ES2326770B1 - Uso de un nuevo aislado de neospora caninum para el desarrollo de pruebas de diagnostico y para la fabricacion de productos para el tratamiento y prevencion de la infenccion causada por neospora. - Google Patents
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Abstract
Uso de un nuevo aislado de Neospora
caninum para el desarrollo de pruebas de diagnóstico y para la
fabricación de productos para el tratamiento y prevención de la
infección causada por Neospora.
El uso de un nuevo aislado de Neospora
caninum (depositado en la Culture Collection of Algae and
Protozoa, con número de acceso CCAP 2051/1), y de los extractos
obtenidos a partir del mismo, en la elaboración de pruebas de
diagnóstico y en la fabricación de productos para el tratamiento y
la prevención de la infección causada por Neospora se basa
en la facilidad con que el nuevo aislado se transforma del estadio
de taquizoíto al de bradizoíto en condiciones
in-vitro. Así mismo y con las mismas
aplicaciones, se emplean los polipéptidos y polinucleótidos
obtenidos a partir del: nuevo aislado y los anticuerpos
inmunoreactivos desarrollados frente a antígenos del mismo.
Description
Uso de un nuevo aislado de Neospora
caninum para el desarrollo de pruebas de diagnóstico y para la
fabricación de productos para el tratamiento y prevención de la
infección causada por Neospora.
La presente invención se encuadra en el campo de
la sanidad animal y se refiere, según se expresa en el enunciado de
esta memoria descriptiva, al desarrollo de pruebas de diagnóstico
para la detección de Neospora caninum en animales y a la
fabricación de composiciones farmacéuticas para la prevención y el
tratamiento de la neosporosis en los mismos.
De forma más concreta, la invención se refiere
al uso del aislado Nc-Spain 7 de N. caninum
que presenta como característica relevante la facilidad de
conversión entre los estadios de taquizoíto y bradizoíto en
condiciones in vitro, y por ello es un candidato apropiado
para la fabricación de nuevos productos vacunales y terapéuticos
frente a la neosporosis, y para el desarrollo de nuevos métodos de
diagnóstico para detectar la infección causada por el parásito
Neospora caninum en animales a partir de muestras
biológicas.
Neospora caninum es un parásito
perteneciente al phylum Apicomplexa dentro del cual se agrupan los
géneros Plasmodium, Babesia, Cryptosporidium, Eimeria y
Toxoplasma, que incluyen algunos de los organismos causantes
de enfermedad más importantes conocidos por el hombre. N.
caninum fue descrito por primera vez en 1984 como un protozoo
capaz de producir encefalitis y miositis en perros y, poco después,
fue reconocido como un agente productor de aborto y mortalidad
neonatal en el ganado bovino. Durante los últimos años, también se
han descrito infecciones producidas por el parásito en otros
hospedadores que incluyen varios ungulados y cánidos, sin embargo
destaca la importancia de la neosporosis en el ganado bovino y en
el perro, que actúa como hospedador definitivo en el ciclo
biológico, (Dubey et al., 2006, J. Comp. Path. 134:
267-289).
Hasta la fecha se han descrito tres estadios en
el ciclo biológico de N. caninum. Los esporozoítos, que se
desarrollan en los ooquistes eliminados en las heces del hospedador
definitivo y son capaces de infectar al hospedador intermediario.
Los taquizoítos, la forma de multiplicación rápida, responsables de
la fase aguda de la infección y su propagación a otros tejidos. Y
los bradizoítos, el estadio de multiplicación lenta del parásito
dando lugar a quistes tisulares donde el parásito permanece
acantonado durante la fase crónica de la infección hasta su
reactivación.
La neosporosis bovina está considerada como una
enfermedad parasitaria de distribución cosmopolita y una de las
causas más frecuentes de fallo reproductivo en el ganado bovino en
los diversos países productores donde se ha estudiado, incluida
España (Pereira-Bueno et al., 2003, Vet
Parasitol 111: 143-152). La manifestación clínica
más importante de la infección es el aborto que tiene lugar
generalmente entre el quinto y séptimo mes de gestación. Además,
pueden nacer terneros infectados vivos que pueden presentar
problemas neuro-musculares hasta los dos meses
postparto. Sin embargo, lo más frecuente es el nacimiento de
terneros clínicamente sanos, pero crónicamente infectados. En
relación con la transmisión de la enfermedad, la vía fundamental es
la infección transplacentaria endógena, aunque se ha demostrado la
implicación de la transmisión horizontal (Trees & Willians,
2005, Trends Parasitol. 21(12): 558-561,
Dubey et al., 2006, J. Comp. Path. 134:
267-289).
Los métodos de diagnóstico utilizados para
detectar la infección por N. caninum, generalmente en
bovinos adultos, están constituidos principalmente por técnicas
basadas en la detección de anticuerpos séricos específicos frente
al parásito. Para ello, se han diseñado diferentes inmunoensayos que
engloban la inmunofluorescencia indirecta (IFI), varios ensayos
inmunoenzimáticos (ELISA) e inmunoblot (IB)
(Ortega-Mora et al., 2006, Acta
Parasitologica 51: 1-14). Los antígenos utilizados
en estas pruebas serológicas proceden de taquizoítos obtenidos en
cultivos celulares de aislados bovinos y caninos de N.
caninum. Taquizoítos enteros, extractos celulares obtenidos a
partir de los mismos, proteínas antigénicas purificadas por
afinidad a partir de estos extractos celulares o proteínas
recombinantes, como se describe en la solicitud de patente
WO97/39009, han sido utilizados como antígenos en el desarrollo de
estas técnicas. Sin embargo, debemos puntualizar que, aunque un
resultado serológico positivo ayuda a identificar un animal adulto
infectado, un resultado negativo no descarta definitivamente la
infección. Diferentes estudios han demostrado que los anticuerpos
séricos frente a N. caninum pueden fluctuar en función de la
edad y el estado de gestación, y seroconvertir a títulos que
normalmente son considerados negativos
(Pereira-Bueno et al., 2000, in: Hemphill A
& Gottstein B (Eds), Int J Parasitol 30:
906-909; Quintanilla-Gozalo et
al., 2000, in: Hemphill A, Gottstein B (Eds), Int J Parasitol
30: 900-906; Maley et al., 2001, Vet
Parasitol. 5; 96 (1): 1-9). Los niveles bajos de
anticuerpos frente a N. caninum se han asociado
principalmente a infecciones crónicas, donde existe un predominio
del estadio de bradizoíto. Así, se ha sugerido que una prueba
serológica utilizando antígenos derivados de bradizoítos podría ser
más adecuada para la identificación de animales persistentemente
infectados (Maley et al., 2001, Vet Parasitol. 5;
96(1):1-9).
96(1):1-9).
Por otra parte, los estudios llevados a cabo
para el desarrollo de vacunas para la protección frente a la
neosporosis han incluido la evaluación de vacunas inactivadas,
vacunas atenuadas, vacunas desarrolladas a partir de proteínas
antigénicas recombinantes y vacunas de ADN con resultados
variables. Uno de los pocos estudios realizados con bovinos demostró
que la vacuna desarrollada a partir de taquizoítos muertos
emulsionados con el adyuvante POLYGEN^{TM}, descrita en la
solicitud de patente WO99/20303, era capaz de originar una ligera
respuesta inmune celular (Andrianarivo et al., 1999, Int. J.
Parasitol. 29, 1613-1625), aunque en reproductoras
gestantes fue incapaz de proteger frente a la infección fetal
(Andrianarivo et al., 2000, Int J Parasitol. 30(9):
985-90). Actualmente, es la única vacuna frente a
N. caninum comercializada y registrada en los Estados Unidos
denominada NeoGuard^{TM} cuya eficacia ha sido recientemente
evaluada en el campo (Romero et al., 2004, Vet Parasitol.
123(3-4): 149-59).
Debemos destacar que todas las vacunas vivas
atenuadas, como se describe en las patentes EP0841392 y
WO2004/
026903, e inactivadas, como las descritas en las patentes EP0898969 y WO99/20303, han sido elaboradas a partir de taquizoítos mantenidos en cultivo celular o a partir de proteínas antigénicas recombinantes que son expresadas en este estadio del ciclo biológico, como se recoge en la solicitud de patente EP0953641, y no a partir del estadio de bradizoíto, predominante en las infecciones crónicas.
026903, e inactivadas, como las descritas en las patentes EP0898969 y WO99/20303, han sido elaboradas a partir de taquizoítos mantenidos en cultivo celular o a partir de proteínas antigénicas recombinantes que son expresadas en este estadio del ciclo biológico, como se recoge en la solicitud de patente EP0953641, y no a partir del estadio de bradizoíto, predominante en las infecciones crónicas.
Actualmente, en N. caninum no se conocen
en detalle los procesos implicados en la conversión
taquizoíto-bradizoíto. Durante los últimos años, en
un único estudio se ha procedido a su obtención a partir de quistes
tisulares purificados de animales infectados experimentalmente
(McGuire et al., 1997, J. Parasitol. 83:
647-651), aunque el elevado número de bradizoítos
necesarios para los diferentes estudios ha planteado el desarrollo
de nuevos métodos para su obtención in vitro. Estos métodos
se han basado principalmente en la utilización de compuestos
químicos como el nitroprusiato sódico como agente inductor de la
transformación en diferentes líneas celulares (Vonlaufen et
al., 2002, Int. J. Parasitol. 32: 1253-1265;
Risco-Castillo et al., 2004, J. Parasitol.
90(3): 466-70). Y cabe resaltar que en los
estudios realizados con diferentes aislados
(Nc-Liverpool, Nc-1,
Nc-2 y Nc-SweB1) también se
observaron diferencias significativas en el porcentaje de
transformación entre ambos estadios en función del aislado utilizado
(Weiss et al., 1999, Int. J. Parasitol. 29:
1713-1723; Vonlaufen, 2002, Int. J. Parasitol. 32:
1253-1265). Estas diferencias podrían ser
atribuibles a la diversidad biológica que existe entre diferentes
aislados de N. caninum.
Los estudios comparativos de las propiedades
biológicas de distintos aislados de N. caninum han
demostrado la existencia de variabilidad biológica, que incluye
diferencias tanto en su patogenicidad como en sus perfiles genéticos
(Atkinson et al., 1999, Parasitology 118 (Pt 4):
363-370; Schock et al., 2001, Parasitology
123(Pt 1): 13-23,
Regidor-Cerrillo et al., 2006, J. Parasitol,
92(3): 517-524). De hecho, en la solicitud
de patente WO02/103430 se describen vacunas vivas obtenidas a
partir de un aislado que presenta baja patogenicidad de forma
natural en un modelo murino experimental.
Los inventores han obtenido y caracterizado un
nuevo aislado de Neospora caninum con una alta capacidad de
transformación in vitro entre los estadios de taquizoíto y
bradizoíto de su ciclo biológico y con aplicabilidad en el
desarrollo de pruebas de diagnóstico y productos para el tratamiento
y prevención de la infección causada por este parásito.
