CN1039332C

CN1039332C - 用杀虫多肽防治害虫的方法

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Publication number: CN1039332C
Application number: CN92101393A
Authority: CN
Inventors: 卡伦·乔安妮·克拉肖; 布拉德福特·卡尔·范瓦格纳; 约翰·伦道夫·亨特·杰克逊
Original assignee: FMC Corp; Natural Product Science Inc
Current assignee: FMC Corp; Natural Product Science Inc
Priority date: 1991-03-01
Filing date: 1992-03-01
Publication date: 1998-07-29
Anticipated expiration: 2007-03-01
Also published as: YU21292A; CZ285487B6; CZ179893A3; ZA921562B; SK87093A3; CN1064684A; PL170630B1; CA2103901A1; BG62194B1; EP0589894A4; WO1992015195A1; JP2591705B2; AU1585492A; MX9200876A; JPH06503229A; IL101081A0; FI933808A; BR9205716A; EP0589894A1; PL168222B1

Abstract

本发明提供了一种自Diguetia canities蜘蛛毒液中可分离到的高效杀虫多肽，制备和应用这种杀虫剂的方法，及编码这些高效杀虫多肽的DNA。

Description

用杀虫多肽防治害虫的方法

本发明与有杀虫效力的多肽有关。特别与如下有关：可从Diguetia蜘蛛毒分离到的有杀虫效力的多肽，编码这些有杀虫效力多肽的DNA，生产上述多肽的方法和控制无脊椎害虫的方法。

近年来，公众已经深刻地意识到与使用人工合成杀虫剂有关的环境危害和对哺乳动物的毒性。因此，这些杀虫剂的使用已经迅速地下降。然而，对有效昆虫控制的需要并末改变。这就促使研究人员去建立新的控制昆虫的方法。

最广泛使用的微生物杀虫剂来自细菌Bacillus thuringiensis(以后简称B.t.)。这种细菌制剂用于控制多种吃叶的鳞翅目幼虫。日本甲虫和蚊子。Karamata等1989年1月10日发表的美国专利号4,797,279阐明了含编码B.t.Kurstakiδ-内毒素的基因和编码B.t.tenebrionisδ-内毒素的基因的杂合细菌细胞以及它们的制备方法。这些杂合子能有效抵抗对B.t.Kurstaki品系敏感的害虫以及对B.t.tenebrionis品系敏感的害虫。一般来说，这些杂合子在杀虫力水平或杀虫力的范围或上述两方面具有有用的杀虫特性优于物理混合母代品系所观察到的结果。把含这些微生物的杀虫混合物以杂合子的有效杀虫量施于昆虫或它们的生存环境中就可以抵抗昆虫。

另一B.t.菌的衍生物发表于欧洲专利申请发行编号为0 325400 A1，属于Gilroy和Wilcox。这项发明与对鳞翅目昆虫有毒性的杂合毒性基因有关。特别地，此发明含有杂合的δ-内毒素基因。它有一部分的B.t.var.Kurstaki HD-73毒素基因和一部分的B.t.var.Kurstaki品系HD-1的毒素基因。此发明阐述了这种编码有抗鳞翅目昆虫活性蛋白的杂合毒素基因(DNA)。

欧洲专利申请发行号0 340 948(属于Wilcox等)，也应用了B.t.菌的杀虫特性。此发明涉及杂合杀虫毒素，它们是为了制备具抗鳞翅目昆虫活性的杂合B.t.毒素而把昆虫肠表皮细胞识别B.t.基因区域与鳞翅目毒素B链融合而产生的。发明指出也许能用这种杂合B.t.基因插入植物中或克隆进棒状病毒中来产生可回收的毒素。或者，这种含杂合B.t.基因的宿主可作为杀虫剂，直接施于靶昆虫的生存环境中。

在寻找杀虫复合物的过程中，蝎子毒被认为是一种可能的具杀虫特性复合物的来源。两种昆虫选择性毒素已从蝎子Leiurusquingquestriatus quinquestriatus毒液中分离出来，由zlotkin等发表在Arch Biochem and Biophysics，240：877-87(1985)，题目为《蝎毒中激活性和抑制性昆虫毒素都影响钠传导并有共同的结合位点》。有关它们的化学和药理性质研究表明一种毒素诱导蝇幼虫快速的激动收缩麻痹，另一种毒素诱导慢速抑制松驰麻痹。两者都影响钠传导。

加拿大专利2,005,658，由Zlotkin等1990年6月19日发表，阐明了一种来源于蝎子Leiurus quinquestriatus hebraeus Buthi-nas，Buthidae的有效杀虫蛋白。这项发明中毒液被冻干并分部分离。对幼虫有最高毒性且对鼠有最低毒性的那部分被进一步纯化，最终产物称为“Lqh P35”。

Grishin(Shemyakin Institute of Bioorganic Chemistry，USSRAcademy of Seiences，Moscow 117988，GSP-1，USSR)发表的《Buthus eupeus和Lucosa singoriensis毒液中的毒素成分》揭示了四种从蝎Buthus eupeus毒液中分离到的昆虫毒素。文章还阐述了塔兰图拉毒蛛Lucosa singoriensis毒液中毒素成分的分离和鉴定。原毒液对昆虫是无毒的。

相应于有关多种杀虫性混合物的研究和发展，研究人员致力于建立产生杀虫基因并把它们引入靶害虫的方法。美国专利编号4,879,236，由Smith和Summers于1989年11月7日发表，涉及了这样一种方法，把一个被选择基因与一个棒状病毒启动子相连引入棒状病毒的基因组中从而产生了一个重组棒状病毒的表达载体。它能在昆虫细胞内表达出被选择基因。这种方法包括切割棒状病毒DNA产生一段DNA含有polyhedrin基因或有polyhedrin启动子的部分polyhedrin基因。为了构建一个重组转移载体，把上述DNA片段插入一个克隆载体然后将被选择基因插入这个修饰过的克隆载体中，这样它就在polyhedrin启动子的控制下，这个重组转移载体然后与野生棒状病毒DNA混合以产生同源重组并把被选择基因整合入棒状病毒的基因组。棒状病毒Autographa california(Ac MN-PV)和与之相关的polyhedrin启动子被发现对形成能在真核宿主细胞中极高表达被选择基因的病毒表达载体是有用的。

发明者们建议通过选择产生对某一特定昆虫或多种昆虫有毒性的蛋白的基因并把它克隆于Ac MNPV表达载体上，这种表达载体可以用于控制昆虫的系统。他们建议这种载体可以施用于要保护的植物或动物上。这种重组病毒能在昆虫摄入后入侵肠壁并开始复制。另一种建议是把基因插入棒状病毒的基因组使它与polyhedrin结构顺序相融合，以致当昆虫肠中碱性环境使多角体外壳解离后，有毒物质就被释放出来。

更一步的构建杀虫基因并把它们引入需保护靶生物的方法已由Cutler阐述，发表在AG Biotech News vol.7(5)：317(1990)，题目为《电穿孔：用于转化农作物：由模式作物证实的成功》。这篇文章指出DNA可以直接用电穿孔进入在萌发的花粉中，花粉可重新放回花中形成种子，然后长成转化植株。这种方法已成功地应用于烟草，可能在玉米和三叶草中也会成功。此方法可能比原生质体电穿孔简单，因为最终目的是授粉并“让花去做这项工作”而不是再生植株。此程序包括收集花粉，让它在萌发液中萌发30-60分钟，之后花粉管将开始伸出花粉粒，在含花粉的悬液中加入需要的DNA，进行电击，在花粉管上打孔，洗去多余的DNA，把变化了的花粉放在植物的柱头上，等待到种子形成。这可能是一种把基因引入作物的简单方法。

另一种传递系统由Barnes和Edwards阐明，于1989年8月29日发表在美国专利编号4,861,595中。此发明涉及把处理过的、实体上完整的微生物细胞作为传递系统，将蛋白复合物送入动物和人体中。这种微生物细胞先通过一个同源基因产生蛋白到细胞内。再用化学或物理方法处理这种产生蛋白的微生物同时保持细胞结构完整。用这种方法程序操作产生的被处理的微生物体不能繁殖，但胞内复合物的活性没有明显降低。因为这种细胞不能复制，它的稳定的细胞壁可以在需要的动物或人类的消化系统区域里分解，所以此发明物可以定时定点地释放被包含的产物。经过合适的处理，这种产生蛋白的微生物细胞本身可以用作传递系统而不需纯化产生的复合物。任何用微生物方法产生的蛋白质、多肽，氨基酸或复合物(包括杀虫剂)都可以作为发明的起始材料。

Carbonell等人探讨了用DNA技术引入编码蝎毒中神经毒素的人工合成基因的可能性，文章发表在Gene 73：409-18(1988)上，题目为《编码一昆虫专一性蝎子神经毒素基因的合成和用棒状病毒载体表达它的尝试》。这篇文章探讨了如下可能性：用DNA技术将编码蝎Buthus eupens毒液中神经毒素的合成基因导入棒状病毒的基因组来提高棒状病毒杀虫性。此文章讨论了三种用以polyhe-dron启动子为基础的Ac MNPV表达系统来影响毒素产生的方法。单是表达36个密码子的基因就可产生少量的毒素。把一信号肽连在毒素上也取得一些成功。把polyhedron基因的N端与毒素基因融合能产生显著量的蛋白。然而检测到的polyhedron本身的量是上述产物量的10到20倍。这种表达的限制被认为不是在转录水平而是在转录后水平包括翻译和蛋白稳定性。没有发现这种毒素产物有麻痹作用。

欧洲专利申请，发行号0 431 829阐明了如下转基因植物，在它们的细胞内，有效地表达一种捕昆虫生物体中的昆虫专一性毒素，其表达量足够使吞噬植物组织的选择性昆虫中毒。被阐明的这种特别毒素是从蝎Androctonus australia毒液中分离的。

研究者们也已能从蜘蛛毒液中抽提到毒素。Geren在J.Toxicol.-Toxin Reviews 5(2)：161-170(1986)发表了《蜘蛛毒液的神经毒素和坏死毒素》，文章评论了有关神经毒素和坏死毒素的工作，并指出蜘蛛毒液分子可以作为特异性杀虫剂的模式。

美国专利发行编号4,925,664是Jackson和Parks在1990年5月15发表的。阐明了用从蜘蛛Agelenopsis aperta和Hololena curta得到的毒素治疗心脏和神经方面疾病的方法。这些毒素也能有效地作为特异的钙通道或激动性氨基酸受体的阻碍物从而抵抗昆虫或相关的害虫。

欧洲专利申请发行编号0 395 357，阐明了从蜘蛛Agelenopsisaperta毒液分离到的多胺和多肽，多胺与激动性氨基酸神经传递物相。这些多肽和其中一种多胺阻碍许多生物体活细胞中的钙通道。文中提到可用上述的钙通道阻碍物来控制无脊椎害虫。

欧洲专利申请发行号0 374 940阐述了从蜘蛛Hololena curta毒液中分离到的毒素。这些多肽能用作杀虫剂，在药学上也有用，例如，作为钙通道和谷氨酸的拮抗物。

Browers等在Proc.Natl.Acad.Sci.84：3506-3510(1987)发表了文章《鉴定和纯化蜘蛛Hololena curta毒液中一种不可逆的突触前膜神经毒素》，阐明了从蜘蛛Hololena curta毒液中分离到的一种蛋白性神经毒素，它能抑制果蝇幼虫的神经肌肉传导。作者指出这种毒素阻碍果蝇运动神经元的突触前膜的钙通道。

Quistad等人在Toxicon 29(3)：329-336(1991)发表了文章《Funnel-web蜘蛛Hololena curta中的麻痹性和杀虫性毒素》，描述了从Hololena curta毒液纯化的一种多肽和十种毒素及其注射入鳞翅目幼虫后的影响。

Stapleton等人在J.Biol.Chem.265(4)：2054-2059(1990)发表文章《毒素：从funnel-web蜘蛛Hololena curta毒液中分离到的神经毒杀虫多肽》，阐明了从蜘蛛Hololena curta毒液分离到的三种多肽神经毒素及其对蟋蟀Acheta domestica的影响。

Quick和Usherwood在Pestic.Sci.20：315-317(1987)上发表文章《Extoncleol Summaries Pesticides Group and Physicochem-ical and Biophysical Panel Symposium Novel Approaches in Agrochemical Research》阐明了寄生蛾和一些orb-web蜘蛛毒液中存在的毒素，当注射入昆虫体内后能引起快速麻痹。作者指出蜘蛛毒素是控制离子选择性膜通道的受体的阻碍物，这些通道与蝗虫骨胳肌中由谷氨酸受体控制的开放通道相互作用。文章不仅提及在Ar-giope和Araneus蜘蛛毒液中的低分子量毒素也提到从Joro蜘蛛Nephila clavata毒腺中分离到的一种毒素。

