturze białka są wynikiem delekcji, addycji lub podstawień. Terminem delecja definiuje się brak jednej lub większej ilości wewnętrznych reszt aminokwasowych w polipeptydzie. Terminem addycja” definiuje się obecność jednej lub większej ilości dodatkowych wewnętrznych reszt aminokwasowych w polipeptydzie w porównaniu z typem dzikim. Podstawienie jest wynikiem zastąpienia jednej lub kilku reszt aminokwasowych przez inne reszty. Fragmentem białkowym określa się polipeptyd składający się

170 630 z pierwszorzędowej sekwencji aminokwasowej, która jest identyczna z częścią sekwencji pierwszorzędowej białka, z którym ten polipeptyd wykazuje podobieństwo.

Korzystne są podstawienia, konserwatywne, to znaczy takie, w których jedna reszta jest zastąpiona inną resztą tego samego ogólnego typu. Aby to dobrze zrozumieć, aminokwasy występujące w stanie naturalnym można klasyfikować na kwaśne, zasadowe, obojętne lub polarne oraz niepolarne i/lub aromatyczne.

W zasadzie jest korzystne, jeśli peptydy różniące się od formy natywnej zawierają podstawienie kodowane przez kodony dla aminokwasów, które należą do tej samej grupy co zastępowany aminokwas.

Tak więc, zasadowe aminokwasy: Lys, Arg i His są wzajemnie wymienialne; kwaśne aminokwasy: Asp i Glu są wzajemnie wymienialne; obojętne polarne aminokwasy: Ser, Thr, Cys, Gin i Asn są wzajemnie wymienialne; niepolarne alifatyczne aminokwasy: Gly, Ala, Val, Ile i Leu są w stsounku do siebie konserwatywne (ale jeśli chodzi o wielkość, Gly jest bardziej spokrewniony z Ala natomiast Val, Ile i Leu są bardziej pokrewne w stosunku do siebie); oraz aromatyczne aminokwasy Phe, Trp i Tyr są wzajemnie wymienialne.

Ponieważ Pro jest aminokwasem niepolarnym i obojętnym, sprawia on kłopoty z powodu wpływu na konformację; podstawienia przez łub zamiast Pro nie są korzystne, z wyjątkiem przypadków, kiedy uzyskuje się tę samą lub podobną konformację. Polarnymi aminokwasami reprezentującymi zmiany konserwatywne są Ser, Thr, Gin, Asn i w mniejszym stopniu Met. Ponadto, jakkolwiek klasyfikowane w różnych kategoriach, aminokmwasy Ala, Gly i Ser wydają się być wzajemnie wymienialne a Cys dodatkowo pasuje do tej grupy albo może być klasyfikowana w grupie polarnych, obojętnych aminokwasów. Mogą być również użyteczne pewne podstawienia kodowane przez kodony dla aminokwasów z różnych klas.

Białka rekombinantowe można wytwarzać technikami rekombinacji, jak również w automatycznych syntetyzerach aminokwasów. Ze względu na różnorodność procesów posttranslacyjnych zachodzących w różnych komórkach gospodarzy uzyskuje się również różnorodne modyfikacje w stosunku do białek występujących w stanie naturalnym. Modyfikowane białko różni się od białka niemodyfikowanego; wynika to z procesów post-translacyjnych, które zmianiają modele glukozylacji, amidowania albo wiązania z lipidami lub też pierwszo-, drugolub trzecio-rzędową strukturę białka.

Należy również zauważyć, że jeśli białka takie jak sekwencja ID nr 1, wytwarza się syntetycznie, to można wprowadzić podstawienie aminokwasem, który nie jest kodowany przez gen. Do takich alternatywnych reszt należą przykładowo w-aminokwasy o wzorze H2N(CH2)nCOOH, gdzie n oznacza liczbę 2 do 6. Do takich obojętnych, niepolarnych aminokwasów zalicza się sarkozynę (Sar), tert-butyloalaninę (t-BuAla), ter^-l^i^u._vloglicynę (t-BuGly), N-metyloizoleucynę (N-Melle) oraz norleucynę (NLeu). Przykładowo, fenyloglicynę można podstawić na miejsca aromatycznego obojętnego aminokwasu, np. Trp, Tyr albo Phe; cytrulina (Cit) i sulfotlenek metioniny (MSO) są polarne ale obojętne, cykloheksyloalanina (Cha) jest obojętna i niepolarna, kwas cysteinowy (Cya) jest kwaśny a ornityna (Orn) jest zasadowa. Właściwości konformacyjne reszt proliny można uzyskać, jeśli jedną lub więcej tych reszt zastąpi się hydroksyproliną (Hyp).

Owadobójcze peptydy są użyteczne w zwalczaniu bezkręgowych szkodników, takich jak motyle, przy kontaktowaniu tych szkodników ze skuteczną ilością peptydu. Korzystnymi szkodnikami są tu owady.

Preparat owadobójczy zawiera skuteczną owadobójczo ilość peptydu lub jego sól dopuszczalną w rolnictwie i ogrodnictwie w nośniku dopuszczalnym w rolnictwie lub ogrodnictwie.

W immunologii znane są metody wykrywania i oczyszczania peptydów reagujących z przeciwciałami.

Określa się, że przeciwciało ma zdolność wiązania cząsteczki, jeśli swoiście reaguje z tą cząsteczką wiążąc się z nią. Termin epitop oznacza tę część antygenu peptydowego, która jest rozpoznawana i wiązana przez przeciwciało. Antygen może posiadać jeden lub więcej epitopów. Antygen ma zdolność pobudzania zwierzęcia do wytwarzania przeciwciał zdolnych do wiązania się z epitopem tego antygenu. Termin reakcja swoista oznacza, że antygen wchodzi

170 630 w reakcję immunologiczną, w sposób wysoce selektywny, z odpowiedniem dla niego przeciwciałem ale nie z wieloma innymi przeciwciałami, wywoływanymi przez inne antygeny.

Stosowany w opisie termin przeciwciało (Ab) lub prreciwciało monoklonalne (Mab) obejmuje całe cząsteczki oraz jej fragmenty (takie jak np. fragmenty Fab i F(ab')2 zdolne do wiązania antygenu. Fragmenty Fab i F(ab')2 nie zawierają fragmentu Fc całkowitego przeciwciała, są szybciej usuwane z krążenia i mogą się charakteryzować słabszym nie-specyficznym wiązaniem tkankowym niż przeciwciała owadzie.

Przeciwciała wytwarza się różnymi sposobami. Sposoby uzyskiwania takich przeciwciał są znane i szeroko opisane w literaturze [np. Sambrook i wsp., Molecular Cloning; a laboratory manuał (Klonowanie molekularne, podręcznik laboratoryjny, II wyd., Cold Spring Harbor Press, tom 3, 18, 1989)]. Przykładowo, komórki wytwarzające owadobójczy peptyd lub jego fragment można podawać zwierzęciu w celu indukowania wytwarzania surowicy zawierającej poliklonalne przeciwciała zdolne do wiązania tego owadobójczego peptydu. Na ogół, wytwarza się taki fragment owadobójczy peptydu i oczyszcza się go, doprowadzając go do stanu w zasadzie wolnego od naturalnych zanieczyszczeń lub też, sposobami znanymi w technice syntetyzuje się taki fragment owadobójczego peptydu. Zarówno oczyszczony jak i syntetyczny fragment albo kombinację oczyszczonych naturalnych fragmentów i/lub syntetycznego fragmentu wprowadza się do organizmu zwierzęcia pobudzając w ten sposób wytwarzanie poliklonalnej anty-surowicy o większej aktywności swoistej.

Przeciwciała monoklonalne można wytwarzać stosując znaną technologię hybrydów nowotworowych (hybridom). W zasadzie, procedury te polegają na immunizacji zwierzęcia antygenem owadobójczego peptydu. Limfocyty śledziony (splenocyty) takich zwierząt poddaje się następnie ekstrakcji i fuzji z odpowiednią linią komórkową szpiczaka. Można stosować dowolną odpowiednią linię komórek szpiczaka. Po fuzji, mieszańcowe komórki nowotworu utrzymuje się na odpowiedniej pożywce selektywnej, po czym klonuje się metodą ograniczonych rozcieńczeń. Uzyskane w wyniku takiej selekcji komórki hybridoma analizuje się, identyfikując klony wytwarzające przeciwciała zdolne do wiązania antygenu owadobójczego peptydu.

Jeśli źródło peptydu jest zanieczyszczone, wówczas tylko niektóre komórki hybridoma będą wytwarzały przeciwciała zdolne do wiązania się z tym peptydem (inne komórki hybridoma będą wytwarzać przeciwciało wiążące się z zanieczyszczeniami tego preparatu peptydowego). Tak więc, może się okazać niezbędny skrining komórek hybridoma zdolnych do wytwarzania przeciwciał wiążących się z tym peptydem. Taki skrining prowadzi się korzystnie przez inkubację próbki peptydu (lub Jadu) wobec przeciwciała monoklonalnego wytwarzanego z każdej grupy komórek hybridoma i identyfikację każdej komórki hybridoma indukującej powstawanie przeciwciała zdolnego do neutralizacji lub osłabienia zdolności jadu do porażania owada. Po zidentyfikowaniu takiej komórki hybrydomalnej można ją namnażać przez klonowanie w znany sposób w celu wytworzenia swoistych w stosunku do peptydu przeciwciał monoklonalnych.

Dla oczyszczenia naturalnej lub rekombinantowej toksyny owadobójczej techniką chromatografii powinowactwa z przeciwciałem należy zastosować przeciwciało wiążące się w tym owadobójczym peptydem. Na ogół, takim przeciwciałem będzie przeciwciało monoklonalne. Po uzyskaniu przeciwciała monoklonalnego swoistego dla peptydu, można go immobilizować wiążąc go ze stałym nośnikiem i stosować do oczyszczania peptydu z naturalnego jadu albo z innych źródeł, metodą chromatografii powinowactwa, stosując sposoby znane w technice. Sposoby te zapewniają wysoki stopień oczyszczenia i otrzymanie peptydu w zasadzie wolnego od zanieczyszczeń naturalnych. W opisie peptyd określa się jako w zasadzie wolny od naturalnych zanieczyszczeń, jeśli występuje on w formie nie zawierającej związków, z którymi w stanie naturalnym jest normalnie związany (to znaczy z innymi białkami, lipidami, węglowodanami i podobnymi związkami).