El nuevo aislado se ha denominado
Nc-Spain 7 cumpliendo la normativa internacional de
nomenclatura de microorganismos, y se ha identificado y
caracterizado mediante diferentes estudios in vitro e
infecciones experimentales in vivo como un nuevo aislado de
la especie Neospora caninum. Una muestra del cultivo de
taquizoítos del aislado Nc-Spain 7 se ha depositado
el día 20.09.2005, de acuerdo con las provisiones del Tratado de
Budapest sobre reconocimiento internacional del depósito de
microorganismos a fines del procedimiento en materia de patentes, en
la Colección de Cultivos de Algas y Protozoos (Culture Collection
of Algae and Protozoa, CCAP) situada en el Dunstaffnage Marine
Laboratory, Dunbeg, OBAN, Argyll PA37 1 QA, Escocia, Gran Bretaña,
que le ha otorgado el número de acceso CCAP 2051/1.
En esta descripción, cuando se habla del
parásito aislado o simplemente aislado de la invención se refiere
al nuevo aislado de Neospora caninum,
Nc-Spain 7, obtenido en cualquier estadio de su
ciclo biológico. Del mismo modo, cuando se habla de extractos,
lisados celulares, polipéptidos y polinucleótidos obtenidos del
aislado de la invención se refiere a extractos, lisados celulares,
polipéptidos y polinucleótidos obtenidos del aislado de la invención
en cualquier estadio de su ciclo biológico.
Dicho aislado fue obtenido a partir del tejido
nervioso de un ternero congénitamente infectado de la especie
Bos taurus de la raza Frisona-Holstein tal
como se describe en el Ejemplo 1.
Para ello, antes de proceder al aislamiento, se
confirmó la presencia del parásito en muestras de tejido nervioso
procedentes del ternero infectado mediante una PCR anidada
desarrollada para la detección específica del ADN del parásito en
muestras clínicas. La amplificación específica de la región
ITS-1 permitió detectar la presencia de ADN de este
parásito en dichas muestras. Además, el análisis histológico e
inmunohistoquímico del mismo tejido nervioso corroboró una vez más
la presencia del parásito en este tejido, con la observación de
lesiones compatibles con la infección por N. caninum, así
como la detección de quistes mediante la utilización de un
anticuerpo policlonal de conejo obtenido frente a taquizoítos de
N. caninum. Inmediatamente después, se procedió a su
aislamiento utilizando como primer paso ratones atímicos de la
estirpe BALB/c sensibles a la infección que fueron inoculados con
diferentes cantidades del tejido nervioso. La aparición de signos
clínicos compatibles con la neosporosis permitió, en un segundo
paso, su aislamiento in vitro en cultivos celulares de la
línea celular MARC-145 (células de riñón de mono
verde africano (Ceropithecus aethiops)).
Su caracterización genética se realizó mediante
el estudio de secuencias microsatélites, que resulta ser una
técnica adecuada para la identificación y discriminación de
diferentes aislados de N. caninum, como se describe en el
Ejemplo 2 de esta memoria. En cuanto a su caracterización patogénica
se llevó a cabo en un modelo murino experimental, tal como se
describe en el Ejemplo 3 de esta solicitud de patente. En dicho
modelo algunos de los ratones inoculados con taquizoítos del
aislado Nc-Spain7 desarrollaron signos clínicos
compatibles con la infección por N. caninum y se detectó la
presencia de ADN del parásito en sangre, pulmón y encéfalo mediante
la PCR anidada de la región ITS-1 anteriormente
mencionada. Por otro lado, en los ensayos de inmunogenicidad,
descritos en el Ejemplo 4, mediante una técnica de ELISA para la
detección de las inmunoglobulinas IgG2a e IgG1 específicas frente a
Neospora, se comprobó la capacidad del aislado
Nc-Spain 7 de inducir una respuesta inmune
específica frente a N. caninum en los ratones infectados
según el modelo murino experimental.
También se valoró la capacidad de transformación
del aislado Nc-Spain7 entre los estadios de
taquizoíto y bradizoíto in vitro, mediante un estudio en
cultivos celulares de la línea MARC-145 y utilizando
nitroprusiato sódico como agente estresante. La transformación
entre ambos estadios se evaluó mediante la detección de vacuolas
parasitóforas por la técnica de inmunofluorescencia indirecta con
parásitos que expresan la proteína BAG1, expresada únicamente en el
estadio de bradizoíto, frente a las vacuolas parasitóforas con
parásitos que expresan la proteína NcSAG1, específica del estadio
de taquizoíto tal y como se describe en el Ejemplo 5.
Los resultados obtenidos demostraron
consecuentemente que el aislado Nc-Spain 7
pertenece a la especie N. caninum y posee una elevada
capacidad de transformación del estadio de taquizoíto a bradizoíto
in vitro, lo que lo hace de gran utilidad para el desarrollo
de nuevas pruebas de diagnóstico, así como para el desarrollo de
nuevas composiciones farmacéuticas para el tratamiento y prevención
de la infección por Neospora, como se describe en los
Ejemplos 7 y 8.
Otro aspecto de la invención se refiere a
cultivos celulares biológicamente puros infectados por el aislado
Nc-Spain 7 de la invención que se mantiene in
vitro mediante pases sucesivos en cultivos de diferentes líneas
celulares. Mediante estos cultivos celulares se obtienen
taquizoítos y bradizoítos del aislado de la invención que se
emplean en la obtención de polipéptidos, antígenos, anticuerpos,
ácidos nucleicos y otros compuestos de utilidad en la elaboración
de productos para el diagnóstico, el tratamiento y la prevención de
la neosporosis.
La expresión "cultivo celular biológicamente
puro" del aislado de la invención se refiere a un cultivo del
aislado Nc-Spain 7 mantenido de forma continua
sustancialmente libre de otros organismos, salvo las células
hospedadoras donde el parásito se multiplica. Se considera que un
cultivo es sustancialmente libre de otros organismos si tras los
procedimientos de recuperación normalizados del aislado dan como
resultado una preparación con al menos el 95% y, preferiblemente,
el 99% ó más del parásito.
El cultivo celular de preferencia es de células
de riñón de mono verde entre las que se pueden mencionar las líneas
MA-104, MARC-145, y las células
Vero.
La invención también comprende los anticuerpos
que reaccionan específicamente frente a los antígenos procedentes
del aislado de la invención.
El termino "anticuerpo" se refiere a una
molécula de inmunoglobulina producida por un organismo animal capaz
de unirse a un epítopo específico de un antígeno. Los anticuerpos
pueden estar constituidos por una mezcla policlonal o ser
anticuerpos monoclonales. También pueden estar constituidos por
inmunoglobulinas intactas de origen natural o de naturaleza
recombinante o fragmentos de estos anticuerpos que retienen su
capacidad de reconocimiento y unión del epítopo diana y que
incluyen el fragmento Fc y los fragmentos de unión al antígeno,
F(ab) y F(ab)_{2}, así como cadenas simples
(cadena pesada (H) y ligera (L)) fusionadas o no a otras
moléculas.
Preferiblemente el antígeno procedente del
aislado Nc-Spain 7, frente al cual el anticuerpo
reacciona específicamente, se selecciona entre el grupo formado por
el propio aislado en cualquiera de sus estadios del ciclo
biológico, extractos o lisados celulares, polipéptidos antigénicos,
o sus mezclas.
Más preferiblemente el antígeno se selecciona
entre el grupo formado por taquizoítos y/o bradizoítos, y
polipéptidos antigénicos. Los polipéptidos antigénicos son los
obtenidos a partir del propio aislado o bien mediante tecnología
recombinante a partir de polinucleótidos del aislado de la
invención.
Para la obtención de anticuerpos policlonales,
distintas especies animales previamente seleccionadas (ratón,
conejo, cabra o caballo, entre otros) son inmunizadas con un
inmunógeno constituido por el propio aislado de la invención
inactivado en cualquiera de los estadios de su ciclo biológico, o
una o varias proteínas de origen natural y/o recombinante,
purificadas o no, en formulación o no con un adyuvante.
Posteriormente, se recoge el suero del animal inmunizado y existe
la opción de tratarlo con el fin de producir un enriquecimiento de
los anticuerpos inmunoreactivos de interés de acuerdo con
diferentes procedimientos convencionales.
En cuanto a los anticuerpos monoclonales se
definen como los anticuerpos producidos por una población clonal de
células originada a partir de una única célula inmortalizada y, por
tanto, son idénticos y capaces de reconocer específicamente un
único epítopo.
Los anticuerpos monoclonales y policlonales
desarrollados frente a determinados epítopos son particularmente
útiles para el diagnóstico de la enfermedad, y aquellos que
presentan una actividad neutralizante frente al parásito son de
gran utilidad en inmunoterapias pasivas. Sus aplicaciones incluyen
pruebas de diagnóstico mediante inmunoensayo como por ejemplo
aglutinación o ELISA de competición, pruebas inmunohistoquímicas, y
otras aplicaciones como evaluación in vitro de la capacidad
de adhesión/invasión del parásito, la detección y selección previa
de antígenos para el desarrollo de nuevas vacunas, purificación de
proteínas de interés, y el rastreo de genotecas genómicas y de ADN
complementario para la identificación de genes de interés.
Los anticuerpos de la presente invención se unen
específicamente al propio aislado de la invención en cualquiera de
sus estadios del ciclo biológico, extractos y/o lisados celulares,
polipéptidos antigénicos, o sus mezclas, y son apropiados para
detectar la presencia del parásito N. caninum o de la
infección causada por el mismo en animales a partir de muestras
biológicas.
Preferiblemente el anticuerpo de la invención es
monoclonal.
También forman parte de la invención
polipéptidos obtenidos a partir del parásito aislado. En esta
descripción, el término "polipéptido" incluye los polipéptidos
obtenidos a partir del aislado de la invención en cualquier estadio
de su ciclo biológico, a partir de extractos y/o lisados celulares,
o sus mezclas. Dentro de los mismos también se incluyen los
polipéptidos recombinantes producidos en sistemas de expresión
heterólogos tras la transcripción y traducción de secuencias
nucleotídicas obtenidas a partir del aislado de la invención en
cualquier estadio de su ciclo
biológico.
biológico.
Las secuencias polipeptídicas de la invención
incluyen no solamente las secuencias "idénticas", sino también
aquellas "sustancialmente idénticas" a las mismas. Los
polipéptidos pueden variar mediante la realización de deleciones,
inserciones y sustituciones en su secuencia aminoacídica, dando
lugar a polipéptidos distintos pero sustancialmente idénticos. El
término "idéntico o porcentaje de identidad" de secuencias
para dos o más polinucleótidos y polipéptidos se refiere a dos o
más secuencias que son la misma o presentan un porcentaje concreto
de residuos nucleotídicos o aminoacídicos que son iguales,
respectivamente, cuando estas son alineadas para la máxima
correspondencia, comparadas y este porcentaje se calcula mediante
el uso de algoritmos utilizados en su comparación o por inspección
visual. El término "sustancialmente idénticas" se refiere a
secuencias polinucleotídicas o polipeptídicas que tienen al menos un
60%, preferiblemente un 80% y mucho más preferible un
90-95% de identidad en los residuos aminoacídicos o
nucleotídicos, cuando son comparadas, alineadas para la máxima
correspondencia y su porcentaje de identidad calculado por los
métodos ya mencionados. El programa BLAST es un ejemplo de los
programas utilizados para calcular el porcentaje de identidad y
similitud entre secuencias
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast).
Los polipéptidos de la invención presentan
interés diagnóstico o inmunogénico. En el primer caso, formando
parte de pruebas de inmunoensayo como antígeno para la detección de
anticuerpos específicos frente a N. caninum, y en el segundo
caso, formando parte de composiciones farmacéuticas para la
prevención y el tratamiento de las infecciones causadas por
Neospora y/o la obtención de anticuerpos.
