JP2006518184A - 弱毒寄生虫生ワクチン - Google Patents
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Abstract
本発明は特にアピコンプレックス門及びトリパノソーマ科の生きた弱毒寄生虫と、ワクチン及び前記ワクチンの製造における前記生きた弱毒寄生虫の使用に関する。更に、本発明は前記生きた弱毒寄生虫を含有するワクチンと、前記ワクチンの製造方法に関する。最後に、本発明は特定ｔｅｔリプレッサー融合蛋白質と、前記ｔｅｔリプレッサー融合蛋白質を含む本発明の生きた弱毒寄生虫に関する。
Description
本発明はアピコンプレックス（Ａｐｉｃｏｍｐｌｅｘａ）門及びキネトプラスト（Ｋｉｎｅｔｏｐｌａｓｔｉｄａ）目の生きた弱毒寄生虫、ワクチン及び前記ワクチンの製造における前記生きた弱毒寄生虫の使用、前記生きた弱毒寄生虫を含有するワクチン、前記ワクチンの製造方法、特定ｔｅｔリプレッサー融合蛋白質並びに前記ｔｅｔリプレッサー融合蛋白質を含む生きた弱毒寄生虫に関する。
原生生物界内でアピコンプレックス門とキネトプラスト目、より具体的にはトリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａｔｉｄａｅ）科には数種の有害な病原寄生虫が存在することが知られている。
トリパノソーマ科には例えばリーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）属やトリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ）属に属する寄生虫が存在する。
リーシュマニア症はリーシュマニアに起因する種々の症状を表す用語である。この疾患はイヌとヒトで最も一般に発生する。寄生虫はサシチョウバエにより哺乳動物宿主に伝播され、世界の全熱帯及び亜熱帯地域に蔓延している。宿主の体内で寄生虫はマクロファージに取込まれて滞留増殖し、慢性炎症プロセスを生じる。臨床面では、イヌの疾患は体重減少、貧血、発熱及びリンパ節障害を特徴とする。皮膚障害が観察されることも多い。ヒトでは複数のリーシュマニア種が感染性であり、そのうちで最も病原性が高いものはＬ．ｉｎｆａｎｔｕｍであり、脾臓、肝臓及び骨髄を冒し、治療せずにおくと死に至る重症内臓リーシュマニア症（Ｋａｌａ ａｚａｒとして知られる）を生じる。他の病原性リーシュマニア種としては例えばＬ．ｍａｊｏｒやＬ．ｍｅｘｉｃａｎが挙げられる。
ヒト及び動物の両者で多種多様の疾患の原因となる複数のトリパノソーマ種が公知である。特に、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉとＴｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉの２種のトリパノソーマ種が病原性であるとして知られている。
Ｔ．ｂｒｕｃｅｉ種はアフリカ諸国に存在し、ヒトの睡眠障害と動物（ウシ、ウマ、ブタ）のナガナ病の原因となる。Ｔ．ｂｒｕｃｅｉはトリポマスティゴート形態を宿主に送達するツェツェバエにより伝播される。
Ｔ．ｃｒｕｚｉ種は主に南米に存在し、この寄生虫は宿主範囲が広い（家畜と野生動物を含む）が、ヒトのシャーガス病の原因となることで有名である。この寄生虫は頭部が円錐形の害虫（例えばＲｈｏｄｎｉｕｓ種やＴｒｉａｔｏｍａ種）により伝播される。メタサイクリック型トリポマスティゴート段階で宿主に感染し、Ｔ．ｂｒｕｃｅｉとは異なり、各種細胞型の宿主細胞質内で増殖する。宿主細胞の破壊後に新規トリポマスティゴート形態が放出され、再び頭部が円錐形の害虫により摂取される。
アピコンプレックス門には例えばアイメリア科の寄生虫が存在する。多種多様のアイメリア種が多種多様の哺乳動物と鳥類に存在する。ニワトリの胃腸管に感染する主要な７種としてＥｉｍｅｒｉａ ｔｅｎｅｌｌａ、Ｅ．ｎｅｃａｔｒｉｘ、Ｅ ｂｒｕｎｅｔｔｉ、Ｅ．ｍａｘｉｍａ、Ｅ．ａｃｅｒｖｕｌｉｎａ、Ｅ．ｐｒａｅｃｏｘ及びＥ．ｍｉｔｉｓが挙げられる。これらのアイメリア種はいずれも家禽のコクシジウム症に関与している。従って、アイメリアは家禽の最重要寄生虫病の原因であり、農家に多大な経済的損失をもたらす。アイメリアは腸の上皮細胞と粘膜下組織に感染して重症出血性腸炎を誘発し、若鶏に高死亡率をもたらす。
この疾患は世界中に広がっており、現代の家禽産業で飼育されている家禽を冒す疾患として最高頻度で記録されている。
トキソプラズマ、サルコシスティス及びネオスポラを含むサルコシスティス（Ｓａｒｃｏｃｙｓｔｉｄａｅ）科にも病原性種が存在することが知られている。
トキソプラズマは広範囲の寄生虫感染であり、ほぼ全哺乳動物、特にヤギ、ヒツジ及びブタに加え、ヒトにも存在する。ヒト罹病率は全人口の７０％にも及ぶ。感染は寄生虫に汚染した肉を十分に加熱せずに摂取して生じることが多いが、最終宿主であるネコの糞便に放出されたオーシストの摂取により生じることもある。動物又はヒトが妊娠中に感染すると、自然流産や発生中の胎児に先天性トキソプラズマ症を生じる場合がある。その結果、神経後遺症や眼病になる恐れがある。免疫不全患者では慢性致死性感染（脳炎）を生じる恐れがある。
ネオスポラ、特にＮ．ｃａｎｉｎｕｍはトキソプラズマに非常によく似たコクシジウム寄生虫である。しかし、トキソプラズマとは対照的に、ネオスポラはイヌを最終宿主とする。Ｎ．ｃａｎｉｎｕｍはその中間宿主に流産を誘発し、ウシに重度急性流産を生じることがある。別のネオスポラ種であるＮ．ｈｕｇｈｅｓｉはウマでウマ原虫性脊髄脳炎の原因ではないかと推測されている。
ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ及びウマには多数のサルコシスティス種が存在する。経済的観点では、Ｓａｒｃｏｃｙｓｔｉｓ ｎｅｕｒｏｎａがウマの臨床ウマ原虫性脊髄脳炎の最も一般的な原因として認められている。米国ではウマの５０％がＳ．ｎｅｕｒｏｎａに血清反応陽性である。
プラスモジウムは住血胞子虫類に属し、例えば蚊に伝播されるマラリアの原因として知られている。ヒトでは、４種のプラスモジウム種が報告されており、そのうち、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍが最も病原性と致死性が高い。４００，０００，０００人が感染していると推定され、毎年２，０００，０００人が死亡している。初期臨床症状は周期的発熱である。初期感染後、プラスモジウムは赤血球に寄生し、多くの場合には貧血を生じる。寄生された赤血球は内臓の毛細血管で詰まり、組織酸素欠乏を生じる。これは脳の場合に特に深刻であり、多発性点状出血を生じ、浮腫や昏睡をもたらし、死に至る場合もある。プラスモジウム種は主にヒトで報告されているが、他のプラスモジウム種も多様な脊椎動物に感染すると考えられる。
バベシアとタイレリアはいずれもピロプラズマに属しており、多数の哺乳動物種に多様な疾患をもたらす寄生虫種を含む。バベシア種はダニにより伝播され、多様な脊椎動物に感染してバベシア症なる疾患を生じる。この疾患は脱力、貧血及び寄生虫症を特徴とし、感染動物の多臓器不全をもたらす。進行段階ではヘモグロビン尿症を生じる。ウシで重要なバベシア種としてはＢ．ｂｏｖｉｓ、Ｂ．ｄｉｖｅｒｇｅｎｓ、Ｂ．ｍａｊｏｒ及びＢ．ｂｉｇｅｍｉｎａが挙げられる。イヌではＢ．ｃａｎｉｓ、Ｂ．ｒｏｓｓｉ、Ｂ．ｍｉｃｒｏｔｉ及びＢ．ｇｉｂｓｏｎｉ種が主にバベシア症の原因となり、一般的な死因である。Ｂ．ｄｉｖｅｒｇｅｎｓやＢ．ｍｉｃｒｏｔｉ等の所定のバベシア種はヒトにも感染することが報告されている。
タイレリアはダニにより伝播される疾患であり、反芻動物に感染し、主にウシで問題となる。タイレリアは白血球と赤血球に感染して成長する。疾病は主に白血球内段階に起因する。ウシではＴ．ｐａｒｖａとＴ．ａｎｎｕｌａｔａの２種の主要タイレリア種を特筆すべきである。Ｔ．ｐａｒｖａはアフリカ諸国に特有の致命的ウシ疾患である東海岸熱の原因となる。東海岸熱は高熱、リンパ節障害、重度肺水腫及び消耗を特徴とする。Ｔ．ａｎｎｕｌａｔａはウシと水牛に感染し、まずリンパ系の細胞に侵入し、やがて赤血球内形態として末梢血に現れる。Ｔ．ａｎｎｕｌａｔａ感染は一般に熱帯タイレリア症と呼ばれる。この疾患はまず高熱とリンパ節膨張が起こり、その後、脱力、脈拍と呼吸速度の増加及び食欲不振を生じる。疾患の最終段階では貧血が観察され、最終的に死に至る。ウマではＢａｂｅｓｉａ ｅｑｕｉ（Ｔｈｅｉｌｅｒｉａ ｅｑｕｉと改名）も主要病原体である。
当然のことながら、これらの寄生虫に対する種々の防除方法が多年来研究されている。
寄生虫感染防除経路の１つは医薬成分の使用であり、例えば現在家禽コクシジウム症の治療に非常に一般的な治療剤である抗コクシジウム剤の長期使用が挙げられる。別の経路は間違いなくワクチン接種である。特に抗生物質の使用を嫌う傾向が高まっていることから、新規で有効なワクチン、特に広範な防御を提供するワクチンが必要とされていることは明白である。
現在、寄生虫感染に対するワクチン接種には弱毒生ワクチンと不活化（死滅）ワクチンの２種の異なるアプローチが使用されている。どちらのアプローチにも以下に要約するように利点と欠点がある。
弱毒ワクチンの主要な利点は自然感染に非常によく似ているという点であり、免疫系の全段階を活性化し、体液性ＩｇＧと局所ＩｇＡを誘導することができ、多数の防御抗原に対して免疫応答を誘導し、より長期間の免疫を提供し、交差反応性が高い。更に、低コストで殆どの場合に迅速な免疫が得られる。
弱毒ワクチンの欠点は正しい弱毒レベルを見いだすのが困難であり、病原性復帰の可能性があり（これらは重大な欠点である）、被接種者から接触感染し、免疫不全のヒト及び動物では問題がある。
不活化ワクチンの利点はブースター投与するならば十分な体液性免疫が得られ、突然変異又は復帰突然変異を示さず（大きな利点）、免疫不全患者でも使用することができ、原則として安全である点である。
不活化ワクチンの欠点は（細胞性）免疫を誘発しないことが多く、ブースターが必要であり、局所免疫が得られず（重要）、高価であり、不活化が１００％未満の場合には使用が危険であるという点である。