Po oczyszczeniu peptydu stosuje się go do immunizacji zwierzęcia (np. myszy lub królika) w celu wywołania wytwarzania przeciwciała poliklonalnego swoistego dla tego peptydu.

Sondy DNA o odpowiednich rozmiarach, na ogół od 10 do 50 nukleotydów, mogą pochodzić z sekwencji DNA kodujących owadobójczy peptyd w zasadzie izolowany z jadu pająka Diguetia. Takie sondy stosuje się do wykrywania obecności DNA kodującego owado18

170 630 bójczy peptyd w zasadzie izolowany z jadu pająka Diguetia przez kontaktowanie jadu z sondą DNA i wykrycie sondy skoniugowanej z tym DNA w znany sposób.

Dla ilustracji szczególnych postaci środka według wynalazku podano następujące przykłady. Materiały i metody

Pająki uzyskano z firmy Spider Pharm. Inc. of Black Canyon City, AZ, która również dokonała identyfikacji gatunku. Pająki Diguetia canities dojono elektrycznie ściągając jad sposobem, w którym stosuje się zabezpieczenia przed zanieczyszczeniem jadu przez zawracające ciecze lub hemolimfę.

Oczyszczanie toksyny - surowy jad (przechowywany w temperaturze -80°C) rozmraża się, dokładnie miesza i przed chromatografią rozpuszcza w 0,1 % kwasie trójfluorooctowym (TFA). Surowy jad frakcjonuje się metodą chromatografii cieczowej z odwróconymi fazami (RPLC), wprowadzając rozpuszczalnik Beckman System Gold 126 i moduły detektorowe z układem fotodiod 168. Jako odczynnik jonowo-kompleksujący stosuje się acetonitryl lub izopropanol w połączeniach z TFA. Do procesów oczyszczania stosuje się następujące kolumny z kolumnami ochronnymi o tej samej matrycy: kolumna Dynamax 300 A RP Cis o wymiarach 25 cm x 4,6 mm średnicy wewnętrznej z wypełnieniem o wielkości cząstek 12 gm; kolumna analityczna Vydac 300 A Cig o wymiarach 25 cm x 4,6 mm średnicy wewnętrznej i o wielkości cząstek 5 gm oraz kolumna pół-preparatywna Vydac 300 A Ci8 o wymiarach 25 cm x 10 mm średnicy wewnętrznej i o wielkości cząstek 5 gm. Detekcji pików dokonuje się przez monitorowanie przy 220 nm i zbieranie frakcji z zastosowaniem kolektora do mikrofrakcji GILSON 208. Po frakcjonowaniu, wszystkie frakcje liofilizuje się do suchej pozostałości i przechowuje się w temperaturze -80°C.

Spektroskopia masowa z bombardującą wiązką elektronów (FaB-MS).

Widma masowe oznaczano na uniwersytecie w Ilinois w spektrometrze masowym VG ZAB-SE w warunkach standardowych dla spektrometrii masowej FAB (ksenon, zdolność rozdzielcza 1000, napięcie przyspieszenia 8 kV, temperatura źródła 40°C). Próbki (około lgg) analizowano w 4 gl tioglicerolu z dodatkiem 25% wodnego roztworu kwasu trójfluorooctowego (TFA; 1,0%).

Przykład I. Wstępne frakcjonowanie i idenfikacja frakcji zawierających owadobójczy peptyd z pełnego jadu Diguetia canities

Ilość 25 gl liofilizowanego pełnego jadu uzyskanego z Diguetia canities w sposób podany uprzednio rozpuszcza się w 0,1% kwasie trójfluorooctowym (TFA) i poddaje frakcjonowaniu metodą chromatografii cieczowej z odwróconymi fazami na pół-preparatywnej kolumnie Vydac RP C18, prowadząc eluowanie z szybkością 3,5 ml/minutę. Stosuje się liniowy gradient eluantu, zaczynając od mieszaniny (85:15) wodnego 0,1% roztworu TFA : 50% acetonitrylu, 0,1% TFA a kończąc na mieszaninie (50 : 50) po 180 minutach.

Frakcja Czas retencji (średni, minuty)

3,^

29,6

48,2

57,1

6^,^

66,4

6^,,7

71,-4

7(7,1

1^^,1

Każdą frakcję zatęża się najpierw przez liofilizację z eluantu a następnie przez liofilizację z wody. Pozostałości przechowuje się w temperaturze -80°C. Do oceny na działanie owadobójcze, każdą frakcję rozpuszcza się w 25 ml buforowanego roztworu soli fizjologicznej. Aktywność owadobójczą frakcji oznacza się w próbach na motylu tytoniowym (Heliothis virescens; TBW) (tabela 1).

Larwom TBW w ilości pięć larw na każdą frakcję podaje się przez injekcję 3 gl testowanego roztworu stosując strzykawkę Hamilton’a o pojemności 50 gl z igłą o grubości oznaczonej

170 630 numerem 33 i ur^Zzenie Zo powtarzalnego mikroZozowama PB 600. Iojek^e poZaje się przez wprowaZzenie igły Zo boszyo-śroZkowej części oZwłoka, w pobliżu oZnóży, w zagięcia, aby uniknąć uszkoZzenia narząZów wewnętrznych. Po injekcji, każZego owaZa umieszcza się w oZZzielnym pojemniku zawierającym sztuczny pokarm. Obserwacje prowaZzi się perioZycznie; porażenie mierzy się po 24 goZzinach oZ iyjeksji. Do wyliczania Zawek bierze się śreZnią masę ciała larwy motyla tytoniowego równą 0,3 g. Grupie owaZów kontrolnych wstrzykuje się tylko buforowany roztwór soli.

Porażenie rozwija się stopniowo i jest poprzeZzane okresem nasilonych skurczy mięśniowych. W ciężkich przypaZkach te skurcze zaczynają się w czasie 15-30 minut oZ injtkcji i stopniowo się nasilają aż Zo całkowitej niezZatności larw. Drżenie czasami utrzymuje się przez czas Złuższy oZ 48 goZzin oZ injekcji. ZZarza się to oZ czasu Zo czasu, nawet przy poZaniu Zawki sub-lttalyej, a larwy ostatecznie powracają Zo normy. Nasilenie Zrżenia jest najbarZziej rzetelnym wskaźnikiem toksyczności; larwy ZoprowaZzone Zo stanu całkowitego porażenia i/lub skurczu ciała nie powracają Zo normy.

Tabela )

Toksyczność frakcji z chromatografii cieczowej z odwróconymi fazami (RPLC) pełnego jadu Diguetia canities na larwy TB W (7,5 jednostek WVE/g owada)*

Frakcja	Początkowe porażenie (%)	Porażenie na 24 godz. (%)*
)	0	0
4	0	0
6	0	0
8	)00	100
9	100	100
)0	)00	100
))	100	100
12	100	100
13	0	0
16	0	0
17	0	0
kontrola	0	0

*Termm Porażenie definiuje się niezdolność owada do odwrócenia się jeśli jest przewrócony na bok lub na plecy.

**Jednostka WVE (równoważnik pełnego jadu) jest to ilość toksyny, która w normalnych warunkachjest obecna w jednym mikrolitrze pełnego, ściągniętego od pająka jadu, 5 jednostek WVE z frakcji 25 pl oznacza 20% odzyskanej ilości.

Przykład II. Oczyszczanie frakcji 9 z jaZu Diguetia canities

Główne skłaZniki aktywnej w stosunku Zo larw motyla tytoniowego frakcji 9 oczyszcza się Zo homogeniczności (Zla każZego jeZno wiZoczne pasmo w elektroforezie SDS-PAGE w zakresie ciężarów cząsteczkowych około 6500 Zakonów) przez jeZną ZoZatkową chromatografię na kolumnie VyZac RP Cie o wymiarach 25 cm x 10 mm śreZnise wewnętrznej stosując liniowy (1,0%/minutę) graZient rozpuszczalników: izopropanol/ 0,1% TFA przy szybkości 3,5 ml/minutę; monitorowanie prowaZzi się przy Zługości fali 220 nm.

Detekcję pików i zbieranie frakcji prowaZzi się jak w przykłaZaie I. Zbiera się Zwie frakcje: pierwszą schoZzącą w 21,81 minucie (frakcja 9.1) i Zrugą, schoZzącą w 22,39 minucie (frakcja 9.2).

Frakcje 9.1 i 9.2 zatęża się przez liofilizację z eluantu a następnie przez liofilizację z woZy, otrzymując oZpowieZnie pozostałości 9.1 i 9.2. Oznaczona czystość liofilizowanych frakcji jest równa lub wyższa oZ 99%. Oznaczono, że frakcja 9.2 uzyskana z 25 pl pełnego jaZu zawiera około 6 pg czystego białka. Pozostałość 9.2 oznacza się na aktywność owaZobójczą wobec motyla tytoniowego w sposób opisany w przyk^Zzie I przez poZanie każZemu z pięciu owaZów injekcji po 6,3 pg pozostałości w buforowanym roztworze soli i pięciu owaZom kontrolnym

170 630 jedynie buforowanego roztworu soli. Owady ocenia się po 24 i po 48 godzinach. Przy odczycie po 24 godzinach wszystkie owady traktowane roztworem pozostałości 9.2 są porażone i następnie giną podczas gdy owady kontrolne są normalne. Nie stwierdza się żadnych zmian po 48 godzinach.

Analiza tego polipeptydu metodą spektroskopii masowej z bombardującą wiązką elektronów wykazuje ciężar cząsteczkowy równy 6371 ±2. Metodą analizy N-terminalnej sekwencji aminokwasowej ustalono częściową sekwencję aminokwasową dla pozostałości 9.2 przedstawioną na sekwencji ID nr 1, aminokwasy 1-33.

LD 50 frakcji 9.2 toksyny Diguetia wobec H. virescens (larwy motyla tytoniowego) wynosi około 1,0 nmola/g. Objawy są podobne do tych jakie obserwuje się przy podaniu pełnego jadu, opisanych w przykładzie I.

Przykład III. Oczyszczanie frakcji II jadu z Diguetia canities.