另一项与分离的蜘蛛毒液毒素性质有关的研究表明从funnel-web蜘蛛毒液中分离到的低分子量因子能可逆地与钙通道结合。cherksey等1989年8月24日发表了WO 89/07608，阐明了这些活性低分子量因子能与钙通道可逆性结合，此结合有足够的特异性和亲和力使神经元的钙传导消失，并可用来纯化钙通道结构。这些毒液对哺乳动物有毒害。

Jackson和Parks讨论了蜘蛛毒素的其它应用，文章发表在Annu Rev Neurosci 12：405-14(1989)，题为《蜘蛛毒素：在神经生物学上的新近应用》。这篇文章讲到不同taxa的毒素有很大的异源性。它指出实验表明钙通道有种特异性，蜘蛛毒液可作为钙通道的拮抗物。被讨论的蜘蛛毒液对脊椎动物有影响。此文章也把蜘蛛毒液当作农业应用方面昆虫特异性毒素的可能来源。

Adams等发表文章《funnel web蜘蛛Agelenopsis Aperta毒液中突触毒素的分离及其生物活性》(《Insect Neurochemistry andNeurophysiology 1986》Borkovec and Gelmaneds.，HumanaPress，New Jersy，1986)。文章讲述了从蜘蛛Agelenopsis aperta分离到多种对昆虫突触传导有拮抗作用的多肽毒素。

美国专利编号4,855,405由Yoshioka等1989年8月8日发表，阐明了从Joro蜘蛛毒腺得到受体抑制物及其操作方法。由液体或固体运载的这种复合物被昆虫接触后即发生杀虫效力。

美国专利编号4,918,107在1990年4月17日由Nakajima等人发表，它与如下有关：一种具有谷氨酸受体抑制活性的复合物。制备这种复合物的程序以及含有这种复合物的一种杀虫混合物。这种复合物用液体或固体载体装载并加入分散剂，直接施于要保护的植物或动物。很低的用量即可有效杀虫，它对哺乳动物和鱼类毒性很低，对环境的不良影响也极小。

用棒状病毒作为生物杀虫剂也已被探讨。野生棒状病毒作为生物杀虫剂的主要缺陷在于它们作用慢。吞噬野生棒状病毒的幼虫一般在5到7天之内死亡。被侵染的幼虫在其间很长一段时间继续进食，破坏大量农作物。

由于与某些合成杀虫剂相关的多种问题，包括毒性、环境危害、由抗性而引起的效力减低，所以持继地需要发展新的无脊椎动物控制方法，包括建立遗传工程重组棒状病毒产生比棒状病毒侵染本身更快地致残宿主的蛋白毒素。

这项发明提供了一种新的有效杀虫多肽，(它是基本纯化的可从Diguetia蜘蛛毒液分离到)和农业或园艺上可接受的多肽的盐。

此杀虫多肽被认为对无脊椎动物特别是昆虫有很高的特异性。而且，已证明此杀虫多肽对农业上重要害虫有极有效的杀虫力因而被认为是对无脊椎害虫控制领域极重要的贡献。

此外，本发明提供了一种新的DNA顺序，它编码了一种Diguetia蜘蛛毒液中的杀虫多肽。

本发明还提供了一种新的重组表达载体，它包含了一段编码Diguetia蜘蛛毒液中的杀虫多肽的DNA顺序，并且该载体能够在转化细胞中有效地表达所述编码顺序。

本发明还提供了一种新的重组宿主细胞，用编码Diguetia蜘蛛毒液中的杀虫多肽的DNA转化或转染得到的重组子细胞能表达此多肽。

本发明还提供了一种新的重组杆状病毒表达载体，它能够在寄主或寄主昆虫细胞中表达编码Diguetia蜘蛛毒液中的杀虫多肽的DNA顺序。

本发明还提供了一种的方法来生产Diguetia蜘蛛毒液中的杀虫多肽，以及生产的多肽。此方法包含以下几步：培养重组宿主细胞，此重组细胞中转化或转染了一种DNA顺序编码Diguetia蜘蛛毒液中的杀虫多肽，所述载体能在转化细胞中有效地表达上述顺序；以及从培养的重组宿主细胞中分离上述杀虫多肽。

本发明还提供了一种新的转基因植物，在该植物的种系中或者在该植物的先代中导入了一段DNA顺序编码Diguetia蜘蛛毒液中的杀虫多肽，通过有性或无性繁殖得到的该转基因植物的后代仍保留有表达此种DNA顺序的性状。

本发明还提供了一种新的方法来控制无脊椎害虫，用有效剂量的Diguetia蜘蛛毒液中的杀虫多肽及其在农业或园艺上可接受的盐来接触所述害虫。

本发明还提供了一种新的方法来控制无脊椎害虫，即用一种重组的杆状病毒接触害虫，该病毒能表达Diguetia蜘蛛毒液中的杀虫多肽及其在农业或园艺上可接受的盐。

本发明还提供了一种新的杀虫剂组成，即在一种农业或园艺上可接受的媒介体中带有的有效杀虫剂量的Diguetia蜘蛛毒液中的杀虫多肽及其在农业或园艺上可接受的盐。

本发明还提供了一种新的抗体能与Diguetia蜘蛛毒液中的杀虫多肽及其农业或园艺上可接受的盐发生免疫反应。

本发明还提供了一种新的方法用上述抗体在检测Diguetia蜘蛛毒液中杀虫多肽的存在：获得蜘蛛毒液；将毒液与带有检测标记的抗体接触；检测所述多肽上的抗体标记。

本发明还提供了一种新方法，用上述抗体来纯化Diguetia蜘蛛毒液的杀虫多肽。此方法包含下述步骤：将抗体与固体支持物偶联；将含有所述多肽的溶液与固体支持物上的抗体接触，使所述多肽吸附到抗体上；将所述多肽从偶联在固体支持物的抗体上洗脱下来；收集纯化的多肽。

本发明还提供了一种新的来源于编码Diguetia蜘蛛毒液中杀虫多肽的核酸顺序的DNA探针。

本发明还提供了一种新的方法来检测编码Diguetia蜘蛛毒液中杀虫多肽的核酸顺序的存在，包含下述几步：获得蜘蛛的核酸；将此核酸与上述DNA探针接触能与DNA结合的探针。

图1是Diguetia canities毒液的RP HPLC图谱，使用0.1％TFA对乙酰基亚硝酸梯度，表明在毒液中检测到的三组成份，第二部分代表TBW活性组分。

图2显示了在大鼠海马切片中，检测DK9.2在1μm浓度下在Schaffer侧-CA1金字塔细胞突触上的突触传递(诱发群体峰)。图中数据代表了平均时间的群体峰记录(a)是DK9.2加入前5分钟(b)是DK9.2加入后的15-20分钟间隙。这些记录是相同的，这表明在这一浓度下，本测试检测不到DK9.2在大鼠CNS中的活性。

图3是pWR9图谱，一种杆状病毒的转移载体带有编码DK9.2前体的基因。

图4是对新生的烟草budworm的连续病毒喂养实验结果(1000,000 PIB/gm喂食量)。

图5表明了TTX的阻止或逆转DK9.2诱导爆发的能力。A.定义.

文中所述的“Diguetia蜘蛛毒液中的杀虫多肽”包括具有杀虫效力的多肽，以及该多肽具有杀虫效力的片断，不管来源如何，而只要它能从Diguetia中以任何已知技术分离得到。例如，来源可以是重组产生的杀虫多肽。

本文中所述的“表达载体”包括能表达所包含的DNA顺序的载体，这样的顺序可以操作连接到其它顺序上以利其表达。尽管没有一直明确指出，它也隐含着这些表达载体能够在寄主生物中以染色体外或整合在染色体上的DNA的形式进行复制。很明显，缺失复制能力将使得它们无法操作。总结起来，“表达载体”是一个功能上的定义，任何DNA序列，只要它能有效地表达所带上的特定DNA片断都包含在这一定义中。一般说来，在重组DNA技术中常用的载体是“质粒”，即指环状双链DNA并且不在染色体上。因为质粒是最常用的载体，所以“质粒”和“载体”可互换使用。尽管如此，本发明也应包括其它逐渐被知的、具有同等功能的表达载体。

“重组宿主细胞”是指用重组DNA技术构建的载体转化所得的细胞”

Diguetia科的蜘蛛现在只包括一个属Diguetis。Diguetis的种主要发现于美国西南部(包括加利福尼亚)和墨西哥。这些小蜘蛛的很多植物和灌木，包括仙人掌上织出扩展的不规则的网。各种Diguetia蜘蛛的种，象大多数蜘蛛一样，主要是捕食者，很容易食用它们捕猎到的大多数种类的昆虫。

虽然本发明并不想被限制在任何理论推理上，但在给昆虫注射杀虫多肽后观察到的不寻常的症状学非常类似于veratridine，一种碱性Na⁺通道促进剂，或者是从Buthidae科和Buthus属中分离到的蝎子毒素——已知的突触前Na⁺通道促进剂注入昆虫体内。一般认为上述多肽可能引进肌肉或神经膜的部分去极化，可能影响了Na⁺或K⁺通道。更专一地讲，上述杀虫多肽诱导了对tetradotoxin阻碍敏感的神经重复释放脉冲。这样，很可能神经膜的对电压敏感的Na⁺通道就是这些肽的作用位点。B.从Diguetis毒液中分离多肽

可以用任何已知方法从Diguetia蜘蛛头胸腺体中抽提毒液。但是，为避免毒液及抽提毒液的污染，最好用电刺激蜘蛛排出毒液，然后抽吸收集毒液，防止因回流或血淋巴造成的污染。(参见U.S.4,925,664)

用电“挤奶”方法取得毒液后，通过高压液相层析(HPLC)，或凝胶过滤层析，或任何其它有效的分离手段将其分离成不同的肽组份(毒素)。当然，最后一步分离用HPLC是最理想的。

这样，用电挤奶技术，以及后面的凝胶过滤、HPLC，或其它有关的分离手段，例如疏水相关层板，就可能获得纯化的蜘蛛毒素。当然，在本发明中使用其它技术分离毒素也是可以的。这样分离得到的毒素即可用常规技术作氨基酸顺序分析或测定杀虫活力。C.杀虫多肽

本发明从其一个方面讲，就是提供了一种杀虫多肽，及其有杀虫活力的片断，并实质上从Diguetia蜘蛛毒液中分离到，制成农业或园艺上可接受的盐。

按前述方法分离并纯化的杀虫多肽，可以用任何已知方法作氨基酸顺序分析，例如N-端氨基酸顺序分析自动氨基酸顺序分析仪。

正象本文所阐述的，本发明的范围也包含其它可能的杀虫多肽，也就是说，包含除了本文所详述的三种外其它从Diguetia分离到的杀虫多肽。下面介绍从Diguetia中分离到的杀虫多肽的一些特性：1)大小：大小范围在6200到7200道尔顿之间，长度为55-65个氨基酸。2)保守的氨基端：SEQ ID NOS：1，前5个氨基酸的3到5个是一样的。3)SEQ ID NOS：1，3，5有40％以上的顺序同源性。4)SEQ ID NOS：1，3，5有大约7或8个半胱氨酸残基。5)基因簇：一个以上的毒素基因在基因组DNA上成簇存在，这表明这些基因有可能来源于一个共祖先。

更专一地讲，现已鉴定并分离了三种杀虫多肽。第一个，DK9.2已经被分离，根据cNDA翻译得到的氨基酸顺序表明就是SEQID NO：1。质谱的数据表明两种同功酶在26位上有一个保守的替代，一个同功酶26位是苏氨酸另一个26位是谷氨酰胺。谷氨酰胺同功酶比苏氨酸同功酶大约27个原子量单位。因DK 9.2可以指两个同功酶或其中的任一个。DK 9.2分子量用质谱测定为约6371-6391dalton，在相反相HPLC上为单一的峰。第二个，DK11分子量为6700dalton，或用质谱测定的6740dalton，在相反相HPLC为单一的峰。更确切说，这一HPLC组分根据cDNA翻译得到的氨基酸顺序如SEQ ID NO：3所示。最后一个被分离的，OK12，分子量大小为7100dalton，或为根据质谱所确定的7080dalton，在相反相HPLC上为单一的峰。并且，这一组分的氨基酸顺序可能就是SEQID NO：5。