しかし、寄生虫に対するワクチンの開発は寄生虫自体が複雑であるという理由にせよ、他の微生物に比較して複雑である。更に、種々の寄生虫はアピコンプレックス門内やトリパノソーマ科内であっても、近縁であるにも拘わらずその遺伝子構成に十分な類似性がないため、これらの全寄生虫に等しく適用可能な共通の弱毒部位又は不活化方法を割り当てることができない。更に、弱毒生ワクチンを製造するには全寄生虫に適切な弱毒ターゲットを配置する必要がある。死滅ワクチンを製造するには全寄生虫についてどの抗原を不活化方法により改変せずにおくべきかを知る必要がある。更に、多くの不活化寄生虫ワクチンは従来有効ではないことが示されている。最後に、感染経路、宿主、宿主内の宿主細胞が多種多様であり、大半の寄生虫に特徴的な生活環の期間で宿主が異なることも多く、更には寄生虫毎に生活環が異なる場合もある。この点もワクチンの開発を困難にしている。
従って、寄生虫感染防除用ワクチンの開発は従来困難であり、時間がかかり、あまり成功していない。
本発明の目的はアピコンプレックス門とトリパノソーマ科の寄生虫に起因する感染の防除用ワクチンとして、死滅ワクチンと弱毒生ワクチンの利点の殆どを兼備すると共にこれらのワクチンの欠点をほぼ完全に解消したワクチンを提供することである。更に、このようなワクチンの製造方法はアピコンプレックス門とトリパノソーマ科の寄生虫に広く適用可能である。
アピコンプレックス門とトリパノソーマ科の全寄生虫の生活環には、所定段階が宿主の細胞に感染して分裂を開始する少なくとも１時点が存在する。この感染時点又はその付近でリボソーム合成を停止できるならば寄生虫は宿主細胞に侵入せず、既存リボソームプールを使用して数回分裂することにより自然感染と完全に同様になることが今回意外にも判明した。しかし、最終的に数回分裂後に子孫寄生虫はリボソームの欠乏により死滅する。
これは毒性感染が生じたかのように感染後の免疫応答の誘導が最も自然な方法で誘発されるが、天然状態とは異なり、寄生虫は所定時間後に不可避的に消滅するという利点がある。この目的はリボソーム蛋白質遺伝子を誘導性プロモーターの制御下におくことにより達成された。
誘導性プロモーターは故意にオン・オフ転換することができるプロモーターである。このようなプロモーターの例は後段に挙げる。
安定な完全に機能的なリボソームの合成には原則として全リボソーム蛋白質が必要であるので、原則として各リボソーム蛋白質遺伝子をターゲットとして使用することができる。アピコンプレックス門とトリパノソーマ科の全寄生虫は細胞質リボソームをもち、その殆どはプラスチドリボソーム及び／又はミトコンドリアリボソームをもつ。これらはいずれも寄生虫の正常な発生に必要である。従って、本発明の生きた弱毒寄生虫は、リボソーム蛋白質遺伝子がプラスチド、ミトコンドリア又は細胞質リボソームのいずれに組込むリボソーム蛋白質をコードするかに関係なく、リボソーム蛋白質遺伝子を誘導性プロモーターの制御下におくことにより獲得することができる。
リボソーム蛋白質配列は種々の寄生虫間で高度に保存されている。従って、アピコンプレックス門とトリパノソーマ科の寄生虫の各々で類似のリボソーム蛋白質を検出するためには以下に示すリボソーム配列のＤＮＡプローブを使用することができる。更に、ＮＣＢＩ蛋白質データベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｉｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）には多種多様の寄生虫の多数のリボソーム蛋白質遺伝子の配列が掲載されている。
１個のリボソーム蛋白質が欠失するだけで安定なリボソームの形成が妨げられるという事実は種々の植物、動物及び微生物で立証されている。１例を挙げると、ショウジョウバエでは８０個のリボソーム蛋白質のうちの一部の突然変異の結果として例えば細く短い剛毛、遅い成長、ヘテロ接合体における雌準不妊及びホモ接合致死性等の典型的表現型となることが示されている。この表現型はＭｉｎｕｔｅ表現型と呼ばれ、例えばリボソーム蛋白質Ｓ１３及びＬ９の突然変異で観察されている（Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ａ．，Ｈｏｌｌｍａｎｎ，Ｍ．，Ｓｃｈａｆｅｒ，Ｕ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ．２５１：３８１−３８７（１９９６），Ｓａｅｂｏｅ−Ｌａｒｓｓｅｎ ＆ Ｓ．，Ｌａｍｂｅｒｔｓｓｏｎ，Ａ．，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １４３：８７７−８８５（１９９６））。別の例は酵母リボソーム蛋白質Ｓ３をコードする酵母のリボソーム蛋白質遺伝子ＹＳ３である。その分裂の結果、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの非生存性半数体胞子を生じる（Ｆｉｎｋｅｎ−Ｅｉｇｅｎ，Ｍ．，Ｄｏｍｄｅｙ，Ｈ．，Ｋｏｈｒｅｒ，Ｋ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ２２３，３９７−４０３（１９９６））。これらの研究は、単一リボソーム蛋白質をダウンレギュレートするだけでリボソーム複合体の形成及び／又は適正な機能が妨げられることを立証している。
リボソーム蛋白質遺伝子の転写制御のために本発明の寄生虫で使用するプロモーターはただ１つの前提条件を満足するだけでよい。即ち、寄生虫の増殖中はプロモーターをオンにしなければならない。これは当然のことながら正常増殖に必要な天然量のリボソームを本発明の寄生虫に与えるために必要である。他方、寄生虫をワクチンとして受容するレシピエント宿主ではプロモーターをオフ転換しなければならない。プロモーターは制御下の遺伝子の転写を開始する場合にオン転換されるとみなされる。本発明では、この遺伝子はリボソーム蛋白質遺伝子である。プロモーターは制御下の遺伝子の転写がオン状態の少なくとも２分の１となる場合にオフ転換されるとみなされる。転写レベルは少なくとも３分の１が好ましく、４分の１がより好ましく、５分の１が更に好ましく、６分の１又は７分の１が更に好ましい。転写の完全な阻害は必要ないことに留意すべきである。低レベルのリボソーム蛋白質転写の結果、寄生虫が消滅するまでの寿命が最終的に延びる。従って、多少長期間にわたって免疫系が活性化される。
原則として２つの異なる可能性があり、プロモーターはプロモーターをオフ転換する所定条件が適用されない限りオンであるか、又はプロモーターはプロモーターをオン転換する所定条件が適用されない限りオフである。
プロモーターは寄生虫をワクチンとして受容するレシピエント宿主に存在しない所定条件が適用されない限り、オフ転換状態であることが好ましい。
必要に応じて２個以上のリボソーム蛋白質遺伝子を誘導性プロモーターの制御下におくことができる。これはプロモーターで使用する誘導性プロモーターを十分にオフ転換できない場合、例えば誘導性プロモーターがリーキープロモーターである場合や、１個の特定リボソーム蛋白質の欠失ではリボソームを脱安定化するのに不十分であるという例外的な場合に好ましい選択である。
以下、例を挙げて本発明を説明する。
Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉはネコを最終宿主とし、草食動物及び雑食動物と肉食動物を夫々順次中間宿主とする。トキソプラズマの場合には、寄生虫のオーシスト／組織嚢胞段階が最終的にヒトに感染する。ヒト及び温血動物がワクチン接種のターゲット哺乳動物であるので、生きた弱毒寄生虫を必要とする寄生虫段階はトキソプラズマタキゾイトである。従って、本発明によりリボソーム蛋白質遺伝子を誘導性プロモーターの制御下におく寄生虫段階はタキゾイトである。こうして作製した組換え寄生虫（生きた弱毒寄生虫とも言う）はプロモーターをオン転換する条件下で従来通りに増殖させることができる。このような状態では、リボソーム数は天然状態と同一であるか又は近似する。ワクチン目的に十分な寄生虫が増殖したならば、生きた弱毒寄生虫を回収し、ワクチンとして投与する。ワクチン接種する宿主には、プロモーターをオン転換する条件は存在しないので、プロモーターはオフ転換状態のまま維持される。リボソームプールは天然状態と同様であるのでワクチン接種時に寄生虫は野生型寄生虫として挙動する。従って、宿主の感染及び侵入プロセスは自然感染プロセスと全く同様である。寄生虫は宿主で分裂を開始するや否や、リボソームプールもその子孫に分配する。しかし、リボソーム蛋白質遺伝子の（少なくとも）１個のプロモーターは宿主細胞ではオフ転換位置にあるので、リボソームのｄｅ ｎｏｖｏ合成は低下するか又は全く生じない。従って、子孫はゆっくりと消滅する。他方、感染プロセス、従って免疫系の誘発は野生型寄生虫感染の場合と同様に継続している。従って、毒性野生型寄生虫感染が生じたかのように最終的に免疫は増進するが、免疫の誘導に使用される生きた弱毒寄生虫は１又は数回感染後に消滅する。以下、例を挙げて更に詳細に説明する。
Ｎｅｏｓｐｏｒａ ｃａｎｉｎｕｍの生活環はネオスポラがイヌを最終宿主とし、例えばウシ、イヌ、ヒツジ及びウマの流産の原因となる点を除いてトキソプラズマと同様である。従って、ネオスポラワクチンのアプローチは上記トキソプラズマワクチンのアプローチと密接な関係がある。トキソプラズマでは、本発明によりリボソーム蛋白質遺伝子を誘導性プロモーターの制御下におく寄生虫段階はタキゾイトである。ネオスポラの分子遺伝学ツールの開発は例えばＨｏｗｅ，Ｄ．Ｋ．ａｎｄ Ｓｉｂｌｅｙ，Ｌ．Ｄ．ＭＥＴＨＯＤＳ：１３（２）：１２３−３３（１９９７）に記載されている。
生きた弱毒アイメリア寄生虫を作製するためには、本発明によりリボソーム蛋白質遺伝子を誘導性プロモーターの制御下におく寄生虫段階はメロゾイトである。しかし、この場合には、ワクチンにはメロゾイトではなく胞子形成オーシストを加える。これは、この寄生虫がニワトリにより通常摂取される形態が胞子形成オーシストであるためである。しかし、本発明により作製した初代組換えメロゾイトを複製させるには、ニワトリの消化管に導入すれば十分である。その後、ニワトリにより排泄される組換えオーシストを単離し、コクシジウム症ワクチン、例えば飲料水投与用経口ワクチンで生きた弱毒寄生虫として直接使用することができる。ニワトリ糞からのオーシストの単離は当分野で周知の標準方法である。アイメリアの遺伝子組換えは例えばＫｅｌｌｅｈｅｒ，Ｍ．ａｎｄ Ｔｏｍｌｅｙ，Ｆ．Ｍ．（Ｍｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．９７（１−２）：２１−３１（１９９８））により記載されている。