Postępując w sposób podobny do opisanego w przykładzie II, frakcję 11 wyizolowaną z pełnego jadu Diguetia canities jak w przykładzie I, oczyszcza się dalej metodą chromatografii cieczowej z odwróconymi fazami, uzyskując jedną frakcję. Frakcję tę zatęża się przez liofilizację z eluantu a następnie przez liofilizację z wody. Pozostałość oznaczoną numerem 11 testuje się na aktywność owadobójczą wobec motyla tytoniowego przy stężeniu 5,0 jednostek WVE/g jak podano w przykładzie II. Po 24 godzinach u 80% owadów traktowanych pozostałością 11 obserwuje się a po 48 godzinach porażenie występuje u 60% owadów traktowanych tym peptydem. Owady kontrolne pozostają normalne. Analiza tego polipeptydu metodą spektroskopii masowej z bombardowaniem wiązką elektronów daje ciężar cząsteczkowy równy 6740±2. Metodą analizy N-terminalnej sekwencji aminokwasowej ustalono częściową sekwencję aminokwasową dla pozostałości 11 przedstawioną na sekwencji ID nr 3, aminokwasy 1-29.

Przykład IV. Oczyszczanie frakcji 12 z jadu Diguetia canities

Postępując w sposób podobny do opisanego w przykładzie II, frakcję i 12 wyizolowaną z pełnego jadu Diguetia canities jak w przykładzie I, oczyszcza się dalej metodą chromatografii cieczowej z odwróconymi fazami uzyskując jedną frakcję. Frakcję tę zatęża się przez liofilizację z wody. Pozostałość oznaczoną numerem 12 testuje się na aktywność owadobójczą wobec motyla tytoniowego jak w przykładzie II. Po 24 godzinach u 100% owadów traktowanych pozostałością 12 obserwuje się porażenie a po 48 godzinach porażenie utrzymuje się u 80% owadów traktowanych tą pozostałością. Owady kontrolne pozostają normalne.

Analiza tego polipeptydu metodą spektroskopii masowej z bombardowaniem wiązką elektronów wykazuje ciężar cząsteczkowy równy 708012. Metodą analizy N-terminalnej sekwencji aminokwasowej ustalono próbną częściową sekwencję aminokwasową dla pozostałości 12 przedstawioną na sekwencji ID nr 55.

Ograniczona ilość materiału nie pozwoliła na dokładne oznaczenie toksyczności; w rezultacie pozostałość 9.2 testowano w dawkach (nmoli/g) o 39% i 67% wyższych niż odpowiednio pozostałość 11 i 12. Dawki dobierano tak, aby zawierały zakres od minimalnej dawki letalnej do dawki nie wywierającej żadnego działania ale nie w każdym przypadku to osiągnięto. Uzyskane wyniki wskazują jednak, że badane peptydy wykazują podobną toksyczność. Pozostałość 9.2 wydaje się mieć nieco silniejsze działanie niż pozostałe, ale różnica jest prawdopodobnie mniejsza od wskaźnika 3. Minimalna dawka letalna (100%) dla tych peptydów (pozostałości 9.2, 11 i 12) wynosi od 3,0 do 5,0 nmoli/g. Jest to korzystne porównanie z dostępnymi w handlu środkami owadobójczymi; przykładowo, miejscowa dawka LD50 (SAW) teflubenzuronu wynosi 1,0 nmol/g.

Przykład V. Izolacja genów kodujących dla reszt 9.2 i 11 z jadu Diguetia canities Etap nr 1: Izolowanie RNA

Pająki zbiera się ze źródeł zewnętrznych i identyfikuje jako Diguetia canities. Żywe pająki zamraza się, preparuje się głowotułów i przechowuje go w ciekłym azocie. Następnie prowadzi się eksprakcję RNA z tych głowotułowiów według przepisu podanego przez Chomczyńskiego i Sacchi’ego w Anallttcal IBlochemistry, 162, 156 (1987). Polladenylowany infinrTua^cyip^' RNA (mRNA) oczyszcza się chromatograficznie na oligo d(T) celulozie (Pharmacia lKb, Szwecja).

170 630

Etap nr 2: Synteza cDNA

Informacyjny RNA poddaje się odwrotnej transkrypcji do cDNA stosując odwrotną transkryptazę wirusa białaczki mysiej dostarczoną z Bethesda Research Laboratories, MD, postępując według wskazań producenta. Ilość 20 pl mieszaniny reakcyjnej zawiera bufor enzymu dostarczony w zestawie do syntezy cDNA (Boehringer Mannheim, IN), 50 ng mRNA, 2 jednostki RNazy H, 30 ng primera d(T)Not z firmy Promega, Madison, wI, po 1 mM każdego z trójfosforanów dezoksynukleozydów i 100 pg odwrotnej transkryptazy. Mieszaninę reakcyjną inkubuje się przez godzinę w temperaturze 37°C a następnie przez 10 minut w temperaturze 42°C. Następnie mieszaninę tę strąca się etanolem i zawiesza w 20 pl wody.

Etap nr 3: Synteza primera

Mieszaninę zdegenerowanej sekwencji DNA primera, mogącą zawierać kod dla reszt aminokwasowych i do 8 według sekwencji ID nr 1 przygotowuje się wykorzystując preferencję kodonów drosophila w celu zmniejszenia degeneracji. Primer ten zsyntetyzowano na Uniwersytecie w Utach, będącym jednostką podległą Howard Hyghes Medical Institute.

Etap nr 4: Amplifikacja

Enzymatyczną amplifikacją DNA kierowaną primerem z udziałem termostabilnej polimerazy DNA po raz pierwszy opisał Saikki i wsp. (Science, 239:487 (1988). (Do naszych celów, jako matrycę do reakcji enzymatycznej amplikacji PCR stosuje się 5 pl cDNA z głowotułowia Diguetia i reagenty zawarte w zestawie do amplifikacji DNA GeneAmp™ firmy Perkin Elmer Cetus, CA).

Mieszanina reakcyjna do amplifikacji zawiera primery sensowne i antysensowne w stężeniu 2 uM, po 100 uM każdego tró_|fostoranu dezoksynukieotydu i 4 jednostki termostabilnej rekombinantowej polimerazy Taq I. Reakcję prowadzi się w aparacie DNA Thermal Cyc l er wytwarzanym przez firmę Perkin Elmer Cetus. Selektywną amplifikację genu kodującego pozostałość 9.2 z rodziny pokrewnych toksyn z podobnymi N-końcowymi sekwencjami aminokwasowymi uzyskuje się stosując wysoką temperaturę przyrzażania (58°C). W tych warunkach amplifikuje się pojedynczy DNA o długości około 275 par zasad, jak wynika z oznaczenia metodą elektroforezy w żelu agarozowym. Jeśli się stosuje mniej ostre warunki przyżarzania, wówczas metodą elektroforezy w żelu agarozowym można zidentyfikować ponad pięć zamplifikowanych produktów o rozmiarach od około 200 do 360 par zasad. Te różne produkty reakcji PCR otrzymane w mieszaninach o niskiej mocy prawdopodobnie kodują polipeptydy pokrewne pod względem sekwencji aminokwasowej, średnich rozmiarów i aktywności owadobójczej z sekwencją obecną w pozostałości 9.2. Przypuszcza się, że te pokrewne polipeptydy zawierają polipeptydy z pozostałości 11 i 12, gdyż sekwencje N-terminalne tych polipeptydów są wzajemnie do siebie bardzo podobne i są podobne do reszty 9.2, co jest uwidocznione na sekwencjach ID nr 1, nr 3 i nr 5.

Etap nr 5: Klonowanie produktów reakcji PCR

Produkty reakcji PCR pochodzące zarówno z reakcji o wysokiej jak i o niskiej mocy oczyszcza się usuwając niepr/ereagowane primery, w urządzeniu do rozdziału według wielkości cząsteczek Centncon-100 (Amicon). Odzyskane produkty poddaje się trawieniu enzymem restrykcyjnym Not I (MBR), firmy Milwaukee, WI, odcinającym primer w końcu 3' pozostawiającym lepki koniec. Wektor pKS, dostarczony z firmy Stratagene (LaJolla, CA) trawi się podwójne enzymami EcoR V (z US Biochemical) i Not I, uzyskując miejsca potrzebne dla ukierunkowanego klonowania. Wektor poddaje się ligacji z insertem i transformuje do kompleksu DH5 F'. Skrining kolonii prowadzi się wykorzystując znakowaną ³²P sondę wewnętrzną. Wybrane kolonie charakteryzuje się dalej przez sekwencjonowanie minipreparatów DNA w aparaturze US BiochemicaPa Seąuenase, wersja 2.0 stosując jako primer sondę wewnętrzną.

Całkowite sekwencje DNA insertów cDNA z dwu klonów są przedstawione na sekwencjach ID nr 2 i nr 4. W klonach pochodzących z reakcji PCR o dużej mocy wykryto tylko pierwszy, podczas gdy w klonach pochodzących z reakcji PCR o słabej mocy znaleziono obydwa typy insertów cDNA. Sekwencja aminokwasowa polipeptydu kodowanego przez sekwencję ID nr 2 jest przedstawiona na sekwencji ID nr 1. Sekwencja N-terminalna tego polipeptydu jest identyczna z tą jaką występuje w pozostałości 9.2. Wyliczony ciężar cząsteczkowy tego polipeptydu wynosi 6377,9 daltonów. Przyjmując, że wszystkie cysteiny w naturalnym polipep22 tydzie występują w formie wewnątrzcząsteczkowych wiązań dwusiarczkowych (cystyny), wyliczony ciężar cząsteczkowy wyniósłby 6369,7 daltonów. Tak więc, polipeptyd ten wydaje się identyczny z polipeptydem wyizolowanym z pozostałości 9.2, którego ciężar cząsteczkowy oznaczony metodą spektrometrii masowej wynosi 6371 ±2. Sekwencja aminokwasowa tego polipeptydu kodowanego przez sekwencję ID nr 4 jest przedstawiona na sekwencji ID nr 3. N-terminalna sekwencja tego polipeptydu jest identyczna z oznaczoną dla pozostałości 11. Tak więc, jest to ten sam polipeptyd, jaki wyizolowano w pozostałości 11.

Przykład VI. Toksyczność wobec ssaków

W trzech oddzielnych próbach ilość 5 pl pełnego jadu uzyskanego z D.canities w opisany powyżej sposób, podanego myszom dootrzewnowo (i.p.) okazała się śmiertelna dla tych zwierząt. Traktowane myszy początkowo są nie do odróżnienia od myszy kontrolnych, którym podano jedynie roztwór soli fizjologicznej. Po 10 - 15 minutach od injekcji u traktowanych myszy pojawia się umiarkowana nadaktywność z charakterystycznym biegiem na tylnych łapach. Następnie występuje krótki okres braku koordynacji, ciężkiego oddechu i drgawek. Śmierć następuje w ciągu 2 minut od wystąpienia pierwszych objawów.