Una opción para el aislamiento de polipéptidos
antigénicos del nuevo aislado Nc-Spain 7 comprende
la utilización de técnicas normalizadas de purificación de
proteínas o polipéptidos.
Un procedimiento alternativo se basa en utilizar
los polinucleótidos obtenidos del aislado de la invención para la
expresión de proteínas recombinantes mediante la introducción de
los polinucleótidos que codifican las proteínas de interés en
sistemas heterólogos de expresión adecuados para su producción,
procediendo posteriormente a un proceso de purificación. Estos
sistemas incluyen células procariotas (por ejemplo Escherichia
coli), levaduras (por ejemplo Sacharomyces cerevisiae,
Schizosacharomyces pombe, Pichia pastoris), líneas
celulares de mamíferos (por ejemplo CHO, HEK, COS) o de insecto
(por ejemplo Sf9, Sf21).
Existe la opción de modificar las secuencias
polinucleotídicas utilizadas en la expresión heteróloga de
polipéptidos para dar lugar a polipéptidos modificados mediante
deleciones, inserciones y/o sustituciones en su secuencia
aminoacídica aunque siguen manteniendo su capacidad inmunogénica
con el fin de obtener variaciones para facilitar su expresión y/o
purificación, o para aumentar su semivida plasmática, aumentando su
eficacia terapéutica, y disminuyendo el grado y/o la aparición de
efectos colaterales, si su uso es terapéutico.
La introducción del material genético en la
célula hospedadora o sistema de expresión del polipéptido se
realiza, por ejemplo, por transfección con sales de calcio,
esferoplastos, electroporación, liposomas o vectores virales. En
cuanto al vector para la inclusión del material genético dentro de
la célula, existe la posibilidad de utilizar cualquiera de los
vectores de expresión convencionales desarrollados para la
expresión de proteínas en células procariotas y eucariotas.
Los polipéptidos recombinantes obtenidos, una
vez purificados, se emplean en la obtención de anticuerpos, para el
desarrollo de pruebas de diagnóstico y para la elaboración de
composiciones farmacéuticas inmunogénicas.
En otro aspecto, la invención también comprende
polinucleótidos obtenidos a partir del parásito aislado de la
invención. En esta descripción el término "ácido nucleico o
polinucleótido" hace referencia a moléculas de los ácidos
nucleicos ADN o ARN obtenidas a partir del aislado de la invención
en cualquier estadio de su ciclo biológico.
Igualmente, los polinucleótidos de la invención
incluyen las secuencias "idénticas" y también las secuencias
"sustancialmente idénticas" a las mismas. De hecho, un número
variable de secuencias polinucleotídicas que son transcritas y
traducidas pueden producir idénticos polipéptidos funcionales
debido a la degeneración del código genético. Como hemos comentado
en el apartado anterior, las secuencias polinucleotídicas son
"sustancialmente idénticas" cuando tienen al menos un 60%,
preferiblemente un 80% y mucho más preferible entre un
90-95% de identidad en los residuos nucleotídicos,
cuando son comparadas, alineadas para la máxima correspondencia y
su porcentaje de identidad calculado por los métodos ya mencionados.
También dos secuencias polinucleotídicas son sustancialmente
idénticas si dos moléculas hibridan la una con la otra en
condiciones de alta especificidad. Estas condiciones dependen de la
secuencia y serán diferentes en función de las condiciones
ensayadas. Generalmente, las condiciones seleccionadas son la
temperatura, que suele ser hasta 5ºC más baja que la temperatura de
disociación o Tm para una secuencia específica en una
solución salina a un pH determinado. La Tm es la temperatura
a la cual el 50% de la secuencia se deshibrida de la secuencia
complementaria.
Una de las aplicaciones de estas moléculas
polinucleotídicas comprende la expresión heteróloga de proteínas de
Neospora de interés diagnóstico o inmunogénico, como se ha
descrito anteriormente, para la elaboración de vacunas de ADN o
como sondas en diferentes pruebas de diagnóstico de la infección en
animales a partir de una muestra biológica.
Los polinucleótidos de interés en el desarrollo
de pruebas de diagnóstico y para la expresión de proteínas
recombinantes se obtienen mediante técnicas conocidas en la materia
y, preferentemente, mediante la técnica de la reacción en cadena de
la polimerasa o PCR a partir de ARN mensajero, ADN genómico o
genotecas. Una opción para la identificación del polinucleótido
requerido para la expresión heteróloga de una proteína en concreto
se basa en la traducción inversa y en el diseño de oligonucleótidos
degenerados a partir de la secuencia de la proteína de interés o de
las regiones conservadas de proteínas homólogas de especies
filogenéticamente relacionadas. Una vez identificado, a partir de
su secuencia se procede al diseño de nuevos oligonucleótidos que se
utilizarán para la amplificación y clonación del polinucleótido de
interés para su posterior expresión heteróloga, el diagnóstico de
la enfermedad mediante la amplificación de ADN específico de
Neospora a partir del ADN obtenido de una muestra biológica,
o para la obtención de sondas nucleotídicas que permiten detectar
la presencia de ARN mensajero o ADN del parásito en muestras
clínicas, o para cualquier otro método de detección basado en los
ácidos nucleicos del parásito.
La invención también incluye el uso del nuevo
aislado para preparar una vacuna para el tratamiento y/o prevención
de la infección causada por N. caninum en animales.
Estas preparaciones se formulan a partir del
aislado de la invención en cualquiera de los estadios de su ciclo
biológico, preferiblemente a partir del parásito vivo atenuado,
inactivado y/o fijado, o bien están constituidas por un extracto o
lisado celular del mismo.
Como ya se ha descrito, otro aspecto de la
invención se refiere a la utilización de proteínas antigénicas,
recombinantes o no, parcial o totalmente purificadas, para la
elaboración de productos vacunales. Entre las vacunas que incluye
la invención también se encuentran las vacunas recombinantes como
las de ADN mediante la clonación del gen codificante del inmunógeno
en vectores plasmídicos que se transfectan a las células
hospedadoras en los animales. Los virus, como por ejemplo el virus
de la vacuna (vaccinia) o algunos adenovirus como vectores,
son otras alternativas para la generación de vacunas
recombinantes.
Las vacunas constituidas por los diferentes
inmunógenos descritos se preparan preferentemente como inyectables
en formulaciones líquidas, como soluciones, suspensiones o
emulsiones donde el inmunógeno está o no encapsulado en liposomas o
cualquier otro sistema apropiado, o en forma sólida para su
posterior reconstitución previamente a su administración. Pero
también pueden presentarse como formulaciones orales (por ejemplo
cápsulas y comprimidos).
En su formulación el inmunógeno puede ir
combinado con excipientes de uso farmacéutico, agentes humectantes
o emulsionantes, reguladores del pH, conservantes y/o adyuvantes
que aumentan la efectividad de la vacuna, además de citoquinas y/u
otros inmunomoduladores.
Las vacunas de la presente invención pueden ser
administradas de forma preventiva a animales sensibles a la
infección con el fin de inducir una respuesta inmune eficaz frente
al parásito. También se puede administrar la vacuna para el
tratamiento de la enfermedad una vez han aparecido los primeros
signos clínicos.
También forma parte de la presente invención el
uso de anticuerpos que reaccionan específicamente contra un
antígeno procedente del aislado de la invención, y en
inmunoterapias pasivas preferiblemente aquellos que presentan una
actividad neutralizante frente al parásito, para la preparación de
un producto farmacéutico para el tratamiento de la infección y/o
enfermedad causada por N. caninum en los animales.
\vskip1.000000\baselineskip
En esta descripción el término "muestra
biológica o muestra clínica" se refiere a cualquier muestra
obtenida de organismos vivos o muertos. Ejemplos de muestras
biológicas son los fluidos biológicos (sangre, suero, plasma, leche,
orina, semen, líquido ascítico, líquido cerebroespinal y fluidos
fetales), las muestras de tejidos (originarios de encéfalo, médula
espinal, pulmón, corazón, hígado y placenta, entre otros) y los
cultivos celulares.
Como objeto de la invención se incluye el uso de
antígenos procedentes del aislado de la invención para detectar la
infección por el parásito N. caninum en animales a partir de
una muestra biológica.
Preferiblemente el antígeno estará constituido
por el propio aislado en cualquiera de sus estadios del ciclo
biológico, extractos o lisados celulares obtenidos a partir del
mismo, polipéptidos antigénicos obtenidos a partir del aislado de
la invención o producidos mediante técnicas de ADN recombinante a
partir de polinucleótidos obtenidos del aislado de la invención,
parcial o totalmente purificados, o sus mezclas.
Más preferiblemente el antígeno empleado estará
constituido por taquizoítos y/o bradizoítos, y polipéptidos
antigénicos.
También forma parte de esta invención el uso de
anticuerpos que reaccionan específicamente contra un antígeno
procedente del aislado de la invención para detectar la infección
por el parásito N. caninum en animales a partir de una
muestra biológica. Si bien los anticuerpos pueden ser anticuerpos
monoclonales o estar constituidos por una mezcla policlonal, una
realización preferida de esta invención emplea anticuerpos
monoclonales.
El diagnóstico de la infección por el parásito
Neospora en animales a partir de una muestra biológica se
puede llevar a cabo mediante diferentes técnicas de inmunoensayo
que permiten la detección de anticuerpos específicos frente a N.
caninum generados durante la respuesta inmune desarrollada en el
animal infectado como son las técnicas inmunoenzimáticas (como la
técnica ELISA), de inmunofluorescencia (como la técnica de IFI), de
inmunoblot (IB) y de aglutinación (DAT) o cualquier otro método
basado en la detección de los anticuerpos citados.
Con fines diagnósticos la detección del parásito
en una muestra biológica también puede llevarse a cabo mediante
técnicas inmunológicas utilizando anticuerpos específicos frente al
parásito (como la técnica de inmunohistoquímica (IHQ)).
Esta invención también incluye la detección de
los ácidos nucleicos del parásito con fines diagnósticos mediante
el uso de diferentes técnicas de biología molecular, basadas en
técnicas de hibridación específica, destacando la aplicación de la
PCR, la hibridación in situ y la PCR in situ. En esta
descripción la expresión "hibridación específica" se refiere a
la hibridación específica entre la secuencia que actúa como sonda
con la secuencia diana. Aunque la sonda podría unirse a otras
secuencias no relacionadas, al menos el 90% y preferiblemente el
95% o más de los complejos de hibridación formados serán con la
secuencia diana.
Además, a partir de una muestra biológica, es
posible realizar el aislamiento del parásito en sistemas in
vivo e in vitro, y su posterior identificación mediante
cualquiera de las técnicas ya mencionadas.
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La invención también incluye el uso del nuevo
aislado modificado genéticamente y de los extractos obtenidos a
partir del mismo para la elaboración de pruebas de diagnóstico y la
fabricación de productos para el tratamiento y la prevención de la
infección causada por Neospora. Así mismo y con los mismos
usos se incluyen los polipéptidos y polinucleótidos obtenidos a
partir del aislado modificado genéticamente y los anticuerpos
inmunoreactivos desarrollados frente a antígenos del mismo.