本発明の弱毒生マラリアワクチンは例えばプラスモジウム寄生虫の赤血球期であるプラスモジウム組換えスポロゾイトから出発して作製することができる。スポロゾイトは雌蚊により（ヒト）血流中に注入される寄生虫の段階である。スポロゾイトは注入後２分以内に肝臓に感染し、シゾントとメロゾイトを生成する。メロゾイトは赤血球に感染して複製する。この時点でリボソームプールを多数の子孫寄生虫に分配しなければならず、この時点で子孫寄生虫は消滅する。この時点で既に完全免疫防御系が完全に誘発される。この例からも本発明の組換え寄生虫をベースとするワクチンの利点は明らかであり、生ワクチンの全利点と不活化ワクチンの利点を兼備している。ワクチン接種は組換え赤血球期プラスモジウム寄生虫又は（あまり実用的ではないが）組換えスポロゾイトで実施することが好ましい。プラスモジウムの組換えＤＮＡ技術は例えばＣｒａｂｂ，Ｂ．Ｓ．ら，（Ｍｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．９０：１３１−１４４（１９９７））とＷｕ，Ｙ．ら，（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９３：１１３０−１１３４（１９９６），及びＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９２：９７３−９７７（１９９５））により記載されている。
本発明の弱毒生タイレリアワクチンも組換えメロゾイトをベースにすることができる。これらのメロゾイトはリンパ球で増殖維持することができる。メロゾイトはリンパ球でリンパ球の分裂と同調して分裂を開始するが、少数の遊離子孫寄生虫は他のリンパ球に感染し、野生型様免疫を誘導するが、他の例と同様にリボソームの欠乏がゆっくりと増すので最終的に子孫は消滅する。タイレリアは主にリンパ細胞で増殖培養することができる。例えばＳｈｋａｐＶ．ら，Ｖｅｔ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．６５：１１−２０（１９９６）とＨｕｌｌｉｇｅｒ，Ｌ．Ｊ．Ｐｒｏｔｏｚｏｏｌ．１２：６４９−６５５（１９６５）参照。
弱毒生バベシアワクチンはメロゾイト及び／又はトロフォゾイトを組換えに使用して作製することができる。これらは赤血球で培養することができる。アプローチ全体はタイレリアについて上述したアプローチと同様である。例えばＬｅｖｙ，Ｍ．Ｇ ａｎｄ Ｒｉｓｔｉｃ，Ｍ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０７：１２１８−１２２０（１９８０）参照。
Ｓ．ｓｕｉｈｏｍｉｎｉｓやＳ．ｎｅｕｒｏｎａ等のサルコシスティス種では、スポロゾイトとメロゾイトの両者が本発明の組換えのターゲットである。この場合も原理は同様であり、組換えスポロゾイトから組換えメロゾイトが得られ、これらのメロゾイトはｄｅ ｎｏｖｏリボソーム蛋白質合成の不在下でリボソームの欠乏によりゆっくりと消滅する。組換えメロゾイトをワクチンで直接使用することができる。例えばＭｕｒｐｈｙ，Ａ．Ｊ．ａｎｄ Ｍａｎｓｆｉｅｌｄ，Ｌ．Ｓ．Ｊ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．８５：９７９−９８１（１９９９）及びＥｌｌｉｓｏｎ，Ｓ．Ｐ．ら，Ｖｅｔ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．９５：２５１−２６１（２００１）参照。
キネトプラスト（Ｋｉｎｅｔｏｐｌａｓｔｉｄａ）目に関しては、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉ（Ｗｉｒｔｚ，Ｅ．ａｎｄ Ｃｌａｙｏｎ，Ｃ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６８：１１７９−１１８３（１９９５）及びＢｉｅｂｉｎｇｅｒ，Ｓ．ら，Ｍｏｌ．＆ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．８５：９９−１１２（１９９７））、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｏｎｇｏｌｅｓｅ（Ｉｎｏｕｅ Ｎ．ら，Ｍｏｌ．＆ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．１２０：３０９−３１３（２００２））及びＬｅｉｓｈｍａｎｉａ ｄｏｎｏｖａｎｉ（Ｙａｎ，Ｓ．ら，Ｍｏｌ．＆ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．１１２：６１−６９（２００１））についてテトラサイクリンの制御下の遺伝子発現が記載されており、リボソーム蛋白質遺伝子転写を制御するために次のように調節することができる。簡単に言えば、寄生虫のプロサイクリック形態がトランスフェクションのターゲットである。異種遺伝子（この場合には非リボソーム遺伝子）をテトラサイクリン依存的に制御できるようにテトラサイクリンリプレッサーをリボソームＲＮＡ反復配列の非転写スペーサーに組込む。 キネトプラスト目の本発明の生きた弱毒寄生虫を構築するには、まず１個以上のテトラサイクリンオペレーターエレメントを含むプロモーターと共にリボソーム蛋白質遺伝子の付加コピーを挿入する。次に、内在遺伝子コピーを寄生虫ゲノムから欠失させる。これは相同組換えにより容易に実施することができ、組換え用マーカーの存在下に実施することが好ましい。これは下記アピコンプレックスの方法と同様である。リーシュマニアとトリパノソーマの大半の遺伝子は同一ＤＮＡ鎖で隣接遺伝子の大きな（＞１００〜５００ｋｂ）ポリシストロンクラスターとして構成されるため、リーシュマニアとトリパノソーマでは内在リボソーム蛋白質遺伝子の直接ターゲティングは実施できない。即ち、１個の遺伝子を阻害すると、下流に配置された全遺伝子の転写が阻害される（Ｍｙｌｅｒ，Ｐ．Ｊ．ら，Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９０：９−１２（２００１））。
以上の例は実際に単に例示に過ぎない。これらの例により本発明の範囲を限定するものではない。アピコンプレックス門とトリパノソーマ科の全種寄生虫の例とその生活環はＥｎｃｙｃｌｏｐａｅｄｉｃ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｏｆ Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ，Ｈｅｉｎｚ Ｍｅｈｌｈｏｒｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ（２００１）（ＩＳＢＮ ３−５４０−６６８２９−２）に記載されている。従って、当業者は上記例とＥｎｃｙｃｌｏｐａｅｄｉｃ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｏｆ Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙを使用してアピコンプレックス門とトリパノソーマ科の各寄生虫について本発明の生きた弱毒寄生虫を作製するための出発点としてどの段階が好ましい段階であるかを完全に決定することができる。
上記科に属する寄生虫の多くは多種多様の宿主をもつ。単に１例を挙げると、イヌに感染するＢ．ｃａｎｉｓ、ウマ、ラバ及びロバに感染するＢ．ｃａｂａｌｌｉ、ウシ、野生反芻動物及びヒトに感染するＢ．ｄｉｖｅｒｇｅｎｓ等のバベシア種が挙げられる。しかし、いずれの場合にも寄生虫の生活環は同様である。従って、例えばバベシアに対する本発明のワクチンが組換えメロゾイトをベースにすることができるという上記記載は全バベシア種に当てはまる。ある科の種々の種の生活環に関する詳細も上記Ｅｎｃｙｃｌｏｐａｅｄｉｃ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｏｆ Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ，Ｈｅｉｎｚ Ｍｅｈｌｈｏｒｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ（２００１）（ＩＳＢＮ ３−５４０−６６８２９−２）に記載されている。
従って、本発明の１態様は誘導性プロモーターの制御下にリボソーム蛋白質遺伝子を含むことを特徴とするアピコンプレックス門又はトリパノソーマ科の生きた弱毒寄生虫に関する。
誘導性プロモーターの概念は上記に要約した通りである。誘導性プロモーターとは外部因子の作用下にオン・オフ転換することができるプロモーターである。このような転換因子は例えば熱等の物理的因子とすることができ、数十年来当分野で周知の多数の熱ショックプロモーターはいずれも熱により活性化される。このような因子は化学種でもよい。このような多くの因子も当分野で周知である。当分野で公知の誘導性プロモーターは枚挙にいとまがない。少数の例を以下に挙げる。ＩＰＴＧ誘導性Ｌａｃプロモーターは恐らく最も多用されている誘導性プロモーターの１種である。他の誘導性プロモーターシステムとしては例えばテトラサイクリンにより制御される転写活性化システム（Ｂａｒｏｎ，Ｕ．ら，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ ２５：２７２３−２７２９（１９９５））やエクジソン誘導性発現システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（Ｙａｏ，Ｔ．Ｐ．ら，Ｃｅｌｌ ７１：６３−７２（１９９２））が挙げられる。
原則として、ある条件の存在下にオン転換されるものと、ある条件の存在下にオフ転換されるものの２種の誘導性プロモーターが存在する。この条件は化学物質の存在でもよい。
本発明のこの態様の好ましい１形態では、使用するプロモーターは宿主に天然では存在しない条件の存在下にオン転換される。このようなプロモーターを使用すると、寄生虫の天然宿主に投与するや否や自動的にオフ転換位置になる（又は転換する）という利点がある。従って、本発明の生きた弱毒寄生虫を複製させるためには「人工」条件下、即ち天然宿主には存在しない条件下で増殖させることが好ましい。
好ましい型の誘導性プロモーターはオペレーター部位と前記オペレーター部位と可逆的に結合することが可能なリプレッサーをベースとする型の誘導性プロモーターである。この場合、リプレッサー蛋白質の結合と分離は上記のように適用される「条件」、即ち熱、化学物質等の有無により制御することができる。
本発明の生きた弱毒寄生虫で非常に有効に使用することができる誘導性プロモーター、又はより厳密にはプロモーター／オペレーター／リプレッサー複合体の非常に適切な例はｔｅｔプロモーター／ｔｅｔオペレーター複合体（ｔｅｔＲシステムとも言う）である。