Pozostałości 9.2, 11 i 12 wstrzykuje się dootrzewnowo myszom w średnich dawkach odpowiednio 4,2,0,9 i 1,2 mg/kg, nie obserwując działania w ciągu 24 godzin u żadnego z tych trzech peptydów.

Pozostałość 9.2 podaje się w postaci injekcji do komór mózgowych czterem myszom (około 28 g) w dawce około 30 ug na zwierzę (około 1 mg/kg). Nie obserwuje się żadnego działania w czasie 48 godzin od injekcji. U jednej myszy, której podano dootrzewnowo 125 ug (4,2 mg/kg) pozostałości 9.2 również nie obserwuje się żadnej reakcji.

W celu oznaczenia toksyczności tego jadu dla kręgowców bada się na myszach pulowane frakcje uzyskane z chromatograficznego rozdziału (HPLC z odwróconymi fazami) pełnego jadu (fig. 1). Frakcja 2 zawiera składniki wykazujące aktywność wobec motyla tytoniowego (TBW). W dawce równoważnej ilości 25 pl pełnego jadu (WVE), dootrzewnowo podane frakcje 1 i 2 nie wywierają działania; Frakcja 3 daje taki sam efekt jak injekcja pełnego jadu. Wyniki te wskazują na wyraźne oddzielenie działania owadobójczego od działania na kręgowce (toksycznego) związków występujących w jadzie Diguetia canities.

Przykład VII. Wyniki badań elektrofizjologicznych

Wpływ DK 9.2, w stężeniu i pM na przekażnictwo synaptyczne (wzbudzane odchylenia populacyjne) oznacza się na synapsach obocznych komórek piramidalnych CA i skrawków hipokampa szczura. Dane przedstawione na fig. 2 są uśrednionymi w czasie zapisami odchyleń populacyjnych (a) na 5 minut przed podaniem DK 9.2, (b) w czasie 15-20 minut po podaniu DK 9.2. Te zapisy nakładają się na siebie, co wskazuje, że przy tym stężeniu DK 9.2 nie wykazuje takiej aktywności na ośrodkowy układ nerwowy szczura, jaką można byłoby wykryć w tej próbie. W próbie tej wykrywa się wiele różnego rodzaju działań na różne kanały jonowe i receptory neuroprzekaźmków ssaków (T. V. Dunwiddie: The Use of In Vitro Brain Slices in Neuropharmacology, In Electrophysiological Techniques in Pharmacology, wyd, H. M. Geller, Alan R. Liss, Inc., Nowy Jork, 1986). Szczególnie cząsteczki, które zapobiegają inaktywacji kanałów sodowych, takie jak niektóre toksyny skorpiona, powodują mocno wyrażone rozszerzenie ostatniej fazy wzbudzonych odchyleń populacyjnych [Kaneda M., Myama Y., Ikemoto Y. i Akaike N.: Scorpion toxin prolongs as inactivation phase of the voltage-dependent sodium current in rat isolated single hippocampal neurons; Brain Res. 487: 192-195 (1989): Alan L., Mueller, Natural Product Sciences, Inc., obserwacje nieopublikowanej. Odwrotnie, DK 9.2 wykazuje aktywność w preparatach owadzich (mucha domowa) w stężeniach 100 razy niższych, w sposób, który świadczy o zapobieganiu inaktywacji kanałów sodowych owada.

Przykład VIII. Sekwencje cDNA w kierunku 5', kodujące prekursor DK 9.2

W celu uzyskania sekwencji w kierunku 5' cDNA kodującego DK 9.2 syntetyzuje się wewnętrzną część oligonukleotydu odpowiadającą resztom kwasów nukleinowych od 159 do 178 na nici antysensowej sekwencji DNA przedstawionej jako sekwencja ID nr 2. Na końcu 5' tego primera znajduje się miejsce restrykcyjne dla Eco RI. Do jednoniciowej cDNA z gruczołu jadowego (10 pl) dosyntetyzowuje się na końcu 3' ogony reszt dezoksyguanozyny stosując enzym, terminalną transferazę dezoksynukleotydową (dostarczoną z firmy Bethesda Research

170 630

Laboratories). Ilość 20 ul mieszaniny reakcyjnej zawierającej 14 uM enzymu i 500 uM dGTP inkubuje się w temperaturze 37°C w czasie 15 minut. Następnie próbkę strąca się etanolem i zawiesza w 20 ul wody.

Sekwencje DNA w górę od specyficznego primera genu anplifikuje się stosując technikę zakotwiczonej reakcji PCR podobną do tej, jaką stosuje się do sekwencji cDNA w dół od sekwencji cDNA dla dojrzałej toksyny. Amplifikacyjna mieszanina reakcyjna zawiera sensowny, (ognowany a d(C) primer) i primery antysensowne w stężeniu 2 uM, po 100 uM każdego z trójfosforanów dezoksynukleotydowych i 4 jednostki termostabilnej rekombinantowej polimerazy Taq. Stosuje się następujące profile temperatury: 2 minuty w temperaturze 94°C, 2 minuty w temperaturze 37°C, i minuta w temperaturze 37°C. Ten cykl powtarza się dwukrotnie po czym zmienia się program na profil identyczny, wprowadzając podwyższoną temperaturę zgrzewania 54°C w drugim etapie. Taki cykl powtarza się 32 razy.

W wyniku tej zakotwiczonej reakcji PCR uzyskuje się fragment o wielkości 380 par zasad, co stwierdza się po elektroforezie w 4% żelu agarozowym wobec bromku etidium. Produkt reakcji wypełnia się na końcach stosując większy fragment Klenowa DNA polimerazy I z E. coli (Molecular Biology Resouces, Madison, WI), i strąca się etanolem. Z produktu przygotowuje się zawiesinę i trawi enzymem restrykcyjnym Eco RI. Trawiony fragment poddaje się działaniu kinazy T4 wobec 1 mM ATP i następnie ligacji z wektorem pBluescriptsKS uprzednio trawionym przez Eco RI i Eco RV. Podklony analizuje się techniką sekwencjonowania dwuniciowego DNA, stosując Sequenase 2.0 (USB).

Translacja sekwencji cDNA zawartych w regionie w górę od sekwencji dla dojrzałego peptydu toksyny ujawnia, ze DK 9.2 jest syntetyzowana jako białko prekursorowe. Sekwencja górę tego cDNA jest przedstawiona na sekwencji ID nr 6. Kod dla białka prekursorowego składa się z sekwencji sygnalnej i regionu propeptydu (sekwencja ID nr 7) usuwanego podczas powstawania dojrzałego białka toksyny dającego się wyizolować z jadu pająka. Sądzi się, że sekwencje sygnalna i propeptydu są niezbędne do wytwarzania i wydzielania DK 9.2 u pająka.

Przykład IX. Konstruowanie rekombinantowego baculowirusa

Sekwencję sygnalną motyli opisaną przez Jones’a i wsp. [Molecular Cloning Regulation and Complete Sequence of a Hemocyanin-Related Juvenile Hormone-Supressible Protein From Insect Hemolymphs, J. Biol. Chem., 265: 8596 (1990)] konstruuje się z dwóch syntetycznych oligonukleotydów w sposób opisany przez Rossi’ego i wsp. [J. Biol. Chem., 257: 9226 (1982)]. Dwa 48-mery oczyszcza się metodą chromatografii jono-wymiennej. Te dwa oligonukleotydy posiadają wspólnych 11 par zasad sekwencji komplementarnej na końcach 3'. Jeśli te sekwencje zgrzewa się wobec czterech trójfosforanów dezoksyrybonukleozydów i fragmentu Klenowa DNA polimerazy I zachodzi synteza dwuniciowego produktu. Produkty reakcji oczyszcza się metodą chromatografii na hydroksyapatycie, po czym trawi się te dwuniciowe cząsteczki DNA enzymem restrykcyjnym Aat II, odpowiednim do następnej insercji tej sekwencji w kierunku w górę od cDNA dla DK 9.2 klonowanego w plazmidzie pKS-DK9c. Następnie prowadzi się skrining podklonów na obecność insercji tej sekwencji sygnalnej i analizuje się przez sekwencjonowanie DNA.

Sekwencjonowanie DNA potwierdza zgodną z ramką odczytu fuzję tych dwóch sekwencji cDNA. Tę całkowitą syntetyczną konstrukcję genową wycina się i przygotowuje do klonowania do miejsca Nhel w plazmidzie pBluBac, będącym baculowirusowym wektorem przeniesienia [Vialard J. i wsp., J. Virology 64: 3 - 50 (1990)]. Podklony sekwencjonuje się w celu potwierdzenia prawidłowej insercjitej konstrukcji. Sekwencjonowanie DNA plazmidu WR9 potwierdza insercję syntetycznego genu pająka-dostawcy (preDK 9.2) w baculowirusowym wektorze przeniesienia pBLueBac (fig. 3). Użycie wektora pBlueBac przyspiesza proces skriningu, gdyż insercji naszego rekombinantowego genu do genomu baculowirusa towarzyszy ko-ekspresja B-galaktozydazy, co wykrywa się przez zmianę barwy przy wzroście na pożywkach indykacyjnych.

Rekombinantowe baculowirusy kodujące preDK 9.2 wytwarza się przez transfekcję komórek Spodoptera frugiperda, szczep Sf9 (ATCC nr CRL1711) mieszaniną i pg wirusowego DNA AcMNPCV i 2 pg plazmidowego DNA według przepisu podanego przez Summers’a i Smith’a (A. Manual of Methods for Baculowirus Vectors and Insect Cel Culture Procedures, Texas Agricultural Experiment Bulletin, nr 1555, 1988). Po czterech dniach od transfekcji,

170 630 rozcieńczenia supernatantu komórkowego posiewa się na płytki o średnicy 100 m, na które uprzednio wysiano 5 x 10⁶ komórek Sf9 i pokrywa się agarozą zawierającąjako substrat Bluo-gal (dostarczony z firmy Gibso BRL, Gaithersburg, MD). Po 5 do 6 dniach rekombinanty wykrywa się dzięki temu, że dają blado-niebieski kolor. Łysinki zbiera się pipetką Pasteura i rozprowadza w 1 ml pożywki. Taki eluent stosuje się do powtórnej infekcji komórek Sf9 wysianych do kolb T-25. Po 3 dniach od infekcji, z sześciu różnych izolatów zbiera się małe ilości supernatantu i stosuje się do preparowania go wirusowego DNA. W reakcji amplifikacji PCR z użyciem wirusowym, specyficznych primerów z regionu otaczającego gen polihedryny potwierdza się, że pięć z sześciu izolatów wirusowych zawiera prawidłowo usytuowany insert i nie wykazuje zanieczyszczeń typu dziekiego. Następnie przygotowuje się mianowane roztwory podstawowe rekombinantowych wirusów do badań in vivo i in vitro.