相对应于SEQ ID NOS：1，3和5的三种肽杀虫活性几乎相近。可能其它肽有55到65个氨基酸，与SEQ ID NOS：1，3和5有大于40％的顺序同源性，并有大约7到8个半胱氨酸残基，并表现出相同的杀虫活力。这种肽可能天然存在或通过重组DNA技术来合成。不管是天然或重组合成的肽，都包含在本发明范畴中。D.本发明中的杀虫多肽编码顺序的确定。

本发明的另一方面，提供了编码Diguetia蜘蛛毒液中杀虫多肽的DNA顺序。使用前述的部分氨基酸顺序数据，即可分离并确定这些基因。有许多方法来获得基因，例如：Fuqua，S.等的“一个简单的PCR方法检测并克隆低丰度转录产物”，Biotechnique，Vol.9，No.2(Aug 1990)；Frohman，M.A.的“竞赛：cDNA末端的快速扩增”，PCR protocds，Innis等编，Academic Press，Sam Diego，CA，(1990)和美国专利No.4,703,008“编码Erythroprotein的DNA顺序”。

简单地说，可以合成一段决定氨基酸顺序的DNA链或其互补链。这种合成的DNA分子可以用作探针来从基因组或从cDNA克隆与其有同源性的DNA。一般说来，十五个或更多的核苷酸可以唯一地确定一同源DNA，也就是说在至少包含五个氨基酸顺序。编码确定的氨基酸分子的DNA越多越好，因为每个氨基酸都有多至六种密码子。因此，单独地使用每个DNA探针是不合适的，而是几种探针同时使用，也就是该领域中常用的简并探针。虽然在探针混合物中只有一个DNA分子与所欲得到的基因有准确的同源性，但其它的探针也可能唯一地识别该基因，因为只需要较高程度的同源性。所以不需要合成所有的可能的探针便可以克隆到基因。一般来说，在探针库中无需包含生物中不常用密码子。事实上，可以只合成一种探针，该探针中对每个氨基酸都使用最常用氨基酸，当然，这种方法不是总能成功。

确定基因顺序的一种方法是聚合酶链反应(PCR)。参见美国专利4,683,195和4,683,202。实质上，只要已知一段DNA的两端顺序，便可以用PCR方法来合成这一DNA。相对于两端顺序的引物或寡聚核苷酸探针合成以后，便可用PCR来合成中间的DNA。

在一个用PCR来获得蜘蛛毒素基因的方法中，先从蜘蛛中抽提RNA并进行纯化。用一个脱氧胸苷酸尾的寡聚核苷酸作引物将RNA反转录成cDNA。然后制备前面所述的编码毒液蛋白氨基端顺序的简并探针。将此种探针与前述脱氧胸苷酸尾的寡聚核苷酸一起进行PCR反应。因为合成的DNA探针对所需的mRNA有专一性，所以只有所需的cDNA可以有效地扩增，其产物可以连接到一些已知的载体上。尽管如此，应该意识到在蜘蛛毒液中可能存在具有类似氨基酸顺序的一族肽，在这种情况下，可能会使一种或更多种编码相应肽的cDNA在PCR反应中扩增。因为相关的肽也有杀虫活性，所以编码这些肽的基因也在本发明的范畴中。

最后，可以用传统方法将合成的cDNA顺序克隆到合适的载体上，确定碱基的顺序，编码杀虫多肽的顺序，如同在SEQ ID NO：2和4中给出的。将PCR产物翻译成蛋白质表明它们代表了成熟蛋白的全顺序。

除了DK9.2成熟蛋白编码区的cDNA，其上游的cDNA也已经克隆并测序。(SEQ ID NO：7)。将完整的mRNA进行翻译表明，DK9.2的前体包括一信号肽，一前体肽和成熟毒素肽。信号肽的作用被认为是引导肽的分泌，信号顺序对新生肽的定位起关键作用。一般地，它们提供了拓扑信号(Blobel，G.Proc.Nat.Acad.Sci.，U.S.A.77，1496-1500(1980)，从而将所引导蛋白定位于细胞内或细胞外。这对于靶位点为细胞外的分泌蛋白尤其重要。这对于重组蛋白的生产也很有帮助，因为可以从细胞外的培养基中很容易就纯化表达蛋白，而不需要破细胞从总的细胞抽提液中纯化。DK9.2前体蛋白的信号肽由17个氨基酸组成：

Met-Lys-Val-Phe-Val-Val-Leu-Leu-Cys-

Leu-Ser-Leu--Ala-Ala-Val-Tyr-Ala

除了信号肽，DK9.2上游的mRNA还有一前体肽。它的功能还不清楚，有21个氨基酸：

-Leu-Glu-Glu-Arg-Leu-Asp-Iys-Asp-Ala -Asp-Ile-Met-Asp-Ser-Pro-Ala-Asp-Met-Glu-Arg-

这些前体肽或前体肽前的顺序可能对DK9.2的稳定性，表达和折叠很有用。这些顺序或其中一部分对于其它分子的表达例如一个构造的基因可能也很重要。作为本发明的一部分，我们也将提供数据来证明其它的信号肽和前体肽也可以用于重组DK9.2的表达中。E.重组表达

本发明还提供了一个重组表达载体，它包含了一段DNA顺序编码Diguetia蜘蛛毒液中的杀虫多肽。载体可以使编码顺序在转化细胞中表达。本发明也提供了用杀虫DNA转化或转染后得到的重组宿主细胞，使宿主细胞可以表达此多肽。有了编码所需蛋白的适当的DNA，便可以用现代的重组技术来生产该蛋白。编码顺序可以通过eDNA或基因组DNA获得，也可以根据基因的核苷酸顺序来合成获得。如果用合成方法制备DNA，可以利用宿主的密码子偏好性。

表达系统必须包含调控顺序，例如启动子，最好有增强子和末端调控，这些在该领域中是较常规的。参见Sambrook等的Molecu-lar Cloning a Laboratory Manual，第二版，Cold Spring HarborPress(1989)。

如此，可以在真核或原核系统中制备所需蛋白，在很多情况下，会产生不同阶段的形式。

最常用的原核系统依然是E.Coli，虽然其它的系统，例如B.Subtilis和Pseudomonas也很有用。原核系统中合适的调控顺序包括组成型和诱导型启动子，例如：lac启动子，trp启动子，杂合启动子tac，入噬菌体PI启动子。一般地，外源蛋白可以在宿主中以融合蛋白或成熟蛋白形成产生。当以成熟蛋白形式表达所需顺序时，顺序常有一个甲硫氨酸，并且不能有效地去除。同样，本文中所述蛋白或肽若用细菌来生产在N端也有一个Met。而且还应在编码序列前构造一个可以操作的信号肽以利其分泌，分泌时信号肽即被切除。

现在，已有许多种真核宿主可用来表达重组外源蛋白。正如细菌宿主，真核宿主也可以被转化表达所需蛋白，但常常需要有信号肽以利其分泌。真核表达系统还有一个优点就是可以剪切内含子，这是高等生物的基因组的编码顺序中常有的。真核系统也提供了其它的处理机制，例如糖基化，氧化或衍生出某些氨基酸残基，构象控制等等。

常用的真核系统包括酵母，昆虫细胞，哺乳类细胞，鸟类细胞和高等植物细胞。这还没有列全。每个宿主类型都有适当的启动子，以及中止顺序和增强子，例如：杆状病毒多角体启动子。同上，启动子也分为组成和诱导型。例如：在哺乳类系统中，MITT启动子可以通过加重金属离子来诱导。

构建表达系统的细节是该领域中常规的。要重组表达一个蛋白，先将编码DNA连接到所选的表达系统上，该系统转化到适当的宿主并在一定条件下进行培养，使外源基因得以表达，然后从培养物中回收本文中所述的杀虫蛋白，可以通过裂解细胞或其它适当方法。

对于蛋白质上的氨基酸残基作一些小修饰，可能会导致活性增强。这些修饰可以是定向的，例如通过定点突变，也可能是偶然的例如通过普通的诱变。改变蛋白质一级结构的突变(普通或特指的蛋白)是由于编码它的核苷酸顺序发生了改变。这些突变特异地包括等位突变。一级结构的改变可以是缺失、增加或替换。“缺失”是指多肽的一个或多个氨基酸残基的缺失，“增加”是指多肽链中比野生型多了一个或多个残基。“替换”是指一个或多个氨基酸残基被其它残基所替换。蛋白片段是指一个多肽其肽顺序与相关多肽的一部分相同。

有用“替换”是指那些保守的，也说是说一个残基被另一个同一大类的残基替换。众知，自然界的氨基酸可以分为酸性、碱性、中性极性或者中性非极性，以及芳香氨基酸。一般希望替换的密码子与原密码编码同一类氨基酸。

这样，一般地，碱性氨基酸Lys、Arg和His可以相互替换；酸性氨基酸Asp和Glu可以相互替换；中性极性氨基酸Ser，Thr，Cys，Gln，Asn可以相互替换；非极性脂肪族氨基酸Gly，Ala，Val，Ile和Keu相互之间是保守的(但因为大小不同，Gly和Ala更近一些，而Val，Ile和Leu更近一些。)；芳香氨基酸Phe，Trp和Tyr可相互替换。

虽然Pro是一个非极性氨基酸，但它有些麻烦，因为它对构象的作用，替换成Pro或Pro被替换一般都不可行，除非造成相似的构象变化。极性氨基酸，包括Ser，Thr，Glr，Asn会产生保守的变化，Met也在较低程度上这样。而且，虽然Ala、Gly和Ser属于不同大类，也似乎可以相互替换，Cys也属于这一类，或者可以划入中性极性氨基酸。有一些不同类的氨基酸替换也可能是很有用的。

因为本发明中的蛋白的重组材料可以提供，这些蛋白可以用重组技术或用自动氨基酸合成仪来获得。因为不同宿主会有不同的翻译后修饰，可以获得天然蛋白的不同修饰型。由于翻译后修饰，包括糖基化，酰胺化或脂化，或者是蛋白质一级、二级或三级结构的变化，会使修饰后的蛋白与未修饰蛋白不同，这也包含于本发明范畴中。

还应该注意到，这里所讲的蛋白质，例如SEQ ID NO：1用人工合成，可替换一些非编码的氨基酸。特异的残基包括，例如ω氨基酸，公式为H₂N(CH₂)nCOOH，n为2-6。它们是中性非极性氨基酸，例如肌氨酸(Sar)，t-丁基丙氨酸(t-Bu Ala)，t-丁基甘氨酸(t-Bu Gly)，N-甲基异亮氨酸(N-Me Ile)和正亮氨酸(Nleu)。例如，苯甘氨酸可替代Trp，Tyr或Phe。瓜氨酸(Cit)和甲硫氨酸亚砜(Mso)是中性极性的，环己基丙氨酸(Cha)是中性非极性的，磺基丙氨酸(Cya)是酸性的，鸟氨酸(Orn)是碱性的。Pro的构象可以替换羟脯氨酸(Hyp)来实现。F.转基因植物

本发明进一步提供的是转基因植物，把编码可大量从Diguetia蜘蛛毒液中分离到的有效杀虫多肽的DNA顺序引入植物种素，DNA顺序的表达性状通过有性生殖或无性生殖而被后代遗传。

根据本发明，编码有效杀虫多肽的基因可以通过遗传工程方法引入植物，当植物细胞产生多肽时可作为控制昆虫害虫的有效手段。因此，有可能产生比自然界的变种有更强抵抗昆虫能力的植株。

用来转化植物的杀虫多肽的编码区可以是基因的全长或有活性的部分。然而，编码多肽的这段遗传顺序所表达并产生的必须是在产生的植物细胞内有功能的多肽。据认为从基因组和cDNA来的DNA以及编码杀虫多肽的合成DNA都可用来转化。而且，构建基因可部分用cDNA克隆，部分用基因组克隆，部分用合成基因以及它们的各种组合。另外，编码多肽基因的DNA可含有不同种的部分而不仅能来源于分离的多肽。

另外，据认为此杀虫多肽可与另外的一种或多种复合物结合，在表达这些复合物嵌合基因的转化植株中产生意想不到的杀虫特性。这些其它复合物可以包括例如对昆虫有口服毒性的蛋白酶抑制剂或从Bacillus thuringiensis来的多肽。B.thuringiensis蛋白引起昆虫肠细胞膜钾离子透性的改变，并推测能在膜上产生小孔。其它能形成小孔的蛋白也可与杀虫多肽同时使用。例如magainin、ce-cropin、attacin、meiittin、gramicidins、钠通道蛋白和合成片段、Staphylococcus aureus的α-毒素，apolipoprotein及其片段，alame-thicin和多种合成的两性多肽。凝集素与细胞膜结合增强内吞作用，是另一类能与此发明的杀虫多肽共同使用的蛋白，可使遗传上改变植物的抗虫性。