ｔｅｔＲシステム自体は既に記載されており、Ｔ．ｂｒｕｃｅｉ（Ｗｉｒｔｚら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６８：１１７９−１１８３（１９９５），Ｂｉｅｂｉｎｇｅｒら（Ｍｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐａｒａｓ．８５：９９−１１２（１９９７））やＥｎｔａｍｏｅｂａ ｈｙｓｔｏｌｉｔｉｃａ（Ｈａｍａｎｎら，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐａｒａｓ．８４：８３−９１（１９９７））等の多種多様の原虫寄生虫で機能することが立証されている。ｔｅｔＲシステムはミオシンＡの発現を調節するためにトキソプラズマで使用するのにも成功している（Ｍｅｉｓｓｎｅｒ Ｍら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２９（２２）：Ｅ１１５（２００１））。更に、テトラサイクリンの制御下の発現もＧｉａｒｄｉａ ｌａｍｂｌｉａやＬｅｉｓｈｍａｎｉａ ｄｏｎｏｖａｎｉで立証されており、原虫におけるその汎用性が示されている（Ｙａｎ Ｓら，Ｍｏｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．１１２（１）：６１−９（２００１），Ｓｕｎ，Ｃ．Ｈ．ａｎｄ Ｔａｉ，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．１０５（１）：５１−６０（２０００））。
この複合体は以下に簡単に記載し、実施例で更に詳細に説明するように作用する。
原則として、リボソーム蛋白質をテトラサイクリンの制御下に発現させるためには、１．テトラサイクリンリプレッサー（ｔｅｔＲ）遺伝子の組込みと発現、及び２．転写開始部位の近傍のリボソーム蛋白質遺伝子のプロモーターへの１個以上のテトラサイクリンオペレーターエレメントの組込みの２段階を実施する必要がある。
ｔｅｔリプレッサー遺伝子はｔｅｔオペレーター部位と結合して隣接遺伝子の転写を阻止することが可能な蛋白質をコードする遺伝子である。この遺伝子を構成的プロモーター（即ち組換え寄生虫で構成的なプロモーター）の制御下におき、組換えＤＮＡ技術を使用して寄生虫に導入する。こうして組換え寄生虫はｔｅｔリプレッサー蛋白質を合成する。ｔｅｔオペレーターはＳＴＳの上流の１個以上のリボソーム蛋白質遺伝子の転写開始部位の近傍、好ましくは内在プロモーターに導入することが好ましい。従って、ｔｅｔリプレッサー蛋白質はｔｅｔオペレーターと結合し、下流のリボソーム蛋白質遺伝子の転写を阻止する。他方、テトラサイクリンの存在下では、リプレッサーはｔｅｔオペレーター部位から分離し、下流の遺伝子の転写を可能にする。従って、テトラサイクリンの存在下では、組換え寄生虫は天然状態と同様に複製することができる。上記例の寄生虫の大半を含む多くの寄生虫の場合のように組換え寄生虫をｉｎ ｖｉｔｒｏ増殖できる場合には、テトラサイクリンを容易に増殖培地に添加することができる。例えばアイメリア寄生虫の場合のように天然宿主で寄生虫を増殖させる必要がある場合には、テトラサイクリンを宿主（この場合にはニワトリ）に容易に経口又は注射により投与することができる。テトラサイクリンは細胞外及び細胞内寄生虫により取込まれることに留意すべきである。薬剤がリボソーム蛋白質の発現の調節に作用するために宿主細胞の細胞破壊は必要ない。
ステップ１におけるテトラサイクリンリプレッサー遺伝子（ｔｅｔＲ）の組込みと発現は上記文献に記載されているように実施することができる。テトラサイクリンリプレッサー遺伝子の安定な形質転換と場合により組込みを指示する適切な周知選択マーカーは例えばＣＡＴ遺伝子である（Ｋｉｍ，Ｋ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６２（５１３５）：９１１− ４（１９９３））。安定なトランスフェクションの選択に適切な他のマーカーも当分野で公知であり、例えばＤＨＦＲ−ＴＳ（Ｄｏｎａｌｄ，Ｒ．Ｇ．ａｎｄ Ｒｏｏｓ，Ｄ．Ｓ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ Ｓ Ａ ９０（２４）：１１７０３−１１７０７（１９９３），Ｒｏｏｓ，Ｄ．Ｓ．ら，ＭＥＴＨＯＤＳ １３：１１２−１２２（１９９７））やＨＸＧＰＲＴ（Ｄｏｎａｌｄ，Ｒ．Ｇ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：１４０１０−１４０１９（１９９６），Ｄｏｎａｌｄ，Ｒ．Ｇ．ａｎｄ Ｒｏｏｓ，Ｄ．Ｓ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．９１（２）：２９５−３０５（１９９８））が挙げられる。
Ｃｒｅ−ｌｏｘシステムも適切な選択システムである（例えばＨａｒｄｙ，Ｓ．ら，Ｊｏｕｒｎ．Ｖｉｒｏｌ．７１：１８４２−１８４９（１９９７）参照）。
ｔｅｔＲシステムを誘導性プロモーターシステムとして使用する場合には、リボソーム蛋白質遺伝子の上流のプロモーターは例えばｔｅｔオペレーターを転写開始部位の近傍にクローニングすることにより誘導可能な内在プロモーターとすることができる（ｔｅｔオペレーター配列と好適挿入部位の詳細については下記参照）。言うまでもなく、リボソーム蛋白質遺伝子の十分に高い転写レベルを提供することが可能な他の任意プロモーターも適切である。
別の誘導性プロモーターシステムを使用する場合には、このような誘導性プロモーターを使用して内在プロモーターを欠失させることは容易である。他方、ｔｅｔオペレーターと同様の原理の別の調節エレメントを使用する場合には、プロモーター自体も内在プロモーターとすることができる。この場合にも言うまでもなく、下流にクローニングしたリボソーム蛋白質遺伝子の十分に高い転写レベルを提供することが可能な他の任意プロモーターも適切である。
ステップ２においてＳＴＳの近傍に１個以上のｔｅｔＯ部位（＝ｔｅｔオペレーター部位）を含むリボソーム蛋白質遺伝子で野生型リボソーム蛋白質遺伝子を置換するには選択リボソーム蛋白質遺伝子のプロモーターと遺伝子自体の間にｔｅｔオペレーター部位を挿入する必要がある。ｔｅｔオペレーターはＹａｎ Ｓら（Ｍｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．１１２（１）：６１−９（２００１））、Ｗｉｒｔｚ，Ｅ ａｎｄ Ｃｌａｙｏｎ，Ｃ．（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６８（５２１４）：１１７９−８３（１９９５））及びＭｅｉｓｓｎｅｒ Ｍら（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２９（２２）：Ｅ１１５（２００１））により記載されている。
単一ｔｅｔオペレーター（ｔｅｔＯ）部位の配列は５’−ＴＣＣＣＴＡＴＣＡＧＴＧＡＴＡＧＡＧＡＴＣ−３’である。
原則として、選択リボソーム蛋白質遺伝子の手前に単一ｔｅｔオペレーター部位を挿入すれば十分である。しかし、ｔｅｔＲシステムは全生物システムと同様に厳密に０％から１００％活性まで誘導可能ではなく、またその逆も可能ではない。従って、高レベルの制御が必要な場合には、２個以上のオペレーター部位を挿入することが好ましい。
ｔｅｔオペレーターは下流遺伝子を転写するＲＮＡポリメラーゼの結合を妨げる。従って、ｔｅｔオペレーターは転写開始部位（本明細書ではＳＴＳと言う）に対してヌクレオチド−１００〜＋３の領域の所定位置に挿入することが好ましい。更に、このようなＳＴＳの決定方法については実施例に詳しく説明する。
１個以上のｔｅｔオペレーター部位を含む組換え遺伝子で野生型リボソーム蛋白質遺伝子を置換する段階は例えばＤｏｎａｌｄ，Ｒ．Ｇ．ａｎｄ Ｒｏｏｓ，Ｄ．Ｓ．（Ｍｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．９１（２）：２９５− ３０５（１９９８））に記載されているヒットエンドランストラテジーを用いて実施することができる。
当業者は陽性及び陰性選択マーカーの他の組み合わせを使用して代替方法を見いだすことができよう。例えばＨＳＶチミジンキナーゼを陰性選択マーカーとして使用することができる。（ＬｅＢｏｗｉｔｚ，Ｊ．Ｈ．ら，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．５１（２）：３２１−５（１９９２），Ｆｏｘ，Ｂ．Ａ．ら，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．１１６（１）：８５−８（２００１））。
本発明の組換えトキソプラズマ寄生虫の構築に使用される分子ツールはネオスポラでも同様に良好に利用できる（Ｈｏｗｅ，Ｄ．Ｋ．ａｎｄ Ｓｉｂｌｅｙ，Ｌ．Ｄ．ＭＥＴＨＯＤＳ １３（２）：１２３−１３３（１９９７））。
アイメリアでも同一方法を適用することができる。単に１例として、Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａでβ−ガラクトシダーゼを一過的に発現できることがＫｅｌｌｅｈｅｒ，Ｍ．ａｎｄ Ｔｏｍｌｅｙ，Ｆ．Ｍ．により報告されている（Ｍｏｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．９７（１−２）：２１−３１（１９９８））。
タイレリアについては、例えば感染性単核Ｔｈｅｉｌｅｒｉａ ａｎｎｕｌａｔａスポロゾイトを一過的にトランスフェクトする方法がＡｄａｍｓｏｎ，Ｒ．らにより開発されている（Ｍｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．１１４（１）：５３−６１（２００１））。
プラスモジウムでは、ピリメタミン耐性を付与するように突然変異させたジヒドロ葉酸レダクターゼ−チミジル酸シンターゼ（ｄｈｆｒ−ｔｓ）コーディング配列、又はピューロマイシン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ、又はアスペルギルスのブラスチシジンＳデアミナーゼ（ＢＳＤ）遺伝子、又はトランスポゾンＴｎ５由来ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ＮＥＯ）遺伝子が選択マーカーとして記載されている（Ｗｕ，Ｙ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ Ｓ Ａ．９３（３）：１１３０−４（１９９６），Ｗａｎｇ，Ｐ．ら，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．１２３（１）：１−１０（２００２），ｄｅ Ｋｏｎｉｎｇ−Ｗａｒｄ，Ｔ．Ｆ．ら（Ｍｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．１１７（２）：１５５−６０．（２００１））。
