SK87093A3

SK87093A3 - Insecticidally effective peptides

Info

Publication number: SK87093A3
Application number: SK870-93A
Authority: SK
Inventors: Karen J Krapcho; Bradford C Vanwagenen; John R H Jackson
Original assignee: Fmc Corp
Priority date: 1991-03-01
Filing date: 1992-02-27
Publication date: 1994-03-09
Also published as: YU21292A; CZ285487B6; CZ179893A3; ZA921562B; CN1064684A; PL170630B1; CA2103901A1; BG62194B1; EP0589894A4; WO1992015195A1; JP2591705B2; AU1585492A; MX9200876A; JPH06503229A; IL101081A0; FI933808A; BR9205716A; EP0589894A1; PL168222B1; HUT69926A

Description

V posledných rqkoch si verejnosť uvedomila nebezpečenstvo znečistenia prostredia, ktoré je spojené s použitím syntetických insekticídov a tiež skutočnosť, že tieto látky sú toxické pre cicavce. V dôsledku toho začalo použitie insekticídov rýchlo klesať. Potreba účinného hubenia hmyzu sa však nezmenila. Z toho dôvodu boli vyvíjané intenzívne snahy nájsť nové spôsoby hubenia hmyzu.

Najrozšírenejšie mikrobiálne pesticídy sú odvodené od baktérie Bacillus thuringiensis, ďalej B. t. Táto bakteriálna látka sa používa na hubenie celého radu húseníc, požierajúcich listy, na hubenie rôznych druhov hmyzu a moskytov. V US patentovom spise č. 4 797 279 z 10. januára 1989 (Karamata a ďalší) sa opisujú hybridné bakteriálne bunky, obsahujúce kódový gén pre delta-endotoxín B. t. kurstaki a delta-endotoxín B. t. tenebrionis, opísaný je taktiež spôsob výroby. Hybridy B. t. sú účinné proti škodcom, citlivým na kmene B. t. kurstaki a tiež proti škodcom, citlivým na kmene B. t. tenebrionis. Tieto hybridy majú všeobecne velmi užitočné insekticídne vlastnosti, výhodnejšie než tie, ktoré je možné získať fyzikálnym zmiešaním oboch pôvodných kmeňov, a to buď z hľadiska insekticídnej účinnosti alebo spektra účinnosti alebo oboch. Insekticídne prostriedky s obsahom týchto mikroorganizmov je možné použiť na hubenie hmyzu tak, že sa hybridy nanesú v insekticídne účinnom množstve na hmyz alebo na jeho životné prostredie.

ΐι

- 2 Ďalšie materiály, odvodené od baktérií B. t. boli opísané v európskom patentovom spise EP 0 325 400 (Gilroy a Vilcox).. Uvedený spis sa týka génu pre hybridný toxín, ktorý je toxický pre hmyz čeľade Lepidoptera. Špecificky sa vynález týka génu pre hybridný delta-endotoxin, ktorý obsahuje časť génu pre toxín HD-73 B. t. var. kurstaki a časť génu pre toxín z B. t. var. kurstaki, kmeň HD-1. Je tiež opísaná DNA génu pre hybridný toxín, ktorá je kódom pre bielkovinu s účinnosťou proti uvedenej čeľadi.

Využitie B. t. je opísané taktiež v európskom patentovom spise EP 0 340 948 (Vilcox a ďalší). V tomto spise sa opisuje hybridný pesticidny toxín, získaný fúziou génu B. t. pre toxín, rozpoznávaný epiteliálnymi bunkami hmyzieho čreva a reťazce pre diperický toxín B za vzniku hybridného toxínu B. t., účinného proti čeľadi Lepidoptera. Bolo navrhované uloženie génu pre tento hybridný toxín do rastliny alebo jeho klonovanie v baculovíruse za vzniku izolovateľného toxínu. Hostiteľ, ktorý obsahuje gén pre hybridný B. t. môže byť sám použitý ako insekticídny prostriedok pre priame nanesenie na životné prostredie hmyzu.

Pri vyhľadávaní insekticídnych zlúčenín bolo zistené, že tiež -jed škorpióna je možným zdrojom zlúčenín s insekticídnymi vlastnosťami. Dva toxíny, selektívne pre určite hmyzie druhy, izolované z jedu škorpióna Leiurus quinquestriatus quinquestriatus bolo opísané v publikácii Zlotkin a ďalší , An Excitatory and Sodium a Depressant Insect Toxín from Scorpion Venon both Affect Sodium Conductance and Possess a Common Binding Site, Árch Biochem and Biophysics, 240: 877-87 (1985). V štúdiách, týkajúcich sa chemických a farmakologických vlastností týchto jedov bolo preukázané, že jeden z týchto toxínov vyvoláva rýchlu excitačnú spastickú obrnu muších lariev a druhý vyvoláva pomalú chabú obrnu. Oba tieto jedy môžu ovplyvniť prevod sodíka.

V kanadskom patentovom spise č. 2 005 658 z 19. júna 1990 (Zlotkin a ďalší) sa opisuje bielkovina s insekticídnym účinkom, odvodená od škorpióna Leiurus quinquestriatus hebraeus Buthinae, Buthidae. Frakcie s najvyššou toxicitou pre larvy a najnižšou toxicitou pre myši bola ďalej čistená a výsledný produkt bol označený LqhP35.

V publikácii Griskin, Toxic components from Buthus eupeus and Lucosa singoriensis venoms, Shemyakin Inštitúte of Bioorganic Chemistry, USSR Academy of Sciences, Moskva, 117988, GSP-1, USSR, sa opisujú štyri pepsíny, izolované z jedu škorpióna Buthus eupeus, toxické pre hmyz. Opisuje sa taktiež izolácia a vlastnosti toxickej zložky jedu tarantule Lucosa singoriensis. Surový jed bol však pre hmyz netoxický.

V dôsledku týchto výskumov a vývoja, spojeného s nachádzaním rôznych látok s insekticídnymi účinkami boli vykonávané ďalšie práce s cieľom vyvinúť postupy pre konštrukciu génov pre 'insekticídy s následným uložením týchto génov do cieľových škodcov. US patentový spis č. 4 879 236 zo 7. novembra 1989 (Smith a Summers) opisuje postup na uloženie určitého génu, spojeného s promótorom baculovírusu do genómu baculovírusu za získania rekombinantného vektora pre expresiu v baculovíruse, vektor je tiež schopný vyvolať expresiu z voľného génu v hmyzej bunke. Postup spočíva v tom, že sa rozštiepi DNA baculovírusu za vzniku fragmentu DNA, ktorý obsahuje polyhedrínový gén alebo jeho časť včítane príslušného promótora. Aby bolo možné pripraviť rekombinantný vektor pre prenos, bol fragment DNA uložený do prostriedku pre klonovanie a potom bol do takto modifikovaného prostriedku pre klonovanie uložený vybraný gén pod riadením polyhedrínového promótora. Tento rekombinantný vektor pre prenos bol potom uvedený do styku s DNA divokého typu baculovírusu, čím došlo k homológnej rekombinancii a k uloženiu zvoleného génu do genómu baculovírusu. Bolo preukázané, že baculovírus Autographa californoca (AcMNPV) a s ním spojený polyhedrínový promótor sú vhodné na konštrukciu vektora na expresiu vo víruse tak, že je možné dosiahnuť vysokú úroveň expresie zvoleného génu v eukaryotických hostiteľských bunkách .

V tomto patentovom spise sa navrhuje použitie tohoto vektora pre expresiu v systéme na hubenie hmyzu tak, že sa vyberie gén, ktorý je kódovým génom pre bielkoviny, toxický pre určitý hmyz alebo pre rad druhov hmyzu a tento gén sa klonuje vo vektore AcMNPV pre expresiu. Vektor by mohol byť uložený do rastliny alebo živočícha, pre ktoré je nutná ochrana, Rekombinantný vírus by sa mohol po požití hmyzom dostávať do buniek jeho črevnej steny, kde by dochádzalo k replikácii. Druhou možnosťou je uložiť gén do genómu baculovírusu, takže by došlo k jeho fúzii s polyhedrínovým štruktúrnym reťazcom a obal by bol za alkalických podmienok v čreve hmyzu rozložený s následným uvoľnením toxickej látky.

Ďalší postup pre konštrukciu insekticídnych génov a pre ich uloženie do organizmu, ktorý má byť chránený, bol opísaný v publikácii Cutler Electroporation, Being Developed to Transform Crops: Success with Moedl Crop Confirmed, AG Biotech, News zv. 7 (5):3 až 17 (1990). V tejto publikácii sa opisuje, že DNA je možné uložiť pri otvorení pórov priamo do klíčiaceho peľu, ktorý je možné uložiť späť na rastlinu za vzniku semien, z ktorých potom vyrastú transformované rastliny. Tento postup bol s úspechom použitý u rastlín tabaku a je možné ho úspešne použiť tiež u kukurice a u lucerny. Postup je ľahší než otvorenie pórov pôsobením elektrického prúdu u protoplastu vzhľadom na to, že cieľom je opelenie rastlín, ktoré sa už o seba samé postarajú a nie regenerácia celej rastliny. Postup spočíva v tom, že sa odoberie peľ, ktorý sa nechá vo vhodnom prostredí 30 až 60 minút klíčiť tak, že klíček už vyčnieva z peľového zrna. Ku kvapalnej suspenzii s obsahom naklíčeného peľu sa potom pridá požadovaná DNA, použije sa elektrický impulz na otvorenie póru v peľovom klíčku, prebytočná DNA sa vymyje a modifikovaný peľ sa uloží na bliznu rastliny a čaká sa, kým sa vytvoria semená. Ide teda o ľahký postup uloženia akéhokoľvek génu do plodiny.

Ďalší systém bol uvedený v US patentovom spise 4 861 595 z 29. augusta 1989 (Barnes a Edwards). Vynález sa týka použitia spracovaných v podstate neporušených mikrobiálnych buniek ako systému na prenos bielkovín na živočíchy aj na človeka. Mikrobiálne bunky produkujú vnútrobunkovo bielkoví- š nu na základe prítomnosti homológneho génu. Mikroorganizmus, produkujúci bielkovinu sa chemicky alebo fyzikálne spracováva, bez toho aby došlo k porušeniu bunky. Spracovanie má za následok získanie mikrobiálnej bunky, z ktorej už nedochádza k prolyferácii, bez toho aby došlo k podstatnej s trate účinnosti zlúčeniny uloženej vo vnútri bunky. Vzhľadom k tomu, že bunka sa už nebude množiť a je vybavená stálou bunkovou stenou, je možné ju rozrušiť v požadovanej oblasti tráviaceho systému živočícha alebo človeka, čím je možné zaistiť časovo aj miestne cielené uvoľnenie bunkových produktov. Po vhodnom spracovaní je možné túto mikrobiálnu bunku, produkujúcu bielkovinu použiť ako systém na privádzanie účinnej látky, účinnú látku teda nie je potrebné čistiť. Účinnou látkou môže byť akákoľvek bielkovina, polypeptid, aminokyselina alebo iná látka včítane insekticídov, ktoré môžu byť produkované mikroorganizmom.

Možnosť použitia DNA na uloženie syntetického génu, ktorý je kódom pre neurotoxín z jedu škorpióna je uvedená v publikácii Carbonell a ďalší, Synthesis of a gene coding for an insect-specific scorpion neurotoxín and atXempts to express it using caculovirus vectors, Gene 73:409 - 418 (1988) . Článok opisuje možnosť použiť technológiu DNA na uloženie syntetického génu, ktorý je kódom pre neurotoxín z jedu škorpióna Buthus eupeus do genómu baculovírusu na zlepšenie pesticídov na báze tohoto vírusu. Študovali sa tri možnosti expresie použitia systému, založeného na AcMNPV a jeho systému expresie spolu s polyhedrónovým promótorom na dosiahnutie produkcie toxínu. Pri expresii génu, obsahujúceho 36 kodónov došlo len k veľmi malej produkcii toxínu. 0 niečo väčší úspech bol dosiahnutý tak, že na toxín bol naviazaný signálny peptid. Podstatne zlepšená produkcia bielkoviny bola dosiahnutá v prípade, že bol gén pre toxín spojený s N-terminálnym zakončením polyhedrónového génu. Avšak produkcia bola i v tomto prípade desaťkrát až dvadsaťkrát menšia než pre polyhedrónový gén ako taký. K obmedzeniu expresie pravdepodobne nedošlo na úrovni transkripcie, ale až po nej a pri translácii a súčasne bola ovplyvnená i stálosť bielkoviny. Nebolo možné pozorovať paralytický účinok týchto produktov.

V európskom patentovom spise EP 0 431 829 sa opisujú transgenické rastliny, u ktorých dochádza k účinnej expresii toxínu, špecifického pre určitý hmyz, pôvodom z príslušného predátora v množstve, ktoré je dostatočné pre toxicitu pre hmyzích jednotlivcov, ktorí požijú rastlinné tkanivo. Toxín bol izolovaný z jedu škorpióna Androctonus australis.

Bol tiež úspešne izolovaný v niekoľkých prípadoch toxín, extrahovaný z jedu pavúkov. V súhrnej publikácii Geren, Neurotoxins and Nectrotoxins of Spider Venoms, J. Toxicol.

- Toxin Reviews 5 (2):161 - 170 (1986) sa opisujú súhrny predošlých prác, týkajúcich sa neurotoxínov a necrotoxínov a uvádza sa, že by molekuly jedu pavúkov mohli byť modelom na výrobu špecifických insekticídov.

V US patentovom spise č. 4 925 664 (Jackson a Parks) z 15. mája 1990 sa opisuje spôsob liečenia ochorenia srdca a neurologických ochorení podávaním toxínu, odvodených od pavúkov Agelenopsis aperta a Hololena curta. Tieto toxíny sú také účinné ako špecifické vápnikové kanály alebo blokátory receptorov pre excitačné aminokyseliny a je možné ich použiť na hubenie hmyzu a iných škodcov.

V európskom patentovom spise EP 0 395 357 sa opisujú polyamíny a polypeptidy, izolované z jedu pavúka Agelenopsis aperta. Tieto polyamíny antagonizujú excitačné aminokyseliny ako nervové prenášače a polypeptidy a jeden z polyamínov blokujú vápnikové kanály v živých bunkách rôznych organizmov. Je tiež navrhované použitie týchto blokátorov vápnikových kanálov pri hubení bezstavovcových škodcov.

V európskom patentovom spise EP 0 374 940 ša opisujú toxíny, izolované z jedu pavúka Hololena curta. Polypeptidy sú vhodné ako insekticídy a tiež ako liečivé látky, napríklad ako vápnikové kanály a ako látky antagonizujúce glutamát.

Bowers a ďalší, Identification and purification of an irreversible presynaptic neurotoxin from the venom of the spider Hololena curta, Proc. Natl. Acad. Sci., 84:3506

- 3510 (1987), opisuje bielkovinový neurotoxin, izolovaný z jedu pavúka Hololena curta a inhibíciu nervosvalového prenosu týmto javom u lariev Drosophila. Autori sa domnievajú, že toxín blokuje presynaptické vápnikové kanály v motorických neurónoch Drosophila.

V publikácii Quistad a ďalší, Paralytic and Insecticidal Toxins from the Funnel Veb Spider, Hololena Curta, Toxicon 29(3):329 - 336 (1991), sa opisuje jeden peptid a desať curtatoxínov, čistených z jedu Hololena curta a účinok týchto látok po vstreknutí larvám čeľade Lepidoptera.

. V publikácii Stapleton a ďalší, Curtatoxins: Neurotoxic insecticidal polypeptides isolated from the funnel web spider Hololena curta, J. Biol. Chem. 265(4):2054 až 2059 (1990) sa opisujú tri polypeptidové neurotoxíny, izolované z jedu pavúka Hololena curta a účinok tohoto jedu na svrčka Acheta domestica.

V publikácii Quicke a Ushérwood, Extended Summaries Pesticides Group and Physicochemical and Biophysical Panel Symposium Novel Approaches in Agrochemical Research, Pestic. Sci., 20:315 - 317 (1987) sa opisuje, že toxíny, prítomné v jede parazitických ôs a v jedoch niektorých pavúkov pôsobia po vstreknutí hmyzu rýchlu obrnu. Autori uvádzajú, že toxíny pavúkov pravdepodobne blokujú selektívne katiónové kanály pre niektoré receptory v membránach, ktoré sú v interakcii s otvorenými kanálmi, ktoré boli otvorené receptormi pre glutamát z kostrových svalov kobylky. Publikácia opisuje tiež toxíny z jedu pavúkov Argiope a Araneus s nízkou molekulovou hmotnosťou a toxín, izolovaný z jedových žliaz pavúka Nephila clavata.

Ďalšie štúdie, vzťahujúce sa k vlastnostiam izolovaných toxínov z jedu pavúkov ukázali na schopnosť nízkomolekulárnych faktorov, izolovaných z jedu pavúka Hololena curta reverzibilne sa viazať na vápnikové kanály. V medzinárodnej patentovej prihláške VO 89/7608, zverejnenej 24. augusta 1989 (Cherksey a ďalší), sa opisuje, že sa tieto účinné faktory s nízkou molekulovou hmotnosťou môžu reverzibilne viazať na vápnikové kanály s dostatočnou špecifičnosťou a afinitou na vylúčenie prevodu vápnika v neurónoch, čím môže dôjsť tiež k izolácii štruktúr vápnikových kanálov a k ich čisteniu. Uvedené jedy boli účinné i pre cicace.

Ďalšie možné použitie toxínov a jedu z pavúkov je opisované v publikácii Jackson a Parks, Spider Toxins: Recent Applications in Neurobiology, Ann Rev. Neurosci 12:405 - 414 (1989). Táto publikácia opisuje, že existuje veľká heterogenita medzi toxínmi rôznych pavúkov. Je zrejmé, že vlastnosti vápnikových kanálov, špecifické pre určitý druh môžu reagovať na jedy pavúkov, ktoré môžu byť antagonistami týchto vápnikových kanálov. Skúmané jedy pavúkov pôsobili najmä na stavovce. V článku sa taktiež uvádza, že niektoré jedy pavúkov sú možným zdrojom toxínov, špecifických pre určité druhy hmyzu a že by teda bolo možné ich využiť pre poľnohospodárske účely.

V publikácii Adams a ďalší, Isolation and Biological Activity of Synaptic Toxins from the Venom of the Funnel Veb Spider, Agelenopsis Aperta, Insect Neurochemistry and Neurophysiology, 1986, Borkovec a Gleman ed., Humana Press, New Jersey, 1986 sa uvádza, že z pavúka Agelenopsis aperta bol izolovaný celý rad toxínov peptidovej povahy, ktoré antagonizujú synaptický prenos u hmyzu.

V US patentovom spise č. 4 855 405 z 8. augusta 1989 (Yoshioka a ďalší), sa uvádza inhibítor receptoru, získaný z jedu pavúka Nephila clavata a spôsob jeho spracovania. Zlúčenina má insekticídny účinok, stačí styk s jedom v kvapalnom alebo v tuhom prostredí.

V US patentovom spise č. 4 918 107 zo 17. apríla 1990 (Nakajima a ďalší), sa opisuje zlúčenina s inhibičným účinkom na receptor glutamátu, spôsob jej výroby a insekticídny prostriedok, ktorý túto látku obsahuje. Zlúčenina je spracovaná spolu s kvapalným alebo tuhým nosičom a s dispergačným činidlom a nanášaná priamo na rastlinu alebo na živočícha. Insekticídny účinok je možné dosiahnuť pri nízkych dávkach, pričom toxicita pre cicavce a ryby je veľmi nízka a prostriedok teda nemá nepriaznivé účinky na prostredie.