El aislado de la invención puede ser manipulado
genéticamente mediante la inserción y/o deleción de secuencias
polinucleotídicas homólogas o heterólogas en su genoma, o mediante
mutagénesis dirigida por la sustitución de nucleótidos en la
secuencia del genoma del mismo. Existe la opción de modificar las
secuencias polinucleotídicas homólogas o heterólogas seleccionadas
para su inserción en el genoma del aislado mediante deleciones,
inserciones y/o sustituciones en su secuencia nucleotídica con la
finalidad de lograr y facilitar su expresión en los diferentes
estadios del ciclo biológico del parásito. La introducción del
material genético se realiza mediante procedimientos bien conocidos
en la materia como la electroporación o la transformación con sales
de calcio. También el aislado puede ser modificado genéticamente
por procedimientos alternativos que incluyen la mutagénesis al azar
utilizando agentes químicos como el metil-sulfonato
de etilo (EMS) o sulfonato de dietilo (DES) y agentes físicos como
las radiaciones ionizantes y/o ultravioleta.
Los aislados de la invención modificados
genéticamente presentan principalmente un interés diagnóstico e
inmuno-profiláctico. En el primer caso, formando
parte de pruebas de inmunoensayo incorporando la expresión de
nuevas proteínas antigénicas que permitan aumentar la sensibilidad y
especificidad del ensayo para la detección de anticuerpos
específicos frente a N. caninum (por ejemplo, expresión de
proteínas específicas de bradizoíto durante el estadio de
taquizoíto usado como antígeno), y en el segundo caso, formando
parte de vacunas para la prevención y el tratamiento de las
infecciones causadas por Neospora mediante la generación de
aislados que expresen nuevas proteínas antigénicas de interés
inmuno-profiláctico (específicas de los estadios de
bradizoíto y/o esporozoíto), mediante la generación de aislados
atenuados por la modificación genética de genes implicados
directamente en la virulencia de Neospora o la inserción de
secuencias polinucleotídicas como "marcadores" si el aislado
forma parte de una vacuna
viva.
viva.
Para complementar la descripción y con objeto de
ayudar a una mejor compresión de las características de la
invención, se acompaña la presente memoria descriptiva, como parte
integrante de la misma, de un juego de figuras en donde, con
carácter ilustrativo y no limitativo, se ha representado lo
siguiente:
Figura 1: Se muestra la carga parasitaria
presente en el pulmón (panel A) y encéfalo (panel B) en el modelo
de infección experimental murino desarrollado con el aislado
Nc-Spain 7 en el ejemplo 3 de esta memoria.
Figura 2: Se presenta la valoración de la
respuesta inmune humoral en el modelo de infección experimental
murino desarrollado con el aislado Nc-Spain 7,
según se explica en el ejemplo 4 de esta memoria.
Figura 3: Se muestra el porcentaje de
transformación in vitro al estadio de bradizoíto a partir de
taquizoítos del aislado Nc-Spain 7.
Figura 4: Se presenta la valoración de la
respuesta inmune humoral desarrollada por los diferentes grupos de
animales de la prueba vacunal desarrollada con el aislado
Nc-Spain 7.
Figura 5: Se muestra el análisis por inmunoblot
con el extracto proteico completo de los aislados de N.
caninum Nc-Spain7 (Panel A) y
Nc-1 (Panel B) en condiciones reductoras con una
mezcla a partes iguales de los plasmas obtenidos a partir de
ratones infectados experimentalmente.
Figura 6: Se muestra el análisis por inmunoblot
con el extracto proteico completo de los aislados de N.
caninum Nc-Spain7 (Panel A) y
Nc-1 (Panel B) en condiciones reductoras con sueros
obtenidos a partir de bovinos.
Los ejemplos que siguen a continuación se
exponen a efectos de proporcionar al experto en la materia una
explicación suficientemente clara y completa de la presente
invención, pero no deben ser considerados como limitaciones a los
aspectos esenciales del objeto de la misma, tal y como han sido
expuestos en los apartados anteriores de esta memoria.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
En este ejemplo se describe la obtención del
aislado de N. caninum denominado Nc-Spain 7
a partir de un ternero congénitamente infectado de la raza
Frisona-Holstein.
El ternero nació de una vaca con serología
positiva en las pruebas de detección para anticuerpos específicos
frente a N. caninum mantenida en una explotación de
producción láctea localizada en la provincia de Navarra, España. El
suero precalostral del ternero fue analizado para la detección de
anticuerpos específicos frente a Neospora por la técnica de
IFI, dando como resultado un título de 1:800. Dos meses después de
su nacimiento permanecía saludable y sin mostrar ningún signo
clínico atribuible a la infección por Neospora. En esta
fecha, fue sacrificado mediante una inyección de 30 ml de
T-61 (Embutramida y Mebezonio yoduro, Intervet) por
vía endovenosa e inmediatamente después, el encéfalo y la porción
superior de la médula espinal fueron extraídos en condiciones
asépticas y mantenidos a 4ºC.
Tras la necropsia, diferentes porciones de 5 a
15 gramos de peso de ambos hemisferios y de la región anterior,
media y posterior del cerebro, así como del cerebelo, tronco del
encéfalo y la médula espinal, se retiraron en condiciones asépticas
y se mantuvieron a 4ºC en una solución de tampón PBS suplementada
con una solución de antibióticos-antimicóticos
(Penicilina G 200 UI/ml, Estreptomicina 200 \mug/ml y
Anfotericina B 500 ng/ml) (Gibco, BRL, UK) hasta su posterior
inoculación a ratones de la estirpe Balb/c nu/nu atímicos.
Simultáneamente, diferentes porciones de encéfalo procedentes de
las mismas localizaciones fueron fijadas en una solución de
formolina tamponada al 10% para su posterior análisis
histológico.
Antes de proceder al aislamiento del parásito,
se analizaron las diferentes muestras de tejido nervioso mantenidas
a 4ºC con el fin de detectar la presencia del ADN de N.
caninum mediante la utilización de la PCR anidada que amplifica
la región ITS-1 del parásito (Buxton et al.,
1998, J. Comp Pathol. 118: 267-279). Para ello,
diferentes porciones de unos 20 mg fueron retiradas de todas las
secciones recogidas y procesadas para la extracción del ADN
genómico con el kit comercial: "Genomic-Prep
cell and tissue ADN isolation kit" (Amershan Biosciences)
siguiendo las instrucciones del fabricante y, posteriormente, 5
\mul de la solución del ADN resultante (100-200
ng) se utilizaron como molde en la PCR anidada de la región
ITS-1 descrita a continuación.
La amplificación de la región
ITS-1 del ADN ribosómico de N. caninum se
llevó a cabo en una primera reacción de PCR utilizando los
oligonucleótidos NN1 (SEQ ID NO: 13) y NN2 (SEQ ID NO: 14), y en
una segunda reacción empleando los oligonucleótidos NP1 (SEQ ID NO:
15) y NP2 (SEQ ID NO: 16). La mezcla de PCR (25 \mul) se componía
de 0,15 \muM de cada oligo (Sigma), 200 \muM dNTPs (Sigma), 1x
tampón (75 mM Tris pH 9, 20 mM
(NH_{4})_{2}SO_{4}, 50 mM KCl) (Biotools, España), 2 mM MgCl_{2} (Biotools) y 0,625 unidades de ADN polimerasa (Biotools). En la primera reacción de amplificación se añadieron 5 \mul de ADN y en la segunda 2 \mul del producto de la primera. Ambas reacciones se realizaron en un termociclador según el siguiente programa: 94ºC durante 5 min y 25 ciclos de 94ºC/1 min, 48ºC/1 min y 72ºC/1,5 min y un último ciclo de 72ºC durante 5 min. Los productos resultantes de la segunda amplificación, con un tamaño 213 pb, se visualizaron en un gel de agarosa al 1,6% en TBE 0,5 x (tampón Tris-borato-EDTA) teñido con bromuro de etidio.
(NH_{4})_{2}SO_{4}, 50 mM KCl) (Biotools, España), 2 mM MgCl_{2} (Biotools) y 0,625 unidades de ADN polimerasa (Biotools). En la primera reacción de amplificación se añadieron 5 \mul de ADN y en la segunda 2 \mul del producto de la primera. Ambas reacciones se realizaron en un termociclador según el siguiente programa: 94ºC durante 5 min y 25 ciclos de 94ºC/1 min, 48ºC/1 min y 72ºC/1,5 min y un último ciclo de 72ºC durante 5 min. Los productos resultantes de la segunda amplificación, con un tamaño 213 pb, se visualizaron en un gel de agarosa al 1,6% en TBE 0,5 x (tampón Tris-borato-EDTA) teñido con bromuro de etidio.
Se detectó ADN del parásito en todas las
secciones de encéfalo analizadas.
Además, las muestras mantenidas en la solución
de formolina tamponada al 10% fueron deshidratadas, embebidas en
parafina y se tiñeron con hematoxilina-eosina
múltiples secciones de 3 a 6 \mum de espesor siguiendo el método
habitual. Para la detección de lesiones compatibles con la infección
de N. caninum las muestras se examinaron microscópicamente
como se describe en González et al., 1999, Vet Rec 144:
145-150. Todas las muestras analizadas mostraron
lesiones compatibles con la infección por éste parásito
caracterizadas por un cuadro de meningoencefalitis no supurativa,
con múltiples nódulos gliales y manguitos perivasculares.
Igualmente, secciones de varios de los bloques fueron
desparafinados y examinados mediante la técnica inmunohistoquímica
como se describe en Pereira-Bueno et al.,
2003, Vet Parasitol 111: 143-152, utilizando un
suero policlonal de conejo desarrollado frente a taquizoítos de
N. caninum, así como un suero policlonal de conejo frente a
la proteína BAG1 como se describe en el Ejemplo 5 de la presente
memoria. En la mayoría de las secciones analizadas se detectó la
presencia de estructuras compatibles con quistes formados por este
parásito.
Una vez confirmada la presencia del parásito,
para el aislamiento se procesaron las muestras de encéfalo
mantenidas a 4ºC mediante su homogeneización con ciclos de 1 min de
duración en un homogenizador de tejidos (Masticator IUL) hasta su
perfecta disgregación. A continuación, se llevó a cabo la
filtración de los macerados a través de una malla de 150 \mum
previamente esterilizada, y se centrifugó a 1350 x g durante 10
minutos. El sobrenadante fue descartado y el sedimento equivalente
a unos 5 gramos de tejido de partida se inoculó
intraperitonealmente con jeringa de insulina y aguja de diámetro
0,5x16 mm a ratones de la estirpe Balb/c nu/nu hembras con
un peso aproximado de 20-25 gramos. Todo el proceso
se realizó en condiciones asépticas.
Los ratones inoculados fueron examinados
diariamente para detectar la aparición de signos clínicos
atribuibles a neosporosis, entre los que se incluyen la pérdida de
peso, parálisis de extremidades, ataxia, letargia, y otros signos
neurológicos, tal como se describe en Yamane et al., 1998, J.
Vet. Diagn. Invest. 10: 364-368. Éstos fueron
detectados en todos los ratones inoculados entre los
18-21 días postinoculación (PI) y, tras su
aparición, los ratones fueron sacrificados en atmósfera de CO_{2}
y utilizados para el aislamiento del parásito en cultivo celular,
mediante la inoculación del lavado peritoneal.