バベシアでも同様の選択マーカーを利用できる。
従って、当業者はアピコンプレックス（Ａｐｉｃｏｍｐｌｅｘａ）門とトリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａｔｉｄａｅ）科に属する全範囲の寄生虫に本発明を適用することができよう。
この態様の好ましい１形態はコクシジウム（Ｃｏｃｃｉｄｉａ）、ピロプラズマ（Ｐｉｒｏｐｌａｓｍｉｄａ）又は住血胞子虫（Ｈａｅｍｏｓｐｏｒｉｄａ）に属する本発明の生きた弱毒寄生虫に関する。
この態様のより好ましい１形態では、生きた弱毒寄生虫はアイメリア（Ｅｉｍｅｒｉｄｉｉｄａｅ）科、クリプトスポリジウム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｉｄａｅ）科又はサルコシスティス（Ｓａｒｃｏｃｙｓｔｉｄａｅ）科に属する。
この態様の更に好ましい１形態では、生きた弱毒寄生虫はアイメリア（Ｅｉｍｅｒｉａ）属、クリプトスポリジウム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）属、トキソプラズマ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ）属、サルコシスティス（Ｓａｒｃｏｃｙｓｔｉｓ）属又はネオスポラ（Ｎｅｏｓｐｏｒａ）属に属する。
この態様の別のより好ましい形態では、生きた弱毒寄生虫はバベシア（Ｂａｂｅｓｉｉｄａｅ）科又はタイレリア（Ｔｈｅｉｌｅｒｉｉｄａｅ）科に属する。
この態様の更に好ましい１形態では、生きた弱毒寄生虫はバベシア（Ｂａｂｅｓｉａ）属又はタイレリア（Ｔｈｅｉｌｅｒｉａ）属に属する。
この態様の別のより好ましい形態では、生きた弱毒寄生虫はプラスモジウム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）属に属する。
この態様の更に別のより好ましい形態では、生きた弱毒寄生虫はトリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ）属又はリーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）属に属する。
更に好ましい１形態では、弱毒寄生虫はＬｅｉｓｈｍａｎｉａ ｍｅｘｉｃａｎａ、Ｌ．ｉｎｆａｎｔｕｍもしくはＬ．ｍａｊｏｒ種又はＴｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉもしくはＴ．ｃｒｕｚｉ種に属する。
この態様の別の好ましい１形態では、本発明の生きた弱毒寄生虫のリボソーム蛋白質遺伝子を抗生物質により誘導可能な誘導性プロモーターの制御下におく。
これらの抗生物質はテトラサイクリン又は無水テトラサイクリン、又はその誘導体がより好ましい。
この態様の別の好ましい形態では、選択リボソーム蛋白質遺伝子はＬ９、Ｓ３、プラスチド−Ｓ９又はＳ１３、好ましくはＴｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉのＬ９、Ｓ３、プラスチド−Ｓ９又はＳ１３をコードする遺伝子である。
ラージサブユニットリボソーム蛋白質番号９（Ｌ９）をコードする遺伝子のヌクレオチド配列と、プロモーター領域を含む上流配列を配列番号１に示す。
プラスチドスモールサブユニットリボソーム蛋白質番号９（Ｓ９）をコードする遺伝子のヌクレオチド配列と、プロモーター領域を含む上流配列を配列番号２に示す。
スモールサブユニットリボソーム蛋白質番号１３（Ｓ１３）をコードする遺伝子のヌクレオチド配列と、プロモーター領域を含む上流配列を配列番号３に示す。
スモールサブユニットリボソーム蛋白質番号３（Ｓ３）をコードする遺伝子のヌクレオチド配列と、プロモーター領域を含む上流配列を配列番号４に示す。
本発明の更に別の態様は、本発明の生きた弱毒寄生虫と医薬的に許容可能なキャリヤーを含有する寄生虫感染防除用ワクチンに関する。
医薬的に許容可能なキャリヤーは例えば滅菌水又は滅菌生理食塩水とすることができる。より複雑な形態では、キャリヤーは例えば当分野で周知の緩衝液（例えばＰＢＳ）とすることができる。
本発明のワクチンは好ましい形態では更に免疫刺激物質（所謂アジュバント）を添加することができる。アジュバントは一般に非特異的に宿主の免疫応答を刺激する物質を含む。多種多様のアジュバントが当分野で公知である。ウシワクチンで多用されているアジュバントの例はムラミルジペプチド、リポ多糖、数種のグルカン及びグリカン並びにＣａｒｂｏｐｏｌ（登録商標）（ホモポリマー）である。
ワクチンは更に所謂「ビークル」を加えることができる。ビークルは蛋白質が共有結合せずに接着する化合物である。このようなビークルは例えば脂質小胞、ＩＳＣＯＭ（登録商標）、デンドロマー、ニオソーム、微粒子、特にキトサン系微粒子、多糖マトリックス等、バイオマイクロカプセル、アルギン酸マイクロカプセル、リポソーム及びマクロゾルであり、いずれも当分野で公知である。ワクチンビークルとしては特に経口ワクチン接種用微粒子、より具体的にはキトサンをベースとする微粒子が非常に適切である。
抗原をビークルに部分的に埋込んだこのようなビークルの特殊形が所謂ＩＳＣＯＭ（ＥＰ １０９．９４２，ＥＰ １８０．５６４，ＥＰ ２４２．３８０）である。
更に、ワクチンは１種以上の適切な表面活性化合物又は乳化剤（例えばＳｐａｎ（登録商標）又はＴｗｅｅｎ（登録商標））を添加することができる。更に、１種以上の免疫刺激剤（例えばインターフェロン等のサイトカイン）もワクチンに添加することができる。
上記生きた弱毒組換え寄生虫をベースとするワクチンは感染中に自己増殖するので不活化寄生虫に比較して比較的少量を投与することができる。従って、非常に適切な量は寄生虫１０２〜１０７匹／用量である。１０２匹／用量未満の量ではワクチン接種した全動物に必ずしも十分なレベルの防御を保証できない。１０７〜１０８匹／用量でもよいが、経済的観点だけから考えるとあまり実用的ではない。
本発明の更に別の態様はアピコンプレックス門又はトリパノソーマ科の寄生虫に起因する感染の防除用ワクチンの製造における本発明の生きた弱毒寄生虫の使用に関する。
本発明の更に別の態様は本発明の生きた弱毒寄生虫と医薬的に許容可能なキャリヤーを混合する段階を含む本発明のワクチンの製造方法に関する。
本発明のワクチンは例えば皮内、皮下、筋肉内、腹腔内、静脈内、又は粘膜表面（例えば経口又は鼻腔内）投与することができる。
ｔｅｔリプレッサー遺伝子は原核起源の遺伝子である。従って、この遺伝子のコドン使用は本発明の生きた弱毒寄生虫等の真核生物では次善の選択である。従って、当業者は真核細胞のコドン使用に対応するようにｔｅｔリプレッサー遺伝子のコーディング配列を改変し、合成ｔｅｔリプレッサー遺伝子を得ようと考えるであろう。これはＭｅｉｓｓｎｅｒ Ｍら（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２９（２２）：Ｅ１１５（２００１））により実施されている。当然のことながら、この合成ｔｅｔリプレッサー遺伝子は既に真核細胞に完全に適応しているのでそれ以上最適化できないと予想される。更に、この「合成」ｔｅｔリプレッサー蛋白質は真核細胞で最適なリプレッサー蛋白質であると予想される。この蛋白質は原則として天然蛋白質と同一蛋白質であるので、ｔｅｔオペレーター部位との相互作用に最適であると定義されている。
しかし、天然即ち原核ｔｅｔリプレッサーのＮ末端部分に融合した異種遺伝子（の部分）を含む組換え遺伝子によりコードされる融合蛋白質が完全に真核生物に適応する「合成」ｔｅｔリプレッサー遺伝子によりコードされるｔｅｔリプレッサー蛋白質よりも著しく良好にｔｅｔオペレーターを調節できることが今回意外にも発見された。
従って、このような融合蛋白質は本発明の生きた弱毒寄生虫で使用する選択肢の一つのリプレッサー蛋白質である。ｔｅｔリプレッサー蛋白質の３Ｄ構造研究によると、Ｎ末端融合はＤＮＡ結合を妨げると予想されていたのでこれは全く予想外の発見であった。意外にも実際にはそうでなかったのである。
異種遺伝子はｔｅｔリプレッサー蛋白質以外の蛋白質をコードする任意遺伝子である。異種蛋白質はｔｅｔリプレッサー蛋白質以外の任意蛋白質である。組換え遺伝子はｔｅｔリプレッサー蛋白質のＮ末端をコードするｔｅｔリプレッサー遺伝子の側に融合した異種遺伝子（の部分）を含む任意人工遺伝子である。
融合蛋白質はｔｅｔオペレーターと相互作用するために核に到達できなければならない。従って、ｔｅｔリプレッサー融合蛋白質は多数の前提条件を満たす必要があり、モノマーｔｅｔリプレッサー融合蛋白質の最終分子量は＜６０ｋＤでなければならず、融合蛋白質の異種部分はｔｅｔリプレッサー蛋白質のＮ末端側になければならず、融合蛋白質はＧＰＩアンカー、分泌／排泄シグナル及び膜貫通領域を欠損していなければならない。原則として、これらの前提条件を満たし、（その結果として）核にターゲティングすることが可能な全蛋白質又はその部分をｔｅｔリプレッサー蛋白質とのＮ末端融合に使用することができる。
融合には全長異種蛋白質を使用する必要はない。このような異種蛋白質の一部を使用すれば十分である。一部とは異種融合蛋白質として少なくとも１０アミノ酸、好ましくは少なくとも２０アミノ酸のフラグメントとみなされる。この部分は異種蛋白質のＮ末端側に由来するものが好ましい。選択異種蛋白質は例えば緑色、赤色及び黄色蛍光蛋白質やＣＡＴ蛋白質である。
従って、本発明の別の態様はｔｅｔリプレッサー蛋白質と、ｔｅｔリプレッサー蛋白質のＮ末端側に融合した異種蛋白質又はその一部を含むことを特徴とするｔｅｔリプレッサー融合蛋白質をコードするＤＮＡフラグメントに関し、融合蛋白質のモノマー形態が＜６０ｋＤのサイズであり、融合蛋白質はＧＰＩアンカー、分泌／排泄シグナル及び膜貫通領域をもたない。
本発明の更に別の態様はｔｅｔリプレッサー蛋白質と、ｔｅｔリプレッサー蛋白質のＮ末端側に融合した異種蛋白質又はその一部を含むことを特徴とするｔｅｔリプレッサー融合蛋白質自体に関し、融合蛋白質のモノマー形態が＜６０ｋＤのサイズであり、融合蛋白質はＧＰＩアンカー、分泌／排泄シグナル及び膜貫通領域をもたない。