Przykład X. Aktywność biologiczna rekombinantowego peptydu DK 9.2

Aktywność biologiczną rekombinantowej pozostałości 9.2 (DSK 9.2) oczyszczonej od pożywki hodowlanej zawierającej surowicę oznacza się na larwach motyla tytoniowego (TBW). Dawki wylicza się na podstawie wartości A280 testowanego roztworu. W dawce 16 gg/g, rekombinantowy materiał powoduje wyraźne skurcze mięśniowe po 2 godzinach od injekcji. Połowa z tych larw (3 z sześciu) ulega porażeniu i silnemu skurczeniu po 48 godzinach podczas gdy u 3 innych larw w dalszym ciągu występują lekkie do umiarkowanych skurcze mięśniowe. Dawka 8 Ltg/g również poraża 3 na 6 larw, podczas gdy dawka 5,2 μg/g poraża 2 na 6 larw. Wyniki potwierdzają, że rekombinantowy materiał DK 9.2 wykazuje aktywność biologiczną.

Przykład XI. Rekombinatowy baculowirus - badania in vitro

A. Aktywność biologiczna rekombinantowego wirusa jądrowej polihedrozy DK 9.2 (vACDK9.2)

1) Mianowanie preparatów wirusowych

Wirusowe preparaty podstawowe mianuje się metodą łysinek opisaną przez Luria’ego i wsp. (General Virology, 1978, str. 21-32; John Wiley and Sons, Nowy Jork). Miana wyraża się w jednostkach tworzących łysinki (PFU) na jednostkę objętości, a dawki wyraża się w jednostkach PFU na larwę. Jedna jednostka PFU jest funkcjonalnym równoważnikiem jednego dojrzałego wirionu (wirusa) w preparacie, w którym każdy wirion ma zdolność zainfekowania jednej komórki gospodarza (Luriai wsp., jak wyżej). Przykładowo, jeśli 103 komórki gospodarza są zarażone przez mikrolitr preparatu wirusowego zawierającego 106 PFU/ml to miano wynosi 103 PFU/ul.

2) Próby biologiczne

Aktywność biologiczną rekombinantowego wirusa jądrowego polihedryny (rNPV) DK 9.2, vacDK9.2, oznacza się w seriach prób, w których prowadzi się oznaczenia zależności od dawki. W próbach tych, larwom motyla tytoniowego (o średniej masie 250 mg) podaje się injekcje różnych dawek vacDK9.2 w pożywce hodowli tkankowej albo samej pożywki hodowlanej tkankowej (n = 10). Tak jak w doświadczeniach injekcji toksyny opisanych w przykładzie I, traktowane larwy utrzymuje się w osobnych pojemnikach, dostarczając karmę i prowadząc okresowo obserwacje. Połączone wyniki dwóch takich prób injekcji wirusowych są przedstawione w tabeli II. W dawkach 5000 jednostek PFU/larwę lub wyższych zaczynają się pojawiać typowe objawy toksyczności DK 9.2 (drżenia mięśniowe i skurcze) po 24 godzinach od injekcji i u co najmnńej połowy testowannch 1 arw występpją objawy nńeedolności ruchhwej (pprażżme lub częściowe ooaażsais) w ciągu 48 go0dln. Najniższa testowana dawka, 50 jednostek PFU/Iżuwę powoduje drżenia i skurcze w czasie 48 godzin i unieruchomienie u co najmniej 70% larw w czasie 96 do 120 godzin.

B. Aktywność biologiczna vAcDK9.2 w porównaniu do NPV typu dzikiego

Dalsze badania prowadzi się w celu oceny skuteczności vAcDK9.2 w porównaniu z wirusem aod0zicislskim typu dzikiego, czyli wirusem jądrowej pollhs0rbzy Autogażphż ożllfbrο^ζ (wt-AcMNNPV). Celem tych badań jest stwierdzenie, czy larwy zainfekowane przez vAcDK9.2 ulegają alsz0blabCci ruchowej w krótszym czasie niż larwy zarażone identyczną dawką wt-AcMNPV.

1) Próby ioje^i

Aktywność bioίbgiozaą vAcDK9.2 i wt-AcMNPV porównuje się w seriach prób iaąekoji. Larwom motyla tytoniowego (^ώ^ viresceas), larwom miernicy kapuścianej (T^choplusia

170 630 ni) i larwom szkodnika buraczanego (Spodoptera exigua) w ostatnim stadium rozwoju podaje się ilości 5 x 19⁵jednostek PFU / larwę wirusa vAcDK9.2 lub wirusa wt-AcMNPV. Kontrolnym larwom podaje się injekcję pożywki hodowli tkankowej. Wyniki przedstawione w tabeli 3 wykazują, vAcDK9.2 jest znacznie bardziej skuteczny niż wt-AcMNNPV w stosunku do wszystkich trzech gatunków.

2) Próby karmienia

W celu zbadania aktywności wirusa vAcDK9.2 podanego drogą pokarmową należy wytworzyć rekombinant polihedryno-ujemny (poi-) w formie zakażającej drogą pokarmową. Dokonuje się tego przez ko-okluzję vAcDK9.2 z wt-AcMNPV stosując sposoby wytwarzania zakażającego drogą doustną poi- rekombinantowych wirusów jądrowej polihedrozy opisane przez innych badaczy [np. Kuroda i wsp. J. Virology 63(4): 1677-1685 (1989) i Price i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. 86: 1453-1456, 1989]. Komórki SF-9 zakaża się jednocześnie wirusem vAcDK9.2 i wt-AcMNPV odpowiednio 10-cio i 2-krotnością infekcji (MOI). W tym samym czasie zakaża się drugą grupę komórek SF-9 samym wt-AcMNPV (wielokrotność = 2). Po 5 dniach od infekacji zbiera się ciała inkluzyjne przez rozerwanie komórek i wirowanie różnicowe (opisane np. przez Wood’a, Virology 104, 392-399, 1980). Ciała inkluzyjne liczy się w hemacytometrze. Komórki, które zostały zakażone zarówno przez vAcDK9.2 jak i wt-AcMNPV wytwarzają mniejszą ilość mniejszych ciał inkluzyjnych niż komórki zakazone samym wtAcMNPV. Wydajność inkluzji polihedralnych(PIB) uzyskanych z infekcji mieszanej wynosi 4,6 PIB/komórkę podczas gdy wydajność z czystej infekcji wt-AcMNPV wynosi 33,3 PIB/komórkę.

W celu oceny aktywności biologicznej ko-okludowanego vAcDK9.2 w porównaniu z wt-AcMNPV wykonuje się próbę podawania doustnego. Inkluzje polihedralne (PEB), mieszane lub typu dziekiego wprowadza się do bezagarowej pożywki owadów w stężeniu 10⁵ PIB/g pożywki. Pożywkę tę umieszcza się w małych pojemnikach i następnie podaje nowo wylęgniętym larwom motyla tytoniowego (jedna larwa na pojemnik, n = 20). Kontrolne larwy karmi się identycznymi ilościami nietraktowanej pożywki. Larwom pozwala się żerować do syta obserwując je okresowo i śledząc rozwój objawów. Wyniki są przedstawione w tabeli II. W ciągu pierwszych 48 godzin nie obserwuje się żadnych objawów ale po 72 godzinach, porażeniu ulega ponad 50% larw karmionych mieszanymi PEB. W tym czasie wirus typu dzikiego nie wywołuje żadnych obajwów. Po 96 godzinach ponad 90% larw traktowanych rekombinantowym wirusem ulega porażeniu podczas gdy tylko 10% larw traktowanych wirusem typu dzikiego zdycha lub kona. Po 120 godzinach zdycha 100% larw traktowanych wirusem rekombinantowym i 75% larw traktowanych wirusem wt-AcMNPV. Tak jak w próbach podawania injekcji, w próbie podawania drogą doustną larwy traktowane wirusem vAcDK9.2 traciły zdolność ruchów w znacznie krótszym czasie niż larwy traktowane wirusem wt-AcMNPV.

Tabela 2

Zależność od dawki działania vAcdk9.2 na motyla tytoniowego . Procent porażenia

Dawka jednostek PFU/larwę	24 godziny	48 godzin	72 godziny	96 godzin	120 godzin
5,1 x 105	0	80	100	100	100
5,1 x 104	0	35	95	100	100
5,1 x 103	0	25	75	90	100
5,1 x 102	0	0	55	85	100
5,1 x 1(0	0	0	20	65	95
Kontrola	0	0	0	0	0

Przykład XII. Promotor dla genu kodującego DK9.2

W celu uzyskania elementów kontrolnych genu kodującego DK 9.2 sporządza się bank genomowy. DNA preparuje się z pająków według przepisu przygotowanego przez Herrmann’a i Frischauf’ a [Methods in Enzymology, tom 152, Academic Press, Inc., str. 180-183, 1987], Ten

170 630

DNA trawi się częściowo enzymem Sau 3A i frakcjonuje przez wirowanie w gradiencie gęstości 10% do 30% sacharozy 25.000 obrotów/minutę rzez 16 godzin w wirówce TLS-55 (Beckman Co., Ltd.). Połączone frakcje zawierające DNA o wielkości 35 do 45 kilozasad przygotowuje się do insercji do trawionego enzymem Xho I wektora kosmidowego metodą częściowego wypełnienia. Jedną czwartą mieszaniny litygacyjnej upakowuje się do cząstek faga stosując aparat Gipak gold™ dostarczony przez formę Stratagene (LaJolla, CA) i po transformacji uzyskuje się równoważnik ponad 3 x 10⁹ par zasad DNA pająka. Bank ten posiewa się na 25 płytek petriego o średnicy 150 mm, po czym przenosi na filtry nylonowe w celu związania z sondą znakowanego DNA.