Sledovala sa tiež možnosť použitia baculovírusov ako biologických insekticídov. Hlavnou nevýhodou použitia baču9 lovírusov divokého typu ako biologických insekticídov je ich pomalý účinok. Larvy, ktoré požijú vírus divokého typu obvykle zahynú v priebehu 5 až 7 dní a do tejto doby infikované larvy môžu podstatným spôsobom poškodiť porast, na ktorom sa vyskytujú.

Vzhľadom na kombináciu rôznych problémov, ktoré sú spojené s použitím radu synretických insekticídov včítane ich toxicity, znečistenia životného prostredia a strate účinnosti na základe vyvíjajúcej sa odolnosti hmyzu existuje trvalá potreba nachádzať nové prostriedky na hubenie bezstavovcového hmyzu včítane rekombinantných baculovírusov, získaných genetickým inžinierstvom, u ktorých dochádza k expresii bielkovinových jedov, ktoré sú schopné zahubiť hostiteľa rýchlejšie než jedy z divokého typu tohoto vírusu.

Podstata vynálezu

Podstatu vynálezu tvoria peptidy s insekticidnym účinkom, izolované v podstate v čistom stave z jedu pavúka Diguetia a ich soli, prijateľné z poľnohospodárskeho hľadiska.

Insekticídne účinné peptidy podľa vynálezu sú vysoko selektívne pre bezstavovcové živočíchy a zvlášť pre hmyz. Okrem tóho sa ukázalo, že peptidy podľa vynálezu s insekticídnym účinkom sú vysoko účinnými insekticídmi proti poľnohospodársky významným škodcom a znamenajú teda dôležité obohatenie tejto oblasti.

Vynález sa taktiež týka nových reťazcov DNA, ktoré sú kódovými reťazcami pre peptid s insekticidnym účinkom, izolovateľný z jedu pavúka Diguetia.

Vynález sa taktiež týka nového rekombinantného vektora pre expresiu, obsahujúcu reťazec DNA, ktorý je kódovým reťazcom pre peptid s insekticidnym účinkom, izolovateľný z jedu pavúka Diguetia, pričom tento vektor je schopný spôsobiť expresiu uvedeného kódového reťazca v transformovaných bunkách.

Podstatu vynálezu tvoria aj nové rekombinantné hostiteľské bunky, ktoré boli podrobené transformácii alebo transfekcii za použitia reťazca DNA, ktorý je kódovým reťazcom pre peptid s insekticídnym účinkom, izolovateľný z jedu pavúka Diguetia, pričom u týchto buniek dochádza k expresii uvedeného peptidu.

Vynález sa taktiež týka nového rekombinantného vektora pre expresiu baculovírusu, schopného spôsobiť expresiu reťazca DNA, ktorý je kódovým reťazcom pre peptid s insekticí dnym účinkom, izolovateľný z jedu pavúka Diguetia v hostiteľovi alebo v bunke hostiteľského hmyzu.

Podstatu vynálezu tvorí taktiež nový spôsob výroby peptidu s insekticídnym účinkom, izolovateľný z jedu pavúka Diguetia a peptid, získaný týmto spôsobom. Tento spôsob spočíva v tom, že sa pestuje rekombinantná hostiteľská bunka a rekombinantný vektor pre expresiu, použitý na transformáciu alebo transfekciu tejto hostiteľskej bunky obsahuje reťazec ĎNA, ktorý je kódovým reťazcom pre peptid s insekticídnym účinkom, izolovateľný z jedu pavúka Diguetia, pričom tento vektor je schopný spôsobiť expresiu uvedeného kódového reťazca v transformovaných bunkách, a na to sa peptid s insekticídnym účinkom z kultúry rekombinantných buniek izoluje·

Vynález umožňuje získanie nových transgenických rastlín, ktoré obsahujú kódový raťazec DNA pre peptid s insekticídnym účinkom, izolovateľný z jedu pavúka Diguetia, zavedený do zárodkovej línie tejto rastliny alebo do rodičovských rastlín tak, že uvedená vlastnosť, zakódovaná vloženým reťazcom DNA sa dedí v nasledujúcich generáciách tejto rastliny pri sexuálnom alebo asexuálnom množení.

Insekticídny prostriedok, získaný podľa vynálezu je možné použiť na hubenie bezstavovcových škodcov tak, že sa títo škodcovia privedú do styku s účinným množstvom peptidu s insekticídnym účinkom, izolovateľným z jedu pavúka Diguetia alebo zo soľou tohto peptidu, prijateľnou z poľnohospodárskeho alebo záhradkárskeho hľadiska.

Uvedeným spôsobom je teda možné hubiť bezstavovcových škodcov tiež tak, že sa škodcovia privedú do styku s rekombinantným baculovírusom, schopným expresie účinného množstva peptidu s insekticídnym účinkom, izolovateľného z jedu pavúka Diguetia alebo jeho soľou, prijateľnou z poľnohospodárskeho alebo záhradníckeho hľadiska.

Vynález sa taktiež týka nového insekticídneho prostriedku, ktorý obsahuje insekticídne účinné množstvo peptidu s insekticídnym účinkom, izolovateľného z jedu pavúka Diguetia alebo jeho soli prijateľné z poľnohospodárskeho alebo záhradníckeho hľadiska.

Podstatu vynálezu tvorí taktiež protilátka, imunoreaktívna s peptidom s insekticídnym účinkom, izolovateľným z jedu pavúka Diguetia alebo so soľou tohto peptidu, prijateľnú z poľnohospodárskeho alebo záhradníckeho hľadiska.

Vynález sa taktiež týka použitia protilátok podľa vynálezu na detekciu prítomnosti peptidu s insekticídnym účinkom, izolovateľného z jedu pavúka Diguetia, postup spočíva v tom, že sa získa pavúči jed, ktorý sa privedie do styku s uvedenou protilátkou, viazanou na zistiteľné označenie a preukáže sa prítomnosť značenej protilátky, viazanej na hľadaný peptid s insekticídnym účinkom.

Ďalej sa vynález týka tiež použitia protilátok podľa vynálezu na čistenie peptidu s insekticídnym účinkom, izolovateľného z jedu pavúka Diguetia, postup spočíva v tom, že sa protilátka naviaže na tuhý nosič, potom sa protilátka viazaná na tuhý nosič privedie do styku s roztokom, obsahujúcim čistený peptid, čím dôjde k väzbe tohoto peptidu s roztokom na protilátku, a na to sa protilátka s naviazaným peptidom oddelí od nosiča a čistený peptid sa izoluje.

Podstatu vynálezu tvorí tiež nová sonda DNA, odvodená od reťazca DNA, ktorý je kódovým reťazcom pre peptid s insekticídnym účinkom, izolovateľný z jedu pavúka Diguetia.

Vynález sa taktiež týka nového spôsobu detekcie prítomnosti kódovej nukleovej kyseliny pre peptid s insekticídnym účinkom, izolovateľný z jedu pavúka Diguetia, postup spočíva v tom, že sa získa nukleová kyselina pavúka, táto nukleová kyselina sa potom privedie do styku so sondou DNA podľa vynálezu a potom sa preukáže prítomnosť tejto sondy, viazanej na nukleovú kyselinu.

Na obr. matografia v za použitia tri skupiny TBV.

Na obr.

Vynález bude ďalej opísaný formou príkladov v súvislosti s priloženými výkresmi.

Prehľad obrázkov na výkrese je znázornená vysokotlaková kvapalinová chroreverznej fáze, RP HPLC jedu Diguetia canities gradientu 0,1 % TFA a acetonitrilu, zrejmé sú zložiek. Frakcia 2 predstavuje účinné zložky je znázornený DK 9,2 pri skúške o koncentrá- cii 1 mikromol na synaptickom prenose (vyvolaný vrchol) na Schafferovej kolateriálnej-CA 1-synapsii piramidálnych buniek na rezoch potkanieho hippocampu. Uvedené údaje znamenajú priemerný záznam v priebehu času, a to a) 5 minút pred pridaním DK 9,2 a b) v priebehu 15 až 20 minút po pridaní DK 9,2. Obidva záznamy sú totožné, čo znamená, že v tejto koncentrácii nemá DK 9,2 žiadny účinok na centrálny nervový systém potkanov, ktorý by bolo možné touto skúškou preukázať .

Na obr. 3 j e znázornená mapa pVR9, vektora pre prenos baculovírusu s obsahom kódového génu pre preDK 9,2.

Nä obr. 4 sú znázornené výsledky kontinuálneho pokusu na novorodených larvách Heliothis virescens (1 000 000

PBI/g krmiva).

Na obr. 5 je znázornená schopnosť TTX zabrániť alebo odstrániť svalové kŕče, vyvolané DK 9,2.

A. Definícia pojmu

Pod pojmom peptid s insekticídnym účinkom, izolovateľný z jedu pavúka Diguetia sa rozumejú insekticídne účinné peptidy a tiež fragmenty týchto peptidov z akéhokoľvek zdroja, pokiaľ je tento peptid možné izolovať z pavúka Diguetia akýmkoľvek známym spôsobom. Tieto zdroje zahrňujú napríklad insekticídne účinné peptidy, ktoré boli získané rekombinantnou technikou.

Pod pojmom vektor pre expresiu sa rozumejú vektory, schopné expresie reťazcov DNA, ktoré sú v nich obsiahnuté, pričom tieto reťazce sú operatívne spojené s Ďalšími reťazcami, ktoré expresiu podporujú alebo umožňujú. I keď to nie je výslovne uvedené, predpokladá sa, že tieto vektory pre expresiu musia byť schopné replikácie v organizme hostiteľa vo forme epizómov alebo ako integrálna časť chromozomálnej

DNA. V prípade, že by neboli schopne replikácie, su nepoužiteľné. Uvedený pojem je funkčnou definíciou a je možné ho použiť pre akýkoľvek reťazec expresiu špecifickej kódovej becne sa pri rekombinantných používa vektorov pre’ expresiu

DNA, ktorý je schopný zaistiť DNA, v ňom obsiahnutej. Všeopostupoch s použitím DNA často vo forme plazmidov, pod týmto pojmom sa rozumie cirkulárna DNA s dvojitým reťazcom, ktorá vo forme vektora nie je viazaná na chromozóm. Pojmy plazmid a vektor sa používajú zameniteľné vzhľadom na to, že plazmid je najbežnejšie používaný vektor. Avšak vynález zahrňuje aj iné formy vektora, ktoré môžu byť rovnako funkčné a ktoré sú taktiež v odbore známe.

Rekombinantná hostiteľská bunka je bunka, ktorá bola transformovaná pomocou vektora, skonštruovaného za použitia rekombinántnej DNA.

Čeľaď pavúkov Diguetidae je v súčasnej dobe tvorená jediným rodom Diguetia. Túto čeľaď je možné nájsť v juhozápadnej oblasti Spojených štátov včítane Kalifornie a tiež v Mexiku. Ide o malé pavúky, ktoré vytvárajú nepravidelné siete na rôznych typoch rastlín a krov v čítané kaktusu. Rôzne typy pavúkov Diguetia sú, ako väčšina pavúkov všeobecne predátormi, ktorí sa živia mnohými druhmi hmyzu, tak ako sú k dispozícii.

Aj napriek tomu, že vynález nemá byť obmedzený žiadnymi teoretickými úvahami, je neobvyklá skupina príznakov, ktorá vzniká po vstreknutí peptidov s insekticídnym účinkom podľa vynálezu rôznym typom hmyzu veľmi podobná príznakom, ktoré vznikajú v prípade, že sa týmto druhom hmyzu vstrekne veratridín, to znamená alkaloid, ktorý je aktivátorom kanálov pre sodné ióny alebo toxíny škorpiónov z čeľade Buthidae a rodu Buthus, ide taktiež o známe aktivátory presynaptických kanálov pre sodíkové ióny. Je pravdepodobné, že insekticídne účinné peptidy môžu spôsobiť čiastočnú depolarizíciu svalovej a/alebo nervovej membrány a pravdepodobne tiež ovplyvniť kanály pre sodné a draselné ióny. Je pravdepodobné, že insekticídne účinné peptidy vyvolávajú skupiny výbojov v nervových vláknach, ktoré je možné blokovať tetrodotoxínom. Miestom účinku týchto peptidov je teda pravdepodobne sodíkový kanál nervovej membrány, citlivý na potenciál.

B. Izolácia peptidov z jedu Diguetia

Jed z Diguetia je možné získať akýmkoľvek známym spôsobom, napríklad zo žľazy v cefalotoraxe. Avšak aby bolo možné sa vyvarovať prítomnosti nečistôt v jede a v izolovaných toxínoch, získava sa jed s výhodou elektrickým podráždením pavúkov tak, aby sami uvoľnili jed a tento uvoľnený jed sa potom odsáva tak, ako je opísané v US patentovom spise č. 4 925 664 aby nedošlo k jeho znečisteniu.

Akonáhle sa jed získaný elektrickým podráždením pavúkov, je možné ho frakcionovať a tak získať peptidové toxické zložky použitím vysokotlakovej kvapalinovej chromatografie HPLC alebo filtrácie na géli alebo iným vhodným frakcionačným postupom. Okrem xoho je často žiaduce použiť ako konečný stupeň frakcionácie HPLC.

Je teda možné po elektrickom podráždení pavúkov na uvoľnenie jedu, po gélovej filtrácii a/alebo HPLC alebo po iných podobných postupoch získať v podstate čistené toxíny pavúka. Je však zrejmé, že je možné na izoláciu týchto toxínov použiť aj iné ekvivalentné postupy. Izolované toxíny je možné analyzovať na insekticídny účinok a na reťazec aminokyselín známymi postupmi.

C. Peptidy s insekticídnym účinkom

Podstatu vynálezu tvoria peptidy s insekticídnym účin kom a ich insekticídne účinné fragmenty, izolovateľné z jedu pavúka Diguetia a tiež soli týchto látok, prijateľné z poľnohospodárskeho alebo záhradníckeho hľadiska.

Po izolácii a čistení frakcie, obsahujúcej účinný peptid je možné stanoviť reťazec aminokyselín akýmkoľvek známym spôsobom, napríklad od N-terminálnej aminokyseliny a za použitia automatického analyzátora aminokyselín.

Je zrejmé, že na základe zisteného, do rozsahu vynálezu budú patriť ďalšie skupiny insekticidne účinných bielkovín. Je tiež možné, že ďalšie účinné peptidy sú izolovateľné z pavúkov Diguetia okrem troch, zatiaľ podrobne opísaných peptidov. Ide zrejme o skupinu insekticídne účinných bielkovín, izolovaných z uvedeného rodu pavúkov. Všetky látky z tejto insekticídne účinnej skupiny peptidov, izolovateľných z pavúkov Diguetia majú zrejmé spoločné nasledujúce vlastnosti:

1) Všetky tieto látky majú molekulovú hmotnosť v rozmedzí 6200 až 7200 a obsahujú 55 až 65 aminokyselín,

2) konzervované aminoterminálne zakončenie: reťazce ID č.l, 3 a 5 sú totožné, pokiaľ ide o prvých päť aminokyselín,

3) reťazce ID č. 1, 3 a 5 majú homológiu reťazca vyššiu než 40 %.

4) Reťazce ID č. 1, 3 a 5 obsahujú 7 alebo 8 cysteínových zvyškov,

5) zhlukovanie génov: gény týchto toxínov alebo viacej než jedného z týchto toxínov sú spoločne uloženými úsekmi DNA genómu, čo pravdepodobne dokazuje, že všetky tieto gény môžu pochádzať z jediného staršieho génu.

Zatiaľ boli izolované tri peptidy s insekticídnym účinkom a boli stanovené ich vlastnosti. Prvý peptid je DK 9,2, bol izolovaný a jeho reťazec aminokyselín je po translácii z izolovanej cDNA uvedený ako reťazec ID č. 1. Pri hmotovej spektroskopii sa ukázalo, že ide asi o dva izozýmy, obsahujúce konzervatívnu substitúciu v polohe 26. Jedna z týchto látok má v polohe 26 zvyšok treonínu a druhá v tejto polohe obsahuje zvyšok glutamínu. Zlúčenina s obsahom zvyšku glutamínu má atómovú hmotnosť približne o 27 vyššiu než zlúčeni na, obsahujúca v uvedenej polohe zvyšok treonínu. Akákoľvek zmienka o DK a/alebo obidve pri stanovení

9,2 teda zahrňuje jednu alebo druhú látku tieto látky. Molekulová hmotnosť DK 9,2 je hmotovou spektrometriou približne 6371 až

6397 a pri HPLC v reverznej fáze sa pohybuje ako jediný vrchol. Ďalej bola izolovaná zlúčenina DK 11 s molekulovou hmotnosťou 6700 pri ' stanovení hmotovou spektrometriou alebo 6740 a pri HPLC v reverznej fáze sa pohybuje ako jediný vrchol. Táto účinná frakcia bola identifikovaná a jej reťazec aminokyselín je po translácii z izolovanej cDNA znázornený ako reťazec ID č. 3. Tretia zlúčenina z tejto skupiny je insekticídne účinná bielkovina DK 12 s molekulovou hmotnosťou 7100 alebo 7080 pri stanovení hmotovou spektrometriou, táto látka sa pri HPLC v reverznej fáze taktiež pohybuje ako jediný vrchol. Reťazec aminokyselín pre túto látku je znázornený ako reťazec ID č. 5. Všetky tri izolované peptidy, zodpovedajúce reťazcom ID č. 1, 3 a 5, majú v podstate rovnakú insekticídnu účinnosť. Je možné očakávať, že Ďalšie peptidy, obsahujúce 55 až 65 aminokyselín, majúce vyššiu homológiu reťazca než 40 % s reťazcami ID 1, 3 alebo 5 a obsahujúce 7 alebo 8 cysteínových zvyškov, budú mať v podstate rovnakú insekticídnu účinnosť. Takéto peptidy môžu existovať v prírode alebo je možné ich získať rekombinantnou technológiou DNA známym spôsobom. Tieto peptidy, prírodné alebo získané rekombinantnými postupmi sú taktiež spadajú do rozsahu vynálezu.

D. Identifikácia kódového reťazca insekticídne účinných peptidov podľa vynálezu

Vynález sa týka izolovaného kódového reťazca DNA pre

- 17 peptidy s insekticídnym účinkom, izolované z jedu pavúka Diguetia.

Použitím parciálneho reťazca aminokyselín, získaného vyššie uvedeným spôsobom je možné izolovať a identifikovať gény na produkciu bielkovín, izolovateľných z jedu pavúkov. Na získanie génu, ktorý je kódovým reťazcom pre produkciu peptidu je k dispozícii celý rad postupov. Ich príklady sú uvedené v publikáciách Euqua S. a ďalší, A simple PCR method for detection and clonihg low abudant transcript, Biotechnique, zv. 9, č. 2, august 1990, Frohman M. A., RAČE: Rapid amplification of cDNA ends, PCR protocols, ed. Innis a ďalší, Academic Press, San Diego, CA, 1990 a US patentový spis č. 4 703 008 DNA Sequences Encoding Erythropoietin.