「膜貫通領域」なる用語における膜とは細胞の細胞質と外界の間に位置する膜である。これらの膜は特に核と細胞質の間の膜を除外する。本発明のｔｅｔリプレッサー融合蛋白質は融合蛋白質を核に特異的に誘導する所定シグナルをもつことが好ましい。これは当然のことながら、ｔｅｔリプレッサー融合蛋白質は（天然ｔｅｔリプレッサー遺伝子に要求されるように）その制御下の遺伝子の転写を制御できるようにするためには核に侵入しなければならないからである。
その汎用性により、ｔｅｔＲシステムとｔｅｔリプレッサー融合蛋白質の組み合わせは本発明の生きた弱毒寄生虫のみならず、当然のことながら他の寄生虫や、他の真核細胞及び生物でも使用することができる。この組み合わせは任意遺伝子の発現を制御するために真核細胞で広く適用可能である。
従って、本発明の生きた弱毒寄生虫はｔｅｔオペレーターと上記ｔｅｔリプレッサー融合蛋白質（をコードする遺伝情報）を併有する場合にワクチンの基盤として更に適切である。その結果、リボソーム遺伝子の転写を更に良好に阻害及び誘導することができる。
従って、より好ましい１形態では、テトラサイクリン、無水テトラサイクリン又はその誘導体により遺伝子の誘導が制御される本発明の生きた弱毒寄生虫はｔｅｔオペレーターと上記ｔｅｔリプレッサー融合蛋白質をコードする遺伝情報を含む。
下記実施例に示すように、上記のようなｔｅｔリプレッサー融合蛋白質の予想外の特徴は２個以上のｔｅｔオペレーター部位をタンデムクローニングした場合に一層顕著になる。「タンデム」なる用語はｔｅｔオペレーター部位を直接相互に隣接させてクローニングしてもよいし、２個以上のｔｅｔオペレーター部位の間にスペーサー配列を挟んでクローニングしてもよいという意味で広義に解釈すべきである。上述のように、ｔｅｔオペレーター部位はＳＴＳに対して−１００〜＋３の領域にクローニングすることが好ましい。
従って、より好ましい形態では、本発明の生きた弱毒寄生虫はｔｅｔＲシステムと上記のようなｔｅｔリプレッサー融合蛋白質に加え、１個でなく２個以上のｔｅｔオペレーター部位を含む。
実験中に使用したプライマー：
挿入した制限部位を下線で示す。
挿入した制限部位を下線で示す。
ＴｕｂＹＦＰ／ＴＲ−ｓａｇＣＡＴ（９３３２ｂｐ）の構築。
プラスミドｐｔｕｂＹＦＰ／ＴＲ−ｓａｇＣＡＴを以下のように段階的に構築した。まず、プライマーＳＡＧ３ＦＷ（＃１，配列番号５）及びＴＵＢ５ＲＶ（＃２，配列番号６）を使用してｐｔｕｂＹＦＰ／ＹＦＰ−ｓａｇＣＡＴ構築物（Ｌｌｏｐｉｓ，Ｊ．ら，ＰＮＡＳ ９７（８）：４３６３−４３６８（２０００））からＴｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉチューブリンＡ（ｔｕｂ）プロモーターを増幅することにより構築物ｐｔｕｂＣＡＴ／ＧＦＰを作製した。ＰＣＲ産物とプラスミドｐｄｈｆｒＣＡＴ／ＧＦＰ（Ｓｔｒｉｅｐｅｎ，Ｂ．ら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ ９２：３２５−３３８（１９９８））をＨｉｎｄＩＩＩとＢｇｌＩＩで消化し、相互にライゲーションした。こうしてｄｈｆｒプロモーターをｔｕｂプロモーターで置換したｐｔｕｂＣＡＴ／ＧＦＰを得た。得られたプラスミドはＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ｐＫＳ＋（登録商標）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）をベースとし、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）をコードする配列と緑色蛍光蛋白質をコードする配列の融合体からＢｇｌＩＩ部位により分離されたα−チューブリンプロモーターを含む。
ｐｔｕｂＹＦＰ／ＴＲ構築物を得るために、ＣＡＴをコードする配列を黄色蛍光蛋白質（ＹＦＰ）で置換し、ＧＦＰをコードする配列をｔｅｔリプレッサーコーディング配列（ｔｅｔＲ）で置換した。ＹＦＰ遺伝子はｐｔｕｂＹＦＰ／ＹＦＰ−ｓａｇＣＡＴ構築物からＢｇｌＩＩとＡｖｒＩＩで切り出し、ｐｔｕｂＣＡＴ／ＧＦＰ構築物のＢｇｌＩＩ−ＡｖｒＩＩ部位間にライゲーションし、ＣＡＴをコードする配列に置換した。ｔｅｔＲコーディング配列はプライマーＴＥＴＡＶＲ５−ＦＷ（＃３，配列番号７）及びＴＥＴＰＳＴ３−ＲＶ（＃４，配列番号８）を使用して大腸菌Ｔｎ１０（Ｈｉｌｌｅｎ，Ｗ．ａｎｄ Ｂｅｒｅｎｓ，Ｃ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４８：３４５−３６９（１９９４））からＰＣＲ増幅し、ＡｖｒＩＩとＰｓｔＩで消化し、ＧＦＰコーディング配列をｔｅｔＲコーディング配列で置換することにより構築物にライゲーションした。得られたプラスミドをｐｔｕｂＹＦＰ／ＴＲと命名した。
最後に、ＣＡＴ選択カセットをｔｕｂプロモーターの上流に挿入し、ｐｔｕｂＹＦＰ／ＴＲ−ｓａｇＣＡＴプラスミドを得た。これはプライマーＴ３（＃５，配列番号９）及びＳＡＧ１／１６３４ＲＶ（＃６，配列番号１０）を使用して上記ｐｔｕｂＹＦＰ／ＹＦＰ−ｓａｇＣＡＴ構築物からＣＡＴカセットを増幅することにより実施し、ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ｐｔｕｂＹＦＰ／ＴＲ構築物のユニークＨｉｎｄＩＩＩ部位にライゲーションした。
ＴｕｂＹＦＰ／ＴＲ−ｓａｇＣＡＴの構築とその完全配列を図１に示す。
Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉのリボソーム蛋白質遺伝子Ｓ１３の転写開始部位の決定
リボソーム蛋白質遺伝子Ｓ１３の転写開始部位を決定するために、ベロ細胞で増殖させたＴｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ ＲＨΔＨＸＧＰＲＴタキゾイトからＲＮＡを単離した。ＧｅｎｅＲａｃｅｒ（登録商標）キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して全ＲＮＡから遺伝子特異的全長ｃＤＮＡを得た。このキットを使用してＲＮＡオリゴを全長ｍＲＮＡの両末端にライゲーションした。オリゴｄＴによる逆転写を実施した後に、ＲＮＡオリゴと結合するＧｅｎｅＲａｃｅｒプライマーを遺伝子特異的プライマーと併用してＰＣＲ増幅し、産物を得た。その後、転写開始部位（ＳＴＳ）を決定することができた。これはプライマーＲＥＶ１３Ａ（＃７，配列番号１１）及びＲＥＶ１３Ｂ（＃８，配列番号１２）を使用してリボソーム蛋白質遺伝子Ｓ１３について実施した。プライマー＃７をＧｅｎｅＲａｃｅｒプライマーと併用して産物を得た後にプライマー＃８をネステッドＰＣＲに使用した。ＰＣＲ産物は２個の弱いバンドと１個の強いバンドの３個のバンドを示した。最高産物量を示すバンドを単離し、ＳＴＳを決定し、０位とした。図３Ａ及び３Ｂには開始コドンに対するＳＴＳの位置関係も示す。
リボソーム蛋白質遺伝子Ｓ１３の転写開始部位を決定するために、ベロ細胞で増殖させたＴｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ ＲＨΔＨＸＧＰＲＴタキゾイトからＲＮＡを単離した。ＧｅｎｅＲａｃｅｒ（登録商標）キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して全ＲＮＡから遺伝子特異的全長ｃＤＮＡを得た。このキットを使用してＲＮＡオリゴを全長ｍＲＮＡの両末端にライゲーションした。オリゴｄＴによる逆転写を実施した後に、ＲＮＡオリゴと結合するＧｅｎｅＲａｃｅｒプライマーを遺伝子特異的プライマーと併用してＰＣＲ増幅し、産物を得た。その後、転写開始部位（ＳＴＳ）を決定することができた。これはプライマーＲＥＶ１３Ａ（＃７，配列番号１１）及びＲＥＶ１３Ｂ（＃８，配列番号１２）を使用してリボソーム蛋白質遺伝子Ｓ１３について実施した。プライマー＃７をＧｅｎｅＲａｃｅｒプライマーと併用して産物を得た後にプライマー＃８をネステッドＰＣＲに使用した。ＰＣＲ産物は２個の弱いバンドと１個の強いバンドの３個のバンドを示した。最高産物量を示すバンドを単離し、ＳＴＳを決定し、０位とした。図３Ａ及び３Ｂには開始コドンに対するＳＴＳの位置関係も示す。
Ｓ１３／ＬＺ構築物
ｔｅｔリプレッサーによる誘導発現を試験するために、単一ｔｅｔＯ部位の存在下又は不在下でＳ１３プロモーターの制御下にｌａｃＺ遺伝子から数種のレポーター構築物を作製した。まず、プラスミドＳ１３／ｌａｃＺ（最終構築物の構成と配列については図２参照）を作製した後、このプラスミドを使用して以下のようにｔｅｔＯ部位の配列を挿入又は置換した。
ｔｅｔリプレッサーによる誘導発現を試験するために、単一ｔｅｔＯ部位の存在下又は不在下でＳ１３プロモーターの制御下にｌａｃＺ遺伝子から数種のレポーター構築物を作製した。まず、プラスミドＳ１３／ｌａｃＺ（最終構築物の構成と配列については図２参照）を作製した後、このプラスミドを使用して以下のようにｔｅｔＯ部位の配列を挿入又は置換した。
プライマーＳ１３ＰＲＯＭＦＵＳ ＦＷ（＃９，配列番号１３）及びＳ１３ＰＲＯＭＦＵＳ ＲＶ（＃１０，配列番号１４）を使用してＴｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ ＲＨ／ΔＨＸＧＰＲＴ株のゲノムＤＮＡからＳ１３のプロモーター領域をＰＣＲ増幅した。プライマーＬＡＣＺ−ＡＶＲＩＩ ＦＷ（＃１１，配列番号１５）及びＬＡＣＺ−ＰＳＴＩ ＲＶ（＃１２，配列番号１６）を使用してＢＬ２１細菌のゲノムＤＮＡからｌａｃＺコーディング配列をＰＣＲ増幅した。次に、Ｓ１３ ＰＣＲ産物をＨｉｎｄＩＩＩとＸｂａＩで消化し、ｌａｃＺ ＰＣＲ産物をＡｖｒＩＩとＰｓｔＩで消化した。プラスミドｐｔｕｂＹＦＰ／ＹＦＰ−ｓａｇＣＡＴを使用してｐｔｕｂＹＦＰ部分とＣＡＴ選択カセットをＳ１３プロモーター部分で置換した。残りのＹＦＰ遺伝子をｌａｃＺ遺伝子で置換し、Ｓ１３／ｌａｃＺプラスミドを得た。Ｓ１３／ｌａｃＺプラスミドを使用して部位特異的突然変異誘発により単一ｔｅｔオペレーター（ｔｅｔＯ）部位の配列（５’−ＴＣＣＣＴＡＴＣＡＧＴＧＡＴＡＧＡＧＡＴＣ−３’）を挿入又は置換した。これはＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）部位特異的突然変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用して実施した。ｔｅｔＯは決定したＳＴＳの近傍に挿入又は置換した。プライマーＳ１３ＩＮＳＴＥＴＯ＋３ ＦＷ（＃１３，配列番号１７）及びＳ１３ＩＮＳＴＥＴＯ＋３ ＲＶ（＃１４，配列番号１８）を使用し、ＳＴＳを０として＋３位にｔｅｔＯ部位を挿入した。プライマーＳ１３ＳＵＢＴＥＴＯ−２３ ＦＷ（＃１５，配列番号１９）及びＳ１３ＳＵＢＴＥＴＯ−２３ ＲＶ（＃１６，配列番号２０）を使用し、ＳＴＳに対して−４３位と−２３位の間にｔｅｔＯ部位を挿入した。これらの２種の構築物Ｓ１３ｉｎｓｔｅｔＯ＋３／ｌａｃＺ及びＳ１３ｓｕｂｔｅｔＯ−２３／ｌａｃＺとＳ１３／ｌａｃＺ構築物をＴｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ株ＲＨΔＨＸＧＰＲＴ、ＲＥＰ１／２（Ｍｅｉｓｓｎｅｒ，Ｍ．ら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２９（２２），Ｅ１１５（２００１））及びｔｕｂＹＦＰ／ＴＲでｔｅｔＲ及び（無水）テトラサイクリンの不在下又は存在下にＣＰＲＧアッセイ（Ｓｅｅｂｅｒ，Ｆ．ら，Ｇｅｎｅ １６９：３９−４５（１９９６））により試験した。