N astępnie wykonuj e się skrining kolonii na filtrze z banku genomowego Diguetia w seriach ze znakowanym radioaktywnie cDNA kodującym DK 9.2 i ze znakowanymi na końcach oligonukleotydami kodującymi koniec aminowy, koniec karboksylowy i z sondą wewnętrzną. Jedem kosmid, cDK2, hybrydyzuje ze wszystkimi sondami. Przeniesienie Southema trawionego Eco RI kosmidowego DNA wykazuje fragment o wielkości 3.0 kilozasad hybrydyzujący z sondą wewnętrzną i C-terminalną. Dwuniciowe sekwencjonowanie kosmidu cDK2 z użyciem trzech primerów zidentyfikowanych powyżej pozwala na izolację genu dla DK 9.2 i stwarza przypuszczenie, że na tym samym przyległym kawałku DNA mogą znajdować się inne geny z tej rodziny, gdyż N-terminalny oligonukleotyd (który wykazuje wysoki stopień homologii ze wszystkimi owadobójczymi peptydami Diguetia) występuje jako primer w wielu miejscach kosmidowego DNA.

Aby uzyskać region promotora genu dla DK 9.2 syntetyzuje się oligonukleotyd odpowiadający sekwencji pre-sygnalnej na nici sensownej. Reakcja amplifikacji PCR między tym primerem a innymi naszymi specyficznymi w stosunku do genu pnmerami pozwala na usytuowanie sekwencji sygnalnej w miejscu ponad 3000 par zasad w górę od końca aminowego egzonu. Następnie, do sekwencjonowania genomowego DNA w regionie bezpośrednio w górę, do końca 5’cDNA kodującego peptyd sygnalny, stosuje się primer na nici antysensownej.

Tabela 3

Porównanie działania vAcDK 9 2 i wt-AcMNPV podanych drogą injekcji na larwy motyla tytoniowego (TBW), miernicy kapuścianej (CL) i szkodnika buraczanego (BAW)

Traktowanie	Gatunek	24 godz.	48 godz.	72 godz.	96 godz.	120 godz.	168 godz
vAcDK9.2	TBW2	0	0	100	100	100	100
wt-AcMNPV	TBW	03	0	0	0	0	O4
Kontrola	TBW	0	0	0	0	0	0
vAcDK9.2	cl5	0	100	100	100	100	N/A
wt-AcMNPV	CL	0	0	0	0	100	N/A
kontrola	CL	0	0	0	0	0	N/A
vAcDK9 2	BAW6	0	70	901	100	100	100
wt-AcMNPV	BAW	0	0	0	0	0	100
kontrola	BAW	0	0	0	0	0	30

objętości pożywki hodowli tkankowej n = 8; średnia waga larwy = 300 mg dwie spośród ośmiu larw padły z powodu urazu fizycznego podczas injekcji; zostały one wykluczone z dalszych analiz śmiertelność spowodowana przez wt-AcMNPV na 8 dzień wynosiła 100% n = 10; średnia waga larwy = 165 mg n = 20 dla vAcDK9.2; n = 10 dla wt-AcMNPV i kontroli, średnia waga larwy = 200 mg.

Sekwencjonowanie DNA w górę od sekwencji sygnalnej na genomowym DNA wskazuje na obecność innego intronu w miejscu -11 par zasad od nicjacyjnej kodonu metioniny. Primer oligonukleotydowy odpowiadający regionowi 5’cDNA dla prekursora DK 9.2 syntetyzuje się i stosuje do zapoczątkowania reakcji PCR, dla oznaczenia jak duża jest sekwencja wstawkowa między miejscami początku transkrypcji i początku translacji. Produkt amplifikacji o wielkości

170 630

1000 par zasad potwierdza istnienie intronu i pozwala na oszacowanie jego wielkości. Sekwencjonowcnie genomowego DNA w górę od miejsca początku transkrypcji (przyjmując, że jest on równoważny z końcem 5’cDNA) wykazuje obecność promotora. Sekwencja DNA regionu promotora jest przedstawiona na sekwencji nr 8. Ten przypuszczalny promotor zawiera wiele ważnych sygnałów kontroli, występujących na ogół u innych promotorów eukariotycznych w regionie bezpośrednio w górę od miejsca początku translacji. Ten promotor lub sekcje tego promotora można użyć do procesów transkrypcji/translacji innych genów eukariotycznych w bakteriach, wirusach, roślinach lub zwierzętach.

Przykład XIII. Badania neurofizjologiczne nad wyjaśnieniem mechanizmu działanic białka DK 9.2

W celu wyjaśnienia mechanizmu działcnic białka 9.2 prowadzi się badania neurofizjologiczne. Zapisy uzyskane z połączeń nerwowo-mięśniowych i z nerwów obwodowych larw wykazują, że DK 9.2 wywołuje powtarzające się wyładowania rozrywające w nerwach wrażliwych na blok tetrodotoksyną. Miejscem działcnic tej toksyny jest więc prawdopodobnie wrażliwy na napięcie kanał sodowy w błonie nerwowej. Dodatkowe badania wykazują, że DK 9.2 trwale pobudza nerwy obwodowe w stężeniu progowym wynoszącym 10 nM. Ponadto, siła dzicłanic DK 9.2 przewyższa co najmniej 50-krotme toksynę ssaków nr 4 skorpiona Leiurus quinquestriatus.

W niniejszym badaniu jako zwierzęta doświadczalne służą larwy muchy domowej (Musca domestica) w trzecim stadium rozwoju między wylinkami. Larwy unieruchamia się igłami do preparowania owadów i otwiera się grzbietowo przez nacięcie środkowe strzałkowe. Korpus rozpina się płasko i usuwa się trzewka eksponując ścianę umięśnienic. Oddziela się nerwy obwodowe w miejscu, gdzie wychodzą z mózgu i usuwa się mózg. Preparat zanurza się w soli fizjologicznej dla owadów o składzie (wyrażonym w mM): NaCl (140), KCl (5), CaCl₂ (0,75), MgCl₂ (4)-NaHCO₃ (5) i bufor HEPES (5); pH = 7,2.

Do każdego dostępnego pnia nerwowego przyłącza się stymulującą elektrodę ssącą w celu zapisu przekażnictwa nerwowo-mięśniowego. Próg stymulacji powoli podnosi się do czasu zaobserwowania skurczu włókna mięśniowego 6 lub 7. Następnie włókno to mocuje się na wewnątrzkomórkowej mikroelektrodzie rejestrującej, połączonej ze wzmacniaczem wstępnym wewnątrzkomórkowym, stosowanym do rejestracji Pobudzających Potencjałów Post-Synaptycznych (EPSP) w odpowiedzi na stymulację nerwu.

W celu rejestracji wstępującej aktywności elektrycznej w obwodowych włóknach nerwowych łączy się elektrodę ssącą ze wzmacniaczem wstępnym AC. Sygnały wzmacnia się 100-krotnie i moc na wyjściu filtruje się przy 0,3 i 1 kHz. Wszystkie zapisy przekształca się w postać numeryczną w skomputeryzowanym systemie oprzyrządowania MacLab w celu zobrazowania i analizy.

W początkowych badaniach nad działaniem DK 9.2 stosuje się wypreparowane połączenia nerwowo-mięśniowe. Pojedynczy bodziec przyłożony do nerwu obwodowego wywołuje pojedynczy potencjał post-synaptyczny (EPSP) w ścianie umięśnienia larwy. W obecności DK 9.2 pojedynczy bodziec wywołuje wyładowania EPSP o wysokiej częstotliwości. Poza tymi wywołanymi bodźcem wyładowaniami, pojawiają się spontaniczne wyładowania rozrywające utrzymujące się przez kilka minut. Czas trwania takiego wyładowania wynosi na ogół ponad sekundę a częstotliwość potencjałów post-synaptycznych podczas wyładowania wynosi > 30 Hz. Takie wyładowania rozrywające powodują silne skurcze mięśniowe, co sprawia, że utrzymanie rejestrów wewnątrzkomórkowych staje się trudne, gdyż elektroda jest wyrzucana z mięśnia podczas wywołanego wyładowaniem skurczu. Dlatego też‘większość eksperymentów prowadzi się w roztworze soli zawierającym wysokie stężenie sacharozy (300 mM), co osłabia skurcze lecz nie ma wpływu na aktywność elektryczną. Podobne wyniki uzyskuje się stosując albo zwykły roztwór soli albo z wysokim stężeniem sacharozy.

Wyładowania rozrywające obserwowano po traktowaniu DK 9.2. sąpodobne do tych, jakie występują w obecności «-toksyn skorpiona będącymi białkami, o których wiadomo, że wchodzą w interakcję z wrażliwymi na napięcie kanałami sodowymi błon nerwowych. Tak więc, wyładowania rozrywające powinny być blokowane przez specyficzny bloker kanałów sodowych, tetrodotoksynę (TTK). Dzicłcnie TTX zapobiegające lub odwracające wyładowania wywołane przez DK 9.2 jest przedstawione na fig. 5. Na fig. 5a jest uwidocznione, że EPSP są natychmiast blokowane przez stężenie i uM TTX i preparat staje się niewrażliwy na następne traktowanie

170 630 stężeniem 100 nM DK 9.2. Podobne doświadczenie jest przedstawione na fig. 5B, gdzie wyładowania rozrywające są indukowane przez DK 9.2 i odwracane przez następne podanie tTx. W tym doświadczeniu wzbudzenie wyładowania wypiera elektrodę z mięśnia, co powoduje błąd pomiaru, gdy usiłowano ponownie ustabilizować zapis. Po znalezieniu odpowiedniego miejsca zapisu monitorowano wyładowania w czasie około 2 minut, po czym zanikała aktywność preparatu w ciągu sekund po podaniu TTX.

Dla przezwyciężenia trudności związanych z pomiarami wewnątrzkomórkowymi z kurczącego się mięśnia, powtarza się powyższe doświadczenia prowadząc zapisy pozakomórkowe z nerwów obwodowych larw. W zapisach tych rejestruje się aktywność nerwów wstępujących czuciowych oraz samoistną aktywację antydromową (przewodzących w odwrotnym kierunku) włókien motorycznych. Przy stężeniu 70 DK 9.2 powoduje wzrost wyładowań nerowych, na które nie ma wpływu następne traktowanie solą fizjologiczną lecz wyładowania te są natychmiast blokowane stężeniem 0,4 uM TTX. Podanie tTx przed DK 9.2 zapobiega pojawieniu się wyładowań rozrywających.