多肽基因的启动子可用作表达嵌合基因顺序，然而，其它启动子也是有用的。可能有用的有效植物启动子是过量表达的启动子。在可操作系中与多肽遗传顺序相连的启动子必须能启动此肽的表达以使转化的植物增强对害虫的抗性。已经知道了可对本发明有用的过量表达的植物启动子。

含人工连接在启动子上的杀虫多肽基因的嵌合遗传顺序可以与合适的克隆载体相连并转化所需植物。一般用质粒或病毒(噬菌体)载体，含有从与宿主细胞相容的种来的复制和调控顺序。克隆载体一般含复制起始点以及特殊基因，在转化的宿主细胞内能作为表形选择标记一般是抗生素抗性。转化宿主细胞后，可通过表型标记选择转化载体。

有用的宿主细胞可以是原核生物，包括细菌宿主象E.coli，Salmonella ryphimuriun和serratia marcescens，或是真核宿主如酵母或线状真菌。

克隆载体及其转化的宿主细胞一般用来增加载体的拷贝数。由于拷贝数增加，含此多肽基因的载体可以被分离，并且，举个例子，可把这里叙述的遗传顺序引入植物或其它宿主细胞。

已经有方法产生表达外源基因的植物。例如，可以用A.tumefaciens直接感染或与植株、植物组织或细胞共培养来转化植物组织；用外源基因直接转移入原生质体；用PEG融合；微注射和微弹轰击。

用电穿孔法(见Ag Biotechnology News，Vol.7 P.3 and 17(Sepet/oct 1990))转化烟草已被证实。此方法中，在有含杀虫多肽基因结构的质粒环境下电穿孔植物原生质体。高电场强度的电脉冲可逆地使生物膜渗透引起质粒进入。电穿孔过的植物原生质体再生出细胞壁。分裂，形成愈伤组织。筛选表达杀虫多肽的转化植物细胞可以用上述的表型标记来完成。外源DNA可以任何形式加入原生质体，例如：裸露的线状、环状或超螺旋DNA，包在脂质体中的DNA，与盐复合的DNA以及如此等等。

所用可用Agrobacferium转化的植物细胞及从此转化细胞再生的整个植株也可以根据本发明转化以获得含转移的杀虫多肽基因的整个转化植株。D.M.Raineri等人证实了可转化水稻，文章发表在Biotechnology vol.8，pp33-38(Jan 1990)上，题为《水稻(oryzasatival.)的脓杆菌介导转化》。

另一种把有效杀虫多肽基因引入植物的方法是用被杀虫多肽基因转化的A.tumefaciens感染植物细胞。在合适的常规条件下，被转化的植物细胞生长形成茎叶、根并进一步长成转化植株。杀虫多肽基因顺序可以导入合适的植物细胞中，例如通过A.tumefaciens的Ti质粒。通过A.tumefaciens感染，Ti质粒被传入植物细胞并整合进植物基因组。

Ti质粒有两段区域对产生转化细胞非常重要。其中一个叫转移DNA(TDNA)，引起肿瘤形成。另一个，叫作毒区域，对形成肿瘤而不是保持肿瘤十分重要。要转入植物基因组的TDNA区域可以通过插入酶的基因顺序来增加它的长度而不影响它的转移能力。去除肿瘤诱导基因使它们不再影响则此被修饰的Ti质粒可作为转移本发明的基因结构的载体而引入合适的植物细胞中。

遗传物质也可用聚乙二醇(PEG)转移进植物细胞，PEG与遗传物质形成沉淀复合物被细胞吸收。

转移DNA进入植物也可以通过注射原生质体培养细胞和组织，注射苗与植株的分生组织来完成。可通过常规方法获得转基因植株及其后代。

另一种把外源DNA顺序引入植物细胞的方法包括把DNA附着在颗粒上，用射击设备称为“基因枪”把它打入植物细胞。任何植物组织或器官都可作为此程序的靶子。包括(但不限于)：胚、顶端或其它分生组织、芽、体内或体外的体细胞和生殖细胞组织。转基因细胞和愈伤组织根据规定的程序进行选择。根据常规程序诱导靶组织，形成体胚或再生苗形成转基因植株。可根据使用的植物种选择合适的程序。用高压微弹将DNA转入胚性细胞已经得到转基因玉米。文章报道见Biotechnology，Vol.8，pp833-838(Sept 1990)，题为《转基因玉米植物子代的遗传性及嵌合基因的表达》。

再生植株对于整合的外源DNA是嵌合的。如果含外源DNA的细胞发育成小或大孢子，整合的DNA将被传入有性后代。如果含外源DNA的细胞是植物体细胞，可以通过无性生殖的常规方法得到非嵌合转基因植株，可在体内通过芽或茎的切割或体外通过常规的方法。可根据使用的植物种选择某些程序。

转化植物细胞或植物后，那些表达出多肽转化植物细胞或植物可通过合适的表型标记来选择。这些标记包括但不限于抗生素抗性。其它表型标记都很常规也可用于此发明。

因为有多种不同的转化系统，原则上所有植物类型都可被转化因而表达出本发明的杀虫多肽。

越来越多的证据表明，实际上所有的植物都可从培养细胞或组织再生，包括(但不限于)：所有主要谷物作品种，甘蔗、甜菜、棉花、水果及其它树木、豆类和蔬菜。现在，知识局限于是否所有植物都可用Agrobacteriurm转化。Agrobacterium的天然植物宿主物种可在体外转化。单子叶植物，尤其是谷物和草，不是Agrobacterium的天然宿主。尝试用Agrobacterium转化到现在为止还未成功。正有增多的证据表明某些单子叶植物可被Agrobacterium转化。应用现在成为可能的新实验方法，谷物是能被转化的。

其它可被Agrobacterium转化的植物属包括Ipomoea，Passi-flora，Cyclamen，Malus，Prunus，Rosa，Rubus，Populus，San-talion，Allium，Lilium，Nacissus，Ananas，Arachis，Phaseolus和Pisum。

种与种间植物的再生是不同的，但一般来说先是提供含多拷贝杀虫多肽基因的转化原生质体悬浮液。可如自然胚一样诱导原生质体悬浮液细胞到成熟和萌发阶段而形成胚。培养液一般含各种氨基酸和激素。一般同时形成茎叶和根。成功的再生依赖于培养液、基因型和培养的历史。如果这三个变量是可控制的，则再生是完全可重复的。

从转化的植物细胞形成的成熟植株可以自交产生自交植物。这种自交植物产生的种子含有杀虫多肽基因。这些种子可长成表达杀虫多肽的植物。自杀植物能够，例如，形成耐虫的杂合植物。即耐虫的自交植物与另一自交系产生杂交植物。

对双倍体植物，通常一个母本用杀虫多肽(毒素)转化，另一母本为野生型。杂交后，子一代(F1)产生1/2毒素/野生型：1/2毒素/野生型的分离。子一代杂合子(F1)自交产生子二代(F2)。F2的基因分离是1/4 toxin/toxin：1/2 toxin wild type：1/4 wild type/wild type。F2代中的基因组成为toxin/toxin被选作昆虫耐受植物。

如这里所采用的，在变种仍能表达本发明的杀虫多肽的前提下，变种指稳定和可遗传的表型变化，包括有性生殖传给后代的可遗传变异。另外如这里所采用的，突变指因环境条件如辐射而引起的变异，或是一种性状根据遗传规律经减数分裂传递的遗传变异。不管怎样，此突变植株必须仍表达本发明的多肽。

一般来说，选来在转化植株中表达的理想杀虫蛋白必须对非靶昆虫和脊椎动物是安全的。要选择使表达水平有足够杀虫效力的表达系统，因此，获得这样的转基因的重要农业作物的技术可行性，将在整个控制害虫系统中给农民增添新的武器，从而减少害虫对作物的危害同时不影响环境。G.多肽作为杀虫剂的应用

据认为本发明的杀虫多肽能以多肽的有效量接触昆虫而用于控制无脊椎害虫如鳞翅目。方便起见，昆虫是偏指的害虫。

用多肽接触无脊椎害虫来控制所说的害虫，其方法已可知，例子有人工包埋蛋白让害虫口服。表达本发明蛋白的重组宿主，如Pseudomonas flubrescers可以被加热杀死，然后让害虫口服来进行控制。

当然，用本发明蛋白控制无脊椎害虫的方法也可与其它控制昆虫的方法一起使用。例如，根据要控制的昆虫类型及其它存在的变量来操作转基因植物和上面提到的E.coli，以表达其它无脊椎毒素。

本发明因而还提供了含本发明多肽的杀虫混合物多肽含量有杀虫效力或以及它的盐，是用农业或园艺上可接受的载体装载的，在农业上或园艺上可接受。H.有效杀虫多肽的抗体

本发明的另一方面是本发明的有效杀虫多肽的抗体。在下面的叙述中，将参考各种常规可掌握的免疫学方法，来检测和纯化能与这里所说的抗体反应的多肽。

如果抗体能特异与一分子反应因而此分子结合在抗体上，就说此抗体能与此分子结合。决定其“epitope”指多肽抗原中能被抗体识别并结合的那部分。一个抗原可以有一个或多个决定基。抗原可诱导动物产生能与此抗原的一个决定基结合的抗体。以上所述的特异应是指抗原将以高度的选择性与相应的抗体进行免疫反应，而不与多种可能由其它抗原引起的其它抗体反应。

这里的“抗体”(Ab)或“单克隆抗体”(Mab)不仅包括完整的分子也包括它的能与抗原结合的片段(举例来说，如Fab和F(ba’)₂片段)。Fab和F(ab’)₂片段缺少完整抗体的Fc片段，能较快地从循环中消除掉，与昆虫抗体的非特异组织结合较少。

本发明的抗体可通过多种方法的任一种制备。制备这种抗体的方法知道得很清楚，在文献中有详细描述。可见例如Sambrook等的《Molecular Clonig a laboratory manul》Second ed.cold SpringHarbor Press，Vol，3 ch 18(1989)。例如：把表达杀虫多肽或其片段的细胞引入动物，诱导产生含能与多肽结合的多克隆抗体的血浆。一般用制备和纯化使其不含天然杂质来得到杀虫多肽片段或者用常规方法合成杀虫多肽片段。为了产生更高活性的多克隆抗血清，可以将纯化的片段或合成的片段或纯化的天然片段和/或合成片段的混合物引入动物。

单克隆抗体可以用杂交瘤技术来制备。一般地，这一程序包括用杀虫多肽抗原免疫动物，抽提免疫动物的脾细胞并与适当的骨髓瘤细胞融合。任何适当的骨髓瘤细胞系都可用于本发明中。融合后，在适当的培养基上保持杂交瘤细胞，并通过限制稀释克隆。最后通过检测分泌抗体能否与杀虫肽抗原结合来确定所需克隆。

如果肽源不纯，只有部分杂交瘤细胞产生的抗体能与肽结合(其它的杂交瘤细胞产生的抗体能与肽杂质结合)。这样，就有必要从杂交瘤细胞中筛选所需克隆。筛选的过程中，将毒液样品与杂交瘤细胞分泌的抗体保温后，观察杀虫活力是否被中和或减弱。一旦确定了所需克隆株，便可用适当方法将其扩增以生产肽专一的单克隆抗体。

为了纯化天然或重组的杀虫毒素，有必要使用杀虫肽专一性抗体。一般地，这种抗体是单克隆抗体。在获得了肽专一性单克隆抗体后，可将其偶联到固体支持物上，然后用免疫亲和层析的方法从天然毒液中分离肽。这种方法可以获得高度纯化的肽没有天然的杂质。在本文中，“无天然杂质”是指没有天然状态下结合的杂质化合物(也就是说，其它的蛋白质，脂，碳水化合物等)。

在纯化了肽以后，可用来免疫动物(例如小鼠或兔子，以诱导产生肽专一性多克隆抗体。

适当大小的DNA探针，一般为10到50个核苷酸，可以来源于Diguetia毒液中杀虫多肽的编码序列。这种探针可用来检测编码Diguetia毒液杀虫多肽的DNA序列的存在，将探针与毒液接触并检测可与探针结合的DNA。I.从遗传上经改造的杀虫微生物

有效杀虫多肽单独使用或与别的昆虫毒素配合使用可以从强度和程度上增强诸如棒状病毒(baculoviuses)和重组细菌等微生物的毒性。

包括那些感染Heliothis Virescens(棉螟蛉)，Orgyia pseudot-sugata(道格拉斯冷杉暗色蛾)，Lymantia dispar(舞毒蛾)，Auto-grapha Californica(苜蓿尺蠖)，Neodiprion sertifer(欧洲松木蝇)以及Lanspcyresia pomonella(青苹蛾)在内的几种棒状病毒已在一些国家鉴定并用作杀虫剂了。把至少一种对昆虫具选择性的毒素基因引入其基因组中可显著增强这类杀虫的效力。