Postupuje sa tak, že sa syntetizuje molekula DNA, ktorá je kódovým reťazcom pre stanovený reťazec aminokyselín alebo ktorá predstavuje komplementárny reťazec DNA k molekule DNA, ktorá je kódom pre stanovený reťazec aminokyselín. Táto syntetická molekula DNA potom môže byť použitá ako sonda na sledovanie homológie reťazcov DNA v bunkových klonoch, obsahujúcich rekombinantné molekuly DNA, v ktorých niektoré sú odvodené od cDNA-kópií molekúl mRNA, izolovaných z buniek alebo tkanív napríklad pavúkov. Obvykle je potrebné použiť molekulý DNA, obsahujúce aspoň 15 nukleidov na identifikáciu homológnej DNA, týmto spôsobom je nutné stanoviť aspoň päť aminokyselín v reťazci. Je zrejmé, že počet rôznych molekúl DNA, ktoré môžu byť kódovými reťazcami pre určitý stanovený reťazec aminokyselín môže byť značne veľký vzhľadom na to, že pre každú aminokyselinu môže byť kódom až šesť kodónov, to znamená reťazec troch nukleotidov v reťazci DNA. Nie je preto z praktického hľadiska vhodné použiť ku skúškam všetky existujúce syntetické sondy DNA a obvykle sa používajú zmesi molekúl DNA ako sondy. Získavanie týchto zmesí, označovaných ako degenerované sondy je známe. Je tiež zrejmé, že i keď len jedna molekula DNA v zmesi, tvoriaca sondu, bude mať presnú homológiu reťazca s hľadaným génom, môže byť niekoľko syntetických molekúl DNA v zmesi schopných presnej identifikácie tohoto génu vzhľadom na to, že je požadovaný len vyso ký stupeň homológie reťazca. Je teda zrejmé, že hľadaný gén je možné úspešne izolovať za použitia sondy, tvorenej zmesou syntetických reťazcov DNA, ktoré nemusia obsahovať všetky teoreticky možné sondy DNA. Všeobecne je možné uviesť, že kodóny, ktoré sú organizmom využívané len zriedka, nie je nutné zahrnúť do sondy, tvorenej zmesou reťazcov. Sondu je možné vytvoriť tak, že sa do DNA zahrnú len kodóny, ktoré sú v organizme pre jednotlivé aminokyseliny najčastejšie používané, i keď vo vzácnych prípadoch nemusí byť tento postup úspešný.

Jedným z postupov na identifikáciu reťazca génu je reakcia za použitia polymerázy, PCR-reakcie, ktorá bola opísaná napríklad v US patentových spisoch č. 4 683 195 a 4 683 202. PCR dovoľuje vytvoriť zvolený reťazec DNA v prípade, že sú známe obe jeho koncové časti. Vytvoria sa priméry alebo oligonukleotidové sondy, zodpovedajúce každému z uvedených zakončení reťazca. Potom sa pomocou PCR synteticky získa stredová časť reťazca DNA.

Pri jednom postupe, pri ktorom sa používa PCR na získanie génu, ktorý obsahuje kódový reťazec pre určitý jed pavúka sa z pavúka izoluje a čistí RNA. Potom sa ako primér použije oligonukleid s deoxytymidylovým zakončením tak, aby došlo k reverznej transkripcii RNA pavúka do cDNA. Potom sa pripraví syntetická sonda DNA alebo zmes syntetických molekúl DNA vo forme vyššie opísanej degenerovanej sondy, ktorá môže obsahovať kód pre reťazec aminoterminálnych aminokyselín bielkovinového toxínu, ako už bolo skôr stanovené. Táto zmes sa použije ako primér spolu s oligonukleotid s deoxytymidylovým zakončením pri PCR-reakcii. Vzhľadom na to, že syntetická zmes DNA, použitá ako primér pri PCR-reakcii je špecifická pre požadovaný reťazec mRNA, dôjde k účinnej amplifikácii len v prípade požadovanej cDNA. Výsledným produktom je amplifikovaná cDNA, ktorú je možné uložiť do známych vektorov pre klonovanie. Okrem toho je nutné uviesť, že v jedoch pavúkov môžu existovať skupiny príbuzných peptidov, ktoré majú veľmi podobné reťazce aminokyselín a použitím zmesi oligonukleotidových primérov môže dôjsť k amplifikácii jednej alebo väčšieho počtu kódových cDNA pre tieto príbuzné peptidy. Gény, obsahujúce kódové reťazce pre príbuzné peptidy majú taktiež použiteľnú insekticidnu účinnosť.

Získané reťazce cDNA je možné klonovať použitím príslušného vektora bežným spôsobom, analyzovať a stanoviť reťazec nukleotidových báz. Kódové reťazce DNA pre insekticídne účinné bielkoviny sú uvedené ako reťazce ID č. 2 a 4. Priama translácia aminokyselín pre tieto PCR-produkty môže dokázať, že zodpovedajú úplnému kódovému reťazcu pre príslušnú bielkovinu .

Okrem kódovej DNA pre úplný DK 9,2 bol klonovaný tiež reťazec cDNA proti smeru kódového reťazca DK 9,2 a bola stanovená analýza tohto reťazca, ide o reťazec ID č. 7. Pri translácii úplnej mRNA sa ukázalo, že DK 9,2 bol syntetizovaný ako prekurzorová bielkovina, obsahujúca signálny peptid, propeptid a toxín. Funkciou signálneho peptidu je cielenie syntetizovaného polypeptidu tak, aby došlo k jeho sekrécii. Signálny reťazec hrá dôležitú úlohu na zaistenie správneho uloženia novej syntetizovanej bielkoviny. Predstavuje obvykle topogenný signál, ako je opísané napríklad v Blobel G., Proc. Nat. Acad. Sci., USA, 77, 1496 až 1500, 1980, ktorý určuje, či bielkovinový reťazec zostane vo vnútri bunky alebo bude vylučovaný do vonkajšieho prostredia mimo bunku. To je zvlášť dôležité v prípade bielkovín, ktorých cieľové miesta sú mimo bunku. Táto skutočnosť je užitočná tiež pri produkcii rekombinantných bielkovín vzhľadom na to, že je ľahšie čistiť bielkovinu z extracelulárneho prostredia než rozrušiť bunky a čistiť bielkovinu z celého bunkového extraktu. Signálny peptid, pre ktorý je kódom kódová cDNA pre prekurzorovú bielkovinu DK 9,2, obsahuje asi 17 aminokyselín s nasledujúcim reťazcom:

Met-Lys-Val-Phe-Val-Val-Leu-Leu-CysLeu-Ser-Leu-Ala-Ala-Val-Tyr-Ala

Okrem signálneho peptidu bol zistený pri translácii mRNA proti smeru kódového reťazca DK 9,2 ešte propeptid.

Funkcia propeptidového reťazca je neznáma. Propeptid obsahuje 21 aminokyselín a má nasledujúci reťazec:

-Leu-Glu-Glu-Arg-Leu-Asp-Lys-Asp-Ala-Asp-Ile -Met-Leu-Asp-Ser-Pro-Ala-Asp-Met-Glu-ArgTieto prekurzorové peptidy alebo preproreťazce môžu podstatne prispievať k stálosti, expresii a tvorbe dvojitého reťazca DK 9,2 alebo iných rekombinantných bielkovín pri expresii in vivo a/alebo in vitro. Predpokladá sa tiež, že tieto reťazce alebo ich časti by mohli byť užitočné pri expresii iných molekúl, napríklad pri konštrukcii génu. V priebehu prihlášky bude tiež preukázané, že v prípade expresie rekombinantného DK 9,2 by mohli byť použité iné signálne a/alebo propeptidové reťazce.

E. Expresia rekombinantných štruktúr

Podstatu vynálezu tvorí tiež rekombinantný vektor pre expresiu, obsahujúci kódový reťazec DNA pre insekticídne účinný peptid, izolovateľný z jedu pavúka Diguetia. Tento vektor jé schopný zaistiť expresiu kódového reťazca v transformovateľných bunkách. Podstatu vynálezu tvoria tiež rekombinantné hostiteľské bunky, získané transformáciou alebo transfekciou za použitia kódového reťazca DNA pre isekticídne účinný peptid, izolovaný z jedu pavúka Diguetia tak, že v hostiteľskej bunke dochádza k expresii tohoto peptidu.

Získanie vhodného reťazca DNA, ktorý je kódovým reťazcom pre požadovanú bielkovinu, dovoľuje produkciu tejto bielkoviny za použitia známych rekombinantných postupov. Kódový reťazec je možné získať izoláciou cDNA alebo reťazca genómu z prírodného zdroja pre bielkovinu alebo je možné tieto štruktúry pripraviť synteticky použitím presného reťazca aminokyselín, stanoveného z nukleotidového reťazca génu. V prípade, že je kódová DNA pripravená synteticky, je možné využiť známe preferencie pre jednotlivé kodóny v zvolenom hostiteľovi.

Systémy pre expres i.u, obsahujúce príslušné riadiace reťazce, napríklad promótory a príslušné pomocné reťazce a terminačné riadiace reťazce sú dostupné a známe pre celý rad hostiteľov, ako je napríklad opísané v súhrnej publikácii Sambrook a ďalší, Molecular Cloning a Laboratory Manual, druhé vydanie, Cold Spring Harbor Press (1989).

Požadované bielkoviny je možné pripraviť v prokaryotických i v eukaryotických, čo vedie v prípade radu bielkovín k získaniu rôznych spracovaných foriem týchto látok.

Najčastejšie používaným prokaryotickým systémom stále zostáva E. coli, napriek tomu, že užitočné sú aj ďalšie systémy, napríklad B. subtilis a Pseudomonas. Vhodné riadiace reťazce pre prokaryotické systémy zahrňujú konštitutívne a indukovateľné promótory včítane promótorov lac a trp, ďalej hybridné promótory, napríklad promótor tac, ktorý je promótorom fágu lambda Pl. Obvykle je možné v týchto hostiteľoch dosiahnuť produkciu cudzorodých bielkovín buď vo forme zložených bielkovín alebo priamo ako požadované bielkoviny. V tomto druhom prípade môže dôjsť k tomu, že získaný reťazec má pred svojim začiatkom metionínový zvyšok, ktorý niekedy nie je ľahké účinne odstrániť. To znamená, že peptidy a bielkoviny podľa vynálezu môžu mať pred svoj im reťazcom pri získaní v baktériách na N-terminálnom zakončení zaradený zvyšok Met. Okrem toho je možné vytvoriť konštrukcie, v ktorých je pred kódovým reťazcom pre peptid uložený operatívne signálny peptid, čo má za následok vylučovanie bielkoviny z bunky. V prípade prokaryotického hostiteľa dochádza pri sekrécii k odstráneniu tohoto signálneho reťazca.

Na produkciu rekombinantných cudzorodých bielkovín je v súčasnej dobe k dispozícií rad eukaryotických hostiteľov. Rovnako ako v baktériách je možné eukaryotických hostiteľov transformovať systémami pre expresiu, ktoré vedú k priamemu získaniu požadovanej bielkoviny, avšak obvykle sa zaraďujú signálne reťazce na dosiahnutie sekrécie bielkoviny. Eukaryotické systémy majú ďalšiu výhodu, že môžu spracovať intróny, ktoré sa môžu vyskytnúť v genómových reťazcoch, ktoré sú kódom pre bielkoviny vyšších organizmov. Eukaryotické systé my obsahujú tiež rad mechanizmov na spracovanie, ktorými je možné dosiahnuť napríklad glykozyláciu, oxidáciu alebo derivatizáciu niektorých zvyškov aminokyselín a podobne.

Bežne používané eukaryotické systémy zahrňujú kvasinky, bunky hmyzu, cicavcov, vtákov a tiež vyšších rastlín. Tento zoznam nie je vyčerpávajúci. K dispozícii sú tiež vhodné promótory, ktoré sú kompatibilné a operatívne v rôznych typoch hostiteľov a tiež terminačné a pomocné reťazce, napríklad polyhedrínový promótor baculovírusu. Rovnako, ako je vyššie uvedené, môže byť promótor konštitutívny alebo môže byť úmyselne zaradený. Napríklad v bunkách cicavcov je možné promótor MTII indukovať pridaním iónov ťažkých kovov.

Podmienky pre konštrukciu systému pre expresiu v prípade určitého hostiteľa sú v odbore známe. V prípade rekombinantnej produkcie bielkoviny je kódová DNA naviazaná do zvoleného systému pre expresiu a systém sa potom použije na transformáciu kompatibilného hostiteľa, ktorý sa potom pestuje a udržuje za podmienok, pri ktorých dochádza k expresii cudzorodého génu. Takto získaná účinná bielkovina podľa vynálezu sa z kultúry izoluje rozrušením buniek alebo zo živého prostredia podľa známych postupov.

Je známe, že v bielkovinách, ktoré majú v podstate ekvivalentnú alebo aj zlepšenú účinnosť v porovnaní s pôvodnými peptidmi môže dochádzať k malým modifikáciám primárneho primárneho reťazca aminokyselín. Tieto modifikácie môžu byť náhodné, pokiaľ ide o mutagenézu, riadenú na určité miesto alebo môžu byť cielené, všetky tieto modifikácie sú zahrnuté do rozsahu vynálezu, pokiaľ je zachovaná insekticídna účinnosť. Mutácia bielkoviny mení primárnu štruktúru tejto látky vzhľadom na bežne sa vyskytujúcu alebo špecificky opísanú bielkovinu, príčinou tejto mutácie je zmena nukleotidového reťazca kódovanej DNA pre túto látku. Mutácie špecificky zahrňujú allelové varianty. Mutačné zmeny v primárnej štruktúre bielkoviny môžu spočívať vo vynechaní určitej časti reťazca, pridaním niektorých aminokyselín alebo môže ísť o zmenu niektorých aminokyselín na iné zvyšky. Pri vynechaní môže byť vynechaný jeden alebo väčší počet zvyškov aminoky selín vo vnútri reťazca. Pri pridaní niektorých zvyškov ide opäť o pridanie jedného alebo väčšieho počtu zvyškov aminokyselín vo. vnútri reťazca v porovnaní s reťazcom divokého typu. Nahradiť je možné tiež jeden alebo väčší počet zvyškov aminokyselín inými zvyškami aminokyselín. Pod pojmom fragment bielkoviny sa rozumie polypeptid, tvorený primárnym reťazcom aminokyselín, ktorý je totožný s časťou primárneho reťazca bielkoviny.

Výhodnými náhradami sú tiež takzvané konzervatívne substitúcie, to znamená prípady, v ktorých je určitý zvyšok nahradený iným zvyškom toho istého všeobecného typu. Je známe, že prírodné sa vyskytujúce aminokyseliny je možné deliť na kyslé, bázické, neutrálne a polárne alebo tiež na neutrálne, nepoláme a/alebo aromatické. Obvykle je vhodné, aby peptidy, ktoré sa odlišujú od pôvodnej formy obsahovali aminoskupinu z tej istej skupiny v nahradenom mieste a kódový reťazec aby obsahoval kód pre túto aminokyselinu.

Všeobecne je možné uviesť, že je možné vzájomne zameniť bázické aminokyseliny Lys, Arg a His, kyslé aminokyseliny Asp a Glu, neutrálne aminokyseliny Ser, Thr, Cys, Gin a Asn, nepoláme alifatické aminokyseliny Gyl, Ala, Val, íle a Leu, avšak vzhľadom k veľkosti molekuly sú bližšie príbuzné Gly a Ala a potom Val, íle a Leu a ďalej aromatické aminokyseliny Phe, Trp a Tyr.

Pokiaľ ide o aminokyseliny Pro, ide síce o nepolámu neutrálnu aminokyselinu, avšak tento zvyšok pôsobí ťažkosti vzhľadom na to, že je ešte nutné brať ohľad na zaradenie tohoto zvyšku medzi iné zvyšky a ten istý výsledok je možné dosiahnuť len pri totožnom alebo veľmi podobnom zaradení inej aminokyseliny medzi tieto zvyšky. Polárne aminokyseliny, ktoré je možné vzájomne nahradzovať, sú Ser, Thr, Gin, Asn a v menšej miere Met. Okrem toho je v niektorých prípadoch možné vzájomne zameniť Ala, Gly a Ser a v niektorých prípadoch Cys, aj napriek tomu, že sú tieto zvyšky inak zaradené do odlišných kategórií. V niektorých prípadoch je tiež ešte možné zameniť aminokyseliny z rôznych skupín.

Vzhľadom na to, že bielkoviny podľa vynálezu môžu byť rekombinantné, je možné ich tiež získavať rekombinantnými postupmi, napríklad pomocou automatického syntetizátora reťazcov aminokyselín. Vzhľadom na rôzne spracovanie po translácii v rôznych hostiteľských bunkách, je tiež možné získať rôzne modifikácie v porovnaní s prírodnými bielkovinami. Modifikovaná bielkovina sa líši od nemodifikovanej bielkoviny post-translačnými zmenami, ako je glykozylácia, amidácia alebo lipidácia alebo sa môže meniť primárna, sekundárna alebo terciálna štruktúra bielkoviny, všetky tieto modifikácie sú zahrnuté do rozsahu vynálezu.

Je tiež nutné uviesť, že v prípade, že bielkoviny, napríklad reťazec ID č. 1 sú vyrobené synteticky, je možné použiť tiež substitúcie aminokyselín, ktoré nie sú v géne zakódované. Alternatívne zvyšky zahrňujú napríklad tiež omega-aminokyseliny všeobecného vzorca , kde n je 2 až 6. Ide o neutrálnu, nepolámu aminokyselinu, ako sarkozíh (Sar), terc.butylalanín (t-BuAla), terc,butylglycín (t-BuGly), N-metylizoleucín (N-Melle) a norleucín (Nleu). Je napríklad možné použiť fenylglycín namiesto Trp, Tyr alebo Phe, citrullín (Cit) a metionínsulfoxid (MSO) sú polárne, avšak neutrálne, ale cyklohexylalanín (Cha) je neutrálny a polárny, kyselina cysteínová (Cya) je kyslá a ornitín (Orn) je bázický. Zaradenie hydroxyprolínu (Hyp) namiesto prolínu obvykle opäť vyžaduje zachovanie konformácie, to znamená zaradenie tohoto zvyšku medzi ďalšie špecifické zvyšky.

F. Transgenické rastliny

Použitím uvedených postupov je možné získať transgenické rastliny, obsahujúce kódový reťazec DNA pre insekticídne účinné peptidy, izolovateľné z jedu pavúka Diguetia, v zárodkovom materiáli rastliny, takže vlastnosť expresie reťazca DNA sa dedí v nasledujúcich generáciách rastliny pri sexuálnom alebo asexuálnom množení.

Gény, ktoré sú kódom pre insekticídne účinné peptidy podľa vynálezu je možné do rastliny uložiť pomocou genetic kého inžinierstva, takže je možné zaistiť produkciu peptidu v rastlinnej bunke a týmto spôsobom hubiť hmyzích škodcov. Je teda možné týmto spôsobom vytvoriť rastlinu, ktorá je k hmyzu tolerantnejšia než prírodné sa vyskytujúce varianty.

Kódová oblasť pre insekticídne účinný peptid môže byť využitá na transformáciu rastliny v celej dĺžke génu alebo je možné použiť len jej účinnú časť. Je však potrebné, aby došlo k expresii kódového reťazca pre peptid a tým k produkcii funkčného peptidu vo výslednej rastlinnej bunke. K tomuto účelu je zrejmé možné použiť DNA a cDNA genóm a syntetickú DNA, obsahujúcu kódový reťazec pre účinný peptid. Okrem toho je možné skonštruovať z klonu cDNA gén, napríklad čiastočne z genómového klonu a čiastočne zo syntetického génu, pričom je možné použiť rôzne kombinácie jednotlivých častí. Okrem toho môže kódová DNA génu pre uvedený peptid obsahovať časti z iných druhov než je zdroj, z ktorého bol peptid izolovaný .