Dodatkowe badania prowadzi się również dla oznaczenia wrażliwości nerwów owadzich na DK 9.2 i dla porównania siły jego działania ze standardową toksyną skorpiona. DK 9.2 oznacza się na preparacie nerwów obwodowych, wychodząc ze stężenia 1 nM i zwiększając to stężenie co 5 minut albo do zaobserwowania wzrostu aktywności. W tym preparacie, stężenie 1 nM i 5 nM DK 9.2 są nieaktywne ale stężenie 10 nM wzbudza aktywność w tym preparacie po krótkiej zwłoce. Wyniki z pięciu preparatów nerwów stosowanych do oznaczania efektywnego stężenia progowego DK 9.2 na larwy owadów są przedstawione w tabeli 4.

Tabela 4

Stężenie	Ilość prób (traktowanie)	Ilość odpowiedzi	%
Odpowiedź	-	-	-
1 nM	2	0	0
2 nM	1	0	0
5	3	1	33
10 nM	3	3	100

W ostatniej grupie doświadczeń oznacza się w podobny sposób wrażliwość larw owadów na toksynę 4 skorpiona Leiurus quinquestriatus (LqTX 4). Preparaty (n = 4) poddaje się działaniu LqTX 4 w stężeniach do 500 nM bez efektu. Ten wynik jest zgodny z poprzednimi spostrzeżeniami, że LqTX 4 wykazuje selektywne działanie na kanały sodowe ssaków. Następne poddanie tych preparatów na działanie DK 9.2 wymaga dawki 10 - 30 nM aby uzyskać odpowiedź. To lekkie podwyższenie efektywnego stężenia progowego DK 9.2 wynika prawdopodobnie ze słabego działania blokującego tego nieaktywnego LqTX 4. Doświadczenia te wykazują, że DK 9.2 jest przynajmniej 50 razy bardziej aktywny w stosunku do nerwów owadów niż LqTX 4.

Tabela 5

Sekwencja ID	Opis sekwencji
1	sekwencja aminokwasowa DK 9.2
2	sekwencja kodująca cDNA dla DK 9.2
3	sekwencja aminokwasowa DK 11
4	sekwencja kodująca cDNA dla DK 11
5	sekwencja aminokwasowa DK 12
6	całkowita sekwencja cDNA kodująca DK 9.2
7	sekwencja aminokwasowa dla sekwencji sygnalnej/liderowej dla prekursora DK 9.2
8	sekwencja DNA dla promotora regionu DK 9 2

170 630

Wykaz sekwencji (1) INFORMACJA OGÓLNA;

(i) ZGŁASZAJĄCY: Karen J. Krapchc; Bradford Carr Van Wagenen; J. R. Hunter Jackson (ii) TYTUŁ WYNALAZKU: Peptydy owadobójcze (iii) ILOŚĆ SEKWENCJI: 8 (iv) ADRES DO KORESPONDENCJI:

(A) NAZWISKO: Woodcock, Washbum, Kurtz, Mackiewicz i Norris (B) ULICA: one Liberty Place - 46th Floor (C) MIASTO: Philadelphia (D) STAN: Pennsylvania (E) Kraj: Stany Zjednoczone Ameryki (F) Numer kodowy: ZIP: 19103 (v) FORMA CZYTELNA DLA KOMPUTERA:

(A) Dysk miękki: Dyskietka 3,5 calowa, 1.44 Mb (B) Komputer: IBM PS/2 (C) System operacyjny: PC-DOS (D) Program Wordperfect 5.0 (vi) BIEŻĄCE DANE O ZGŁOSZENIU:

(A) Numer zgłoszenia:

(B) Data zgłoszenia:

(C) Klasyfikacja:

(vii) DANE O WCZEŚNIEJSZYM ZGŁOSZENIU:

(A) numer zgłoszenia: 662.373 (B) Data zgłoszenia: 1 marzec 1991 (viii) INFORMACJA O AGENCIE/RZECZNIKU;

(A) Nazwisko: John W. Caldwell, Esq.

(B) Numer rejestracyjny: 28.937 (C) Numer dokumentów: FMC-0054 (ix) INFORMACJA O TELEKOMUNIKACJI:

(A) Telefon: (215)568-3100 (B) Telefax: (215)568-3439 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NR 1 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) Długość : 56 aminokwasów (B) Typ: aminokwas (D) Topologia: nieznana (XI) OPIS SEKWENCJI: sekwencja ID nr 1

Ala Lys Asp Gly Asp Vsl Glu Gly Pro Ala Gly Cys Lys Lys Tyr 6 10 15

Asp Val Glu Cys Asp Ser Gly Glu Cys Cys Xaa Lys Gin Tyr Leu 20 25 30

Trp Tyr Lys Trp Arg Pro Leu Asp Cys Arg Cys Leu Lys Ser Gly

40 45

Phe Phe Ser Ser Lys Cys Val Cys Arg Asp Val

55 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NR 2 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) Długość : 275 par zasad (B) typ: kwas nukleinowy (C) Ilość nici: dwie (D) Topologia: nieznana

170 630 (xi) OPIS SEKWENCJI; sekwencja ID nr 2

GCC AAG GAC GGC GAC GTC GAG GGG CCT GCG 30

Ala Lys Asp Gly Asp Val Glu Gly Pro Ala

5 10

GGC TGC AAG AAA TAC GAC GTA GAG TGC GAC 6₀

Gly Cys Lys lys Tyr Asp Val Glu Cys Asp

20

AGT GGA GAG TGC TGC MMS AAG CAG TAC CTG 9₀

Ser Gly Glu Cys Cys Xaa Lys Gin Tyr Leu

30

TGG TAC AAG TGG CGA CCC CTG GAT TGC CGA 120

Trp Tyr Lys Trp Arg Pro Leu Asp Cys Arg

40

TGC CTA AAG AGC GGT TTC TTC AGC AGC AAG ₁₅₀

Cys Leu Lys Ser Gly Phe Phe Ser Ser Lys

50

TGC GTT TGC AGA GAC GTG TAGATGTGAA ATGAAGATTCG 188

Cys Val Cys Arg Asp Val

TGATCl llll AGGTAAATAT TATCCTAATA ACACTC.CTGT 228

CTAAATTTCC TCTATTTAAT TTATTTTATA CATTATACTA 268

CATTTGC 27 5 (2) INFORMACJA DLA SEKWENCJI ID NR 3 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) Długość:

(B) Typ:

(D) Topologia: nieznana (ii) OPIS SEKWENCJI; sekwencja ID nr 3

Ala Lys Asp Gly Asp Val Lys Gly Pro Ala Gly Cys Met Lys Tyr

10 15

Lys Ser Gly Asp Cys Arg Gly Lys Thr Cys Cys Asp Gin Gin Tyr

25 30

Leu Trp Tyr Lys Trp Arg Asn Leu Ala Cys Arg Cys Phe Thr Val

40 45

Glu Val Phe Lys Lys Asp Cys Trp Cys Asn Asp Ile Ser

55 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NR 4;

(I) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI;

(A) Długość: 204 pary zasad (B) typ: kwas nukleinowy (C) Ilość nici: dwie (D) Topologia: nieznana

170 630 (XI) OPIS SEKWENCJI; sekwencja ID nr 4

GCC AAG GAT GGC GAT GTC AAG GGA CCT GCT GGC TGC ATG AAG TAC AAG 48

Ala Lys Asp Gly Asp Val Lys Gly Pro Ala Gly Cys Met Lys Tyr Lys

10 15

AGC GGA GAC TGC AGA GGC AAA ACT TGC TGC GAC CAA CAG TAC CTC TGG 96

Ser Gly Asp Cys Arg Gly Lys Thr Cys Cys Asp Gin Gin Tyr Leu Trp

25 30

TAC AAG TGG CGG AAT CTT GCA TGC AGG TGC TTC ACG GTC GAA GTG TTC 144

Tyr Lys Trp Atg Asn Leu Ala Cys Arg Cys Phe Thr Val Glu Val Phe

40 45

AAG AAG GAC TGC TGG TGC AAC GAC ATC AGT TAATTCCACA TGAAGAAGTA 194

Lys Lys Asp Cys Trp Cys Asn Asp Ile Ser

55

AGCATCTCCT 204 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID nr 5 (i) CHARAKTTRYSTYYK S EKKWNCCI;

(A) Długość: 62 aminokwasy (B) Typ: aminokwasy (D) Topologia: nieznana (xi) OPIS SEKWENCJI: sekwencja ID nr 5

Ala Lys Asp Gly Asp Phe Glu Gly Pro Pro Gly Xaa Leu Lys Met

5 10 15

Gly Glu Leu Xaa Lys Gly Gly Thr Xaa Xaa Thr Lys Val Tyr Lys

25 30

Tyr Trp Lys Trp Arg Lys Leu Glu Cys Leu Gly Lys Asn Asp Gly

40 45

Trp Phe Lys Lys Lys Phe Ile Cys Asp Glu Arg Xaa Asn Pro Xaa

55 60

Xaa Xaa (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NR 6 (i) CHARARTYRYSTYYT SERTΈRCCI (A) Długość: 359 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Ilość nici: podwójna (D) Topologia: nieznana (xi) OPIS SEKWENCJI; Sekwencja ID nr 6