一种非常适用于本发明的重组表达载体是如美国专利4,879,236中所描述的那种类型的棒状病毒表达载体，该专利已详细阐明了其特征。又见Carbonell等“编码一利昆虫专一性蝎子神经毒素的基因之合成及通过棒状病毒载体表达该基因的尝试”，Gene，73：409-418(1988)。这种载体预计在一表达系统中是有用的，该系统中将把自Diguetia蜘蛛毒液中可大量分离提取的一种有效杀虫多肽的DNA编码序列克隆到一种Autographa Californica棒状病毒(AcMNPV)表达载体中，此棒状病毒载体已在美国专利4,879,236和Miller等，Science，219，715-721，(1983)，中描述过。该重组表达载体病毒可应用于被昆虫所有害侵染的动物或植物。当病毒被有害昆虫摄入时，重组病毒便侵入昆虫的肠壁细胞开始复制，有效杀虫多肽基因便会在复制过程中表达，从而在比昆虫摄入野生型AcMNPV病毒后更短的时间内导致昆虫伤残或死亡。

一种同样被预计有用的重组病毒阐明于欧洲专利申清0,340,948中。表达本发明的DNA的该种杂交病毒可以变成改变了昆虫宿主范围的病毒。如，由本发明中的DNA与一种专一性昆虫肠细胞识别蛋白基因构成的重组基因可表达一单链融合蛋白产物，此融合蛋白产物可在识别蛋白基因产物的指导下使有效杀虫多肽到达宿主昆虫靶位。

按欧洲专利申请0,325,400中所述方法，多种原核和真核微生物可被一种重组毒素基因转化并表达其编码的有效杀虫多肽。

含载有本发明蛋白质基因的质粒的重组细菌预计适用于本发明中的方法。昆虫将通过应用此重组细菌于该昆虫而受到控制。参见实例，美国专利4,797,279，该专利中已详细阐明了其特征。

运用适于本发明的棒状病毒的其他实例见于Tomalski等，“由棒状病毒介导一种螨神经毒素基因的表达引起的昆虫麻痹症”，Na-ture，352：82-85(1991)以及Steuart等，“一种改进的带有昆虫专一性毒素基因的棒状病毒杀虫剂的构建，”Nature 352：85-88(1991)；McCutchen等，“一种表达昆虫选择性神经毒素的重组棒状病毒之获得：害虫防治的可能性”，Biotechnology，9：848-851(1991)。J.杂交：DNA序列作为有关分子的探针

适当大小的DNA探针可以从本发明的DNA序列推测出。这类探针可用来与其他来源的核酸杂交以检测其中是否存在有编码本发明中之有效杀虫多肽的DNA。用其信号序列或其cDNA片段甚至其完整的cDNA作为寡核苷酸探针在非严谨条件下筛选，将可得到与本文所述的毒素分子族功能同源的其他活性多肽DNA。可与本发现DNA序列的寡核苷酸探针杂交的好的合适核酸来源应包括，但不限于，同属不同种的蜘蛛，相关属的蜘蛛，以及同一属但不同产地的蜘蛛。K.一启动子序列的鉴定

本发明另一方面提供了在蜘蛛中调控DK9.2合成的启动子序列。用成熟毒素cDNA作探针筛选染色体DNA库以分析DK9.2基因的结构。对染色体DNA转录录起点上游的分析，表明存在一个推测的启动子。此启动子区的421bp的一般DNA序列示于SEQ IDNO：8。这个推测的启动子包含通常存在于紧接转录起始位点的上游区域内的许多必需调控信号。(启动子调控信号的综述见Meknight等，1982。真核蛋白质编码基因的转录控制信号。Science217：316)。一个典型的TATA框位于推测的转录启始位点以外一30处，并且看来该框对调控RNA合成的启动是重要的。在更上游处有两个相距较远的回文顺序，其中一个包含据认为对RNA多聚酶的结合重要的同感CAAT框。据推测，这个启动子或启动子区域对在植物、动物或细菌中不同基因的转录和表达有使用价值，例如在一个重组构造的基因中。

实施例

以下实施例用以阐明本发明范围内具体的产物和方法，但它们并不限定本发明的应用范围。

材料和方法

蜘蛛由Spider pharm，Inc of Black Canyon city，AZ，并由该公司进行种的鉴定。Diguetia canities蜘蛛毒液是用电法挤出的，同时采用保护措施确保其中无唾液和血细胞的污染。毒素纯化—将原始毒液(贮存于-80℃)融化，在层析前将其彻底混匀并溶于0.1％的三氟乙酸(TFA)中。原始毒液使用Beckman Systern Gold 126溶剂和168光电二极管束检测器以逆向液相层析(RPLC)法分部。乙酸基亚硝酸或异丙醇加入TFA作为阳离子偶联剂。纯化中使用下列含同样基质的柱子：Dynamax 300ARPC18柱(25cm×4.6mm i.d.，颗粒大小12μm)，Vydac 300A C₁₈分析柱(25cm×4.6mm i.d.，颗粒大小5μm)，以及Vydac 300A C₁₈半制备性柱(25cm×10mmi.d.，颗粒大小5μm)。在220nm光波处监测寻找峰值，并用GILSON 208微量部分收集器进行分部收集。所有收集部都经冰冻干燥后，贮于-80℃。快速原子轰击质谱分析(FAB-MS)-在标准FAB条件下，在Univ.of ILLinois的VG仪器ZAB-SE质谱仪上测量质谱(氙气，分辨力1000，加速电压8KV，内部温度40℃)。样品(约1ug)溶于4ml含25％水溶TFA(1％)的硫代甘油中分析。

实施例1

将用前述方法自Diguetia canities中获得的25μl冷冻干燥原始毒液溶于0.1％三氟乙酸(TFA)中，在半制备性Vydac RP C₁₈柱上用逆向液相层析法分级，以每分钟3.5ml的流速洗脱，使用线性梯度洗脱液，其成分为水溶0.1％TFA和50％亚硝酸溶解的0.1％TFA，开始洗脱时二者的比例为85∶15，在180分钟以后50∶50的比例结束洗脱。

收集部滞留时间(大约分钟数)

1 3.2

4 29.6

6 48.2

8 57.1

9 62.8

10 66.4

11 68.7

12 71.4

13 77.1

16 126.1

17 131.4

每一收集部均经冰冻干燥陆续除去洗脱剂和水，样品贮存于-80℃，杀虫鉴定时每个收集部样品都溶于25μl生理缓冲盐液中。一些收集部的杀虫活力通过对tobacco budworm(HeliothisVirescens)“TBW”的作用的试验得到证实(表I)

TBW幼虫用装了33gauge针头和PB 600连续加样的50μlHamilton针筒注射3μl测试溶液，每个收集部用五只幼虫作试验。注射方法是，把针头插入到腹部侧中线处(靠近任一前腿处)，以小角度注射以免破坏内脏。注射后每只昆虫都放入一含有人工合成食物的容器中。定时观察；注射后24小时开始测量麻痹症状。在计算剂量时用0.3gm作为TBW的平均体重。一组对照幼虫只注射生理缓冲盐液。

麻痹症状逐渐发展，而此之前有一明显的肌肉痉挛阶段。严重情况下，痉挛在注射后的15-30分钟之间产生，并逐渐增强直至幼虫完全失去活动力，有时颤抖持续48小时以上。这种现象有时也可发生于只注射了亚致死剂量而幼虫最终复活的情况。颤抖的严重程度是毒性最可靠的指标。若被作用至完全麻痹和/或身体收缩，幼虫便不能复活。

表I

Diguetia canities原始毒液RPLC收集部对

TBW的毒性(7.5WVE/每克昆虫)^**

麻痹百分数麻痹百分数收集部初时 24hr

1 0 0

4 0 0

6 0 0

8 100 100

9 100 100

10 100 100

11 100 100

12 100 100

13 0 0

16 0 0

17 0 0

对照 0 0

麻痹被定义为昆虫在被侧转或翻转不能恢复自身常态的症状。

^**WVE，原始毒液等价量是指正常存在于lμl挤出的原始毒液的任何毒素的量；自25μl分离液得到5WVE相当于回收样品的20％。

实施例2

Diguetia canities收集部9的纯化

TBW活性收集部9的主要成分通过再次层析化得到单一组分(每分组分在SDS-DAGE电泳中均为一可见带，分子量约在6,500 Dalton)，层析在Vydac RPC₁₈(25cm×10mm i.d)柱上进行，以3.5ml/min的速度在异丙醇/0.1％三氟乙醇的线性溶剂梯度(1.0％/min)下洗脱，在220nm波长下监测。

峰的探测和分部收集如例1中所示收集两个部分。第一个在21.81分钟洗脱出(收集部9.1)，第二个峰在22.39分钟洗脱出(收集部9.2)。

收集部9.1和9.2分别通过冰冻干燥先后除去洗脱剂和水，浓缩留下样品9.1和9.2。冷冻干燥后收集部产物的纯度估计至少达99％。从25μl原始毒液中估计可得到大约含6μg纯蛋白的样品9.2。把样品9.2注射入如例1所示的tobacco badworm以试验其杀虫活力，方法是五只实验昆虫中每只都注射溶于缓冲盐液的6.3μg样品9.2，另用五只幼虫只注射缓冲盐液作为对照组。24小时及48小时后检验昆虫。在24小时时所有的那些处理昆虫都被麻痹并随之死去而对照昆虫却显示正常。48小时时无任何变化。

通过快原子轰击质谱分析该多肽表明其分子量为6371±2。对样品9.2的N-末端氨基酸顺序分析得其部分氨基酸顺序实际上与SEQ ID No：1氨基酸1-33所示的一致。

在H.Virescens(TBW)中Diguetia毒素9.2的半死剂量LD₅₀大约为1.0nmol/gm.其产生症状与实施例1中使用原始毒液所产生的相似。

实施例3

Diguetia Canities收集部11的纯化

用类似例2中所述方式，例1中Diguetia Canities原始毒液中分离到的收集部11，再经逆向液相层析纯化得到一个组分。该组分经冰冻干燥先后除去洗脱剂和水而得到一种的遗留物称为样品11。该样品通过例2所述的方法用5.0 WVE/g的剂量检测其对tobac-co budworm活力。24小时后，经样品处理的昆虫80％呈现麻痹症状，48小时后60％呈现麻痹症状。对照组昆虫则表现正常。

经快原子轰击质谱分析显示该多肽分子量为6740±2，用末端氨基酸顺序分析法测得样品11的部分氨基酸顺序，见SEQ IDNO：3氨基酸1-29。

实施例4

Diguetia Canities收集部12的纯化

用类似例2中的方式，例1中Diguetia Canities原始毒液中分离到的收集部12经逆向液相层析纯化，得到一个组分。该组分经冷冻干燥先后除去洗脱剂和水得到浓缩的样品，称样品12。该样品通过例2所述的方法检测其对tobacco budworm的杀虫活力。24小时后经样品12处理的昆虫100％呈现麻痹症状，48小时后80％呈现麻痹状态。对照组昆虫则表现正常。

经快原子轰击质谱分析该多肽测得其分子量为7080±2。N-末端氨基酸分析表明其部分氨基酸顺序，见SEQ ID NO：5。

有限的材料供应不允许精确标定毒性；因此样品9.2在比样品11、12分别高39％和67％的剂量(nmol/mg)水平上检测毒性。选择的剂量是为了覆盖最小致死剂量到无效应剂量水平，但并非每次都达到目的。尽管如此，结果表明这些多肽具有非常相似的毒性。样品9.2可能比另二个样品具有稍强的毒性，但差异可能小于3倍。这些多肽(样品9.2，11，12)的最小100％致死剂量在3.0到5.0nmol/gm之间，这与商业性杀虫剂相比更具优越性；如teflubenzuron，其半致死剂量(SAW)为1.0nmol/gm。

实施例5

分离自Diguetia Canities毒液中分离到的样品9.2，11的编码基因。第一步：RNA的分离

自野外收集Diguetia Canities蜘蛛。活蜘蛛在液氮下冰冻并取出头胸。按Chomczynski和Sacchi，Analytical Biochemisfry，162，156(1987)的方法自头胸中抽提RNA。多聚腺苷酸化信使RAN(mRNA)经寡d(T)纤维素层析(Pharmacia LKB，Sweden)而纯化。第二步：cDNA的合成