Además, con el fin de mantener el aislado in
vivo en el modelo murino, el encéfalo de los ratones
sacrificados fue retirado y homogeneizado en una solución de PBS
suplementada con una solución de
antibióticos-antimicóticos (100 UI/ml Penicilina G,
100 \mug/ml Estreptomicina y 250 ng/ml Anfotericina B) (Gibco,
BRL, UK) mediante sucesivos pases de jeringa con agujas de 21 G y
25 G y, a continuación, el homogeneizado equivalente a la cuarta
parte encéfalo, fue inoculado intraperitonealmente a un nuevo ratón
de la estirpe Balbc nu/nu atímico que igualmente se
monitorizó hasta la aparición de los signos clínicos descritos
anteriormente. El proceso se llevó a cabo hasta 6 pases
consecutivos de ratón a ratón, observando la aparición de los signos
clínicos ya descritos, en todos los ratones inoculados, entre los 6
y 15 días PI. Con el fin de confirmar que los signos clínicos
observados eran consecuencia de la infección por N. caninum,
se procedió a la extracción del ADN a partir de 20 mg de muestra
del encéfalo de los ratones inoculados con el encéfalo del ternero,
que fue sometido al análisis mediante la PCR anidada de la región
ITS-1 descrita anteriormente, detectándose el
producto de amplificación específico en todos los ratones
analizados.
En cuanto al aislamiento en cultivo celular se
llevó a cabo mediante la inoculación del lavado peritoneal de los
ratones con signos clínicos previamente sacrificados, sobre un
cultivo en monocapa de la línea celular MARC-145.
Para ello, se llevó a cabo el lavado de la cavidad peritoneal con
aproximadamente 8 ml de medio Dulbeco's Modified Eagle Medium
(DMEM) suplementado con suero fetal bovino al 2% y una solución de
antibióticos-antimicóticos al 2% (200 UI/ml
Penicilina G, 200 \mug/ml Estreptomicina y 500 ng/ml Anfotericina
B) (Gibco BRL, UK) que, inmediatamente después, fue añadido sobre
una monocapa de aproximadamente 10^{6} células de la línea
MARC-145 en un frasco de cultivo de 25 cm^{2}.
A las 24 horas, se retiró el medio y se
sustituyó por DMEM suplementado con suero equino al 2% y la misma
solución de antibióticos-antimicóticos al 1%. Cada
4 días el tapiz celular se levantó mecánicamente con el uso de un
"raspador" celular, se pasó por jeringa y aguja de 25 G y se
añadió sobre un nuevo cultivo de 5x10^{5} células
MARC-145. Nuevamente, a las 24 horas el medio se
retiró y se sustituyó por DMEM suplementado con suero equino al
2%.
Los cultivos se mantuvieron en estufa húmeda a
37ºC y atmósfera de CO_{2} al 5% y se observaron diariamente en
microscopio de contraste de fases para la visualización del
parásito. A los 4 días PI se observaron algunas vacuolas y
taquizoítos en el cultivo celular, que a continuación fue mantenido
por pases sucesivos según el procedimiento descrito hasta obtener
recuentos en cámara de Neubauer igual o superior a 10^{6}
taquizoítos al tercer pase. A partir de este momento, el cultivo se
mantuvo según describe Perez-Zaballos et al.,
2005, J. Parasitol., 91(3):
507-10.
507-10.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
En este ejemplo se describe la caracterización
genética del aislado Nc-Spain 7 junto con otros
aislados obtenidos a partir de diversos hospedadores y de diferente
origen geográfico, permitiendo su identificación y discriminación
del resto. Para ello, se amplificaron y secuenciaron 13 secuencias
microsatélites, previamente identificadas en el genoma de N.
caninum, a partir del aislado de la invención, tal y como se
había realizado previamente con otros 9 aislados
(Regidor-Cerrillo et al., 2006, J.
Parasitol., 92(3): 517-524).
Los microsatélites están constituidos por
secuencias nucleotídicas sencillas de 2 a 5 nucleótidos que se
repiten en tándem y que se caracterizan por un elevado
polimorfismo, principalmente en función del número de repeticiones
del motivo nucleotídico que presentan, constituyendo una herramienta
adecuada para la identificación y discriminación de los diferentes
aislados de N. caninum.
Para la identificación de secuencias
microsatélites en el genoma de N. caninum, aproximadamente
25.330 ESTs (Expression Sequences Tags) depositadas en bancos de
datos públicos derivadas de los aislados de N. caninum
Nc-1 y Nc-Liv fueron analizadas con
los programas informáticos Tandem Repeat Occurrence Locator
(TROLL) (Castelo et al., 2002. Bioinformatics.
18:634-636), Tandem Repeats Finder (TRF)
(Benson 1999, Nucleic Acids Res. 27:573-580) y, por
último, para evitar el análisis de secuencias redundantes, mediante
el programa informático
BLASTN.
BLASTN.
De las 126 secuencias microsatélites detectadas,
se seleccionaron 13 marcadores en función de varios criterios que
incluían la posibilidad de diseño de cebadores para su posterior
amplificación por PCR y secuenciación, el número de repeticiones en
tándem que presentaban, seleccionando los de mayor número, y su
localización fuera de regiones codificantes del genoma, con la
finalidad de seleccionar los más polimórficos. En la Tabla I se
describen los 13 microsatélites utilizados en este estudio como
marcadores moleculares. Para cada microsatélite seleccionado, que
se denominaron como se especifica en la Tabla I, se diseñaron
cebadores específicos (de SEQ ID NO: 17 a SEQ ID NO: 42) que fueron
utilizados para la amplificación de productos de PCR de
aproximadamente 300 pb, que incluían el motivo de repetición y
parte de las secuencias que lo flanquean, a partir del ADN genómico
de diez aislados de N. caninum de diferentes hospedadores y
origen geográfico, incluido el aislado objeto de la invención, tal
como se muestra en la Tabla II.
El ADN genómico del aislado
Nc-Spain7 fue obtenido a partir de 10^{8}
taquizoítos mediante la utilización del sistema comercial Genomic
Prep Cells and Tissue DNA Isolation Kit (Amersham Biosciences,
Uppsala, Sweden). Para ello, los taquizoitos mantenidos en monocapa
de la línea celular MARC-145, según se describe en
el Ejemplo 1, fueron recogidos del cultivo cuando el
70-80% de las vacuolas parasitóforas se habían roto,
y purificados de los restos celulares mediante varios pases por
aguja de 25 G y la utilización de las columnas de cromatografía
PD10 (Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden). Tras su extracción,
la concentración del ADN genómico fue determinada mediante
espectrofotometría a 260/280 nm y almacenadas a -20ºC.
Las reacciones de PCR se llevaron a cabo en
volúmenes de 50 \mul compuestos de 0,2 \muM de cada
oligonucleótido, 200 \muM dNTPs (Sigma), 1x tampón de reacción
(75 mM Tris pH 9, 20 mM (NH_{4})_{2}SO_{4}, 50 mM KCl),
(Biotools, España), 2 mM MgCl_{2} (Biotools), 2 unidades de ADN
polimerasa (Biotools) y 50 ng de ADN molde. Las condiciones de
reacción fueron las siguientes: 1 ciclo a 94ºC durante 5 min, 35
ciclos de 94ºC/1 min, 60ºC/1 min, y 72ºC/1 min, con un ciclo final
de 72ºC durante 10 min. En cada serie de amplificaciones, como
control negativo, se incluyeron ADN obtenido a partir de las
células donde el parásito era habitualmente mantenido y H_{2}O.
Los productos de PCR obtenidos se separaron por electroforesis en
geles de agarosa con bromuro de etidio (NuSieve 3:1, Cambrex
BioScience, USA) al 2,5% y se visualizaron bajo luz UV.
Posteriormente, los productos fueron purificados con el
Exo-SAP IT kit (USB, USA), de acuerdo con las
instrucciones del fabricante, y directamente secuenciados en ambas
direcciones. Las secuencias se analizaron usando el programa
informático BioEdit Sequence Alignment Editor v.7.0.1 (Copyright©
1997-2004 Tom Hall, Ibis Therapeutics, Carlsbad CA
92008, USA) y se depositaron en el banco de datos GenBank database
bajo los números de acceso AY935165-AY935200 y
AY937107-AY937178, excepto para el aislado
Nc-Spain 7.
Nc-Spain 7.
La presencia de polimorfismo para los 13
microsatélites seleccionados variaba desde un bajo polimorfismo con
2 ó 3 alelos para cada microsatélite (MS1A, MS1B, MS12 y MS21)
hasta 4 a 9 alelos para el resto de microsatélites en los 10
aislados analizados. Además, el MS7 mostró un alelo que portaba un
SNP (Single Nucleotide Polymorphism) dentro del
microsatélite. Las secuencias obtenidas para el aislado objeto de la
invención se describen en SEQ ID NO: 1 (microsatélite MS1A), SEQ ID
NO: 2 (microsatélite MS1B), SEQ ID NO: 3 (microsatélite MS2), SEQ
ID NO: 4 (microsatélite MS3), SEQ ID NO: 5 (microsatélite MS4), SEQ
ID NO: 6 (microsatélite MS5), SEQ ID NO: 7 (microsatélite MS6A y
MS6B), SEQ ID NO: 8 (microsatélite MS7), SEQ ID NO: 9
(microsatélite MS8), SEQ ID NO: 10 (microsatélite MS10), SEQ ID NO:
11 (microsatélite MS12), SEQ ID NO: 12 (microsatélite MS21).
Para el análisis de los genotipos de cada
aislado en "multilocus", cada alelo fue designado con un
número de acuerdo con la longitud del motivo repetitivo y las
diferencias encontradas en su secuencia. El análisis en
"multilocus" aumentó considerablemente el poder
discriminatorio de las secuencias microsatélites y así, se
obtuvieron perfiles genéticos únicos para cada aislado, indicando
que todos los aislados diferían significativamente entre ellos,
como se puede observar en la Tabla II.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
Ejemplo
3
En este apartado se describen los experimentos
llevados a cabo para determinar la patogenicidad del aislado objeto
de la invención Nc-Spain 7 en un modelo murino
experimental.
Se inocularon ratones hembras de la estirpe
BALB/c de 6 semanas de edad por vía intraperitoneal con 10^{6}
(grupo A) y 10^{7} (grupo B) taquizoítos del aislado
Nc-Spain 7 mantenidos en cultivo celular como se
describe en el Ejemplo 1. El grupo testigo (grupo C) consistió en
ratones BALB/c de las mismas características inoculados con 200
\mul de PBS por vía intraperitoneal. En el curso del experimento
se sacrificaron aleatoriamente en los días 1, 2, 4, 8, 16, 32 y 64
cinco animales de cada grupo, excepto para el grupo testigo que se
sacrificaron tres ratones por día.
Todos los ratones fueron examinados diariamente
para observar signos clínicos compatibles con la infección por
N. caninum.
El sacrificio de los ratones se realizó en
atmósfera de CO_{2}. Inmediatamente después del sacrificio se
obtuvo sangre mediante punción intracardíaca con jeringa de
insulina y aguja de 0,5x16 mm. Los ratones se pesaron en el momento
del sacrificio con el fin de detectar disminuciones del peso con
respecto al grupo testigo. Las muestras de sangre
(200-500 \mul) se depositaron en tubos de 1,5 ml
con EDTA para al estudio de la parasitemia. Posteriormente, se
realizó la necropsia de cada individuo procediendo a la apertura de
las cavidades abdominal y torácica, valorando la presencia de
lesiones macroscópicas y extrayendo el pulmón y el encéfalo, los
cuales se congelaron a -80ºC en tubos de 1,5 ml estériles hasta la
extracción del ADN, con el objetivo de detectar la presencia del
parásito por PCR.