ATATTAC AAG CCGCTCCAGT AGCCGAAGAA GCCTAAGCCA AGAACCCAGG TCCGCCACA 60

ATG AAG GTT TTT GTT GTA CTG TTG TGC TTG TCT CTG GCA GCA GTT TAC 108

Met Lys Val Phe Val Val Leu Leu Cys Leu Ser Leu Ala Ala Val Tyr

-35 -30 -25

GCC TTG GAG GAA AGA CTA GAC AAA GAC GCC GAC ATC ATG CTT GAT TCA 156

Ala Leu Glu Glu Arg Leu Asp Lys Asp Ala Asp Ile Mei Leu Asp Ser

-20 -15 -10

170 630

CCA GCC GAC ATG GAA AGA GCG AAG GAC GGT GAC GTG GAA GGG CCT GCG 204

Pro Ata Asp Met G'u Arg Ala Lys Asp Gly Asp Val Glu Gly Pro Ala

-5 15 10

GGC TGC AAG A AA TAC GAC GTA GAG TGC GAC AGT GGA GAG TGC TGC MMS 252

Gly Cys Lys Lys Tyr Asp Val Glu Cys Asp Ser Gly Glu Cys Cys Xaa

20 25

AAG CAG TAC CTG TGG TAC AAG TGG CGA CCC CTG GAT TGC CGA TGC CTA 300

Lys Gin Tyr Leu Trp Tyr Lys Trp Arg Pro Leu Asp Cys Arg Cys Leu

35 40

AAG AGC GGT TTC TTC AGC AGC AAG TGC GTT TGC AGA GAC GTG 3-42

Lys Ser Gly Phe Phe Ser Ser Lys Cys Val Cys Arg Asp Val

50 55

TAGATTTGAA TTCCAAC 359 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NR 7 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) Długość : 38 aminokwasów (B) Typ: żmiabkwżsy (C) Ilość nici:

(D) Topologia: nieznana (xi) OPIS SEKWENCJI; Sekwencja ID na 7

Met Lys Val Phe Val Val Leu Leu Cys Leu Ser Leu Ala Ala -35 -30 -25

Val Tyr Ala Leu Glu Glu Arg Leu Asp Lys Asp Ala Asp He

-20 .15

Met Leu Asp Ser Pro Ala Asp Met Glu Arg -10 -5 .1 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NR 8 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) Długość: 421 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Ilość nici: podwójna (D) Topologia: nieznana (xi) OPIS SEKWENCJI; Sekwencja ID na 8

TTTAGCAGCC CAAGGCTACA GAGCTGCCGC ACAGGTAAAC CTGAACTACA CAATGCCCCA 60

TGCCCACGCT CAAACCACAT ACACTCTTTC CCCAACTTTT TTTIT GGTAA AGACAGTTGT 120

TGCATTCTAA AAGCACGTTT TACTGCAGCT GCTCAGACTG TCTGCTGCTG GTCGAGGCAG 110

AGTATGTTTC CTACAGAATT CCACCGAAGC ATTGTTCGTG GTACGACGCA GTAAGCATGA 240

CGCTCAGTTT TTTTTGAATC GGAATATGTA ATATCTGCAG CGACACTTAT TGAAATGTTT 300

CTCCTTCGAC AAGCAATCGC TTTATCGGAA TACCTGCATG ACATAACTGA CAAAACACAT 330

GTGGCTCCAG AAACAACGAA AACATTCATT CCTGTATATA AGTATCGGAG GAGTGCTGTA 420

T 221

170 630

5msec

FIG.2

BamHI8038 H ind ΠΓ 8138 KpnI8468 HindlU 9068 Sali 10088 HindlU 10118 synOK 9.2

_rNheI°766O Psf 17260

BamHI 7250 pUC 8 Amp

Xho 11900

BstΕ I 960 HindlU 0/14348

EcoRI6l6O

SacI5340

EcoRI427O Xba 14210 BamHI 3960

Sal I 3180

Sal 12870 Nsi 12600

FIG. 3

170 630

LARW PORAŻONYCH LUB MARTWYCH

FSG. 4 mV

msec

F1G. 5A

FIG. 5B

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz. Cena 6,00 zł

Claims (12)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Środek owadobójczy zawierający substancję czynną i nośnik, znamienny tym, że jako substancję czynną zawiera oczyszczony, owadobójczy peptyd wyizolowany z jadu pająka Diguetia mający następującą sekwencję aminokwasową ID nr 1

   Ala Lys Asp Gly Asp Val Glu Gly Pro Ala Gly Cys Lys Lys Tyr 5 10 15

   Asp Val Glu Cys Asp Ser Gly Glu Cys Cys Xaa Lys Gin Tyr Leu 20 25 30

   Trp Tyr Lys Trp Arg Pro Leu Asp Cys Arg Cys Leu Lys Ser Gly 05 40 45

   Phe Phe Ser Ser Lys Cys Val Cys Arg Asp Val 50 55 lub akceptowaną w rolnictwie lub ogrodnictwie sól tego peptydu.
2. 2. Środek według zastrz. 1, znamienny tym, że jako substancję czynną zawiera jad pająka Diguetia canaties.
3. 3. Środek według zastrz. 1, znamienny tym, że jako substancję czynną zawiera peptyd o ciężarze cząsteczkowym oznaczonym metodą spektrometrii masowej około 6371-6397 daltonów, który daje jeden plik w chromatografii cieczowej z odwróconymi fazami, bądź akceptowaną w rolnictwie lub ogrodnictwie sól tego peptydu.
4. 4. Środek według zastrz. 1, znamienny tym, że jako substancję czynną zawiera skuteczny owadobójczo peptyd według zastrz. 1 kodowany następującą sekwencją DNA określoną jako ID nr 2

   GCC AAG GAC GGC GAC GTC GAG GGG CCT GCG 00

   GGC TGC AAG AAA TAC GAC GTA GAG TGC GAC 50

   AGT GGA GAG TGC TGC MMS AAG CAG TAC CTG 90

   TGG TAC AAG TGG CGA CCC CTG GAT TGC CGA 120

   TGC CTA AAG AGC GGT TTC TTC AGC AGC AAG 150

   TGC GTT TGC AGA GAC GTG TAGATTTGAA ATGAAATTCG 188

   TGTTCTTTTT TGGTTGTTAGA TGACCTAATG AAACAACTGA 228

   CATGGAATAAA ACAAAATTGA ATGAATTGAA AAAAAAAAAA 268

   AAAAAGC

   275

   170 630
5. 5. Środek owadobójczy zawierający substancję czynną i nośnik, znamienny tym, że jako substancję czynną zawiera oczyszczony, owadobójczy peptyd wyizolowany z jadu pająka Diguetia mający następującą sekwencję aminokwasową ID nr 3

   Ala Lys Asp Gly Asp Val Lys Gly Pro Ala Gly Cys Met Lys Tyr 5 10 15

   Lys Ser Gly Asp Cys Arg Gly Lys Thr Cs^s Cys Asp Gin Gin Tyr

   20 25 30

   Leu Trp Tyr Lys Trp Arg Asn Leu Ala Cys Arg Cys Phe Thr Val

   05 45 45

   Glu Val Phe Lys Lys Asp Cys Trp Cys Asn Asp Ile Ser 50 55 lub akceptowaną w Rolnictwie lub ogrodnictwie sól tego peptydu.
6. 6. Środek według zastrz. 5, znamienny tym, że jako substancję czynną zawiera jad pająka Diguetia canities.
7. 7. Środek według zastrz. 5, znamienny tym, że jako substancję czynną zawiera peptyd o ciężarze cząsteczkowym oznaczonym metodą spektrometrii masowej około 6740 daltonów, który daje jeden plik w chromatografii cieczowej z odwróconymi fazami, bądź akceptowaną w rolnictwie lub ogrodnictwie sól tego peptydu.
8. 8. Środek według zastrz. 5, znamienny tym, że jako substancję czynną zawiera skuteczny owadobójczy peptyd według zastrz. 5 kodowany następującą sekwencją DNA określoną jako ID nr 4

   GCC AAG GAT GGC GAT GTC AAG GGA CCT GCT GGC TGC ATG AAG TAC AAG 58

   AGC GGA GAC TGC AGA GGC AAA ACT TGC TGC GAC CAA CAG TAC CTC TGG 96

   TAC AAG TGG CGG AAT CTT GCA TGC AGG TGC TTC ACG GTC GAA GTG TTC 555

   AAG AAG GAC TGC TGG TGC AAC GAC ATC AGT TAATTCCACA TGAAGAAGTA 595

   AGCATCTCCT 205
9. 9. Środek owadobójczy zawierający substancję czynną i nośnik, znamienny tym, że jako substancję czynną zawiera oczyszczony, owadobójczy peptyd wyizolowany z jadu pająka Diguetia mający następującą sekwencję aminokwasową ID nr 5

   Ala Lys Asp Gly Asp Phe Glu Gly Pro Pro Gly Xaa L_^u Lys Met 5 10 15

   Gly Glu Leu Xaa Lys Gly Gly Thr Xaa Xaa Thr Lys Val Tyr Lys 20 25 (30

   Tyr Trp Lys Trp Arg Lys Leu Glu Cys Leu Gly Lys Asn Asp Gly 05 40 45

   Trp Phe Lls I_lss Lys Phe lle Cys As p du Arcg Xaa Asn Pro Xaa 50 55 60

   Xaa Xaa lub akceptowaną w rolnictwie lub ogrodnictwie sól tego peptydu.
10. 10. Środek według zastrz. 9, znamienny tym, że jako substancję czynną zawierajad pająka

    Diguetia canities.

    170 630
11. 11. Środek według zastrz. 9, znamienny tym, że jako substancję czynną zawiera peptyd o ciężarze cząsteczkowym oznaczonym metodą spektrometrii masowej 7080 daltonów, który daje jeden plik w chromatografii cieczowej z odwróconymi fazami, bądź akceptowana w rolnictwie lub ogrodnictwie sól tego peptydu.
12. 12. Środek według zastrz. 9, znamienny tym, że jako substancję czynną zawiera skuteczny owadobójczy peptyd według zastrz. 9 kodowany następującą sekwencją DNA określoną jako ID nr 6

    ATATTACAAG CCGCTCCAGT AGCCGAAGAA GCCTAAGCCA AGAACCCAGG

    TCCGCCCACA 60

    ATG AAG GTT TTT GTT GTA CTG TTG TGC TTG TCT CTG GCA GCA GTT TAC 108

    GCC TTG GAG GAA AGA CTA GAC AAA GAC GCC GAC ATC ATG CTT GAT TCA 156

    CCA GCC GAC ATG GAA AGA GCG AAG GAC GGT GAC GTG GAA GGG CCT GCG 204

    GGC TGC AAG AAA TAC GAC GTA GAG TGC GAC AGT GGA GAG TGC TGC MMS 252

    AAG CAG TAC CTG TGG TAC AAG TGG CGA CCC CTG GAT TGC CGA TGC CTA 300

    AAG AGC GGT TTC TTC AGC AGC AAG TGC GTT TGC AGA GAC GTG 342

    TAGATTTGAA TTCCAAC.