信使RNA在鼠白细胞病毒逆转录酶(Bethesda Research Lab-oratories，MD)的作用下，按生产商提供的操作程度逆转录合成cD-NA。在20μl的反应混合物中含有由cDNA合成工具盒(BorbringerMamnbeim，1N)提供的酶缓冲液，50μg mRNA，2单位RNaseH，30ngd(T)NotI引物(promega，Madison，WI)，四种脱氧核苷三磷酸各1mM，以及100μg逆转录酶。反应混合物在37C温育1小时，然后在42℃继续温育10分钟。再加乙醇沉淀，最后溶于20μl水中。第三步：引物的合成

一简并的引物DNA顺序混合物

使用Drosophila倾向使用的密码子设计一段按SEQ ID NO：1可编码第1到第8个氨基酸的简并引物DNA顺序混合物。该引物由犹他大学Howard Hughes Medical Institute合同设备合成。第四步：扩增

使用热稳定DNA多聚酶进行由引物指导的DNA扩增，此方法最先由Saikki等发表于Science，239，487(1988)。在实际应用中，我们在含有GeneAmp Tm DNA扩增工具盒(Perkin Elmer Cetus，CA)提供的多聚酶链式反应物中加入5μl Diguetia头胸cDNA作为模板。扩增反应体系中含有意义及反义引物各2μM，四种脱氧核苷三磷酸各100μM及4单位热稳定重组TaqI多聚酶。反应在PerkinElmer Cetus公司生产的DNA热循环仪上进行。从具有相似N-末端氨基酸顺序的相关毒素基因家族中通过使用严紧退火温度(58℃)选择性扩增编码样品9.2之基因。在这样的条件下扩增产生了单一的一段DNA，琼脂糖凝胶电泳表明其大小为275bp.在较不严紧的条件下，则琼酯糖凝胶电泳检测出五个以上的扩增产物，其大小自200bp到360bp不等。这些在较不严紧条件下得到的不同PCR产物可能编码一些氨基酸顺序上，分子量大小上及杀虫活力上与样品9.2相近的多肽。这些相关的多肽中预计有样品11和12，因为其N-末端氨基酸顺序如SEQ ID NO：1，3和5所示彼此间及其与样品9.2非常相似。第五步：PCR产物的克隆

由高度严紧条件及较不严紧条件得到的PCR产物经过Centri-con-100(Amicon)分子大小分离系统除去未参入的引物而得到纯化。所得产物再用限制性内切酶NotI(MBR，Milwawkee，WI)酶解，该酶可在引物的下游(3’末端)切开产生一粘性末端。载体PKC(Sfratagene，LaJolla，CA)经EcoRV(US Biochemical)和NotI双酶切产生单向克隆位点。载体和插入片段连接后转化compex DH5aF’。转化子用³²P标记的中间片段探针筛选，选出的克隆应用中间片段探针作引物测量小量DNA顺序(US Biochemical’s Sequerase Ver-sion 2.0)作进一步的鉴定。

两个克隆的cDNA插入片段的完整DNA顺序如SEQ ID NO：2和4所示。仅前者是来自严紧PCR反应所得的克隆，而两种cD-NA插入片段在由较不严紧PCR反应条件得到的克隆中均可发现。SEQ ID NO：2编码的多肽氨基酸顺序见SEQ ID NO：1，该多肽具有与样品9.2一致的N-末端顺序。该多肽的分子量据估计为6377.9Daltons，假定在天然形式下该多肽所有(半胱氨酸)都以分子内二硫键(烷氨基)的形式存在，则分子量为6369.7D。因此，该多肽看来与样品9.2为同一分子。后者经质谱分析确定其分子量为6371±2。由SEQ ID NO：4编码的多肽氨基酸顺序见SEQ ID NO：3。该多肽具有一与样品11相同的N-末端顺序。因此，此多肽看来与样品11是同一多肽。

实施例6

对哺乳动物的毒性

如前所述的方法自D.Canities获得的5μl原始毒液，若分三次向小鼠腹膜内注射(IP)，将致小鼠死亡。处理过的小鼠起初与只注射盐液的对照小鼠无区别。但注射后10到15分钟，处理小鼠就变得比较多动，表现出独特的跳跃姿态；接着出现短时间的动作不协调，呼吸困难及痉挛，自产生症状到死亡约2分钟。

分别以约4.2，0.9，1.2mg/kg的剂量向小鼠腹膜内注射样品9.2，11，12，24小时内均无效应产生。

以每只小鼠约30μg的剂量(约1mg/kg)向小鼠(约28gm)脑内室注射样品9.2。直到注射后48小时均未发现任何效应。另有一小鼠腹膜内注射约125μg(4.2mg/kg)的样品9.2，亦无效应可见。

为了鉴定本毒液对脊椎动物的毒性。原始毒液经逆向液相层析后合并的收集部在小鼠中进行毒性试验，收集部2含有对tobac-co budworm(TBW)有活力的成分。相当于25μl原始毒液的剂量向小鼠腹膜内注射收集1和2无任何效应。而收集部3则产生与注射原始毒液所观察到的一样，这些结果表明Diguetia Canities毒液的成分中杀虫有效成分和脊椎动物有害成分是明显不同的。

实施例7

电生理数据

DK9.2以1μM的浓度在大鼠海马切片的Schaffer collateral-CA1锥状细胞突触上研究突触转导(激动群体钩连)。示于图2中数据代表以时间平均的群体钩连记录(a)DK9.2加入前5分钟的记录，(b)DK9.2加入后15-20分钟期间的记录。这些记录可以是重叠的表明，在该浓度下，DK9.2对大鼠中枢神经系统不具有此分析法可检测到的活力。用此分析法可检测到不同哺乳动物离子通道及神经递质受体的多种多样的效应。(T.V.Dunwiddie，The Use of InVitro Brain Slices in Neuropharnacology，In EletophysiologicalTechniques in Pharmacology，edited by H.M.Geller，Alan R.Liss，Inc.，New York，1986)。例如，阻止钠通道失活的分子，如某些蝎毒素，可导致群体钩连响应最后相的明显扩展。(Kaneda M，MyamaY，Ikemoto Yand Akaike N.，Scorpion foxin prolongs an lnacfiva-tion phase of the voltage-dependent Sodium current in rat isolafed single hippocampal pleurons，Brain Res，487：192-195，1989；Alan L.Mueller，Natural prochucts Sciences，Inc.，Unpublishedobseruations)，相对而言，DK9.2在低100倍的浓度下对昆虫试验品(家蝇)有活性。它以一种推测是阻止昆虫钠通道失活的方式发挥作用。

实施例8

编码DK9.2前体的cDNA上游顺序

为了得到编码DK9.2的cDNA上游顺序，合成了一段相应于SEQ ID NO：2 DNA顺序的反义链上第159-178核苷酸残基的中间片段寡核苷酸，在此引物的5’末端有一个EcoRI切点。10μl的单链毒液素cDNA用末端脱氧核苷酸转移酶(Bethesda ResearchLaboratories)在其3’末端加上若干脱氧鸟核苷酸残基。20μl的反应液中含14单位的酶和500μM dGTP，在37℃温育15分钟。样品经乙醇沉淀后溶于20μl水中。

通过一个与扩增下游/或熟毒素cDNA顺序方法相似的锚定PCR技术，由特异引物引导扩增了基因上游DNA序列。扩增反应液中含有有义引物(dcc结尾的引物)和无义引物各2μM，脱氧核苷三磷酸各100μM，以及4单位的热稳定重组Tag多聚酶。温度变化如下：94℃2分钟，37℃2分钟，37℃1分钟，该循环重复两次，在后面的循环中将第二步退火温度提高到54℃。此循环共重复32次。

在EB存在的4％琼指糖凝胶电泳显示，锚定PCR产生一条380bp的片段。该片段用E.coli DNA多聚酶I大片段(Klenow片段)(Molecular Biology Resources，Madison WI)，然后用乙醇沉淀，溶解沉淀后用限制性内切酶EcoRI酶切。酶切片段在1mMATP存在下由T₄蛋白酶磷酸化，然后连接到由EcoRI和EcoRV双酶切的P Blue scripts KS载体上。亚克隆用测序酶(Sequenase)2.0(USB)分析双链DNA顺序。含有成熟多肽毒素基因上游区域的cDNA翻译表明DK9.2是以前体蛋白质形式合成的。上游cDNA顺序见SEQ ID NO：6。编码前体蛋白的基因上有一段信号序列和前多肽基因片段(SEQ ID NO：7)，除去这一区段就可产生自蜘蛛毒液分得的成熟多肽毒素。据推测信号序列及前多肽中序列对于蜘蛛产生和分泌DK9.2是必需的。

实施例9

重组棒状病毒的构建

一段鳞翅目昆虫的信号顺序(Jones et al.，Molecular CloningRegulation and Complete Sequence of a Hemocyanin-RelatedJuvenile Hormore-Supressible Proteim From Insect Hemolymqhs，J.Biol.Chem，265：8596(1990))，应用Rossi，et al(J.Biol.Chem，257：9226(1982))的方法由两段合成的寡核苷酸构建而成。经由离子交换层析纯化得到两段48个核苷酸组成的单链片段，它们在3’末端有十一个可互补的碱基。当这两个片段在有四种脱氧核苷三磷酸和DNA多聚酶I Klenow片段存在下退火时，可合成一个双链产物，该产物经羟基磷灰石层析纯化，再用Aat II酶解，产生的片段可插入到克隆于PKS-DK9C的DK9.2 cDNA的上游区。筛选得到插有信号序列的亚克隆并测其DNA顺序。

DNA测序证实有一个此二cDNA顺序的融合产物不改变阅读框。切下该完整的合成基因，经适当改造后克隆到一种棒状病毒转移载体P BlueBac(Vialard，J.，et al.，J，Vinrology 64：3-50(1990))的NheI切点中。对亚克隆顺序的测定证明了重组基因的正确插入。对质粒WR9的DNA顺序的测定证实该合成“Caterspider”基因(pre DK9.2)插入到了棒状病毒转移载体PBlueBac(图3)中。P BlueBac载体的应用加快了筛选进程，因为插入到棒状病毒基因组中的重组基因可与β-半乳糖苷酶基因共表达，故在指示培养基上生长时可通过颜色是否变化来识别。

应用Summers和Smith建立的方法，编码前9.2的重组棒状病毒可用lμg AcMNPV病毒DNA和2μg质粒DNA混合共转染Spodoptera frugiperda菌株Sfq获得。转染4天后，将细胞上清的稀释液涂布于接有5×10⁶Sf9细胞的100mm平板上，上覆一层含Bluo-gal底物(Gibco BRL，Gaithersburg，MD)的琼脂糖凝胶。5到6天内，重组子因其呈浅兰色可被识别。重组噬菌斑用Pasteur pipet微量加样器挑出，用1ml培养液洗脱，该洗脱液再感染生长于T-25烧瓶中的Sf9细胞，三天后从感染了六个不同噬菌斑的细菌培液中收集小体积上请用以制备病毒DNA。应用病毒的外壳蛋白(Polyhedrin)基因周围区域的特异性引物进行PCR扩增，证实这6个病毒噬菌斑中有5个含有合适大小的插入片段且无任何野生型污染。接着制备经滴定成斑数的重组病毒贮存液用于体内和体外试验。

实施例10

重组DK 9.2的生物学活性

自含血清组织培养液中分离得到的重组样品9.2(DK9.2)的生物学活性检测是在龄虫TBW幼虫中进行的。剂量在被测溶液的A280吸收值基础上计算。采用16μg/g的剂量，重组产物在注射后2小时内可导致明确的肌肉痉挛，48小时后有一半幼虫(6只中的3只)被麻痹并严重收缩，而其他3只幼虫仍表现轻度到中度的肌肉痉挛。8μg/g的剂量也使只幼虫中的3只麻痹，而5.2μg/g的剂量则只使两只麻痹。结果证明重组DK9.2有生物活性。

实施例11

重组棒状病毒的体内测试A.DK9.2重组核型多角体病病毒(vAcDK9.2)的生物学活性1)病毒制备物的滴定

病毒贮存液用噬菌斑分析法滴定(Luria et al.，“General Virol-ogy”，1978，pp.21-32；John，Willey and Sons，New York)。滴度用每单位体积贮液可形成噬等斑的数目(pfu)表示，剂量则用pfu/幼虫表示。若各病毒颗粒都可成功地感染一个不同的宿主细胞，一个pfa就相当于一个成熟病毒颗粒(Luria et al.，ibid)。例如，103个宿主细胞可被1ml含量为106PFU/ml的病毒制备物感染(i.e.，130PFU/μl)。2)生物分析实验