Okrem toho je zrejmé, že je možné kombinovať peptid s insekticídnym účinkom s inou zlúčeninou alebo zlúčeninami za účelom získania neočakávaných insekticídnych vlastností transformovanej rastliny, u ktorej potom dochádza k expresii rôznych zlúčenín na základe chimérnych génov, v rastline obsiahnutých. Tieto ďalšie zlúčeniny môžu zahrňovať inhibítory proteázy, napríklad s perorálnou toxicitou pre hmyz alebo tiež polypeptidy z Bacillus thuringiensis. Bielkovina z Bacillus thuringiensis pôsobí zmeny priepustnosti bunkovej membrány buniek v čreve hmyzu pre draslík, takže pravdepodobne v membráne vznikajú malé póry. Je možné použiť aj iné, póry vytvárajúce bielkoviny v kombinácii s insekticídne účinnými peptidmi. Príkladom bielkovín, ktorých pôsobením sa v bunkovej membráne vytvárajú póry, môžu byť magainíny, cecropíny, attacíny, meiittín, gramicidín S, bielkoviny, ktoré môžu ovplyvniť sodíkové kanály a ich syntetické fragmenty, alfa-ΐοχίη zo Staphylococcus aureus, apolipoproteíny a ich fragmenty, alameticín a rad syntetických amfifatických peptidov. Lecitíny, ktoré sa môžu viazať na bunkovú membránu a podporujú endocytózu sú ďalšou skupinou bielkoviny, ktorú je možné použiť v kombinácii s insekticídne účinnými peptidmi podľa vynálezu na dosiahnutie genetickej modifikácie rastliny na zaistenie odolnosti proti hmyzu.

Promótor peptidového génu je zrejme vhodnou časťou konštrukcie pri expresii chimérneho génu, je však asi možné použiť tiež iné promótory. Účinný rastlinný promótor, pri ktorého použití je možné dosiahnuť vysokú produkciu požadovanej látky. Tento promótor potom môže pri operatívnom spojení s kódovým reťazcom pre peptid zaistiť expresiu peptidu, takže transformovaná rastlina má zvýšenú toleranciu voči hmyzím škodcom. Rastlinné promótory uvedeného typu, ktoré budú vhodné pre toto použitie, sú známe.

Chimérny genetický reťazec, obsahujúci gén pre insekticídne účinný peptid, operatívne viazaný na promótor je možné uložiť do vhodného vektora pre klonovanie a použiť na transformáciu požadovanej rastliny. Všeobecne sa používajú plazmidy alebo vírusové vektory (bakteriofágy), obsahujúce reťazce pre replikáciu a riadiace reťazce, odvodené od druhov, kompatibilných s hostiteľskou bunkou. Vektor pre klonovanie bude typicky obsahovať začiatok replikácie a tiež špecifické gény, schopné fenotypicky odlišiteľného značenia transformovaných hostiteľských buniek, ako je napríklad odolnosť proti antibiotikám. Po transformácii hostiteľských buniek je potom transformované bunky možné odlíšiť podľa uvedeného fenotypového označenia.

Použiteľnými hostiteľskými bunkami by mohli byť prokaryotické bunky včítane bakteriálnych hostiteľov, ako sú E. coli, Salmonella typhimurium a Serratia marcescens, použiť je možné tiež eukaryotickú hostiteľskú bunku, napríklad kvasinky alebo vláknité huby.

Vektor pre klonovanie a hostiteľská bunka, transformovaná týmto vektorom sa všeobecne používajú na zvýšenie počtu kópií vektora. Po zvýšení počtu kópií je možné vektory s obsahom génu pre peptid izolovať a použiť napríklad na uloženie príslušných genetických reťazcov do rastlín alebo do iných hostiteľských buniek.

Postupy na vytvorenie rastlín, u ktorých dochádza k expresii cudzorodých génov sú známe. Rastlinné tkanivo je napríklad možné transformovať priamou infekciou alebo spoločným pestovaním rastlín, rastlinných tkanív alebo rastlinných buniek a A. tumefaciens, ďalej je možné preniesť gén alebo exogénnu DNA priamo do protoplastov, je možné využiť tiež inkubáciu s PEG, mikroinjekcie alebo takzvaného bombardovania pomocou mikroprojektilu.

Transformácia tabaku pomocou otvorenia pórov pôsobením elektrického prúdu bola opísaná v Ag Biotechnology News, zv. 7, str. 3 a 17, september a október 1990. Pi tomto postupe sa otvoria póry rastlinných protoplastov pôsobením elektrického prúdu v prítomnosti plazmidov, obsahujúcich genetickú konštrukciu pre insekticídne účinný peptid. Použitím elektrických impulzov s vysokou energiou póla dochádza k reverzibilnej priepustnosti biologických membrán, takže je možné do nich uložiť plazmidy. Potom dochádza k regenerácii bunkovej steny protoplastov, k ich deleniu a vytvoreniu rastlinného tkaniva. Selekciu transformovaných rastlinných buniek, u ktorých dochádza k expresii insekticídne účinného peptidu je možné uskutočniť pomocou fenotypového značenia, ako už bolo vyššie opísané. Exogénnu DNA je možné k protoplastom pridať v akejkoľvek forme, napríklad vo forme voľne lineárnej, cirkulárnej alebo špirálovitej DNA, DNA, uzavretej do lipozómov, sféroplastov alebo iných rastlinných protoplastov, vo forme komplexu so sólami a pod.

Úplné rastlinné bunky, ktoré možno transformovať za použitia Agrobacterium a rastliny, regenerované z transformovaných buniek je možné podobným spôsobom tiež transformovať spôsobom podlá vynálezu za získania transformovaných rastlín, obsahujúcich gén pre insekticídne účinný peptid. Transformácia ryže bola opísaná napríklad v publikácii D. M. Rainer a ďalší, Agrobacterium-mediated transformation of rice (Oryza sativa 1.), Biotechnology, zv. 8, str. 33 až 38, január 1990.

Ďalším postupom na zavedenie génu pre insekticídne účinný peptid do buniek rastliny je infekcia rastlinných bu niek pomocou A. tumefaciens, transformovaného génom pre insekticídne účinný peptid. Za vhodných známych podmienok je možné transformované rastlinné bunky pestovať tak, že dochádza k vytvoreniu výhonkov a koreňov a k vývoju celej transformovanej rastliny. Genetické reťazce pre insekticidne účinné peptidy je možné zaviesť do príslušných rastlinných buniek napríklad použitím plazmidu Ti z A. tumefaciens. Uvedený plazmid sa prenesie do rastlinnej bunky pri infekcii A. tumefaciens a dôjde k jeho stabilnej integrácii do génu rastliny.

ne z týchto oblastí sa Označuje DNA láva tvorbu nádorov. Druhá, pre tvorbu, avšak nie na ktorá sa prenáša do genómu žením genetického reťazca k nepriaznivému dových reťazcov vaný plazmid Ti nu podľa vynálezu do príslušných rastlinných buniek.

Genetický materiál je tiež možné preniesť do rastlinnej bunky použitím polyetylénglykolu PEG, ktorý vytvára komplex

Plazmidy Ti obsahujú dve oblasti, ktoré sú pravdepodobpodstatné pre produkciu transformovaných buniek. Jedna pre prenos (T DNA) a vyvovirulentná oblasť, je podstatná udržanie nádorov. Oblasť T DNA, rastliny, môže byť zväčšená ulopre enzým, bez toho aby došlo oblasti TDNA. Po odstránení kónádorov je potom možné modifiko ovplyvneniu pre tvorbu použiť ako vektor pre prenos konštrukcie gés genetickým materiálom a tento komplex je potom bunkou prij ímaný.

Prenos DNA do rastlinných buniek je možné uskutočniť tiež vstreknutím do izolovaných protoplastov, pestovaných buniek a tkanív alebo meristematických tkanív semenáčkov a rastlín. Transgenické rastliny a ich potomstvo sa potom získa bežným spôsobom.

Ďalší postup na zavedenie cudzorodého reťazca DNA do rastlinnej bunky spočíva v naviazaní tejto DNA na častice, ktoré sa potom zavedú do rastlinnej bunky prístrojom, vysielajúcim strely. Ako cieľ môže byť použité akékoľvek rastlinné tkanivo alebo rastlinný orgán, včítane zárodkových buniek, apikálnych a iných pletív, pukov, somatických a sexuálnych tkanív in vivo a in vitro. Transgenické bunky a kallus sa volia podľa známych postupov. V cieľových tkanivách sa potom vyvolá tvorba zárodkových tkanív alebo regenerácia klíčkov za vzniku celých transgenických rastlín známymi postupmi. Príslušný postup sa volí podľa zvoleného druhu rastliny. Napríklad transgenické rastliny kukurice boli pripravené prenosom génov do embryonálnych buniek pomocou mikroprojektilov s vysokou rýchlosťou, ako bolo opísané v publikácii Inheritance and expression of chimeric genes in the progeny of transgenic maize plánts”, Biotechnology, zv. 8, str. 833 až 838, september 1990.

Regenerovaná rastlina môže byť chimérna, pokial ide o cudzorodú DNA. V prípade, že sa bunky s obsahom DNA cudzieho pôvodu vyvíjajú na mikrospóry alebo makrospóry, dôjde k prenosu integrovanej cudzorodej DNA do sexuálneho potomstva. V prípade, že bunky, obsahujúce cudzorodú DNA sú somatické bunky, získajú sa nechimérne transgenické rastliny bežným vegetatívnym, t.j. asexuálnym množením in vivo z pukov alebo odrezkov alebo in vitro známym spôsobom. Tiež tieto postupu sa volia podľa zvolenej čeľade rastlín.

Po transformácii rastlinnej bunky alebo rastliny je možné podrobiť selekcii tie rastliny, u ktorých dochádza k expresii peptidov, na základe príslušného fenotypového označenia. Toto fenotypové označenie zahŕňa napríklad odolnosť voči antibiotikám. Známe je tiež iné fenotypové označenie, ktoré je taktiež možné použiť.

Vzhľadom k najrôznejším transformačným systémom je možné zásadne transformovať všetky typy rastlín, takže u nich môže dochádzať k expresii insekticídne účinného peptidu podľa vynálezu.

Existujú stále sa množiace dôkazy, že je možné z pestovaných buniek alebo tkanív regenerovať prakticky všetky rastliny včítane všetkých dôležitých plodín, ako sú obilniny, cukrová trstina, cukrová repa, bavlník, ovocné a iné stromy, strukoviny a zeleninu. Zatiaľ existuje len omedzená informácia o tom, či je možné všetky tieto rastliny transformovať použitím Agromacterium. Rastliny, ktoré sú prirodzenými hostiteľmi Agrobacterium môžu byť transformované in vitro. Jednoklíčne rastliny a zvlášť obilniny a trávoviny nie sú prirodzenými hostiteľmi Agrobezterium. Pokusy transformovať tieto rastliny použitím Agrobacterium boli dlho neúspešné, avšak teraz sa množia informácie o tom, že i niektoré jednoklíčne rastliny je možné týmro spôsobom transformovať, ide napríklad o obilniny a trávoviny.

Ďalšie rody rastlín, ktoré je možné transformovať pomocou Agrobacterium, zahrňujú: Ipomoea, Passiflora, Cyclamen, Malus, Prunus, Rosa, Rubus, Populus, Santalion, Allium, Lilium, Narcisus, Ananas, Arachis, Phaseolus a Pisum.

Regenerácia sa mení podľa druhu rastliny, avšak obvykle sa najprv získa suspenzia transformovaných protoplastov, obsahujúcich mnohopočetné kópie génu pre insekticídne účinný peptid. Tvorbu embryí je možné indukovať zo suspenzie protoplastov až do štádia dozrievania a germinácie, ako je to u prírodných embryí. Životné prostredie bude obvykle obsahovať rôzne aminokyseliny a hormóny. Klíčky a korienky sa obvykle vyvíjajú súčasne. Účinná regenerácia bude závisieť na použitom prostredí, na genotype a na histórii kultúry. Vhodným riadením týchto troch premenných je možné dosiahnuť plne reprodukovateľnej a opakovateľnej regenerácie.

Zrelé rastliny, vypestované z transformovaných rastlinných buniek je možné použiť na získanie inbredných rastlín. Inbredné rastliny produkujú semená, obsahujúce gén pre insekticídne účinný peptid. Tieto semená je možné pestovať na získanie rastlín, u ktorých dochádza k expresii insekticídne účinného peptidu. Napríklad je možné získať hybridy, tolerantné k hmyzu. Postupuje sa tak, že sa inbredná línia, tolerantná pre hmyz kríži s ďalšou inbradnou líniou za vzniku hybridu.

U diploidných rastlín sa typicky použije jedna rodičovská rastlina, transformovaná genetickým reťazcom pre insekticídne účinný peptid (toxín) a druhá divokého typu. Po krížení budú hybridy prvej generácie mať distribúciu 1/2 toxín/divoký typ a 1/2 toxín/divoký typ. Tieto hybridy F^ sa opäť vzájomne množia za vzniku druhej generácie hybridov F₂s distribúciou 1/4 toxín/toxín, 1/2 toxín/divoký typ a 1/4 divoký typ/typ. Ako rastliny, tolerantné ku hmyzu sa potom volia hybridy F2 s distribúciou toxín/toxín.

Pojem, variant, používaný v priebehu prihlášky označuje fenotypovú zmenu, ktorý je stály a dedí sa včítane variácií, ktoré sa dedia a sú sexuálne prenášané na potomstvo za predpokladu, že u variantu stále dochádza k expresii insekticídne účinného peptidu podľa vynálezu. Pod pojmom mutanta sa rozumie variácia v dôsledku vplyvu podmienok vonkajšieho prostredia, napríklad žiarenia alebo v dôsledku genetickej variácie, pri ktorej sa určitá vlastnosť prenáša meioticky podľa známych zákonov dedičnosti. U mutovanej rastliny však musí stále dochádzať k expresii peptidov podľa vynálezu.

Všeobecne je možné uviesť, že ideálnou bielkovinou s insekticídnym účinkom, zvolenou pre expresiu v transgenickej rastline bude taká bielkovina, ktorej použitie je bezpečné z hľadiska hmyzu, ktorý nemá byť vyhubený a z hľadiska stavovcov. Systém pre expresiu je nutné voliť tak, aby bola dosiahnutá účinná úroveň expresie. Možnosť transgenických, z poľnohospodárskeho hľadiska dôležitých plodín môže pomôcť vylúčiť pôsobenie škodcov bez poškodenia plodín a bez znečistenia životného prostredia.

G. Použitie peptidov ako insekticídov

Peptidy podľa vynálezu s insekticídnym účinkom je možné použiť na hubenie bezstavovcových škodcov, napríklad radu Lepidoptera tak, že sa títo škodcovia privedú do styku s účinným množstvom peptidu vynálezu. Títo škodcovia sú obvykle hmyzí škodcovia.

Spôsob, ktorým je možné priviesť bezstavovcových škodcov do styku s peptidom, sú známe. Je napríklad možné bielkovinu synteticky zapuzdriť tak, aby bola škodcom perorálne prijímaná. Rekombinantný hostiteľ, u ktorého dochádza k expresii bielkoviny podľa vynálezu, napríklad Pseudomonas fluorescens, môže byť usmrtený zohriatím pre perorálne prij imanie škodcom.

Je samozrejmé, že hubenie hmyzu použitím bielkovín podľa vynálezu je možné kombinovať s inými postupmi na hubenie škodcov. Je napríklad možné dosiahnuť u transgenických rastlín alebo u E. coli expresiu iných toxínov pre bezstavovcov v závislosti na škodcovi, ktorý má byť vyhubený a na ďalších podmienkach.

Týmto spôsobom je možné získať insekticídne prostriedky, ktoré obsahujú insekticídne účinné množstvo peptidu podľa vynálezu alebo jeho soli, prijateľné z poľnohospodárskeho alebo záhradníckeho hľadiska a okrem toho nosič, prijateľný z poľnohospodárskeho alebo záhradníckeho hľadiska.

H. Protilátky proti'insekticídne účinným peptidom

Podstatu vynálezu tvoria tiež protilátky proti insekticídne účinným peptidom podľa vynálezu. V nasledujúcom opise budú uvádzané odkazy na známe imunologické postupu na detekciu a čistenie peptidov, ktoré môžu reagovať s takými protilátkami.

Protilátka je schopná sa viazať na molekulu v prípade, že je schopná špecificky reagovať s touto molekulou za vzniku vzájomnej väzby. Epitop je tá časť peptidového antigénu, ktorá je protilátkou rozpoznávaná a na ktorú sa protilátka viaže. Antigén môže mať jeden alebo viacej než jeden epitop. Antigén je látka, ktorá je schopná u živočícha vyvolať tvorbu protilátky, schopnej viazať sa na epitop tohoto antigénu. Špecifická reakcia uvedeného typu dokazuje, či je antigén imunoreaktívny, to znamená vysoko selektívny len svojou väzbou na zodpovedajúce protilátky a nie väzbou na ďalšie protilátky, ktorých tvorba mohla byť vyvolaná inými antigénmi.

Pojem protilátka (Ab) alebo monoklonálna protilátka (Mab) zahŕňa celú molekulu alebo jej fragmenty, napríklad fragmenty Fab alebo F(ab’)₂. schopné sa viazať na antigén. Oba uvedené fragmenty neobsahujú fragment Fc neporušenej protilátky, vylučujú sa rýchlejšie z obehu a majú menšiu mieru nešpecifickej väzby na protilátku hmyzieho tkaniva.

Protilátky podľa vynálezu môžu byť pripravené rôznymi postupmi. Spôsoby výroby protilátok sú dobré známe a úplne opísané v.literatúre, napríklad v súhrnej publikácii Sambrook a ďalší, Molecular Cloning a laboratory manual, druhé vydanie, Cold Spring Harbor Press, zv. 3, kap. 18, 1989. Je napríklad možné podať bunky, u ktorých dochádza k expresii insekticídne účinného peptidu alebo jeho fragmentu živočíchom, čím sa vyvolá produkcia séra, obsahujúceho polyklonálne protilátky, schopné väzby na insekticídne účinný peptid. Obvykle sa pripraví čistý insekticídne účinný peptid, v podstate prostý prirodzených nečistôt alebo sa syntetizuje insekticídne účinný peptidový fragment známym spôsobom. Potom sa čistený fragínent alebo syntetizovaný fragment alebo čisteného prírodného fragmentu a/alebo syntetizovaného fragmentu zavedie do živočícha na získanie polyklonálneho antiséra s vyšším špecifickým účinkom.

Monoklonálne protilátky je možné pripraviť použitím známeho postupu s využitím hybridomu. Tento postup obvykle zahŕňa imunizáciu živočícha insekticídne účinným peptidovým antigénom. Potom sa z tohoto živočícha vyberú splenocyty a uskutoční sa ich fúzia s vhodnou bunkovou líniou myelómu. Pri vykonávaní spôsobu podľa vynálezu je možné použiť akúkoľvek vhodnú bunkovú líniu uvedeného typu. Po fúzii sa výsledné bunky hybridomu selektívne udržujú vo výhodnom živnom prostredí a potom sa klonujú obmedzením riedenia. Takto získané bunky sa potom podrobia selekcii na identifikáciu klonov, u ktorých dochádza k vylučovaniu protilátok, schopných väzby na insekticídne účinný peptid ako na antigén.