Ｓ１３／ｌａｃＺ構築物を図２に示し、Ｓ１３／ｌａｃＺ構築物におけるｔｅｔオペレーターの置換又は挿入部位を図３Ａに示す。
Ｌ９／ＬＺ構築物
ｒｐ−Ｌ９プロモーターへのｔｅｔＯ挿入／置換を図３Ｂに示す。
ｒｐ−Ｌ９プロモーターへのｔｅｔＯ挿入／置換を図３Ｂに示す。
ｐＴｕｂ−ＹＦＰ−ＴＲ−ｓａｇＣＡＴを導入した安定なトランスフェクタントトキソプラズマ寄生虫の選択。
Ｒｏｏｓ，Ｄ．Ｓ．ら（“Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ”Ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９４），Ｄ．Ｇ．Ｒｕｓｓｅｌｌ，ｅｄｉｔｏｒ）により記載されているようにトキソプラズマ寄生虫のエレクトロポレーションを実施した。
Ｋｉｍ，Ｋ．ら（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６２（５１３５）：９１１−４（１９９３））に従って安定なトランスフェクタントの選択を実施した。
再びＲｏｏｓ，Ｄ．Ｓ．ら（１９９４，前出）に従ってＳ１３／ＬＺ、Ｓ１３ｉ＋３／ｌａｃＺ及びＳ１３ｓ−２３／ｌａｃＺ構築物のエレクトロポレーションを実施した。
実施例４の結果
ｔｕｂ−ＹＦＰ−ＴＲ株にエレクトロポレーションした場合に単一ｔｅｔオペレーターを含むＳ１３プロモーターにより誘導されるＬａｃＺ発現の測定。
ｔｕｂ−ＹＦＰ−ＴＲ株にエレクトロポレーションした場合に単一ｔｅｔオペレーターを含むＳ１３プロモーターにより誘導されるＬａｃＺ発現の測定。
以下の構築物を試験した：
ａ）Ｓ１３／ＬＺ：これはＳ１３リボソーム蛋白質遺伝子プロモーターの制御下にＬａｃＺ遺伝子を一過的にトランスフェクトしたｔｕｂ−ＹＦＰ−ＴＲトランスフェクタントトキソプラズマ株である。この構築物にはｔｅｔオペレーター部位が存在しない。
ａ）Ｓ１３／ＬＺ：これはＳ１３リボソーム蛋白質遺伝子プロモーターの制御下にＬａｃＺ遺伝子を一過的にトランスフェクトしたｔｕｂ−ＹＦＰ−ＴＲトランスフェクタントトキソプラズマ株である。この構築物にはｔｅｔオペレーター部位が存在しない。
ｂ）Ｓ１３ｉ＋３／ｌａｃＺ：これはＳ１３リボソーム蛋白質遺伝子プロモーターの制御下にＬａｃＺ遺伝子を一過的にトランスフェクトしたｔｕｂ−ＹＦＰ−ＴＲトランスフェクタントトキソプラズマ株であり、ＳＴＳに対して＋３位にｔｅｔオペレーター部位を挿入した（図３Ａ参照）。
ｃ）Ｓ１３ｓ−２３／ｌａｃＺ：これはＳ１３リボソーム蛋白質遺伝子プロモーターの制御下にＬａｃＺ遺伝子を一過的にトランスフェクトしたｔｕｂ−ＹＦＰ−ＴＲトランスフェクタントトキソプラズマ株であり、ＳＴＳに対して−２３位にｔｅｔオペレーター部位を挿入した（図３Ａ参照）。
ｒｐ−Ｌ９プロモーターにｔｅｔＯを挿入／置換した同様の構築物を図３Ｂに示す。
図４から明らかなように、ｔｕｂ−ＹＦＰ−ＴＲは予想通り、無水テトラサイクリンとテトラサイクリンの存在下及び不在下のいずれでも同一レベルのＬａｃＺを産生する。
構築物Ｓ１３ｉ＋３／ｌａｃＺのトランスフェクションの結果、無水テトラサイクリンとテトラサイクリンの不在下のＬａｃＺ産生量は無水テトラサイクリンとテトラサイクリンの存在下のＬａｃＺ産生量の２分の１になる。これはこの株におけるＬａｃＺ転写の誘導性を明白に示すものである。
構築物Ｓ１３ｓ−２３／ｌａｃＺのトランスフェクションの結果、無水テトラサイクリンとテトラサイクリンの不在下のＬａｃＺ産生量は無水テトラサイクリンとテトラサイクリンの存在下のＬａｃＺ産生量の約１／３になる。これもこの株におけるＬａｃＺ転写の誘導性を明白に示すものである。
これらの結果は更にＳＴＳに対してｔｅｔオペレーター部位を配置する部位がさほど重要ではないことを立証している。更に、挿入と置換のどちらでもｔｅｔオペレーター部位を導入できることも立証している。
単一ｔｅｔオペレーター又は二重ｔｅｔオペレーターを含むＳ１３プロモーターにより誘導されるＬａｃＺ遺伝子を含む構築物をエレクトロポレーションした一過的トランスフェクタントのＣＰＲＧアッセイ。
本アッセイでは以下の構築物を比較した：
ａ）上記Ｓ１３／ＬＺ
ｂ）上記Ｓ１３ｓ−２３／ｌａｃＺ（Ｉ）（＝Ｓ１３ｓ−２３／ｌａｃＺ）
ｃ）Ｓ１３ｓ−２３／ｌａｃＺ（ＩＩ）：これは第１のｔｅｔオペレーターのすぐ下流に付加ｔｅｔオペレーター部位をクローニングした以外はＳ１３ｓ−２３／ｌａｃＺと同一である。この構築物はＳ１３ｓ−２３／ｌａｃＺ（Ｉ）と同様の方法を使用して構築した。
ａ）上記Ｓ１３／ＬＺ
ｂ）上記Ｓ１３ｓ−２３／ｌａｃＺ（Ｉ）（＝Ｓ１３ｓ−２３／ｌａｃＺ）
ｃ）Ｓ１３ｓ−２３／ｌａｃＺ（ＩＩ）：これは第１のｔｅｔオペレーターのすぐ下流に付加ｔｅｔオペレーター部位をクローニングした以外はＳ１３ｓ−２３／ｌａｃＺと同一である。この構築物はＳ１３ｓ−２３／ｌａｃＺ（Ｉ）と同様の方法を使用して構築した。
図５から明らかなように、上記合成ｔｅｔリプレッサー遺伝子（Ｍｅｉｓｓｎｅｒ）と本発明の融合ｔｅｔリプレッサー遺伝子（ｔｕｂ−ＹＦＰ−ＴＲ）はテトラサイクリンの不在下でＬａｃＺの転写を阻害することが可能である。更に注目すべき点として、隣接する２個のｔｅｔオペレーター部位を使用すると、単一ｔｅｔオペレーターを使用した場合に比較して発現阻害は３〜４倍良好になることも明らかである。
上記合成ｔｅｔリプレッサー遺伝子（Ｍｅｉｓｓｎｅｒ）を含む株と、本発明の融合ｔｅｔリプレッサー遺伝子を含む株におけるＬａｃＺ発現を比較する一過的トランスフェクタントのＣＰＲＧアッセイ。
驚くべきことに図５から明らかなように、本発明の融合ｔｅｔリプレッサー蛋白質は上記のような合成ｔｅｔリプレッサー蛋白質（Ｍｅｉｓｓｎｅｒ）で観察される阻害に比較してＬａｃＺの転写を著しく良好に阻害する。また、驚くべきことに、本発明の融合ｔｅｔリプレッサー遺伝子では上記合成ｔｅｔリプレッサー遺伝子（Ｍｅｉｓｓｎｅｒ）で観察される誘導に比較して著しく良好なＬａｃＺ転写の誘導が観察される。
相同組換えとヒットエンドラン突然変異誘発法を使用したリボソーム蛋白質Ｓ１３遺伝子座へのｔｅｔオペレーターエレメントの挿入。
特定遺伝子座、この場合にはリボソーム蛋白質Ｓ１３遺伝子座（Ｓ１３）のゲノムにｔｅｔオペレーター部位を組込むためには相同組換えが必要である。相同組換えには、非相同組換えではなく相同組換えを得るために組込み部位の上流と下流に大きい配列部分（この場合には〜１２００ｂｐ）が必要である。Ｄｏｎａｌｄら（Ｍｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐａｒａｓ．９１：２９５−３０５（１９９８））により記載されているように、ヒポキサンチン−キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＸＧＰＲＴ）遺伝子を選択マーカーとして使用して２段階で配列エレメントを特定遺伝子座に組込むことが可能である。
詳細に説明すると、ＨＸＧＰＲＴカセットに続く組込み部位の近傍にＳ１３遺伝子座の部分を含むトランスフェクトプラスミドは相同ゲノムＤＮＡ Ｓ１３遺伝子座と１回相同組換えし、Ｉ又は１１型偽二倍体を形成する（図６）。これは文献（Ｄｏｎａｌｄら，１９９８，前出）に記載されているようにミコフェノール酸とキサンチンによるＨＸＧＰＲＴの正の選択下に実施される。次に、６−チオキサンチンでＨＸＧＰＲＴに対して２回目の相同組換えを選択し、その結果、偽二倍体が減少し、Ｓ１３遺伝子座に組込まれたｔｅｔオペレーター部位の存在下又は不在下でタキゾイトが形成される（〜１：１比）。この方法をヒットエンドラン突然変異誘発と言う。
この方法を実施するために、まずＤＨＦＲプロモーターの制御下にＨＸＧＰＲＴ選択カセットを含むプラスミドを作製した。Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ ＲＨタキゾイトからＲＮＡを単離した。このＲＮＡを使用し、ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ（登録商標）ＩＩ ＲｎａｓｅＨ−Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）と標準分子生物学手順（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ＆ Ｒｕｓｓｅｌｌ：“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ”（２００１），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ；ＩＳＢＮ：０８７９６９５７７３）を使用してｃＤＮＡを作製した。ＨＸＧＰＲＴコーディング配列はプライマーＨＸＧＰＲＴ／ＢＧＬＩＩ−ＦＷ（配列番号２８）及びＨＸＧＰＲＴ／ＰＳＴＩ−ＲＶ（配列番号２９）を使用してＴ．ｇｏｎｄｉｉ ＲＨタキゾイトのｃＤＮＡから増幅し、スプライス変異体−Ｉをその後の使用に選択した（Ｄｏｎａｌｄら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：１４０１０−１４０１９（１９９６））。ＰＣＲ産物とプラスミドｐｄｈｆｒＣＡＴ／ＧＦＰ（Ｓｔｒｉｅｐｅｎ，Ｂ．ら，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐａｒａｓ．９２：３２５−３３８（１９９８））の両者をＢｇｌＩＩとＰｓｔＩで消化した後に、ＣＡＴ／ＧＦＰコーディング配列をＨＸＧＰＲＴコーディング配列で置換し、ｐｍｉｎｉＨＸＧＰＲＴと呼ぶｄｈｆｒＨＸＧＰＲＴ構築物を得た。