DK9.2重组核型多角体病病毒(rNPV)，vAcDK9.2的生物学活力可经一系列剂量反应分析实验检测。该实验中，TBW幼虫(平均质量约250mg)被注射含不同剂量vAcDK9.2的组织培养液或单纯的组织培养液(n＝10，即10只)。如例1所示毒素注射实验，处理过的幼虫分别培养于放有食物的容器中，定时观察。这两个病毒感染分析实验的综合结果见表II。采用5000pfu/幼虫和更大的剂量，DK9.2毒性的典型症状(肌肉颤抖和痉挛)在注射后幼24小时开始出现。48小时内至少一半试验昆虫失去了活动力(i.e.，麻痹或半麻痹)。最低测试剂量50pfu/幼虫在48小时内诱导颤抖和痉挛，在96到120小时内至少70％的幼虫失去活动力。B.vAcDK9.2和野生型NPV的生物学活动力比较

进一步研究比较了vAcDK9.2与其亲本野生型病毒Auto-grapha Carforica NPV(Wt-AcMNPV)的效力。这些分析实验的目的是为了确定受vAcDK9.2感染的幼虫与受等剂量Wt-AcM-NPV感染的幼虫相比，是否在更短时间内失去活动力。1)注射分析实验

vAcDK9.2和wt-AcMNPV的生物学活力在一系列注射实验中进行比较。向末龄的tobaco budworm(Heliothis virescens)幼虫，Cabbage Looper(Tr ichoplusiani)幼虫以及beet army worm(Spodopte exigua)幼虫注射5×10pfu/幼虫的vAcDK9.2或wt-AcMNPV；对照幼虫只注射组织培养液。结果表明，在所有三个物种上，vAcDK9.2确定比wt-AcMNPV具有更强的效力，结果总结于表III。2)喂养分析实验

为了检测vAcDK9.2经摄食后的活力必需制备一种可口腔感染的多角素阴性(pol^-)重组子。此目的可根据其他研究者发表的建成具口腔感染力的pol^-重组NPV.的方法，经vAcDK9.2和wt-AcMNPV的其潴留来达到。(如Kuroda et al.，1989，J.Virology 63(4)；1677-1685，和Price et al.，1989.Proc Natl Acad，Sci 861453-1456)。SF-9细胞同时被vAcDK9.2和wt-AcMNPV感染的多重感染系数(MOI)分别为10和2。同时，另一组SF-9细胞只被wt-AcMNPV(MOI＝2)感染。感染5天后，破碎细胞后差别离心，收集内含体(e.g.，Wood，1980，Vivology 104：392-399)。内含体在血细胞计数器上计数。那些共感染vAcDK9.2和wt-AcM-NPV的细胞比只感染wt-AcMNPV的细胞，产生的内含体较少同时较小，由前者得到的多角内含体(PIB)产量为4.6PIB/细胞，而后者内含体产量为33.3PIB/细胞。

为了比较wt-AcMNPV和vAcDK9.2的生物学活力，实验中运用了一种食物掺入分析方法。混合的或反野生型的PIB以10⁵PIB/gm的浓度掺入到一种不含琼脂的昆虫食物中，该食物分配到小容器中，将所生的TBW幼虫放入容器(每个容器一只，共20只)。对照幼虫给予等量未经处理的食物。允许幼虫随意进食，定时观察其病状的发展。结果见表II。开始48小时内无任何效应，但72小时后50％以上喂以混合PIB的幼虫被麻痹；野生型病毒此时未引起任何效应。96小时后，90％以上喂以混合PIB幼虫被麻痹，而喂以野生型PIB的幼虫只有10％死亡或垂死。120小时后，前一组幼虫100％死亡或垂死，而后一组幼虫仅75％死亡或垂死。因此，正如注射分析实验的结果，在喂养分析实验中，vAcDK9.2处理的幼虫比wt-AcMNPV处理幼虫在显著缩短的时间丧失活动力。

表II

vAcDK9.2在TBW中的剂量响应分析实验

％麻痹百分数

剂量成斑数/幼虫	24小时	48小时	72小时	96小时	120小时
剂量成斑数/幼虫	24小时	48小时	72小时	96小时	120小时	5.1×10⁵	0	80	100	100	100
5.1×10⁴	0	35	95	100	100	5.1×10⁵	0	80	100	100	100
5.1×10⁴	0	35	95	100	100	5.1×10³	0	25	75	90	100
5.1×10²	0	0	55	85	100	5.1×10³	0	25	75	90	100
5.1×10²	0	0	55	85	100	5.1×10¹	0	0	20	65	95
对照	0	0	0	0	0	5.1×10¹	0	0	20	65	95

表III

vAcDK9.2和wt-AcMNPV注射TBW.CL

和BAW幼虫效应比较

处理方式	种	24小时	48小时	72小时	96小时	120小时	168小时
处理方式	种	24小时	48小时	72小时	96小时	120小时	168小时	vAcDK9.2	TBW₂	0	0	100	100	100	100
wt-AcMNPV	TBW	0₃	0	0	0	0	0₄	vAcDK9.2	TBW₂	0	0	100	100	100	100
wt-AcMNPV	TBW	0₃	0	0	0	0	0₄	对照	TBW	0	0	0	0	0	0
vAcDK9.2	CL₅	0	100	100	100	100	N/A	对照	TBW	0	0	0	0	0	0
vAcDK9.2	CL₅	0	100	100	100	100	N/A	wt-AcMNPV	CL	0	0	0	0	100	N/A
对照	CL	0	0	0	0	0	N/A	wt-AcMNPV	CL	0	0	0	0	100	N/A
对照	CL	0	0	0	0	0	N/A	vAcDK9.2	BAW₆	0	70	90	100	100	100
wt-AcMNPV	BAW	0	0	0	0	0	100	vAcDK9.2	BAW₆	0	70	90	100	100	100
wt-AcMNPV	BAW	0	0	0	0	0	100	对照	BAW	0	0	0	0	0	30

1.每只幼虫注射病毒5×10⁵pfu；对照组只注射等量体积的组织培养基

2. n＝8；每只幼虫的平均体重为300mg

3. 8只幼虫中的2只因注射时产生的伤残而死亡，因此不作进一步的分析

4.第9天wt-AcMNPV处理的幼虫死亡率为100％

5. n＝10；每只幼虫平均体重为165mg

6.对cAcDK9.2，n＝20；对wt-AcMNPV，n＝10及对照；每只幼虫平均体重为200mg

实施例12

DK9.2基因的启动子

为得到DK9.2基因的调节组分，构建了一个染色体基因文库。采用Herrmarn and Frischanf的方案(见Methods in Enzymslogy，Vol，V52，Acaclemic Press，Ine 1987，99，180-183)制备蜘蛛DNA，用Sau3A部分酶切，然后用TLS-55转头(Beckman Co.，Ltd)在10％-38％蔗糖密度梯度系统中以25,000rpm转速离心16小时，再分部收集。合并35-45Kb的DNA收集部，用部分填充法将DNA片段插入粉粒载体的一个XhoI位点中。连接产物中的1/4用Gigak gold^TM(Stratagene，LaJolla，CA)包装到噬菌体颗粒中，经转染得到相当于超过3×10⁹bp的蜘蛛DNA。该基因库铺于25个150mm平板上，再印至尼龙滤膜上，用编码DK9.2的放射性标记的cDNA、编码其N末端的末端标记寡核苷酸、编码其C末端的末端标记寡核苷酸放射性标记的中间片段等4种探针来筛选目的菌落。有一个编码cDNA的粘粒与以上所有探针均杂交，其EcoRI酶切片段的DNA转移杂交结果表明其中一个3.0kb的片段可与中间体片段以及C末端探针杂交。用前述的三个引物测定粘粒cDK2双链序列证实分离到了DK9.2的基因，并提示了该毒素家族的另一个或一些基因位于同样的邻近DNA片段上的可能性，因为此基因N末端寡核苷酸(它和所有Dignetia杀虫有效多肽有高度同源性)在粘粒DNA的多个位点插入。

为获得DK9.2基因的启动子序列，先得到一段与有义链上前信号序列一致的合成寡核苷酸。在这个引物和另外的本发明基因特异性的引物之间的PCR扩增产物将信号序列定位于N末端外显示上游大于3,000bp处。反义链上的引物用于测定紧接编码信号肽的cDNA5’端上游区域的DNA顺序。

该信号序列到上游的DNA顺序表明，起始甲硫氨酸密码以外一11bp处有另一个内含子。合成了与DK9.2前体的cDNA5’区域一致的一段寡核苷酸引物，用于引发一个PCR反应以确定在转录起始位点与翻译起始位点之间间隔序列的大小。一个1,000bp的扩增产物证实了该内含子的存在并表明了其大小。转录起始位点上游DNA顺序确证其中包含一个启动子，该启动子区的DNA序列见SEQ Listing NO：8，它包含多个普遍存在于其他真核启动子中的位于紧接转录起始位点上游区域的必需调控信号。该启动子或其中部分片段可用于在细菌、病毒、植物或动物中转录或翻译其他真核基因。

例13

关于DK 9.2作用方式的神经生理学研究

神经生理学研究是为了阐明DK 9.2的作用方式、蛆神经肌肉接合的周围神经的记录表明DK 9.2诱发易于被河豚毒素阻断的神经反复(阵发)放电，因此，此毒素作用位点可能是电压敏感的神经膜钠离子通道。进一步的研究表明DK 9.2在达到10nM阀值浓度时可持续激动周围神经。另外，它的效力至少是蝎4号哺乳动物毒素的50倍。

本研究中所用的实验动物是家蝇第三期龄虫。幼虫用昆虫钉固定住，用医用外科解科刀切开腹部，展平幼虫射体，并用钉固定，除去内脏露出体壁肌肉组织。在周围神经与脑交接外将其切割出来，除去脑，然后浸入昆虫盐液中，成份是(mM)：NaCl(140)，KCl(5)，CaCl₂(0.75)，MgCl₂(4)，NaHCO₃(5)和HEPES(5)，pH7.2。

一刺激接受电极附着于任一合适的神经干上用以记录神经肌肉传导。缓慢加大刺激阀值直至观察到肌肉6或7的一根纤维收缩为止。然后在这根纤维中插入一个胞内记录微电极，该电极连接一个用于检测应答神经刺激的激动后突触电势(EPSP)的胞内予放大器。

为记录周围神经纤维上升的电活性，记录电极附在一个交流予放大器上，信号被放大100倍，在0.3和1Hz下输出，有记录都在MacLab装备计算机的仪器系统中数字化，并显示、分析。

有关DK 9.2作用的最初实验中使用了神经肌肉连结制备物。若给予周围神经单次刺激则导致体壁肌肉出现一次单个EPSP。有DK 9.2存在时，单个刺激导EPSP高效率的放电。除了刺激引发的放电以外，还出现自发阵发放电并延续数分钟。一阵发过程常持续1秒以上，此时的EPSP频率大于30Hz，阵发放电的出现引发体壁肌细胞强烈收缩，这使得保持胞内记录非常困难。因为阵发动电引起的收缩将电极排出肌肉。因此绝大多数实验是在含高浓度蔗糖(300mM)的盐溶液中进行的，蔗糖可抑制收缩而不影响电活性。用通常的或高浓度蔗糖的盐液获得的结果是类似的。

DP 9.2处理后观察到的阵发放电与蝎α毒素存在时观察到的现象类似，已知蝎毒素α作用于神经细胞膜的电压敏感离子通道。电此可见，阵发放电可以被专一性钠离子通道阻抑剂河豚毒素(TTX)所阻抑。TTX阻止或逆转DK 9.2诱发的阵发放电能力示于图5中。在图5A中，EPSP被1μM TTX迅速阻抑，使得制备物对随后的100nM DK 9.2的处理不敏感。类似的实验见于图5B中，该实验中先由DK 9.2诱发阵发放电，然后被随后加入的TTX逆转。在该实验中，阵发放电的产生使电极被逐出肌肉，使得当试图重新进行记录时引入一刺入假象记录。一旦找到一合适记录位点，则检测阵发放电2分钟左右，这时该制备物显示在TTX处理后的数秒内其活动停止。

为了避免因肌肉收缩而导致细胞内记录的困难，上述实验在蛆周围神经上进行细胞外记录重复实验。结果是，伴随运动纤维的逆向活化，感受神经活性有所上升。当DK 9.2的浓度在70nM时可导致神经放电的增强，而且不受随后盐液处理的影响，但0.4μMTTX可迅速抑制此反应。另外，在DK 9.2之前加入TTX可阻止阵发放电的出现。