Las muestras de sangre se centrifugaron a 2000 x
g durante 10 min. El sedimento formado por las células sanguíneas
se destinó a la extracción del ADN utilizando el sistema comercial
"Genomic-Prep cell and blood DNA isolation
kit" (Amershan Biosciences) y el plasma obtenido fue
mantenido a -80ºC. El ADN de pulmón y encéfalo se extrajo a partir
de 10-20 mg de tejido congelado con el sistema
comercial "Genomic-Prep cell and tissue DNA
isolation kit" (Amershan Biosciences).
Para la detección del parásito en las muestras
de sangre, pulmón y encéfalo recogidas de los animales sacrificados
se utilizó la técnica de PCR anidada de la región
ITS-1, siguiendo el procedimiento descrito en el
Ejemplo 1. En todas las reacciones se utilizaron como testigo
positivo el ADN obtenido de taquizoítos de N. caninum y como
negativo agua ultrapura estéril.
Todos los ratones del grupo testigo (grupo C)
sobrevivieron hasta el final del experimento clínicamente
saludables. Por el contrario, uno de los ratones del grupo A
desarrolló signos clínicos claramente compatibles con la neosporosis
(hemiparesia y ataxia) a partir del día 31 y sobrevivió hasta el
día 38 postinoculación (PI) cuando, por la gravedad de los
síntomas, fue sacrificado. En el grupo B un total de 11 ratones
presentaron signos clínicos compatibles con la neosporosis en mayor
o menor grado a lo largo del experimento. A partir del día 14 PI,
estos presentaron erizamiento del pelo, fuerte anorexia, letargia,
hemiparesia y algunos de ellos torneo. Tres de los ratones fueron
sacrificados los días 24 y 58 PI debido a la gravedad de los
síntomas.
Durante la necropsia se observó esplenomegalia
en la mayoría de los ratones sacrificados de los grupos A y B desde
el día 2 al día 16 PI, y linfoadenopatía en ganglios mesentéricos e
iliacos desde el día 2 hasta el día 32, en el grupo A, y desde el
día 1 hasta el final del experimento en el grupo B.
El ADN de N. caninum se detectó en sangre
desde el día 1 al 8 PI, y en pulmón y encéfalo desde el día 2 al 64
PI. En lo que se refiere a la frecuencia de detección de N.
caninum se observó una mayor detectabilidad del parásito al
aumentar la dosis del inóculo. En el grupo C (grupo testigo) todas
las muestras analizadas fueron negativas, según lo esperado. Los
resultados obtenidos para la distribución del parásito en los grupos
A y B se muestran en la Tabla III.
En dicha tabla se puede observar que a partir de
los 16 días PI el parásito desaparece de la sangre y de los
pulmones de los ratones, incluso de aquellos que fueron inoculados
con la dosis más alta. En cuanto a la presencia del parásito en
encéfalo el ADN fue detectado a partir del día 16 PI en el grupo A
y a partir del día 4 PI en el grupo B hasta el día 64 PI,
demostrando la capacidad de acantonamiento del aislado de la
infección en este órgano.
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A continuación se procedió a determinar la carga
parasitaria de las muestras de encéfalo y pulmón positivas mediante
la técnica de PCR cuantitativa en tiempo real según consta en la
patente EP1655378.
Las cargas parasitarias obtenidas para el grupo
A en el pulmón fueron bajas en el día 4 PI, incrementándose
ligeramente el día 8 PI. En el caso del grupo B, la carga detectada
se incrementó significativamente en el día 4 PI, alcanzando el
máximo el día 8 PI (Figura 1, panel A). Cuando se estudiaron las
cargas parasitarias en el encéfalo de los ratones del grupo A, el
número de parásitos encontrados los días 16 y 32 PI fue similar y
se incrementó ligeramente en el día 64 PI. En el grupo B la carga
parasitaria fue máxima en el día 16 PI, y en los días 32 y 64
disminuyó, aunque se mantuvo en niveles elevados. El análisis
estadístico comparativo de ambos grupos mediante el programa
informático Statistica (version 5.0, copyright Statsoft. Inc.)
demostró que durante los días 16 y 32 PI, el grupo B presentó una
mayor carga parasitaria (P < 0,05 U de
Mann-Whitney), sin embargo en el día 64 PI, las
cargas detectadas en ambos grupos fueron similares (P >
0,05 U de Mann-Whitney) (Figura 1, panel
B).
En la figura 1, en ordenadas se representa el
número de taquizoítos detectados por microgramo de ADN genómico del
hospedador, cuantificados por la técnica de la PCR en tiempo real
en pulmón (Panel A) y encéfalo (Panel B) de los ratones de los
grupos A (barras de puntos), inoculados con 10^{6} taquizoítos
del aislado Nc-Spain 7, y B (barras listadas),
inoculados con 10^{7} taquizoítos, a lo largo de la infección
experimental. En abscisas se indica el día postinoculación. Las
barras están representadas con su mediana, y los cuartiles 25% y
75%.
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Ejemplo
4
La detección de las inmunoglobulinas de los
isotipos IgG1 e IgG2a específicas para N. caninum en el
plasma de los ratones infectados del Ejemplo 3 se llevó a cabo
mediante un ensayo inmunoenzimático (ELISA) indirecto.
Para ello, cada placa de 96 pocillos (Maxisorp
de Nunc) fue antigenada con 0,5 \mug de proteína del extracto
soluble de taquizoítos del aislado Nc-1 de N.
caninum obtenido por sonicación y fijada con solución de
formolina tamponada al 10%. Tras bloquear con tampón
PBS-Tween-20 al 0,05% y
seroalbumina bovina al 1%, e incubar con los sueros problema a una
dilución 1/100, se emplearon como anticuerpos secundarios
anti-IgG1 y anti-IgG2a de ratón
conjugados con peroxidasa (Southern Biotechnology) a una dilución
1/5000. Finalmente, la reacción colorimétrica se desarrolló mediante
la adición del sustrato
o-dihidrocloruro-diamino-fenileno
(0,6 mg/ml; Sigma) en tampón citrato 0,05 M suplementado con el
0,045% de H2O2. Tras parar la reacción colorimétrica con una
solución de H_{2}SO_{4} 2M, la absorbancia se midió en un
lector de ELISA a una longitud de onda de 450 nm. Los resultados se
expresaron como densidad óptica. Como testigos de la prueba se
incluyeron en cada placa una muestra de suero de ratón negativa
(densidad óptica menor de 0,1) así como un suero de ratón infectado
experimentalmente con una densidad óptica mayor de 2,0.
La producción de las inmunoglobulinas IgG1 e
IgG2a no fue detectada hasta el día 8 PI para ambos grupos A y B.
En el grupo A, a partir del día 16 PI se produjo un fuerte
incremento de los niveles detectados para ambos isotipos que se
mantuvieron hasta el día 64 PI. A lo largo del experimento, los
ratones inoculados con 10^{6} taquizoítos tuvieron una
concentración de IgG2a ligeramente superior a IgG1 durante los días
8, 16 y 32 PI, aunque el día 64 PI la concentración de IgG1 superó
ligeramente a la de IgG2a (Figura 2, panel A). En cuanto al grupo
B, se produjo un incremento de los niveles de ambas
inmunoglobulinas a partir del día 8 PI que se mantuvo hasta el día
64 PI, donde se obtuvieron los máximos valores. En este caso la
producción de la IgG2a el día 8 PI fue considerablemente superior a
la de IgG1, mientras que en los días 16, 32 y 64 PI los niveles de
IgG1 predominaron frente a los de IgG2a (Figura 2, panel B).
En la figura 2, en ordenadas se representa la
densidad óptica (D.O.), determinada a 450 nm utilizando la técnica
de ELISA, como la medida de los anticuerpos IgG1 (barras en negro) e
IgG2a (barra en gris) específicos frente a N. caninum
producidos por los ratones de los grupos A, (Panel A) y B (Panel
B), que fueron inoculados con 106 y 10' taquizoítos del aislado
Nc-Spain 7 respectivamente, frente al grupo testigo
(IgG1, representados por barras con líneas oblicuas e IgG2a
representados por barras en blanco) a lo largo de la infección
experimental. En abscisas se muestran los días postinfección
(PI).
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Ejemplo
5
En este apartado se describe la valoración de la
capacidad de transformación al estadio de bradizoíto de taquizoítos
del aislado Nc-Spain 7 in vitro siguiendo el
procedimiento descrito por Risco-Castillo et
al., 2004, J Parasitol.
90(3):466-70.
Se cultivaron monocapas de la línea celular
MARC-145 sobre cubreobjetos circulares de 10 mm de
diámetro, dentro de placas de 24 pocillos utilizando como medio de
cultivo medio DMEM suplementado con 10% de suero fetal bovino,
HEPES 15 mM (pH 7,2), glutamina 2 mM, penicilina 100 U/ml,
estreptomicina 100 \mug/ml y anfotericina B 250 ng/ml. Las
monocapas celulares fueron infectadas a las 24 horas con
taquizoítos del aislado Nc-Spain 7 a una dosis de
infección hospedador:parásito de 2:1. Veinticuatro horas después de
la infección, el medio se reemplazó con medio fresco conteniendo 2%
de suero fetal bovino y nitroprusiato sódico 70 \muM (Sigma) como
agente estresante inductor de la transformación al estadio de
bradizoíto. Este medio se renovó diariamente durante 7 días y los
cultivos se mantuvieron a 37ºC y 5% CO_{2}.
A lo largo del experimento se fijaron las
monocapas celulares infectadas diariamente hasta el día 3 y los
días 5 y 7 postestrés para la realización de un ensayo de
inmunofluorescencia indirecta de doble marcaje, utilizando un suero
policlonal de conejo producido frente a la proteína TgBAG1
recombinante (\alphaBAG1; dilución 1:100), que reacciona frente el
antígeno intracitoplasmático específico de bradizoíto denominado
NcBAG1, y un anticuerpo monoclonal desarrollado en ratón frente a
la proteína superficial específica de taquizoíto llamada SAG1
(\alphaSAG1, dilución 1:150). Como anticuerpos secundarios, se
usaron anti-IgG de conejo conjugada con
isotiocianato de fluoresceína (FICT) y anti-IgG de
ratón conjugado con tetrametil rodamina (TRIC) (Sigma),
respectivamente. Los núcleos de las células hospedadoras y del
parásito fueron marcados con DAPI.
Los cristales fueron observados en un
microscopio invertido de fluorescencia (Nikon Eclipse TE200) usando
un objetivo de inmersión 100X. La transformación se evaluó por
duplicado para cada día estudiado, contando 10 campos al azar en
cada cristal, para determinar la expresión de cada proteína
específica. La expresión de BAG1 se detectó desde el segundo día
post-estrés y aumentó progresivamente hasta
observar un 32% de vacuolas parasitóforas BAG1 positivas el día 7
post-estrés (Figura 3).
El grado de conversión entre estadios se
estableció como el porcentaje relativo del número de vacuolas
parasitóforas que expresaron BAG1 versus el total de
vacuolas parasitóforas contadas.
En la figura 3, en el eje de las ordenadas se
representa la media del porcentaje de vacuolas BAG1 positivas
(barras en negro) y SAG1 (barras en blanco). En el eje de las
abscisas se muestran los días de tratamiento con 70 \muM de
nitroprusiato sódico (SNP).