V prípade, že peptidový zdroj je nečistý, budú len niektoré bunky hybridomu produkovať protilátky, schopné viazať sa na peptid (ostatné bunky budú produkovať protilátky, schopné väzby na rôzne nečistoty). To znamená, že je nutné vybrať z buniek hybridomu tie, ktoré vylučujú protilátku, schopnú viazať sa na peptid. To je možné vykonať inkubáciou vzorky peptidu alebo jedu v prítomnosti monoklonálnej protilátky, vylučovanej skupinou buniek hybridomu a identifikáciou tých buniek hybridomu, ktoré sú schopné vylučovať pro tilátku, schopnú neutralizovať jed alebo znížiť jeho schopnosť paralyzovať hmyz. Akonáhle je takáto bunka identifikovaná, je možné ju množiť známym spôsobom a získať tak špecifickú monoklonálnu protilátku proti uvedenému peptidu z takto získaného bunkového klonu.

Toxín, selektívny pre hmyz je možné čistiť v natívnej alebo rekombinantnej forme použitím afinitnej chromatografie s viazanou protilátkou. Je nutné použiť protilátku, schopnú väzby na insekticídne účinný peptid, obvykle monoklonálnu protilátku. Akonáhle je takáto špecifická monoklonálna protilátka proti peptidu získaná, je možné ju imobilizovať väzbou na tuhý nosič a použiť na čistenie peptidu z prírodného jedu alebo iného zdroja afinitnej chromatografie známym spôsobom. Týmto postupom je možné dosiahnuť vysokého stupňa čistenia a získať peptid, v podstate zbavený prírodných nečistôt. Pod týmto pojmom sa rozumie peptid vo forme, zbavenej nečistôt, ktoré sú s ním obvykle v prirodzenom stave spojené, to znamená ďalších bielkovín, lipidov, uhľohydrátov a podobne.

Akonáhle je peptid vyčistený, je možné ho použiť na imunizáciu živočícha, napríklad myši alebo králika na vyvolanie pólyklonálnych protilátok, špecifických pre použitý peptid.

Od reťazca DNA, ktorý je kódovým reťazcom pre insekticídne účinný peptid, v podstate izolóvateľný z jedu pavúka Diguetia je možné odvodiť sondy vhodnej veľkosti, obvykle 10 až 50 nuklidov. Tieto sondy je potom možné použiť na detekciu prítomnosti kódovej DNA pre insekticídne účinný peptid, izolovateľný z jedu Diguetia tak, že sa jed privedie do styku so sondou DNA a zistí sa prítomnosť sondy, konjugovanej s hľadanou kódovou DNA známym spôsobom.

I. Insekticídne mikroorganizmy, získané genetickým inžinierstvom

Insekticídne účinný peptid ako taký alebo v kombinácii s inými toxínmi je možné využiť na potenciáciu alebo žvýše35 nie toxicity mikroorganizmov, napríklad baculovírusu alebo hybridných baktérií.

V rade štátov už boli nájdené určité typy baculovírusov včítane tých, ktoré vyvolávajú infekciu Heliothis virescens, Orgyia pseudotsugata, Lymantia dispar, Aurographa californica, Neodiprion sertifer a Lanspcyresia pomonella a boli použité ako pesticídy. Je možné očakávať, že účinnosť týchto pesticídov by bolo možné ešte zvýšiť tak, že sa do genómu zavedie gén aspoň pre jeden toxín, selektívny pre určité druhy hmyzu.

Rekombinantným vektorom pre expresiu, zvlášť vhodným nä použitie pri vykonávaní spôsobu podľa vynálezu je vektor pre expresiu z baculovírusu, opísaný v US patentovom spise č. 4 879 236 a tiež v publikácii Carbonell a ďalší, Synthesis of a gene coding for an insect-specific scorpion neurotoxin and attempts to exprešs it using baculovírus vectors, Gene, 73:409 - 418, 1988. Tento vektor bude pravdepodobne veľmi vhodný v systéme, v ktorom bude kódový reťazec DNA pre insekticídne účinný peptid, izolovaný z jedu pavúka Diguetia klonovaním v baculovíruse, napríklad Autographa californica (AcMNPV) v jeho vektore pre expresiu, tak ako bolo opísané v US patentovom spise č. 4 879 236 a v publikácii Miller a ďalší, Science, 219, 715 - 721, 1983. Rekombinantný vektor pre expresiu tohoto vírusu môže byť uložený do rastliny alebo živočícha, vzhľadom ku ktorému je hmyz škodcom a po použití vírusu hmyzom sa rekombinantný vírus dostane do buniek jeho črevnej steny a dôjde k jeho replikácii. V priebehu tejto replikácie dôjde tiež k expresii génov pre účinnú bielkovinu, takže hmyz bude zahubený alebo oslabený v kratšej dobe než v prípade, keď dôjde k požitiu divokého vírusu AcMNPV.

Je tiež možné očakávať, že použiteľný bude aj hybridný vírus, ako sa opisuje v európskom patentovom spise EP 0 340 948. Hybridný vírus, u ktorého dochádza k expresii DNA podľa vynálezu, môže mať zmenené spektrum pôsobenia na hmyz. Môže napríklad dochádzať k expresii zloženej bielkoviny ako jediného produktu hybridného génu, tvoreného DNA podľa vynálezu a špecifickou bielkovinou, rozpoznávajúcou črevné bunky hmyzu, takže insekticidne účinný peptid je priamo smerovaný na hostiteľskú bunku, ktorú môže poškodiť.

Zásadne je možné transformovať rôzne prokaryotické a eukaryotické mikroorganizmy tak, aby u nich dochádzalo k expresii hybridného génu pre toxín, ktorý je kódom pre insekticídne účinnú bielkovinu, postup bol opísaný v európskom patentovom spise EP 0 325 400.

Hybridné bakteriálne bunky, obsahujúce plazmid s ulože- • ným génom pre bielkovinu podľa vynálezu bude možné úspešne použiť na vykonávanie spôsobu podľa vynálezu. Hmyz bude hu- • bený tak, že sa privedie do styku s týmito hybridnými bunkami, ako je obdobne opísané napríklad v US patentovom spise č. 4 797 279.

Ďalšie príklady použitia baculovírusu, ktoré by bolo možné využiť pri vykonávaní vynálezu, boli opísané v publikácii Tomalski a ďalší, insect paralysis by baculovirusmediated expression of a mite neurotoxin gene, Náture, 352, 82 - 85, 1991), a Stevard a ďalší, Construction of an improved baculóvirus insekticíde containing an insect-specific toxin gene, Náture, 352:85 - 88 (1991), McCutchen a ďalší,

Development of a recombinanť Baculóvirus expressing an , insect seective Neurotoxin: Potential for Pest Control,

Biotechnology, 9:848 - 851 (1991).

J. Skrížená hybridizácia: reťazce DNA ako sondy pre príbuzné zlúčeniny

Sondy DNA vhodnej veľkosti je možné odvodiť od reťazca DNA podľa vynálezu. Tieto sondy je možné použiť na detekciu prítomnosti kódových nukleových kyselín pre insekticidne účinný peptid podľa vynálezu hybridizáciou s nukleovými kyselinami z iných zdrojov. Použitie oligonukleotidových sond, ktoré sú kódovými reťazcami pre signálne reťazce, fragmenty cDNA alebo celú cDNA za silne vymedzených podmienok umožní nájsť ďalšie účinné peptidy s funkčnou homológiou so skupinou opísaných molekúl toxínu. Zdroje nykleových kyselín, ktoré by bolo možné dobré využiť pre skríženú hybridizáciu s nukleotidovými sondami, odvodenými od reťazcov DNA podľa vynálezu môžu zahŕňať napríklad produkty pavúkov toho istého rodu, avšak odlišnej čeľade, produkty pavúkov pavúkov príbuzných rodov a produkty pavúkov toho istého rodu, avšak žijúcich v iných oblastiach.

K. Identifikácia reťazca promótora

Vynález sa týka tiež reťazca promótora, riadiaceho syntézu DK 9,2 u pavúka. Organizácia génu pre DK 9,2 bola skúmaná analýzou génového súboru pomocou cDNA pre úplný toxín ako sondy. Analýzou DNA genómu proti smeru translácie od začiatku transkripcie, t.j. pravdepodobne od 5 *-zakončenia cDNA, sa môže preukázať prítomnosť putatívneho promótora. Reťazec DNA pre oblasť promótora o veľkosti 421 párov báz je uvedený ako reťazec ID č. 8. Tento promótor radu základných riadiacich signálov, ktoré sú obvykle zaradené v oblasti tesne pred miestom pre začiatok translácie. Súhrne údaje o promótorových riadiacich signáloch je možné nájsť v publikácii McKnight a ďalší, 1982, Transcription Control Signals of an Eucaryotic Protein. Coding Gene, Science 217, 316. Zoskupenie TATA je uložené v polohe -30 od predpokladaného začiatku transkripcie a je zrejmé dôležité pre riadenie začiatku syntézy RNA. Ešte ďalej od tohoto začiatku sú uložené dva distálne palindromové, u ktorých jeden obsahuje zoskupenie CAAT, ktoré je zrejmé dôležité pre väzbu enzýmu RAN polymerázy II. Predpokladá sa, že tento promótor alebo oblasti tohoto promótora sú užitočné pri transkripcii a expresii rôznych génov v rastlinných, živočíšnych alebo bakteriálnych bunkách, napríklad pri tvorbe rôznych rekombinantných konštrukcií.

Vynález bude vysvetlený nasledujúcimi príkladmi, v ktorých sú opísané zvláštne uskutočnenia a postupy, tieto príklady však nemajú viesť k obmedzeniu rozsahu vynálezu. Ďalej budú ešte vysvetlené niektoré pojmy, ktoré sú v príkladovej časti bežne používané.

Materiály a metódy

Pavúky

Pavúky boli získané z ich čeľade a druhy boli identifikované pomocou Spider Pharm, Inc., Black Canyon City, AZ. Od pavúkov Diguetia canities bol získavaný jed elektrickým podráždením žliaz. Ide o opatrenie, ktoré pomáha zaistiť kontamináciu jedu, napríklad pri regurgitácii hemolymfy pavúka.

Čistenie toxínu

Surový jed, skladovaný pri -80 °C bol po roztopení dôkladne premiešaný a rozpustený v 0,1% kyseline trifluóroctovej, TFA, a na to bol podrobený chromatografii. Surový jed bol frakcionovaný kvapalinovou chromatografiou v reverznej fáze RPLC použitím rozpúšťadla Beckman Systém Gold 126 a modulu so 168 fotodiódami pre detekciu. V zmesi s TFA bol ako rozpúšťadlo použitý acetonitril alebo izopropanol. Boli použité nasledujúce stĺpce pri rôznych stupňoch čistenia: stĺpec Danamax 300 A RP C^g s rozmerom 25 cm x 4,6 mm vnútorného priemeru, stredný priemer častíc 12 mikrometrov, analytický stĺpec Vydac 300 A C^g s rozmerom 25 cm x 4,6 mm vnútorného priemeru, stredný priemer častíc 5 mikrometrov a semipreparatívny stĺpec Vydac 300 A C^g s rozmerom 25 cm x 10 mm vnútorného priemeru, stredný priemer častíc 5 mikrometrov. Detekcia vrcholov bola vykonávaná pri 220 nm a frakcie boli odoberané pomocou zariadenia Gilson 208. Všetky frakcie boli lyofilizované a uložené pri teplote -80 ’C.

Hmotové spektrometrie s bombardovaním rýchlymi atómami, FAB-MS

Hmotové spektrá boli zaznamenané v University of Illinois na hmotovom spektrometri ZAB-SE (VG instruments), boli použité štandardné podmienky, t.j. plynný xenón, rozlíšenie 1000, urýchľovacie napätie 8 kV, teplota zdroja 40 °C. Vzorky o hmotnosti 1 mikrogram boli analyzované v 4 mikrolitroch tioglycerolu s obsahom 25 % 1 % vodnej TFA.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Počiatočná frakcionácia a identifikácia frakcií s obsahom insekticídneho peptidu z jedu Diguetia canities mikrolitrov lyofilizovaného jedu, získaného od pavúka Diguetia canities vyššie uvedeným spôsobom bolo rozpustených v 0,1% kyseline trifluóroctovej TFA a podrobené frakcionácii kvapalinovou chromatografiou v reverznej fáze na semipreparativnom stĺpci Vydac RP C-^g, elúcia bola vykonávaná rýchlosťou 3,5 ml za minútu. Bol použitý lineárny gradient, a to na začiatku zmesou 0,1% TFA a 50% acetonitrilu, potom 0,1% TFA a nakoniec zmesou 0,1% TFA a 50% acetonitrilu v pomere 50 : 50 po 180 minútach.

frakcia doba retencie (min.)

1	3,2
4	29,6
6	48,2
8	57,1
9	62,8
10	66,4
11	68,7
12	71,4
13	77,1
16	126,1
17	131,4

Každá frakcia sa zahustí lyofilizáciou najprv z elučného činidla a potom z vody. Materiál sa uloží pri -80 ’C. Každá frakcia sa rozpustí v 25 mikrolitroch fyziologického roztoku chloridu sodného s obsahom pufra na vyhodnotenie insekticídneho účinku. Insekticidna účinnosť niektorých frakcii bola potvrdená skúškami proti Helióthis virescens, TBV, ako je uvedené v tabuľke I.

Larvy TBV, päť jedincov pre každú frakciu boli použité v pokuse, pri ktorom boli každej larve vstreknuté 3 mikrolitre skúmaného roztoku použitím Hamiltonovej striekačky s obsahom 50 mikrolitrov, vybavenej ihlou č. 33 a mikrozásobníkom PB 600. Injekcie boli prevedené tak, že ihla bola zavedená do laterálnej črevnej brušnej časti v tupom uhle tak, aby nedošlo k poškodeniu vnútorných orgánov. Po injekcii bol každý jedinec uložený do zvláštnej komôrky, obsahujúcej umelé krmivo. Periodicky potom boli vykonávané pozorovania a bola meraná paralýza do 24 hodín po injekcii. Na vypočítanie dávky bola použitá priemerná hmotnosť lariev 0,3 g. Kontrolnej skupine lariev bol vstreknutý len fyziologický roztok chloridu sodného s obsahom pufra.

Paralýza sa vyvíjala postupne a pred ňou došlo k obdobiu vyjadrených svalových kŕčov. V ťažkých prípadoch sa tieto kŕče objavili 15 až 30 minút po injekcii a potupne sa zväčšovali až do úplného oslabenia lariev. Trasenie niekedy pretrvávalo viac než 48 hodín po injekcii. K tomu dochádzalo v prípade, že nebola podaná smrtiaca dávka a u niektorých lariev došlo k zotaveniu. Závažnosť traseniíi bola dobrým ukazovateľom toxicity. Larvy, u ktorých trasenie pretrvávalo až do celkového ochrnutia a/alebo pri celkových kŕčoch sa už nezotavili.

Výsledky týchto pokusov sú zhrnuté v nasledujúcej tabuľke I.

Tabuľka I

Toxicita RPLC frakcii jedu Diguetia canities pre TBV 7,5

VVE/g hmyzu^{* xx} frakcia

počiatočná paralýza^x paralýza po 24 hod. % %

1	0	0
4	0	0
6	0	0
8	100	100
9	100	100
10	100	100
11	100	100
12	100	100
13	0	0
16	0	0
17	0	0
kontrola	0	0

^x Paralýza bola definovaná ako neschopnosť larvy zaujať pôvodnú polohu po prevrátení nabok alebo na chrbát.

^xx VVE, ekvivalent úplného jedu je množstvo toxínu, ktoré je obvykle prítomné v 1 mikrolitri jedu, získaného z pavúka. 5 VVE z 25 mikrolitrov oddeleného materiálu znamená 20 % získaného zvyšku.

Príklad 2

Čistenie frakcie 9 z Diguetia canities

Hlavné zložky frakcie 9, účinnej proti TBV boli čistené do homogenity, to znamená do vzniku jediného viditeľného pásu pri SDS-PAGE-elektroforéze, približne v oblasti molekulovej oblasti 6500 za použitia chromatografie na stĺpci Vydac RP C-£g s rozmerom 25 cm x 10 mm vnútorného priemeru použitím prietoku pri lineárnom gradiente 1,0 % za minútu izopropanolu/3,5 ml 0,1% TFA/minúta, priebeh bol sledovaný pri 220 nm..

Detekcia vrcholov a odoberanie frakcií bolo vykonávané rovnakým spôsobom ako v príklade 1. Boli odobraté dve frakcie, prvá po 21,81 minútach (frakcia 9,1) a druhá po 22,39 minútach (frakcia 9,2).

Frakcie 9,1 a 9,2 boli zahustené lyofilizáciou najprv z elučného činidla a potom z vody, čím boli získané frakcie

9,1 a 9,2 v suchom stave. Čistota lyofilizovaných frakcií bola aspoň 99 %. Frakcia 9,2, získaná z 25 mikrolitrov jedu obsahovala približne 6 mikrogramov čistej bielkoviny. Frakcia 9,2 potom bola skúšaná na insekticídnu účinnosť proti TBV rovnakým spôsobom ako v príklade 1 tak, že piatim hmyzím jedincom bolo vstreknuté vždy 6,3 mikrogramov frakcie v roztoku vo fyziologickom roztoku chloridu sodného s obsahom pufra, piatim kontrolným jedincom bol podávaný len fyziologický roztok s obsahom pufra. Po 24 a 48 hodinách bol odčítaný výsledok. Po 24 hodinách boli všetci hmyzí jedinci, ktorým bol podaný roztok frakcie 9,2 paralyzovaní a postupne uhynuli, kontrolný hmyz bol normálny, po 48 hodinách nedošlo k žiadnym zmenám.

Analýza tohoto polypeptidu hmotovou spektrometriou s bombardovaním rýchlymi atómami preukázala molekulovú hmotnosť 6371 ± 2. Analýza N-terminálneho reťazca aminokyselín preukázala reťazec aminokyselín pre frakciu 9,2 tak, ako je uvedený pre aminokyseliny 1 až 33 v reťazci ID č. 1.

LD^q pre frakciu 9,2 toxínu Diguetia u TBV je približne 1,0 nmol/g. Príznaky boli podobné tým, ktoré boli pozorované pri podaní nefrakcionovaného jedu v príklade 1.

Príklad 3

Čistenie frakcie 11 jedu Diguetia canities

Podobným spôsobom ako v príklade 2 bola izolovaná z jedu Diguetia canities frakcia 11 a čistená kvapalinovou chro matografiou v reverznej fáze, čím bola získaná jediná frakcia, ktorá bola zahustená lyofilizáciou najprv z elučného činidla a potom z vody, čím bol získaný tuhý podiel frakcie 11. Tento tuhý podiel bol skúšaný na insekticídnu účinnosť proti TBV v dávke 5,0 VVE/g, ako bolo uvedené v príklade 2. Po 24 hodinách došlo u 80 % hmyzích jedincov, ktorým bol vstreknutý tuhý podiel 11 na paralýzu a po 48 hodinách malo paralýzu 60 % jedincov. Kontrolní jedinci boli normálni.