着手进一步研究的目的是为了确定昆虫神经对DK 9.2的敏感性，并与标准蝎毒素比较其效力。DK 9.2在外围神经制备物上测试其作用，开始用1nM，以后大约每5分钟增加浓度直至观察到其活力的上升。在该制备物中，1nM到5nM DK 9.2是无作用的，但达10nM时，在一短暂的延迟时间后就能在该制备物上诱发活力。五个神经制备物用以确定DK 9.2在昆虫神经上的有效阀浓度，其结果总结于表五中。

表 IV浓度处理次数产生响应昆虫所占的比例％响应1nM 2 0 02nM 1 0 05nM 3 1 3310nM 3 3 100

用相似的方法，在最后一组实验中确定蝎子Leiurus quingues-triatus毒素4(LqT×4)对昆虫神经的敏感性。制备物(4个)在受到浓度达到500nM的LqT×4时无效应。这些发现与以前的研究结果相等，即发现LqT×4是特异作用哺乳动物钠通道的。这些制备物在后继的DK 9.2处理时，DK 9.2浓度需达到10-30nM才产生反应。DK 9.2的有效阈值浓度的略微上升可能是失活的CqT×4的弱抑制作用所致。这些实验证明DK 9.2对昆虫神经的作用比LqT×4至少强50倍。

表 V

序列号	内容
序列号	内容	1	DK 9.2氨基酸顺序
2	DK 9.2 cDNA编码序列	1	DK 9.2氨基酸顺序
2	DK 9.2 cDNA编码序列	3	DK11氨基酸序列
4	DK 11 cDNA编码序列	3	DK11氨基酸序列
4	DK 11 cDNA编码序列	5	DK 12氨基酸序列
6	编码DK 9.2之完整cDNA序列	5	DK 12氨基酸序列
6	编码DK 9.2之完整cDNA序列	7	DK 9.2前体的信号/引导序列的氨基酸序列
8	DK 9.2启动子的DNA序列	7	DK 9.2前体的信号/引导序列的氨基酸序列

序列单

(1)一般情况：

(i)申请人：Karen J.Krapcho；Bradford Carr

VanWagenen；J.R.Hunter Jackson

(ii)发明标题：有效杀虫多肽

(iii)序列数目：8

(iv)通讯地址：

(A)ADDRESSEE：Woodcock，Washburn，Kurtz，Mack-iewicz & Norris(B)STREET：One Liberty Place-46th Floor(C)CITY：Philadelphia(D)STATE：Pennsylvania(E)COUNTRY：U.S.A.(F)ZIP：19103(v)计算机形式：(A)媒介型号：DISKETTE，3.5 INCH，1.44Mb STORAGE(B)计算机：IBM PS/2(C)操作系统：PC-DOS(D)软件：WORDPERFECT 5.0(vi)目前申请资料：(A)申请号：(B)登记时间：(C)分类：(vii)以前申请资料：(A)申请号：662,373(B)登记时间：March 1，1991(viii)律师/代理人情况：(A)姓名：John W.Caldwell，Esp.(B)登记号：28,937(C)工作代号：FMC-0054(ix)通讯情况：(A)电话：(215)568-3100(B)传真：(215)568-3439(2)SEQ ID NO：1情况：(i)序列特征：(A)长度：56个氨基酸

(B)类别：氨基酸

(D)空间构型：未知

(xi)序列内容：SEQ ID NO：1：Ala Lys Asp Gly Asp Val Glu Gly Pro Ala Gly Cys Lys Lys Tyr

5 10 15Asp Val Glu Cys Asp Ser Gly Glu Cys Cys Xaa Lys Gin Tyr Leu

20 25 30Trp Tyr Lys Trp Arg Pro Leu Asp Cys Arg Cys Leu Lys Ser Gly

35 40 45Phe Phe Ser Ser Lys Cys Val Cys Arg Asp Val

50 55

(2)SEQ ID NO：2情况：

(i)序列特征：

(A)长度：275个碱基对

(B)类别：核酸

(C)链型：双链

(D)空间构型：未知

(xi)序列内容：SEQ ID NO：2GCC AAG GAC GGC GAC GTC GAG GGG CCT GCG 30Ala Lys Asp Gly Asp Val Glu Gly Pro Ala1 5 10GGC TGC AAG AAA TAC GAC GTA GAG TGC GAC 60Gly Cys Lys Lys Tyr Asp Val Glu Cys Asp

15 20AGT GGA GAG TGC TGC MMS AAG CAG TAC CTG 90Ser Gly Glu Cys Cys Xaa Lys Gln Tyr Leu

25 30TGG TAC AAG TGG CGA CCC CTG GAT TGC CGA 120Trp Tyr Lys Trp Arg Pro Leu Asp Cys Arg

35 40TGC CTA AAG AGC GGT TTC TTC AGC AGC AAG 150Cys Leu Lys Ser Gly Phe Phe Ser Ser Lys

45 50TGC GTT TGC AGA GAC GTG TAGATTTGAA ATGAAATTCG 188Cys Val Cys Arg Asp Val

55TGTTCTTTTT TGGTTGTAGA TGACCTAATG AAACAACTGA 228CATGAATAAA ACAAAATTGA ATGAATTGAA AAAAAAAAAA 268AAAAAGC 275

(2)SEQ ID NO：3情况：

(i)序列特征：

(A)长度：58个氨基酸

(B)类别：氨基酸

(D)空间构型：未知

(xi)序列内容：SEQ ID NO：3：Ala Lys Asp Gly Asp Val Lys Gly Pro Ala Gly Cys Met Lys Tyr

5 10 15Lys Ser Gly Asp Cys Arg Gly Lys Thr Cys Cys Asp Gln Gln Tyr

20 25 30Leu Trp Tyr Lys Trp Arg Asn Leu Ala Cys Arg Cys Phe Thr Val

35 40 45Glu Val Phe Lys Lys Asp Cys Trp Cys Asn Asp Ile Ser

50 55

(2)SEQ ID NO：4情况：

(i)序列特征：

(A)长度：204个碱基对

(B)类别：核酸

(C)链型：双链

(D)空间构型：未知

(xi)序列内容：SEQ ID NO：4GCC AAG GAT GAC GAT GTC AAG GGA CCT GCT GGC TGC ATG AAG TAC AAG 48Ala Lys Asp Gly Asp Val Lys Gly Pro Ala Gly Cys Met Lys Tys Lys1 5 10 15AGC GGA GAC TGC AGA GGC AAA ACT TGC TGC GAC CAA CAG TAG CTC TGG 96Ser Gly Asp Cys Arg Gly Lys Thr Cys Cys Asp Gln Gln Tyr Leu Trp

20 25 30TAC AAG TGG CGG AAT CTT GCA TGC AGG TGC TTC ACG GTC GAA GTG TTC 144Tyr Lys Trp Arg Asn Leu Ala Cys Arg Cys Phe Thr Val Glu Val Phe

35 40 45AAG AAG GAC TGC TGG TGC AAC GAC ATC AGT TAATTCCACA TGAAGAAGTA 194Lys Lys Asp Cys Trp Cys Asn Asp Ile Ser

50 55AGCATCTCCT 204

(2)SEQ ID NO：5情况：

(i)序列特征：

(A)长度：62个氨基酸

(B)类别：氨基酸

(C)链型：

(D)空间构型：未知

(xi)序列内容：SEQ ID NO：5：Ala Lys Asp Gly Asp Phe Glu Gly Pro Pro Gly Xaa Leu Lys Met1 5 10 15Gly Glu Leu Xaa Lys Gly Gly Thr Xaa Xaa Thr Lys Val Tyr Lys

20 25 30Tyr Trp Lys Trp Arg Lys Leu Glu Cys Leu Gly Lys Asn Asp Gly

35 40 45Trp Phe Lys Lys Lys Phe Ile Cys Asp Glu Arg Xaa Asn Pro Xaa

50 55 60Xaa Xaa

(2)SEQ ID NO：6情况：

(i)序列特征：

(A)长度：359个碱基对

(B)类别：核酸

(C)链型：双链

(D)空间构型：未知

(xi)序列内容：SEQ ID NO：6ATATTACAAG CCGCTCCAGT AGCCGAAGAA GCCTAAGCCA AGAACCCAGG TCCGCCACA 60ATG AAG GTT TTT GTT GTA CTG TTG TGC TTG TCT CTG GCA GCA GTT TAC 108Met Lys Val Phe Val Val Leu Leu Cys Leu Ser Leu Ala Ala Val Tyr

-35 -30 -25GCC TTG GAG GAA AGA CTA GAC AAA GAC GCC GAC ATC ATG CTT GAT TCA 156Ala Leu Glu Glu Arg Leu Asp Lys Asp Ala Asp Ile Met Leu Asp Ser

-20 -15 -10CCA GCC GAC ATG GAA AGA GCG AAG GAC GGT GAC GTG GAA GGG CCT GCG 204Pro Ala Asp Met Glu Arg Ala Lys Asp Gly Asp Val Glu Gly Pro Ala

-5 1 5 10GGC TGC AAG AAA TAC GAC GTA GAG TGC GAC AGT GGA GAG TGC TGC MMS 252Gly Cys Lys Lys Tyr Asp Val Glu Cys Asp Ser Gly Glu Cys Cys Xaa

15 20 25AAG CAG TAC CTG TGG TAC AAG TGG CGA CCC CTG GAT TGC CGA TGC CTA 300Lys Gln Tyr Leu Trp Tyr Lys Trp Arg Pro Leu Asp Cys Arg Cys Leu

30 35 40AAG AGC GGT TTC TTC AGC AGC AAG TGC GTT TGC AGA GAC GTG 312Lys Ser Gly Phe Phe Ser Ser Lys Cys Val Cys Arg Asp Val

45 50 55TAGATTTGAA TTCCAAC 359

(2)SEQ ID NO：7情况：

(i)序列特征：

(A)长度：38个氨基酸

(B)类别：氨基酸

(C)链型：

(D)空间构型：未知

(xi)序列内容：SEQ ID NO：7：Met Lys Val Phe Val Val Leu Leu Cys Leu Ser Leu Ala Ala

-35 -30 -25Val Tyr Ala Leu Glu Glu Arg Leu Asp Lys Asp Ala Asp Ile

-20 -15Met Leu Asp Ser Pro Ala Asp Met Glu Arg-10 -5 -1

(2)SEQ ID NO：8情况：

(i)序列特征：

(A)长度：421个碱基对

(B)类别：核酸

(C)链型：双链

(D)空间构型：未知

(xi)序列内容：SEQ ID NO：8TTTAGCAGCC CAAGGCTACA GAGCTGCCGG ACAGGTAAAC CTGAACTACA CAATGCCCA 60TGCCCACGCT CAAACCACAT ACACTCTTTC CCCAACTTTT TTTTTGGTAA AGACAGTTGT 120TGCATTCTAA AAGCACGTTT TACTGCAGCT GCTCAGACTG TCTGCTGGTG GTGGAGGCAG 150AGTATGTTTG GTACAGAATT CCACCGAAGC ATTGTTCGTG GTACGACGCA GTAAGCATGA 240CGCTCAGTTT TTTTTGAATC GGAATATGTA ATATCTGCAG CGACACTTAT TGAAATGTTT 300CTCCTTCGAC AAGCAATCGC TTTATCGGAA TACCTGCATG ACATAACTGA CAAAACACAT 360GTGGCTCCAG AAACAACGAA AACATTCATT CCTGTATATA AGTATCGGAG GAGTGCTGTA 420T 421

Claims

1.一种防治鳞翅目昆虫的方法，其特征在于，它包括：将有效量的肽或其农业或园艺上可接受的盐与该昆虫进行接触，其中该肽具有选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：5的氨基酸序列。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该肽具有SEQ ID NO：1中所述的氨基酸序列。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该肽具有SEQ ID NO：3中所述的氨基酸序列。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该肽具有SEQ ID NO：5中所述的氨基酸序列。

5.一种防治鳞翅目昆虫的方法，其特征在于，它包括：将表达有效量的肽或其农业或园艺上可接受的盐的重组棒状病毒，与该昆虫进行接触，其中该肽具有选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3和SEQ IDNO：5的氨基酸序列。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，该肽具有SEQ ID NO：1中所述的氨基酸序列。

7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，该肽具有SEQ ID NO：3中所述的氨基酸序列。

8.如权利要求5所述的方法，其特征在于，该肽具有SEQ ID NO：5中所述的氨基酸序列。

9.如权利要求5所述的方法，其特征在于，重组棒状病毒含有SEQID NO：2中所述的核苷酸序列。

10.如权利要求5所述的方法，其特征在于，重组棒状病毒含有SEQID NO：4中所述的核苷酸序列。

11.如权利要求5所述的方法，其特征在于，重组棒状病毒含有SEQID NO：6中所述的核苷酸序列。