次に、プライマーＳ１３ＮＯＴＩ−ＦＷ（配列番号２１）及びＳ１３ＳＡＣＩ−ＲＶ（配列番号２２）を使用してｔｅｔオペレーター組込み部位（ＳＴＳに対して−４３／−２３）の上流（〜１２００ｂｐ）と下流（〜１２００ｂｐ）の両者の領域を含むＤＮＡ部分をＴ．ｇｏｎｄｉｉ ＲＨタキゾイトのゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅した。このＰＣＲ産物とｐｍｉｎｉＨＸＧＰＲＴの両者をＮｏｔＩとＳａｃＩで消化した後にＰＣＲ産物をＨＸＧＰＲＴカセットの下流にライゲーションした。最後に、実施例３に記載したような部位特異的突然変異誘発を使用してプライマーＳ１３ＳＵＢＴＥＴＯ−２３ＦＷ（配列番号１９）及びプライマーＳ１３ＳＵＢＴＥＴＯ−２３ＲＶ（配列番号２０）を使用して置換によりｔｅｔオペレーターを挿入し、ｐＳ１３ｓ−２３／ｐｍｉｎｉＨＸＧＰＲＴを形成した。
環状ｐＳ１３ｓ−２３／ｐｍｉｎｉＨＸＧＰＲＴプラスミドを従来記載されているように（実施例４）ＲＨΔＨＸＧＰＲＴタキゾイトにエレクトロポレーションした。ベロ細胞単層に感染後に、Ｄｏｎａｌｄら（１９９８，前出）により記載されているようにミコフェノール酸／キサンチン選択を開始した。
Ｋｉｍ，Ｋ．ら（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６２（５１３５）：９１１−４（１９９３））に従って安定なトランスフェクタントを作製した後に、数個のクローン寄生虫株を採取した。これらのクローンの各々からゲノムＤＮＡを単離した。プライマーＭ１３−ＲＥＶ（配列番号２３）、Ｓ１３ＣＬ ＦＷ３（配列番号２４）、ＨＲＣＨＥＣＫＩＩ ５ Ｓ１３−ＦＷ（配列番号２５）、ＨＲＣＨＥＣＫＩＩ Ｓ１３−ＲＶ（配列番号２６）、及びＴ７（配列番号２７）を使用してこれらのゲノムＤＮＡサンプルでＰＣＲ分析を実施し、これらのトランスフェクタントに偽二倍体形態が存在するか否かを確認した。４個のクローン（ｃ４，ｃ５，ｃ６及びｃ９）を詳細に分析し、ＲＨΔＨＸＧＰＲＴ株とベロ細胞のゲノムＤＮＡを陰性対照として使用した。各種プライマー組み合わせ（図６）を使用してこれらのサンプルのゲノムＤＮＡをＰＣＲ増幅し、これらを配列番号２３及び２４のプライマーの組み合わせ等の意味で２３／２４、２５／２６、２３／２６、及び２５／２７と記載する。結果を図７に示す。
プライマー組み合わせ２３／２４は各種クローンにおけるプラスミドの有無を示す。プライマーＭ１３−ＲＥＶ（配列番号２３）はトランスフェクトしなかった寄生虫（ＲＨΔＨＸＧＰＲＴ）には不在のベクター部分とアニールする。トランスフェクトした全クローンは正しいサイズ（２．８ｋｂ）のバンドを示し、安定な全トランスフェクタントがエレクトロポレーション後にプラスミドを取込んでおり、選択中に維持していることが分かった。次に、プライマー組み合わせ２５／２６はクローンにおける偽二倍体形態の有無を示す。ゲノムではどちらのプライマーもベクターに存在するＳ１３部分の上流（プライマーＨＲＣＨＥＣＫ ＩＩ ５ Ｓ１３−ＦＷ（配列番号２５））又は下流（プライマーＨＲＣＨＥＣＫ ＩＩ Ｓ１３−ＲＶ（配列番号２６））に位置する。偽二倍体が存在しないならば、「野生型」Ｓ１３状態はＰＣＲ増幅され、その結果、クローンｃ４と野生型寄生虫ＲＨΔＨＸＧＰＲＴで観察できるような〜２．６ｋｂの産物が得られる。これはクローンｃ４が偽二倍体を含まない安定なトランスフェクタントであることを示し、非相同組換えが生じなかったことを示唆している。クローンｃ５、ｃ６及びｃ９には２．６ｋｂ ＰＣＲ産物が存在しないのでこれらのクローンは偽二倍体形態を含むと思われる。更に、クローンｃ５及びｃ９には偽二倍体が存在する場合に予想されるような約１０ｋｂの産物を観察することができる。クローンｃ６には１０ｋｂ産物を検出できなかった。プライマー組み合わせ２３／２６とプライマー組み合わせ２５／２７を使用してＰＣＲを実施した処、ｐ１３ｓ−２３／ｐｍｉｎｉＨＸＧＰＲＴベクターの両側にＳ１３遺伝子座が存在することが判明した。プライマーＭ１３−ＲＥＶ（配列番号２３）はベクター配列内に位置し、プライマーＨＲＣＨＥＣＫ ＩＩ Ｓ１３−ＲＶ（配列番号２６）はベクターの相同Ｓ１３部分の下流のゲノムに位置する。プライマーＴ７（配列番号２７））はベクター配列内に位置し、プライマーＨＲＣＨＥＣＫ ＩＩ ５ Ｓ１３−ＦＷ（配列番号２５）はベクターの相同Ｓ１３部分の上流のゲノムに位置する。野生型状態では、プライマー組み合わせ２３／２７はＤＮＡとアニールしないので、ＰＣＲ産物を増幅することができない。偽二倍体の場合には、プライマー組み合わせ２３／２６により４．６ｋｂの産物が得られ、組み合わせ２５／２７により２．６ｋｂのＰＣＲ産物が得られる。図７に示すデータから明らかなように、実際に陽性クローンはどちらの組み合わせでも正しいバンドを示すが、陰性サンプルでは産物は観察されなかった。
従って、このＰＣＲ分析はヒットエンドラン突然変異誘発法により例えばＳ１３遺伝子座への相同組換えに成功したかどうかを確認するために使用される。
【配列表】
Claims (20)
- 誘導性プロモーターの制御下にリボソーム蛋白質遺伝子を含むことを特徴とするアピコンプレックス（Ａｐｉｃｏｍｐｌｅｘａ）門又はトリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａｔｉｄａｅ）科の生きた弱毒寄生虫。
- 前記寄生虫がコクシジウム（Ｃｏｃｃｉｄｉａ）、ピロプラズマ（Ｐｉｒｏｐｌａｓｍｉｄａ）又は住血胞子虫（Ｈａｅｍｏｓｐｏｒｉｄａ）に属することを特徴とする請求項１に記載の生きた弱毒寄生虫。
- 前記寄生虫がアイメリア（Ｅｉｍｅｒｉｄｉｉｄａｅ）科、クリプトスポリジウム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｉｄａｅ）科又はサルコシスティス（Ｓａｒｃｏｃｙｓｔｉｄａｅ）科に属することを特徴とする請求項２に記載の生きた弱毒寄生虫。
- 前記寄生虫がアイメリア（Ｅｉｍｅｒｉａ）属、クリプトスポリジウム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）属、トキソプラズマ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ）属、サルコシスティス（Ｓａｒｃｏｃｙｓｔｉｓ）属又はネオスポラ（Ｎｅｏｓｐｏｒａ）属に属することを特徴とする請求項３に記載の生きた弱毒寄生虫。
- 前記寄生虫がバベシア（Ｂａｂｅｓｉｉｄａｅ）科又はタイレリア（Ｔｈｅｉｌｅｒｉｉｄａｅ）科に属することを特徴とする請求項２に記載の生きた弱毒寄生虫。
- 前記寄生虫がバベシア（Ｂａｂｅｓｉａ）属又はタイレリア（Ｔｈｅｉｌｅｒｉａ）属に属することを特徴とする請求項５に記載の生きた弱毒寄生虫。
- 前記寄生虫がプラスモジウム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）属に属することを特徴とする請求項２に記載の生きた弱毒寄生虫。
- 前記寄生虫がトリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ）属又はリーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）属に属することを特徴とする請求項１に記載の生きた弱毒寄生虫。
- 前記誘導性プロモーターがオペレーター部位と前記オペレーター部位と可逆的に結合することが可能なリプレッサー蛋白質をベースとすることを特徴とする請求項１から８のいずれか一項に記載の生きた弱毒寄生虫。
- 前記誘導性プロモーターが抗生物質により誘導可能であることを特徴とする請求項１から９のいずれか一項に記載の生きた弱毒寄生虫。
- 前記誘導性プロモーターがテトラサイクリン又は無水テトラサイクリン又はその誘導体により誘導可能であることを特徴とする請求項１０に記載の生きた弱毒寄生虫。
- ｔｅｔＲシステムを誘導性プロモーターとして使用することを特徴とする請求項１１に記載の生きた弱毒寄生虫。
- 前記リボソーム蛋白質遺伝子がＬ９、Ｓ３、プラスチド−Ｓ９又はＳ１３、好ましくはトキソプラズマ・ゴンジイ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ）のＬ９、Ｓ３、プラスチド−Ｓ９又はＳ１３をコードする遺伝子であることを特徴とする請求項１から１２のいずれか一項に記載の生きた弱毒寄生虫。
- ワクチンで使用するための請求項１から１３のいずれか一項に記載の生きた弱毒寄生虫。
- 請求項１から１３のいずれか一項に記載の生きた弱毒寄生虫と医薬的に許容可能なキャリヤーを含有することを特徴とする寄生虫感染防除用ワクチン。
- アピコンプレックス門又はトリパノソーマ科の寄生虫に起因する感染の防除用ワクチンの製造における請求項１から１３のいずれか一項に記載の生きた弱毒寄生虫の使用。
- 請求項１から１３のいずれか一項に記載の生きた弱毒寄生虫と医薬的に許容可能なキャリヤーを混合する段階を含む請求項１５に記載のワクチンの製造方法。
- ｔｅｔリプレッサー蛋白質と異種蛋白質又はその一部を含むｔｅｔリプレッサー融合蛋白質をコードするＤＮＡフラグメントであって、前記異種蛋白質又はその一部がｔｅｔリプレッサー蛋白質のＮ末端側に融合しており、前記融合蛋白質のモノマー形態が分子量６０ｋＤ未満であり且つＧＰＩアンカー、分泌／排泄シグナル及び膜貫通領域をもたない前記ＤＮＡフラグメント。
- 前記寄生虫がｔｅｔオペレーター部位と請求項１８に記載のｔｅｔリプレッサー融合蛋白質をコードするＤＮＡフラグメントを含むことを特徴とする請求項１から１３のいずれか一項に記載の生きた弱毒寄生虫。
- 前記寄生虫が２個以上のｔｅｔオペレーター部位を含むことを特徴とする請求項１９に記載の生きた弱毒寄生虫。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP02078953 | 2002-09-20 | ||
| PCT/EP2003/010696 WO2004026903A2 (en) | 2002-09-20 | 2003-09-19 | Live antenuated parasite vaccine |
Publications (2)
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