Pri analýze tohoto polypeptidu hmotovou spektrometriou pri bombardovaní rýchlymi atómami bolo možné preukázať molekulovú hmotnosť 6740 ± 2. Analýzou N-terminálneho reťazca aminokyselín bolo možné dokázať reťazec pre aminokyseliny

I až 29 tuhého podielu 11 tak, ako je uvedený pre reťazec ID č. 3.

Príklad 4

Čistenie frakcie 12 jedu Ďiguetia canities

Podobným spôsobom ako v príklade 2 bola ďalej čistená frakcia 12, získaná z jedu podlá príkladu 1 chromatografiou v reverznej fáze, čím bola získaná jediná frakcia. Táto frakcia bola lyofilizovaná najprv z elučného činidla a potom z vody, čím bol získaný tuhý podiel 12. Tento tuhý podiel bol skúšaný na insekticídnu účinnosť proti TBV podľa príkladu 2. Po 24 hodinách bolo možné pozorovať u 100 % hmyzích jedincov, ktorým bol vstreknutý tuhý podiel 12 paralýzu a po 48 hodinách bolo možné pozorovať paralýzu u 80 % týchto jedincov. Kontrolný hmyz mal normálny vzhľad. Analýza polypeptidu hmotovou spektrometriou pri bombardovaní rýchlymi atómami preukázala molekulovú hmotnosť 7080 ± 2. Pri analýze N-terminálneho reťazca aminokyselín bol zistený parciálny reťazec pre tuhý podiel 12, uvedený ako reťazec: ID č. 5.

Obmedzená možnosť získania materiálu nedovolila presné stanovenie toxicity. V dôsledku toho bola frakcia 9,2 skúšaná v dávkach (nmol/g) o 39 a 67 % vyšších než tuhé podiely

II a 12. Zvolené dávky mali pokryť rozmedzie od minimálnej letálnej dávky až do dávky, u ktorej už nedochádza k účinku, toto však nebolo dosiahnuté vo všetkých prípadoch. Výsledky aj napriek, tomu dokazujú, že uvedené peptidy majú obdobnú toxicitu. Tuhý podiel 9,2 je zrejme o niečo účinnejší než osxatné peptidy, tento rozdiel je však pravdepodobne nižší než trojnásobok. Minimálna 100% letálna dávka pre tuhé podiely 9,2, 11 a 12 je v rozmedzí 3,0 až 5,0 nmol/g. Ide o priaznivú hodnotu v porovnaní s bežne používanými insekticídmi, napríklad tefluobenzuron má LD^q SAV 1,0 nmol/g.

Príklad 5

Izolácia kódových génov pre tuhé podiely 9,2 a 11 z jedu Diguetia canities

Stupeň 1: Izolácia RNA

Pavúky boli získaní z vonkajších zdrojov a identifikovaní ako Diguetia canities. Živé pavúky boli zmrazené a ich cefalotorax bol odstránený spôsobom podľa publikácie Chomczynski a Sacchi, Analytical Biochemistry, 162, 156 (1987). Polyadenylovaná mRNA bola čistená za použitia d(T)-celulózy (Pharmacia LKB, Švédsko) chromatografickým spôsobom.

Stupeň 2: Syntéza cDNA cDNA bola získaná reverznou transkripciou mRNA použitím reverznej transkriptázy z vírusu leukémie potkanov (Bethesda Research Laboratories, MD) pri dodržiavaní odporúčaní výrobcu. Reakčná zmes obsahovala v 20 mikrolitroch objemu pufer pre enzým z balíčka, dodávaného pre syntézu cDNA (Boehringer Mannheim, IN), 50 ng mRNA, 2 jednotky RNázy H, 30 ng priméru d(T)Not I (Promega, Madison, VI), 1 mM každého deoxynukleozidtrifosfátu a 100 mikrogramov reverznej transkriptázy. Reakčná zmes bola inkubovaná 1 hodinu pri teplote 37 °C a potom ešte 10 minút pri teplote 42 °C. Reakčná zmes bola vyzrážaná etanolom a potom bol materiál uvedený do suspenzie v 20 mikrolitroch vody.

Stupeň 3: Syntéza priméru

Zmes reťazcov DNA degenerovaných primárov, ktorá by mohla byť . kódovými reťazcami pre zvyšky aminokyselín 1 až 8 reťazca ID č. 1 bola pripravená, bol vzatý ohľad na niektoré preferencie kódov u Drosophila na zníženie degenerácie. Primér bol syntetizovaný v University of Utah, Howard Hughes Medical Inštitúte.

Stupeň 4: Amplifikácia

Amplifikácia DNA pôsobením enzýmu, riadená primérom bola použitím DNA-polymerázy, stále pri vyššej teplote opísaná v publikácii Saikki a ďalší, Science, 239:487 (1988), V tomto prípade bolo ako ’templát pre PCR-reakciu použitých 5 mikrolitrov cDNA z cefalotoraxu Diguetia, reakčná zmes obsahovala zložky z balíčka GeneAmp¹'^ pre amplifikáciu DNA (Perkin Elmer Cetus, CA). Amplifikačná reakčná zmes obsahovala kódové a antikódové priméry v koncentrácii 2 mikromoly, 100 mikromolov každého deoxynukleotidu, 4 jednotky rekombinantnej polymerázy Tag I, stále pri vyššej teplote. Reakcia bola vykonávaná na zariadení DNA Therma Cycler (Perkin Elmer Cetus) . Selektívna amplifikácia kódového génu pre tuhý podiel

9,2 zô skupiny príbuzných toxínov s podobnými NH2-terminálnymi reťazcami aminokyselín bola dosiahnutá za použitia teploty, obmedzenej na 58 °C. Za týchto podmienok došlo k amplifikácii jedinej DNA o dĺžke približne 275 párov báz, ako bolo preukázané elektroforézou na agarózovom géli. Použitím menej vymedzených podmienok bolo možné preukázať elektroforézou na agarózovom géli viac než päť amplifikovaných produktov, ktorých rozmery boli 200 až 360 párov báz. Tieto rôzne produkty PCR, získané za menej obmedzených podmienok sú pravdepodobne kódovými reťazcami pre polypeptidy s príbuzným reťazcom aminokyselín, s približne rovnakým rozmerom a s približne rovnakou insekticídnou účinnosťou v porovnaní s tuhým podielom 9,2. Je pravdepodobné, že tieto príbuzné polypeptidy budú zahŕňať tuhé podiely 11 a 12 vzhľadom na to, že N-terminálne reťazce týchto polypeptidov sú vzájomne veľmi podobné a sú tiež podobné reťazcu tuhého podielu 9,2, ako je zrejmé pri porovnaní reťazcov ID č. 1, 3 a 5.

Stupeň 5: Klonovanie produktov PCR

Produkty PCR, získané pri silnom alebo menej vyjadrenom obmedzení teploty boli čistené kvôli odstráneniu nezaradených primérov použitím deliaceho zariadenia Centricon-100 (Amicon) na oddelenie látok s rôznou molekulovou hmotnosťou. Čistené produkty potom boli rozštiepené reštrikčným enzýmom Νοΐ I (MBR, Milwaukeee, Vi), ktorý štiepi primér v smere translácie a zanecháva kohezívne zakončenie. Vektor pKS (Stratagene, LaJolla, CA) bol dvakrát rozštiepený enzýmom EcoRV (US Biochemicál) a Not I na získanie miest, špecifických pre riadené klonovanie. Vektor a vložená časť boli naviazané a transformované v DH5alfaF’. Kolónie boli skúšané vnútornou sondou, značenou p a kolónie, ktoré boli pozitívne, boli ďalej podrobené analýze reťazca použitím vnútornej sondy ako priméru (US Biochemicál’s Sequenase Version 2.0).

Úplné reťazce DNA vložených cDNA oboch klonov sú uvedené ako reťazce ID č. 2 a 4. Len reťazec 2 bol získaný v klonoch, získaných za silného obmedzenia teploty PCR reakcie, oba typy vloženej cDNA boli nájdené u klonov, získaných pri vykonávaní PCR-reakcie za menšieho obmedzenia teploty. Kódový reťazec pre polypeptid ID č. 2 tvorí po expresii reťazec ID č. 1. Tento polypeptid má N-terminálne zakončenie totožné s N-terminálnym zakončením tuhého podielu 9,2, vypočítaná molekulová hmotnosť pre tento polypeptid je 6377,9. Za predpokladu, že všetky cysteínové zvyšky v prírodnom polypeptide sa vyskytujú vo forme disulfidových väzieb vo vnútri molekuly (cystín), bola by molekulová hmotnosť 6369,7. Tento polypeptid je zrejmé totožný s polypeptidom tuhého podielu 9,2, ktorý má pri hmotovej spektrometrii molekulovú hmotnosť 6371 ± 2. Reťazec aminokyselín polypeptidu, pre ktorý je kódom reťazec ID č. 4, je uvedený ako reťazec ID č. 3. Tento polypeptid má N-terminálny reťazec totožný s N-terminálnym reťazcom tuhého podielu 11. Ide teda zrejme o ten istý po47 lypeptid, ktorý bol izolovaný ako tuhý podiel 11.

Príklad 6 .

Toxicita pre cicavce míkrolitrov jedu z D. canities mal smrtiace účinky na myši po intraperitoneálnej injekcii v troch testoch. Myši, ktorým bol jed podaný, sa spočiatku ničím nelíšili od kontrolných myší, ktorým bol podaný fyziologický roztok. Avšak po 10 až 15 minútach po injekcii začali byť myši, ktorým bol podaný jed hyperaktívne, potom došlo ku krátkemu obdobiu nekoordinovaných pohybov, po ňom k namáhavému dýchaniu a vzniku kŕčov. K uhynutiu' došlo do 2 minút od prvého vzniku príznakov.

Tuhé podiely 9,2, 11 a 12 boli vstreknuté intraperitoneálne myšiam v dávkach 4,2, 0,9 a 1,2 mg/kg, v žiadnom z týchto prípadov nebolo možné pozorovať do 24 hodín žiadny účinok.

Tuhý podiel 9,2 bol podaný dó mozgových komôr štyrom myšiam s hmotnosťou približne 28 g v dávke 30 mikrogramov každému zvieraťu, to znamená približne 1 mg/kg. Do 48 hodín po injekcii nebolo možné pozorovať žiadny účinok. Ďalšej myši bolo intraperitoneálne podaných 125 mikrogramov tuhého podielu 9,2 (4,2 mg/kg) bez akéhokoľvek účinku.

Aby bolo možné charakterizovať toxicitu jedu pre stavovce, boli vykonané skúšky tografiou v reverznej fáze, ledky sú znázornené na obr. účinné proti TBV. V dávke, frakcionovaného jedu VVE i frakcie 1 a 2 žiadny účinok s jedom, frakcionovaným chromafrakcie boli podané myšiam, výs1. Frakcia 2 obsahovala zložky, ekvivalentnej 25 mikrolitrom neemalo intraperitoneálne podanie

Frakcia 3 vyvolala účinky, ktoré boli pozorované pri podaní nefrakcionovaného jedu. Výsledky teda preukazujú nesúlad medzi insekticídnym účinkom a toxickým účinkom pre stavovce v rôznych zložkách jedu Di guetia canties.

Príklad 7

Elektrofyzjologické údaje

DK 9,2 bol skúšaný v koncentrácii 1 mikromol pri prenose na synapsách (vyvolané zhluky výbojov) u Schafferovej kolaterálnej-CA 1 synapse pyramidálnych buniek v rezoch hippocampu potkana. Údaje, znázornené na obr. 2 predstavujú časový záznam vzniku vrcholov (a) 5 minút pre pridaním DK

9,2 a (b) v priebehu 15 až 20 minút po pridaní DK 9,2. Pri porovnaní týchto záznamov je zrejmé, že v použitej koncentrácii nemá DK 9,2 na CNS potkana žiadny účinok, ktorý by touto skúškou bolo mbžné preukázať. Použitá skúška môže preukázať rôzne typy účinkov na kanály rôznych iónov u cicavcov a na receptory nervových prenášačov, ako bolo opísané v publikácii T. V. Dunwiddie, The Use of In Vitro Brain Slices in Neurropharmacology, v Electrophysiological Technigues in Pharmacology, ed. H. M. Geller, Alan R. Liss, Inc. , New York, 1986. Zvlášť molekuly, ktoré bránia inaktivácii sodíkových kanálov, napríklad niektoré toxíny škorpiónov, pôsobia vyjadrené rozšírenie v poslednej fáze odpovede, ako bolo opísané v publikácii Kaneda M., Myama Y., Ikemoto Y. a Akaike N. , Scorpion toxín prolongs an inactivation phase of the voltage-dependent dosium current in rat isolated single hippocampal neurons, Brain Res. 487:192 - 195, 1989, lan L.

Mueller, Natural Product Sciences, Inc. Na rozdiel od týchto pozorovaní je DK 9,2 účinný na hmyzích preparátoch (mucha domáca) pri stokrát nižšej koncentrácii spôsobom, ktorý naznačuje, že táto látka bráni inaktivácii sodíkových kanálov u hmyzu.

Príklad 8

Reťazce cDNA, uložené pred kódovým reťazcom DK 9,2, ktoré sú reťazcami pre prekurzor DK 9,2

Aby bolo možné získať reťazce cDNA, uložené pred kódo vým reťazcom pre DK 9,2, bol syntetizovaný vnútorný oligonukleid, zodpovedajúci zvyškom 159 až 178 v reťazci DNA pred začiatkom translácie reťazca ID č. 2. Na 5’-zakončení tohoto priméru je uložené miesto pôsobenia enzýmy Eco RI. 10 mikrolitrov cDNA s jednoduchým reťazcom z jedovej žlazy bolo na svojom 3’-zakončení vybavené zvyškom deoxyguanozínu použitím enzýmu terminálnej deoxynukleotidtransferázy (Bethesda Research Laboratories). 20 mikrolitrov reakčnej zmesi s obsahom 14 mikrolitrov enzýmu 500 μΜ dGPT bolo inkubovaných 15 minút pri teplote 37 °C. Potom bola vzorka vyzrážaná etanolom a materiál bol uvedený do suspenzie v 20 mikrolitroch vody.

Reťazec DNA, uložený pred špecifickým primérom pre gén bol amplifikovaný použitím PCR-reakcie, podobne ako tomu bolo pre reťazec cDNA na druhej strane toxínu. Amlifikačná reakcia obsahovala antikódový primér s d(C)-zakončením a kódové priméry v koncentrácii 2 mikromoly, 100 mikromolov každého deoxynukleotidtrifosfátu a 4 jednotky rekombinantnej Taq-polymerázy, stálej pri vyššej teplote. Reakcia bola vykonávaná 2 minúty pri 94 °C, 2 minúty pri 37 C a 1 minútu pri 37 °C. Tento cyklus bol dvakrát opakovaný a potom bol program zmenený za použitia teploty 54 °C v druhom stupni. Tento ďalší cyklus bol opakovaný 32x.

Pri PCR reakcii bol získaný fragment o 380 pároch báz, ako bolo preukázané elektroforézou na 4% agarózovom géli v prítomnosti etidiumbromidu. Tento reakčný produkt bol na svojich koncoch vyplnený použitím veľkého (Klenowovho) fragmentu DNA-polymerázy I z E. coli (Molecular Biology Resources, Madison, VI) a potom bol materiál vyzrážaný etanolom. Produkt bol znova uvedený do suspenzie a rozštiepený reštrikčným enzýmom Eco RI. Rozštiepený fragment bol potom v prítomnosti 1 mM ATP podrobený pôsobeniu enzýmu T4-kinázy a potom naviazaný na vektor pBluescriptsKS, rzštiepený enzýmami Eco RI a Eco RV. Subklony boli analyzované analýzou dvojitého reťazca DNA použitím enzýmu Sequenase 2,0 (USB).

Translácia reťazca cDNA z oblasti pred úplným peptidovým toxínom preukázala, že DK 9,2 je syntetizovaný vo forme prekurzorovej bielkoviny. Príslušný reťazec cDNA je uvedený ako reťazec ID č. 6. Prekurzorová bielkovina je tvorená signálnym reťazcom s propeptidovou oblasťou (reťazec ID č. 7), tieto reťazce sú odstránené za vzniku úplného peptidového toxínu, izolovaného z jedu pavúka. Je pravdepodobné, že signálny reťazec a propeptidový reťazec sú nutné pre produkciu a sekréciu DK 9,2 v jedovej žľaze.

Príklad 9

Rekombinantná konštrukcia baculovírusu

Signálny reťazec hmyzu z čeľade Lepidoptera, opísaný v publikácii Jones a ďalší, Molecular Cloning Regulation and Complete Sequence of a Hemocyánin-Related Juvenile Hormone-Supressible Protein From Insect Hemolyphs, J. Biol. Chem. , 265:8596 (1990), bol skonštruovaný z dvoch syntetických oligonukleotidov použitím spôsobu podľa publikácie Rossi a ďalší, J. Biol. Chem., 257:9226 (1982). Dva 48-méry boli čistené chromatografiou na iónomeniči. Tieto dva oligonukleotidy majú spoločných 11 párov báz komplementárneho reťazca na svojom 3’-zakončení. V prípade, že sa oba reťazce naviažu v prítomnosti štyroch deoxyribonukleozidtrifosfátov a Klenowovho fragmentu DNA-polymerázy I, získa sa produkt s dvojitým reťazcom. Reakčné produkty boli ďalej čistené použitím chromatografie na hydroxylapatite a molekuly DNA s dvojitým reťazcom boli rozštiepené enzýmom Aat II, ktorý je vhodný na uloženie reťazca pred cDNA pre DK 9,2 pri klonovaní v plazmide pKS-DK9c. Subklony boli skúmané na prítomnosť uloženého signálneho reťazca a vyhodnotené analýzou reťazca DNA.

Analýza reťazca potvrdila spojenie oboch reťazcov cDNA v príslušnom rámci. Celá syntetická konštrukcia génu bola vybratá a upravená pre klonovanie v mieste pôsobenia Nhe I plazmidu pBlueBac, čo je vektor pre prenos v baculovíruse, ako bolo opísané v Vialard J. a ďalší, J. Virology, 64:3 - 50 (1990). Subklony boli podrobené analýze reťazca na potvrdenie správneho uloženia konštrukcie. Analýza reťazca DNA plazmidu VR9 potvrdila uloženie syntetizovaného génu Caterspider, preDK 9,2 do plazmidu pBlueBac, ktorý je vektorom pre prenos baculovirusu, ako je znázornené na obr. 3. Použitie plazmidu pBlueBac ako vektora dovoľuje vyhľadávať príslušné klony rekombinantného génu v genóme baculovirusu podľa súčasnej expresie beta-galaktozidázy, takže je možné ich preukázať podľa zmeny farby pri pestovaní na príslušnom prostredí.