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Ejemplo
6
En este ejemplo se describen los análisis
inmunohistoquímicos llevados a cabo en las muestras del encéfalo
del ternero congénitamente infectado a partir del cual se obtuvo el
aislado de la invención con lo que se confirma la capacidad de
transformación entre los estadios de
taquizoíto-bradizoíto del aislado
Nc-Spain 7 in vivo.
Para ello, las diferentes muestras de tejido
nervioso mantenidas en solución de formolina al 10% fueron
deshidratadas y embebidas en parafina siguiendo el método habitual.
A continuación, múltiples secciones consecutivas de 3 a 6 \mum de
espesor de las muestras parafinadas fueron desparafinadas con
xileno, rehidratadas y sometidas al tratamiento en H_{2}O_{2} al
0,3% en metanol durante 30 minutos, con el fin de inhibir la
actividad peroxidasa endógena. Posteriormente, fueron tratadas con
solución de cloruro cálcico-tripsina (pH 7,8)
durante 40 minutos a 37ºC y bloqueadas con suero de cabra durante 30
minutos. Las diferentes secciones fueron incubadas con suero
policlonal de conejo desarrollado frente al antígeno BAG1,
expresado en el estadio de bradizoíto (\alphaBAG1) a una dilución
1:200 durante 12-18 horas a temperatura ambiente, o
un suero policlonal de conejo anti-taquizoítos de
N. caninum (ataquizoíto) a una dilución 1:3000.
Inmediatamente después, las muestras fueron incubadas con el
anticuerpo anti-inmunoglobulina IgG de conejo
biotinilado durante 30 minutos y, seguidamente, con la solución
ABC-P durante 40 minutos. El revelado se realizó
mediante la utilización de diaminobenzidina como substrato de
acuerdo con las instrucciones del fabricante especificadas en el
kit ABC (Vectastain ABC kit, Vector Lab.). Por último, las
diferentes secciones fueron teñidas con hematoxilina, deshidratadas
y montadas para su observación microscópica.
En la mayoría de las secciones analizadas se
detectó la presencia de bradizoítos localizados en quistes. Estos
bradizoítos fueron específicamente reconocidos por el anticuerpo
\alphaBAG1.
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Ejemplo
7
En este ejemplo se describe el desarrollo de una
vacuna inactivada elaborada con el aislado de la invención
Nc-Spain7 y se evalúa su seguridad y eficacia
utilizando un modelo murino experimental.
El antígeno para las inmunizaciones se preparó a
partir de taquizoítos obtenidos, recogidos y purificados como se
describe en el Ejemplo 2, que fueron inactivados mediante su
tratamiento con el agente etilenimina binaria (BE!) a una
concentración 0,01 M en agua destilada durante un período de 96
horas a 4ºC y, posteriormente, se neutralizó con una solución de
tiosulfato sódico. A continuación, el producto vacunal fue
formulado mediante su adyuvantado con el adyuvante A (Laboratorios
Hipra S.A., Girona, España) a una concentración de antígeno
equivalente a 5 x 10^{5} taquizoítos inactivados por dosis de
inoculación en los laboratorios Hipra S.A. (Gerona, España). Para
la prueba de vacunación se emplearon ratones hembras de la estirpe
BALB/c de 8 semanas de edad (Harlan Ibérica,
Barcelona).
Barcelona).
En la Tabla IV se recogen los diferentes grupos
incluidos en la prueba vacunal que incluyen un grupo vacunado con
el antígeno adyuvantado (G1) o con el adyuvante sin antígeno (G2)
que fueron desafiados con una dosis de infección experimental de 2
x 10^{6} taquizoítos del aislado Nc-1, y dos
grupos de ratones testigo, uno no vacunado y desafiado (G3) y otro
no vacunado no desafiado (G4), que constituyeron el grupo "no
vacunado" durante el período inductor. En cuanto a la pauta de
vacunación consistió en dos dosis vacunales con 21 días de
intervalo considerando la primera inoculación como día 0 del
experimento, y a los 53 días postinoculación se realizó el desafío
con 2x10^{6} taquizoítos del aislado Nc-1, por vía
subcutánea.
La seguridad del producto vacunal se evaluó
observando diariamente a los animales, comprobando si se producían
reacciones locales en la zona de inoculación o bien reacciones
sistémicas debidas a la vacunación.
La eficacia de la vacuna se valoró mediante la
evaluación de la respuesta inmune humoral inducida en los animales
vacunados, morbilidad y mortalidad, así como la presencia del
parásito en el sistema nervioso central por la técnica de PCR.
Para evaluar la respuesta inmune humoral (IgG1 e
IgG2a) desarrollada en los diferentes grupos ensayados se utilizó
un ELISA indirecto con proteínas solubles de N. caninum como
antígeno según se describe en el Ejemplo 4. La respuesta inmune se
estudió durante la fase inductora (proceso de vacunación),
sacrificando un número de 5 animales del grupo G1, G2 y "no
vacunado" en el día 23 postinoculación. El día 30 postdesafío
(día 83 postinoculación) los ratones de los diferentes grupos
fueron sacrificados. Se recogió una muestra de sangre para la
evaluación de la respuesta inmune humoral desarrollada durante la
fase efectora (fase de desafío o infección con el parásito).
La presencia del parásito en el encéfalo de los
animales sacrificados el día 30 postdesafío se determinó mediante
la técnica de PCR. Para ello, se realizó la extracción del ADN
genómico a partir de 10-20 mg de tejido nervioso de
los diferentes encéfalos mediante la prueba comercial "Realpure
Extracción DNA Genómico" (Realpure, Durviz), siguiendo las
instrucciones del fabricante, y a continuación, se procedió a la
detección del parásito mediante la técnica de PCR anidada de la
región ITS-1 siguiendo el procedimiento descrito en
el Ejemplo 1.
En cuanto al análisis estadístico de los datos
obtenidos, la valoración de las diferencias entre porcentajes se
realizó aplicando la prueba estadística Chi cuadrado o F de
Fisher mediante tablas de contingencia 2\times2. En el caso de
los valores de densidad óptica para IgG1 e IgG2a, las diferencias
entre los grupos fueron analizadas por la prueba paramétrica Anova
unifactorial. Cuando se observaron diferencias estadísticamente
significativas, los grupos se compararon dos a dos mediante la
prueba paramétrica de Duncan. Asimismo y empleando el test
paramétrico de Dunnett, todos los grupos se compararon con el grupo
G3 (no vacunado e infectado).
En cuanto a la seguridad, únicamente se observó
en aquellos grupos inoculados con el adyuvante A una reacción local
debida a la vacunación. Sin embargo, en ninguno de los grupos se
observaron reacciones sistémicas adversas como consecuencia de la
misma.
En cuanto a la eficacia, después del desafío, se
observaron signos clínicos compatibles con la infección por N.
caninum (inactividad, erizamiento, encorvamiento, debilidad y
sintomatología nerviosa) en algunos animales (un ratón del grupo G1
y otro del grupo G3). No se observaron diferencias significativas
en ninguno de los grupos analizados.
En la fase inductora se detectaron los niveles
más altos de los isotipos IgG1 e IgG2a en el grupo vacunado (G1).
Con respecto a IgG1 se observaron diferencias significativas al
comparar el grupo G1 versus G2 (Anova unifactorial) y el grupo
"no vacunado" (G4) (Prueba de Dunnett). En el caso del isotipo
IgG2a no se observaron diferencias estadísticamente significativas
(Figura 4, Panel A). Durante la fase efectora se detectaron niveles
elevados para ambos isotipos IgG2a e IgG1 en todos los grupos
desafiados (G1, G2 y G3). Con respecto a IgG1 no se observaron
diferencias estadísticamente significativas al comparar los grupos
desafiados, aunque con respecto al isotipo IgG2a los niveles
detectados en el grupo G2 fueron significativamente superiores
frente al grupo G1 (Anova unifactorial) (Figura 4, Panel B).
En la figura 4, en ordenadas se representa la
densidad óptica (D.O.), determinada a 450 nm utilizando la técnica
de ELISA, como la medida de los anticuerpos IgG1 (barras en gris) e
IgG2a (barras en negro) específicos frente a N. caninum
producidos por los ratones de los diferentes grupos de la prueba
vacunal durante la fase inductora el día 23 postinoculación (Panel
A) y efectora el día 30 tras el desafío (Panel B). En abscisas se
muestran los diferentes grupos incluidos en la prueba vacunal.
Los resultados obtenidos durante el período
inductor demostraron la capacidad del preparado vacunal de inducir
una repuesta inmunológica, al menos de tipo humoral, específica
frente a N. caninum.
La presencia de ADN de N. caninum se
detectó en un número variable de animales en función del grupo
analizado (Tabla V). No se obtuvieron diferencias estadísticamente
significativas cuando se compararon los grupos G1 versus G2
o G2 versus G3 (P>0,05, F de Fisher), aunque el resultado
fue estadísticamente significativo cuando se efectuó la comparación
del grupo G1 (vacunado y desafiado) frente al grupo G3 (no vacunado
y desafiado) (P<0,05, F de Fisher). Por tanto, en los
animales vacunados con el aislado Nc-Spain 7 se
observó una disminución significativa de la detectabilidad del
parásito en el SNC respecto al grupo testigo no vacunado y
desafiado, lo cual implica que la respuesta inmune desarrollada por
el preparado vacunal es capaz de limitar la multiplicación del
parásito en este órgano diana.
Ejemplo
8
Se describe la utilización del aislado de la
invención Nc-Spain7 en técnicas de diagnóstico
basadas en la detección de anticuerpos serológicos específicos
frente a N. caninum, y en este ejemplo concreto, mediante su
empleo en la técnica de inmunoblot.
Diferentes muestras de 10^{8} taquizoítos de
los aislados Nc-Spain7 y Nc-1,
utilizado en este estudio como aislado de referencia, mantenidos a
-80ºC, obtenidos, recogidos y purificados como se describe en el
Ejemplo 2, fueron resuspendidos en tampón de Tisis de proteínas (2%
de sodio dodecil sulfato (SDS), 10% de glicerol, 60 mM de
Tris-HCl (pH 6.8), 100 mM de ditiotreitol (DTT) y
0,048% de azul de bromofenol), hervidos durante 10 minutos y
sometidos a electroforesis en geles de acrilamida. De este modo, el
antígeno equivalente a 2 x 10' taquizoítos por gel fue resuelto a
través de un gel empaquetador de bis/acrilamida al 4% (pH 6,8)
seguido a continuación por un gel separador de
acrilamida-DATD al 12,5%, utilizando el sistema
Mini-PROTEAN II System (Bio-Rad,
California, USA). Con el fin de estimar el patrón de migración de
los diferentes antígenos posteriormente detectados, se incluyó
también el marcador Precision Plus Protein Standards Kaleidoscope
(Bio-Rad). A continuación, las proteínas fueron
transferidas a una membrana de nitrocelulosa de 0,22 \mum
utilizando el sistema Mini Trans-Blot Cell
(Bio-Rad).
Tras el tratamiento de las membranas en solución
bloqueante TBS (BSA 3% en TBS- Tween 0,05%), fueron incubadas con
los plasmas obtenidos a partir de ratones infectados
experimentalmente y los sueros de bovinos infectados natural o
experimentalmente, a una dilución 1:50 y 1:20, respectivamente.