Rekombinantné baculovírusy, obsahujúce kódový reťazec preDK 9,2 boli získané transfekciou Spodoptera frugiperda, kmeňa Sf9 (ATCC CRL 1711) zmesou 1 mikrogramu vírusovej DNA AcMNPV a 2 mikrog’ramov plazmidovej DNA podľa publikácie Summers a Smith, A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect Celí Culture Prôcedures, Texas Agricultural Experiment Bulletin č. 1555, 1988. Štyri dni po transfekcii bol nanesený supernatant buniek v rôznom riedení na platne s priemerom 100 mm, naočkované 5 x 10^ buniek Sf9 a potom prekrytých agarózou, obsahujúcou Bluo-gal (Gibso BRL, Gaithersburg, MD) ako substrát. V priebehu 5 až 6 dní bolo možné rekombinanty preukázať podľa ich svetlomodrej farby. Kolónie boli odobraté použitím Pasteurovej pipety a vyluhované do 1 ml prostredia. Takto získaný materiál bol použitý na opätovnú infekciu buniek Sf9, naočkovaných vo fľaši T-25. Tri dni po infekcii bolo odobraté zo šiestich rôznych izolátov malé množstvo supernatantu a použité na získavanie vírusovej DNA. PCR-amlifikácia použitím primérov, špeciálnych pre vírusovú oblasť, obklopujúcu polyhedrínový gén potvrdila, že 5 zo 6 vírusových izolátov obsahovalo uloženú časť príslušného rozmeru bez akejkoľvek kontaminácie divokým typom. Potom boli pripravené titrované zásobné vzorky rekombinantných vírusov na vykonávanie skúšok in vivo a in vitro.

Príklad 10

Biologická účinnosť rekombinantného DK 9,2

Biologická účinnosť rekombinantného tuhého podielu 9,2 (DK 9,2), čisteného zo živného prostredia s obsahom séra bola skúmaná na larvách RBV. Dávky boli vypočítané na báze ^280 skúmaného roztoku. V dávke 16 mikrogramov/g vyvolával rekombinantný materiál do 2 hodín po injekcii vyjadrené svalové kŕče. 3 zo 6 použitých lariev boli paralyzované a mali závažné kŕče ešte po 48 hodinách, u ďalších troch lariev bolo možné pozorovať mierne až stredne silné svalové kŕče. Dávka 8 mikrogramov/g taktiež spôsobila paralýzu troch lariev z použitých šiestich, kdežto dávka 5,2 mikrogramov/g spôsobila paralýzu u dvoch zo šiestich lariev. Výsledky potvrdzujú biologickú účinnosť DK 9,2.

Príklad 11

Rekombinantný baculovírus - skúšky in vivo

A. Biologická účinnosť DK 9,2 (vACDK9,2)

1) Titrácia vírusových preparátov

Zásobný vírus bol titrovaný skúškou použitím plakov (Luria a ďalší, Generál Virology, 1978, str. 21 - 32, John Viley and Sons, New York). Titer bol vyjadrený vo forme jednotiek pre tvorbu plakov PFU na jednotku objemu, dávka bola vyjadrená vo forme PFU/larva. PFU je funkčný ekvivalent jedného zrelého viriónu (vírus) v prípravku, pričom každý virión je schopný úspešne infikovať jednu hostiteľskú bunku, ako bolo opísané vo vyššie uvedenej publikácii Luria a ďalších. Napríklad 103 hostiteľských buniek je možné infikovať každým mikrolitrom vírusového prostriedku, obsahujúceho 106 PFU (ml, t.j. 103 PFU/mikroliter.

2) Biologické skúšky

Biologická účinnosť rekombinantného vírusu nukleárnej polyhydrózy rNPV, s DK 9,2 (vAcDK9,2), bola skúšaná v rade skúšok závislosti odpovedi na dávke. Pri týchto skúškach boli larvám TBV so strednou hmotnosťou približne 250 mg injek čne podané rôzne dávky vAcDK9,2 v tkanivovom živnom prostredí, v každej skupine bolo použitých 10 jedincov. Rovnako ako pri pokusoch z príkladu 1 boli larvy uložené oddelene spolu s krmivom a boli periodicky pozorované. Výsledky dvoch takých skúšok sú zahrnuté v tabuľke II. V dávke 5000 PFU/larva a vo vyšších dávkach sa začnú typické príznaky toxicity DK 9,2, svalové trasenie a kŕče, objavovať približne 24 hodín po injekcii a aspoň polovica jedincov je do 48 hodín paralyzovaná alebo čiastočne paralyzovaná. Najnižšia skúmaná dávka 50 PFU/larva vyvolávala trasenie a kŕče do 48 hodín a aspoň 70 % lariev bolo paralyzovaných alebo čiastočne paralyzovaných v rozmedzí 96 až 120 hodín.

B. Biologická účinnosť vAcDK9,2 v porovnaní s divokým typom NPV

Boli vykonané ďalšie štúdie na stanovenie účinnosti vAcDK 9,2 v porovnaní s pôvodným divokým typom vírusu, Autographa californica NPV (wt-AcMNPV). Cieľom týchto skúšok bolo stanoviť, či larvy po pôsobení rekombinantného vírusu sú paralyzované po kratšej dobe než larvy, ktorým bola podaná totožná dávka vírusu divokého typu.

1) Injekčné podanie

Biologická účinnosť vAcDK9,2 a wt-AcMNPV bola porovnaná v rade pokusov, pri ktorých boli obidve látky larvám vstrekované. Larvy Heliothis virescens v poslednom instare, larvy Trichoplusia ni a larvy Spodoptera exigua boli ovplyvnené injekciou dávky 5 x 10^ PFU/larva použitím rekombinantného alebo divokého typu. Kontrolným larvám bolo podané len živné prostredie. Výsledky , ktoré sú zahrnuté v tabuľke III preukazujú, že pre všetky tri druhy hmyzu je rekombinantný typ ďaleko účinnejší než divoký typ.

2) Kŕmne pokusy

Aby bolo možné preukázať účinnosť vAcDK9,2 po požití, bolo nutné získať túto polyhedrínnegativnu (pol-) rekombi nantu v perorálnej infektívnej forme. Toto bolo dosiahnuté spoločným použitím vAcDK9,2 a wt-AcMNPV použitím postupov, ktoré už boli opísané na získanie perorálne infektívneho pol-rekombinantného NPVs napríklad v publikáciách Kuroda a ďalší, 1989, J. Virology 63(4) :1677 - 1685 a Price a ďalší, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci., 86 : 1453 - 1456. Bunky SF-9 boli súčasne infikované pomocou vAcDK9,2 a wt-AcMNPV použitím desaťnásobku a dvojnásobku infekčných jednotiek MOI. Súčasne bola druhá skupina buniek SF-9 infikovaná len divokým typom wt-AcMNPV (MOI = 2) . Päť dní po infekcii bolo izolované inklúzne telieska rozrušením buniek a diferenciálnym odstredením podľa publikácie Vood, 1980, Virology 104 : 392 - 299. Inklúzne telieska boli spočítané v hemocytometri. Bunky, ktoré boli súčasne infikované rekombinantným a divokým typom, vytvorili menej a menších inklúznych teliesok, než bunky, ktoré boli infikované len divokým typom. Výťažok mnohosteňných inklúzií(PIB) z buniek so zmiešanou infekciou bol 4,6 PIB/bunka, ale výťažok pri čistej infekcii divokým typom bol 33,3 PIB/bunka.

Aby bolo možné stanoviť biologickú účinnosť spoločného podania oboch typov v porovnaní s účinnosťou divokého typu, bol vykonaný prvý pokus. PIB zmiešaného alebo divokého typu boli uložené do hmyzieho krmiva a to na inej než agarózovej báze v koncentrácii 10^ PIB/g krmiva. Krmivo potom bolo rozdelené do malých nádob, do ktorých potom boli prenesené novorodené larvy TBV, vždy jedna larva do jednej nádobky, v jednej skupine bolo použitých 20 lariev. Kontrolným larvám bolo podané rovnaké množstvo čistého krmiva. Larvy mohli spotrebovávať krmivo podľa ľubovôle a boli periodicky pozorované a boli zaznamenané zistené príznaky. Výsledky sú zhrnuté v tabuľke II. Do 48 hodín nebolo možné pozorovať žiadny účinok, avšak po 72 hodinách bolo paralyzovaných viac než 50 % lariev, ktorým bolo podané krmivo so zmiešaným typom PIB. V prípade divokého typu nebolo v tejto dobe ešte možné pozorovať žiadny účinok. Po 96 hodinách bolo paralyzovaných viac než 90 % lariev, ktorým bolo podané so zmiešaným typom PIB, kdežto len 10 % lariev po podaní divokého typu uhynulo alebo bolo paralyzovaných. Po 120 hodinách uhynulo alebo bolo paralyzovaných 100 % lariev po podaní zmesi s rekombinantným typom, kdežto len 75 % lariev po podaní divokého typu bolo paralyzovaných alebo uhynulo. Je teda zrejmé, že ako pri injekčnom podaní, tak aj pri kŕmnych pokusoch dochádza po pôsobení rekombinantného typu k zneschopneniu lariev v podstatne kratšom časovom období, než je tomu u lariev po pôsobení divokého typu.

Tabuľka II

Závislosť odpovedi na dávke u TBV použitím vAcDK9,2 % paralyzovaných jedincov

dávka PFU/larva	24 h	48 h	72 h	96 h	120
5,1 x 10⁵	0	80	100	100	100
5,1 x 10⁴	0	35	95	100	100
5,1 x 10³	0	25	75	90	100
5,1 x 10²	0	0	55	85	100
5,1 x 10^·	0	0	20	65	95
kontrola	0	0	0	0	0

Tabuľka III

Porovnanie, účinku vAcDK9,2 a wt-AcMNPV pri injekčnom podaní larvám Heliothis virescens (TBV), Trichoplusia ni (CL) a Spodoptera exigua (BAV)

zlúčenina	hmyz	24 h	48 h	72 h	96 h	120 h	168 1
vAcDK9,2	tbv₂	0	0	100	100	100	100
wt-AcMNPV	TBV	°3	0	0	0	0	°4
kontrola	TBV	0	0	0	0	0	0
vAcDK9,2	^CL5	0	100	100	100	100	N/A
wt-AcMNPV	CL	' 0	0	0	0	100	N/A
kontrola	CL	0	0	0	0	0	N/A
vAcDK9,2	bav₆	0	70	90	100	100	100
wt-AcMNPV	BAV	0	0	0	0	0	100
kontrola	BAV	0	0	0	0	0	30

Vysvetlivky k tabuľke III:

Vírusy boli vstreknuté v dávke 5 x 10³ PFU/larva, kontrolám bol podaný rovnaký obsah živného prostredia.

Stredná hmotnosť približne 300 mg na jednu larvu, boli použité skupiny po 8 larvách.

Dve z ôsmich lariev zjavne uhynuli na základe fyzikálneho poškodenia pri injekcii a boli vyradené z ďalšej analýzy.

Uhynutých po podaní wt-AcMNPV v 9 dní bolo 100 %.

Boli použité skupiny po 10 larvách, stredná hmotnosť larvy bola približne 165 mg.

Bola použitá skupina 20 lariev pre vAcDK9,2 a 10 lariev pre wt-AcMNPV a kontroly, stredná hmotnosť larvy bola približne 200 mg.

Príklad 12

Promótor pre kódový gén pre DK9.2

Aby bolo možné získať informáciu a prístup k riadiacim prvkom pre kódový gén pre DK 9,2 bola vytvorená zostava génu. DNA bola z pavúkov pripravená spôsobom podľa publikácie Herrmann a Frischauf, Methods in Enzymology”, zv. 152, Academic Press, Inc. 1987, str. 180 - 183. DNA bola čiastočne rozštiepená enzýmom Sau 3A a frakcionovaná odstredením v sacharózovom gradiente 10 až 38 % pri 25 000 ot/min 16 hodín použitím rotora TLS-55 (Beckman Co., Ltd.). Spojené frakcie DNA o veľkosti 35 až 45 kb boli pripravené tak, že boli spracované pre uloženie do kozmidu ako vektora, rozštiepeného enzýmom Xho I s čiastočne vyplnenými koncami. Jedna štvrtina zmesi bola uložená do častíc fágu použitím Gigapak goldⁱⁿ (Strátagene, LaJolla, CA) a po transformácii bol získaný ekvivalent s 3 x 10^ bp DNA pavúka. Génová bunka bola nanesená na Petriho misky s priemerom 150 mm, bolo použitých 25 týchto misiek, z ktorých bol materiál odobratý nylonovými filtrami tak, aby ho bolo možné vyšetriť rádioaktívne značenou sondou DNA.

Na filtri odobratý materiál genómovej knihóvne Diguetia bol sériovo vyšetrený použitím rádioaktívne značenej kódovej cDNA pre DK 9,2 a pri použití oligonukleidov, ktoré sú kódovými reťázcami pre aminoterminálne zakončenie, karboxyterminálne zakončenie a vnútorné časti reťazca, tieto oligonukleotidy boli značené na svojich koncoch. Jeden z kozmidov, cDK2, hybridizoval so všetkými sondami. DNA tohoto kozmidu, rozštiepená enzýmom Eco RI bola použitá na vykonanie skúšky southern blot a bolo preukázané, že fragment o veľkosti 3,9 kb hybridizuje so sondou pre vnútornú časť reťazca i pre C-terminálne zakončenie. Pri analýze dvojitého reťazca kozmidu cDK2 boli použité tri vyššie identifikované priméry, bolo možné potvrdiť izoláciu génu pre DK 9,2a je veľmi pravdepodobné, že v tejto časti DNA môže byť prítomný ešte ďalší gén alebo ďalšie gény vzhľadom na to, že aminoterminálny oligonukleid má vysoký stupe%n homológie so všetkými insekticidne účinnými peptidmi Diguetia a teda i s celým radom častí DNA kozmidu.

. Aby bolo možné získať prístup k promótorovej oblasti pre DK9,2 bol syntetizovaný oligonukleid, zodpovedajúci signálnemu reťazcu a časti reťazca pred signálnym reťazcom v antikódovej časti reťazca. PCR-amplifikácia medzi týmto primérom a ďalším primérom, špecifickým pre ten istý gén viedla k mapovaniu signálneho reťazca, nachádzajúceho sa viac než 3000 párov báz pred aminoterminálnym exonom. Potom bol použitý primér v kódovom reťazci tak, aby bolo možné analyzovať reťazec DNA genómu v oblasti, nachádzajúcej sa tesne pred 5’-zakončením cDNA, ktorá je kódom pre signálny peptid.

Analýza reťazca DNA pred signálnym reťazcom DNA genómu preukázala tiež prítomnosť ďalšieho intrónu a páru báz -11 smerom od počiatočného kodónu pre metionín. Bol syntetizovaný oligonukleotidový primér, zodpovedajúci 5’-oblasti cDNA pre prekurzor DK9,2 a tento oligonukleotid bol použitý pri PCR-reakcii ako primér, aby bolo možné stanoviť, aký veľký reťazec sa nachádza medzi miestami, ktoré označujú začiatok transkripcie a začiatok translácie. Amplifikačný produkt, obsahujúci 1000 párov báz potvrdil prítomnosť intrónu a umožnil odhad jeho veľkosti. Analýza reťazca DNA genómu pred miestom pre začiatok transkripcie, o ktorom sa predpokladá, že sa nachádza na 5’-zakončení cDNA, ukazuje na prítomnosť promótora. Reťazec DNA promótovej oblasti je uvedený ako reťazec ID č. 8. Tento promótor obsahuje rad základných riadiacich signálov, obvykle prítomných tiež v ďalších eukaryotických promótoroch v oblasti, nachádzajúcej sa tesne pred miestom pre začiatok translácie. Tento promótor alebo časť tohoto promótora je možné použiť pre transkripciu a transláciu ďalších eukaryotických génov v baktériách, vírusoch, rastlinách alebo u živočíchov.

Príklad 13

Neuroiyziologické skúšky na získanie informácií o spôsobe účinku DK 9,2

Neurofyziolog.ické skúšky boli vykonané tak, aby bolo možné vysvetliť spôsob účinku DK9,2. Záznamy boli vykonávané na nervosvalových spojeniach a periférnych nervoch bezhlavých a beznohých lariev a preukazujú, že DK9,2 vyvoláva opakované salvy výbojov v nervoch, ktoré sú tiež blokované tetrodotoxínom. To znamená, že miestom pôsobenia tohoto toxínu je pravdepodobne sodíkový kanál nervovej membrány, citlivý na napätie. Ďalšie skúšky preukázali, že DK9,2 dráždia periférne nervy pri prahovej koncentrácii 10 nM. Okrem toho je aspoň 50x účinnejší než toxín 4 škorpióna Leiurus quinquestriatus.

Použitými pokusnými živočíchmi boli larvy tretieho instaru muchy domácej, Musca domestica. Larvy boli imobilizované pomocou špeciálnych špendlíkov a otvorené stredným saggitálnym rezom. Telo larvy bolo pomocou špendlíkov rozložené do plochy a vnútorné orgány boli odstránené tak, aby bola exponovaná svalovina steny larvy. Periférne nervy boli oddelené pri výstupe z mozgu a mozog bol odstránený. Preparát bol uložený do fyziologického roztoku pre hmyz, ktorý obsahuje nasledujúce koncentrácie uvedených zlúčenín v mM: 140 NaCl, 5 KC1, 0,75 CaCl_2> 4 MgCl₂, 5 NaHC0₃ a 5 HEPES, pH roztoku je 9,2.

K akémukoľvek nervu boli pripojené stimulačné sacie elektródy pre záznam nervosvalového prenosu. Prah pre stimuláciu bol postupne zvyšovaný tak dlho, až bolo možné pozorovať sťahujúce sa vlákna svalov 6 alebo 7. Potom bola na tieto vlákna uložená intracelulárna mikroelektróda na záznam, spojená s intracelulárnym predbežným zosilňovačom, použitým na sledovanie exitačných postsynaptických potenciálov (EPSP) ako odpoveď na nervové podráždenie.

Na záznam stúpajúcej elektrickej aktivity vo vláknach periférnych nervov bola sacia elektróda pripojená na AC-predzosilňovač. Signál bol HOOx zosilnený a na výstup bol uložený filter 0,3 a 1 kHz. Všetky záznamy boli privádzané do počítačového systému MacLab kvôli znázorneniu a analýze.

Pri počiatočnom pokuse na zistenie účinku DK9,2 bol použitý preparát nervosvalového spojenia. V tomto prípade jedno podráždenie periférneho nervu má za následok vznik jedného EPSP v stene svalu. V prítomnosti ĎK9,2 má jedno podráždenie za následok vysokofrekvenčný výboj EPSP. Okrem toho dôjde okrem výbojov, vyvolaných podráždením ešte k ďalším samovoľným výbojom, ktoré pretrvávajú niekoľko minút. Trvanie série výbojov je obvykle dlhšie než 1 sekunda a frekvencia EPSP v priebehu série výbojov je väčšia než 30

V dôsledku svalovej steny, týchto výbojov dôjde k silným kontrakciám ktorá takmer znemožní vnútrobunkový záznam vzhľadom na to, že elektróda je v priebehu svalového sťahu zo svalu vypudená. Väčšina pokusov bolo vykonávaná vo fyziologickom roztoku s' obsahom vysokej koncentrácie 300 mM sacharózy, ktorá potlačí svalové sťahy, avšak neovplyvní elektrické javy. Podobné výsledky boli získané tiež použitím ďalších roztokov, obsahujúcich soli a prípadne sacharózu.

Série výbojov, ktoré boli pozorované po pôsobení DK9,2 boli podobné ako tie, ktoré je možné pozorovať v prítomnosti alfa-toxínov škorpióna. Ide o bielkovinu, o ktorých je známe, že pôsobia na sodíkové kanály nervových membrán, ktoré sú citlivé na elektrické napätie. To znamená, že by tieto výboje máli byť blokované tetrodotoxínom TTX, ktorý je špecifickým blokátorom sodíkových kanálov. Schopnosť TTX potlačiť alebo zabrzdiť sťahy, už vyvolané pôsobením DK 9,2, je znázornená na obr. 5. Na obr. 5A došlo k rýchlemu blokovaniu EPSP po pridané jedného mikromolu TTX, súčasne tento jav spôsobil znecitlivenie preparátu následným pridaním 100 nM DK 9,2. Podobný pokus je znázornený na obr. 5B, kde sa elek trický výboj, vyvolaný DK 9,2 potlačí následným pridaním TTX. V tomto pokuse došlo pri svalových sťahoch k vypudeniu elektródy zo svalu a potom bolo možné pokračovať v zázname.

Potom boli elektrické výboje sledované približne 2 minúty a bolo možné preukázať, že aktivita preparátu ustáva v priebehu niekoľkých sekúnd po pridaní TTX.

Aby bolo možné prekonať problémy, spojené s pokusmi o vnútrobunkový záznam svalových sťahov, boli pokusy opakované použitím extracelulárnych záznamov z periférnych nervov bezhlavých a beznohých lariev. Tieto záznamy sú tvorené stúpajúcou aktivitou senzorických nervov a spontánnou aktiváciou motorických vlákien. V koncentrácii 70 nM pôsobí DK 9,2 zvýšenie nervového podráždenia, ktoré nie je možné ovplyvniť uložením nervu do fyziologického roztoku, avšak je možné ho veľmi rýchlo blokovať pridaním 0,4 mikroinolov TTX. Okrem toho, v prípade, že sa TTX pridá pred pridaním DK 9,2 k elektrickým výbojom vôbec nedôjde.

Boli vykonané ešte ďalšie skúšky, aby bolo možné stanoviť citlivosť nervov hmyzu pre DK 9,2 a porovnať účinnosť DK 9,2 s účinnosťou štandardného jedu škorpióna. DK 9,2 bol skúšaný na preparátoch periférnych nervov pri počiatočnej koncentrácii 1 nM zvyšovaním tejto koncentrácie približne každých 5 minút tak dlho, až bolo možné pozorovať vzostup aktivity. Použitím tohto preparátu boli koncentrácie 1 nM a 5 nM DK 9,2 neúčinné, avšak koncentrácia 10 nM vyvolala aktivitu preparátu po krátkej dobe. Výsledky, získané na piatich preparátoch nervov stanovením účinnej prahovej koncentrácie DK 9,2 na nerve hmyzu sú zahrnuté v tabuľke IV.

Tabuľka IV

koncentrácia	počet pokusov	počet odpovedí	%
1 nM	2	0	0
2 nM	1	0	0
5 nM	3	1	33
10 nM	3	3	100
Posledná	skupina pokusov	stanovila podobným	spôsobom

citlivosť hmyzieho nervu na toxín 4 škorpióna Leiurus quinquestriatus (LqTX 4). Celkom štyri preparáty boli vystavené koncentráciám až 500 nM jedu LqTX bez akéhokoľvek účinku. To zodpovedá predchádzajúcim pokusom, ktoré preukázali, že jed je špecifický pre sodíkové kanály cicavcov. Pri následnom pridaní DK 9,2 týmto preparátom bola potrebná koncentrácia

10 až 30 nM na vyvolanie odpovede. Mierne zvýšenie prahovej koncentrácie DK 9,2 je zrejmé spôsobené slabým blokujúcim účinkom LqTX 4. Tieto pokusy dokazujú, že DK 9,2 je na nervy hmyzu aspoň 50x účinnejší než LqTX 4.

Claims

1. Peptid s insekticídnym účinkom, v podstate čistený, izolovateľný z jedu Diguetia alebo jeho soľ, prijateľná z poľnohospodárskeho alebo záhradníckeho hľadiska.

2. Peptid podľa nároku 1, izolovateľný z jedu pavúka Diguetia canities.

3. Peptid s insekticídnym účinkom podľa nároku 1 s molekulovou hmotnosťou 6371 až 6397 stanovenou hmotovou spektrometriou, pohybujúci sa ako jediný vrchol pri vysokotlakej kvapalinovej chromatografii v reverznej fáze a jeho soli, prijateľné z poľnohospodárskeho alebo záhradníckeho hľadiska.

4. Peptid s insekticídnym účinkom podľa nároku 1 s reťazcom aminokyselín, v podstate zodpovedajúcim reťazcu aminokyselín ID č. 1.

5. Peptid s insekticídnym účinkom podľa nároku 1 s molekulovou hmotnosťou 6740 stanovenou hmotovou spektrometriou, pohybujúci sa ako jediný vrchol pri vysokotlakej kvapalinovej chromatografii v reverznej fáze a jeho soli, prijateľné z poľnohospodárskeho alebo záhradníckeho hľadiska.

6. Peptid s insekticídnym účinkom podľa nároku 1 s reťazcom aminokyselín, v podstate zodpovedajúcim reťazcu aminokyselín ID č. 3.

7. Peptid s insekticídnym účinkom podľa nároku 1 s molekulovou hmotnosťou 7080 stanovenou hmotovou spektrometriou, pohybujúci sa ako jediný vrchol pri vysokotlakej kvapalinovej chromatografii v reverznej fáze a jeho soli, prijateľné z poľnohospodárskeho alebo záhradníckeho hľadiska.

8. Peptid s insekticídnym účinkom podľa nároku 1 s reťazcom aminokyselín, v podstate zodpovedajúcim reťazcu aminokyselín ID č. 5.

9. Reťazec DNA, v podstate izolovaný, ktorý je kódovým reťazcom pre peptid s insekticídnym účinkom, izolovateľný z jedu pavúka Diguetia.

10. Reťazec DNA podľa nároku 9, ktorý je kódovým reťazcom pre peptid z jedu pavúka Diguetia canities.

11. Reťazec DNA, v podstate izolovaný, podľa nároku 9, ktorý zodpovedá reťazcu DNA ID č. 2.

12. Reťazec DNA, v podstate izolovaný, podľa nároku 9, ktorý zodpovedá reťazcu DNA ID č. 4.

13. Reťazec DNA, v podstate izolovaný, podľa nároku 9, ktorý zodpovedá reťazcu DNA ID č. 6.

14. Rekombinantný vektor pre expresiu, obsahujúci kódovú DNA pre peptid s insekticídnym účinkom, izolovateľný z jedu pavúka Diguetia, schopný zaistiť expresiu kódového reťazca v transformovaných bunkách.

15. Rekombinantný vektor pre expresiu podľa nároku 14, obsahujúci kódovú DNA pre peptid, izolovateľný z jedu pavúka Diguetia canities.

16. Rekombinantný vektor pre expresiu podľa nároku 14, obsahujúci kódovú DNA pre peptid s insekticídnym účinkom s molekulovou hmotnosťou 6371-6397 stanovenou hmotovou spektrometriou, pohybujúci sa ako jediný vrchol pri vysokotlakej kvapalinovej chromatografii v reverznej fáze.

17. Rekombinantný vektor pre obsahujúci kódovú DNA pre peptid reťazcu ID. č . 1.

expresiu podľa nároku 14, s reťazcom zodpovedajúcom

18. Rekombinantný vektor pre expresiu podľa nároku 14, obsahujúci kódový reťazec DNA pre insekticídne účinný peptid s molekulovou hmotnosťou 6740 stanovenou hmotovou spektro metriou, pohybujúci sa ako jediný vrchol pri vysokotlakej kvapalinovej chromatografii v reverznej fáze.

19. Rekombinantný vektor pre expresiu podľa nároku 14, obsahujúci kódový reťazec DNA pre insekticídne účinný peptid s molekulovou hmotnosťou 7080 stanovenou hmotovou spektrometriou, pohybujúci sa ako jediný vrchol pri vysokotlakej kvapalinovej chromatografii v reverznej fáze.

20. Rekombinantný vektor pre obsahujúci kódovú DNA pre peptid reťazcu ID č. 3.

21. Rekombinantný vektor pre obsahujúci kódovú DNA pre peptid reťazcu ID č. 5.

22. Rekombinantný vektor pre obsahujúci kódovú DNA s reťazcom, reťazcu ID č. 2.

23. Rekombinantný vektor pre obsahujúci kódovú DNA s reťazcom, reťazcu ID č. 4.

24. Rekombinantný vektor pre obsahujúci kódovú DNA s reťazcom, reťazcu ID č. 6.

expresiu podľa nároku 14, s reťazcom, zodpovedajúcom expresiu podľa nároku 14, s reťazcom, zodpovedajúcom expresiu podľa nároku 14, v podstate zodpovedajúcom expresiu podľa nároku 14, v podstate zodpovedajúcom expresiu podľa nároku 14, v podstate zodpovedajúcom

25. Rekombinantný vektor pre expresiu podľa nároku 14, uložený do transformovaných buniek rastlín, obvykle napadaných hmyzom.

26. Transgenické rastliny, obsahujúce reťazec DNA, ktorý je kódovým reťazcom pre peptid s insekticidnym účinkom, izolovateľný z jedu pavúka Diguetia a uložený do zárodkovej línie tejto rastliny alebo do ich rodičovskej línie, pričom expresia uvedeného reťazca DNA sa dedí v nasledujúcich generáciách rastliny sexuálnym alebo nesexuálnym množením.

27. Rekombinantný vektor pre expresiu z baculovirusu, schopný expresie kódového reťazca DNA pre peptid s insekticídnym účinkom, izolovateľný z jedu pavúka Diguetia v hostiteľovi alebo v hostiteľskej hmyzej bunke.

28. Rekombinantný vektor pre expresiu z baculovirusu podľa nároku 27, obsahujúci reťazec DNA s uloženým polyhedrínovým génom za súčasného riadenia transkripcie polyhedrínovým promótorom baculovirusu.

29. Rekombinantná hostiteľská bunka po transfekcii alebo transformácii reťazcom DNA, ktorý je kódovým eťazcom pre insekticídne účinný peptid, izolovateľný z jedu pavúka Diguetia, pričom v hostiteľskej bunke dochádza k expresii tohoto peptidu.

30. Rekombinantná hostiteľská bunka podľa nároku 29, v ktorej dochádza k expresii peptidu z jedu pavúka Diguetia canities.

31. Rekombinantná hostiteľská bunka podľa nároku 29, transformovaná kódovým reťazcom DNA pre insekticídne účinný peptid s molekulovou hmotnosťou 6371-6397 stanovenou hmotovou spektrometriou a pohybujúca sa ako jediný vrchol v priebehu vysokotlakej kvapalinovej chromatografie v reverznej fáze.

32. Rekombinantná hostiteľská bunka podľa nároku 29, transformovaná reťazcom DNA, ktorý je v podstate kódovým reťazcom pre.peptid definovaný reťazcom ID č. 1.

33. Rekombinantná hostiteľská bunka podľa nároku 29, transformovaná kódovým reťazcom DNA pre insekticídne účinný peptid s molekulovou hmotnosťou 6740 stanovenou hmotovou spektroskopiou a pohybujúca sa ako jediný vrchol v priebehu vysokotlakej kvapalinovej chromatografie v reverznej fáze.

34. Rekombinantná hostiteľská bunka podľa nároku 29, transformovaná reťazcom DNA, ktorý je v podstate kódovým reťazcom pre peptid definovaný reťazcom ID č. 3.

35. Rekombinantná hostiteľská bunka podľa nároku 29, transformovaná kódovým reťazcom DNA pre insekticídne účinný peptid s molekulovou hmotnosťou 7080 stanovenou pomocou hmotovou spektroskopiou a pohybujúca sa ako jediný vrchol v priebehu vysokotlakej kvapalinovej chromatografie v reverznej fáze.

36. Rekombinantná hostiteľská bunka podľa nároku 29, transformovaná reťazcom DNA, ktorý je v podstate kódovým reťazcom pre peptid definovaný reťazcom ID č. 5.

37. Rekombinantná hostiteľská bunka podľa nároku 29, transformovaná reťazcom DNA, v podstate zodpovedajúcom reťazcu ID č. 2.

38. Rekombinantná hostiteľská bunka podľa nároku 29, transformovaná reťazcom DNA, v podstate zodpovedajúcom reťazcu ID č. 4.

39. Rekombinantná hostiteľská bunka podľa nároku 29, transformovaná reťazcom DNA, v podstate zodpovedajúcom reťazcu ID č. 6.

40. Spôsob výroby peptidu s insekticidnym účinkom vy značujúci sa tým, že sa

a) pestuje rekombinantná hostiteľská bunka po transfekcii alebo transformácii kódovým reťazcom DNA pre peptid s insekticidnym účinkom, v podstate izolovateľný.z jedu pavúka Diguetia, pričom uvedený vektor je schopný zaistiť expresiu uvedeného kódového reťazca v transformovanej bunke a

b) z kultúry rekombinantných hostiteľských buniek sa požadovaný peptid s insekticidnym účinkom izoluje.

41. Rekombinanťne získaný peptid, produkovaný spôsobom podľa nároku 40.

42. Spôsob podľa nároku 40, vyznačujúci sa tým, že reťazec DNA, použitý na transformáciu je kódový reťazec pre insekticídne účinný peptid s molekulovou hmotnosťou 6371-6397 stanovenou hmotovou spektroskopiou a pohybujúci sa ako jediný vrchol pri vysokotlakej kvapalinovej chromatografii v reverznej fáze.

43. Spôsob podľa nároku 40, vyznačujúci sa tým, že reťazec DNA, použitý na transformáciu je v podstate kódovým reťazcom pre peptid, definovaný reťazcom ID č. 1.

44. Spôsob podľa nároku 40, vyznačujúci sa tým, že reťazec DNA, použitý na transformáciu je kódový reťazec pre insekticídne účinný peptid s molekulovou hmotnosťou 6740 stanovenou hmotovou spektroskopiou a pohybujúci sa ako jediný vrchol pri vysokotlakej kvapalinovej chromatograf i i v reverznej fáze.

45. Spôsob podľa nároku 40, vyznačujúci sa tým, že reťazec DNA, použitý na transformáciu je v podstate kódovým reťazcom pre peptid, definovaný reťazcom ID č. 3.

46. Spôsob podľa nároku 40, vyznačujúci sa tým, že reťazec DNA, použitý na transformáciu je kódový reťazec pre insekticidne účinný peptid s molekulovou hmotnosťou 7080 stanovenou hmotovou spektroskopiou a pohybujúci sa ako jediný vrchol pri vysokotlakej kvapalinovej chromatograf ii v reverznej fáze.

47. Spôsob podľa nároku 40, vyznačujúci sa tým, že reťazec DNA, použitý na transformáciu je v podstate kódovým reťazcom pre peptid, definovaný reťazcom ID č. 5.

48. Spôsob podľa nároku 40, vyznačujúci sa tým, že reťazec DNA, použitý na transformáciu, je v podstate definovaný reťazcom ID č. 2.

49. Spôsob podľa nároku 40, vyznačujúci sa tým, že reťazec DNA, použitý na transformáciu, je v podstate definovaný reťazcom ID č. 4.

50. Spôsob podľa nároku 40, vyznačujúci sa tým, že reťazec DNA, použitý na transformáciu, je v podstate definovaný reťazcom ID č. 6.

51. Spôsob hubenia bezstavovcových škodcov, vyznačujúci sa tým, že sa títo škodcovia privedú do styku s účinným množstvom peptidú, izolovateľného z jedu pavúka Diguetia alebo jeho soli, prijateľné z poľnohospodárskeho alebo záhradníckeho hľadiska.

52. Spôsob podľa nároku 51, vyznačujúci sa tým, že sa použije peptid z jedu pavúka Diguetia canities.

53. Spôsob podľa nároku 51, vyznačujúci sa tým, že sa hubia hmyzí škodcovia.

54. Spôsob podľa nároku 51, vyznačuj úci sa t ý m, že sa hubia škodcovia z čeľade Lepidoptera.

55. Spôsob hubenia bezstavovcových škodcov, vyznačujúci sa tým, že sa títo škodcovia privedú do styku s rekombinantným baculovírusom. schopným expresie účinného množstva peptidu, izolovatelného z jedu pavúka Diguetia.

56. Insekticídny prostriedok, v y 2: n a č u j úci sa t ý m, že ako svoju účinnú zložku obsahuje účinné množstvo peptidu podľa nároku 55 alebo jeho soli, prijateľné z poľnohospodárskeho alebo záhradníckeho hľadiska spolu s nosičom, prijateľným z poľnohospodárskeho alebo záhradníckeho hľadiska.

57. Protilátka, v podstate imunoreaktívna s peptidom, izolovateľným z jedu pavúka Diguetia.

58. Protilátka podľa nároku 57, imunoreaktívna s peptidom, izolovateľným z jedu pavúka Diguetia canities.

59. Spôsob detekcie prítomnosti insekticídne účinného peptidu, izolovatelného z jedu pavúka Diguetia použitím protilátky podľa nároku 57, vyznačujúci sa tým, že sa

a) získa jed pavúka,

b) jed pavúka sa privedie do styku s protilátkou, viazanou na zistiteľné označenie a

c) preukáže sa prítomnosť značenej protilátky, viazanej na uvedený peptid.

60. Spôsob podľa nároku 59, vyznačujúci sa t ý m, že sa zisťuje prítomnosť jedu pavúka Diguetia canities .

61. Sonda DNA, odvodená od kódového reťazca DNA pre peptid s insekticídnym účinkom, v podstate izolovateľný z jedu pavúka Diguetia.

62. Spôsob detekcie prítomnosti kódovej nukleovej kyseliny pre peptid s insekticidnym účinkom, v podstate izolovateľný z jedu pavúka Diguetia, vyznačujúci sa t ý m, že sa

a) získa nukleová kyselina z pavúka,

b) táto nukleová kyselina sa privedie do styku so sondou DNA podľa nároku 61 a

c) preukáže sa prítomnosť sondy, konjugovanej s nukleovou kyselinou.

63. Spôsob čistenia insekticídne účinných peptidov, izolovateľných z jedu pavúka Diguetia použitím protilátok podľa nároku 57, vyznačujúci sa tým, že sa

a) protilátka konjuguje s tuhým nosičom,

b) roztok, obsahujúci peptid sa privedie do styku s protilátkou, konjugovanou s tuhým nosičom za vzniku väzby peptidu z roztoku na protilátku,

c) peptid, viazaný na protilátku, konjugovanú s tuhým nosičom sa oddelí a

d) oddelený peptid sa izoluje.

64. Preproreťazec s reťazcom aminokyselín s vysokou homológiou reťazca s reťazcom aminokyselín, definovaným v reťazci ID č. 7 alebo jeho časť, pričom tento preproreťazec alebo jeho časť riadi sekréciu a/alébo ďalšie spracovanie štruktúry úplného peptidu.

65. Konštrukcia génu pre reťazec aminokyselín s podstatnou homológiou reťazca aminokyselín ID č. 7 alebo jeho časť, operatívne viazaná na peptid.

66. Reťazec promótora s vysokou homológiou reťazca s reťazcom ID č. 8 alebo jeho časť, riadiaci expresiu génu v rekombinantnej konštrukcii.

67. Rekombinantná konštrukcia, obsahujúca reťazec s vysokou homológiou s reťazcom ID č. 8 alebo jeho časť, operatívne viazaná na gén, ku ktorého expresii dochádza.

68. Peptid s insekticídnym účinkom, s nasledujúcimi vlastnosťami:

a) dĺžkou 55 až 65 aminokyselín

b) vyššou než 40% homológiou reťazca s reťazcom ID č. 1, 3 alebo 5 a

c) približne 7 alebo 8 cysteínovými zvyškami.

69. Peptid podľa nároku 68 z jedu pavúka Diguetia.