Como segundo anticuerpo se utilizó un anticuerpo policlonal
desarrollado en conejo frente a la molécula completa de la IgG de
ratón a una dilución 1:500 (Sigma) y un anticuerpo monoclonal
frente a la IgG1 e IgG2 de bovino a una dilución 1:400 (Hipra S.A.,
Gerona, Spain), ambos conjugados con peroxidasa. Tras la incubación
con este segundo anticuerpo, los complejos
antígeno-anticuerpo formados fueron detectados
utilizando el compuesto cromogénico 4-cloro- 1
naphtol (Bio-Rad) como sustrato.
Las muestras de plasma de ratón utilizadas se
obtuvieron mediante la mezcla a partes iguales de los plasmas
recogidos a partir del día 32 postinfección de ratones infectados
experimentalmente con 10^{6} taquizoítos de los aislados
Nc-1, Nc-Liverpool y
Nc-Spain7 y 10^{7} taquizoítos de
Nc-Spain7, según se describe en el Ejemplo 3.
Igualmente, se incluyó como control la mezcla de los plasmas de los
ratones testigo inoculados con PBS el día 32 postinfección.
En cuanto a las muestras de bovino estudiadas se
incluyeron sueros de animales naturalmente infectados, tanto sueros
pre-calostrales obtenidos a partir de terneros
infectados congénitamente, incluyendo el suero del ternero a partir
del cual se obtuvo el aislado Nc-Spain7, como sueros
obtenidos a partir de vacas naturalmente infectadas. Además, se
probaron sueros obtenidos mediante la mezcla a partes iguales de
los sueros recogidos a partir de novillas experimentalmente
infectadas en el día 70 de gestación con 10^{8} taquizoítos del
aislado Nc-1. Los respectivos sueros testigos
negativos también fueron incluidos.
Los perfiles antigénicos detectados al usar el
plasma de los ratones analizados fueron idénticos en los extractos
de ambos aislados, Nc-Spain 7 y
Nc-1 (Figura 5). Las principales proteínas
antigénicas detectadas en ambos aislados fueron de 17, 24, 30,
34-35, 37, 39, 72-74 kDa, y algunas
con elevado peso molecular (> 80 kDa). Aunque la reacción fue
más intensa y se observó un mayor número de bandas con el plasma de
los ratones infectados con 10^{7} taquizoítos del aislado
Nc-Spain7 frente al plasma de los infectados con
10^{6}, la mayoría de los antígenos inmunodominantes de 30,
34-35 y 37 kDa descritos en estudios previos
(Atkinson et al., 1999, Parasitology 118 (Pt
4):363-370) se detectaron claramente.
En la Figura 5 se muestra el análisis por
inmunoblot con el extracto proteico completo de los aislados de
N. caninum Nc-Spain7 (Panel A) y
Nc-1 (Panel B) en condiciones reductoras con una
mezcla a partes iguales de los plasmas obtenidos a partir de
ratones infectados experimentalmente como se describe a
continuación: Ratones Balb/c infectados con 10^{6} taquizoítos de
Nc-1 (línea 1), ratones Balb/c infectados con
10^{6} taquizoítos de Nc-Liverpool (línea 2),
ratones Balb/c infectados con 10^{7} taquizoítos de
Nc-Spain7 (línea 3), ratones Balb/c infectados con
10^{6} taquizoítos de Nc-Spain7 (línea 4) y
ratones Balb/c inoculados con PBS (línea 5). El perfil de migración
de las proteínas correspondientes al marcador Precision Plus
Protein Standards Kaleidoscope (Bio-Rad) está
indicado mediante líneas con su masa molecular correspondiente en
kDa. Los principales antígenos inmunodominantes detectados están
señalados mediante puntas de flecha, indicando la masa molecular
aparente en kDa.
También en el análisis realizado con los sueros
bovinos se reconocieron perfiles antigénicos similares para ambos
aislados. Los antígenos inmunodominantes de 17, 28, 30,
34-35 y 37 kDa, identificados en estudios previos
(Alvarez-García et al., 2002, Vet Parasitol.
107(1-2):15-27) fueron
detectados con los sueros bovinos de infección natural. Los perfiles
antigénicos desarrollados con los sueros obtenidos a partir de las
novillas infectadas experimentalmente, en cambio, mostraron un
perfil distinto donde destacó la reacción generada por una proteína
de 39 kDa, pero fueron idénticos para ambos aislados.
En la Figura 6 se muestra el análisis por
inmunoblot con el extracto proteico completo de los aislados de
N. caninum Nc-Spain7 (Panel A) y
Nc-1 (Panel B) en condiciones reductoras de los
sueros obtenidos a partir de bovinos, como se describe a
continuación: suero precalostral de ternero (título IFI 1:1600)
(línea 1), suero precalostral de ternero (título IFI 1:800) (ternero
de origen para el aislamiento de Nc-Spain7) (línea
2), suero precalostral de ternero testigo negativo (línea 3),
mezcla a partes iguales de los sueros de novillas experimentalmente
infectadas con 10^{8} taquizoítos de Nc-1 (línea 4
y 5), mezcla a partes iguales de los sueros de novillas inoculadas
con PBS (línea 6) y suero de vacas naturalmente infectadas (línea 7
y 8). El perfil de migración de las proteínas correspondientes al
marcador Precision Plus Protein Standards Kaleidoscope
(Bio-Rad) está indicado mediante líneas con su masa
molecular correspondiente en kDa. Los principales antígenos
inmunodominantes detectados están señalados mediante puntas de
flecha, indicando la masa molecular aparente en kDa.
Los resultados mostrados en esta prueba
confirman la utilidad del aislado Nc-Spain7 como
antígeno en pruebas de inmunoensayo para la detección de
anticuerpos específicos frente a Neospora en una muestra
biológica. La batería de sueros utilizada en la prueba de
inmunoblot desarrollada en el presente ejemplo, formada por sueros
procedentes de animales infectados natural y experimentalmente con
el parásito N. caninum, mostraron idéntico patrón antigénico
de detección en los extractos celulares obtenidos del aislado de
referencia, Nc-1, y de Nc-Spain7,
incluyendo la detección del conjunto de proteínas antigénicamente
predominantes o antígenos inmunodominantes descritos en estudios
previos por otros autores, lo cual corrobora su utilidad
diagnóstica.
<110> Universidad Complutense de
Madrid
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Uso de un nuevo aislado de
Neospora caninum para el desarrollo de pruebas de diagnóstico
y para la fabricación de productos para el tratamiento y prevención
de la infección causada por Neospora.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 42
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 313
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Neospora caninum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 253
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Neospora caninum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 139
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Neospora caninum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 198
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Neospora caninum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 250
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Neospora caninum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 269
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Neospora caninum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 403
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Neospora caninum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 254
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Neospora caninum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 193
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Neospora caninum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 292
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Neospora caninum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 242
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Neospora caninum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 289
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Neospora caninum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Neospora caninum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Neospora caninum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Neospora caninum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Neospora caninum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Neospora caninum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Neospora caninum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Neospora caninum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Neospora caninum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Neospora caninum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Neospora caninum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\hskip1cm
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Neospora caninum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Neospora caninum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Neospora caninum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Neospora caninum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Neospora caninum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Neospora caninum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Neospora caninum
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Neospora caninum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Neospora caninum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Neospora caninum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Neospora caninum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Neospora caninum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Neospora caninum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 35
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Neospora caninum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 36
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Neospora caninum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 37
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Neospora caninum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 38
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Neospora caninum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 39
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Neospora caninum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 40
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Neospora caninum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 41
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Neospora caninum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 42
\hskip1cm
Claims (26)
1. Parásito aislado a partir de tejido nervioso
bovino, de la especie Neospora caninum y denominado
Nc-Spain7, depositado en la Colección de Cultivos de
Algas y Protozoos con número de acceso CCAP 2051/1.
2. Cultivo celular biológicamente puro infectado
por el aislado Nc-Spain7.
3. Cultivo celular biológicamente puro infectado
por el aislado Nc-Spain7, según la reivindicación
2, caracterizado porque es un cultivo de células de riñón de
mono verde.
4. Uso de los cultivos celulares de las
reivindicaciones 2 y 3 para la obtención de taquizoítos de
Nc-Spain7.
5. Uso de los cultivos celulares de las
reivindicaciones 2 y 3 para la obtención de bradizoítos de
Nc-Spain7.
6. Uso de los cultivos celulares de las
reivindicaciones 2 y 3 para la obtención de ADN genómico de
taquizoítos de Nc-Spain7.
7. Uso de taquizoítos de
Nc-Spain7 para producir anticuerpos frente a
Neospora caninum.
8. Uso del aislado Nc-Spain7 de
la reivindicación 1 en la elaboración de una vacuna para el
tratamiento y/o prevención de la infección causada por
Neospora en animales.
9. Uso del aislado Nc-Spain7,
según la reivindicación 8, caracterizado porque la
elaboración de la vacuna se realiza a partir del aislado
Nc-Spain7 vivo atenuado, inactivado y/o fijado en
cualquiera de los estadios del ciclo biológico.
10. Uso del aislado Nc-Spain7,
según la reivindicación 8, caracterizado porque la
elaboración de la vacuna se realiza a partir de un extracto y/o
lisado celular del aislado Nc-Spain7 en cualquiera
de los estadios del ciclo biológico.
11. Uso del aislado Nc-Spain7,
según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10,
caracterizado porque la vacuna se prepara como inyectable en
formulaciones líquidas o en forma sólida para su posterior
reconstitución.
12. Uso del aislado Nc-Spain7,
según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10,
caracterizado porque la vacuna se prepara como formulación
oral.
13. Uso del aislado Nc-Spain7,
según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12, que comprende un
adyuvante y/o una o varias citoquinas y/o inmunoestimuladores.
14. Composición vacunal que comprende
taquizoítos purificados de Nc-Spain7 y un
excipiente farmacéuticamente aceptable.
15. Composición vacunal, según la reivindicación
14, en la que los taquizoítos están inactivados.
16. Composición vacunal, según cualquiera de las
reivindicaciones 14 y 15, en la que se incluye un adyuvante.
17. Uso del aislado de Neospora caninum
de la reivindicación 1 en el diagnóstico de la infección causada
por Neospora.
18. Uso según la reivindicación 17 en el que el
diagnóstico se realiza mediante técnicas inmunológicas.
19. Uso según la reivindicación 18 en el que las
técnicas inmunológicas se basan en el empleo de proteínas
antigénicas de Nc-Spain7.
20. Uso según la reivindicación 19 en el que las
proteínas antigénicas se caracterizan por tener una masa
molecular aparente de 17, 24, 28, 30, 34-35, 37, 39
ó 72-74 kDa.
21. Uso según la reivindicación 17 en el que las
técnicas inmunológicas se basan en el empleo de los extractos
completos del aislado Nc-Spain7.
22. Uso según la reivindicación 17 en el que las
técnicas inmunológicas se basan en el empleo de anticuerpos frente
al aislado Nc-Spain7.
23. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
19-22 en el que la técnica inmunológica empleada es
el inmunoblot.
24. Uso de las secuencias SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4,
5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 y/o 12 del aislado de la reivindicación 1 en
el diagnóstico de la neosporosis mediante técnicas de detección de
ácidos nucleicos.
25. Uso según la reivindicación 24 en el que la
técnica de detección de ácidos nucleicos utilizada es la PCR.
26. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
24 y 25 en el que la técnica de detección de ácidos nucleicos se
aplica al DNA del parásito extraído a partir de una muestra
biológica.
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